KR20060052877A - 암 치료용 약제를 제조하기 위한 ｐａｒｐ 활성을 억제하는ｒｎａｉ의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상동 재조합을 매개하는 유전자의 결함으로 인해 야기되는 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, DNA 가닥 절단의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 제제의 용도에 관한 것이다.

Description

암 치료용 약제를 제조하기 위한 ＰＡＲＰ 활성을 억제하는 ＲＮＡＩ의 용도{USE OF RNAI INHIBITING PARP ACTIVITY FOR THE MANUFACTURE OF A MEDICAMENT FOR THE TREATMENT OF CANCER}
본 발명은 특정한 암 형태, 특히 유방암의 치료 시, DNA 가닥 절단의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 제제의 용도에 관한 것이다.
상동 재조합(HR)은 포유동물 세포의 DNA 복제 포크(replication fork)에서 일어나는 손상을 복구하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다(2). 따라서, HR에 결함이 있는 세포는 성장 지연 및 더 높은 수준의 유전적 불안정성을 나타낸다. 인간 암에서 HR 복구의 소실로 인한 유전적 불안전성이 상기 세포에서의 암 발생에 상당한 영향을 미친다고 생각된다(1).
DNA 가닥 절단에 대한 폴리(ADP-리보실)화(PARP)에 의한 핵 단백질이 번역후 변형되는 것이 DNA 복구, 아폽토시스(apoptosis)의 조절 및 게놈 안정성의 유지에서 중요한 역할을 한다.
폴리(ADP-리보스)폴리머라제(PARP-1)는 NAD+를 기질로 사용하는 폴리(ADP-리보스(PAR) 중합체의 형성을 촉진하는, 포유동물 세포에 풍부하게 존재하는 핵 단백질이다. DNA의 손상 시, PARP-1이 DNA 가닥 절단(단일 가닥 또는 이중 가닥)에 빠 르게 결합하여, 그 자체(자가변형) 및 다른 단백질에 대해 음으로 전하된 PAR 쇄의 첨가를 촉진시킨다(리뷰를 위해 [3, 4] 참조). DNA 가닥 절단에 대한 PARP-1의 결합으로, PARP-1이 PAR 중합체로부터 생성된 축전된 음전하에 의한 절단으로 해리될 때까지, DNA 손상이 추가 프로세스로부터 보호된다고 생각된다(5, 6).
PARP-1이 여러 핵 프로세스, 예컨대 염색질 구조의 조절, DNA 복제, DNA 복구 및 번역과 관련된다 하더라도, PARP-1 녹아웃(knockout) 마우스는 정상적으로 발달한다(7). 이들 마우스에서 분리한 세포는 SCE, 소핵 및 4배체의 수준이 증가된 형태로 유전적 불안정성 및 과다 재조합 표현형(hyper recombination phenotype)을 나타낸다(8-10). 유전적 불안정성은 상기 PARP-1 녹아웃 마우스에서 텔로미어 단축, 증가된 염색체 융합 빈도 및 이수체를 통해 발생할 수도 있지만(11), 이들 결과 모두를 다른 세트의 PARP-1 녹아웃 마우스에서 반복할 수는 없었다(12). 전자의 마우스 녹아웃에서는, PARP-1 널 돌연변이(null mutation)가 SCID 마우스 내에서 손상된 V(D)J 재조합을 구해낸다(13).
이 결과는, PARP-1이 재조합에 대해 보호적 기능을 한다는 Lindahl과 그의 동료들이 제안한 관점을 지지한다(5). 이들은, DNA 가닥 절단에 대한 PARP-1의 결합으로 재조합 기전이 DNA 손상을 인지 및 프로세스하는 것을 방지하거나, 또는, 대안으로, 폴리 ADP-리보실화 후 축적된 음전하가 인접 재조합성 DNA 서열을 억제한다는 것을 제안하였다. 후자인 모델만이 SCE, 유전자 증폭 및 상동 재조합을 유도하는 우성 음성 돌연변이체 PARP-1의 발현 및 PARP-1 그 자체의 억제와 일치한다(HR [14-18]).
PARP 억제제를 이용한 세포의 치료, 또는 PARP-1 또는 PARP-2 녹아웃 마우스에서 유래된 세포의 치료에 기초한 연구는, PARP-1 활성을 저해하면 DNA 손상 제제에 대한 세포의 감수성이 증가하여, 가닥 절단 재결합이 억제된다는 것을 나타낸다(3, 4, 8-11, 19, 20, 47).
PARP-1 활성에 대한 억제제는 방사선요법 및 화학요법과 같은 종래의 항암제와 함께 사용되어 왔다(21). 이 억제제는 메틸화제, 토포이소머라제 독 및 이온화 방사선과 함께 사용되며, 이들 치료 형태의 효과를 증강시킨다는 것이 발견되었다. 그러나 상기 치료는 비암성 또는 "건강한" 세포에 대한 손상 및 사멸을 유도한다고 알려져 있으며, 불쾌한 부작용과도 관련이 있다.
따라서 암 세포 사멸에 효과적이고 선별적이며, 방사선요법 또는 화학요법 치료와 함께 투여할 필요없이 암을 치료하기 위한 필요성이 존재한다.
본 발명자들은 놀랍게도 야생형 세포에 비해 상동 재조합(HR)에 결함이 있는 세포가 PARP 억제제에 대해 과민하다는 것을 발견하였다. 이는 PARP-1 녹아웃 마우스가 정상적으로 생존하여 PARP-1이 생명 유지에 필수적인 것이 아니라는 점을 나타내기 때문에 놀라운 것이다. 따라서 세포가 PARP 억제에 민감할 것이라 예상할 수 없었다.
본 발명의 제1 측면에 따라, 상동 재조합을 매개하는 유전자의 유전자 결함으로 인해 야기되는 질병의 치료용 약제의 제조에 있어서의, DNA 가닥 절단의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 제제의 용도를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 상동 재조합을 매개하는 유전자의 유전자 결함으로 인해 야기되는, 인간을 비롯한 포유동물의 질병 또는 병태의 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 복제 포크에 존재하는 DNA 가닥 절단 또는 다른 손상의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 제제의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 측면에서, 상기 효소는 PARP이다. 다른 바람직한 측면에서, 상기 제제는 PARP 억제제 또는 PARP 유전자에 특이적인 RNAi 분자이다.
다른 바람직한 측면에서, 용도는 암 치료에서의 용도이다.
바람직하게, 약제는 약학적 허용 담체 또는 희석제와 함께 PARP 억제제로 이루어진 약학 조성물이다.
PARP-1 억제에 대한 HR 결함성 종양의 특이적인 민감성이란, 정상적으로 분열하는 환자 세포는 치료에 영향을 받지 않을 것이라는 것을 의미한다. PARP 억제제를 사용하는 HR 결함성 암 세포의 치료는, 종래의 방사선요법 또는 화학요법 치료와 함께 조합 요법으로서 투여할 필요가 없어, 이들 종래 형태의 치료와 관련된 부작용을 피할 수 있다는 장점을 가진다.
상동 재조합을 매개하는 유전자의 유전적 결함은 HR과 관련된 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이, 유전자의 부재, 또는 유전자의 결함성 발현으로 인한 것일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 HR 결함성 세포의 아폽토시스를 유도하기 위한 약제의 제조에 있어서의, PARP 억제제의 용도를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 HR 결함성 세포의 아폽토시스를 유도하기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은 PARP 억제제의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함한다.
HR 결함성 세포의 아폽토시스를 야기함으로써, 포유동물에서 종양 성장을 감소시키거나 정지시킬 수 있다.
바람직하게, HR 결함성 세포는 암 세포이다.
HR에 결함이 있는 암 세포는 HR에 부분적으로 또는 완전히 결함이 있을 수 있다. 바람직하게, 암 세포는 HR에 완전히 결함이 있다.
용어 "암" 또는 "종양"은 폐암, 결장암, 췌장암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 유방암 또는 전립선암을 포함한다. 이 암은 피부암, 신장암, 간암, 방광암 또는 뇌암도 포함할 수 있다. 바람직한 측면에서, 암은 포유동물의 암, 바람직하게는 인간의 암이다.
치료되는 암은 암의 유전형일 수 있는데, 이 때 치료를 받는 환자는 암에 대한 가족성 소인을 가질 수 있다. 바람직하게, 치료되는 암은 유전자와 관련된 유전성 암이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 암은 유전자와 관련된 유전성 유방암이다.
바람직한 측면에서, PARP 억제제는 HR과 관련된 유전자의 발현에 결함이 있는 암 세포의 치료에 유용하다. 소정의 HR 기능을 가진 유전자로는 XRCC1, ADPRT(PARP-1), ADPRTL2(PARP-2), CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NBS1, WRN, BLM, Ku70, Ku80, ATM, ATR, chk1, chk2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, RAD9, FEN-1, Mus81. Eme1, DDS1, BARD를 포함한다(리뷰를 위해 (2, 3, 5, 22∼28) 참조).
HR과 관련된 유전자는 종양 억제 유전자일 수 있다. 따라서 본 발명은 종양 억제 유전자의 발현에 결함이 있는 암 세포의 치료에 관한 것이다. 바람직하게, 종양 억제 유전자는 BRCA1 또는 BRCA2이다 .
유방암은 오늘날 서구 세계의 여성에게서 가장 보편적인 암 질환이다. 어떤 가족은 유방암에 대한 강한 소인을 갖고 있는데, 이는 종종 BRCA1 또는 BRCA2의 한 대립 유전자의 유전성 돌연변이 때문이다. 그러나 이들 환자는 다른 하나의 기능성 대립 유전자는 보유하고 있다. 따라서 이들 환자는 정상적으로 발달하며, 이 돌연변이로 인한 표현형은 나타내지 않는다. 그러나 한 세포에서 기능성 대립 유전자가 소실되어, 이 세포를 암성으로 만드는 동시에 상동 재조합(HR)에 결함을 가져올 수 있다. 이것이 종양 발병의 중요한 단계이다(1).
본 발명자들은 놀랍게도 야생형 세포에 비해 BRCA2 결함성 세포가 PARP 억제제인 NU1025의 세포 독성에 대해 100배 이상 민감하다는 것을 발견하였다.
따라서 바람직한 측면에서, 본 발명은 예컨대 BRCA1 및/또는 BRCA2 발현의 소실로 인해 HR에 결함이 있는 암 세포를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, PARP 억제제의 용도를 제공한다.
치료되는 암 세포는 BRCA1 또는 BRCA2 발현에 부분적으로 또는 전체적으로 결함이 있을 수 있다. BRCA1 및 BRCA2 돌연변이는 다양한 PCR 기법, 배열 기법(29, 30) 또는 당업자에게 공지되어 있는 다른 스크리닝 기법을 사용하여 확인할 수 있다.
본 발명에서 유용한 PARP 억제제는 PARP-1, PARP-2, PARP-3, PARP-4, 탄키라제 1 또는 탄키라제 2의 억제제 중에서 선택할 수 있다(리뷰를 위해 31을 참조). 바람직한 구체예에서, 본 발명에 유용한 PARP 억제제는 PARP-1 활성의 억제제이다.
본 발명에 유용한 PARP 억제제는 벤즈이미다졸-카르복사미드, 퀴나졸린-4-[3H]-온 및 이소퀴놀린 유도체(예, 2-(4-히드록시페닐)벤즈이미다졸-4-카르복사미드(NU1085), 8-히드록시-2-메틸퀴나졸린-4-[3H]온(NU1025); 6(5H)페난트리디논; 3 아미노벤자미드; 벤즈이미다졸-4-카르복사미드(BZ1-6) 및 트리시클릭 락탐 인돌(TI1-5)을 포함한다[32]. PARP의 추가 억제제는 고안에 의해[33] 또는 신규한 FlashPlate 분석에 의해[34] 확인할 수 있다.
약학 조성물로 제형화된 PARP 억제제는, 예를 들어, 특히 경구, 정맥내, 근내, 피내, 비내, 국소 경로로 투여하는 것을 비롯하여, 암 세포를 표적으로 하기에 효과적이면서도 편리한 방식으로 투여할 수 있다. 약학 조성물로 유용한 담체 또는 희석제는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
요법 또는 예방용으로, 주사 가능 조성물(예, 멸균 수성 분산액)로서 활성제를 개체에 투여할 수 있다. 억제제는 종양에 직접 투여하거나, 또는 종양을 표적으로 하여 전신 투여할 수 있다.
억제제의 치료적 유효량은 통상적으로 소정의 효과를 얻기에 충분한 양으로, 질병 상태의 특징 및 심각성, 및 억제제 효능에 따라 다를 수 있다. 활동성 질병의 치료용이라기보다 예방용으로 상이한 농도를 사용하는 것이 바람직할 것이다.
포유동물, 특히 인간에 투여하기 위한 활성제의 1일 투여 수준은 최대 100 ㎎/㎏으로, 예를 들어 O.O1∼50 ㎎/㎏ 체중, 통상적으로는 최대 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10, 15, 20 또는 30 ㎎/㎏ 체중일 것이라 예상된다. 그러나 궁극적으로 투여되는 억제제의 양과 투여 횟수는 담당 의사의 재량으로 정해질 것이다.
암 세포를 치료하기 위해 PARP 억제제를 사용하는 것의 치료적 이점은, 암 치료 시 치료 효과를 얻기 위해 단지 소량의 투여량만이 필요하여, 억제제의 전신성 보강(build up) 및 임의의 관련된 독성 효과를 감소시키는 것이다.
본 발명의 바람직한 측면은 억제성 RNA(RNAi) 분자인 제제를 제공하는 것이다.
유전자 기능을 특이적으로 제거하는 기법은 억제성 RNA(RNAi)라고도 불리는 이중 가닥 RNA를 세포에 도입하여, 이 RNAi 분자에 포함된 서열에 상보적인 mRNA를 파괴시키는 것이다. RNAi 분자는 서로 어닐링(annealing)하는 2개의 상보적인 RNA 가닥(센스 가닥(sense strand) 및 안티센스 가닥(antisense strand))을 포함하여 이중 가닥의 RNA 분자를 형성한다. 통상적으로 RNAi 분자는 제거되는 유전자의 엑손 서열 또는 코딩 서열로부터 유래된다.
바람직하게, 상기 RNAi 분자는 핵산 분자로부터 유래되는데, 이 핵산 분자는,
a) 도 9, 10, 11, 12, 13 또는 14의 서열로 나타내어지는 핵산 서열 또는 이의 단편;
b) 도 9, 10, 11, 12, 13 또는 14의 핵산 서열에 하이브리드화하고, PARP에 대한 유전자를 코딩하는 핵산 서열; 또는
c) 상기 (a) 및 (b)에 정의된 핵산 서열에 대한 유전자 코드의 결과로서 축퇴(degenerate)된 서열을 포함하는 핵산 서열
로 이루어지는 군에서 선택된 핵산 서열을 포함한다.
최근 연구에서, 코딩 서열로부터 유래된 100∼1,000 bp 범위의 RNAi 분자가 유전자 발현의 효과적인 억제제라는 것이 제시되었다. 놀랍게도, 단지 몇 개의 RNAi 분자만이 유전자 발현을 차단하기 위해 필요한데, 이는 기작이 촉매 작용성이라는 것을 의미한다. 작용 부위는 핵으로 드러났는데, 이는 임의의 RNAi가 세포의 세포질 중에서 검출가능할 경우, RNAi가 mRNA 합성 또는 프로세스 도중 이의 효과를 보인다는 것을 나타낸다.
더 바람직하게, 상기 RNAi 분자의 길이는 10∼1,000 nb(뉴클레오티드 염기)이다. 더 바람직하게, 상기 RNAi 분자의 길이는 1O nb; 20 nb; 30 nb; 40 nb; 50 nb; 60 nb; 70 nb; 80 nb; 90 nb; 또는 1OO bp이다. 더 바람직하게, 상기 RNAi 분자의 길이는 21 nb이다.
더 바람직하게, RNAi 분자는 핵산 서열 aaa agc cau ggu gga gua uga를 포함한다(PARP-1).
더 바람직하게, RNAi 분자는 핵산 서열 aag acc aau cuc ucc agu uca ac로 이루진다(PARP-2).
더 바람직하게, RNAi 분자는 핵산 서열 aag acc aac auc gag aac aac로 이루어진다(PARP-3).
RNAi 분자는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다.
본 발명의 각 측면의 바람직한 특징은 다른 필요한 변경을 가한 다른 측면의 각 특징과 같다.
이제 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 설명할 것이다:
도 1은 HR 결함성 세포가 PARP-1의 억제로 인해 야기되는 독성 효과에 대해 과민하다는 것을 나타내는 그래프이다. 3-AB(A), ISQ(B) 또는 NU1025(C)에 대한 노출 시 차이니스 햄스터 세포주 AA8(야생형), irs1SF(HR의 결함[4]), CXR3(XRCC3로 보완된 irs1SF[2]), V79(야생형), irs1(HR의 결함[5]) 또는 irs1X2.2(XRCC2로 보완된 irs1[1])의 콜로니 성장. 3회 이상의 실험의 평균값(심볼) 및 표준 편차(바(bar))가 도시되어 있다. 콜로니 성장 분석을 사용하였다;
도 2는 야생형 V79 세포, BRCA2 결함성 VC-8 세포, 및 기능성 BRCA2 유전자로 보완된 VC-8 세포(VC-8#13, VC-8+B2) 중 PARP 억제제 NU1025의 존재 하에 세포 생존을 나타내는 그래프이다. 콜로니 성장 분석을 사용하였다;
도 3은 NU1025와의 72시간 항온배양한 뒤 아폽토시스된 세포를 백분율로 나타낸 히스토그램이다;
도 4. (a) siRNA로 48시간 형질감염시킨 MCF-7(p53wt) 또는 MDA-MB- 231(p53mut) 유방암 세포에서 분리한 단백질 용해물의 웨스턴 블롯 분석. (b) siRNA-처리된 MCF-7 세포의 콜로니 성장, 또는 (c) PARP 억제제 NU1025에 노출시킨 MDA-MB-231 세포의 콜로니 성장. 3회 이상의 실험의 평균값(심볼) 및 표준 편차(바)가 도시되어 있다.
도 5. BRCA2 결함성 세포는 PARP의 억제제에 의해 복제 포크에서 형성된 재조합 손상을 복구하지 못한다. (a) 펄스-필드 겔 전기 영동에 의한, NU1025(0.1 mM)로 24시간 처리한 BRCA2 능숙(proficient) 또는 결함성 세포 중 이중 가닥 절단(DSB)의 시각화. 히드록시우레아 2 mM을 양성 대조군으로 사용하였다. (b) 미처리된 V-C8+B2 및 V-C8 세포 중 γH2Ax 병소의 시각화. NU1025(10 μM)로 24시간 처리한 V-C8+B2 및 V-C8 세포 중 시각화된 γH2Ax 병소(c) 또는 RAD51 병소(d)를 포함하는 세포의 수. 3∼9회의 실험의 평균값(심볼) 및 표준 편차(바)가 도시되어 있다. 세포 사멸에 대해 제시된 모델은 BRCA2 결함성 세포에서 유도하였다.
도 6. BRCA2의 부재 하에 사멸을 야기하는, 재조합성 손상의 형성을 방지하는 데 PARP-1은 중요하지만, PARP-2는 중요하지 않다. (a) 48시간 동안 나타낸, BRCA2, PARP-1 및 PARP-2 siRNA의 조합으로 처리한 SW480SN.3 세포로부터 분리된 RNA에 대한 RT-PCR. (b) BRCA2, PARP-1 및 PARP-2 고갈 48시간 후 클론원성 생존율. 3회 이상의 실험의 평균값(심볼) 및 표준 편차(바)가 도시되어 있다. 2개 또는 3개의 별표(** 또는 ***)는 각각 t-시험에서 p < 0.01 및 p < 0.001의 통계학적 유의성을 나타낸다. (c) 상이한 siRNA로 처리한 SW480SN.3 세포 중 PARP-1에 대한 웨스턴 블롯.
도 7. (a) 미처리된 V79 세포 중 PAR 중합체의 시각화 및 (b) 티미딘으로 처리된 V79 세포 중 PAR 중합체의 시각화(24시간 동안 5 mM). (c) 히드록시우레아(0.2 mM) 및 티미딘(5 mM)으로 처리한 뒤 > 10 부위의 PARP 활성을 포함하는 세포(%). 각 처리 및 실험에 대해 300개 이상의 핵을 계수하였다. (d) 히드록시우레아 또는 (e) 티미딘 및 NU1025(10 μM)로 공-처리한 V-C8+B2 세포의 생존율. (f) PARP의 활성은 MMS, 히드록시우레아(0.5 mM) 또는 티미딘(10 mM)으로 처리한, 유리 NAD(P)H11의 수준으로 측정하였다. 3회 이상의 실험의 평균값(심볼) 및 표준 편차(에러 바)가 도시되어 있다.
도 8. (a) 미처리된 V-C8 및 (b) V-C8+B2 세포 중 PAR 중합체의 시각화. (c) 미처리된 V-C8 및 V-C8+B2 세포 중 > 10 부위의 PARP 활성을 포함하는 세포(%)의 정량화. (d) 미처리된 V-C8 및 V-C8+B2 세포 중에서 측정한 NAD(P)H의 수준. 별표 3개(***)는 t-시험에서의 p < 0.001를 나타낸다. (e) 24시간 티미딘(5 mM)으로 처리한 V79 세포 중 RAD51 및 PARP 활성 부위의 시각화. (f) 정지된(stalled) 복제 포크에서의 PARP 및 HR의 역할 모델.
도 9는 PARP-1의 인간 cDNA 서열이다;
도 10은 PARP-2의 인간 cDNA 서열이다;
도 11은 PARP-3의 인간 cDNA 서열이다;
도 12는 탄키라제 1의 인간 gDNA 서열이다;
도 13은 탄키라제 2의 인간 mRNA 서열이다;
도 14는 VPARP의 인간 mRNA 서열이다.
물질 및 방법
HR-결함성 세포에 대한 PARP 억제제의 세포 독성: XRCC2. XRCC3 또는 BRCA2
세포 배양
irs1, irs1X2.1 및 V79-4 세포주는 John Thacker로부터 기증받은 것이고[40], AA8, irs1SF 및 CXR3 세포주는 Larry Thompson에게서 제공받았다[41].
VC-8, VC-8+B2, VC-8#13은 Malgorzata Zdzienicka가 기부하였다[42]. 본 연구에 사용된 모든 세포주는 CO2 5%를 함유하는 대기 하에 37℃에서 스트렙토마이신 설페이트(100 ㎍/mL) 및 페니실린(100 U/ml) 및 태아 소 혈청 10%를 가진 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 생장시켰다.
독성 분석 - 콜로니 성장 분석
3-AB, ISQ 또는 NU1025를 첨가하기 4시간 전 배지 내에 현탁된 500개의 세포를 페트리 디시에 플레이팅하였다. ISQ 및 NU1025는 처리 배지 중의 최종 농도가 0.2%가 되도록 DMSO 중에 용해시켰다. 7∼12일 후, 콜로니를 관찰할 수 있을 때, 이들 콜로니를 메탄올(4 g/ℓ) 중에 고정시켜 메틸렌 블루로 염색하였다. 그 뒤 50개 이상의 세포로 이루어진 콜로니를 계수하였다.
아폽토시스 실험
0.25 x 106개의 세포를 페트리 디시에 플레이팅하고, NU1025로 처리하기 전 4일간 생장시켰다. 72시간 후, 세포를 트립신화하고, 상기 샘플로부터의 임의의 부 유 세포를 함유하는 배지로 재현탁시켰다. 세포는 원심 분리하여 펠릿화하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 아폽토시스 분석을 위해 FITC-접합된 아넥신-V 및 프로피듐 요오드(PI)(ApoTarget, Biosource International)를 이용하여 재현탁시켰다. 샘플은 유세포 분석기(Becton-Dickenson FACSort, 488 nm 레이저)로 분석하고, 아폽토시스 세포의 백분율은 FITC-접합된 아넥신-V와 결합한 생세포(PI-음성)의 분획에 의해 측정되었다.
면역 형광법
나타낸 바와 같이 24시간 처리하기 4시간 전 세포를 커버슬립 위에 플레이팅하였다. 처리 후, 배지를 제거하고, 커버슬립은 37℃에서 PBS에서 1회 세정하고, 다른 문헌[2]에서 언급한 바와 같이 고정시켰다. 이 연구에서 사용된 1차 항원 및 희석도는 다음과 같다; 래빗 폴리클로날 항 PAR(Trevigen; 1:500), 염소 폴리클로날 항 Rad51(C-20, Santa Cruz; 1:200) 및 래빗 폴리클로날 항 Rad51(H-92, Santa Cruz; 1:1000). 2차 항원은 Cy-3-접합된 염소 항-래빗 IgG 항체(Zymed; 1:500), Alexa 555 염소 항-래빗 F(ab')2 IgG 항체(Molecular Probes; 1:500), Alexa 546 당나귀 항-염소 IgG 항체(Molecular Probes; 1:500) 및 Alexa 488 당나귀 항-래빗 IgG 항체(Molecular Probes; 1:500)였다. 항체는 3% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS 중에 희석시켰다. DNA는 1 ㎍/ml To Pro(Molecular Probes)로 염색하였다. 영상은 플라나포크로마트(planapochromat) 63X/NA 1.4 유침 대물렌즈 및 여기 파장 488 nm, 546 nm 및 630 nm를 사용하는 Zeiss LSM 510 역상 다중초점 현미경을 이용하여 얻었다. 포커스 최대 방사(focus maximum projection)를 통해, 절편 두께가 1.0 ㎛인 0.50 ㎛ 떨어진 광학 절편으로부터 영상을 얻었다. 영상은 Adobe PhotoShop(Abacus Inc)을 사용하여 프로세싱하였다. 각 슬라이드에서 300개 이상의 핵을 계수하였고, 10개 이상의 RAD51 병소 또는 PARP 활성 부위를 포함하는 핵은 양성으로 분류하였다.
PARP 활성 분석
수용성 테트라졸륨 염(WST-8 5 mM)을 사용하여 NAD(P)H의 환원 중 황색으로 착색된 포르마잔 염료에 대한 NAD(P)H의 양을 모니터링하였다[43]. 5000개의 세포를 96 웰 플레이트의 웰에 3중으로 플레이팅하고, 37℃에서 4시간 동안 정상 성장 배지 100 ㎕ 중에서 배양하였다. 그 뒤 소정의 농도에서 DNA 손상 제제로 처리하거나 처리하지 않고 WST-8을 함유하는 CK8 완충액(Dojindo Molecular Technology, Gaithersburg, USA)을 첨가하였다. NAD(P)H의 존재 하에 WST-8의 환원도는 매 30분 마다 가시 흡광도(OD450)를 측정하여 결정하였다. 단지 배지와 CK8 완충액만을 함유하는 대조군 배지(medium blank)도 제조하였다. DNA 손상 제제로 처리한 세포 및 DMSO만으로 처리한 세포를 함유하는 웰의 흡광도를 비교하여 NAD(P)H 수준의 변화를 계산하였다. 대안으로 CK8 완충액 중에서 4시간 항온처리한 뒤 상이한 세포주 중 NAD(P)H의 상대적인 수준을 계산하였다.
또한 PARP-1 활성을 억제하기 위한 NU1025의 능력은 Halldorsson 등의 방법[44] 및 다른 참조문헌[45]에 상세히 설명되어 있는 방법을 변경하여 투과성 세포에서 분석하였다. 요컨대, NU1025-처리된(15분) 투과성 세포 300 ㎕는 총 부피 400 ㎕ 중 올리고뉴클레오티드(최종 농도 2.5 ㎍/㎖), NAD + [32P] NAD(Amersham Pharmacia, Amersham, UK) 75 μM로 26℃에서 항온처리하였다. Whatman GF/C 여과기(LabSales, Maidstone, UK)로 여과하기 전 60분간 아이스 콜드(ice cold) 10% TCA 10% Na Ppi를 첨가하여 5분 뒤 종결시키고, 1% TCA 1% Na PPi로 6회 세정하고, 건조하도록 그대로 둔 뒤, 혼입된 방사능을 측정하여 PARP-1 활성을 결정하였다. 데이터는 [32P] NAD 표준을 참조하여 혼입된 pmol NAD/106 세포로 나타낸다.
펄스-필드 겔 전기영동
1.5 x 106개의 세포를 100 mm 디시에 플레이팅하였고, 결합하도록 4시간 동안 두었다. 세포를 트립신화하고 106개의 세포를 각각 1% 아가로스 삽입물로 용해시킨 뒤 18시간 동안 약물에 노출시켰다. 이들 삽입물은 다른 문헌(8)에 기재된 바와 같이 항온처리하고, 24시간 동안의 펄스-필드 겔 전기영동으로 분리하였다(BioRad; 각도 120°, 변경 시간(switch time) 60∼240초, 4 V/cm). 그 뒤, 분석을 위해 겔을 EtBr로 염색하였다.
siRNA 처리
사전 고안된 BRCA2 SMARTpool 및 스크램블(scramble) siRNA를 구입하였다(Dharmacon, Lafayette, CO). 10,000개의 세포를 6개의 웰 플레이트에 뿌리고, 밤새 그대로 둔 뒤, 제조업자의 지시에 따라 Oligofectamine 제제(Invitrogen)를 사용하여 siRNA 100 nM로 형질감염시켰다. 그 뒤, 세포는 트립신화 전 48시간 동안 정상 성장 배지에서 배양하고, 독성 분석을 위해 재플레이팅하였다. BRCA2의 억제는 BACA2에 대한 항체와 siRNA로 처리한 단백질 추출물을 웨스턴 블로팅(상기함[46])하여 확인하였다(Oncogene, Nottingham, UK).
실시예
상동 재조합 결함성 세포는 PARP-1 억제에 대해 과민하다
PARP-1의 억제에 대한 세포 반응에서 HR과의 관련성을 조사하기 위해, HR 복구 결함성 세포주의 생존율에 대한 PARP-1 억제제의 효과를 연구하였다. HR에 결함이 있는 세포(즉, XRCC3에 결함이 있는 irs1SF, 또는 XRCC2에 결함이 있는 irs1[표 1 참조]은 3-아미노벤자미드(3-AB)의 독성 효과 및 PARP-1:1,5-디히드록시이소퀴놀린(ISQ; [37]) 또는 8-히드록시-2-메틸퀴나졸론(NU1025[38, 39])의 둘 이상의 효능있는 억제제에 대해 매우 민감하다는 것을 발견하였다(도 1). 3-AB, ISQ 또는 NU1025에 대한 irs1SF 세포의 민감도는 기능성 XRCC3 유전자(CXR3)를 함유하는 코스미드(cosmid)의 도입으로 교정(correct)하였다. 유사하게, 3-AB, ISQ 또는 NU1025에 대한 irs1 세포의 민감도는 기능성 XRCC2 유전자(irs1X2.2)를 함유하는 코스미드의 도입으로 교정하였다.
BRCA2 결함성 세포는 PARP-1 억제에 대해 과민하다
PARP-1 억제제의 존재 하에 BRCA2 결함성 세포(VC8) 및 야생형 세포(V79Z)의 생존율을 조사하였다. VC8 세포는 NU1025의 독성 효과에 대해 매우 민감하다는 것을 발견하였다(도 2). VC8 세포의 민감도는 염색체 13(VC8#13) 또는 과발현 벡터(VC8+B2) 상에 기능성 BRCA2 유전자를 도입하여 교정하였다. 이 결과는, PARP-1 억 제제에 대한 민감도가 BRCA2 기능의 소실에 대한 직접적인 결과임을 입증하는 것이다.
PARP-1을 억제하는 것이 BACA2 결함성 세포의 아폽토시스를 유발하는지를 조사하기 위해, NU1025에 대한 노출 72시간 후에 아폽토시스 수준을 조사하였다. NU1025는 단지 VC8 세포에서만 아폽토시스를 유발한다는 것을 발견하였는데, 이는 BRCA2 결함성 세포에서의 PARP-1 활성의 소실이 세포의 사멸을 유발한다는 것을 입증하는 것이다(도 3).
BRCA2 결함성 유방암 세포는 PARP-1 억제에 대해 과민하다
MCF7(야생형 p53) 및 MDA-MB-231(돌연변이된 p53) 유방암 세포주가 BRCA2의 고갈 시 NU1025에 대해 유사한 민감도를 나타내는 지를 실험하였다. BRCA2가 BRCA2 siRNA의 혼합물로 고갈될 경우에만 PARP 억제제가 MCF7 및 MDA-MB-231 세포의 생존율을 크게 감소시킨다는 것을 발견하였다(도 4). 이는 BRCA2가 고갈된 유방암 세포가 p53 상태와는 무관하게 PARP 억제제에 대해 민감함을 나타내는 것이다.
BRCA2 결함성 세포는 DNA 이중 가닥 절단(DSB)의 부재 하에, 그러나 γH2Ax의 존재 하에 PARP-1 억제로 인해 사멸한다
HR은 DNA 복제 도중 일어나는 DSB 및 다른 손상의 복구와 관련이 있는 것으로 알려져 있다[2]. BRCA2 결함성 세포의 민감성으로 인해 NU1025로 처리한 뒤 DSB를 복구할 수 없다는 결과를 확인하고자, 높은 독성 수준의 NU1025로 처리한 뒤 V79 및 V-C8 세포 중의 DSB 축적도를 측정하였다. 처리된 세포에서 얻은 DNA의 펄스-필드 겔 전기영동 분석으로는 DSB를 검출할 수 없다는 것을 발견하였는데(도 5A), 이는 낮은 수준의 DSB 또는 다른 재조합성 기질이 γH2Ax를 유발하는 HR 결함성 세포에서의 PARP 억제 후에 축적된다는 것을 뜻한다(도 5B). BRCA2 결함성 세포가 이러한 재조합성 손상의 유도로 사멸하는 것은 이러한 손상을 복구할 수 없기 때문인 것 같다. 이를 시험하기 위해, NU1025에 대한 반응으로 RAD51 병소를 형성하는 BRCA2 결함성 V-C8 세포 및 BRCA2 상보성 세포의 능력을 측정하였다. 실제로 NU1025를 이용한 처리로 RAD51 병소가 V-C8+B2 세포에서 유도된다는 것은 밝혀져 있다(t-시험 p < 0.05로 통계학적으로 유의적임; 도 5D). 이는 재조합성 손상이 상기 세포에서 HR 복구를 유발하여, 이들 세포를 생존시킬 수 있음을 나타낸다. 대조적으로, BRCA2 결함성 V-C8 세포는 NU1025 처리에 대해 RAD51 병소를 형성할 수 없는데(도 5D), 이는 HR이 없음을 나타내는 것으로, 재조합성 손상을 남겨 세포 사멸을 유도할 것이다.
PARP-2가 아니라 PARP-1이 재조합성 손상의 형성을 방지하는 데 중요하다
포유동물 세포의 핵 중에는 2가지의 주요 PARP, 즉, PARP-1 및 PARP-2가 존재하며, 모든 보고된 PARP 억제제가 이 둘을 억제한다. PARP가 효과를 초래하는 지를 구별하기 위해, 본 발명자들은 PARP-1 및/또는 PARP-2의 부재가 독성 손상을 축적하는지를 인간 세포에서 siRNA와 BRCA2 및 병소를 고갈시켜 시험하였다(도 6a). 본 발명자들은, 클론원성 생존율이 PARP-1 및 BRCA2 단백질 둘 다 인간 세포로부터 함께 고갈될 때 유의적으로 감소한다는 것을 발견하였다(도 6b). BRCA2와 PARP-2의 고갈은 클론원성 생존율에 영향을 주지 않았으며, PARP-1 및 BRCA2 고갈된 세포에서의 PARP-2의 고갈은 추가 독성을 야기하지 않았다. 이들 결과는, PARP-2가 아니 가 PARP-1이 인간 세포에서 독성 재조합성 손상을 감소시킨다는 것을 보여준다. 클로닝 효능은 PARP-1 및 BRCA2가 함께 고갈된 세포에서 단지 대조군의 60%로 감소하였지만, HR 결함성 세포는 PARP 억제제를 이용한 처리로 생존하지 않았다. 이는 충분한 PARP-1 단백질의 siRNA에 의한 불완전한 고갈로 인한 것일 수 있는데(도 6c), 이는 세포 몇몇에서 PARP-1 기능을 유지하는 데 충분할 수 있다.
PARP-1은 복제 억제제에 의해 활성화된다
HR은 또한 정지된 복제 포크에서 발생하는 손상의 복구와 관련있는데, 이는 검출할 수 있는 DSB와는 관련이 없을 수 있다[2]. PARP가 복제 포크에서 역할을 하는지를 시험하기 위해, DNA 복제 포크의 진행을 저지하거나 정지시키는 제제(티미딘 또는 히드록시우레아)로 세포를 처리하여 세포에서의 PARP 활성을 실험하였다. 티미딘은 세포의 dCTP를 고갈시켜, DSB를 야기하지 않는 복제 포크를 느리게 한다. 히드록시우레아는 다수의 dNTP를 고갈시켜, 복제 포크를 차단하는데, 이는 복제 포크에서 DSB가 형성되는 것과 관련이 있다[2]. 상기 제제 둘 다 HR을 효능있게 유도한다[2]. 티미딘 또는 히드록시우레아로 24시간 동안 처리한 V79 햄스터 세포를 PAR 중합체에 대해 염색하였다. 이는 PARP 활성 부위를 포함하는 세포수를 실질적으로 증가시키는 것으로 드러났다(도 7C). 이 결과는, 정지된 복제 포크에서의 PARP 기능을 제시한다. 또한 NU1025를 이용한 PARP의 억제는 V-C8+B2 세포에서 티미딘 또는 히드록시우레아에 대한 민감도를 증강시킨다는 것을 나타냈다(도 7D, 7E). 이 결과는, PARP 활성이 정지된 복제 포크의 복구에 중요하거나, 대안으로 정지된 복제 포크를 가진 세포에서 사멸의 유도를 방지한다는 것을 뜻한다.
PARP는 DNA 단일 가닥 절단(SSB)에서 빠르게 활성화되어, DNA 복구 효소를 끌어들인다[3∼6]. 메틸메탄 설포네이트(MMS)는 DNA의 알킬화를 야기하는데, 이는 염기 절제 복구에 의해 복구된다. PARP는 이 복구 도중 형성된 SSB-중간체에 의해 빠르게 활성화되는데, 이는 NAD(P)H 수준을 고갈시킨다(도 7F). 본 발명자들은 PARP의 활성화 및 NAD(P)H 수준의 환원이 이어지는 티미딘 또는 히드록시우레아 처리를 더 느리게 한다는 것을 발견하였다. 이러한 느린 PARP 활성화는 티미딘 및 히드록시우레아의 간접 작용, 및 세포가 세포 주기 중 S 단계에 들어설 때 정지된 복제 포크를 축적하는 데 필요한 시간에 의해 설명할 수 있다.
PARP-1 및 HR은 정지된 복제 포크에서 별도의 역할을 한다
미처리된 BRCA2 결함성 V-C8 세포의 PARP 활성 부위 수를 측정하였다. V-C8+B2 세포에 비해 더 많은 V-C8 세포가 PARP 활성 부위를 함유하고 있음을 발견하였다(도 8A, B, C). 또한, V-C8 세포는 교정된 세포보다 유리 NAD(P)H 수준이 더 낮았는데(도 8D), 이는 증가된 PARP 활성의 결과인 듯하다. 중요한 것은, 이들 PARP 활성 부위는 RAD51 병소와 겹치지 않는다는 것이다(도 8E).
본원의 이러한 결과는, PARP 및 HR이 정지된 복제 포크의 보호 또는 구조 시 별도의 역할을 한다는 것을 제시한다(도 8F). PARP 활성의 소실은 증가된 HR로 보완할 수 있으나, HR의 소실은 증가된 PARP 활성으로 보완할 수 있다. 그러나 이들 둘 모두의 경로 소실은 정지된 복제 포크의 축적을 유도하여 사멸에 이르게 하는데, 이는 PARP가 BRCA2 결함성 세포를 억제하는 경우이다.
도 8F에 개략화된 모델에서 나타낸 바와 같이, PARP 및 HR은 정지된 복제 포 크에서 상호 보완적인 역할을 한다. (i) 복제 포크는, DNA 주형 상에서 장애물과 만날 때 정지할 수 있다. 또한, 이는 dNTP의 부족 또는 다른 복제 조인자(co-factor)의 부족으로 인해 일시적으로 정지할 수도 있다. (ii) PARP는 정지된 복제 포크 또는 다른 복제-관련된 손상에 결합하여, PAR 중합을 유발한다. dNTP 또는 다른 조인자를 사용할 수 있을 경우, 복제 포크를 동시에 복원할 수 있을 때까지, 정상적으로 복제 포크를 프로세스할 단백질(예, 리솔베이스(resolvase))을 억제함으로써, 생성된 음으로 하전된 PAR 중합체가 정지된 복제 포크를 보호할 수 있다. 대안으로, PAR 중합체 또는 PARP는 단백질을 유인하여 다른 방법으로 복제 차단을 해결할 수 있다. (iii) PARP 활성의 부재 하에, HR을 대안 경로로 사용하여, 정지된 복제 포크를 복구할 수 있다. 이 보완 모델로, 증가된 수준의 HR 및 RAD51 병소를 PARP 결함성 세포3-5에서 발견하고, 더 높은 PARP 활성을 HR 결함성 세포(즉, V-C8)에서 발견하였음을 설명한다. 동시의 복제 차단/손상은 PARP와 HR 둘 다의 부재 하에서만 치명적이다.
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Claims (32)

  1. 상동 재조합을 매개하는 유전자의 결함으로 인해 야기되는 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, DNA 가닥 절단의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 제제의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 효소는 폴리(ADP-리보스)폴리머라제(PARP)인 것인 용도.
  3. 제2항에 있어서, 제제는 PARP 억제제인 것인 용도.
  4. 제3항에 있어서, PARP 억제제는 PARP-1, PARP-2, PARP-3, PARP-4, 탄키라제 1 및 탄키라제 2로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 용도.
  5. 제4항에 있어서, PARP는 PARP-1인 것인 용도.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제제는 PARP 유전자에 대해 특이적인 RNAi 분자인 것인 용도.
  7. 제6항에 있어서, RNAi 분자는,
    a) 도 9, 10, 11, 12, 13 또는 14의 서열로 나타내어지는 핵산 서열 또는 이 의 단편;
    b) 도 9, 10, 11, 12, 13 또는 14의 핵산 서열에 하이브리드화하고, PARP에 대한 유전자를 코딩하는 핵산 서열; 또는
    c) 상기 (a) 및 (b)에 정의된 핵산 서열에 대한 유전자 코드의 결과로서 축퇴(degenerate)된 서열을 포함하는 핵산 서열
    로 이루어지는 군에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에서 유래되는 것인 용도.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, RNAi 분자는 핵산 서열 aaa agc cau ggu gga gua uga를 포함하는 것인 용도.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, RNAi 분자는 핵산 서열 aag acc aau cuc ucc agu uca ac로 이루어지는 것인 용도.
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서, RNAi 분자는 핵산 서열 aag acc aac auc gag aac aac로 이루어지는 것인 용도.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 결함은 HR과 관련된 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이인 것인 용도.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 결함은 HR과 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 부재하는 것인 용도.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 결함은 HR과 관련된 단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 있는 것인 용도.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, HR을 매개하는 유전자는 XRCC1, ADPRT(PARP-1), ADPRTL2(PARP-2), CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NBS1, WRN, BLM, Ku70, Ku80, ATM, ATR, chk1, chk2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, RAD9, FEN-1, Mus81, Eme1, DDS1 및 BARD로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 용도.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료를 위한 것인 용도.
  16. 제15항에 있어서, 암은 폐암, 결장암, 췌장암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 용도.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 암은 인간의 암인 것인 용도.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 유전자와 관련된 유전성 암인 것인 용도.
  19. 제18항에 있어서, 암은 유방암인 것인 용도.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 치료되는 암 세포는 BRCA1 발현에 결함이 있는 것인 용도.
  21. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 치료되는 암 세포는 BRCA2 발현에 결함이 있는 것인 용도.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 암 세포는 BRCA1 및/또는 BRCA2 발현에 부분적으로 결함이 있는 것인 용도.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 암 세포는 BRCA1 및/또는 BRCA2 발현에 전체적으로 결함이 있는 것인 용도.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, HR을 매개하는 유전자는 종양 억제 유전자인 것인 용도.
  25. 제24항에 있어서, 종양 억제 유전자는 BRCA1인 것인 용도.
  26. 제24항에 있어서, 종양 억제 유전자는 BRCA2인 것인 용도.
  27. HR 결함성 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하기 위한 약제의 제조에 있어서의 PARP 억제제의 용도.
  28. 제27항에 있어서, HR 결함성 세포는 암 세포인 것인 용도.
  29. 제28항에 있어서, HR에 결함이 있는 암 세포는 HR에 부분적으로 결함이 있는 것인 용도.
  30. 제28항에 있어서, HR에 결함이 있는 암 세포는 HR에 전체적으로 결함이 있는 것인 용도.
  31. 상동 재조합을 매개하는 유전자의 유전적 결함으로 인해 야기되는, 인간을 비롯한 포유동물의 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로서, DNA 가닥 절단의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 제제의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  32. 포유동물에서 HR 결함성 세포의 아폽토시스를 유도하는 방법으로서, PARP 억제제의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
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