KR20020092971A

KR20020092971A - 단백질 중공 나노 입자와 그것을 이용한 물질운반체, 및세포로의 물질도입방법

Info

Publication number: KR20020092971A
Application number: KR1020027011239A
Authority: KR
Inventors: 구로다순이치; 다니자와가츠유키; 세노마사하루; 곤도아키히코; 우에다마사카즈
Original assignee: 카가쿠키쥬쯔 신코지교단
Priority date: 2000-02-28
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2002-12-12
Also published as: KR100645851B1; JP2001316298A; EP1262555A1; EP1262555B1; JP4085231B2; US20030092069A1; WO2001064930A1; EP1262555A4; US7597905B2

Abstract

목적으로 하는 세포나 조직에 물질(유전자, 단백질, 화합물 등)을 특이적, 또한 안전하게 운반, 도입하기 위한 범용적인 방법으로서, 입자형성 능력을 갖는 단백질로서, B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus:HBV)표면항원 단백질에 생체인식분자를 도입한 중공 나노 입자를 제공한다.

Description

단백질 중공 나노 입자와 그것을 이용한 물질운반체, 및 세포로의 물질도입방법{PROTEIN HOLLOW NANO PARTICLES, TRANSPORTER WITH THE USE OF THE SAME AND METHOD OF INTRODUCING SUBSTANCE INTO CELLS}

최근, 의학의 분야에 있어서, 환부에 직접 작용하고, 높은 효과를 나타내는 부작용이 적은 약품의 개발이 한창 수행되고 있다. 특히, Drug Delivery System(DDS, 약품 전달 시스템)이라 불리는 방법은 목적 세포, 또는 목적 조직에 대하여 특이적으로 약제 등의 유효성분을 운반하고, 목적 장소에서 유효성분을 작용시킬 수 있는 방법으로서 주목되고 있다.

또, 최근의 분자 세포 생물학의 분야에 있어서도 특정 세포로의 유전자 도입은 필요 불가결한 기술로서 왕성하게 연구되고 있다. 또한, 인간 게놈 계획의 진전에 의해 각종 질환의 유전적인 배경이 분명하게 되고 있는 중인 현재, 이와 같은 세포 및 조직에 대한 특이성이 높은 유전자 도입법이 확립되면, 유전자 치료의 분야에서의 응용도 가능하게 된다.

세포에 유전자를 도입하는 방법으로서는 지금까지 유전자를 거대분자화 하여, 엔도시토시스(endocytosis)에 의하여 유전자를 집어넣는 방법(인산칼슘법, 리포펙타민법)이나, 전기펄스 자극에 의해, 세포막에 천공을 뚫고, 유전자를 유입시키는 방법(일렉트로포레이션법, 유전자총법)이 알려져 있고, 모두 오늘날에는 분자 생물학적 실험에 있어서, 일반적으로 실시되고 있는 수단이다.

이들의 방법은 간편하지만, 세포를 직접, 물리적으로 손상시키고, 유전자 도입 부분을 외과적으로 노출시킬 필요가 있으므로, 생체내부의 세포나 조직에는 용이하게 적용할 수 없다. 또, 100% 가까운 도입율을 얻기가 곤란하다.

한편, 안전성이 높은 물질 도입 방법으로서는 리포솜법이 알려져 있다. 이 방법은 세포를 손상시키는 일이 없기 때문에, 생체내부의 세포나 조직에도 적용하는 것이 가능하다. 그러나, 단순한 지질인 리포솜에 고도한 세포 및 조직 특이성을 부여하는 것은 곤란하고, 또한, in vivo에서의 유전자 도입율은 요구되는 값에 비해서는 훨씬 낮다고 하는 문제가 있다.

최근들어, 바이러스 DNA에 목적의 유전자를 넣고, 감염성 바이러스를 생성하여, 유전자 도입을 수행하는 기술이 개발되었다. 이 방법은 도입부분을 노출시킬 필요가 없고, 개체에도 응용할 수 있고, 도입효율도 100% 가까운 획기적인 방법으로서 주목되었지만, 바이러스가 광범위의 세포에 비특이적으로 감염하기 때문에 목적의 세포 이외에도 유전자가 도입되어 버린다고 하는 중대한 문제가 있다. 또, 바이러스 게놈 본체가 염색체에 넣어지고, 장래 예기되는 부작용을 일이킬 가능성이있기 때문에, 실제로는 질병의 초기치료 등에는 사용할 수 없고, 말기증상의 환자에 적용되는 데에 그치고 있는 것이 현재상태이다.

그래서, 본 출원의 발명은 이상과 같은 사정을 감안하여 이루어진 것이고, 종래 기술의 문제점을 해소하고, 목적으로 하는 세포나 조직에 물질(유전자, 단백질, 화합물 등)을 특이적, 또한 안전하게 운반, 도입하기 위한 범용적인 방법을 제공하는 것을 과제로 하고 있다

본 출원의 발명은 입자형성 능력을 갖는 단백질에 생체인식분자가 도입되어 있는 중공 나노 입자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 출원의 발명은 특정의 세포 및 조직에 물질을 도입하기 위한 운반체로서 사용할 수 있는 중공 나노 입자에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 실시예에 있어서의 HBsAg유전자의 각 단백질 영역을 나타내는 개략 모식도이다. 1∼8은 표면항원에 있어서의 각 부위의 작용을 나타내고 있다.(1:방충억제, 2:리셉터, 3:당쇄 1, 4:혈청중합 알부민 리셉터, 5:막관통, 6:안정화, 7:당쇄2, 8:막관통 저중합화·분비)

도 2는 본 발명의 실시예에 있어서의 유전자 재조합 효모를 사용한 HBsAg입자의 발현 및 정제 조작을 예시한 개략 설명도이다.

(a)유전자 재결합 효모의 작성, (b)High-Pi배지에서 배양, (c)8S5N-P400배지에서 배양, (d)파쇄, (e)밀도 구배 원심 분리, (f)HBsAg입자를 각각 나타낸다.

도 3은 본 발명의 실시예에 있어서, GFP플라스미드를 도입한 HBsAg입자와 HepG2를 접촉시킨 때의 HepG2의 공초점 레이저 형광 현미경 사진을 나타낸 도이다. (a)HBsAg입자 사용(플라스미드량:8ng), (b)지질(리포솜)사용(플라스미드량:800ng), (c)벡터만(플라스미드량:800ng)을 각각 나타낸다.

도 4는 GFP를 주입시킨 HBsAg입자에 의하여, 인간 간암 유래 세포(NUE)내에 있어서도 HepG 2와 같은 정도로 GFP가 발현되는 것을 나타낸 공초점 레이저 형광 현미경 사진을 나타낸 도이다. (a)HepG 2세포, (b)NUE세포를 각각 나타낸다.

도 5는 HBsAg입자가 인간 간암 유래 세포(HuH-7)로 극히 특이적으로 GFP를 도입시킬 수 있는 것을 나타내는 공초점 레이저 형광 현미경 사진을 나타낸 도이다. (a)인간 게놈 유래 세포(HuH-7)를 이식시킨 쓸개암 마우스의 종양부(형광임), (b)마우스의 통상 간장(형광아님)

본 출원의 발명은 상기의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 우선, 제 1로는 입자형성 능력을 갖는 단백질에 생체인식분자가 도입되고 있어 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자를 제공한다.

제 2로는 본 출원의 발명은 진핵세포에서 단백질을 발현시켜 얻어지는 단백질 입자에 생체인식분자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자를 제공한다.

제 3으로는 본 출원의 발명은 진핵세포가 효모 또는 유전자 재조합 효모 중 어느 것으로부터 선택되는 것, 및 제 4로는 진핵세포가 곤충세포인 것을 상기 제 2의 발명의 중공 나노 입자의 형태로서 제공한다.

또, 제 5로는 본 출원의 발명은 입자를 형성하는 단백질이 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질인 상기 중 어느 것의 중공 나노 입자 입자를 제공한다.

또, 본 출원의 발명은 제 6으로는 상기 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질이 항원성을 감소시킨 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질인 상기의 중공 나노 입자를 제공한다.

본 출원의 발명은 또, 제 7로는 생체 확인 분자가 세포기능 조절 분자인 것, 제 8로는 생체인식분자가 항원인 것, 제 9로는 생체 확인 분자가 항체인 것, 제 10으로는 생체 확인 분자가 당쇄인 것을 상기 중 어느 것의 중공 나노 입자의 상태로서 제공한다.

제 11로 본 출원의 발명은 또한, 상기 중 어느 것의 중공 나노 입자에 세포도입물질이 내포되어 있는 것을 특징으로 하는 물질운반체도 제공한다.

또, 본 출원의 발명은 제 11의 발명의 물질운반체에 있어서, 제 12에는 세포도입물질이 유전자인 것, 제 13으로는 세포도입물질이 단백질인 것, 제 14로는 세포도입물질이 세포내에서 세포상해성을 나타내는 RNase인 것, 제 15로는 세포도입물질이 화합물인 것을 형태로서 제공한다.

또한, 본 출원의 발명은 상기 제 11 내지 제 15의 발명 중 어느 하나의 물질운반체의 제조방법으로서, 제 16에는 상기 제 1 내지 제 10 중 어느 하나의 중공 나노 입자에 일렉트로포레이션(electroporation)법에 의해 세포도입물질을 내포시키는 것, 제 17로는 초음파법에 의해 세포도입물질을 내포시키는 것, 제 18로는 단순 확산법에 의해 세포도입물질을 내포시키는 것, 제 19로는 전하를 갖는 지질을 사용하여 세포도입물질을 내포시키는 것을 제공한다.

그리고, 제 20으로는 본 출원의 발명은 상기 제 1부터 제 10의 발명 중 어느 하나의 중공 나노 입자를 사용하는 것을 특징으로 세포 또는 조직으로의 물질 도입 방법을, 제 21로는 상기 제 11부터 제 15 중 어느 하나의 물질운반체를 사용하는것을 특징으로 하는 세포 또는 조직으로의 물질 도입 방법을 제공한다.

그리고 또한, 제 22에는 본 출원의 발명은 적어도 상기 중 어느 하나의 물질 도입 방법을 사용하고, 특징 세포 또는 조직으로 물질을 운반하는 조작을 포함한 질환의 치료방법도 제공한다.

본 출원의 발명의 중공 나노 입자는 입자형성 능력을 갖는 단백질에 생체 확인 분자를 도입하는 것에 의하여, 목적 세포 또는 목적 조직에 특이적으로 물질을 운반하는 것을 가능하게 하는 것이다. 이와 같은 입자형성 능력을 갖는 단백질로서는 여러가지의 바이러스로부터 얻어지는 서브 바이러스 입자를 적용할 수 있다. 구체적으로는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus:HBV)표면항원 단백질 등이 예시된다.

또, 이와 같은 입자형 성능을 갖은 단백질로부터 이루어지는 단백질 입자로서는 진핵세포에서 단백질을 발현시키는 것에 의해 얻어지는 것이 열거된다. 요컨대, 진핵세포에서 입자형성 능력을 갖는 단백질을 발현시키면, 같은 단백질은 소포체막 위에 막단백질로서 발현, 축적되고, 입자로서 방출되는 것이다. 이 때, 진핵세포로서는 효모나 유전자 재결합 효모, 곤충세포 등을 적용할 수 있다.

발명자들은 후술의 실시예에 나타내는 바와 같이, 유전자 재결합 효모에서 상기 HBV표면항원 L단백질을 발현시키는 것에 의해, 발현시킨 HBV표면항원 L단백질로서부터 효모유래의 지질 2중막에 다수의 동일한 단백질이 들은 단지름 약20nm, 장지름 약 150nm의 타원형상 중공 입자가 형성되는 것을 발견하고, 보고하고있다(J.Bio.chem.,Vol.267,No. 3, 1953-1961, 1992). 이와 같은 입자는 HBV게놈이나 HBV단백질을 전부 함유하지 않으므로, 바이러스로서는 기능하지 않고, 인체로의 안정성이 극히 높다. 또, HBV의 간세포로의 극히 높은 감염력을 지닌 간세포 특이적 리셉터를 입자표면에 제시하고 있기 때문에, 간세포에 대하여 특이적으로 물질을 운반하는 운반체로서의 효과도 높다.

이와 같은 유전자 재조합 효모를 사용하여 단백질 입자를 형성하는 방법은 균체내의 가용성 단백질로부터 고효율로 입자가 생산되는 점에서 바람직하다.

한편, 곤충 세포는 효모보다도 고등 동물에 가까운 진핵 세포이고, 효모에서는 재현되지 않는 당쇄 등의 고차구조를 재현할 수 있는 점에서 다른 종 단백질의 대량생산에 있어서, 바람직한 방법이라고 말한다. 종래의 곤충세포의 계는 베큘로바이러스(Baculovirus)를 사용한 계로, 바이러스 발현을 동반하는 것이었기 때문에, 단백질 발현할 때 세포가 사멸되거나, 용해되거나 하였다. 그 결과 단백질 발현을 연속적으로 수행하거나, 사멸 세포로부터 유리된 프로티아제(protease)에 의해 단백질이 분해되거나 한다는 문제가 있었다. 또, 단백질을 분비 발현 시키는 경우에는 배지 중에 함유되는 다량의 소태자 혈청이 혼입하는 것으로서, 일부러 배지 중에 분비시켜도 정제가 곤란하였다. 그러나, 최근에는, 베큘로바이러스를 통하지 않은 곤충 세포계로 무혈청 배양 가능한 것이 Invitrogen 사에 의해 개발되고, 시판되고 있다. 따라서, 이와 같은 곤충 세포를 사용하면, 정제가 용이하고, 고차 구조를 재현시킨 단백질 입자가 얻어진다.

본 출원의 발명의 단백질 중공 나노 입자에서는 이상과 같은 여러가지의 방법에 의하여 얻어지는 입자 표면의 리셉터를 임의의 생체인식분자로 개변하거나, 여러가지의 물질(DNA, RNA, 단백질, 펩티드, 및 약제 등)을 입자내에 도입하는 것에 의해, 간세포 이외에도 임의의 세포 및 조직에 극히 높은 특이성으로 물질을 운반, 도입하는 것이 가능하게 된다.

물론, 입자형성 능력을 갖는 단백질은 상기의 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질에 한정되는 것은 아니고, 입자를 형성할 수 있는 단백질이면, 어떤 것이어도 좋고, 동물세포, 식물세포, 바이러스, 균종 등에서 유래하는 천연 단백질이거나, 여러가지의 합성 단백질 등이 고려된다. 또, 예컨대, 바이러스 유래의 항원 단백질 등이 생체내에 있어서 항체를 야기할 가능성이 있는 경우 등은 개변하여 항원성을 감소시킨 것을 생체인식분자로서 사용하여도 좋다.

입자형성 능력을 갖는 단백질에 도입되는 생체인식분자로서는 예컨대, 성장인자, 사이토킨(Cytokine) 등의 세포 기능 조절 분자, 세포 표면 항원, 조직 특이적 항원, 리셉터 등의 세포 및 조직을 식별하기 위한 분자, 바이러스 및 미생물에서 유래하는 분자, 항체, 당쇄, 지질 등이 바람직하게 사용된다. 이들은 목적으로 하는 세포 또는 조직에 대하여 적당선택된다.

본 출원의 발명에서는 이상과 같은 단백질 중공 나노 입자에 목적 세포 또는 조직에 도입되는 물질(세포도입물질)을 내포시키는 것에 의하여, 세포 특이성을 갖는 물질운반체가 얻어진다. 이 물질운반체에 내포되는 세포도입물질이란, 예컨대, DNA, RNA 등의 유전자, 천연 또는 합성 단백질, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 약제, 천연 또는 합성 화합물 등, 그와 같은 것이어도 좋다.

구체적으로는 이미 발명자들에 의해 보고된 인간 RN sae 1(Jinno H, Ueda M, Ozawa S, Ikeda T, Enomoto K, Psarras K, Kitajima M, Yamada H, Seno M Life Sci. 1996;58(21):1901-8) 또는 RN ase 3(별명 ECP : eosinophil cationicprotein; Mallorqui-Fernandez G,Pous J,Peracaula R, Aymami J, Maeda T, Tada H, Yamada H, Seno M, de Liorens R, Gomis-Ruth FX, Coll M; J Mol Biol. 2000 Jul 28;300(5):1297-307.)등이 적용된다.

이들의 단백질은 세포외에서 작용하여도 세포 상해 활성을 나타내지 않지만, 세포내에 집어 넣으면 세포 상해 활성을 나타내는 것으로 구분된다. 그래서, 이들의 RNase를 내포시킨 본원 발명의 물질운반체를 이용하면, 세포나 조직에 선택적으로 세포 상해 활성이 있는 단백질의 강제 발현을 수행할 수 있고, 새로운 암치료 방법으로서 기대된다.

또, 이들의 세포도입물질을 상기의 중공 나노 입자에 도입하는 방법으로서, 통상의 화학적, 분자 생물학적 실험수법에서 사용되는 다양한 방법이 적용된다. 예를들면, 일렉트로포레이션법, 초음파법, 단순 확산법, 또는 전하를 갖는 지질을 사용하는 방법이 바람직하게 예시된다.

그리고, 이들의 단백질 중공 나노 입자 또는 물질운반체를 사용하고, in vivo 또는 in vitro에서 세포, 또는 조직에 특이적인 물질을 도입하는 것이 가능하게 된다. 또는 상기의 RNase를 사용한 예와 같이, 이상과 같은 단백질 중공 나노 입자나 물질운반체를 사용하고, 특정의 세포 또는 조직에 물질을 도입하는 것을 각종 질환의 치료법 또는 치료법의 1단계로서 수행하는 것도 가능하게 된다.

이하, 첨부된 도면에 부합하여, 실시예를 나타내고, 본 발명의 실시의 형태에 관하여 더욱 상세하게 설명한다. 물론, 본 발명은 이하의 예에 한정되는 것은 아니고, 세부에 관해서는 다양한 형태가 가능한 것은 말할 것도 없다.

실시예

이하, 실시예에 있어서, HBsAg란, B형 간염 바이러스 표면 항원(Hepatitis B virus surface Antigen)을 나타낸다. HBsAg는 HBV의 외피 단백질이고, 도 1의 모식도에 나타낸 바와 같이, HBsAg에는 S단백질, M단백질, L단백질의 3종류가 있다. 이 중, S단백질은 3종의 단백질에 공통인 중요한 외피 단백질이고, M단백질은 S단백질의 N말단측에 55아미노산(pre-S2 peptide)이 부가된 것이다. 또, L단백질은 M단백질의 N말단측에 108 또는 119아미노산(pre-S1 peptide)이 부가된 것이다.

HBsAg L단백질의 Pre-S 영역(pre-S1, Pre-S2)은 HBV가 간세포에 결합할 때, 각각 중요한 역할을 지닌 것으로 알려져 있다. Pre-S1은 간세포에 직접 결합하는 부위를 갖고, pre-S2는 혈중의 중합 알부민을 통하여, 간세포에 결합시킨 중합 알부빈 리셉터를 갖는 것이다.

진핵 세포에서 HBsAg를 발현시키면, 동일한 단백질은 소포체 막 위에 막단백질로서 발현, 축적된다. HBsAg의 L단백질은 분자 사이에서 응집을 일으키고, 소포체 막을 집어 넣으면서, 출아 양식으로 루멘측에 입자로서 방출된다.

이하의 실시예에서는 HBsAg의 L단백질을 사용하였다. 또한, 도 2에 이하의 실시예에 기재되는 HBsAg입자의 발현 및 정제 기작의 개략 설명도를 나타내었다.

실시예 A 유전자 재조합 효모에 의한 HBsAg입자의 발현

발명자들에 의하여 보고된 J.Bio,Chem.,Vol.267, No. 3, 1953-1961, 1992기재의 방법에 기초하여, pGLDLIIP39-RcT를 유지한 유전자 재조합 효모 (Saccharomyces Cerevisiae AH22R^-주)를 합성 배지 High-Pi 및 8S5N-P400 중에 배양하고, HBsAg L단백질 입자를 발현시켰다(도 2a, b)

정상 성장기(약 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터 Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical Co. 제)를 사용하고, Whole cell extract를 준비하고, 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아미드겔 전기 영동(SDS-PAGE)를 사용하여 분리하고, 은 염색에 의하여 시료 중의 HBsAg의 동정을 수행하였다.

이것에서 HBsAg는 분자량 약 52kDa의 단백질인 것이 분명하게 되었다.

실시예 B HBsAg입자의 유전자 재조합 효모로부터의 정제

(1)합성배지8S5N-P400에서 배양된 유전자 재조합 효모(습중량26g)을 buffer A용액(7.5M요소, 0.1M 인산 나트륨, pH7.2, 15mM EDTA, 2mM PMSF, 0.1% Tween 80)100ml에 현탁하고, 유리구슬을 이용하여 비드 비터(BEAD-BEATER)로 효모를 파쇄하였다. 파쇄 후, 상청을 원심분리에 의해 회수하였다.(도 2c, d)

(2)다음에, 상청을 0.75배용의 33%(w/w)PEG600으로 혼합하고, 30분간 빙냉하였다. 그 후, 원심분리(7000rpm, 30분간)를 수행하고, 펠릿을 회수하였다. 동일 펠릿은 Tween 80을 함유하지 않은 buffer A용액 중에서 재현탁되었다.

(3)재현탁된 액을 10∼40%의 구배를 가한 CsCl에 중층(重層)하고, 28000rpm, 16시간의 초원심 분리를 수행하였다. 원심분리 후의 시료를 12획분으로 나누고, 웨스턴 블로트법(Western Blotting)(1차 항체는 anti-HBsAg모노 크로날 항체)에 의해 HBsAg를 함유하는 획분을 동정하였다. 또한, HBsAg를 함유하는 획분을 Tween 80을 함유하지 않는 buffer A용액에서 투석하였다.

(4)(3)에서 얻어진 투석액(12ml)을 5∼50%의 구배를 가한 자당으로 중층하고, 28000rpm, 16시간의 초원심 분리를 수행하였다. 원심분리 후, (3)과 동일하게, HBsAg를 함유하는 획분을 동정하고, HBsAg를 함유하는 획분을 요소와 Tween80은 함유하지 않고, 그 대신에 0.85%의 NaCl을 함유하는 buffer A용액으로 투석하였다.((2)∼(4): 도 2e)

(5)(4)와 동일하게 조작을 반복하고, 투석 후의 시료를 울트라 필터(Ultra Filter)Q2000(아드반텍 가부시끼가이샤 제품)을 사용하여 농축하고, 사용할 때까지 4℃로 냉장보존하였다.(도 2f)

CsCl평형 원심분리 후의 웨스턴 블로트(3)의 결과로부터, HBsAg는 분자량 52kDa에서 S항원성을 갖는 단백질인 것이 판명되었다. 최종적으로, 배지 2.5L유래, 습중량 26g의 균체로부터, 약 24mg의 정제 HBsAg입자를 얻었다.

일련의 정제 과정에 있어서의 획분을 은염색 SDS-PAGE로 해석하였다. 또, 정제에 의해 효모유래의 프로티아제가 제거되고 있는 것을 확인하기 위해서, (5)에서 얻어진 HBsAg입자를 37℃에서 12시간 인큐베이터한 후, SDS-PAGE를 수행하고, 은염색에 의해 동정(同定)을 수행하였다.

그 결과, 효모유래의 프로티아제는 일련의 정제과정에 있어서 완전하게 제거되고 있는 것이 확인되었다.

실시예1 인간 간염세포 HepG 2에 있어서의 HBsAg입자에 의한 유전자 도입

지수 증식기에 있는 인간 간암세포 HepG2를 1×10⁵cells/well이 되도록 3.5cm유리 저혈(底血)샤알레에 식균하고, 37℃, 5% CO₂존재 하에서 10%소 태아 혈청을 함유하는 D-MEM을 사용하여 하룻만 배양하였다. 다음날, HBsAg입자와 녹색형광 단백질 발현 플라스미드(GFP expression plasmid pTB701-hGFP)를 혼합하고, 일렉트로 포레이션을 수행한 후, 이 시료를 HepG2배양액으로 혼합하고, 37℃, 5% CO₂존재 하에서 4일간 배양하였다.

HepG2내에서의 GFP의 발현의 양자를 공초점 레이저 형광 현미경으로 관찰하였다.

HepG2를 사용하여 HBsAg입자의 유전자 도입 효율을 평가하였다. 간격 4mm의 큐빗(cuvet)을 사용하고, 110V, 950μF의 조건으로 일렉트로포레이션을 수행한 HBsAg-플라스미드를 HepG2로 형질 다입시키고, 37℃, 5%CO₂존재 하에서 D-MEM을 사용하여 4일간 배양하였다.

HepG2의 공초점 레이저 사진을 도 3에 나타내었다. 도 3(a)을 도 3(b), (c)와 비교하면, 도 3(a)는 도 3(b)의 약 200배의 효율을 나타내고 있고, HBsAg입자에 의한 GFP expression plasmid의 도입 효율은 비상하게 높은 것으로 판명되었다.

실시예2 HepG2 이외의 인간 간암세포에 있어서의 HBsAg입자에 의한 유전자 도입

실시예 1에 기재된 방법에 따라서, 인간 간암 유전세포로서 HuH-7(JCRB0403) 및 NUE(방위의과대학교 기생충학 강좌 "타다쿠마 타카시"교수에 의해 분양)을 준비하였다.

또, 음성 대조로서, 인간 대장암 유래 세포 WiDr(ATCC CCL-218), HT29(ATCC HTB-38), SW1116(ATCC CCL-233), 인간 악성흑색종 유래 세포 SEKI(JCRBO620), 인간 편평상피암 유래 세포 A431(JCRB9009)를 각각 3.5cm유리 저혈 샤알레 위에 배양하고, GFP발현 플라스미드(pEGFP-F(Clontech 사)) 8ng을 함유하는 HBsAg입자를 10⁵세포에 감염시키고, 4일간 배양을 계속하였다. 그 후, 각 세포 내에서의 GFP의 발현의 양자를 공초점 레이저 형광 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, HuH-7 및 NUE세포에서, HepG2세포와 동일한 정도의 형광이 관찰되었다 (도 4).

한편, 인간 간장유래에 없는 세포에서는 모두 GFP의 형광이 관찰되지 않았다.

이상으로부터, 본 발명의 HBsAg입자를 사용하고, 배양 세포레벨에서, 인간 간세포에 대하여 극히 높은 특이성과 효율로 유전자를 도입할 수 있는 것이 나타내졌다.

실시예 3 인간간암을 이식한 누드마우스에 대한 HBsAg입자에 의한 유전자 도입

쓸개암 마우스는 누드마우스(계통:BALB/c nu/nu, 미생물학적 품질:SPF, 성별:♂ 5주령)의 양측배부피하에 실시예 2에서 사용한 인간 종양주(HuH-7 및 WiDr)을 각각 1×10⁷세포 피하에 주사하고, 이식종양이 직경 2cm정도의 고형암으로 될 때까지 2∼6주간 생육시켜 얻었다.

실시예 2에 기재된 방법에 의해 얻은 GFP발현 플라스미드(pEGFP-F)2.5㎍을 함유하는 HBsAg입자 10㎍을 마우스 복강 내에 26주사침을 사용하여 투여하였다. 투여 후, 4일째 마우스를 도살하여, 종양부, 간장, 비장, 신장, 장을 적출하고, GFP용 수지 포매(包埋) 키트(Technovit7100)를 사용하여 조직을 고정·포매하였다.

구체적으로는 고정은 4% 중화 포름알데히드에 침지하여 수행하고, 탈수는 70%EtOH에서 실온 2시간, 96%EtOH에서 실온 2시간, 100%EtOH에서 실온 1시간, 예비침지는 100%EtOH/Technovit7100 등 중혼합액으로 실온 2시간 수행하였다. 그 후, Technovit7100에서 실온 24시간 이내의 침지를 수행하고, 꺼낸 후, 실온에서 1시간 및 37℃에서 1시간 정치하여 중합반응을 시켰다.

통상의 방법에 따라서, 절편을 제작하고, 동시에 헤마톡신에오린 염색(일반적인 조직염색)을 수행하고, 형광 현미경에 의해 HBsAg입자 투여군과 비투여군의 GFP에 의한 형광을 비교하였다.(도 5)

도 5에서, 인간 간암 유래 HuH-7세포에 의한 쓸개암 마우스의 종양부에 GFP에서 유래하는 형광을 인식하였다. 그러나, 동일한 마우스에 의해 동시에 적출한 간장, 비장, 신장, 장에는 형광을 인식시키지 않았다. 또한, 인간 대장암 유래 WiDr세포에 의한 쓸개암 마우스의 종양, 간장, 비장, 신장, 장 및 HBsAg입자 비투여군에서도 형광은 인식되지 않았다.

이상으로부터, HbsAg입자를 사용하는 것에 의해, 실검동물 레벨에서도, 사람간 세포에 대하여 극히 높은 특이성과 효율로 유전자 도입이 가능한 것을 나타내었다. 그러므로, 본 발명의 물질운반체는 극히 유효인 것이 확인되었다.

실시예C 생체인식분자 제시용 범용형 HBsAg입자(HBsAg-Null입자)의 제작

HBsAg입자는 인간 간세포에 특이적으로 감염할 수 있으나, 그 높은 감염성을 지닌 같은 입자 표면에 제시되어 있는 간세포 인식부위는 pre-S1영역의 3∼77아미노산 잔기에 함유되어 있는 것이 판명되고 있다(Le Seyec J, Chouteau P, Canniel, Guguen-Guillouzo C, Gripon P.,J.Virol.1999, Mar;73(3):2052-7).

여기서는 HBsAg입자의 입자형성 능력을 갖으면서, 간세포에 대한 높은 감염 능력을 결실시키고, 또한, 임의의 생체인식분자를 입자표면에 제시할 수 있는 개변 HBsAg입자(이후, HBsAg-Null입자라 부름)의 제작법을 기록한다.

실시예 A에 기재된 pGLDLIIP39-RcT플라스미드의 인간 간세포 인식부위를 코드하는 유전자 영역을 결실시키고, 동시에 제한효소 Notl 사이토(gcggccgc)를 삽입하기 위해, 서열목록 1의 올리고뉴클레오티드와 서열목록 2의 올리고뉴클레오티드를 PCR용 프라이머로서 사용하고, QuickChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene 사)를 사용한 PCR법을 pGLDLIIP39-RcT플라스미드에 대하여 수행하였다.

구체적으로는 내열성 DNA폴리머라제로서 Pfu DNA polymerase(Stratagene)을 사용하고, PCR스케쥴은 95℃ 30초간의 변성, 55℃ 1분간의 아닐링, 68℃ 30분간의 합성반응을 30회 반복하였다. 그 후, PCR산물을 제한효소 Dpnl로 처리하고, 대장균 DH5α으로 형질전환하고, 출현콜로니(colony)로부터 벡터-DNA를 압출하고, 염기배열로부터 변이도입시킨 pGLDLIIP39-RcT플라스미드를 선발하였다.(이하,pGLDLIIP39-RcT(null)이라 부름).

실시예 A기재의 방법으로 pGLDLIIP39-RcT(null)플라스미드를 형질전환하고, 합성배지 High-Pi 및 8S5N-P400 중에서 배양하고, HBsAg-Null입자를 발현시켰다.

정상 성장기(배양개시로부터 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터, Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical사 제품)를 사용하여 균제 조압출액을 제작하고, SDS-PAGE를 사용하여 분리하고, 은염색 및 항S모노크로날항체(푸나코시 가부시끼가이샤)를 사용하는 Western법에 의해 HBsAg-Null의 동정을 수행하였다.

이로부터 HBsAg-Null은 분자량 약 42kDa의 단백질인 것이 분명하게 되었다.

또한, 실시예 B에 기재된 방법에 따라서, 배지 2.5L유래의 상기 균체(약 26g)로부터 약 3mg의 정제 HBsAg-Null입자를 얻었다. HBsAg의 입자구조만을 검출할 수 있는 Auszyme II EIA 키트(다이나보트 가부시끼가이샤)를 사용하고, HBsAg입자 및 HBsAg-Null입자의 S항원성(HBsAg의 입자화 정도)을 측정하였더니, 양쪽 모두 동등의 값이 관찰되었다.

실시예4 인간 유래 암세포에 있어서의 HBsAg-Null입자에 의한 유전자 도입

실시예2에 기재된 방법에 따라서, 실시예C에서 얻은 간세포에 대한 높은 감염 능력을 결실시키고, 또한, 임의의 생체인식분자를 입자 표면에 제시할 수 있는 HBsAg-Null입자 내부에 GFP발현용 플라스미드(pEGFP-F(Clontech 사)를 봉입하고, HepG2세포와 실시예 2에 기재된 각종 인간 유래 암세포로의 유전자 도입을 배양 세포 레벨에서 수행하였다.

그러나, 어느 것의 세포에서도 GFP에 의한 형광은 관찰되지 않았다. 이 것으로부터, HBsAg-Null입자가 인간 간장 유래 세포에 대한 높은 감염 능력을 소실하고 있는 것을 나타내었다.

실시예5 인간유래 암세포를 이식한 누드마우스에 대한 HBsAg-Null입자에 의한 유전자 도입

실시예 3에 기재된 방법에 따라서, 인간 종양주(HuH-7 및 WiDr)을 이식한 슬개암 마우스를 제작하고, GFP발현 플라스미드(pEGFP-F(Clontech 사))를 함유하는 HBsAg-Null입자를 투여하였으나, 종양부 및 전체의 주요 장기에 있어서, GFP에 의한 형광은 관찰되지 않았다.

이것으로부터 HBsAg-Null입자가 모든 장기에 대하여 감염성을 갖지 않는 것이 확인되었다.

실시예D 상피성장인자(EGF:Epidermal Growth Factor)제시형 HBsAg입자(HBsAg-EGF입자)의 제작

EGF수용체는 극히 대부분의 세포가 세포 표층에서 발현하고 있는 것이 알려져 있고, 특히 어떤 종의 암(식도암, 대장암 등)의 증오에 관계하고 있는지를 알고있다. 그래서, EGF수용체를 표적으로 하는 HBsAg입자를 제작하면, EGF수용체를 발현하는 암조직에 대한 유효한 치료수단으로 된다고 생각되어진다.

여기서는 실시예 C에 기재된 방법에 의해 HBsAg-Null입자를 근본으로 한, EGF제시형 HBsAg입자(HBsAg-EGF입자)의 제작법을 기록한다.

인간 유래 EGF전구체 cDNA단편(Bell Gl, Fong NW, Stempien MM, WormstedMA, Caput D, Ku LL, Urdea Ms, Rall LB, Sanchez-Pescador R Nucleic Acids Res 1986 Nov 11;14(21):8427-46)을 주형(鑄型)으로서, 성숙형 인간 EGF영역(53아미노 산 잔기)를 코드하는 유전자 단편을 PCR법에 의해 통상의 방법과 같이 증폭시켰다.

사용한 2종류의 PCR프라이머는 센스측이 서열목록 3의 올리고뉴클레오티드, 안티센스측이 서열목록 4의 올리고뉴클레오티드이고, 양쪽 모두 5'말단측에 제한효소 Notl 사이토(gcggccgc)를 갖도록 설계되었다.

PCR산물을 아가로스(agarose)전기영동으로 분리한 후, 목적의 cDNA를 함유하는 밴드(약 170bp)를 회수하고, TOPO TA Cloning kit(Invitrogen 사)를 사용하고, pCR2.1-TOPO벡터(Invitrogen 사)에서 서브클로닝하였다. 염기배열을 확인한 후, 제한효소 Notl로 절단하고, 약 170bp의 목적 DNA단편을 회수하고, pGLDLIIP39-RcT(null)을 제한효소 Notl로 개열시킨 것과 TaKaRa Ligation kit ver.2(TaKaRa 사)를 사용하여 폐환결합시키고, 대장균 DH5α를 형질전환하였다.

염기배열 해석에 의해 선발을 수행하고, 삽입한 EGF유전자가 HBsAg유전자와 판독틀이 일치하여 융합된 것을 선발하고, 플라스미드를 pGLDLIIP39-RcT-EGF플라스미드를 pGLDLIIP39-RcT-EGF라 명명하였다.

실시예A의 방법에 기초하여, pGLDLIIP39-RcT-EGF플라스미드를 형질전환하고, 합성배지 High-Pi 및 8S5N-P400 중에서 배양하여, HBsAg-EGF입자를 발현시켰다.

정상 성장기(배양개시로부터 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터 Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical사 제품)을 사용하고, 균체 조압출액을 제작하고, SDS-PAGE를 사용하여 분리하고, 은염색 및 항인간 EGF폴리크로날 항체(Santa Cruz 사)를 사용하여 Western법에 의해 HBsAg-EGF의 동정을 수행하였다.

이로부터, HBsAg-EGF는 분자량 약 50kDa의 단백질인 것이 분명하게 되었다.

실시예 B에 기재된 방법에 따라서, 배지 2.5L유래의 상기 균체(약 26g)으로부터 약 3mg의 정제 HBsAg-EGF입자를 얻었다. HBsAg의 입자구조만을 검출할 수 있는 Auszyme II EIA 키트(다이나보트 가부시끼가이샤)를 사용하고, HBsAg입자 및 HBsAg-Null입자의 S항원성(HBsAg의 입자화 정도)을 측정하였더니, 양쪽 모두 동등한 값이 관찰되었다.

따라서, HBsAg-EGF입자가 HBsAG입자와 동일한 형태로 얻어지고 있는 것이 나타내어졌다.

실시예6 인간 유래 암세포에 있어서의 HBsAg-EGF입자에 의한 유전자 도입

실시예 2에 기재된 방법에 따라서, HBsAg-EGF입자 내부에 GFP발현용 플라스미드 pEGFP-F벡터-(Clontech 사)를 주입하고, HepG2세포 및 실시예 2에 기재된 각종 인간 유래 암세포로의 유전자 도입을 배양 세포 레벨에서 수행하였다.

그 중에서, EGF리셉터를 대량으로 세포 표면에 발현하고 있는 A431세포에 있어서, GFP에 의한 강한 형광을 관찰할 수 있었다.

이것에 따라서, HBsAg-EGF입자가 EGF리셉터 발현세포에 대한 높은 감염 능력을 갖는 것이 확인되었다. 또, 배양세포 레벨에서 개선 HBsAg입자에 임의의 생체 인식 능력을 부여할 수 있는 것이 나타내졌다.

실시예7 인간 유래 암세포를 이식한 누드마우스에 대한 HBsAg-EGF입자에 의한유전자 도입

실시예 3에 기재된 방법에 따라서, 인간 종양주(A431, HuH-7, WiDr)을 이식한 쓸개암 마우스를 제작하고, GFP발현 플라스미드(pEGFP-F(Clontech 사))를 함유하는 HBsAg-EGF입자를 투여하였더니, A431에 의한 종양부에 강력한 GFP에 의한 형광은 관찰되었다. 한편, 다른 세포에 의한 종양부 및 주요 장기에 있어서는 GFP에 의한 형광은 관찰되지 않았다.

이것으로부터 HBsAg-EGF입자가 EGF리셉터를 저량 발현하고 있는 세포에 특이적으로 감염될 수 있는 것, 및 주요장기에 대해서는 감염성을 갖지 않는 것이 확인되었다.

따라서, 임의의 생체인식분자를 융합 또는 부가한 HBsAg-Null입자는 실검동물 레벨에서도, 모든 조직 및 장기에 물질을 특이적으로 운반할 수 있는 입자로 되는 것이 보여졌다.

실시예E 베타셀루린(BTC:Betacellulin)제시형 HBsAg입자(HBsAG-BTC입자)의 제작

BTC는 EGF패밀리(family)에 일종이지만, 발현부위는 EGF와 다르다. 특히, 혈당 조절 기구에 중요한 역할을 지닌 췌장내 랑게르한스섬 β세포의 분화에 중요한 역할을 지닌 것으로 판명되고 있다. 그래서, BTC수용체를 표적으로 하는 HBsAg입자를 제작하면, BTC수용체를 발현하는 조직에 대한 유효한 물질 운반 수단으로 할 수 있고, β세포에 기인하는 당뇨병의 치료에도 유용할 것으로 기대된다.

여기서는 실시예C 기재의 방법에 의하여 제작된 HBsAg-Null입자를 기초로, BTC제시형 HBsAg입자(HBsAg-BTC입자)의 제작법을 기록한다.

인간 유래 BTC전구체 cDNA단편(Sasada R, Ono Y, Taniyama Y, Shing Y, Folkman J, Igarashi K; Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993 Feb 15;190(3) :1173-9.)를 주형으로서, BTC수용체에 결합 능력을 나타내는 것이 알려져 있는 부분(GHFSR------VDLFY의 48아미노산 잔기)을 코드하는 유전자 단편을 PCR법에 의해 통상의 방법과 같이 증폭하였다.

사용한 2종류의 PCR프라이머는 센스측이 서열목록 5의 올리고뉴클레오티드, 안티센스측은 서열목록 6의 올리고뉴클레오티드이고, 양쪽 모두 5'말단측에 제한효소 Notl 사이토(gcggccgc)를 갖도록 설계하였다.

PCR산물을 아가로스 전기영동에서 분리한 후, 목적의 cDNA를 함유하는 밴드(약 160bp)를 회수하고, TOPO TA Cloning kit(Invitrogen 사)를 사용하고, pCR2.1-TOPO벡터(Invitrogen 사)에서 서브클로닝하였다. 염기배열을 확인한 후, 제한효소 Notl로 절단하고, 약 160bp의 목적 DNA단편을 회수하고, pGLDLIIP39-RcT(null)을 제한효소 Notl로 개열시킨 것과 TaKaRa Ligation kit ver.2(TaKaRa 사)를 사용하여 폐환결합시키고, 대장균 DH5α를 형질전환하였다. 염기배열 해석에 의해 선발을 수행하고, 삽입된 BTC유전자가 HBsAg유전자와 판독틀이 일치하여 융합된 것을 선발하고, 플라스미드를 pGLDLIIP39-RcT-BTC라 명명하였다.

실시예 A와 동일한 방법으로 pGLDLIIP39-RcT-BTC플라스미드를 형질전환하고, 합성배지 High-Pi 및 8S5N-P400 중에서 배양하고, HBsAg-Null입자를 발현시켰다.

정상 성장기(배양개시로부터 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터, Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical사 제품)를 사용하여 균체조압출액을 제작하고, SDS-PAGE를 사용하여 분리하고, 은염색 및 항BTC폴리크로날항체(오카야마 대학부 "세노우"씨 제작)를 사용하는 Western법에 의해 HBsAg-BTC의 동정을 수행하였다.

이로부터 HBsAg-BTC는 분자량 약 50kDa의 단백질인 것이 분명하게 되었다.

실시예 B에 기재된 방법에 따라서, 배지 2.5L유래의 상기 균체(약 26g)로부터 약 3mg의 정제 HBsAg-BTC입자를 얻었다. HBsAg의 입자구조만을 검출할 수 있는 Auszyme II EIA 키트(다이나보트 가부시끼가이샤)를 사용하고, HBsAg입자 및 HBsAg-BTC입자의 S항원성(HBsAg의 입자화 정도)을 측정하였더니, 양쪽 모두 동등의 값이 관찰되었다.

실시예8 인간 유래 암세포에 있어서의 HBsAg-BTC입자에 의한 유전자 도입

실시예 2에 기재된 방법에 따라서, HBsAg-BTC입자 내부에 GFP발현용 플라스미드(pEGFP-F(크론테크 사))를 봉입하고, BTC리셉터 발현하고 있는 쥐췌장 유래세포 AR42J, BTC리셉터를 발현하고 있는 않는 인간 폐암유래 H69세포, 게다가, 실시예 2에 기재된 각종 인간 우래 암세포로의 유전자 도입을 배양세포 레벨로 수행하였다.

그 중에서, BTC리셉터를 대량으로 세포표면에 발현하고 있는 AR 42J세포에 있어서 GFP에 의한 강한 형광을 관찰할 수 있었다.

이로부터, HBsAg-BTC입자가 BTC리셉터 발현 세포에 대한 높은 감염 능력을 갖는 것이 확인되었다.

실시예F 염기성 선유아세포 증식인자(bFGF:basicfibroblast growth factor)제시형 HBsAg입자(HBsAg-bFGF입자)의 제작

개체 내에서의 암조직의 증식에 있어서, 암세포는 주변 조직에 대하여, 혈관유도를 촉진하는 시그날을 발생시키는 것으로 알려져 있다(혈관신생 또는 angiogenesis). 이것에는 다수의 성장인자(별명 angiogenesis factor)가 관여하는 것이 알려져 있으나, 그 중심적인 역할을 지니고 있는 것이 bFGF이고, 주변조직으로는 bFGF리셉터가 항진하고 있다는 보고도 있다(Li VW, Folkerth RD, Watanabe H, YuC, Rupnick M, Barnes P, Scott RM, Black PM, Sallan SE, Folkman J Lancet 1994 Jul 9;344(8915):82-6).

그래서, bFGF수용체를 표적으로 하는 HBsAg입자를 제작하면, bFGF수용체를 발현하는 조직에 대한 유효한 물질 운반 수단이라고 생각되고, 암주변 조직에 있어서의 혈관신생 현상의 억제를 효과적으로 유도하는 치료에 도움을 주는 것도 가능하다.

여기서는 실시예C 기재의 방법에 의하여 제작된 HBsAg-Null입자를 기초로, bFGF제시형 HBsAg입자(HBsAg-bFGF입자)의 제작법을 기록한다.

인간 유래 bFGF전구체 cDNA단편(Kurukawa T, Sasada R, Iwane M, Igarashi K FEBS Lett. 1987 Mar 9;213(1):189-94.)을 주형으로서, bFGF수용체에 결합 능력을 나타내는 것이 알려져 있는 부분(PALPED------PMSAKS의 146아미노산 잔기)을 코드하는 유전자 단편을 PCR법에 의해 통상의 법대로 증폭시켰다.

사용한 2종의 PCR프라이머는 센스측이 서열목록 7의 올리고뉴클레오티드와 안티센스측이 서열목록 8의 올리고뉴클레오티드이고, 양쪽 모두 5'말단측에 제한효소 Notl 사이토(gcggccgc)를 갖도록 설계되었다.

PCR산물을 아가로스 전기영동에서 분리한 후, 목적의 cDNA를 함유하는 밴드(약 450bp)를 회수하고, TOPO TA Cloning kit(Invitrogen 사)를 사용하고, cCR2.1-TOPO벡터(Invitrogen 사)로 서브클로닝하였다. 염기배열을 확인한 후, 제한효소 Notl로 절단하고, 약 450bp의 목적 DNA단편을 회수하고, pGLDLIIP39-Rct(null)을 제한효소 Notl로 개열시킨 것과 TaKaRa Ligation kit ver.2(TaKaRa 사)를 사용하여 폐환결합시키고, 대장균 DH5α를 형질전환하였다. 염기배열 해석에 의해 선발을 수행하고, 삽입된 bFGF유전자가 HBsAg유전자와 판독틀이 일치하여 융합된 것을 선발하고, 플라스미드를 pGLDLIIP39-RcT-bFGF라 명명하였다.

실시예 A와 동일한 방법으로 pGLDLIIP39-RcT-bFGF플라스미드를 형질전환하고, 합성배지 High-Pi 및 8S5N-P400 중에서 배양하고, HBsAg-bFGF입자를 발현시켰다.

정상 성장기(배양개시로부터 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터, Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical사 제품)를 사용하여 균체조압출액을 제작하고, SDS-PAGE를 사용하여 분리하고, 은염색 및 항bFGF모노크로날항체3H3(와코우쥰야쿠)를 사용하는 Western법에 의해 HBsAg-bFGF의 동정을 수행하였다.

이로부터 HBsAg-bFGF는 분자량 약 58kDa의 단백질인 것이 분명하게 되었다.

실시예 B에 기재된 방법에 따라서, 배지 2.5L유래의 상기 균체(약 26g)로부터 약 2mg의 정제 HBsAg-bFGF입자를 얻었다. HBsAg의 입자구조만을 검출할 수 있는Auszyme II EIA 키트(다이나보트 가부시끼가이샤)를 사용하고, HBsAg입자 및 HBsAg-bFGF입자의 S항원성(HBsAg의 입자화 정도)을 측정하였더니, 양쪽 모두 동등의 값이 관찰되었다.

실시예9 인간 유래 암세포에 있어서의 HBsAg-bFGF입자에 의한 유전자 도입

실시예 2에 기재된 방법에 따라서, HBsAg-bFGF입자 내부에 GFP발현용 플라스미드(pEGFP-F(clontech 사))를 봉입하고, bFGF리셉터 발현하고 있는 인간 유방암 유래세포 MDA-MB-231, bFGF리셉터를 발현하고 있지 않는 인간 편평상피부암 유래 A431세포, 및 실시예 2에 기재된 각종 인간 유래 암세포로의 유전자 도입을 배양세포 레벨에서 수행하였다.

그 중에서, bFGF리셉터를 대량으로 세포 표면에 발현하고 있는 MDA-MB-231세포에 있어서 GFP에 의한 강한 형광을 관찰할 수 있었다.

이로부터, HBsAg-bFGF입자가 bFGF리셉터 발현 세포에 대한 높은 감염 능력을 갖는 것이 확인되었다.

실시예G HBsAg입자 내부에 봉입하는 인간 RNase발현 벡터의 구축

여기서는 상기 RNase를 세포내에서 발현시키는 벡터를 구축하였다. 우선, 인간 RNase1 유전자(Seno,M.,Futami,J.,Kosaka, M.,Seno,s. and Yamada,H. Biochim. Biophys. Acta 1218(3), 466-468 1994)를 주형으로 하여 서열목록 9의 올리고뉴클레오티드(Xhol 사이토 ctcgag를 갖음)와 서열목록 10의 올리고뉴클레오티드(Hind lll 사이토 aagctt를 갖음)를 프라이머로서 사용한 PCR에 의해, 시그날펩티드를 함유한 인간 RNase1(156아미노산 잔기)을 코드하는 유전자 단편(RO단편)을 증편시켰다.

다음에, 인간 RNase1 유전자를 주형으로 하여 서열목록 11의 올리고펩티드 (Xhol 사이토 ctcgag를 갖음)와 서열목록 12의 올리고펩티드(Hindlll 사이토 aagctt를 갖음)를 이용한 PCR에 의해, 시그날펩티드를 함유하지 않는 인간 RNase1(128아미노산 잔기)을 코드하는 유전자 단편(RM단편)을 증폭시켰다.

또, 인간 ECP유전자(Rosenberg HF, Ackerman SJ and Tenen DG. J. Exp. Med. 170(1), 163-176 1989)를 주형으로 하여 서열목록 13의 올리고펩티드(Xhol 사이토 ctcgag를 갖음)와 서열목록 14의 올리고펩티드(Hindlll 사이토 aagctt를 갖음)를 사용한 PCR에의해, 시그날 펩티드를 함유한 인간 ECP(160아미노산 잔기)를 코드하는 유전자 단편(EO단편)을 증폭시켰다.

또한, 인간 ECP유전자를 주형으로 하여 서열목록 15의 올리고펩티드(Xhol 사이토 ctcgag를 갖음)와 서열목록 16의 올리고펩티드(Hindlll 사이토 aagctt를 갖음)를 사용한 PCR에 의해, 시그날펩티드를 함유하지 않는 인간 ECP(133아미노산 잔기)를 코드하는 유전자 단편(EM 단편)을 증폭시켰다.

이상의 조작에 의해 얻어지는 RO, RM, EO, EM 단편을 일단 pGEM-Teasy 벡터(promega사)에 서브클로닝한 후, 염기배열을 확인 후, EcoRl와 Hindlll로 절단하고, 상기 단편을 함유하는 DNA단편을 분리하고, 아가로스 전기영동을 사용하여 회수하였다. 한편, 발현 벡터 pTriEx-1(Novagen 사)를 EcoRl과 Hindlll로 개열시킨 것을 준비하고, 상기 단편을 TaKaRa Ligation Kit ver.2(TaKaRa 사)를 사용하여, 각각 폐환결합시켰다. 그 결과, 얻어진 플라스미드를 pTriEx-1-RO, pTriEx-1-RM,pTriEx-1-EO 및 pTriEx-1-EM이라 명명하였다.

실시예H 배양세포를 이용한 인간 RNase발현 벡터에 의한 세포상해 결과

아프리카 녹색 원숭이 신장유래 COS-7세포를 1×10⁴세포씩 16구멍 웰플레이트의 각 웰에 파종하고, 37℃, 5%CO₂존재 하에서 10% 소태자 혈청을 함유하는 D-MEM을 사용하여 하룻밤 배양시켰다. 다음날, pTriEx-1-RO, pTriEx-1-RM, pTriEx-1-EO 및 pTriEx-1-EM의 각 플라스미드를 0, 0.2, 0.5, 1.0, 5.0㎍으로 분배하고, 3㎕의 유전자 도입용 지질 FuGene6(로슈사)과 세게 혼합하고, 또한, 혈청을 함유하지 않는 D-MEM배지 100㎕를 가한 것을 각 웰에 첨가하였다.

37℃, 5%CO₂존재 하에서 10% 소태자 혈청을 함유하는 D-MEM을 사용하여 이틀밤 배양시켰다. 그 후, MTT용액[5mg/ml MTT(와코우쥰야쿠)를 함유하고 PBS(인산 식염 버퍼)]를 100㎕씩 각 웰에 가하고, 37℃에서 4시간 정치한 후, 또한, 용해액[0.04N 염산을 함유하는 이소프로판올]을 1㎖부가하여, 실온에서 1시간 진탕하고, 570nm와 630nm의 흡광도를 측정하였다.

각 샘플은 3셋트로 준비하고, 570nm에서의 흡광도를 630nm에서의 흡광도로 나눈 값을 측정값으로 하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

그 결과, 전체의 발현계에 있어서 세포 상해 유도 능력이 관찰되었다.

이로부터, 이들의 RNase발현용 벡터를 본 출원 발명의 각 종 단백질 중공 나노 입자에 봉입하면, 세포특이적으로 상기의 RNase가 도입되고, 세포내에서 세포 상해효과를 발휘하여 유효한 질환치료법으로 되는 것을 기대할 수 있다.

실시예I 무혈청 배양의 곤충세포에 의한 HBsAg입자 제작

실시예 A에 기재되어 있는 유전자 재조합 효모에 의한 HBsAg입자의 발현은 균체내의 가용성 단백질의 약 40%가 HBsAg로서 생산되는 극히 높은 효율의 HBsAg입자 생산법이나, 정제 HBsAg입자를 얻기 위해서는 실시예 B에 나타낸 바와 같은 복잡한 기작이 필요하다. 또, 효모는 고등동물유래의 단백질을 발현하는데 적당한 소포체막 등의 단백질 합성계를 갖고는 있으나, 하등 진핵생물이기 때문에 당쇄 등의 고차 구조는 재현할 수 없는 것으로 알려져 있다.

그래서, 이하에 베큘로바이러스를 통하지 않고, 무혈청 배양이 가능한 곤충세포계로 HBsAg입자를 제작하는 방법을 설명한다.

실시예A에 기재되어 있는 효모용 HBsAg발현 플라스미드 pGLDLIIP39-RcT로부터, 서열목록 17의 올리고뉴클레오티드(Kpnl 사이토 ggtacc를 갖음) 및 서열목록 18의 올리고뉴클레오티드(Sacll 사이토 ccgcgg를 갖음)의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 닭유래 리소짐 분비 시그날 펩티드 융합형 HBsAg유전자 단편을 증폭시켰다.

PCR산물을 아가로스 전기영동으로 분리하고, 약 1.3kbp의 목적 밴드를 회수한 후, TOPO TA Cloning kit(Invitrogen 사)를 사용하여 pCR2.1-TOPO(Invitrogen사)에서 서브클로닝하고, 대장균 DH5α로 형질전환하였다. 염기배열 해석에 의해, 목적의 유전자가 틀림없이 들어있는 플라스미드를 선발하고, 그 후, Kpnl 및 Sacll으로 처리하여, 아가로스 전기영동으로 분리 후, 약 1.3kbp의 Kpnl-Sacll단편을 아가로스 전기영동에 의해 회수하였다.

다음에, 곤충세포 안정 발현용 벡터 plZT/V5-His(Invitrogen 사)의 Kpnl 사이토와 Sacll 사이토의 사이에 상기 유전자 단편을 TaKaRa Ligation kit ver.2(TakaRa사)를 사용하여 폐환결합시켰다.

염기배열을 확인한 후, 플라스미드를 pIZT/V5-His-HBsAg라 명명하였다. 동일하게, 실시예 C기재의 pGLDLIIP 39-RcT(null) 및 실시예 D기재의 pGLDLIIP39-RcT-EGF의 플라스미드로부터 개변 HBsAg유전자를 골라내어, pIZT/V5-His에 삽입하고, 각각 pIZT/V5-His-null 및 pIZT/V5-His-EGF라 명명하였다.

한편, 곤충세포 High Five 주(BTI-TN-5B1-4:Invitrogen 사)를 약 1개월에 걸쳐서 차츰 소태자 혈청이 들어간 배지로부터 무혈청 배지(Ultimate Insect Serum-Free Medium:Invitrogen사)에 순화시킨 High Five 주에서 형질전환되었다. 그 후, 무혈청 배지에서 27℃ 48시간 배양하고, 항생물질 zeocin(Invitrogen 사)을 400㎍/mL함유하는 무혈청 배지해서 세포가 confluent로 될 때까지 4∼7일간 더 배양시켰다.

1500×g, 5분간 원심에 의해 배양 상청을 회수하고, Auszymell EIA 장치(다이나보트 사)에 의해 배지 중의 HBsAg입자를 발현측정하였더니, HBsAg입자가 발현하고 있는 것이 확인되었다.

이상의 형태로 하여 얻어진 배양상청 1L는 한외여과기(사용필터는 UK-200:ADVANTEC 사, 배제분자량 200K)로 농축한 후, 음이온 교환 컬럼(DEAE-Toyopearl 650M, 도우요우 소다 가부시끼가이샤)에 의해 균일한 HBsAg입자 2mg을 정제할 수 있었다.

실시예J 항원성을 감소시킨 HBsAg입자의 제작

HBsAg입자는 접종된 인간에 있어서 항HBsAg항체를 야기시킬 가능성이 있다. 그래서, HBsAg입자 내부의 주요항원인 S단백질의 항원성을 저하시킨 개변 HBsAg입자를 제작하였다.

구체적으로는 HB백신 접종자이면서도 B형 간염이 발증된 환자로부터 단리된 HB바이러스의 변이형(Carman WF, Zanetti AR, Karayiannis P, Waters J, Manzillo G, Tanzi E, Zuckerman AJ, Thomas HC; Lancet 1990 Aug 11; 336(8711):325-9; Chiou HL, Lee Ts, Kuo J, Mau YC, HO MS J Gen Virol 1997 Oct;78(Pt10):2639-45)를 HBsAg입자에 도입하였다.

실시예 A에 기재된 pGLDLIIP39-RcT플라스미드의 S단백질 부분의 145번째 Gly잔기를 Arg잔기로 치환하기 위해(변이부분은 하선으로 표시), 5'-GCTGTACAAAACCTT CGGACAGAAACTGCACTTGTATTCC-3'(서열목록 19)와 그 상보배열 5'-GGAATACAAGTGCAGT TTCTGTCCGAAGGTTTTGTACAGC-3'(서열목록 20)을 코드하는 PCR용 프라이머 2종류를 사용하여, QuickChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene사)를 사용한 PCR법을 pGLDLIIP39-RcT 플라스미드에 대하여 수행하였다.

구체적으로는 내열성 DNA폴리멜라제로서 Pfu DNA polymerase(Stratagene)를 사용하고, PCR스케줄은 95℃ 30초간의 변성, 55℃ 1분간의 아닐링, 68℃ 30분간의 합성반응을 30회 반복하였다. 그 후, PCR산물을 제한효소 Dpnl로 처리하고, 대장균 DH 5α로 형질전환시킨 후, 출현콜로니로부터 벡터DNA를 압출하고, 염기배열로부터 변이도입된 pGLDLIIP39-RcT플라스미드를 선발하였다. (이하, pGLDLIIP39-RcT(G145R)라 호칭.)

실시예A와 동일한 방법으로 pGLDLIIP39-RcT(G145R)플라스미드를 형질전환하고, 합성배지 High-Pi 및 8S5N-P400 중에서 배양시켜, HBsAg(G145R)입자를 발현시켰다.

정상 성장기(배양개시로부터 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터, Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical사 제품)를 사용하여 균체조압출액을 제작하고, SDS-PAGE를 사용하여 분리하고, 은염색 및 항S모노크로날항체(후나코시 사)를 사용하는 Western법에 의해 HBsAg(G145R)의 동정을 수행하였다.

이로부터 HBsAg(G145R)는 분자량 약 52kDa의 단백질인 것이 분명하게 되었다.

실시예 B에 기재된 방법에 따라서, 배지 2.5L유래의 상기 균체(약 26g)로부터 약 20mg의 정제 HBsAg(G145R)입자를 얻었다. HBsAg의 S항원성에 기초하여 입자구조만을 검출할 수 있는 Auszyme II EIA 키트(다이나보트 사)를 사용하고, HBsAg입자 및 HBsAg(G145R)입자의 S항원성을 측정하였더니, 전자를 1로 하였을 때 후자는 0.2이었다.

상기 pGLDLIIP39-RcT(G145R)플라스미드의 S단백질 부분의 129번째 Gln잔기를 코Arg잔기로 치환하기 위해(변경부분은 하선으로 표시) 5'-GCACGATTCCTGCTCGAGGA ACCTCTATG-3'(서열목록 21)과 그 상보배열 5'-CATAGAGGTTCCTCGAGCAGGAATCGTGC-3'(서열목록 22)을 코드하는 PCR용 프라이머 2종류를 사용하고, QuickChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene 사)를 사용한 PCR법을 pGLDLIIP39-RcT(G145R)플라스미드에 대하여 수행하였다.

구체적으로는 내열성 DNA폴리멜라제로서 Pfu DNA polymerase(Stratagene)를 사용하고, PCR스케줄은 95℃ 30초간의 변성, 55℃ 1분간의 아닐링, 68℃ 30분간의 합성반응을 30회 반복하였다.

그 후, PCR산물을 제한효소 Dpnl로 처리하고, 대장균 DH 5α로 형질전환시킨 후, 출현콜로니로부터 벡터DNA를 압출하고, 염기배열로부터 변이도입된 pGLDLIIP39-RcT(G145R)플라스미드를 선발하였다. (이하, pGLDLIIP39-RcT(Q129R,G145R)로 호칭

실시예A와 동일한 방법으로 pGLDLIIP39-RcT(Q129R, G145R)플라스미드를 형질전환하고, 합성배지 High-Pi 및 8S5N-P400 중에서 배양시켜, HBsAg(Q129R, G145R)입자를 발현시켰다.

정상 성장기(배양개시로부터 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터, Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical사 제품)를 사용하여, 균체조압출액을 제작하고, SDS-PAGE를 사용하여 분리하고, 은염색 및 항S모노크로날항체(후나코시 사)를 사용하는 Western법에 의해 HBsAg(Q129R, G145R)의 동정을 수행하였다.

이로부터 HBsAg(Q129R, G145R)는 분자량 약 52kDa의 단백질인 것이 분명하게 되었다.

실시예 B에 기재된 방법에 따라서, 배지 2.5L유래의 상기 균체(약 26g)로부터 약 20mg의 정제 HBsAg(Q129R, G145R)입자를 얻었다. HBsAg의 S항원성에 기초하여 입자구조만을 검출할 수 있는 Auszyme II EIA 키트(다이나보트 사)를 사용하고, HBsAg입자 및 HBsAg(Q129R, G145R)입자의 S항원성을 측정하였더니, 전자를 1로 하였을 때, 후자는 0.01 미만이었다.

이로부터, HBsAg(Q129R, G145R)는 분자량 약 52kDa의 단백질인 것이 분명하게 되었다.

실시예B에 기재된 방법에 따라서, 배지 2.5L유래의 상기 균체(약 26g)로부터 약 20mg의 정제 HBsAg(Q129R, G145R)입자를 얻었다. HBsAg의 S항원성에 기초하여입자제조만을 검출할 수 있는 Auszyme II EIA 키트 (다이나보트 사)를 사용하고, HBsAg입자 및 HBsAg(Q129R, G145R)입자의 S항원성을 측정하였더니, 전자를 1로 했을 때, 후자는 0.01 미만이었다.

이로부터, HBsAg(Q129R, G145R)입자는 저항원성인 것이 분명하게 되고, 동입자를 사용하여 생체내에서도 안정된 유효한 물질운반 수단으로 적용할 수 있음이 분명하게 되었다.

이상 상세하게 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하여, 세포 또는 조직에 특이적으로 물질을 운반, 도입하는 운반체로서 사용되는 새로운 중공 나노 입자가 제공된다. 이 중공 나노 입자는 특정 세포 또는 조직에 대한 강한 감염구조를 갖고 있으므로, 바이러스 게놈을 유지하지 못하게 하기 때문에, 안정성이 놓고, 유전자 치료나 DDS로서 널리 응용할 수 있다. 또, 대량 발현계를 이용하여 생산할 수 있고, 산업상의 이용성도 높다.

Claims

입자형성 능력을 갖는 단백질에 생체인식분자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
진핵세포에서 단백질을 발현시켜서 얻어지는 단백질 입자에 생체인식분자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
제 2항에 있어서, 진핵세포가 효모 또는 유전자 재조합 효모 중 어느 하나에서 선택되는 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
제 2항에 있어서, 진핵세포가 곤충세포인 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 입자를 형성하는 단백질이 B형 간염 바이러스 표면항원 단백질인 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
제 5항에 있어서, B형 간염 바이러스 표면항원 단백질이 항원성을 감소시킨 B형 간염 바이러스 표면항원 단백질인 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체인식분자가 세포기능 조절분자인 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체인식분자가 항원인 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체인식분자가 항체인 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체인식분자가 당쇄인 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 중공 나노 입자에 세포도입물질이 내포되어 있는 것을 특징으로 하는 물질운반체.
제 11항에 있어서, 세포도입물질이 유전자인 것을 특징으로 하는 물질운반체.
제 11항에 있어서, 세포도입물질이 단백질인 것을 특징으로 하는 물질운반체.
제 11항에 있어서, 세포도입물질이 세포내에서 세포상해성을 나타내는 RNase인 것을 특징으로 하는 물질운반체.
제 11항에 있어서, 세포도입물질이 화합물인 것을 특징으로 하는 물질운반체.
제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 기재된 물질운반체를 제조하는 방법으로서, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 중공 나노 입자에 일렉트로포레이션법에 의해 세포도입물질을 내포시키는 것을 특징으로 하는 물질운반체의 제조방법.
제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 기재된 물질운반체를 제조하는 방법으로서, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 중공 나노 입자에 초음파법에 의해 세포도입물질을 내포시키는 것을 특징으로 하는 물질운반체의 제조방법.
제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 기재된 물질운반체를 제조하는 방법으로서, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 중공 나노 입자에 단순확산법에 의해 세포도입물질을 내포시키는 것을 특징으로 하는 물질운반체의 제조방법.
제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 기재된 물질운반체를 제조하는 방법으로서, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 중공 나노 입자에 전하를 갖는 지질을 사용하여 세포도입물질을 내포시키는 것을 특징으로 하는 물질운반체의 제조방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 중공 나노 입자를 사용하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직으로의 물질도입방법.
제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 기재된 물질운반체를 사용하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직으로의 물질도입방법.
적어도 제 20항 또는 제 21항에 기재된 물질도입방법을 사용하여 특정세포 또는 조직으로 물질을 운반하는 조작을 포함하는 것을 특징으로 하는 질환의 치료방법.