ES2367433T3 - Uso de la actividad parp inhibidora de arni para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. - Google Patents

Uso de la actividad parp inhibidora de arni para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Download PDF

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Abstract

Uso de un inhibidor de la poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de células cancerosas defectivas en la recombinación homóloga (RH); en el que las células cancerosas tienen un defecto en un gen seleccionado entre el grupo constituido por XRCC1, CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NBS1, WRN, BLM, Ku70, Ku80, ATM, ATR, chk1, chk2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, RAD9, FEN-1, Mus81, Emel, DDS1 y BARD.

Description

[0001] Esta invención se refiere al uso de un agente que inhibe la actividad de una enzima que media en la reparación de roturas en las cadenas de ADN para el tratamiento de algunas formas de cáncer, en particular el cáncer de mama.
[0002] La recombinación homóloga (RH) ha demostrado jugar un importante papel en la reparación del daño que se produce en las horquillas de replicación del ADN en células de mamíferos (2). De esta manera, las células deficientes en RH muestran un crecimiento retardado y presentan mayor nivel de inestabilidad genética. Se piensa que la inestabilidad genética debida a la pérdida de reparación de la RH en cánceres humanos contribuye significativamente al desarrollo del cáncer en estas células (1).
[0003] La modificación después de la transcripción de las proteínas nucleares mediante poli-ADP-ribosilación (PARP) en respuesta a las roturas en las cadenas de ADN desempeña un importante papel en la reparación del ADN, la regulación de la apoptosis, y el mantenimiento de la estabilidad genómica.
[0004] La poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP-1) es una proteína nuclear abundante en células de mamíferos que cataliza la formación de polímeros de poli-ADP-ribosa (PAR) usando NAD+ como sustrato. Tras el daño del ADN, la PARP-1 se une rápidamente a una cadena de ADN (monocatenaria o bicatenaria) rota y cataliza la adición de cadenas de PAR cargadas negativamente a sí mismo (automodificación) y a otras proteínas (véase [3, 4] para revisiones). Se piensa que la unión de la PARP-1 a las roturas en las cadenas de ADN protege las lesiones del ADN de un procesamiento adicional hasta que la PARP-1 se disocia de la cadena rota por la carga negativa acumulada resultante de los polímeros PAR (5,6).
[0005] Aunque se ha involucrado a la PARP-1 en algunos procesos nucleares, tales como la modulación de la estructura de la cromatina, la replicación del ADN, la reparación y la transcripción del ADN, los ratones con PARP-1 inactivada se desarrollan normalmente (7). Las células aisladas de estos ratones presentan un fenotipo de hiperrecombinación e inestabilidad genética en la forma de niveles crecientes de SCE, micronúcleos y tetraploidía (8-10). Se puede producir también inestabilidad genética en estos ratones con PARP-1 inactivada mediante acortamiento telomérico, frecuencia creciente de fusión cromosómica y aneuploidía (11), aunque todos estos resultados no se podrían repetir en otro lote de ratones con PARP-1 inactivada (12). En los ratones inactivados anteriores, la mutación nuII de PARP-1 rescata la recombinación V(D)J desequilibrada en ratones SCID (13). Estos resultados apoyan la opinión sugerida por Lindahl y colaboradores de que la PARP-1 tiene un papel protector frente a la recombinación (5). Estos autores propusieron que la unión de la PARP-1 a las roturas en las cadenas de ADN evita que la maquinaria de recombinación reconozca y procese lesiones de ADN o, alternativamente, que las cargas negativas acumuladas tras la poli-ADP-ribosilación repelan las secuencias de ADN recombinogénicas adyacentes. Solo el último modelo es consistente con la propia inhibición de la PARP-1 y la expresión de un mutante PARP-1 negativo dominante, induciendo SCE, la amplificación génica y la recombinación homóloga (RH [14-18]).
[0006] Los estudios basados en el tratamiento de células con inhibidores de la PARP o de células derivadas de ratones con PARP-1 o PARP-2 inactivados indica que la supresión de la actividad de la PARP-1 aumenta la susceptibilidad celular a los agentes que dañan el ADN e inhibe la reunión de la cadena rota (3,4, 8-11, 19, 20, 47).
[0007] Se han usado inhibidores de la actividad de la PARP-1 en combinación con agentes anticancerosos tradicionales, tales como radioterapia y quimioterapia (21). Se usaron los inhibidores en combinación con agentes metilantes, venenos de la topoisomerasa y radiaciones ionizantes y se encontró que potenciaban la efectividad de estas formas de tratamiento. Se sabe, sin embargo, que dichos tratamientos producen daño y muerte de las células no cancerosas o “sanas” y están asociados con efectos secundarios desagradables.
[0008] Existe por tanto una necesidad de tratamiento del cáncer que sea eficaz y selectivo al mismo tiempo en la eliminación de células cancerosas y que no necesite administrarse en combinación con tratamientos de radioterapia o quimioterapia.
[0009] Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que las células deficientes en la recombinación homóloga (RH) son hipersensibles a los inhibidores de la PARP en comparación con las células naturales. Esto es sorprendente debido a que los ratones con PARP-1 inactivada viven de manera normal indicando de este modo que la PARP-1 no es esencial para la vida. De esta manera, no se esperaría que dichas células fueran sensibles a la inhibición de la PARP.
[0010] De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente que inhibe la actividad de una enzima que media en la reparación de roturas de las cadenas de ADN en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que están producidas por un defecto genético en un gen que media en la recombinación homóloga.
[0011] En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento de tratamiento de una enfermedad
o dolencia en un mamífero, que incluye un ser humano, que está producida por un defecto genético en un gen que media en la recombinación homóloga, dicho procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que inhibe la actividad de una enzima que media en la reparación de cadenas de roturas en el ADN u otras lesiones presentes en las horquillas de replicación.
[0012] En un aspecto preferido, dicha enzima es la PARP. En un aspecto preferido adicional dicho agente es un inhibidor de la PARP o una molécula de ARNi específica del gen PARP.
[0013] En un aspecto preferido adicional, el uso es en el tratamiento del cáncer.
[0014] Preferiblemente, el medicamento es una composición farmacéutica constituida por el inhibidor de la PARP en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
[0015] La sensibilidad específica de tumores defectivos en la RH respecto de la inhibición de la PARP-1 significa que las células que se encuentran normalmente en división en el paciente no se verán afectadas por el tratamiento. El tratamiento de las células cancerosas defectivas en la RH que usan un inhibidor de la PARP tiene también la ventaja de que no necesita administrarse como una terapia de combinación junto con los tratamientos de radioterapia o quimioterapia convencionales, evitando por tanto los efectos secundarios asociados con estas formas convencionales de tratamiento.
[0016] Un defecto genético en un gen que media en la recombinación homóloga puede ser debido a una mutación en, la ausencia de, o la expresión defectiva de, un gen que codifica una proteína implicada en la RH.
[0017] En un aspecto adicional, la invención proporciona además el uso de un inhibidor de la PARP en la fabricación de un medicamento para inducir la apoptosis en células defectivas en la RH.
[0018] En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inducir la apoptosis en células defectivas en la RH en un mamífero, cuyo procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la PARP.
[0019] Al producir la apoptosis en células defectivas en la RH debería ser posible reducir o detener el crecimiento de un tumor en el mamífero.
[0020] Preferiblemente, las células defectivas en la RH son células cancerosas.
[0021] Las células cancerosas defectivas en la RH pueden ser parcial o totalmente deficientes en la RH. Preferiblemente, las células cancerosas son totalmente deficientes en la RH.
[0022] El término “cáncer” o “tumor” incluye cáncer de pulmón, de colon, de páncreas, gástrico, de ovarios, de cuello de útero o de próstata. El cáncer puede incluir también cáncer de piel, de riñón, de hígado, de vejiga o cerebral. En un aspecto preferido, el cáncer es en un mamífero, preferiblemente un ser humano.
[0023] El cáncer que se va a tratar puede ser una forma heredada de cáncer en la que el paciente que se va a tratar tiene una predisposición familiar al cáncer. Preferiblemente, el cáncer que se va a tratar es un cáncer hereditario vinculado a genes. En una realización preferida de la invención, el cáncer es un cáncer de mama hereditario vinculado a genes.
[0024] En un aspecto preferido, el inhibidor de la PARP es útil en el tratamiento de células cancerosas defectivas en la expresión de un gen implicado en la RH. Los genes con función sugerida sobre la RH incluyen XRCC1, ADPRT (PARP-1), ADPRTL2 (PARP-2), CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NBS1, WRN, BLM, Ku70, Ku80, ATM, ATR, chk1, chk2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, RAD9, FEN-1, Mus81. Eme1, DDS1, BARD (véanse (2, 3, 5, 22-28) para las revisiones).
[0025] Un gen implicado en la RH puede ser un gen supresor del tumor. La invención proporciona de esta manera el tratamiento de células cancerosas defectivas en la expresión de un gen supresor del tumor. Preferiblemente, el gen supresor del tumor es BRCA1 o BRCA2.
[0026] El cáncer de mama es la dolencia cancerosa más común entre mujeres en el mundo occidental en la actualidad. Algunas familias tienen una fuerte predisposición al cáncer de mama, que se debe a menudo a una mutación heredada en un alelo de cualquiera de BRCA1 o BRCA2. Sin embargo, estos pacientes siguen manteniendo un alelo funcional. De esta manera, estas pacientes se desarrollan normalmente y no tienen consecuencias fenotípicas de esta mutación. Sin embargo, en una célula, puede perderse el alelo funcional, convirtiendo esta célula en cancerosa y al mismo tiempo deficiente en la recombinación homóloga (RH). Esta etapa es crítica para el inicio de un tumor (1).
[0027] Los presentes inventores han encontrado de manera sorprendente que las células deficientes en BRCA2 son 100 veces más sensibles a la citotoxicidad del inhibidor de la PARP, NU1025, que las células naturales.
[0028] De esta manera, en un aspecto preferido, la invención proporciona el uso de un inhibidor de la PARP en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de células cancerosas defectivas en la RH, debido, por ejemplo a la pérdida de expresión de BRCA1 y/o BRCA2.
[0029] Las células cancerosas que se van a tratar pueden ser parcial o totalmente deficientes en la expresión de BRCA1 o BRCA2. Se pueden identificar mutaciones de BRCA1 y BRCA2 usando técnicas de PCR multiplex, técnicas de matriz (29,30) o usando otros cribados conocidos de la persona experta.
[0030] Se pueden seleccionar inhibidores de la PARP útiles en la presente invención a partir de inhibidores de PARP-1, PARP-2, PARP-3, PARP-4, tanquirasa 1 o tanquirasa 2 (véase 31 para una revisión). En una realización preferida, el inhibidor de PARP útil en la presente invención es un inhibidor de la actividad de PARP-1
[0031] Los inhibidores de la PARP útiles en la presente invención incluyen bencimidazol-carboxamidas quinazolin-4-[3H]-onas y derivados de isoquinolina (por ejemplo, 2-(4-hidroxifenil)bencimidazol-4-carboxamida (NU1085), 8-hidroxi-2-metilquinazolin-4-[3H]ona (NU1025); 6(5H)fenantridinona; 3 aminobenzamida; bencimidazol-4carboxamidas (BZ1-6) e indoles de lactamas tricíclicas (TI1-5) [32]. Se pueden identificar inhibidores adicionales de PARP ya sea mediante diseño [33] ya sea mediante el novedoso ensayo FlashPlate [34]
[0032] Se puede administrar el inhibidor de la PARP formulado como composición farmacéutica de cualquier manera conveniente eficaz efectiva para dirigir células cancerosas incluyendo, por ejemplo, administración por rutas intravenosa, intramuscular, intradérmica, intranasal, tópica, entre otras. Los vehículos o diluyentes útiles en la composición farmacéutica pueden incluir, pero no limitarse a disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y sus combinaciones.
[0033] En terapia o como profiláctico, se puede administrar el principio activo a un individuo en forma de una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril. Se puede administrar el inhibidor directamente a un tumor o se puede dirigir al tumor mediante administración sistémica.
[0034] Una cantidad terapéuticamente eficaz de inhibidor es normalmente una que es suficiente para conseguir el efecto deseado y puede variar de acuerdo con la naturaleza y la gravedad de la enfermedad o dolencia, y de la potencia del inhibidor. Se apreciará que se pueden emplear diferentes concentraciones para la profilaxis y para el tratamiento de una enfermedad activa.
[0035] Para la administración a mamíferos, y particularmente a seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del principio activo será de hasta 100 mg/kg, por ejemplo de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, normalmente hasta 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10, 15, 20 o 30 mg/kg de peso corporal. En última instancia, sin embargo, la cantidad de inhibidor administrada y la frecuencia de administración será a discreción de un médico.
[0036] Una ventaja terapéutica de usar inhibidores de la PARP para tratar células cancerosas es que se necesitan solo muy pocas dosis para tener un efecto terapéutico en el tratamiento del cáncer reduciendo, por tanto, la acumulación sistémica de los inhibidores y cualquier efecto tóxico asociado. [0037] Un aspecto preferido de la invención proporciona un agente que es una molécula de ARN inhibidor (ARNi).
[0038] Una técnica para extirpar específicamente la función génica es a través de la introducción de ARN bicatenario, denominado también como ARN inhibidor (ARNi), en una célula, lo que da como resultado la destrucción del ARNm complementario a la secuencia incluido en la molécula de ARNi. La molécula de ARNi comprende dos cadenas complementarias de ARN (una cadena de sentido directo y una cadena de sentido contrario) hibridadas entre sí para formar una molécula de ARN bicatenario. La molécula de ARNi se deriva normalmente de la secuencia exónica o de codificación del gen que se va a extirpar.
[0039] Preferiblemente, dicha molécula de ARNi se deriva de la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo constituido por:
a) una secuencia de ácido nucleico como la secuencia representada por la secuencia en la Figura 9, 10, 11, 12, 13 o 14 o uno de sus fragmentos; b) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con las secuencias de ácido nucleico de la Figura 9, 10, 11, 12, 13 o 14 y que codifica un gen de PARP; c) una secuencia de ácido nucleico que comprende secuencias que están degeneradas como resultado del código genético de las secuencias de ácido nucleico definidas en (a) y (b).
[0040] Recientes estudios sugieren que las moléculas de ARNi que oscilan entre 100-1000 pb derivados de la secuencia de codificación son inhibidores eficaces de la expresión génica. De manera sorprendente, solo se requieren unas pocas moléculas de ARNi para bloquear la expresión génica, lo que implica que el mecanismo es catalítico. El sitio de acción parece ser nuclear ya que apenas se detecta ARNi en el citoplasma de las células, lo que indica que el ARNi ejerce su efecto durante la síntesis o el procesamiento del ARNm.
[0041] Más preferiblemente, dicha molécula de ARNi, de acuerdo con lo anterior, tiene una longitud de entre 10 bases de nucleótidos (bn) – 1000bn. Incluso más preferiblemente, dicha molécula de ARNi tiene una longitud de 10bn; 20bn; 30bn; 40bn; 50bn; 60bn; 70bn; 80bn; 90bn; o 100pb. Incluso de manera aún más preferible, dicha molécula de ARNi tiene 21bnu de longitud.
[0042] Incluso de manera aún más preferible, la molécula de ARNi comprende la secuencia de ácido nucleico aaa agc cau ggu gga gua uga (PARP-1)
[0043] Incluso de manera aún más preferible, la molécula de ARNi está constituida por la secuencia de ácido nucleico aag acc aau cuc ucc agu uca ac (PARP-2)
[0044] Incluso de manera aún más preferible, la molécula de ARNi está constituida por la secuencia de ácido nucleico aag acc aac auc gag aac aac (PARP-3)
[0045] La molécula de ARNi puede comprender bases de nucleótidos modificados
[0046] Las características preferidas de cada aspecto de la invención son como para cada uno del resto de los aspectos cambiando lo que haya que cambiar.
[0047] La presente invención se describirá ahora por medio de ejemplos solo con referencia a las figuras que la acompañan, en las que:
La Figura 1 es una gráfica que demuestra que las células deficientes en la RH son hipersensibles al efecto tóxico producido por la inhibición de la PARP-1. Crecimiento de colonias de líneas de células AA8 de hámster chino (tipo natural) irs1SF (deficiente en RH[4]), CXR3 (irs1SF complementado con XRCC3 [2]), V79 (natural), irs1 (deficiente en RH[5]) o irs1X2.2 (irs1 complementado con XRCC2 {1]) tras exposición a 3-AB (A), ISQ (B) o NU1025 (C). Se muestran los promedios (símbolos) y las desviaciones estándar de al menos tres experimentos. Se usó el ensayo del crecimiento de colonias;
La Figura 2 es una gráfica que muestra la supervivencia celular en presencia del inhibidor de la PARP NU1025 en células V79 naturales, células VC-8 deficientes en BCRA2 y células VC-8 complementadas con el gen BRCA2 funcional (VC-8 nº 13, VC-8+B2). Se usó el ensayo de crecimiento de colonias;
La Figura 3 es un histograma que muestra el porcentaje de las células en apoptosis tras 72 horas de incubación con NU1025;
Figura 4. (a) Análisis de transferencia Western de lisados de proteínas aislados de de células de cáncer de mama MCF-7 (p53nat) o MDA-MB-231 (p53mut) después de 48 horas de la transfección con ARNip. (b) Crecimiento de colonias de células MCF-7 tratadas con ARNip o (c) células MDA.MB-231 tras exposición al inhibidor de la PARP NU1025. Se muestran los promedios (símbolos) y las desviaciones estándar (barras) de al menos tres experimentos.
Figura 5. Células deficientes en BRCA2 fracasan en la reparación de una lesión de recombinación formada en las horquillas de replicación por inhibidores de la PARP. (a) Visualización de las roturas en las cadenas bicatenarias (DSB) en células proficientes o deficientes en BRCA2 después de un tratamiento de 24 horas con NU1025 (0,1 mM) mediante electroforesis en gel con campo pulsante. Se usó hidroxiurea 2 mM como control positivo. (b) visualización de focos de H2Ax en células V-C8+B2 y V-C8 sin tratar. Numerosas células que contenían focos de H2Ax (c) o focos RAD51 (d) visualizados en células V-C8+B2 y V-C8 después de un tratamiento de 24 horas con NU1025 (10 µM). Se muestran los promedios (símbolos) y los errores estándar (barras) de tres a nueve experimentos. (e) Un modelo sugerido de muerte celular inducida en células deficientes en BDCA2.
Figura 6. Es importante en la PARP-1, y no en la PARP-2, evitar la formación de una lesión recombinogénica, productora de muerte en ausencia de BDCA2. (a) RT-PCR en ARN aislado de células SW480SN.3 tratadas con ARNip de BRCA2, PARP-1 y PARP-2 en combinaciones tal como se muestra durante 48 horas. (b) Supervivencia clonogénica después de 48 horas del agotamiento de BRCA2, PARP-1 y PARP-2. Se muestran los promedios (símbolos) y las desviaciones estándar (barras) de al menos tres experimentos. Dos y tres estrellas designan la significancia estadística en el test de la t p<0,01 y p<0,001, respectivamente. (c) Transferencia Western de PARP-1 en células SW480SN.3 tratadas con diferentes ARNip.
Figura 7. (a) Visualización de polímeros PAR en células V79 sin tratar y (b) tratadas con timidina (5 mM durante 24 horas). (c) Porcentaje de células que contienen >10 sitios de actividad de la PARP tras el tratamiento con hidroxiurea (0,2 mM) y timidina (5 mM). Se contaron al menos 300 núcleos para cada tratamiento y experimento. (d) Supervivencia de células V-C8+B2 tras el tratamiento simultáneo con hidroxiurea o (e) timidina y NU1025 (10 µM). (f) Se midió la actividad de la PARP por el nivel de NAD(P)H 11 libre, tras el tratamiento con MMS, hidroxiurea (0,5 mM) o timidina (10 mM). Se representan gráficamente los promedios (símbolos) y las desviaciones estándar (barras de errores) de al menos tres experimentos.
Figura 8. (a) Visualización de polímeros PAR en células V-C8 y (b) V-C8+B2 sin tratar. (c) Cuantificación del porcentaje de células que contienen >10 sitios de actividad de PARP en células V-C8 y V-C8+B2 sin tratar. (d) Nivel de NAD(P)H medido en células V-C8 y V-C8+B2 sin tratar. Tres estrellas designan p<0,001 en el test de la t. (e) Visualización de RAD51 y de sitios de actividad de la PARP en células V79 después de 24 horas de tratamiento con timidina (5 mM). (f) Un modelo del papel de la PARP y la RH en las horquillas de replicación atascadas.
La Figura 9 es la secuencia del ADNc humano de la PARP-1;
La Figura 10 es la secuencia del ADNc humano de la PARP-2;
La Figura 11 es la secuencia del ADNc humano de la PARP-3;
La Figura 12 es la secuencia del ADNg de la Tanquirasa 1;
La Figura 13 es la secuencia del ARNm humano de la Tanquirasa 2;
La Figura 14 es la secuencia del ARNm de la VPARP.
Materiales y procedimientos
Citotoxicidad de los inhibidores de PARP en células defectivas en la RH: XRCC2, XRCC3 o BRCA2
Cultivo celular
[0048] Las líneas celulares irs1, irs1X2.1 y V79-4 fueron una donación de John Thacker [40] y Larry Thompson [41] proporcionó las líneas celulares AA8, irs1SF y CXR3.
[0049] Las líneas celulares VC-8, VC-8+B2, VC-8 nº 13 fueron un regalo de Malgorzata Zdzienicka [42]. Todas las líneas celulares en este estudio se hicieron crecer en Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero fetal de bovino al 10% (100 U/ml) y sulfato de estreptomicina (100 µg/ml) a 37ºC en una atmósfera que contiene CO2 al 5%.
Ensayo de toxicidad – ensayo de crecimiento de colonias
[0050] Se plaquearon 500 células suspendidas en medio en una placa Petri 4 horas antes de la adición de 3AB, ISQ o NU1025. Se disolvieron ISQ y NU1025 en DMSO a una concentración final de 0,2% en medio de tratamiento. 7 – 12 días después, cuando se observaron las colonias, se fijaron y tiñeron estas colonias con azul de metileno en metanol (4 g/l). Posteriormente. Se contaron las colonias constituidas por más de 50 células.
Experimentos de apoptosis
[0051] Se plaquearon 0,25 x 106 células en placas Petri y se hicieron crecer durante 4 horas antes del tratamiento con NU1025. Después de 72 horas, se tripsinizaron las células y se volvieron a suspender con medio que contenía algunas células flotantes procedentes de la muestra. Se aglomeraron las células mediante centrifugación y se volvieron a suspender para el análisis de la apoptosis con anexina-V conjugada con FTTC y yoduro de propidio (PI) (ApoTarget, Biosource International) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se analizaron las muestras mediante citometría de flujo (Becton-Dickinson FACSort, láser de 488 nm ), y se determinó el porcentaje de células apoptóticas por la fracción de células vivas (PI-negativas) unidas con anexina-V conjugada con FITC.
Inmunofluorescencia
[0052] Se plaquearon las células en cubres 4 h antes de los tratamientos de 24 h según se ha indicado. Tras los tratamientos, se retiró el medio y se enjuagaron los cubres una vez en PBS a 37ºC y se fijaron según se ha descrito en muchas partes [2]. Los anticuerpos primarios y las diluciones usadas en este estudio fueron anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra PAR (Trevigen; 1:500), anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra Rad51 (C20, Santa Cruz; 1:200) y anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra Rad51 (H-92, Santa Cruz; 1:1000). Los anticuerpos secundarios fueron anticuerpo de cabra conjugado con Cy-3 dirigido contra IgG de conejo (Zymed; 1:500), anticuerpo de cabra conjugado con Alexa 555 dirigido contra IgG F(ab’)2 de conejo (Molecular Probes; 1:500), anticuerpo de burro conjugado con Alexa 546 dirigido contra IgG de cabra (Molecular Probes; 1:500), anticuerpo de burro conjugado con Alexa 488 dirigido contra IgG de conejo (Molecular Probes; 1:500). Se diluyeron los anticuerpos en PBS que contenía albúmina de suero bovino al 3%. Se tiñó el ADN con 1 µg/ml de ToPro (Molecular Probes). Se obtuvieron imágenes con un microscopio confocal invertido Zeiss LSM 510 usando un objetivo de inmersión en aceite planapocromático 63X/NA 1.4 y longitudes de onda de excitación de 488, 546 y 630 nm. Se adquirieron las imágenes a través de un objetivo de proyección máxima de secciones ópticas separadas de 0,50 µm y con un espesor de sección de 1,0 µm. se procesaron las imágenes usando Adobe PhotoShop (Abacus Inc). Se contaron al menos 300 núcleos en cada porta y los que contenían más de 10 focos RAD51 o sitios de actividad de PARP se clasificaron como positivos.
Ensayos de actividad de la PARP
[0053] Se usó una sal de tetrazolio soluble en agua (WST-8 5 mM) para controlar la cantidad de NAD(P)H mediante su reducción a colorante de formazán de color amarillo [43]. Se plaquearon 5000 células al menos por triplicado en los pocillos de una placa de 96 pocillos y se cultivaron en 100 µl de medio de crecimiento normal durante 4 h a 37ºC. A continuación se añadió tampón CK8 (Dojindo Molecular Technology, Gaithersburg, EE.UU), que contenía WST-8, tanto con o sin tratamiento con agentes que dañan el ADN a las concentraciones indicadas. Se determinó la reducción de WST-8 en presencia de NAD(P)H midiendo la absorbancia visible (DO450) cada 30 min. Se preparó también un medio blanco que contenía solo el medio y el tampón CK8. Se calcularon los cambios en los niveles de NAD(P)H comparando la absorbancia de los pocillos que contenían células tratadas con agentes que dañan el ADN y las tratadas solo con DMSO. Se calcularon de forma alterna los niveles de NAD(P)H en diferentes líneas celulares tras 4 h de incubación en tampón CK8.
[0054] Se evaluó también la capacidad de NU1025 para inhibir la actividad de PARP-1 en células permeabilizadas usando una modificación del procedimiento de Halldorsson y col [44], y descrita con detalle en muchas partes [45]. De manera breve: se incubaron 300 µl de células permeabilizadas tratadas con NU1025 (15 min) a 6ºC con oligonucleótido (conc. final 2,5 µg/ml), NAD 75 µM + [32 P] NAD (Amersham Pharmacia, Amersham, Reino Unido) en un volumen total de 400 µl. La reacción finalizó después d 5 min añadiendo TCA al 10% frío en hielo, NaPpi al 10% durante 60 min antes de filtrar a través de un filtro Whatman GF/C (LabSales, Maidstone, Reino Unido), enjuagado 6x con TCA al 1% y NaPPi al 1%, se dejó secar, y se midió la radioactividad incorporada para determinar la actividad de PARP-1. Se expresaron los datos como pmol de NAD incorporados/106 células por referencia a patrones de [32P]NAD.
Electroforesis en gel de campo pulsante
[0055] Se plaquearon 1,5 x 106 células en placas de 100 mm y se dejaron 4 h para la unión. La exposición al fármaco fue durante 18 h tras las cuales las células se tripsinizaron y se dispersaron 106 células en cada inserción de agarosa al 1%. Se incubaron estas inserciones como se ha descrito en muchas partes (8) y se separaron mediante electroforesis en gel de campo pulsante durante 24 h (BioRad; ángulo de 120º tiempo de inversión de 60 a 240 s, 4 V/cm). Se tiñó posteriormente el gel con bromuro de etidio para el análisis.
Tratamiento del ARNip
[0056] Se adquirieron un combinado de BRCA2 SMART prediseñado y ARNip mezclados (Dharmacon, Lafayette, CO). Se sembraron 10000 células en placas de 6 pocillos y se dejaron durante la noche antes de transfectarse con ARNip 100 nM usando Reactivo de Oligofectamina (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación se cultivaron las células en medio de crecimiento normal durante 48 h antes de la tripsinización y se volvieron a plaquear para las pruebas de toxicidad. Se confirmó la supresión de BRCA2 mediante transferencia Western (tal como se ha descrito anteriormente [46]) de los extractos de proteínas tratados con ARNip con un anticuerpo dirigido contra BRCA2 (Oncogene, Nottingham, Reino Unido).
EJEMPLOS
Las células deficientes en la recombinación homóloga son hipersensibles a la inhibición de PARP-1
[0057] Para investigar la implicación de la RH en las respuestas celulares a la inhibición de PARP-1, se estudiaron los efectos de los inhibidores de PARP-1 sobre la supervivencia de las líneas celulares deficientes en la reparación de la EH. Se encontró que las células deficientes en la RH (es decir, irs1SF que es defectiva en XRCC3 o its1 que es defectiva en XRCC2 [véase la Tabla 1] fueron muy sensibles al efecto tóxico de 3-aminobenzamida (3AB) y a dos inhibidores más potentes de PARP-1: 1,5-dihidroxiisoquinolina (ISQ; [37]) u 8-hidroxi-2metilquinazolinona (NU1025 [38, 39]) (Figura 1). La sensibilidad en las células irs1SF a 3-AB, ISQ o NU1025 se corrigió mediante la introducción de un cósmido que contenía un gen XRCC3 funcional (CXR3). De manera similar, la sensibilidad en las células irs1 a 3-AB, ISQ o NU1025 se corrigió mediante la introducción de un cósmido que contenía un gen XRCC2 funcional (irs1X2.2).
Las células deficientes en BRCA2 son hipersensibles a la inhibición de PARP-1
[0058] Se investigó la supervivencia de las células deficientes en BRCA2 (VC8) y en las células naturales (V79Z) en presencia de inhibidores de la PARP-1. Se encontró que las células VC8 eran muy sensibles al efecto tóxico de NU1025 (Figura 2). La sensibilidad en las células VC8 se corrigió mediante la introducción de un gen BTCA2 funcional tanto en el cromosoma 13 (VC8 nº 13) como en un vector de expresión en exceso (VC8+B2). Este resultado demuestra que la sensibilidad de los inhibidores de PARP-1 es una consecuencia directa de la pérdida de la función de BRCA2.
[0059] Para investigar si la inhibición de la PARP-1 estimula la apoptosis en las células deficientes en BRCA2, se investigó el nivel de la apoptosis 72 horas después de la exposición NU1025. Se encontró que NU1025 estimuló la apoptosis solo en células VC8, lo que demuestra que la pérdida de la actividad de la PARP-1 en células deficientes en BRCA2 estimula estos promedios de muerte (Figura 3)
Las células de cáncer deficientes en BRCA2 son hipersensibles a la inhibición de PARP-1
[0060] Se examinó si las líneas celulares de cáncer de mama MCF7 (p53 natural) y MDA-MB-231 (p53 mutado) mostraban una sensibilidad similar a NU1025 tras el agotamiento de BRCA2. Se encontró que los inhibidores de PARP redujeron fuertemente la supervivencia de las células MCF7 y MDA-MB-231 solo cuando BRCA2 se destruyó con una mezcla de ARNip de BRCA2 (Figura 4). Esto demuestra que las células de cáncer de mama en las que se agotó BRCA2 eran sensibles a los inhibidores de PARP con respecto al estado de p53.
Las células deficientes en BRCA2 mueren por la inhibición de la PARP-1 en ausencia de roturas de ADN bicatenario (DSB) pero en presencia de H2Ax
[0061] Se sabe que la RH está implicada en la reparación de las DSB y otras lesiones que se producen durante la replicación del ADN [2]. Para determinar si la sensibilidad de las células deficientes en BRCA2 es el resultado de una incapacidad para reparar las DSB tras el tratamiento con NU1025, se midió la acumulación de las DSB en células V79 y V-C8 tras tratamiento con niveles muy tóxicos de NU1025. Se encontró que ninguna DSB fue detectable mediante el análisis electroforético en gel de campo pulsante del ADN obtenido de las células tratadas (Figura 5A), sugiriendo que se acumulan bajos niveles de DSB u otros sustratos recombinogénicos tras la inhibición de PARP en las células deficientes en la RH, (Figura 5B) con el estímulo de H2Ax (Figura 5B). La razón por la cual las células deficientes en BRCA2 mueren tras la inducción de estas lesiones recombinogénicas se debe probablemente a una incapacidad para reparar dichas lesiones. Para ensayar esto, se determinó la capacidad de las células V-C8 deficiente en BRCA2 y de las células complementadas en BRCA2 para focos de RDA51 en respuesta a NU1025. Se encontró que los focos de RAD51 se inducían a su vez en células V-C8+B2 tras el tratamiento con NU1025 (estadísticamente significativo en el test de la t p<0,05; Figura 5D). Esto indica que las lesiones recombinogénicas desencadenan la reparación de la RH en estas células, permitiéndoles sobrevivir. En contraste, las células V-C8 deficientes en BRCA2 fueron incapaces de formar focos RAD51 en respuesta al tratamiento con NU1025 (Figura 5D) indicando sin RH, lo que dejaría las lesiones recombinogénicas sin reparar y de esta manera produce la muerte celular.
La PARP-1, y no la PARP-2, es la importante para evitar la formación de una lesión recombinogénica
[0062] Existen dos PARP principales presentes en el núcleo de las células de mamíferos, la PARP-1 y la PARP-2, y todos los inhibidores de la PARP de los que se ha informado inhiben ambas formas. Con el fin de distinguir qué PARP es responsable del efecto, los inventores probaron si la ausencia de PARP-1 y/o PARP-2 daba como resultado la acumulación de lesiones tóxicas, disminuyendo éstas y BRCA2 con ARNip en células humanas (Figura 6a). Los inventores encontraron que la supervivencia clonogénica se redujo significativamente cuando las proteínas PARP-1 y BRCA2 se agotaron simultáneamente en las células humanas (Figura 6b). El agotamiento de la PARP-2 con BRCA2 no tuvo efecto sobre la supervivencia clonogénica y el agotamiento de PARP-2 en PARP-1 y en células con BCRA2 agotada no dio como resultado una toxicidad adicional. Estos resultados sugieren que la PARP1, y no la PARP-2, es la responsable de reducir las lesiones recombinogénicas tóxicas en células humanas. La eficacia de la clonación se redujo solo hasta el 60% del control en células con PARP-1 y BCRA2 agotadas simultáneamente, mientras que no sobrevivieron las células deficientes en RH en los tratamientos con inhibidores de PARP. Esto se podría conseguir con un agotamiento incompleto de la abundante proteína PARP-1 por el ARNip (Figura 6c), que puede ser suficiente para mantener la función de la PARP-1 en alguna de estas células.
La PARP-1 se activa por los inhibidores de la replicación
[0063] La RH está también implicada en la reparación de las lesiones que se producen en las horquillas de replicación atascadas, lo que puede no implicar las DSB detectables [2]. Para probar si PARP tiene un papel en las horquillas de replicación, se examinó la activación de PARP en células tratadas con agentes (timidina o hidroxiurea) que retrasa o detiene la progresión de las horquillas de replicación del ADN. La timidina agota el dCTP de las células y ralentiza las horquillas de replicación sin producir DSB. La hidroxiurea agota algunos dNTP y bloquea la horquilla de replicación, que está asociada con la formación de las DSB en las horquillas de replicación [2]. Ambos agentes inducen potentemente la RH [2]. Se tiñeron células V79 de hámster tratadas durante 24 horas con timidina o hidroxiurea para los polímeros PAR. Esto desveló un aumento sustancial en el número de células que contenían sitios de actividad de la PARP (Figura 7C). Este resultado sugiere una función de PARP en las horquillas de replicación atascadas. Se demostró también que la inhibición de PARP con NU1025 aumenta la sensibilidad a la timidina o a la hidroxiurea en células V-C8+B2 (Figura 7D, E). Este resultado sugiere que la actividad de la PARP es importante en la reparación de las horquillas de replicación atascadas o, alternativamente, que evita la inducción de muerte en las células con horquillas de replicación atascadas.
[0064] La PARP se activa rápidamente en roturas de cadenas bicatenarias (SSB) y atrae enzimas de reparación del ADN [3-6]. El metil-metano sulfonato (MMS) produce la alquilación del ADN, que se repara mediante reparación por excisión de bases. La PARP se activa rápidamente mediante la SSB intermedia formada durante esta reparación, que agota los niveles de NAD(P)H (Figura 7F). Los inventores encontraron que la activación de la PARP y la reducción de los niveles de NAD(P)H es mucho más lenta después de los tratamientos con timidina o hidroxiurea. Se puede explicar esta lenta activación de PARP por la acción indirecta de la timidina y la hidroxiurea y el tiempo necesario para acumular horquillas de replicación atascadas a medida que las células entran en la fase S del ciclo celular.
La PARP-1 y la RH tienen papeles independientes en las horquillas de replicación atascadas
[0065] Se determinó el número de sitios de actividad de la PARP en células V-C8 deficientes en BRCA2 sin tratar. Se encontró que más células V-C8 contienen sitios de actividad de PARP en comparación V-C8+B2 (Figura 8A, B, C). También, las células V-C8 tienen menores niveles de NAD(P)H libre que las células corregidas (Figura 8D), como probable resultado de la creciente actividad de la PARP. De manera importante, estos sitios de actividad no se solapan con focos de RAD51 (Figura 8E).
[0066] Los resultados del presente documento sugieren que la PARP y la RH tienen papeles independientes en la protección o el rescate de horquillas de replicación atascadas (Figura 8F). Una pérdida de actividad de PARP puede estar compensada por una creciente RH mientras que una pérdida de RH puede estar compensada por una creciente actividad de PARP. Sin embargo, la pérdida de estas rutas conduce a la acumulación de horquillas de replicación atascadas y a la muerte, como en el caso de células deficientes en BRCA2 inhibidas por PARP.
[0067] Tal como se muestra en el modelo reseñado en la Figura 8F, la PARP y la RH tienen papeles complementarios en las horquillas de replicación atascadas. (i) Las horquillas de replicación pueden atascarse cuando encuentran un obstáculo en la plantilla de ADN. Adicionalmente, pueden atascarse temporalmente, debido a
la ausencia de dNTP u otros cofactores de la replicación. (II) PARP se une a las horquillas de replicación atascadas u otros daños asociados a la replicación, estimulando la polimerización. Los polímeros PAR negativamente cargados resultantes pueden proteger las horquillas de replicación atascadas, repeliendo las proteínas que normalmente procesarían las horquillas de replicación (por ejemplo, resolvasas), hasta que la horquilla de replicación se puede 5 restaurar espontáneamente cuando los dNTP y otros cofactores llegas a estar disponibles. Alternativamente, los polímeros PAR o PARP pueden atraer proteínas para resolver el bloqueo de la replicación por otros medios. (iii) En ausencia de actividad de la PARP, se puede usar la RH como una ruta alternativa para reparar las horquillas de replicación atascadas. Este modelo compensatorio explica el creciente nivel de RH como focos de RAD51 que se encuentran en células 3-5 y la mayor actividad de la PARP que se encuentra en células deficientes en RH (es decir, 10 V-C8). Las replicaciones espontáneas de bloques/lesiones solo son letales en ausencia tanto de PARP como de RH.
[0068] Tabla 1. Genotipo y origen de las líneas celulares usadas en este estudio.
Línea celular Genotipo Defecto Origen Referencia AA8 Wt Wt CHO [41] irs1SF XRCC3- XRCC3-, deficiente en RH AA8 [41] CXR3 XRCC3-+ hXRCC3 Wt irs1SF [41] V79-4 Wt Wt V79 [40] irs1 XRCC2-XRCC2-, deficiente en RH V79-4 [40] irs1X2.2 XRCC2-+ hXRCC2 Wt irs1 [40] V79-Z Wt Wt V79 [42] VC8 BRCA2-BRCA2-, deficiente en RH V79-Z [42] VC8 nº 13 BRCA2- + hBRCA2 Wt VC8 [42] VC8+B2 BRCA2- + hBRCA2 Wt VC8 [42]
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Claims (36)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Uso de un inhibidor de la poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de células cancerosas defectivas en la recombinación homóloga (RH); en el que las células cancerosas tienen un defecto en un gen seleccionado entre el grupo constituido por XRCC1, CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NBS1, WRN, BLM, Ku70, Ku80, ATM, ATR, chk1, chk2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, RAD9, FEN-1, Mus81, Emel, DDS1 y BARD.
  2. 2.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el inhibidor de la PARP se selecciona entre el grupo constituido por inhibidores PARP-1, PARP-2, PARP-3, PARP-4, tanquirasa 1 tanquirasa 2.
  3. 3.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 2 en el que el inhibidor de la PARP es un inhibidor de la PARP-1.
  4. 4.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el inhibidor de la PARP se selecciona entre el grupo constituido por bencimidazol-carboxamidas, quinazolin-4-[3H]-onas y derivados de isoquinolona.
  5. 5.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 4 en el que el inhibidor de la PARP se selecciona entre el grupo constituido por 2-(4-hidroxifenil) bencimidazol-4-carboxamida, 8-hidroxi-2-metilquinazolin-4-[3H]ona, 6(5H) fenantridinona, 3-amnobenzamida, bencimidazol-4-carboxamidas e indoles de lactama tricíclica.
  6. 6.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el inhibidor de la PARP es una molécula de ARNi específica de un gen PARP.
  7. 7.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 6 en el que la molécula de ARNi se deriva de una molécula de
    ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo constituido por: a) una secuencia de ácido nucleico como la representada por la secuencia de la Figura 9, 10, 11, 12, 13 o 14, o uno de sus fragmentos; b) una secuencia que se hibrida con las secuencias de ácido nucleico de la Figura 9, 10, 11, 12, 13 o 14, y que codifica un gen de PARP; o c) una secuencia de ácido nucleico que comprende secuencias que están degeneradas como resultado del código genético de las secuencias de ácido nucleico definidas en (a) y (b).
  8. 8.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7 en el que la molécula de ARNi comprende la secuencia de ácido nucleico aaa agc cau ggu gga gua uga.
  9. 9.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7 en el que la molécula de ARNi está constituida por la secuencia de ácido nucleico aag acc aau cuc ucc agu uca ac.
  10. 10.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7 en el que la molécula de ARNi está constituida por la secuencia de ácido nucleico aag acc aac auc gag aac aac.
  11. 11.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las células cancerosas defectivas en la RH son parcialmente deficientes en la RH.
  12. 12.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que las células cancerosas defectivas en la RH son totalmente deficientes en la RH.
  13. 13.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el defecto es una mutación en el gen.
  14. 14.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el defecto es la ausencia del gen.
  15. 15.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el defecto está en la expresión del gen.
  16. 16.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las células cancerosas que se van a tratar se seleccionan entre el grupo constituido por células de cáncer de pulmón, colon, páncreas, ovarios, cuello de útero, mama y próstata.
  17. 17.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las células cancerosas están en un ser humano.
  18. 18.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las células cancerosas que se van a tratar son células de cáncer hereditario vinculado a genes.
  19. 19.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 18 en el que las células cancerosas que se van a tratar son células de cáncer de mama.
  20. 20.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las células cancerosas que se van a tratar son defectivas en la expresión de BRCA1.
  21. 21.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las células cancerosas que se van a tratar son defectivas en la expresión de BDCA2.
  22. 22.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 20 o 21 en el que las células cancerosas son parcialmente deficientes en la expresión de BRCA1 y/o BRCA2.
  23. 23.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 20 o 21 en el que las célula cancerosas son totalmente deficientes en la expresión de BRCA1 y/o BRCA2.
  24. 24.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el gen que media en la RH es un gen supresor del tumor.
  25. 25.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 24 en el que el gen supresor del tumor es BRCA1.
  26. 26.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 24 en el que el gen supresor del tumor es BRCA2.
  27. 27.
    Un inhibidor de la poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP) para uso en el tratamiento de células cancerosas defectivas en la recombinación homóloga (RH);
    en el que las células cancerosas tienen un defecto en un gen seleccionado entre el grupo constituido por XRCC1,, CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NBS1, WRN, BLM, Ku70, Ku80, ATM, ATR, chk1, chk2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, RAD9, FEN-1, Mus81, Emel, DDS1 y BARD.
  28. 28.
    Un inhibidor de la PARP para uso de acuerdo con la reivindicación 27 en el que el inhibidor de la PARP se selecciona entre el grupo constituido por inhibidores de PARP-1, PARP-2, PARP-3, PARP-4, tanquirasa 1 y tanquirasa 2.
  29. 29.
    Un inhibidor de la PARP para uso de acuerdo con la reivindicación 28 en el que el inhibidor de la PARP es un inhibidor de la PARP-1.
  30. 30.
    Un inhibidor de la PARP para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29 en el que el inhibidor de la PARP se selecciona entre el grupo constituido por bencimidazol-carboxamidas, quinazolin-4[3H]-onas y derivados de isoquinolona.
  31. 31.
    Un inhibidor de la PARP para uso de acuerdo con la reivindicación 30 en el que el inhibidor de la PARP se selecciona entre el grupo constituido por 2-(4-hidroxifenil) bencimidazol-4-carboxamida, 8-hidroxi-2metilquinazolin-4-[3H] ona, 6(5H) fenantridinona, 3-amnobenzamida, bencimidazol-4-carboxamidas e indoles de lactama tricíclica.
  32. 32.
    Un inhibidor de la PARP para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 en el que las células cancerosas defectivas en la RH son parcialmente deficientes en la RH.
  33. 33.
    Un inhibidor de la PARP para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 en el que las células cancerosas defectivas en la RH son totalmente deficientes en la RH.
  34. 34.
    Un inhibidor de la PARP para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33 en el que las células cancerosas que se van a tratar se seleccionan entre el grupo constituido por células de cáncer de pulmón, colon, páncreas, gástrico, de ovarios, de cuello de matriz, mama y próstata.
  35. 35.
    Un inhibidor de la PARP para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 34 en el que las células cancerosas que se van a tratar son células de cáncer hereditario vinculadas a genes.
    5 36. Un inhibidor de la PARP para uso de acuerdo con la reivindicación 35 en el que las células cancerosas que se van a tratar son células de cáncer de mama.
  36. 37. un inhibidor de la PARP para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36 en el
    que las células cancerosas que se van a tratar son defectivas en la expresión de BRCA1 o BRCA2. 10
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