BRPI0412909B1 - Uso de um inibidor de poli (adp-ribose) polimerase 1 (parp-1) para a fabricação de um medicamento para o tratamento de células de câncer defeituosas em recombinação homóloga - Google Patents

Uso de um inibidor de poli (adp-ribose) polimerase 1 (parp-1) para a fabricação de um medicamento para o tratamento de células de câncer defeituosas em recombinação homóloga Download PDF

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Abstract

USO DE RNAI INIBINDO ATIVIDADE DE PARP PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER A presente invenção se refere ao uso de um agente que inibe a atividade de uma enzima que media reparo de uma quebra do filamento do DNA na fabricação de um medicamento para o trata-mento de doenças causadas por um defeito em um gene que media a recombinação homóloga.

Description

[001]Esta invenção se refere ao uso de um agente que inibe a atividade de uma enzima que media o reparo de quebras do filamento do DNA no tratamento de certas formas de câncer em particular câncer de mama.
[002]A recombinação homóloga (HR) foi mostrada desempenhar um impor-tante papel no reparo de ocorrência de dano em forquilhas de replicação de DNA em células de mamífero (2). Desta maneira, as células deficientes em HR mostram crescimento retardado e exibem nível mais alto de instabilidade genética. Acredita- se que a instabilidade genética devido a perda de reparo de HR em cânceres humanos significativamente contribui para o desenvolvimento de câncer nestas células (1).
[003]A modificação pós-transcricional de proteínas nucleares por poli(ADP- ribosil)ação (PARP) com respeito a quebras do filamento do DNA desempenham um papel importante no reparo de DNA, regulagem de apoptose e manutenção da esta-bilidade genômica.
[004]A Poli(ADP-ribose) Polimerase (PARP-1) é uma proteína nuclear abun-dante em células de mamífero que catalisam a formação de polímeros de poli(ADP- ribose) (PAR) empregando-se NAD+ como substrato. No dano de DNA, PARP-1 ligase rapidamente a uma quebra do filamento do DNA (filamento único ou filamento duplo) e catalisa a adição de cadeias de PAR negativamente carregadas para si mesmo (auto-modificação) e outras proteínas (veja [3,4] para revisões). A ligação de PARP-1 às quebras do filamento do DNA acredita-se proteger lesões de DNA de outro processo até que PARP-1 seja dissociada da quebra pela carga acumulada negativa resultante de polímeros de PAR (5,6).
[005]Embora PARP-1 tenha sido implicada em vários processos nucleares, tal como modulação da estrutura de cromatina, replicação de DNA, transcrição e reparo de DNA, camundongos nocauteados por PARP-1 desenvolvem-se normalmente (7). As células isoladas destes camundongos exibem um fenótipo de hiper recombinação e instabilidade genética na forma de níveis aumentados de SCE, mi- cronúcleos e tetraploidi (8-10). A instabilidade genética pode da mesma forma ocorre nestes camundongos nocauteados por PARP-1 através de encurtamento de telô- mero, frequência aumentada de fusão de cromossomo e aneuploidia (11), embora todos estes resultados não possam ser repetidos em outro grupo de camundongos nocauteados por PARP-1 (12). No nocaute de camundongos anterior, o auxílio de mutação nula de PARP-1 prejudicou a recombinação de V(D)J em camundongos SCID (13).
[006]Estes resultados sustentam a visão sugerida por Lindahl e colaboradores que PARP-1 tem um papel protetor contra recombinação (5). Eles propuseram que a ligação de PARP-1 às quebras do filamento do DNA impede a maquinaria de recombinação de reconhecer e processar lesões de DNA ou, alternativamente, que as cargas negativas acumuladas seguindo a poli ADP-ribosilação repele as sequências de DNA recombinogênico adjacente. Apenas o último modelo está consistente com a inibição de PARP-1 propriamente dita e expressão de uma PARP-1 mutante negativa dominante, induzindo SCE, amplificação de gene e recombinação homóloga (HR [14-18]).
[007]Estudos baseados no tratamento de células com inibidores de PARP ou células derivadas de camundongos nocauteados por PARP-1 ou PARP-2 indicam que a supressão de atividade de PARP-1 aumenta a suscetibilidade celular a agentes de danificação de DNA e inibe a reunião da quebra do filamento (3,4, 8-11, 19,20, 47).
[008]Os inibidores de atividade de PARP-1 foram empregados na combinação com agentes anti-câncer tradicionais tais como radioterapia e quimioterapia (21). Os inibidores foram empregados em combinação com agentes de metilação, venenos de topoisomerase e radiações ionizadoras e foram constatados aumentar a eficácia destas formas de tratamento. Tais tratamentos, entretanto, são conhecidos por causarem dano e morte às células não cancerosas ou “saudáveis” e estão associados com efeitos colaterais desagradáveis.
[009]Há portanto uma necessidade para um tratamento para câncer que seja igualmente eficaz e seletivo no extermínio de células de câncer e que não necessite ser administrado em combinação com tratamentos de rádio ou quimioterapia. Os presentes inventores surpreendentemente constataram que células deficientes em recombinação homóloga (HR) são hipersensíveis a inibidores de PARP quando comparadas a células do tipo selvagem. Isto é surpreendente uma vez que os ca-mundongos nocauteados por PARP-1 vivem normalmente, desse modo indicando que PARP-1 não é essencial para vida. Desta maneira, não pôde ser esperado que as células fossem sensíveis a inibição de PARP.
[0010]De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido o uso de um agente que inibe a atividade de uma enzima que media o reparo de quebras do filamento do DNA na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças que são causadas por um defeito genético em um gene que media a recombinação homóloga.
[0011]Em um outro aspecto a invenção fornece um método de tratamento de uma doença ou condição em um mamífero, incluindo humano, que é causada por um defeito genético em um gene que media a recombinação homóloga, cujo método compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que inibe a atividade de uma enzima que media reparo de quebras do filamento do DNA ou outras lesões presentes em forquilhas de replicação.
[0012]Em um aspecto preferido, a referida enzima é PARP. Em um outro aspecto preferido, o referido agente é um inibidor de PARP ou uma molécula de RNAi específica para o gene de PARP.
[0013]Em um outro aspecto preferido, o uso é no tratamento de câncer.
[0014]Preferivelmente o medicamento é uma composição farmacêutica que consiste no inibidor de PARP em combinação com um diluente ou portador farma- ceuticamente aceitável.
[0015]A sensibilidade específica de tumores defeituosos em HR a inibição de PARP-1 significa que normalmente a divisão de células no paciente não será afetada pelo tratamento. O tratamento de células de câncer defeituosas em HR empregando-se um inibidor de PARP da mesma forma tem a vantagem que não precisa ser administrado como uma terapia de combinação junto com tratamentos de rádio ou quimioterapia convencionais, desse modo evitando os efeitos colaterais associados com estas formas convencionais de tratamento.
[0016]Um defeito genético em um gene que media a recombinação homóloga pode ser devido a uma mutação em, a ausência de, ou expressão defeituosa de, um gene que codifica uma proteína envolvida em HR.
[0017]Em um outro aspecto, a invenção também fornece o uso de um inibidor de PARP na fabricação de um medicamento para induzir apoptose em células defeituosas em HR.
[0018]Em outro aspecto, a invenção fornece um método de induzir apoptose em células defeituosas em HR em um mamífero cujo método compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de PARP.
[0019]Causando-se apoptose em células defeituosas em HR, seria possível reduzir ou parar o crescimento de um tumor no mamífero.
[0020]Preferivelmente, as células defeituosas em HR são células de câncer.
[0021]Células de câncer defeituosas em HR pode parcialmente ou totalmente deficiente em HR. Preferivelmente as células de câncer são totalmente deficientes em HR.
[0022]O termo “câncer” ou “tumor” inclui câncer de pulmão, cólon, pancreáti- co, gástrico, ovariano, cervical, de mama ou prostático. O câncer pode da mesma forma incluir câncer de pele, renal, fígado, bexiga ou cerebral. Em um aspecto preferido, o câncer está em um mamífero, preferivelmente humano.
[0023]O câncer a ser tratado pode estar uma forma herdada de câncer em que o paciente a ser tratado tem uma predisposição familiar ao câncer. Preferivelmente, o câncer a ser tratado é câncer hereditário ligado por gene. Em uma modalidade preferida da invenção o câncer é câncer de mama hereditário ligado por gene.
[0024]Em uma modalidade preferida, o inibidor de PARP é útil no tratamento de células de câncer defeituosas na expressão de um gene envolvido em HR. Os genes com função sugerida em HR incluem XRCC1, ADPRT (PARP-1), ADPRTL2 (PARP-2), CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NBS1, WRN, BLM, Ku70, Ku80, ATM, ATR, chk1, chk2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, RAD9, FEN-1, Mus81. Eme1, DDS1, BARD (veja (2,3, 5, 22-28) para revisões).
[0025]Um gene envolvido em HR pode ser um gene supressor de tumor. A invenção desse modo fornece o tratamento de células de câncer defeituosas na ex-pressão de um gene supressor de tumor. Preferivelmente, o gene supressor de tumor é BRCA1 ou BRCA2.
[0026]O câncer de mama é a doença de câncer mais comum entre mulheres no mundo Ocidental hoje. Certas famílias têm forte predisposição ao câncer de mama, que é frequente devido a uma mutação herdada em um alelo de BRCA1 ou BRCA2. Entretanto, estes pacientes ainda mantêm um alelo funcional. Desta maneira, estes pacientes normalmente desenvolvem e não têm nenhuma consequência fenotípica desta mutação. Entretanto, em uma célula, o alelo funcional poderia estar perdido, tornando esta célula cancerosa e ao mesmo tempo deficiente em recombi- nação homóloga (HR). Esta etapa é crítica para o início de um tumor (1).
[0027]Os presentes inventores têm surpreendentemente constatado que cé-lulas deficientes em BRCA2 são 100 vezes mais sensíveis à citotoxicidade do inibidor de PARP, NU1025, do que células tipo silvestre.
[0028]Desta maneira, em um aspecto preferido, a invenção fornece o uso de um inibidor de PARP na fabricação de um medicamento para o tratamento de células de câncer defeituosas em HR, e. g devido a perda de expressão de BRCA1 e /ou BRCA2.
[0029]As células de câncer a ser tratadas podem ser parcialmente ou total-mente deficientes na expressão de BRCA1 ou BRCA2. As mutações de BRCA1 e BRCA2 podem ser identificadas empregando-se técnicas de PCR multíplex, técnicas de disposição (29, 30) ou empregando-se outras avaliações conhecidas pela pessoa versada.
[0030]Os inibidores de PARP úteis na presente invenção podem ser selecio-nados de inibidores de PARP-1, PARP-2, PARP-3, PARP-4, tankyrase 1 ou tankyra- se 2 (veja 31 para uma revisão). Em uma modalidade preferida, o inibidor de PARP útil na presente invenção é um inibidor de atividade de PARP-1.
[0031]Os inibidores de PARP úteis na presente invenção incluem benzimi- dazol-carboxamidas, quinazolin-4-[3H]-onas e derivados de isoquinolina (por exem-plo, 2-(4-hidroxifenil)benzimidazol-4-carboxamida (NU1085), 8-hidróxi-2- metilquinazolin-4-[3H]ona (NU1025); 6(5H)fenantridinona; 3-aminobenzamida; ben- zimidazol-4-carboxamidas (BZ1-6) e indóis de lactama tricíclicos (TI1-5) [32]. Outros inibidores de PARP podem ser identificados por projeto ou [33] ou o novo ensaio de FlashPlate [34].
[0032]O inibidor de PARP formulado como uma composição farmacêutica pode ser administrado de qualquer maneira eficaz, conveniente eficaz para alvejar células de câncer incluindo, por exemplo, administração por rotinas orais, intraveno- sas, intramusculares, intradérmicas, intranasais, tópicas entre outros. Os portadores ou diluentes úteis na composição farmacêutica podem incluir, porém não são limitados a, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol e combinações destes. Na terapia ou como um profilático, o agente ativo pode ser administrado a um indivíduo como uma composição injetável, por exemplo como uma dispersão aquosa estéril. O inibidor pode ser administrado diretamente a um tumor ou pode ser alvejado ao tumor por meio de administração sistêmica.
[0033]Uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor é tipicamente um que é suficiente para obter o efeito desejado e pode variar de acordo com a natureza e severidade da condição da doença, e da potência do inibidor. Será apreciado que concentrações diferentes podem ser empregadas para profilaxia do que para trata-mento de uma doença ativa.
[0034]Para administração a mamíferos, e particularmente humanos, é espe-rado que o nível de dosagem diária do agente ativo seja até 100 mg/kg, por exemplo de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, tipicamente até 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 5,0, 10, 15, 20 ou 30 mg/kg de peso corporal. Ultimamente, entretanto, a quantidade de ini-bidor administrada e a frequência de administração estarão na discrição de um mé-dico.
[0035]Uma vantagem terapêutica de empregar inibidores de PARP para tratar células de câncer é que baixíssimas doses são necessárias para ter um efeito terapêutico no tratando de câncer desse modo reduzindo a construção sistêmica dos inibidores e quaisquer efeitos tóxicos associados.
[0036]Um aspecto preferido da invenção fornece um agente que é uma mo-lécula de RNA (RNAi) inibidor.
[0037]Uma técnica para especificamente remover a função do gene é pela introdução de RNA de filamento duplo, da mesma forma referido como RNA inibidor (RNAi), em uma célula que resulta na destruição de mRNA complementar à se- quência incluída na molécula de RNAi. A molécula de RNAi compreende dois fila-mentos complementares de RNA (um filamento de sentido e um filamento antisenti- do) recozidos mutuamente para uma molécula de RNA de filamento duplo. A molé-cula de RNAi é derivada tipicamente da sequência de codificação ou exônica do gene que deve ser removido. Preferivelmente a referida molécula de RNAi é derivada da molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em: a) uma sequência de ácido nucléico como representado pela sequência na Figura 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 ou fragmento desta; b) uma sequência de ácido nucléico que hibridiza para as sequências de ácido nucléico das Figuras 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 e codifica um gene para PARP; c) uma sequência de ácido nucléico que compreende sequências que são degeneradas como um resultado do código genético para as sequências de ácido nucléico definidas em (a) e (b).
[0038]Recentes estudos sugerem que moléculas de RNAi variando de 100 - 1000bp derivadas da sequência de codificação são inibidores eficazes da expressão de gene. Surpreendentemente, apenas algumas moléculas de RNAi são requeridas para bloquear a expressão de gene que implica o mecanismo é catalítico. O sítio de ação parece ser nuclear quando pequeno se qualquer RNAi for detectável no citoplasma de células que indicam que RNAi mostra seu efeito durante o processo ou síntese de mRNA.
[0039]Mais preferivelmente, a referida molécula de RNAi de acordo tem um comprimento dentre 10 bases de nucleotídeo (nb)-1000nb. Ainda mais preferivel-mente, a referida molécula de RNAi tem um comprimento de 10nb; 20nb; 30nb; 40nb; 50nb; 60nb; 70nb; 80nb; 90nb; ou 100bp. Ainda mais preferivelmente entretanto a referida molécula de RNAi é de 21nb no comprimento.
[0040]Ainda mais preferivelmente entretanto a molécula de RNAi compreen- de a sequência de ácido nucléico aaa agc cau ggu gga gua uga (PARP-1).
[0041]Ainda mais preferivelmente entretanto a molécula de RNAi consiste na sequência de ácido nucléico aag acc aau cuc ucc agu uca ac (PARP-2).
[0042]Ainda mais preferivelmente entretanto a molécula de RNAi consiste na sequência de ácido nucléico aag acc aac auc gag aac aac (PARP-3).
[0043]A molécula de RNAi pode compreender bases de nucleotídeo modifi-cadas.
[0044]Características preferidas de cada aspecto da invenção são como para cada dos outros aspectos mutatis mutandis.
[0045]A presente invenção será descrita agora por meio de exemplo apenas com referência às figuras acompanhantes, em que:
[0046]Figura 1 é um gráfico que demonstra que células deficientes de HR são hipersensíveis ao efeito tóxico causado por inibição de PARP-1. O crescimento de colônia das linhagens de célula de hamster Chinês AA8 (tipo silvestre), irs1SF (deficiente em HR[4]), CXR3 (irs1SF complementada com XRCC3 [2]), V79 (tipo sil-vestre), irs1 (deficiente em HR[5]) ou irs1X2.2 (irs1 complementada com XRCC2 [1]) na exposição a 3-AB (A), ISQ (B) ou NU1025 (C). As médias (símbolos) e desvio padrão (bars) de pelo menos três experiências são mostrados. O ensaio de crescimento de colônia foi empregado;
[0047]Figura 2 é um gráfico que mostra a sobrevivência de célula na presença de inibidor de PARP NU1025 em células wt V79, células VC-8 deficientes em BRCA2 e células VC-8 complementares com gene BRCA2 funcional VC-8#13, VC- 8+B2). Ensaio de crescimento de colônia foi empregado;
[0048]Figura 3 é um histograma que mostra a porcentagem das células em apoptose que segue uma incubação de 72 horas com NU1025;
[0049]Figura 4. (a) análise de Western blot de lisados de proteína isolados de MCF-7 (p53wt) ou células de câncer de mama MDA-MB-231 (p53mut) que seguem 48 horas de transfecção com siRNA. (b) Crescimento de colônia de células MCF-7 tratadas com siRNA ou (c) células MDA-MB-231 que seguem exposição ao inibidor de PARP NU1025. As médias (símbolos) e desvio padrão (bars) de pelo menos três experiências são mostrados.
[0050]Figure 5. Células deficientes de BRCA2 falham ao reparar uma lesão de recombinação formada em forquilhas de replicação por inibidores de PARP. (a) Visualização das quebras do filamento duplo (DSBs) em células deficientes ou profi-cientes de BRCA2 que seguem um tratamento de 24 horas com NU1025 (0,1 mM) por eletroforese em gel de campo de pulsação. 2 mM de hidroxiuréia foram empregados como um controle positivo. (b) Visualização de focos de yH2Ax em células V- C8+B2 e V-C8 não tratadas. Número de células contendo focos de yH2Ax (c) ou focos de RAD51 (d) visualizados em células V-C8+B2 e V-C8 que seguem um tratamento de 24 horas com NU1025 (10 μM). As médias (símbolos) e erros padrão (bars) de três a nove experiências são mostrados. (e) Um modelo sugerido para morte celular induzida em células deficientes de BRCA2.
[0051]Figura 6. PARP-1 e não PARP-2 é importante na prevenção da forma-ção de uma lesão recombinogênica, causando morte na ausência de BRCA2. (a) RT-PCR em RNA isolado de células SW480SN.3 tratadas com siRNA de BRCA2, PARP-1 e PARP-2 em combinações como mostrado durante 48 horas. (b) Sobrevivência clonogênica seguindo depleção de 48 horas de BRCA2, PARP-1 e PARP-2. As médias (símbolos) e desvio padrão (bars) de pelo menos três experiências são mostrados. Duas e três asteriscos designam a significação estatística em teste t p<0,01 e p<0,001, respectivamente. (c) Western blot para PARP-1 em células SW480SN.3 tratadas com siRNA diferentes.
[0052]Figura 7. (a) Visualização de polímeros de PAR em células V79 não tratadas e (b) tratadas com timidina (5 mM durante 24 horas). (c) Porcentagem de células que contêm >10 sítios de atividade de PARP seguindo tratamento com hi- droxiuréia (0,2 mM) e timidina (5 mM). Pelo menos 300 núcleos foram contados para cada tratamento e experiência. (d) Sobrevivência de células V-C8+B2 seguindo co- tratamento com hidroxiuréia ou (e) timidina e NU1025 (10 μM). (f) A atividade de PARP foi medida pelo nível de NAD(P)H11 livre seguindo o tratamento com MMS, hidroxiuréia (0,5 mM) ou timidina (10 mM). As médias (símbolo) e desvio padrão (er-ro bars) de pelo menos três experiências são descritos.
[0053]Figura 8. (a) Visualização de polímeros de PAR em células V-C8 e (b) V-C8+B2 não tratadas. (c) Quantificação de células em porcentagem que contêm >10 sítios de atividade de PARP em células V-C8 e V-C8+B2 não tratadas. (d) Nível de NAD(P)H medido em células V-C8 e V-C8+B2 não tratadas. Três asteriscos designam p<0,001 no teste t. (e) Visualização de RAD51 e sítios de atividade de PARP em células V79 que seguem um tratamento (5 mM) de timidina de 24 horas. (f) Um modelo para o papel de PARP e HR em forquilhas de replicação bloqueadas. Figura 9 é a sequência de cDNA humano de PARP-1; Figura 10 é a sequência de cDNA humano de PARP-2; Figura 11 é a sequência de cDNA humano de PARP-3; Figura 12 é a sequência de gDNA humano de Tankyrase 1; Figura 13 é a sequência de mDNA humano de Tankyrase 2; Figura 14 é a sequência de mDNA humano de VPARP. Materiais e Métodos Citotoxicidade de inibidores de PARP para células defeituosas de HR: XRCC2, XRCC3 ou BRCA2
Cultura de célula
[0054]As linhagens de célula irs1, irs1X2.1 e V79-4 foram uma doação de John Thacker [40] e as linhagens de célula AA8, irs1SF e CXR3 foram fornecidas por Larry Thompson[41].
[0055]As VC-8, VC-8+B2, VC-8#13 foram uma doação de Malgorzata Zdzie- nicka[42]. Todas as linhagens celulares neste estudo foram crescidas em Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino Fetal e penicilina (100 U/ml) e sulfato de estreptomicina (100 μg/mL) a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de CO2.
Ensaio de toxicidade - ensaio de crescimento de colônia
[0056]500 células suspensas em médio foram semeadas em uma placa de Petri 4 horas antes da adição de 3-AB, ISQ ou NU1025. ISQ e NU1025 foram dissol-vidos em DMSO em uma concentração final de 0,2% em médio de tratamento. 7 - 12 dias depois, quando as colônias puderam ser observadas, estas colônias foram fixadas e manchadas com azul de metileno em metanol (4 g/l). As colônias que consistem em mais de 50 células foram contadas subsequentemente.
Experiências de apoptose
[0057]0,25x106 foram semeadas em placas de Petri e crescidas durante 4 horas antes do tratamento com NU1025. Depois de 72 horas, as células foram tripsi- nizadas e re-suspensas com meio contendo quaisquer células flutuantes dessa amostra. As células foram empelotadas por centrifugação e re-suspendas para análise de apoptose com anexina-V conjugada de FITC e iodo de propídio (PI) (ApoTarget, Biosource International) de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo (Becton - Dickenson FACSort, 488 nm de laser), e a porcentagem de células apoptóticas foi determinada pela fração de células vivas (PI-negativo) ligadas com anexina-V conjugadas por FITC.
Imunofluorescência
[0058]As células foram semeadas em lamínulas 4 horas antes dos tratamentos de 24 horas como indicado. Seguindo os tratamentos, o meio foi removido e as lamínulas enxaguadas uma vez em PBS a 37°C e fixadas como descrito em outro lugar [2]. Os anticorpos primários e diluições empregadas neste estudo foram; anti PAR policlonal de coelho (Trevigen; 1:500), anti Rad51 policlonal de cabra (C-20, Santa Cruz; 1:200) e anti Rad51 policlonal de coelho (H-92, Santa Cruz; 1:1000). Os anticorpos secundários foram anticorpo de IgG anti-coelho de cabra conjugado de Cy-3 (Zymed; 1:500), anticorpo de IgG de F(ab’)2 anti-coelho de cabra Alexa 555 (Sondas Moleculares; 1:500), anticorpo de IgG anti-coelho de burro Alexa 546 (Sondas Moleculares; 1:500) e anticorpo de IgG anti-coelho de burro Alexa 488 (Sondas Moleculares; 1:500). Os anticorpos foram diluídos em PBS contendo 3% de albumina sérica bovina. DNA foi manchado com 1 μg/ml de To Pro (Sondas Moleculares). As imagens foram obtidas com um microscópio confocal invertido Zeiss LSM 510 empregando objeto de imersão em óleo planapochromat 63X/NA 1.4 e comprimentos de onda de excitação de 488, 546 e 630 nm. Através do foco, imagens de projeção máxima foram adquiridas de seções ópticas de 0,50 μm à parte e com uma espessura de seção de 1,0 μm. As imagens foram processadas empregando Adobe PhotoShop (Abacus Inc). Pelo menos 300 núcleos foram contados em cada lâmina e aqueles contendo mais de 10 focos de RAD51 ou sítios de atividade de PARP foram classificados como positivas.
Ensaios de atividade de PARP
[0059]Sal de tetrazólio solúvel em água (5 mM de WST-8) foi empregado pa-ra monitorar a quantidade de NAD(P)H através de sua redução em uma tintura[43] de formazana de coloração amarela. 5000 células foram semeadas em pelo menos três vezes em cavidades de uma placa de 96 cavidades e cultivadas em 100 μl de meios de crescimento normais durante 4 horas a 37°C. Tampão de CK8 (Dojindo Molecular Technology, Gaithersburg, USA), contendo WST-8, foi em seguida adicionado com ou sem tratamento com agentes de danificação de DNA em concentrações indicadas. A redução de WST-8 na presença de NAD(P)H foi determinada medindo-se a absorvência visível (OD450) a cada 30 minutos. Um blank médio foi da mesma forma preparado contendo apenas meios e tampão de CK8. Mudanças nos níveis de NAD(P)H foram calculadas comparando-se a absorvência de cavidades contendo células tratadas com agentes de danificação de DNA e aquelas tratadas apenas com DMSO. Alternadamente, níveis relativos de NAD(P)H em linhagens ce-lulares diferentes foram calculados depois de 4 horas de incubação em tampão de CK8.
[0060]A capacidade de NU1025 inibir a atividade de PARP-1 foi da mesma forma ensaiada em células permeabilizadas empregando uma modificação do método de Halldorsson e outros [44], e descrita em detalhes em outro lugar [45]. Brevemente: 300 μl de células permeabilizadas tratadas com NU1025 (15 minutos) foram incubados a 26°C com oligonucleotídeo (concentração final de 2,5 μg/ml), 75 μM de NAD +[32p] NAD (Amersham Pharmacia, Amersham, UK) em um volume total de 400 μl. A reação foi terminada depois de 5 minutos adicionando-se 10% de TCA frio 10% de Na Ppi durante 60 minutos antes da filtragem através de um filtro Whatman GF/C (LabSales, Maidstone, UK), enxaguada 6x com 1% de TCA 1% de NaPPi, deixada secar e a radioatividade incorporada foi medida para determinar a atividade de PARP-1. Os dados são expressos como pmol de NAD incorporado/106 células por referência aos padrões de [32P]NAD.
Eletroforese em gel de campo de pulsação
[0061]1,5x106 células foram semeadas em placas de 100 mm e permitidas 4 h para ligação. Exposição à droga foi durante 18 h depois que a células foram tripsi- nizadas e 106 células fundidas em cada inserção de 1% de agarose. Estas inserções foram incubadas como descrito em outro lugar (8) e separadas por eletroforese em gel de campo de pulsação durante 24 horas (BioRad; ângulo de 120°, tempo de mudança de 60 a 240 s, 4 V/cm). O gel foi subsequentemente manchado com brometo de etídio para análise.
Tratamento de siRNA
[0062]siRNAs misturados e SMARTpool de BRCA2 pré designados foram adquiridos (Dharmacon, Lafayette, CO). 10000 células foram semeadas em placas de 6 cavidades e deixadas durante a noite antes de transfectadas com 100nM de siRNA empregando Reagente de Oligofectamina (Invitrogen) de acordo com instru-ções dos fabricantes. Células foram em seguida cultivadas em meios de crescimento normal durante 48 horas antes da tripsinização e re-semeadas para ensaios de toxicidade. A supressão de BRCA2 foi confirmada por Western blotting (como previ-amente descrito [46]) de extratos de proteína tratados com siRNA com um anticorpo contra BRCA2 (Oncogene, Nottingham, UK).
EXEMPLOS Células deficientes em recombinação homóloga são hipersensíveis à inibição de PARP-1
[0063]Para investigar o envolvimento de HR em respostas celulares para ini-bição de PARP-1, os efeitos de inibidores de PARP-1 na sobrevivência de linhagens celulares deficiente de reparo em HR foram estudados. Foi constatado que as células deficientes em HR (isto é , irs1SF que é defeituosa em XRCC3 ou irs1 que é defeituosa em XRCC2 [veja Tabela 1] foram muito sensíveis ao efeito tóxico de 3- aminobenzamida (3-AB) e para dois inibidores mais potentes de PARP-1: 1,5- diidroxiisoquinolina (ISQ; [37]) ou 8-hidróxi-2-metilquinazolinona (NU1025[38, 39]) (Figura 1). A sensibilidade em células irs1SF a 3-AB, ISQ ou NU1025 foi corrigida pela introdução de um cosmídeo contendo um gene de XRCC3 funcional (CXR3). Similarmente, a sensibilidade em células irs1 a 3-AB, ISQ ou NU1025 foi corrigida pela introdução de um cosmídeo contendo um gene de XRCC2 funcional (irs1X2.2).
Células deficientes de BRCA2 são hipersensíveis a inibição de PARP-1
[0064]A sobrevivência de células deficientes de BRCA2 (VC8) e células tipo silvestres (V79Z) na presença de inibidores de PARP-1 foi investigada. Foi constatado que as células VC8 são muito sensíveis ao efeito tóxico de NU1025 (Figura 2). A sensibilidade em células VC8 foi corrigida pela introdução de um gene de BRCA2 funcional no cromossoma 13 (VC8#13) ou em um vetor de super-expressão (VC8+B2). Este resultado demonstra que a sensibilidade a inibidores de PARP-1 é uma consequência direta da perda da função de BRCA2.
[0065]Para investigar se a inibição de PARP-1 dispara apoptose em células deficientes de BRCA2, o nível de apoptose 72 horas a seguir à exposição a NU1025 foi investigado. Foi constatado que NU1025 disparou apoptose somente em células VC8, mostrando que a perda de atividade de PARP-1 em células deficientes de BRCA2 dispara esta forma de morte (Figura 3).
Células de câncer de mama deficientes de BRCA2 são hipersensíveis a ini-bição de PARP-1
[0066]Foi examinado se as linhagens celulares de câncer de mama MCF7 (p53 tipo silvestre) e MDA-MB-231 (p53 mutado) exibiram uma sensibilidade similar a NU1025 na depleção de BRCA2. Foi constatado que inibidores de PARP reduziram profundamente a sobrevivência de células MCF7 e MDA-MB-231 somente quando BRCA2 foi esgotado com uma mistura de siRNA de BRCA2 (Figura 4). Isto mostra que células de câncer de mama esgotadas de BRCA2 são sensíveis aos inibidores de PARP independente do estado de p53.
Células deficientes de BRCA2 morrem a partir da inibição de PARP-1 na au-sência de quebras do filamento duplo do DNA (DSBs) porém na presença yH2Ax
[0067] HR é conhecido por estar envolvido no reparo de DSBs e outras lesões que ocorrem durante a replicação de DNA [2]. Para determinar se a sensibilidade de células deficientes de BRCA2 é o resultado de uma incapacidade de reparar DSBs seguindo tratamento de NU1025, o acúmulo de DSBs em células V79 e VC8 foi medido seguindo tratamentos com níveis altamente tóxicos de NU1025. Foi constatado que nenhuma DSB foi detectável por análise eletroforética de gel de campo pulsado de DNA obtida das células tratadas (Figure 5A), sugerindo que baixos níveis de DSBs ou outros substratos recombinogênicos acumularam-se seguindo a inibição de PARP em células deficientes de HR, que dispara yH2Ax Figura 5B). A razão pela qual as células deficientes de BRCA2 morrem seguindo indução destas lesões recombinogênicas é provável de ser devido a uma incapacidade de reparar tais lesões. Para testar isto, a capacidade de células V-C8 deficientes de BRCA2 e células complementadas de BRCA2 de formar focos de RAD51 em resposta a NU1025 foi determinada. Foi constatado que focos de RAD51 foram realmente induzidos em células V-C8+B2 seguindo tratamento com NU1025 (estatisticamente signi- ficante no teste t p<0,05; Figura 5D). Isto indica que as lesões recombinogênicas disparam reparo por HR nestas células permitindo-as sobreviverem. Ao contrário, as células V-C8 deficientes de BRCA2 foram incapazes de formar focos de RAD51 em resposta ao tratamento de NU1025 (Figura 5D) não indicando HR, o que deixaria as lesões recombinogênicas não reparadas e desse modo causaria a morte celular.
PARP-1 e não PARP-2 são importantes na prevenção da formação de uma lesão recombinogênica
[0068]Há duas PARPs principais presentes nos núcleos em células de ma-mífero, PARP-1 e PARP-2 e todos inibidores de PARP relatados inibem ambas. A fim de distinguir qual PARP foi responsável pelo efeito, nós testamos se a ausência de PARP-1 e/ou PARP-2 resulta no acúmulo de lesões tóxicas, esgotando-se estas e BRCA2 com siRNA em células humanas (Figura 6a). Nós constatamos que a so-brevivência clonogênica foi significativamente reduzida quando ambas proteínas PARP-1 e BRCA2 foram co-esgotadas de células humanas (Figura 6b). A depleção de PARP-2 com BRCA2 não teve efeito sobre a sobrevivência clonogênica e deple- ção de PARP-2 em PARP-1 e células esgotadas de BRCA2 não resultaram em toxicidade adicional. Estes resultados sugerem que PARP-1 e não PARP-2 são responsáveis para reduzir lesões recombinogênicas tóxicas em células humanas. A eficiência de clonagem foi somente reduzida em 60% de controle em células co-esgotadas de PARP-1 e BRCA2, enquanto nenhuma célula deficiente em HR sobreviveu aos tratamentos com inibidores de PARP. Isto é provável estar com depleção incompleta da proteína PARP-1 abundante por siRNA (Figura 6c), que pôde ser suficiente para manter a função de PARP-1 em algumas das células.
PARP-1 é ativado por inibidores de replicação
[0069]HR está da mesma forma envolvida no reparo de lesões que ocorrem em forquilhas de replicação bloqueada, que não pode envolver DSBs detectáveis [2]. Para testar se PARP tem um papel nas forquilhas de replicação, a ativação de PARP em células tratadas com agentes (timidina ou hidroxiuréia) que retardam ou inter-rompem o progresso de forquilhas de replicação de DNA foi examinada. Timidina esgota células de dCTP e reduz as forquilhas de replicação sem causar DSBs. Hi- droxiuréia esgota vários dNTP e bloqueia a forquilha de replicação, que é associada com a formação de DSBs em forquilhas de replicação [2]. Ambos destes agentes potencialmente induzem HR [2]. Células de hamster V79 tratadas durante 24 horas com timidina ou hidroxiuréia foram manchadas para polímeros de PAR. Isto revelou um aumento substancial no número de células contendo sítios de atividade de PARP (Figura 7C). Este resultado sugere uma função para PARP em forquilhas de replica- ção bloqueadas. Foi da mesma forma mostrado que a inibição de PARP com NU1025 realça a sensibilidade à timidina ou hidroxiuréia em células V-C8+B2 (Figura 7D,E). Este resultado sugere que a atividade de PARP é importante no reparo de forquilhas de replicação bloqueadas ou alternativamente que previne a indução de morte em células com forquilhas de replicação bloqueadas.
[0070]PARP é rapidamente ativada em quebras do filamento único do DNA (SSB) e atrai enzimas de reparo de DNA [3-6]. Sulfonato de metilmetano (MMS) causa alquilação de DNA, que é reparado por reparo de excisão base. PARP é ativada rapidamente pelo intermediário de SSB formado durante este reparo, que esgota os níveis de NAD(P)H (Figura 7F). Nós constatamos que a ativação de PARP e redução de níveis de NAD(P)H são muito mais lentas seguindo tratamentos com ti- midina ou hidroiuréia. Esta ativação de PARP lenta pode ser explicada pela ação indireta de timidina e hidroxiuréia e o tempo requerido para acumular forquilhas de replicação bloqueadas como células entra na fase S do ciclo celular.
PARP-1 e HR têm papéis separados em forquilhas de replicação bloqueadas
[0071]O número de sítios de atividade de PARP em células V-C8 deficientes de BRCA2 não tratadas foi determinado. Foi constatado que mais células V-C8 con-têm sítios de atividade de PARP comparados a células V-C8+B2 (Figura 8A, B, C). Da mesma forma, as células V-C8 têm níveis de NAD(P)H livres mais baixos do que as células corrigidas (Figura 8D), como um provável resultado da atividade de PARP aumentada. Importantemente, estes sítios de atividade de PARP não sobrepõem com focos de RAD51 (Figura 8E).
[0072]Os resultados aqui sugerem que PARP e HR têm papéis separados na proteção ou auxílio de forquilhas de replicação bloqueadas (Figura 8F). Uma perda de atividade de PARP pode ser compensada aumentando-se HR enquanto uma perda de HR pode ser compensada por atividade de PARP aumentada. Entretanto, a perda de ambas estas vias leva ao acúmulo de forquilhas de replicação bloqueadas e à morte, como no caso de células deficientes de BRCA2 inibidas por PARP.
[0073]Como mostrado no modelo esboçado na Figura 8F, PARP e HR têm papéis complementares em forquilhas de replicação bloqueadas. (i) Forquilhas de replicação podem bloquear ao encontrar um bloqueio no padrão de DNA. Além disso, elas podem da mesma forma bloquear temporariamente, devido à falta de dNTPs ou outros co-fatores de replicação. (ii) PARP liga forquilhas de replicação bloqueadas ou outro dano associado à replicação, disparando polimerização de PAR. Polímeros de PAR negativamente carregados resultantes podem proteger forquilhas de replicação bloqueadas, repelindo-se proteínas que normalmente preparariam forquilhas de replicação (por exemplo, resolvases), até que a forquilha de replicação possa ser restaurada espontaneamente quando dNTPs ou outros co-fatores tornem-se disponíveis. Alternativamente, polímeros de PAR ou PARP podem atrair proteínas para resolver o bloco de replicação por outros meios. (iii) Na ausência de atividade de PARP, HR pode ser empregada como uma trilha alternativa para reparar as forquilhas de replicação bloqueadas. Este modelo compensatório esclarece o nível aumentado de focos de HR e RAD51 encontrados em células3-5 deficientes de PARP e atividade de PARP superior encontrada em células deficientes de HR (isto é, VC8). Blocos/lesões de replicação espontâneos são apenas letais na ausência de ambas PARP e HR. Tabela 1. Genótipo e origem de linhagens celulares empregadas neste estudo.
Figure img0001
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Claims (10)

1. Uso de um inibidor de poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP-1), CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de células de câncer defeituosas em recombinação homóloga (HR) em um ser humano, em que as células de câncer apresentam um defeito em um gene selecionado a partir do grupo que consiste em XRCC2, XRCC3 e BRCA2; em que o inibidor de PARP-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em benzimidazol-carboxamidas, quinazolin-4-[3H]-onas, 6(5H)fenantridinona, 3- aminobenzamida, benzimidazol-4-carboxamidas, indóis de lactama tricíclicos, 2-(4- hidroxifenil)benzimidazol-4-carboxamida e 8-hidroxi-2-metilquinazolin-4-[3H]ona; e em que o inibidor de PARP-1 não é um composto de fórmula:
Figure img0002
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as células de câncer defeituosas em HR são parcialmente deficientes em HR.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as células de câncer defeituosas em HR são totalmente deficientes em HR.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o defeito é a ausência do gene.
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que as células de câncer a serem tratadas são se-lecionadas do grupo que consiste em células de câncer de pulmão, do cólon, pan- creáticas, gástricas, ovarianas, da cervical, da mama e da próstata.
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que as células de câncer a serem tratadas são célu-las de câncer hereditárias ligadas ao gene.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que as células de câncer a serem tratadas são células de câncer de mama.
8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que as células de câncer a serem tratadas são de-feituosas na expressão de BRCA2.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que as células de câncer são parcialmente deficientes na expressão de BRCA2.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que as células de câncer são totalmente deficientes na expressão de BRCA2.
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