CN108048465A

CN108048465A - 一种抑制PARP基因用于治疗乳腺癌的siRNA

Info

Publication number: CN108048465A
Application number: CN201711385728.0A
Authority: CN
Inventors: 李风玲; 柳平; 柳一平; 卓南; 毛帮成; 季晓
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2018-05-18

Abstract

本发明涉及乳腺癌治疗技术领域，特别涉及利用抑制PARP基因表达的siRNA来降低PARP基因的表达水平，通过在线软件设计3对针对PARP基因的siRNA，通过Real‑time PCR、Western Blot和MTT实验分别检测PARP mRNA表达水平降低、蛋白质表达水平降低和抑制乳腺癌细胞增长，表明该siRNAs能够高效抑制PARP基因的表达，为PARP抑制剂的研发提供理论基础。

Description

一种抑制PARP基因用于治疗乳腺癌的siRNA

技术领域

本发明涉及乳腺癌治疗技术领域，特别涉及一种抑制PARP基因表达的siRNA来降低PARP基因的表达水平，达到治疗乳腺癌的目的。

背景技术

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）广泛存在于真核细胞中，PARP是一个超蛋白家族，迄今为止已经发现了十余种PARP，PARP的功能涉及DNA修复、细胞增殖、细胞死亡和端粒长度调节等多方面，PARP能够迅速与DNA断链结合，活性增加数百倍之多，能够通过碱基切除修复途径使受损的DNA得以修复，在DNA损伤修复中发挥着重要作用。现存很多化疗药物的目的都是通过损伤DNA杀伤肿瘤细胞，肿瘤细胞也会针对不同的化疗药物启动修复途径，对抗化疗药物会产生一定的耐药性，降低化疗药物的疗效。

RNA 干扰技术是一种新兴的基因治疗技术，又称为基因敲低 (knock-down) 或基因沉默 (gene silencing)，其中 siRNA(small interfering RNA) 是最关键的效应分子，其具有 21-23nt 碱基的短片段双链 RNA 分子，能够以序列特异性地结合靶 mRNA 并使mRNA 降解。能有效、特异地抑制细胞内基因的表达。由于 RNA 干扰具有高效、特异性，siRNA 介导的转录后基因沉默是针对靶向基因的外显子序列，对其启动子或内含子序列却没有效应，是一种转录后基因表达调控机制，且不诱导非特异性的干扰素激活途径，因而成为继反义核普酸、核酶技术之后一种新的分析功能缺失表型的工具，为基因功能研究和基因治疗开辟了新的道路。

PARP抑制剂通过抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞发生凋亡，从而可增强化疗药物的疗效，是一种能够影响癌细胞的自我复制方式的医学用剂。对于PARP抑制剂，医学专家们寄予了厚望，也给肿瘤患者带来希望，但我国对于PARP抑制剂的研究还落后于国际水平，故需要为PARP抑制剂提供一些理论基础，从而推动我国在此领域研发的进度。

发明内容

鉴于以上问题，本提供3 对针对PARP基因 DNA 片段的 siRNA，能高效的抑制PARP基因表达的小干扰核糖核酸，为研发PARP抑制剂做好理论准备。

所述 siRNA 序列包含如下序列：

siRNA1 正义链：5’- CAGGCUGCUUUGUCAAGAAUU-3’

反义链：3’- UUGUCCGACGAAACAGUUCUU-5’；

siRNA2 正义链：5’- GAGCUACUCAUCUUCAACAUU-3’

反义链：3’- UUCUCGAUGAGUAGAAGUUGU-5’；

siRNA3 正义链：5’- CAAAGGAAUUCCGAGAAAUUU-3’

反义链：3’- UUGUUUCCUUAAGGCUCUUUA-5’。

本发明提供了一种小分子干扰核糖核酸，其包含正义 RNA 片段和反义 RNA片段，所述正义 RNA片段和所述反义 RNA片段能形成双链 RNA，该双链 RNA能抑制PARP基因的表达。对于上述小分子干扰核糖核酸来说，所述正义RNA片段和反义RNA片段可以存在于两条不同的RNA 链上，也可以存在于同一条RNA 链上。当正义RNA片段和反义RNA片段存在于同一条RNA链上时，所述核糖核酸优选为发夹型单链RNA分子，其中正义 RNA片段和反义 RNA片段之间的互补区域形成双链 RNA 区域。对于任一项所述的小分子干扰核糖核酸，其中双链 RNA 的互补区域至少有 19 个碱基对。本发明的所述抑制PARP基因表达的 siRNA，通过人工合成形成，其生产和制备属于现有技术。

进一步的，Real-time PCR检测mRNA表达水平。

进一步的，Western Blot实验检测蛋白质表达水平。

进一步的，MTT法为实验手段检测癌细胞生长。

所述的Real-time PCR实验、Western Blot实验和MTT法中，所选择的癌细胞均为人乳腺癌细胞株T47D。

本发明提供的siRNA能抑制PARP基因的表达，Real-time PCR检测PARP mRNA表达水平降低，Western Blot实验检测PARP蛋白质表达水平降低，MTT法中可抑制 T47D细胞的生长，该 siRNAs能够高效特异地抑制PARP基因的表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为RT-PCR 实验显示PARP siRNA 组mRNA 表达量有所下降。

图2为Western Blot 实验灰度值分析，转染 PARP siRNA 组的PARP蛋白的表达水平相对于阴性对照组显著下降。

图3为MTT实验显示可抑制 T47D细胞的生长。

附图标记说明

Blank代表空白对照组

NC代表阴性对照组

PA-siR代表转染 PARP siRNA 组。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1. siRNA 的设计合成及转染

从Genebank中调取PARP基因(NM_001618) 信息，用在线设计软件设计针对 PARP基因可能有效的 siRNA 靶点；再通过 BLAST 分析，将候选 siRNA 靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同 PARP基因以外的其它人类基因序列具有较高序列同源性 (16 个以上碱基 ) 的序列，以确保候选 siRNA 靶位点不会对其它人类基因发生抑制作用，而仅对PARP基因具有特异的抑制作用。分析设计总共得到 3对 siRNA：

siRNA1 正义链：5’- CAGGCUGCUUUGUCAAGAAUU-3’

反义链：3’- UUGUCCGACGAAACAGUUCUU-5’；

siRNA2 正义链：5’- GAGCUACUCAUCUUCAACAUU-3’

反义链：3’- UUCUCGAUGAGUAGAAGUUGU-5’；

siRNA3 正义链：5’- CAAAGGAAUUCCGAGAAAUUU-3’

反义链：3’- UUGUUUCCUUAAGGCUCUUUA -5’。

选取与基因组中的任何序列都没有连续 16 个碱基的同源性的靶序列作为阴性对照 NC，具体序列如下：

正义链序列：5’-UUCUCCGAAGCUGUCACGUTT-3’

反义链序列：5’-ACGUGACAGCUUCGGAGAATT-3’。

所述 siRNA 1-3 和 NC 序列中的 A、G、C、U 分别表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T 表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

将浓度为 0.6×10⁴PM 的细胞悬液接种于标准 12 孔细胞培养板中，以DMEM＋15％的小牛血清为培养基培养人乳腺癌细胞株T47D，转染前更换新鲜培养剂。每孔加入 10pmole 的 siRNA 和 7ul 的 siRNA 转染试剂 INTERFERin™，转染方法按照转染试剂生产商的试剂说明书进行。

实施例2. 细胞总RNA的提取

实验分三组进行：空白对照组（Blank），随机对照组（Negative control, NC），

PARP siRNA（PA-siR）组。

a. 用PBS溶液洗涤细胞，去上清，去除培养基；

b. 培养皿中加入1 ml Trizol ，用枪头吹打混匀，细胞完全裂解后转移至1.5 ml离心管中。加入200 μL氯仿，剧烈震荡混匀后常温放置15 min；

c. 4℃，12000 rpm离心15 min。小心吸取上层水相，至新的无菌1.5 ml离心管中，加入等体积预冷异丙醇，于-20℃下放置1 h；

d. 4℃，12000 rpm离心10 min，弃掉上清液，RNA沉于管底。向RNA沉淀中加75%乙醇（用DEPC水配制），温和震荡离心管，悬浮沉淀；

e. 4℃，8000 rpm离心15 min，弃掉上清液，室温放置20 min使RNA沉淀干燥。用50 μLDEPC水或TE溶解RNA 沉淀，-80℃保存。

实施例3. 反转录

1）基因组DNA去除

配置反应体系如下：

4×gDNA wiper Mix 2 μL

模板RNA 1 pg-500 ng

RNase free ddH2o 加至8 μL

用移液枪轻轻吹打混匀，反应条件为42℃ 2 min；

2）逆转录体反应

配置反应体系如下：

5×qRT SuperMixII 2 μL

上一步的反应液 8 μL

用移液器轻轻吹打混匀。设置反应条件为：25℃，10 min；50℃，30 min；85℃，5 min；该反应体系于4℃下保存。

实施例4. Real-time -PCR操作

配置20 μL反应体系：

SYBR GREEN MIX 10 μL

上游引物 0.4 μL

下游引物 0.4 μL

DYE2 0.4 μL,

ddH2O 6.8 μL

模板 2.0 μL

设置反应程序如下：

扩增后的产物取 3μL 进行 1％浓度的琼脂糖凝胶电泳，然后在成像仪上进行拍照，利用 SensiAnsys 图像分析软件分析电泳条带的灰度值。mRNA 表达的相对强度＝目的条带的灰度值 /β-actin 条带的灰度值。

实验结果如图1所示，空白对照组mRNA 表达的相对强度为0.618±0.021 ，阴性对照组mRNA 表达的相对强度为0.623±0.029， PARP siRNA 组mRNA 表达的相对强度为0.358±0.020 (P＜0.01)。PARP siRNA 组mRNA 表达相对其它两组表达有所下降。

实施例5. Western Blot实验样品制备

实验分三组进行：空白对照组（Blank），阴性对照组（Negative control），

PARP siRNA (PA-siR)组。

从-20℃取出WB细胞及组织裂解液，蛋白酶抑制剂和PMSF，配制比例为100:1，置于4℃冰上，此步骤需新鲜配制；

b. 取出灭菌EP管，做好标记，置于4℃冰上；

c. 取出含有培养细胞的六孔板，去培养基，每孔用10 ml移液管加入4℃PBS 1 ml，移去，每孔用移液枪加入60-100 μL已加入蛋白溶解酶抑制剂的细胞裂解液，吹打，用细胞刮将贴壁细胞刮下，吹打，用移液枪吸到已标记的EP管中，置于4℃冰上，注意细胞刮每次刮完一孔用纸巾擦净，再刮下一个，刮的时候要保证各个方向都刮到；

d. 将含有裂解液的细胞液或组织悬浊液于4℃冰上用超声仪裂解，每支离心管超声10次，每次1 s。每管超声后，超声仪金属头部需用PBS或蒸馏水清洗（洗瓶清洗），再用滤纸吸干。超声仪金属头部不可插入EP管过深，否则会有细胞液溅出；

e. 充分裂解后，4℃、12000 r离心10 min，取上清，快速加入到已标记的EP管中；

f. BCA法测蛋白浓度，将测好浓度的数据，用excel编辑。保证细胞蛋白不低于30µg/20µl，组织蛋白上样不低于60~80 µg/20 µl；

g. 将计算好的每孔数据，根据样品母液实际量等体积扩大、稀释，再加入loadingbuffer，按照loading buffer：细胞液为1:4加入，混合，在保证每个EP管壁和管顶都有编号，并保证每个EP管上打过孔或封口膜封口后，再沸水煮3-5min，按顺序摆放到干燥的冰盒上，然后低速离心；

h. 将变性过的蛋白进行分装，充分混匀，每管分装35 µl。

实施例6. SDS-PAGE电泳

a. 用两块干净的玻璃板，玻璃板对齐后放入夹中卡紧，并固定在灌胶支架上；

b. 配制15ml 10%分离胶液体，配方如下：H₂O 5.9 ml，30% Acrylamid 5.0 ml， 1.5MTris-HCl（pH8.8）3.8 ml，10% SDS 0.15 ml， 10%过硫酸铵0.15 ml，TEMED 0.006 ml。然后加入10%的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀；

c. 立即将分离胶液体加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm左右高为止；

d. 往夹层的液面顶部缓缓加入1ml无水乙醇或水。让凝胶在室温聚合30 min。聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线；

e. 倾去顶层的无水乙醇或水，并以1×Tris-Cl/SDS，pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面，尽量用吸水纸吸干；

f. 配制4 ml 5%积层胶液体，配方如下：H₂O 2.7 ml，30% Acrylamide 0.67 ml，1.0MTris-HCl（pH6.8） 0.5 ml，10% SDS 0.04 ml， 10% 过硫酸铵 0.04 ml，TEMED 0.004ml。将液体加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部；

g. 将0.75mm厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合30 min；

h. 小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。取出梳子后，以1×SDS电泳缓冲液冲洗加样孔，并以此缓冲液充满之；

i. 按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室，同时往下缓冲液室加入推荐量的1×SDS电泳缓冲液；

j. 将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔；

k. 上样进行SDS-PAGE电泳。连接电源，先在80 V下电泳30 min至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120 V继续电泳50 min左右至溴酚蓝到达凝胶底部为止，关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。

实施例7. 转膜显影

a. 电泳结束前，准备与凝胶同样大小的一张PVDF膜与6张 Whatman3 MM滤纸，PVDF膜用甲醇活化5 min，滤纸在转移缓冲液中平衡 15 min；

b. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡；

c. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。将凝胶在ddH₂O中漂洗一遍，再在1×转膜缓冲液中漂洗一次。小心将分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路；

d. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰盒来降温。一般用300 mA转移1.5 h。

实施例8. 免疫反应

a. 将膜移至含有含5%脱脂奶粉的TBST的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h；

b. 选取β-actin为内参，将一抗用含5%脱脂奶粉的TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；把需要的条带剪下来，注意剪下来的每一张膜都在左上角剪角，以便区分膜的正反面和方向,放入加完一抗的抗体孵育盒里，4℃孵育过夜；

c. 回收一抗后用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10 min；

d. 同上方法稀释二抗，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下摇床上洗三次，每次10min；

e. 将A和B两种试剂等体积混合；将膜蛋白面朝上放在白板上，将发光液滴加在膜上，充分覆盖膜表面，然后放入成像仪中拍照。

实验结果如图2所示：转染终浓度为100nmol/L的 PARP siRNA 于 T47D 细胞 48h后，所示 PARP的蛋白表达有所下调。其中转染 PARP siRNA 组，PARP蛋白的表达水平相对于阴性对照组显著下降；而转染阴性对照组的 PARP 蛋白的表达水平与空白对照组相比无明显变化，表明本发明提供的PARP siRNA能有效抑制PARP蛋白的表达。

实施例10. MTT 法分析 siRNA 对癌细胞生长的影响

将处于对数生长期的T47D 细胞接种于 24 孔板中，培养至细胞融合度达到约40％，进行细胞转染。转染后于 37℃，5％ CO2条件下培养 24 h和48 h，于结束前 4h 加入 MTT 10μL/ 孔 ( 浓度为 5mg/mL)，继续培养 4h 后弃上清液，加入二甲基亚砜 (DMSO)100μL/孔，于振荡器上震荡 10min 左右，酶标仪 490nm 检测 OD 值。以转染了阴性对照 siRNA的T47D细胞作为阴性对照，以未加任何小干扰 RNA 处理的 HepG2 细胞作为空白对照，细胞生长抑制率＝ ( 阴性对照组 A 值 - 转染组 A 值 )/ 阴性对照组 A 值 ×100％。

结果如图3所示，与转染阴性对照 siRNA 组相比，转染 PARP-siRNA 后T47D细胞增殖速度显著降低，于24h时抑制率达（47±2.1）%，与48 h时抑制率达（68±2.2）%，结果提示 siRNA 可抑制 T47D细胞的生长。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 李风玲

<120> 一种抑制PARP基因用于治疗乳腺癌的siRNA

<130> 12

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

caggcygcyy ygycaagaay y 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

yygyccgacg aaacagyycy y 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gagcyacyca ycyycaacay y 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

yycycgayga gyagaagyyg y 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

caaaggaayy ccgagaaayy y 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

yygyyyccyy aaggcycyyy a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

yycyccgaag cygycacgyt t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

acgygacagc yycggagaat t 21

Claims

1.抑制PARP基因表达的siRNA，所述 siRNA 序列包含如下序列：

siRNA1 正义链：5’- CAGGCUGCUUUGUCAAGAAUU-3’

反义链：3’- UUGUCCGACGAAACAGUUCUU-5’；

siRNA2 正义链：5’- GAGCUACUCAUCUUCAACAUU-3’

反义链：3’- UUCUCGAUGAGUAGAAGUUGU-5’；

siRNA3 正义链：5’- CAAAGGAAUUCCGAGAAAUUU-3’

反义链：3’- UUGUUUCCUUAAGGCUCUUUA-5’。

2.如权利要求 1 所述的抑制PARP基因表达的siRNA在用于制备治疗癌症的药物中的用途。

3.权利要求 2 所述的用途，其特征在于，所述癌症为卵巢癌和乳腺癌。

4.如权利要求1所述的抑制PARP基因表达的siRNA，其特征在于，siRNA选择INTERFERin™作为转染试剂。

5.根据权利要求1所述的抑制PARP基因表达的siRNA，其特征在于，使用Real-time PCR为实验手段检测mRNA表达水平。

6.根据权利要求1所述的抑制PARP基因表达的siRNA，其特征在于，使用Western Blot为实验手段检测蛋白质表达水平。

7.根据权利要求1所述的抑制PARP基因表达的siRNA，其特征在于，使用MTT法为实验手段检测癌细胞生长。

8.根据权利要求5-7中分别所述的Real-time PCR实验、Western Blot实验和MTT法中，其特征在于，所选择的癌细胞均为人乳腺癌细胞株T47D。