KR101138471B1

KR101138471B1 - 트리시클로 ｐａｒｐ 저해제

Info

Publication number: KR101138471B1
Application number: KR1020067001725A
Authority: KR
Inventors: 토마스 헬레다위; 니콜라 커틴
Original assignee: 화이자 인코포레이티드; 캔써 리서치 테크놀로지 리미티드
Priority date: 2003-07-25
Filing date: 2004-07-23
Publication date: 2012-04-25
Also published as: PT1660095E; JP2007533601A; CY1110335T1; KR20060066067A; CA2533332A1; RU2404183C2; EP1660095A2; DK1660095T3; NZ544989A; ATE454893T1; HK1084602A1; MXPA06000993A; BRPI0412899A; US7531530B2; JP2012087135A; US20070072841A1; RU2006105652A; NO20060928L; DE602004025123D1; EP1660095B1

Abstract

본 발명은 트리시클로 락탐 인돌 유도체 및 트리시클로 락탐 벤즈이미다졸 유도체 및 PARP 효소의 활성을 저해하는 이들의 용도에 대한 것이다. 본 발명은 또한 약제 제조시 이러한 화합물의 용도에 대한 것이다.

트리시클로 락탐 인돌 유도체, PARP, 상동성 재조합(HR), 암

Description

트리시클로 ＰＡＲＰ 저해제 {TRICYCLIC PARP INHIBITORS}

본 발명은 트리시클로 락탐 인돌 및 트리시클로 락탐 벤즈이미다졸의 유도체이며 폴리(ADP-리보스) 폴리메라제 (PARP)를 저해하는 유도된 일련의 화합물, 및 암, 특히 유방암 치료에서 이들의 용도에 관한 것이다.

상동성 재조합(HR)은 포유동물 세포에서 DNA 복제점에서 발생하는 손상의 수복에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(2). 따라서, HR 에서 세포 결함으로 인해 성장이 저해되고 유전적 불안정성이 높은 수준으로 나타났다. 인체의 암에서 HR 수복의 실패로 인한 유전적 불안정성은 이러한 세포에서 암의 발생에 현저하게 기여하는 것으로 여겨진다(1).

DNA 가닥 절단에 대하여 폴리(ADP-리보실)화에 의한 핵 단백질의 전사후 변형은 DNA 수복, 아포토시스의 조절 및 유전적 안정성의 유지에 중요한 역할을 한다.

폴리(ADP-리보스) 폴리메라제 (PARP-1)는 PARP 효소군의 주요 구성요소이고 포유동물 세포에 풍부하게 존재하는 핵 단백질이다. PARP-1 은 기질로서 NAD⁺ 를 사용하여 폴리(ADP-리보스) (PAR) 중합체의 형성을 촉진시킨다. DNA 손상시, PARP-1 은 절단된 DNA 단일-가닥(SSB)에 신속하게 결합하고 PARP-1 자신에 음전하를 띠는 PAR 쇄의 첨가(자가변형) 및 다른 단백질에도 음전하를 띠는 PAR 쇄의 첨가를 촉진시킨다[리뷰지(3, 4) 참조하라]. SSBs 에 PARP-1 의 결합은, PARP-1 이 PAR 중합체로부터 축적된 음전하에 의해 절단으로부터 분리될때 까지 다른 과정으로부터 DNA 병변을 보호하는 것으로 여겨진다(5, 6).

PARP-1 이 크로마틴 구조의 조절, DNA-복제, DNA 수복 및 전사와 같은 핵의 여러 처리과정에 관여하지만, PARP-1 녹아웃(knockout) 마우스는 정상적으로 발생한다(7). 이러한 마우스로부터 분리된 세포는 자매염색분체 교환(SCE) 미소핵 및 사배수성의 증가된 수준의 형태로 과재조합(hyper recombination) 표현형 및 유전적 불안정성을 나타낸다(8, 10). 이러한 모든 결과들이 다른 집합의 PARP-1 녹아웃 마우스에서는 반복되지 않는다고 할지라도(12), 텔로미어 단축, 염색체 융합의 증가된 빈도수 및 이수체를 통하여 유전적 불안정성은 이러한 PARP-1 녹아웃 마우스에서 발생할 것이다(11). 전자의 녹아웃 마우스에서, PARP-1 영돌연변이 (null mutation)는 SCID 마우스에서 손상된 V (D) J 재조합을 중단시킨다(13).

이러한 결과는 PARP-1 이 재조합에 대해 예방 역할을 한다는 Lindahl 및 공동-연구자에 의해 제시된 관점을 뒷받침한다(5). ssDNA 의 절단에 대한 PARP-1 의 결합이 DNA 병변을 인식하고 프로세싱할 때 재조합 기전을 예방하거나 선택적으로 폴리(ADP-리보실)화로부터 축적된 음전하가 인접한 재조합유전자(recombinogenic) DNA 서열을 막아준다고 제안되었다. 후자 모델만이 PARP-1 자체의 저해 및 SCE, 유전자 증폭 및 상동성 재조합을 포함하는 우성의 음성 돌연변이체 PARP-1 의 발현의 저해와 일치한다(14-18).

PARP-1 저해제를 갖는 세포 또는 PARP-1 녹아웃 마우스로부터 유래된 세포의 처리에 기초하는 연구는 PARP-1 활성의 억제가 DNA 손상 제제에 대한 세포 감수성을 증가시키고 스트랜드 절단 재연결(strand break rejoining)을 저해함을 나타낸다(3, 4, 8-11, 19, 20).

PARP-1 활성의 저해제를 방사선-치료 및 화학요법과 같은 전형적인 암 치료 양생법과 함께 사용하였다(21). 저해제를 메틸화제, 토포이소메라제 독 및 이온화 방사선과 함께 사용할 때, 저해제가 이러한 형 태의 치료의 효능을 증가시킴을 발견하였다. 그러나, 이러한 치료는 비선택적이므로 비-암성 세포 또는 '건강한' 세포의 손상이나 사멸을 야기한다. 게다가, 이러한 치료는 좋지 않은 부작용을 발생시킨다고 알려졌다.

그러므로, 암 세포를 사멸시키는데 효과적이고 선택적이며 방사선-치료 또는 화학요법 치료와 함께 투여할 필요가 없는 암 치료를 제공하는 것이 매우 바람직하다.

놀랍게도, 상동성 재조합(HR)이 결핍된 세포가 야생형 세포에 비해 PARP 저해제에 대해 과민성을 나타냄을 발견하였다.

그러므로, 본 발명의 첫 번째 양상에 따라, 하기 화학식 Ⅰ 을 갖는 PARP 활성을 저해하는 화합물 및 약학적으로 용인가능한 이의 염을 제공한다 :

본 발명의 두 번째 양상에 따라, 하기 화학식 Ⅱ 를 갖는 PARP 활성을 저해하는 화합물 및 약학적으로 용인가능한 이의 염을 제공한다 :

본 발명의 세 번째 양상에 따라, 하기 화학식 Ⅲ 을 갖는 PARP 활성을 저해하는 화합물 및 약학적으로 용인가능한 이의 염을 제공한다 :

본원에 기재된 화합물을 제 WO 00/42040 호 및 제 WO 01/16136 호에 기재된 합성 경로를 기초로 하는 합성 경로로 제조할 수 있다.

본 명세서에서 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ 의 화합물에 관한 언급은 이 화합물의 약학적으로 용인가능한 염 또는 그외의 관련된 약학적으로 용인가능한 생전구체(약물전구체 형태)로서 확대하여 해석해야 할 것이다. 용어 "약물전구체" 는 포유동물의 치료 과정에서 투여, 특히 경구 또는 정맥내 투여된 후 생분해되거나 변형되어 생리학적으로 활성인 화합물로 변환되는, 생리학적으로 활성인 화합물의 변형된 형태 또는 유도체를 나타내기 위해 본 명세서에서 사용하였다. 이러한 약물전구체는 제형화 문제를 해결하는데 도움이 되고 또한 몇몇 경우에서는 활성 제제의 서방성을 부여하는데 도움이 되는 수성 배지에서의 증가된 용해도 때문에 일반적으로 선택된다.

본원에서 언급한 바와 같이, 약학적으로 용인가능한 염은 금속염, 인산염 및 4 차 아민을 포함한다. 금속염은 리튬, 나트륨 또는 칼륨과 같은 알칼리 금속과 함께 형성될 수 있다.

바람직하게, 상기 화학식 Ⅰ 의 화합물을 하기 화학식을 갖는 약학적으로 용인가능한 인산염의 형태로 투여할 수 있다 :

본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물의 치료학적 이용에 관한 것이다.

그러므로, 본 발명의 추가적인 양상에 따라, 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅰ 의 화합물 및 약학적으로 용인가능한 이의 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅱ 의 화합물 및 약학적으로 용인가능한 이의 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅲ 의 화합물 및 약학적으로 용인가능한 이의 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 상동성 재조합을 매개하는 유전자의 유전적 결함에 의해 야기되는 질환이나 증상의 치료를 위한 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅰ 의 화합물 및 약학적으로 용인가능한 이의 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 상동성 재조합을 매개하는 유전자의 유전적 결함에 의해 야기되는 질환이나 증상의 치료를 위한 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅱ 의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 상동성 재조합을 매개하는 유전자의 유전적 결함에 의해 야기되는 질환이나 증상의 치료를 위한 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅲ 의 화합물의 용도를 제공한다.

상동성 재조합을 매개하는 유전자의 유전적 결함에 의해 야기되는 질환이나 증상은 암, 특히 유방암을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

본원에 언급된 바와 같이, "암" 또는 "종양" 은 폐암, 결장암, 췌장암, 위암, 난소암, 경부암, 유방암, 전립선암, 골암, 뇌암 또는 피부암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

PARP 저해제의 사용은 상동성 재조합을 매개하는 유전자의 유전적 결함에 의해 야기되는 암의 치료에 특히 적합하다. 이러한 유형의 암 세포는 HR 결함이 있는 경향이 있다.

PARP 저해에 대한 HR 결함 종양의 특이적인 감수성은 충분한 양의 HR 을 갖는 환자에서의 일반적으로 "건강한" 세포로 분류되는 세포가 치료에 의해 크게 영향받지 않을 것임을 의미한다.

PARP 저해제를 사용한 치료의 추가적인 장점은 PARP 저해제를 통상적인 방사선치료 또는 화학요법 치료와 함께 복합 치료로서 투여할 필요가 없어 이러한 통상적인 형태의 치료에 관련된 부작용을 피할 수 있는 것이다.

상동성 재조합을 매개하는 유전자의 결함은 HR 에 관련된 단백질을 코드하는 유전자의 돌연변이, 결여 또는 유전자 발현의 결함에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, HR 결함 세포의 아포토시스를 유도하기 위한 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅰ 의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, HR 결함 세포의 아포토시스를 유도하기 위한 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅱ 의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, HR 결함 세포의 아포토시스를 유도하기 위한 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅲ 의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 암 치료용 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅰ 의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 암 치료용 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅱ 의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 암 치료용 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅲ 의 화합물의 용도를 제공한다.

본원에 기재된 화합물로 치료하기에 적합한 암 세포는 부분적으로 또는 전체적으로 HR 결함이 있을 것이다. 바람직하게, 세포는 전체적으로 HR 결함이 있다.

치료 받을 환자가 암에 대한 가족성 소인을 갖는 유전성 형태의 암을 치료하기 위해 본원에 기재된 화합물을 사용할 수 있다. 그러나, 상기 화합물은 유전자-관련 유전성 암, 특히 유전자-관련 유전성 유방암의 치료에 특히 적합하다.

바람직한 양상에서, PARP 저해제는 HR 에 관련된 유전자의 발현에 결함이 있는 암 세포의 치료에 유용하다. HR 의 제시된 기능을 갖는 유전자는 다음을 포함한다 : XRCC1, ADPRT (PARP-1), ADPRTL2, (PARP02) CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51β, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NB51, WRN, BLM KU70, KU80, ATM, ATR CHK1, CHK2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, RAD9[(2, 3, 5, 22-28)을 참조하라].

HR 과 관련된 유전자는 종양 억제 유전자이다. 따라서 본 발명은 종양 억제 유전자 발현에 결함이 있는 암 세포의 치료를 제공한다. 바람직하게, 종양 억제 유전자는 BRCA1 또는 BRCA2 이다.

유방암은 서방 세계의 여성에게 발생하는 가장 흔한 유형의 암이다. 종종 BRCA1 또는 BRCA2 의 한 대립 유전자의 유전되는 돌연변이로 인해, 특정 가족은 유방암에 걸리기 쉬운 강한 소인을 갖는다. 그러나, 하나의 기능적인 대립 유전자는 유지된다. 따라서, 상기 돌연변이를 보유하는 개체는 일반적으로 발생하며 이러한 돌연변이의 표현형은 나타나지 않는다. 그러나, 한 세포에서, 세포가 암에 걸림과 동시에 HR 에 결함이 있는 기능적인 대립 유전자는 손실된다. 이러한 단계는 종양 발생에 중요하다(1).

그러므로, 본 발명의 더 추가적인 양상에 따라, 본 발명은 BRCA1 및/또는 BRCA2 발현에 결함이 있는 암 세포를 치료하기 위한 약제 제조시 치료량(therapeutic amount)의 화학식 Ⅰ 의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 본 발명은 BRCA1 및/또는 BRCA2 발현에 결함이 있는 암 세포를 치료하기 위한 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅱ 의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 본 발명은 BRCA1 및/또는 BRCA2 발현에 결함이 있는 암 세포를 치료하기 위한 약제 제조시 치료량의 화학식 Ⅲ 의 화합물의 용도를 제공한다.

치료될 암 세포는 부분적으로 또는 전체적으로 BRCA1 또는 BRCA2 발현에 결함이 있을 수 있다. 이러한 결함은 숙련자들에게 공지된 다중 PCR 기술 배열 기술(29, 30) 또는 다른 스크린을 사용하여 확인할 수 있다. 특히 유용한 기술은 실시간 정량 RT-PCR, 노던 블럿, 면역 조직화학 및 웨스턴 블럿을 포함한다(31, 32).

따라서, 본 발명의 화합물은 특히 선택된 범주의 암 종양을 치료하는 것을 목적으로 하며, 본 발명은 또한 암을 앓고 있는 환자의 치료방법을 제공한다.

본원에 기재되어 있는 화합물은 효과적으로 암 세포를 표적으로 하는 적합한 모든 경로를 통해 치료학적으로 효과적인 비-독성 양으로 투여할 수 있다. 적합한 투여 경로는 경구, 정맥내, 근육내, 피내, 비강내 및 국소 경로 중 어느 하나를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본원에 기재되어 있는 화합물의 치료학적 유효량은 일반적으로 바람직한 효능을 나타내기에 적합한 양이며, 이는 질환 증상의 특성 및 심각성, 및 화합물의 효능에 따라 다양하다. 상이한 농도는 활성 질환을 치료하는 것보다 예방 하기 위해 사용할 수 있다는 것이 명백해질 것이다.

포유동물 및 특히 사람에게 투여하기 위해, 활성 제제의 일일 투여량 수준은 마우스에서 0.01 내지 50 ㎎/㎏ 및 사람의 체표면적에서 0.01 ㎎/㎡ 내지 50 ㎎/㎡ 이 예상된다. 그러나, 궁극적으로 투여되는 유효성분의 양 및 투여 빈도는 의사의 판단에 따른다.

유리하게, PARP 저해 화합물의 매우 낮은 투여량은 암을 치료하여 화합물의 전신 축적을 감소시킴으로써 관련된 모든 독성 효능을 최소화시키는 치료학적 효능을 지니는 것이 필요하다.

본원에 기재되어 있는 화합물은 '가공하지 않은' 화합물로서 단독으로 투여할 수 있으며, 화합물은 약학적 조성물 내에 존재하는 것이 바람직하다.

이러한 약학적 조성물을 제조하는 모든 제형화 방법은 일반적으로 본원에 기재되어 있는 화합물 중 하나를 하나 또는 그 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 관련하여 도입시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 액상 담체 또는 미세하게 분쇄된 고형 담체, 또는 이 둘 다와 관련하여 화학식 Ⅰ 의 화합물을 균일하고 친밀하게 도입시킨 다음, 필요에 따라 바람직한 제형으로 산물을 형상화하여 제조한다.

경구 투여하기에 적합한 본 발명의 제형은 예를 들어, 각각 본원에 기재되어 있는 화합물 중 하나의 미리 결정된 양을 함유하는 캡슐, 카세제, 정제 또는 함당정제와 같은 분리된 유닛 ; 분말 또는 과립 ; 또는 시럽, 일릭서제, 에멀젼 또는 음료와 같은 수성 액체 또는 비-수성 액체로 용해시킨 현탁액으로서 존재한다. 본원에 기재되어 있는 화합물 중 어느 하나는 또한 환괴, 지제 또는 이고로서 존재한다.

정제는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 보조 성분과 압축 또는 성형하여 제조할 수 있다. 압축 정제는 선택적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 계면활성제 또는 분산제와 혼합된, 분말 또는 과립과 같은 자유-흐름 형태로 본원에 기재되어 있는 화합물 중 하나를 적합한 기계에서 압축하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 적합한 기계에서 모든 적합한 담체와 본원에 기재되어 있는 분말화된 화합물 중 어느 하나의 혼합물을 성형하여 제조할 수 있다.

시럽은 모든 바람직한 보조 성분에 첨가될 수 있는, 농축시킨 설탕의 수용액, 예를 들어, 수크로스에 본원에 기재되어 있는 화합물 중 하나를 첨가함으로써 제조할 수 있다. 이러한 보조 성분은 향미료, 설탕의 결정화를 방해하는 제제, 또는 다가 알콜 예를 들어, 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 다른 성분의 용해도를 증가시키는 제제를 포함한다.

직장 투여용 제형은 코코아 버터와 같은 일반적인 담체를 수반하는 좌제이다.

적합한 비경구 투여용 제형은 통상적으로 바람직하게 수여자의 혈액과 등장인, 본원에 기재되어 있는 화합물 중 하나의 멸균 수성 제제를 포함한다.

상기한 성분에 더하여, 본 발명의 제형 예를 들어, 연고, 크림 등은 하나 또는 그 이상의 보조 성분 예를 들어, 희석제, 완충용액, 향미료, 결합제, 계면활성제, 증점제, 윤활제 및/또는 방부제(항산화제 포함) 또는 이외의 약학적으로 불활성인 부형제를 포함한다.

본 발명의 화합물은 또한 본 분야에 널리 공지된 방법으로 제조할 수 있는 리포솜 제형으로 투여하도록 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가적인 양상에 따라, 본 발명은 활성 제제로서 화학식 Ⅰ 의 화합물 또는 약학적으로 용인가능한 이의 염을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 본 발명은 활성 제제로서 화학식 Ⅱ 의 화합물 또는 약학적으로 용인가능한 이의 염을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상에 따라, 본 발명은 활성 제제로서 화학식 Ⅲ 의 화합물 또는 약학적으로 용인가능한 이의 염을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

약학적 조성물은 추가로 적합한 약학적으로 용인가능한 첨가제, 담체 희석제 또는 부형제를 제공하는 적어도 하나의 다른 성분을 포함하고, 이는 단위 투여 형태로 존재한다.

담체는 제형의 다른 성분과 부합되도록 약학적으로 용인가능해야 하며, 이의 수용을 저하시키지 않아야 한다.

가능한 제형은 경구, 직장, 국소 및 비경구(피하, 근육내 및 정맥 내 투여 포함) 투여, 또는 폐 또는 비강 경로와 같은 다른 흡수 부위로 투여하기에 적합한 제형을 포함한다.

본원에 언급된 화합물은 이외의 항-암 화합물과 조합하여 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재되어 있는 화합물 및 약학적으로 용인가능한 이의 염을 투여함으로써 포유동물의 암을 치료하는 방법을 포함한다.

따라서, 본 발명의 추가적인 양상에 따라, 본 발명은 화학식 Ⅰ 의 화합물 또는 약학적으로 용인가능한 이의 염을 투여함을 포함하는, 포유동물의 암을 치료하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 추가적인 양상에 따라, 본 발명은 화학식 Ⅱ 의 화합물 또는 약학적으로 용인가능한 이의 염을 투여함을 포함하는, 포유동물의 암을 치료하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 추가적인 양상에 따라, 본 발명은 화학식 Ⅲ 의 화합물 또는 약학적으로 용인가능한 이의 염을 투여함을 포함하는, 포유동물의 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 첨부된 도면에 관하여 단지 예로서 기재할 것이다:

도 1 은 AA8 세포주, IsrISF 세포주 및 CxR3 세포주에서 화학식 Ⅲ 의 PARP 저해제의 존재시 세포 생존율을 나타내는 그래프이다;

도 2 는 V79 세포주, VC8 세포주 및 VC8B2 세포주에서 화학식 Ⅲ 의 PARP 저해제의 존재시 세포 생존율을 나타내는 그래프이다;

도 3 은 V79 세포주, VC8 세포주 및 VC8B2 세포주에서 화학식 Ⅰ 의 PARP 저해제의 존재시 세포 생존율을 나타내는 그래프이다;

도 4 는 화학식 Ⅲ 의 PARP 저해제의 존재시 VC8, V79, VC8#13 및 VC8, VC8#13 및 VC8+B2 세포주에서 PARP 활성도를 나타내는 막대 그래프이다;

도 5 는 디기토닌에 투과시킨 L1210 세포(위에 있는 그래프) 및 디기토닌에 투과시키지 않은(intact) L1210 세포(아래에 있는 그래프)에서 화학식 Ⅰ 및 Ⅲ 의 PARP 저해제의 존재시 세포의 PARP 활성도의 저해를 나타내는 2 개의 그래프이다;

도 6 은 SW620 이종이식한 마우스에서 1 ㎎/㎏(위에 있는 그래프) 및 10 ㎎/㎏(아래에 있는 그래프)의 화학식 Ⅰ 의 화합물의 인산염 형태에 대한 혈액 및 종양의 약물동태학 및 약력학을 나타내는 2 개의 막대 그래프이다;

도 7 은 SW620 이종이식한 마우스에서 화학식 Ⅲ 의 화합물에 대한 약물동태학 및 약력학을 나타내는 막대 그래프이다;

도 8 은 각각 테모졸로마이드(TMZ)와 병용한 화학식 Ⅲ 의 화합물 및 TMZ 만을 처리한 후에 SW620 이종이식한 마우스의 종양 성장[상대적인 종양 부피(relative tumour volume, RTV)의 중앙값]을 나타내는 그래프이다;

도 9 는 각각 테모졸로마이드(TMZ)와 병용한 화학식 Ⅰ 의 화합물의 인산염 형태, 단독으로 화학식 Ⅰ 의 화합물의 인산염 형태 및 단독으로 TMZ 만으로 처리한 후에 SW620 이종이식한 마우스의 종양 성장(상대적인 종양 부피의 중앙값)을 나타내는 그래프이다;

도 1 은 다양한 농도의 화학식 Ⅲ 의 화합물로 처리하였을 때 AA8, IrS ISF 및 CxR3 세포주의 생존율을 보여준다. 화학식 Ⅲ 의 화합물이 100 nM 의 LC₅₀(50 % 의 세포를 사멸시키는 유효 성분의 농도)을 갖는, XRCC3 이 결여된 IrS ISF 에 대하여 가장 효과적임을 알 수 있었다.

도 2 는 다양한 농도의 화학식 Ⅲ 의 화합물로 처리하였을 때 V79-Z, VC8 및 VC8B2 세포주의 생존율을 보여준다. 화학식 Ⅲ 의 화합물이 43 nM 의 LC₅₀ 값을 갖는, BRCA2 가 결여된 VC8 세포주에 대하여 가장 효과적임을 알 수 있으며 LC₉₀(90 % 의 세포를 사멸시키는 유효 성분의 농도)은 1200 nM 이다.

도 3 은 다양한 농도의 화학식 Ⅰ 의 화합물로 처리하였을 때 V79-Z, VC8 및 VC8B2 세포주의 생존율을 보여준다. 화학식 Ⅰ 의 화합물이 12 nM 의 LC₅₀ 값을 갖는, BRCA2 가 결여된 VC8 세포주에 대하여 가장 효과적임을 알 수 있으며 LC₉₀ 은 27 nM 이다.

도 4 는 다양한 농도의 화학식 Ⅲ 의 화합물로 처리하였을 때 다양한 세포주의 PARP 활성도를 보여준다. 도 3 의 그래프를 각각의 세포주에 대한 4 가지 결과 세트로 분류하였다. 각각의 세트의 첫 번째 막대는 아무것도 처리하지 않은 PARP 활성도[올리고(oligo)가 제공되지 않으므로 PARP 활성도는 내인성 DNA 절단에 의해 좌우됨]를 보여주고, 두 번째 막대는 올리고에 의해 자극될 수 있는 전체의 PARP 활성도이며 세 번째 및 네 번째 막대는 화학식 Ⅲ 의 화합물 존재시 PARP 활성도를 보여준다.

도 5 는 PARP 활성도에서 화학식 Ⅰ 및 Ⅲ 의 화합물의 효과를 보여준다.

도 5 에서 나타낸 결과를 수득하기 위해 사용된 세포를 디기토닌에 투과시킨 다음 화학식 Ⅰ 및 화학식 Ⅲ 의 PARP 저해제의 존재 및 부재시 올리고에 의해 자극될 수 있는 전체의 PARP 활성도에 대해 검정하거나, 또는 세포를 디기토닌에 투과시키기 전에 20 분 동안 상기 PARP 저해제 중 하나에 노출시키고 자극될 수 있는 전체의 PARP 활성도를 검정하였다.

저해 화합물을 첨가하기 전에 세포를 디기토닌에 투과시켰을 때 화학식 Ⅰ 및 화학식 Ⅲ 의 화합물의 PARP 저해 활성도에서는 차이가 없었으나 화학식 Ⅰ 의 화합물이 세포 내에서 보다 높은 정도로 축적되기 때문에 화학식 Ⅰ 의 화합물은 디기토닌에 투과시키지 않은 세포(intact cell)에서 보다 효능이 있었다.

도 6 은 화학식 Ⅰ 의 화합물의 인산염을 복강내 투여한 후에 다양한 시간에서 화학식 Ⅰ 의 화합물의 혈장 및 종양 농도 및 마우스 말초혈 림프구(pbl parp) 및 SW620 이종이식(종양 PARP)에서 화합물의 약물동태 효과를 나타내었다. 화학식 Ⅰ 의 화합물의 인산염은 화학식 Ⅰ 의 용해도를 증가시켰다. 그러나 동물(인체를 포함)에 대한 투여에서 혈장 포스파타제는 화학식 Ⅰ 의 인산염(화학식 Ⅰ의 화합물의 인산염)을 모 화합물(즉 화학식 Ⅰ)로 분해한다.

10 ㎎/㎏ 의 화학식 Ⅰ-인산염을 투여한지 30 분 후에 혈장 및 종양 둘 다에서 고농도의 모 화합물이 검출된 것을 도 6 에서 명백히 알 수 있다. 화학식 Ⅰ 의 농도는 시간이 지남에 따라 종양에서 보다 혈장에서 빠르게 감소하였고, 투여한지 24 시간 후에 종양에서 상당한 수준을 검출할 수 있었으나 혈장에서는 어떠한 것도 검출할 수 없었다. pbls 및 종양 둘 다에서 PARP 활성도가 충분하게 서방성 저해되었다(최대 24 시간까지 < 50 % 로 조절됨).

1 ㎎/㎏ 의 화학식 Ⅰ의 인산염의 투여 후에 혈장 및 종양 둘 다에서 저농도의 화학식 Ⅰ 의 화합물을 발견할 수 있었고 따라서 PARP 활성도에서 낮은 효과가 나타났다.

도 7 은 10 ㎎/㎏ 의 화학식 Ⅲ 의 화합물을 복강내 투여한 후에 다양한 시간에서 SW620 이종이식(종양 PARP act)에서 화학식 Ⅲ 의 화합물의 혈장 및 종양 농도, 및 화합물의 약물동태 효과를 나타내었다. 이러한 화합물은 또한 종양에서 잘 분해되었고 선택적으로 시간이 지남에 따라 유지되었고 종양에서 마찬가지로 PARP 활성도를 저해하였다.

도 8 은 테모졸로마이드의 투여(매일 68 ㎎/㎏ ×5) 후 20 일 동안 종양 이종이식의 크기가 점진적으로 감소되었음을 나타내었다. 그러나 이 기간 직후에 종양 크기가 증가되기 시작하였다. 화학식 Ⅲ 의 화합물(매일 5 ㎎/㎏ ×5)을 테모졸로마이드와 병용하여 투여하였을 때 종양이 약 15 일 동안 검출할 수 없는 크기로 상당히 줄어들었고, 종양 크기가 추가로 50 일 동안 검출할 수 없는 크기로 유지되었다가 그후에 종양 크기가 증가되기 시작하였다. 화학식 Ⅲ 의 화합물을 보다 많은 투여량(매일 15 ㎎/㎏ ×5)으로 투여하였을 때, 실험이 종결되었을 때까지 추가로 80 일 동안 종양 크기가 검출할 수 없는 크기로 유지되었고, 부검 시에 어떠한 종양도 검출되지 않았다(즉 완전한 종양 퇴행).

도 9 는 화학식 Ⅰ 의 인산염 형태를 테모졸로마이드와 병용하여 투여(0.1 ㎎/㎏ 및 1.0 ㎎/㎏)한 후에 도 8 에서 나타낸 패턴과 유사한 패턴을 나타내었다.

물질 및 방법

HR(XRCC3 또는 BRCA2)에 결함이 있는 세포에 대한 PARP 저해제의 세포독성

세포 배양

AA8, irs1SF 및 CXR3 세포주는 Larry Thompson[41]에 의해 제공되었다.

VC-8, VC-8+B2, VC-8#13 을 Malgorzata Zdienicka[42]로부터 제공받았다. 본 연구에서 모든 세포주를 5 % CO₂ 가 함유된 대기 하에서 37 ℃ 에서 10 % 우태아 혈청 및 페니실린(100 U/ml) 및 스텝토마이신 설페이트(100 ㎍/mL)를 가진 달베코 변형 이글 배지(DMEM) 내에 성장시켰다.

독성 검정-클론원성 생존 검정

6-웰 플레이트에서 기하급수적으로 성장한 세포를 배지에서 24 시간 동안 1 % DMSO 에 용해시킨 도 2 에 나타낸 농도의 화학식 Ⅲ 의 화합물 또는 1 % DMSO 에만 노출시켰다.

세포를 트립신처리하여 수집하고 계수하였으며 콜로니 형성을 위해 10 ㎝ 디쉬에 약물이 결여된 신선한 배지에서 다양한 밀도로 접종하였다.

7-10 일 후에 디쉬를 메탄올:아세트산 3:1 로 고정시키고 0.4 % 크리스털 바이올렛으로 염색시켰다.

콜로니를 계수하고 1 % DMSO 대조 처리된 세포에 대한 상대적인 생존을 계산하였다.

PARP 활성도 검정

기하급수적으로 성장한 세포인 디기토닌에 투과시킨 세포 또는 디기토닌에 투과시키지 않은 세포를 세척 및 디기토닌-투과 전에 20 분 동안 배양 배지에서 1 % DMSO(대조군)에 노출시키거나 또는 도 4 에 나타낸 농도로 1 % DMSO 에 용해시킨 화학식 Ⅰ 또는 Ⅲ 의 화합물에 노출시켰다. 평활-말단 올리고누클레오티드를 첨가하여 자극시킨 후에 [32P] 표지된 NAD⁺ 기질을 TCA 침전시킬 수 있는 중합체에 삽입하여 PARP 활성도를 측정하고 비-올리고누클레오티드-자극 세포와 비교하였다. 화학식 Ⅲ 의 화합물-처리 마우스로부터의 종양 호모지네이트(등장 완충용액에서 40 중 1)에서 PARP 활성도를 같은 방법으로 측정하였다. pbls 에서의 PARP 활성도 및 화학식 Ⅰ 의 인산염 처리 마우스로부터의 종양 호모지네이트를 10H 항체를 사용하여 중합체의 면역학적 검출로 측정하였다. 간단하게, 등장 완충액에 최대 1:1000 으로 희석시킨 종양 호모지네이트를 6 분 동안 350 μM NAD 와 함께 배양하고 니트로셀룰로오스 막에 블롯팅시켰다. 폴리(ADP-리보스)(PAR)에 대한 10H 항체 및 2 차 항-마우스 항체를 배양한 후에 PAR 중합체 형성을 PAR 표준의 계열 희석에 대한 참고로 Fuji LAS3000 UV 조사기를 사용하여 화학 발광 검출에 의해 정량하였다. 결과를 호모지네이트의 측정된 단백질 함량에 대한 참고로 표준화하였다.

본 발명을 단지 예로서 기재된 상기 실시형태의 상세한 설명으로 제한하려는 의도가 아님을 본원에서 이해할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> HELLEDAY, Thomas CURTIN, Nicola <120> TRICYCLIC PARP INHIBITORS <160> 6 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 5468 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Human cDNA sequence of PARP-1 <400> 1 cgcccgccca gccccggggg cagggaaagc ctaaattacg gaattaccgc gagcaaggag 60 cgcggaatcg gggagcgtcc ggagctagct ggatcctcta ggcaggatgg tgatgggaat 120 ctttgcaaat tgtatcttct gtttgaaagt gaagtactta cctcagcagc agaagaaaaa 180 gctacaaact gacattaagg aaaatggcgg aaagttttcc ttttcgttaa atcctcagtg 240 cacacatata atcttagata atgctgatgt tctgagtcag taccaactga attctatcca 300 aaagaaccac gttcatattg caaacccaga ttttatatgg aaatctatca gagaaaagag 360 actcttggat gtaaagaatt atgatcctta taagcccctg gacatcacac cacctcctga 420 tcagaaggcg agcagttctg aagtgaaaac agaaggtcta tgcccggaca gtgccacaga 480 ggaggaagac actgtggaac tcactgagtt tggtatgcag aatgttgaaa ttcctcatct 540 tcctcaagat tttgaagttg caaaatataa caccttggag aaagtgggaa tggagggagg 600 ccaggaagct gtggtggtgg agcttcagtg ttcgcgggac tccagggact gtcctttcct 660 gatatcctca cacttcctcc tggatgatgg catggagact agaagacagt ttgctataaa 720 gaaaacctct gaagatgcaa gtgaatactt tgaaaattac attgaagaac tgaagaaaca 780 aggatttcta ctaagagaac atttcacacc tgaagcaacc caattagcat ctgaacaatt 840 gcaagcattg cttttggagg aagtcatgaa ttcaagcact ctgagccaag aggtgagcga 900 tttagtagag atgatttggg cagaggccct gggccacctg gaacacatgc ttctcaagcc 960 agtgaacagg attagcctca acgatgtgag caaggcagag gggattctcc ttctagtaaa 1020 ggcagcactg aaaaatggag aaacagcaga gcaattgcaa aagatgatga cagagtttta 1080 cagactgata cctcacaaag gcacaatgcc caaagaagtg aacctgggac tattggctaa 1140 gaaagcagac ctctgccagc taataagaga catggttaat gtctgtgaaa ctaatttgtc 1200 caaacccaac ccaccatccc tggccaaata ccgagctttg aggtgcaaaa ttgagcatgt 1260 tgaacagaat actgaagaat ttctcagggt tagaaaagag gttttgcaga atcatcacag 1320 taagagccca gtggatgtct tgcagatatt tagagttggc agagtgaatg aaaccacaga 1380 gtttttgagc aaacttggta atgtgaggcc cttgttgcat ggttctcctg tacaaaacat 1440 cgtgggaatc ttgtgtcgag ggttgctttt acccaaagta gtggaagatc gtggtgtgca 1500 aagaacagac gtcggaaacc ttggaagtgg gatttatttc agtgattcgc tcagtacaag 1560 tatcaagtac tcacacccgg gagagacaga tggcaccaga ctcctgctca tttgtgacgt 1620 agccctcgga aagtgtatgg acttacatga gaaggacttt tccttaactg aagcaccacc 1680 aggctacgac agtgtgcatg gagtttcaca aacagcctct gtcaccacag actttgagga 1740 tgatgaattt gttgtctata aaaccaatca ggttaaaatg aaatatatta ttaaattttc 1800 catgcctgga gatcagataa aggactttca tcctagtgat catactgaat tagaggaata 1860 cagacctgag ttttcaaatt tttcaaaggt tgaagattac cagttaccag atgccaaaac 1920 ttccagcagc accaaggccg gcctccagga tgcttctggg aacttggttc ctctggagga 1980 tgtccacatc aaagggagaa tcatagacac tgtagcccag gtcattgttt ttcagacata 2040 cacaaataaa agtcacgtgc ccattgaggc aaaatatatc tttcctttgg atgacaaggc 2100 cgctgtgtgt ggcttcgaag ccttcatcaa tgggaagcac atagttggag agattaaaga 2160 gaaggaagaa gcccagcaag agtacctaga agccgtgacc cagggccatg gcgcttacct 2220 gatgagtcag gatgctccgg acgtttttac tgtaagtgtt ggaaacttac cccctaaggc 2280 taaggttctt ataaaaatta cctacatcac agaactcagc atcctgggca ctgttggtgt 2340 ctttttcatg cccgccaccg 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cttctagctt ttttcctatt ttggctccgg ccgttggttc 4080 ctatcttacc ccgactaccc gcgctcacag tcctgcttcc ttgtcttttg cctcatatcg 4140 tcaggtagct agtttcggtt cagctgctcc tcccagacag tttgatgcat ctcaattcag 4200 ccaaggccct gtgcctggca cttgtgctga ctggatccca cagtcggcgt cttgtcccac 4260 aggacctccc cagaacccac cttctgcacc ctattgtggc attgtttttt cagggagctc 4320 attaagctct gcacagtctg ctccactgca acatcctgga ggctttacta ccaggccttc 4380 tgctggcacc ttccctgagc tggattctcc ccagcttcat ttctctcttc ctacagaccc 4440 tgatcccatc agaggttttg ggtcttatca tccctctgct tactctcctt ttcattttca 4500 accttccgca gcctctttga ctgccaacct taggctgcca atggcctctg ctttacctga 4560 ggctctttgc agtcagtccc ggactacccc agtagatctc tgtcttctag aagaatcagt 4620 aggcagtctc gaaggaagtc gatgtcctgt ctttgctttt caaagttctg acacagaaag 4680 tgatgagcta tcagaagtac ttcaagacag ctgcttttta caaataaaat gtgatacaaa 4740 agatgacagt atcccgtgct ttctggaagt aaaagaagag gatgaaatag tgtgcacaca 4800 acactggcag gatgctgtgc cttggacaga actcctcagt ctacagacag aggatggctt 4860 ctggaaactt acaccagaac 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attactagag gctttgggag acattgaaat tgctattaag ctggtgaaaa cagagctaca 1080 aagcccagaa cacccattgg accaacacta tagaaaccta cattgtgcct tgcgccccct 1140 tgaccatgaa agttacgagt tcaaagtgat ttcccagtac ctacaatcta cccatgctcc 1200 cacacacagc gactatacca tgaccttgct ggatttgttt gaagtggaga aggatggtga 1260 gaaagaagcc ttcagagagg accttcataa caggatgctt ctatggcatg gttccaggat 1320 gagtaactgg gtgggaatct tgagccatgg gcttcgaatt gcccaccctg aagctcccat 1380 cacaggttac atgtttggga aaggaatcta ctttgctgac atgtcttcca agagtgccaa 1440 ttactgcttt gcctctcgcc taaagaatac aggactgctg ctcttatcag aggtagctct 1500 aggtcagtgt aatgaactac tagaggccaa tcctaaggcc gaaggattgc ttcaaggtaa 1560 acatagcacc aaggggctgg gcaagatggc tcccagttct gcccacttcg tcaccctgaa 1620 tgggagtaca gtgccattag gaccagcaag tgacacagga attctgaatc cagatggtta 1680 taccctcaac tacaatgaat atattgtata taaccccaac caggtccgta tgcggtacct 1740 tttaaaggtt cagtttaatt tccttcagct gtggtgaatg ttgatcttaa ataaaccaga 1800 gatctgatct tcaagcaaga aaataagcag tgttgtactt gtgaattttg tgatatttta 1860 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agcccgcccc aggggcttca gcgccgccgc cgccacctcc tcccccactc agccctggcc 120 tggccccggg gaccacccca gcctctccca cggccagcgg cctggccccc ttcgcctccc 180 cgcggcacgg cctagcgctg ccggaggggg atggcagtcg ggatccgccc gacaggcccc 240 gatccccgga cccggttgac ggtaccagct gttgcagtac caccagcaca atctgtaccg 300 tcgccgccgc tcccgtggtc ccagcggttt ctacttcatc tgccgctggg gtcgctccca 360 acccagccgg cagtggcagt aacaattcac cgtcgtcctc ttcttccccg acttcttcct 420 catcttcctc tccatcctcc cctggatcga gcttggcgga gagccccgag gcggccggag 480 ttagcagcac agcaccactg gggcctgggg cagcaggacc tgggacaggg gtcccagcag 540 tgagcggggc cctacgggaa ctgctggagg cctgtcgcaa tggggacgtg tcccgggtaa 600 agaggctggt ggacgcggca aacgtaaatg caaaggacat ggccggccgg aagtcttctc 660 ccctgcactt cgctgcaggt tttggaagga aggatgttgt agaacactta ctacagatgg 720 gtgctaatgt ccacgctcgt gatgatggag gtctcatccc gcttcataat gcctgttctt 780 ttggccatgc tgaggttgtg agtctgttat tgtgccaagg agctgatcca aatgccaggg 840 ataactggaa ctatacacct ctgcatgaag ctgctattaa agggaagatc gatgtgtgca 900 ttgtgctgct 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Claims

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다음 화학식 Ⅰ, Ⅱ 또는 Ⅲ 의 화합물, 또는 약학적으로 용인가능한 이의 염의 치료학적 유효량을 포함하는, 상동성 재조합을 매개하는 유전자의 유전적 결함에 의해 야기되는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물

화학식 Ⅰ

화학식 Ⅱ

화학식 Ⅲ
제 33 항에 있어서, 화합물은 화학식 Ⅰ 의 화합물임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 34 항에 있어서, 화학식 Ⅰ 의 화합물은 인산염 형태임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 33 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 유방암임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 33 항에 있어서, 유전적 결함은 상동성 재조합에 관련된 단백질을 코드하는 유전자가 결여된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 33 항에 있어서, 상동성 재조합에 관련된 단백질을 코드하는 유전자 발현에 있어서 유전적 결함이 존재함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 38 항에 있어서, 유전자는 XRCC1, CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51β, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NB51, WRN, BLM KU70, KU80, ATM, ATR CHK1, CHK2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, 및 RAD9 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상동성 재조합을 매개하는 유전자는 종양 억제 유전자임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 40 항에 있어서, 종양 억제 유전자는 BRCA1, BRCA2, 또는 이 둘 다임을 특징으로 하는 약학적 조성물.