KR20060097065A

KR20060097065A - 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제, 그 제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20060097065A
Application number: KR1020067013965A
Authority: KR
Inventors: 파쥔 난; 밍웨이 왕; 웬롱 왕; 차이홍 주
Original assignee: 상하이 인스티튜트 오브 마테리아 메디카 차이니즈 아카데미 오브 싸이언시즈
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2003-12-25
Publication date: 2006-09-13
Also published as: EP1695968A4; RU2006124796A; US20070043093A1; CN1626521A; CN100453533C; BR0318631A; ZA200605721B; EP1695968A1; JP4527665B2; AU2003296205B2; RU2342368C2; CA2549355A1; WO2005056537A1; IL176223A0; KR100764863B1; AU2003296205A1; US7838682B2; UA87122C2; JP2007523828A

Abstract

본 발명은 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제를 제공한다. 상기 작용제는 약물 테스트에 의해 글루카곤계 펩티드-1 수용체에 대해 우수한 결합력을 가지는 것으로 시사된다. 또한, 본 발명의 상기 작용제의 제조 방법을 제공한다.

글루카곤계 펩티드-1 수용체, 당뇨병

Description

글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제, 그 제조 방법 및 용도{THE GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1 RECEPTOR AGONISTS, THE PREPARATION AND THE USE OF THE SAME}

본 발명은 글루카곤계 펩티드-1 수용체(GLP-1R) 작용제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 비펩티드 GLP-1R 작용제로서 이용될 수 있는 치환된 5-원 헤테로사이클 고리 유도체의 소분자 유기화합물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 인슐린 둔감성 2형 당뇨병 및 비만 등의 당대사-교란과 관련있는 질환의 치료용 약제로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 GLP-1R 작용제 제조 방법에 관한 것이다.

당뇨병(Diabetes mellitus: DM)은 유전적인 소향을 가지는 일반적인 내분비 대사성 질환이다. 당뇨병은 주로 인슐린의 절대적 또는 상대적인 분비감소에 의해 야기되며, 당, 지방, 단백질과 부차적으로 비타민, 물 및 전해질의 대사성 교란을 초래한다. 증상으로는 혈당 및 뇨중 포도당의 증가가 있으며, 환자는 조갈증, 다식증, 다뇨증, 구강 건조 및 전신권태 증상을 나타낸다. 당뇨병으로 인한 사망율은 1 내지 5 %를 차지하고 있으며, 점차적으로 증가하는 향상을 보인다. 당뇨병, 암 및 심혈관계 질환은 세계 3대 중증 질환이다. 당뇨병의 치료는 상기 증상들을 제거하고, 췌장의 기능 회복을 촉진시키고, 인슐린 내성을 향상시키고, 보다 나은 건강한 상태와 체력을 유지시키고, 여러가지 합병증을 예방 및 치료하기 위해, 탄소화물의 대사 교란을 바로잡는 것을 목적으로 한다.

당뇨병은 일반적으로 두가지 유형으로 분류된다: 인슐린 의존성 당뇨병(1형, IDDM) 및 비-인슐린 의존성 당뇨병(2형, NIDDM). 이들 두가지 유형의 당뇨병의 병인이 달라 이의 치료제가 매우 다르며, 그 각각은 다음과 같다.

1형 당뇨병은 면역기작을 통해 췌장 세포의 역설적 반응을 형성하는 유전적으로 감수성이 있는 사람의 바이러스 감염에 의해 유발되고, 췌장은 손상되기 시작하여 기능을 완전히 상실하게 된다. 당뇨병의 약 5%가 1형이다. 현재, 1형 당뇨병 치료제로는 주로 외인성 인슐린(인간 인슐린 및 동물 인슐린 포함), 인슐린 유사 효과를 나타내는 약물, 인슐린계 성장 인자-1(IGF-1), 장기간 작용하는 신생 인슐린 조제물 및 진퀴(Jin Qi) 저혈당 정제 등이 있다.

2형 당뇨병의 일부는 인슐린 분비를 감소시키는 베타-섬세포의 직접적인 손상에 의해 초래된다. 2형 당뇨병의 대부분은 유전적 특징, 생활 습관, 환경적 요인, 대사성 장애, 비만 등을 포함할 수 있는 요소들의 조합에 의해 유발된다. 상기 질환 상태에서, 근육, 간 및 지방 조직은 인슐린에 둔감하므로, 포도당 흡수가 감소된다. 대부분의 당뇨병 환자는 2형 당뇨병이다. 현재, NIDDM의 임상 치료에 사용되는 약제로는 주로 설포닐유레아제, 비구아니드(biguanides), 그외 저혈당제 및 보강제 등이 있다.

설포닐유레아제 저혈당제는 베타-섬세포의 세포막 수용체에 결합하여 칼륨 이온 채널을 폐쇄함으로써, 칼륨 이온의 유출을 차단하고 세포막의 탈분극화를 유 도하며, 그로인해 칼슘 이온 채널이 개방되고 세포외 칼슘 이온이 내부로 유입되게 된다. 세포내 칼슘 이온의 농도 증가는 인슐린 방출을 촉발한다. 설포닐유레아제 저혈당제는 이의 출현 시기에 따라 두가지 세대로 분류된다. 제1 세대로는 톨프로파미드가 있으며, 제2 세대로는 글리벤클라미드(유글루칸), 글리클라지드(디아미크론), 글리피지드 및 글리퀴돈 등이 있다.

비구아니드 저혈당제는 식욕을 억제하고, 수용체에 인슐린 결합을 향상시키고, 세포내 혐기성 당분해를 촉진시키고, 조직 호흡을 저해하며, 간의 포도당 합성을 저해한다. 상기 비구아니드 저혈당제로는 메트포르민, 펜포르민 및 부포르민이 있다.

그외 저혈당제로는, 티아졸리딘디온 약물(예컨대 트로글리타존, 로시글리타존, 및 피오글리타존 등), β3-아드레노셉터 조절자, 글루카곤 수용체 길항제, 지방산 대사 간섭제, α-글루코시다제 저해제(예컨대, 아카르보스, 보글리보스, 미글리톨) 및 알도스 리덕타제 저해제 등이 주로 포함된다.

최근, 내인성 펩티드 호르몬 관련 당대사에 대한 연구의 진전으로 당뇨병 치료제에 대한 새로운 아이디어가 제시되고 있다. 인체가 영양 물질을 섭취할때 장내분비 세포는 글루카곤계 펩티드-1(GLP-1) 및 포도당-의존성 인슐린성(insulintropic) 펩티드(GIP)를 주로 포함하며 인슐린 합성, 위장의 연동 및 섬세포 증식에 작용함으로써 대사를 조절하는 장내펩티드 호르몬을 방출한다. 여기에서, GLP-1은 장-췌장 세포에 의해 분비되며, 단백질 키나제를 추가적으로 활성화시키기 위해, 아데닐레이트 사이클라제를 활성화시킴으로써 베타-섬세포의 GLP-1 수용체와의 매우 특이적인 결합에 의해 cAMP를 합성한다. 대사 신호(당대사) 및 키나제 신호(GLP-1의 결합)는 세포막 수준에서 동시 작용하여, 최종적으로 Ca² ⁺ 채널의 개방과 칼슘 이온의 유입을 초래하며, 그로인해 글루카곤 합성을 저해하면서 인슐린의 분비를 더욱 자극함으로써, 식후 혈당은 일정한 수준으로 유지되는 혈당치로 낮아지게 된다. 또한, GLP-1은 신경조절 기능을 가지며, 위 공복을 저지하여 식욕을 억제할 수 있다. 이러한 모든 점들이 당뇨병 제어에 매우 유익하다. 정상적으로, GLP-1은 혈당 농도에 따라 인슐린 분비를 자극한다. 혈당이 낮아지면, GLP-1의 인슐린 분비 자극 작용이 감소된다. 따라서, 혈당 감소에 있어서의 GLP-1의 작용은 스스로 제한되어, 저혈당을 초래하지 않는다. 이에, 당뇨병 치료에 있어서의 GLP-1 유사 작용을 가지는 약제가 당뇨병 치료에 매우 적합하다. GLP-1R 작용제는 국제 약물 개발 기구의 중점 연구 대상이다. 현재, GPL-1R에 대한 연구는 주로 폴리펩티드 조절제에 집중되어 있다. 예컨대 아밀린사의 AC 2993은 미국(IND)에서 임상 테스트용으로 제공되고 있다. AC 2993은 39개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드로, GPL-1처럼 인슐린의 분비를 촉진하는 작용을 가지고 있다. 폴리펩티드 약물은 경구 투여용으로 부적합하며 쉽게 분해되기 때문에 현재 새로운 연구 방향은 비펩티드 GLP-1R 조절자에 관한 것이다.

발명의 개시

본 발명은 당뇨병 약제에 있어서의 선두 화합물 또는 약물 검색 방법을 제공하기 위하여, 글루카곤계 펩티드-1 수용체(GLP-1R) 작용제로서 사용될 수 있는 치환된 5원 헤테로사이클릭 고리 유도체의 신규 소분자 유기 화합물을 제작하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 이들 화합물들의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제는 하기 구조식을 가진다.

상기 구조식에서,

Ar₁ 및 Ar₂는 각각 독립적으로 페닐 또는 치환된 페닐이고, 상기 치환된 페닐의 치환기는 알킬; 하이드록실; 치환된 알콕실, 또는 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 알킬아미노; 치환된 알카노일옥시, 또는 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 알카노일아미노; 산소 또는 아민으로 치환된 탄소수 2-6의 알케닐, 페닐, 벤질, 탄소수 2 내지 6의 에노일, 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일, 벤조일, 알콕실 및 알카노일아미노를 함유하고 있는 1, 2 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일, 벤질로일, 테노일, tert-부톡시카르보닐, 아다만탄 포름옥실(

) 및 만델로일(

); 알콕실; 알카노일아미노; 사이클로알콕실; 사이클로알카노일아미노; 아미노; 아미드; 알콕시카르보닐; 사이클로알콕시카르보닐; 알카노일옥시; 알카노일아미노; 사이클로알카노일옥시; 사이클로알카노일아미노; 카르바미도; 유릴렌; 알카노일; 니트로; 카르복실; 및 알데하이드 기로부터 선택적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기이고;

X는 O, S 또는 NH이고,

Y는 O 또는 S이다.

이때, Ar₁은

으로,

R₁은 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 벤질로일; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₁은 O 또는 NH이며,

Ar₂는

으로,

R₂는 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₂는 O 또는 NH임)이거나, 또는

Ar₂는

로,

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₁은 O 또는 NH이고;

X₂는 O 또는 NH이다.

상기에서, Ar₁은

로,

R₅ 및 R₆은 각각 독립적으로 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₁은 O 또는 NH이고;

X₂는 O 또는 NH이며,

Ar₂는

로,

R₂는 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₂는 O 또는 NH이거나, 또는

Ar₂는

로,

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₁은 O 또는 NH이고;

X₂는 O 또는 NH이다.

본 발명은 아래 단계에 의해 수행된다.

화학 반응식:

(상기에서, Ar₁ 및 Ar₂는 각각 독립적으로 페닐 또는 치환된 페닐이고, 상기 치환된 페닐의 치환기는 니트로; 카르복실; 알데하이드; tert-부톡시카르보닐 및 산소 또는 아미노로 치환된 테노일이고, X는 O, S 또는 NH이고, Y는 O 또는 S임), 또는

화학 반응식:

(상기에서 R₁, R₂ 및 R₃은 선택적으로, H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 치환기를 임의로 포함하는 치환된 벤조일; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실 중 어느 하나이고, X는 O, S 또는 NH이고, Y는 O 또는 S이고, X₁, X₂ 및 X₃은 각각 독립적으로 O 또는 NH이고, X₄는 Cl 또는 OH임)

화합물III은 화합물 I과 II의 축합 반응에 의해 제조된다. 축합 반응은, 디클로로메탄, 아세트 무수화물, 테트라하이드로퓨란, 디메틸퓨란, 디클로로에탄, 톨루엔, 벤젠, 물, 디옥산 또는 이들 용매의 혼합물내에서 수행된다. 필요에 따라, 일부 활성제, 예컨대 피리딘, N-메틸모르폴린, 이소부틸 클로로포르메이트, 트리에틸아민, 디에틸프로필에틸 아민 또는 DMAP 등을 상기 반응에 첨가할 수 있다. 상기 화합물의 반응 조건에 따라, 반응 온도는 일반적으로 -78 ℃ 내지 실온(예, 화합물 Wng462 등)이거나, 또는 열처리에 의한 50 ℃ 내지 230 ℃(예, 화합물 Wng520 등)이다. 반응 시간은 특정 반응물에 따라 결정된다. 일반적으로, 반응 진행은 TLC를 이용한 트레이싱(tracing)에 의해 결정된다. 반응 종료후, 일반적인 후처리 방법은, 펌프를 이용한 필터링, 용매를 제거하기 위한 반응액 농축, 추출 및 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리 등을 포함한다. 최종 산물 III은 NMR 검출로 검증한다.

본 발명에 따른 치환된 5원 헤테로사이클릭 고리의 구조 단위의 합성 공정은 유기 합성 CV 2, 55에 언급되어 있다.

본 발명에서는 신규 글루카곤계 펩티드-1 수용체(GLP-1R) 작용제를 제작 및 합성한다. 본 발명에 따른 GLP-1R 작용제는 우수한 GLP-1R 결합력을 나타내며, cAMP 합성을 촉진시키고, 인슐린 둔감성 2형 당뇨병 및 비만 등과 같은 당대사 교란성 질환 치료용 약제 제조에 이용될 수 있다. 또한, 이것은 종래에 폴리펩티드 조절자 약물이 경구 투여가 어렵고 쉽게 분해되는 결점을 해결할 수 있다. 본 발명의 화합물은 비교적 간단한 구조를 가지며 쉽게 제조된다.

도 1은 본 발명의 화합물에 있어서 리포터 유전자 발현의 검출 결과를 나타내며, 이는 GLP-1R에 대한 화합물의 활성화 활성을 평가하는데 이용된다. 도 1에서, 30 nM의 양성 표준물질 GLP-1 의해 유도된 루시퍼라제의 상대적인 활성은 100% 로 둔다.

도 2는 293/GLP-1R 세포에서 cAMP의 농도에 대한 화합물 2f의 영향을 나타낸다.

본 발명은 아래 구체적인 실시예에서 참조문헌과 함께 더욱 설명되지만, 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

아래 제조예 1 내지 3에서 화합물 제조 공정은 다음과 같은 3가지 반응 조작 공정을 포함한다.

공정 1:

화합물 I 및 II, 소듐 아세테이트 및 아세트 무수화물을 혼합하고, 가온(150 ℃ 내지 230 ℃)하여 용해한 다음, 1시간동안 용해된 상태로 둔다. 이후, 반응 혼합물에 에탄올을 첨가하고, 냉각시킨다. 이를 결정화한 다음 여과하여 산물을 분리한다. 잔류 액체를 농축하여 용매를 완전하게 제거하고, 컬럼 크로마토그래피로 산물을 분리한다.

공정 2:

화합물 I을 디클로로메탄에 용해시키고, -20 ℃의 빙점조(cryohydrate bath)내에서 냉각시킨 다음, 트리플루오로아세트산을 첨가하고 실온으로 온도를 상승시킨다. 화합물 I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적한다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전히 제거한 다음, 기질을 디클로로메탄에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨다. 이후, 피리딘 및 아실 클로라이드를 순차적으로 첨가하고, 온도를 실온으로 상승시킨 다음 TLC로 반응을 추적한다. 반응액을 농축하고, 컬럼 크로마토그래피로 산물을 분리한다.

공정 3:

화합물 I을 디클로로메탄에 용해시키고, -20 ℃의 빙점조(cryohydrate bath)내에서 냉각시킨 다음, 트리플루오로아세트산을 첨가하고, 실온으로 온도를 상승시킨다. 화합물 I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하고, 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전히 제거한다. 이후, 화합물 II를 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해하고, 빙점조내 -20 ℃로 냉각시킨다. 이후, N-메틸모르폴린(NMM) 및 ClCOOⁱBu를 순차적으로 첨가한다. 트리플루오로아세트산을 이용한 화합물 I의 반응 산물을 테트라하이드로퓨란에 용해시키고, 이를 실온에서 반응시키기 위해 시린지를 이용하여 상기 혼합물로 이동시킨다. 반응은 TLC로 추적한다. 반응 종료 후, 반응액을 농축하고, 컬럼 크로마토그래피로 산물을 분리한다.

화합물 wang520, wang337, wang405, wang450, wang520-1 및 wang462-1은 반응 공정 1에 의해 제조하고, 화합물 wang420, wang462, wang524, wang516, wang488, wang568, wang502, wang530, wang504, wang866, 2f, wang582, wang538 및 wang496은 화합물 wang520을 이용한 공정 2에 의해 제조하고, 화합물 wang516-1 및 wang591은 wang520을 이용한 공정 3에 의해 제조한다.

하기 제조예에서, NMR은 베리언 코퍼레이션에서 제조한 수은-Vx 300M을 이용하여 측정한다. NMR 기준은 δH/C 7.26/7.77 ppm(CDCl₃); δH/C 2.50/39.51 ppm(DSMO-d6); 및 δH/C 3.31/49.15 ppm(메틸-d3 알콜-d)이다. 반응시약은 상하이 화학시약회사에서 제공받았다. 또한, 산물은 컬럼 크로마토그래피로 주로 정제한다. 정제용 실리카 겔은 200 - 300 메쉬이고, 컬럼 크로마토그래피용 실리카 겔 모델은 굵고 오목한 형태(ZLX-II)이며, 큉다오 해양 화학 공장의 지점에서 생산된다.

실시예 1

실온에서, 화합물II(466 mg, 1.78 mmol), 화합물I(576 mg, 1.96 mmol), 소듐 아세테이트(146 mg, 1.78 mmol) 및 아세트 무수화물 2 mL를 혼합하고, 녹을때까지 170 ℃로 가온한 다음, 1시간 동안 녹은 상태로 유지시켰다. 이후, 반응 혼합물에 에탄올 2 mL을 첨가하고, 실온으로 냉각시켰다. 노란색의 고형물을 분리 및 여과하였다. 잔류 액체를 농축하여 용매를 완전히 제거함으로써 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(5:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang520 556 mg을 수득하였다(수율 60%).

실온에서, 화합물II(466 mg, 1.78 mmol), 화합물I(576 mg, 1.96 mmol), 소듐 아세테이트(146 mg, 1.78 mmol) 및 아세트 무수화물 2 mL를 혼합하고, 녹을때까지 200 ℃로 가온한 다음, 1시간 동안 녹은 상태로 유지시켰다. 이후, 반응 혼합물에 에탄올 2 mL을 첨가하고, 실온으로 냉각시켰다. 액체를 농축하여 용매를 완전히 제거함으로써 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(1:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang462-1 158 mg을 수득하였다.

실온에서, 화합물II(1.46 g, 9.6 mmol), 화합물I(1.9 g, 10.7 mmol), 소듐 아세테이트(0.8 g, 9.8 mmol) 및 아세트 무수화물 2.8 mL를 혼합하고, 녹을때까지 170 ℃로 가온한 다음, 1시간 동안 녹은 상태로 유지시켰다. 이후, 반응 혼합물에 에탄올 5 mL을 첨가하고, 실온으로 냉각시켰다. 노란색의 고형물을 분리 및 여과하여 산물, 화합물 wang337 2.0 g을 수득하였다(수율 62%).

실온에서, 화합물II(262 mg, 1.0 mmol), 화합물I(200 mg, 1.1 mmol), 소듐 아세테이트(82 mg, 1.0 mmol) 및 아세트 무수화물 1 mL를 혼합하고, 녹을때까지 170 ℃로 가온한 다음, 1시간 동안 녹은 상태로 유지시켰다. 이후, 반응 혼합물에 에탄올 5 mL을 첨가하고, 실온으로 냉각시켰다. 노란색 고형물을 분리 및 여과하였다. 잔류 액체를 농축하여 용매를 완전히 제거함으로써 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(6:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang405 235 mg을 수득하였다(수율 58%).

실온에서, 화합물II(262 mg, 1.0 mmol), 화합물I(250 mg, 1.1 mmol), 소듐 아세테이트(82 mg, 1.0 mmol) 및 아세트 무수화물 4 mL를 혼합하고, 녹을때까지 170 ℃로 가온한 다음, 1시간 동안 210 내지 230 ℃로 유지시켰다. 이후, 반응 혼합물에 에탄올 5 mL을 첨가하고, 실온으로 냉각시켰다. 노란색 고형물을 분리 및 여과하여, 산물, 화합물 wang450 100 mg을 수득하였다(수율 22%).

실시예 2

화합물I(50 mg, 0.1 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 반응 중간산물을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 이후 피리딘 40 ㎕(0.6 mmol)을 첨가하고, 점차적으로 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응액을 농축하고, 용매를 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(2:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang420 38 mg을 수득하였다(수율 90%).

화합물I(50 mg, 0.1 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 반응 중간산물을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 이후 피리딘 40 ㎕(0.6 mmol)을 첨가하고, 화합물II(27 ㎕, 0.39 mmol)을 첨가하고, 점차적으로 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응액을 농축하고, 용매를 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(1.5:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang462 26 mg을 수득하였다(수율 56%).

화합물I(40 mg, 0.08 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 반응 중간산물 을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 이후 피리딘 40 ㎕(0.6 mmol)을 첨가하고, 화합물II(23 ㎕, 0.2 mmol)을 첨가하고, 점차적으로 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응액을 농축하고, 용매를 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(5:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang524 15 mg을 수득하였다(수율 36%).

화합물I(40 mg, 0.08 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 반응 중간산물을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 이후 피리딘 40 ㎕(0.6 mmol)을 첨가하고, 화합물II(25 ㎕, 0.2 mmol)을 첨가하고, 점차적으로 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응액을 농축하고, 용 매를 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(4:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang516 25 mg을 수득하였다(수율 62.5%).

화합물I(40 mg, 0.08 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 반응 중간산물을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 이후 피리딘 40 ㎕(0.6 mmol)을 첨가하고, 화합물II(23 ㎕, 0.2 mmol)을 첨가하고, 점차적으로 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응액을 농축하고, 용매를 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이 트(4:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang488 25 mg을 수득하였다(수율 64%).

화합물I(40 mg, 0.08 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 반응 중간산물을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 이후 피리딘 40 ㎕(0.6 mmol)을 첨가하고, 화합물II(23 ㎕, 0.2 mmol)을 첨가하고, 점차적으로 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응액을 농축하고, 용매를 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(4:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화 합물 wang568 26 mg을 수득하였다(수율 57%).

화합물I(40 mg, 0.08 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 반응 중간산물을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 이후 피리딘 40 ㎕(0.6 mmol)을 첨가하고, 화합물II(23 ㎕, 0.2 mmol)을 첨가하고, 점차적으로 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응액을 농축하고, 용매를 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(4:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang502 22 mg을 수득하였다(수율 56%).

화합물I(40 mg, 0.08 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 반응 중간산물을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 이후 피리딘 40 ㎕(0.6 mmol)을 첨가하고, 화합물II(23 ㎕, 0.2 mmol)을 첨가하고, 점차적으로 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응액을 농축하고, 용매를 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(4:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang530 24 mg을 수득하였다(수율 57%).

화합물I(40 mg, 0.08 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 반응 중간산물을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 이후 피리딘 40 ㎕(0.6 mmol)을 첨가하고, 화합물II(23 ㎕, 0.2 mmol)을 첨가하고, 점차적으로 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응액을 농축하고, 용매를 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(6:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang504 4 mg을 수득하였다(수율 10%).

화합물I(40 mg, 0.08 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 반응 중간산물을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 이후 피리딘 40 ㎕(0.6 mmol)을 첨가하고, 화합물II(27 ㎕, 0.2 mmol)을 첨가하고, 점차적으로 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응액을 농축하고, 용매를 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 CH₂Cl₂를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang554 40 mg을 수득하였다(수율 89%).

화합물I(52 mg, 0.1 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 반응 중간산물을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 이후 피리딘 40 ㎕(0.6 mmol)을 첨가하고, 화합물II(10 mg, 0.03 mmol)을 첨가하고, 점차적으로 온도를 실온으로 상승시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응액을 농축하고, 용매를 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 CH₂Cl₂를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang866 19 mg을 수득하였다(수율 44%).

동일한 공정으로, 트리플루오로아세트산을 이용하여 화합물

1 eq과 아세틸 클로라이드 1.5eq의 반응 산물을 이용함으로써 화합물 2f를 제조하였다(수율 56%).

동일한 공정으로, 트리플루오로아세트산을 이용하여 화합물 wang520 1 eq과 디아만탄 포르밀 클로라이드 1.5 eq의 반응 산물을 이용함으로써 화합물 wang582를 제조하였다(수율 38%).

동일한 공정으로, 트리플루오로아세트산을 이용하여 화합물 wang520 1 eq과 벤질 아세틸 클로라이드 1.5 eq의 반응 산물을 이용함으로써 화합물 wang538를 제조하였다(수율 58%).

동일한 공정으로, 트리플루오로아세트산을 이용하여 화합물 wang520 1 eq과 클로로 아세틸 클로라이드 1.5 eq의 반응 산물을 이용함으로써 화합물 wang496를 제조하였다(수율 70%).

실시예 3

화합물I(40 mg, 0.08 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산 1 mL을 첨가하고 점차적으로 실온으로 온도를 상승시켰다. 화합물I이 완전하게 반응할때까지 TLC로 반응을 추적하였다. 반응계를 농축하여 트리플루오로아세트산을 완전하게 제거한 다음, 화합물II(19 ㎕, 0.16 mmol)을 테트라하이드로퓨란 2 mL에 용해시키고, 빙점조내 -20 ℃에서 냉각시키고, 상기 온도에서 10분간 교반하였다. 이후, N-메틸모르폴린(NMM)(53 ㎕, 0.48 mmol)과 ClCOOⁱBu(21 ㎕, 0.16 mmol)을 순차적으로 첨가하고 -20 ℃에서 0.5 시간동안 교반하였다. 화합물I과 트리플루오로아세트산의 반응 산물을 테트라하이드로퓨란 1 mL에 용해하고, 약 15시간동안 실온에서 반응시키기 위해 시린지를 이용하여 상기 혼합물로 이동시켰다. 반응액을 농축시키고, 용매를 완전히 제거하여 조산물을 수득하였다. 조산물은 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(5:1 v/v)를 이용한 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피를 실시하여 산물, 화합물 wang516-1 12 mg을 수득하였다(수율 30%).

동일한 공정으로, 트리플루오로아세트산을 이용하여 화합물 wang520 1 eq과 화합물 Boc-Ala-OH 2.0 eq의 반응 산물을 이용함으로써 화합물 wang591을 제조하였다(수율 18%).

실시예 4

화합물 wang568(11 mg, 0.02 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시키고, 10분간 -78 ℃에서 냉각시킨 다음, BCl₃/n-헥산 용액(1M) 0.2 mL을 첨가하여 -78 ℃에서 30분간 반응을 계속하였다. 이후, 온도를 -18 ℃로 상승시켜 4시간동안 반응시켰다. 반응을 중지시키기 위해 에테르 2 mL을 첨가하여 실온에서 30분간 교반한 다음, 물 5 mL을 첨가하였다. 수상과 유기상을 분리하였다. 수상은 디클로로메탄으로 추출하고, 유기상을 조합한 다음 무수 MgSO₄로 건조 및 농축하였다. 페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트(1/2 v/v)를 이용한 크로마토그래피로 조산물을 분리하여, 화합물 wang477을 수득하였다(1.5 mg, 수율 17%).

화합물 wang591(3 mg)을 디클로로메탄 1.5 mL에 용해시키고, 5분간 얼음조에서 냉각시킨 다음, 트리플루오로아세트산 0.15 mL을 첨가하였다. 이후, 온도를 실온으로 점차 올리고, TLC로 반응을 추적하였다. 원료 물질이 사라진 후, 펌핑에 의해 용매와 트리플루오로아세트산을 제거함으로써, 화합물 wang605 2 mg을 수득하였다(수율 65%).

실시예 4: 생물학적 활성에 대한 실험 테스트

1. 리포터 유전자의 발현 테스트

GLP-1R이 GLP-1 또는 작용제과 결합하면, 그것의 Gα서브유닛이 활성화되어 아데닐레이트 사이클라제를 자극하게 되고, 이로인해 세포내 cAMP 농도가 증가되게 된다. 프로인슐린 유전자의 프로모터 부위에 cAMP 반응 요소가 있으므로, 상기 반응 요소에 cAMP가 결합하면 β-섬 세포의 포도당 민감성을 증가시키기 위해 프로인 슐린 유전자의 전사가 활성화되고, 인슐린의 발현 및 분비가 향상된다(Diabetes, 2000, vol. 49: 1156 - 1164). 후보 화합물에 대한 반응을 보기 위해, cAMP 반응 요소의 조절하의 GLP-1R 유전자의 발현 벡터와 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현 벡터로 안정적으로 형질 감염된 인간 배아 신장 세포주를, 스크리닝 모델로 채택하였다(Cell Biology, 1992, Vol. 89: 8641-8645; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987. Vol.84: 3434-3438). 후보 화합물 스크리닝시, 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하도록 유도할 수 있는 화합물은 GLP-1을 활성화하는 활성을 가지는 것이다.

1.1 실험 재료 및 기기

세포주: GLP-1R 및 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 HEK 293/GLP1R+Luc 세포주(국립 신약 스크리닝 센터).

소태아혈청(GIBCO/BRL 코퍼레이션)

Steady-glo^TM 루시퍼라제 분석 시스템(프로메가 코퍼레이션)

표준 GLP-1(시그마 코퍼레이션)

G418(인비트로젠 코퍼레이션)

포르마(forma) 이산화탄소 배양기(포르마 코퍼레이션)

빅터 2 카운팅 기계(웰렉 코퍼레이션)

후보 화합물: 화합물 wang524, wang520, wang462, 2f, wang516, wang516-2, wang502 및 wang504.

1.2 실험 과정

HEK 293/GLP1R+Luc 세포를 20000 세포/100㎕/웰로 96-웰 플레이트에 접종하고, 10% 소태아혈청 및 G418 500 ㎍/ml을 포함하는 DMEM 배양 배지로 하룻밤동안 37 ℃에서 배양하였다. 후보 화합물 wang516-2, wang502 및 wang504를 각각 2 mM, 1 mM, 0.3 mM, 0.1 mM, 0.03 mM, 0.01 mM 및 0.003 mM로 희석하고, 다른 후보 화합물은 1:3의 비율로 8차례 30 mM에서부터 농도 구배(즉, 30 mM, 10 mM, 3 mM, 1 mM, 0.3 mM, 0.1 mM, 0.03 mM 및 0.01 mM)로 희석하였고, 상기 96웰 플레이트에 1 ㎕/웰로 첨가하였다. 이후, 세포는 5% 이산화탄소, 37 ℃에서 6시간동안 배양하였다. 루시퍼라제 활성은 Steady-glo^TM 루시퍼라제 분석 시스템 키트의 설명서에 따라 검사하였고, 빅터 2 카운팅 기계로 측정하였다. 양성 대조군으로는 표준 GLP-1 30 nM을 사용하였다.

1.3 실험 결과

후보 화합물에 대한 리포터 유전자의 실험 결과는 도 1 및 표 1에 나타낸다.

도 1은 화합물 wang520이 최종 농도 30 μM에서 화합물 2f의 활성에 비해 크게 향상된 최상의 상대적인 활성(94%)을 가짐을 보인다. 또한, 표 1에 나타낸 화합물은 GLP-1R의 활성에 대해 용량 의존성을 가지며, 화합물 wang520, wang516, wang554, wang488, wang516-2, wang502 및 wang504의 평균 유효량은 10 μM 미만이다. 이러한 결과는, 화합물의 GLP-1R과의 상호작용에 있어서의 우수한 구조를 결정하는 방향성을 제시한다.

표 1

화합물 번호	EC₅₀/μM
wang524	46.5
wang520	4.6
wang462	11.6
wang516	6.85
2f	13.0
wang866	54.41
wang554	5.24
wang488	6.73
wang516-2	6.06
wang502	3.31
wang504	4.87

2. 세포내 cAMP 농도 결정

리포터 유전자의 발현 검출에 의한 세포내 cAMP 농도 결정은 간접적인 방법이므로, 화합물이 세포내 cAMP의 농도를 확실하게 증가시킬 수 있다는 확신을 갖기위해 기능적 재검색을 cAMP-검출 키트로 직접 수행하였다.

2.1 실험 재료 및 기기

cAMP-검출 키트(Applied Biosystems Cooperation)

포르마(forma) 이산화탄소 배양기(포르마 코퍼레이션)

빅터 2 카운팅 기계(웰렉 코퍼레이션)

GLP-1R 및 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 HEK 293/GLP1R+Luc 세포주(국립 신약 스크리닝 센터)

후보 화합물: 화합물 2f

표준 cAMP(키트로 제공, Applied Biosystems Cooperation)

2.2 실험 과정

HEK 293 세포를 20000 세포/100㎕/웰로 96-웰 플레이트에 접종하고, 하룻밤동안 37 ℃에서 배양하였다. 화합물 2f를 디메틸 설폭사이드로 1.00E-03M, 1.00E-04M, 1.00E-05M, 1.00E-06M 및 1.00E-07M으로 희석하였고, 1l/웰로 상기 96웰 플레이트에 접종하여, 5% 이산화탄소, 37 ℃에서 1시간동안 배양하였다. cAMP-스크린 직접^TM 시스템 키트의 설명서에 따라 세포내 cAMP 농도를 검사하였다.

2.3 실험 결과

세포내 cAMP의 농도 결정 결과는 도 2에 나타낸다. 도 2에서 보여진 바와 같인, 화합물 2f의 농도 증가에 따라, 형성된 cAMP 농도는 기하급수적인 증가하였다. 이는 화합물 2f가 GLP-1R 작용제로서 GLP-1R의 신호 전달에 특정 효과를 가진다는 것을 나타내는 것이다. 화합물 2f의 농도를 30 μM 및 100 μM로 증가시켰을때, cAMP의 농도는 감소하는 경향을 보였으며, 이는 고농도의 화합물 2f의 세포독성 효과에 의한 것이다.

3. 리간드-결합 활성 테스트

화합물의 리간드에 대한 결합 활성을 결정하기 위해, GLP-1R을 고도로 발현하는 세포를 준비하였다. 후보 화합물에 첨가하면서, ¹²⁵I로 표지된 GLP-1을 리간드로 사용하였다. 후보 화합물이 ¹²⁵I로 표지된 GLP-1과 경쟁적으로 결합하는 경우, 세포막 상의 동위원소 표지물이 감소한다. 따라서, 후보 화합물의 리간드에 대한 친화성을 평가할 수 있다(J Mol Endocrinol. 2000 Vol. 25:321-35; J Biomol Screen, 2000 Vol. 5:377-84).

3.1 실험 재료 및 기기

HEK 293/GLP1R + Luc 세포주(국립 신약 스크리닝 센터)

표지된 화합물: ¹²⁵I로 표지된 GLP-1(아머샴 바이오사이언스 코퍼레이션)

월렉 마이크로바타 워크 스테이션(퍼킨 엘머 코퍼레이션)

톰테크 세포 컬렉턱(톰테크 코퍼레이션)

테스트 완충액:

20 mM 트리스-HCl(pH 7.4)(상하이 센공 생물공학기술 리미티드), 100 mM NaCl(상하이 화학시약 코퍼레이션), 15 mM NaF(상하이 화학시약 코퍼레이션), 2 mM 데옥시피리독신(시그마 코퍼레이션), 0.2 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(시그마 코퍼레이션), 어프로티닌(상하이 화학시약 코퍼레이션)(1 ㎍/ml) 및 루펩틴(상하이 화학시약 코퍼레이션)(1 ㎍/ml)

세정액:

20 mM 트리스-HCl(pH 7.4), 100 mM NaCl 및 15 mM NaF

신틸레이션 용액(월렉 코퍼레이션)

후보 화합물을 디메틸 설폭사이드를 이용하여 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM, 10000 nM 및 100000 nM의 농도로 희석하였다.

3.2 실험 과정

대수 성장기의 HEK293/GLP1R + Luc 세포 10⁵을 ¹²⁵I로 표지된 GLP-1 양성 펩티드(최종 40 pM 농도)와 함께 테스트 완충액 200 ㎕내에서, 비표지 양성 펩티드 또는 후보 화합물을 첨가하면서, 25 ℃에서 4시간동안 배양하였다. 세포 컬렉터로 세포를 수득하고, 세정액으로 3회 세정하였다. 신틸레이션 용액을 이에 첨가하고, 마이크로바타 카운터로 각 웰을 측정하였다.

3.3 실험 결과

표 3에 수용체-결합 실험 결과를 나타낸다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 화합물 2f는 GLP-1R에 대해 향상된 친화성을 가지지만 화합물 wang520 및 wang516의 친화성은 약하였으며, 그외 화합물은 실질적으로 테스트 농도 범위에서는 수용체에 결합하지 않았다.

표 3

화합물 번호	EC₅₀/μM
wang524	>100 μM
wang450	>100 μM
wang405	>100 μM
wang327	>100 μM
wang520	60 - 100 μM
wang462	>100 μM
wang866	>100 μM
wang516	40 - 80 μM
wang420	>100 μM
2f	31 μM

Claims

하기 구조식으로 표시되는 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제:

상기 구조식에서,

Ar₁ 및 Ar₂는 각각 독립적으로 페닐 또는 치환된 페닐이고, 상기 치환된 페닐의 치환기는 알킬; 하이드록실; 치환된 알콕실, 또는 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 알킬아미노; 치환된 알카노일옥시, 또는 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 알카노일아미노; 산소 또는 아민으로 치환된 탄소수 2-6의 알케닐, 페닐, 벤질, 탄소수 2 내지 6의 에노일, 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일, 벤조일, 알콕실 및 알카노일아미노를 포함하는 1, 2 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일, 벤질로일, 테노일, tert-부톡시카르보닐, 아다만탄 포름옥실 및 만델로일; 알콕실; 알킬아미노; 사이클로알콕실; 사이클로알킬아미노; 아미노; 아미드; 알콕시카르보닐; 사이클로알콕시카르보닐; 알카노일옥시; 알카노일아미노; 사이클로알카노일옥시; 사이클로알카노일아미노; 카르바미도; 유릴렌; 알카노일; 니트로; 카르복실; 및 알데하이드 기로부터 선택적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기이고;

X는 O, S 또는 NH이고,

Y는 O 또는 S이다.
제 1항에 있어서, Ar₁은 식 1로 표시되는 화합물이고, Ar₂는 식 2로 표시되는 화합물이거나 식 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제:

(식 1)

상기에서,

R₁은 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₁은 O 또는 NH이며,

(식 2)

R₂는 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₂는 O 또는 NH이며,

(식 3)

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₁은 O 또는 NH이고;

X₂는 O 또는 NH이다.
제 1항에 있어서, Ar₁은 식 4로 표시되는 화합물이고, Ar₂는 식 5로 표시되는 화합물이거나, 식 6으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제:

(식 4)

상기에서,

R₅ 및 R₆은 각각 독립적으로 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄 소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₁은 O 또는 NH이고;

X₂는 O 또는 NH이며,

(식 5)

R₂는 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₂는 O 또는 NH이며,

(식 6)

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X₁은 O 또는 NH이고;

X₂는 O 또는 NH이다.
식 7로 표시되는 화합물과 Ar₁CHO를 축합시키는 단계를 포함하는, 제 1항에 따른 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제의 제조 방법:

(식 7)

상기 식 7에서,

Ar₁ 및 Ar₂는 각각 독립적으로 페닐 또는 치환된 페닐이고, 상기 치환된 페닐의 치환기는 니트로; 카르복실; 알데하이드; tert-부톡시카르보닐 및 산소 또는 아미노로 치환된 테노일로부터 선택적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기이고,

X는 O, S 또는 NH이고,

Y는 O 또는 S이다.
제 4항에 있어서, 식 9로 표시되는 화합물과 트리플루오로아세트산의 반응 생성물과 R₁COX₄를 축합 반응시켜 식 8로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제의 제조 방법:

(식 8)

(식 9)

상기에서,

R₁, R₂ 및 R₃은 H; 알킬; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알킬; 탄소수 2 내지 6의 알케닐; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬; 페닐; 벤질; 알카노일; 할로겐, 알콕실 또는 하이드록실을 함유하고 있는 치환기를 포함하는 치환된 알카노일; 탄소수 2 내지 6의 에노일; 탄소수 3 내지 6의 사이클로알카노일; 벤조일; tert-부톡시카르보닐; 알콕실 또는 알킬아미노를 함유하고 있는 1개, 2개 또는 3개의 선택 치환기를 포함하는 치환된 벤조일; 벤질로일; 트레노일; 아다만탄 포름옥실; 및 만델로일 중 어느 하나이고;

X는 O, S 또는 NH이고;

Y는 O 또는 S이고;

X₁, X₂ 및 X₃은 각각 독립적으로 O 또는 NH이고;

X₄는 Cl 또는 OH이다.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 축합 반응에 사용된 용매는 디클로로메 탄, 아세트 무수화물, 테트라하이드로퓨란, 디메틸퓨란, 디클로로에탄, 톨루엔, 벤젠, 물, 디옥산 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제의 제조 방법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 반응 온도는 -78 ℃ 내지 실온이거나, 열처리 온도는 50 내지 230 ℃인 것을 특징으로 하는 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제의 제조 방법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 축합 반응에서 피리딘, 트리에틸아민, 디에틸프로필에틸 아민, DMAP, N-메틸모르폴린 또는 이소부틸 클로로포르메이트를 활성제로서 사용하는 것을 특징으로 하는 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제의 제조 방법.
제 1항에 따른 글루카곤계 펩티드-1 수용체 작용제의, 인슐린 둔감성 2형 당뇨병 또는 비만과 같은 탄수화물 대사 교란성 질환의 치료용 약제로서의 용도.