WO2001064930A1

WO2001064930A1 - Nanoparticules creuses proteiques, transporteur associe a l'utilisation de ces nanoparticules et procede d'introduction d'une substance dans des cellules

Info

Publication number: WO2001064930A1
Application number: PCT/JP2001/000926
Authority: WO
Inventors: Shun'ichi Kuroda; Katsuyuki Tanizawa; Masaharu Seno; Akihiko Kondo; Masakazu Ueda
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation
Priority date: 2000-02-28
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2001-09-07
Also published as: JP2001316298A; KR100645851B1; EP1262555B1; US20030092069A1; JP4085231B2; EP1262555A1; US7597905B2; KR20020092971A; EP1262555A4

Description

明細書

タンパク質中空ナノ粒子とそれを用いた物質運搬体、

ならびに細胞への物質導入方法技術分野

この出願の発明は、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が導入されている中空ナノ粒子に関するものである。さらに詳し〈は、この出願の発明は、特定の細胞および組織に物質を導入するための運搬体として使用することができる中空ナノ粒子に関するものである。背景技術

近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。とくに、ドラッグデリバリ一システム（ D D S ) と呼ばれる方法は、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。

また、最近の分子細胞生物学の分野においても特定細胞への遺伝子導入は必要不可欠な技術として盛んに研究されている。さらに、ヒトゲノム計画の進展によリ各種疾患の遺伝的な背景が明らかになりつつある現在、このような細胞および組織に対する特異性の高い遺伝子導入法が確立されれば遺伝子治療の分野での応用も可能となる。

細胞に遺伝子を導入する方法としては、これまでに、遺伝子を巨大分子化してェンドサイト一シスによって遺伝子を取込ませる方法 (リン酸カルシウム法、リポフエクタミン法）や、電気パルス刺激により、細胞膜に穿孔を開け、遺伝子を流入させる方法（エレクトロボレ一シヨン法、遺伝子銃法）が知られており、いずれも今日では分子生物学的実験において、一般的に実施されている手法である。

これらの方法は簡便であるが、細胞を直接、物理的に傷つけ、遺伝子導入部位を外科的に露出させる必要があるため、生体内部の細胞ゃ組織には容易に適用できない。また、 1 0 0 %近い導入率を得ることは難しい。

一方、安全性の高い物質導入方法としてはリボソーム法が知られている。この方法は、細胞を傷つけることがないため、生体内部の細胞や組織にも適用することが可能である。しかし、単純な脂質であるリボソームに高度な細胞および組織特異性を付与することは困難であり、さらに、 / 7 での遺伝子導入率は、要求される値に比べてはるかに低いという問題がある。

最近になって、ウィルス D N Aに目的の遺伝子を組み込み、感染性ウィルスを生成して遺伝子導入を行う技術が開発された。この方法は導入部位を露出する必要がなく、個体にも応用でき、導入効率も 1 0 0 %近い画期的な方法として注目される力ウィルスが広範囲の細胞に非特異的に感染するため目的の細胞以外にも遺伝子が導入されてしまうという重大な問題がある。また、ウィルスゲノム本体が染色体に組み込まれ、将来予期できぬ副作用を引き起こす可能性があるため、実際には疾病の初期治療等には用いられず、末期症状の患者に適用されるに留まっているのが現状である。

そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、目的とする細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を特異的、かつ安全に運搬、導入するための汎用的な方法を提供することを課題としている。発明の開示

この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第 1 には、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が導入されていることを特徴とする中空ナノ粒子を提供する。

第 2には、この出願の発明は、真核細胞でタンパク質を発現させて得られるタンパク質粒子に生体認識分子が導入されていることを特徴とする中空ナノ粒子を提供する。

第 3には、この出願の発明は、真核細胞が酵母または遺伝子組換え酵母のいずれかから選択されること、および第 4には、真核細胞が昆虫細胞であることを前記第 2の発明の中空ナノ粒子の態様として提供する。

また、第 5には、この出願の発明は、粒子を形成するタンパク質が B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質である前記のいずれかの中空ナノ粒子を提供する。

さらに、この出願の発明は、第 6には、該 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質が抗原性を減少させた B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質である前記の中空ナノ粒子を提供する。

この出願の発明は、また、第フには、生体認識分子が細胞機能調節分子であること、第 8には、生体認識分子が抗原であること、第 9には、生体認識分子が抗体であること、第 1 0には、生体認識分子が糖鎖であることを前記のいずれかの中空ナノ粒子の態様として提供する。

第 1 1 に、この出願の発明は、さらに、前記のいずれかの中空ナノ粒子に細胞導入物質が内包されていることを特徴とする物質運搬体をも提供する。

また、この出願の発明は、第 1 1 の発明の物質運搬体において、第 1 2には、細胞導入物質が遺伝子であること、第 1 3には、細胞導入物質がタンパク質であること、第 1 4には、細胞導入物質が細胞内で細胞傷害性を示す R N a s eであること、第 1 5には、細胞導入物質が化合物であることを態様として提供する。

さらに、この出願の発明は、前記第 1 1 ないし第 1 5の発明のいずれかの物質運搬体の製造方法として、第 1 6には、前記第 1 ないし第 1 0のいずれかの中空ナノ粒子に、エレクトロポレ一シヨン法により細胞導入物質を内包させること、第 1 フには、超音波法によリ細胞導入物質を内包させること、第 1 8には、単純拡散法により細胞導入物質を内包させること、第 1 9には、電荷を有する脂質を用いて細胞導入物質を内包させることを提供する。

そして、第 2 0には、この出願の発明は、前記第 1 から第 1 0の発明のいずれかの中空ナノ粒子を用いることを特徴とする細胞または組織への物質導入方法を、第 2 1 には、前記第 1 1 から第 1 5のいずれかの物質運搬体を用いることを特徴とする細胞または組織への物質導入方法を提供する。

そしてさらに、第 2 2には、この出願の発明は、少なくとも前記のいずれかの物質導入方法を用いて、特定細胞または組織へ物質を運搬する操作を含む疾患の治療方法をも提供する。図面の簡単な説明

図 1 は、この発明の実施例における H B s A g遺伝子の各タンパク質領域を表す概略摸式図である。 1 〜 8は、表面抗原における各部位の働きを示している。（ 1 ：放出抑制、 2 ：レセプタ一、 3 ：糖鎖 1 、 4 : 血清重合アルブミンレセプター、 5 : 膜貫通、 6 : 安定化、 7 ：糖鎖 2、 8 ：膜貫通低重合化 ■ 分泌）

図 2は、この発明の実施例における遺伝子組換え酵母を用いた H B s A g粒子の発現および精製操作を例示した概略説明図である。 ( a ) 遺伝子組換え酵母の作成、（ b ) H i g h - P i 培地における培養、（ c ) 8 S 5 N— P 4 0 O培地における培養、（ d ) 破砕、 ( e ) 密度勾配遠心分離、（ f ) H B s A g粒子をそれぞれ示す。図 3は、この発明の実施例において、 G F Pプラスミドを導入した H B s A g粒子と H e p G 2を接触させた際の H e p G 2の共焦点レ一ザ一蛍光顕微鏡写真を示した図である。（ a ) H B s A g粒子使用（プラスミド量： 8 n g )、（ b ) 脂質（リボソーム）使用（プラスミド量： 8 0 0 n g )、 ( c ) ベクタ一のみ（プラスミド量： 8 0 0 n g ) をそれぞれ示す。

図 4は、 G F Pを封入された H B s A g粒子によって、ヒト肝癌由来細胞（ N U E ) 内においても H e p G 2 と同程度に G F Pが発現されることを表す共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真を示した図である。（ a ) H e p G 2細胞、（ b ) N U E細胞をそれぞれ示す。

図 5は、 H B s A g粒子が、ヒト肝癌由来細胞（ H u H— 7 ) に極めて特異的に G F Pを導入できることを表す共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真を示した図である。（ a ) ヒト肝癌由来細胞（ H u H— フ）を移植された胆癌マウスの腫瘍部（蛍光あり）、 ( b ) マウスの通常肝臓（蛍光なし）発明を実施するための最良の形態

この出願の発明の中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子を導入することによって、目的細胞あるいは目的組織に特異的に物質を運搬することを可能とするものである。このような粒子形成能を有するタンパク質としては、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用することができる。具体的には、 B型肝炎ウィルス（Hepat i t i s B V i rus： H B V ) 表面抗原タンパク質等が例示される。

また、このような粒子形成能を有するタンパク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞でタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出されるのである。このとき、真核細胞としては、酵母や遺伝子組換え酵母、昆虫細胞等が適用できる。

発明者らは、後述の実施例に示すとおり、遺伝子組換え酵母で前記 H B V表面抗原 Lタンパク質を発現させることにより、発現された H B V表面抗原 Lタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約 2 0 n m、長径約 1 5 0 n mの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告している . Bio. Chem. , Vo I . 267, No. 3, 1953 - 1961， 1992)。このような粒子は、 H B Vゲノムゃ H B Vタンパク質を全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、 H B Vの肝細胞への極めて高い感染力を担う肝細胞特異的レセプターを粒子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高いのである。

このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。

—方、昆虫細胞は、酵母よりも高等動物に近い真核細胞であるといえ、酵母では再現しきれない糖鎖等の高次構造をも再現できる点で異種タンパク質の大量生産において好ましい方法といえる。従来の昆虫細胞の系はバキュロウィルスを用いた系で、ウィルス発現を伴うものであったために、タンパク質発現に際して細胞が死滅したリ溶解したりした。その結果、タンパク質発現を連続的に行ったり、死滅細胞から遊離したプロテアーゼによりタンパク質が分解したりするという問題があった。また、タンパク質を分泌発現させる場合には、培地中に含まれる大量の牛胎仔血清が混入することで、折角培地中に分泌されても精製が困難であった。しかし、最近になって、バキュロウィルスを介さない昆虫細胞系で、無血清培養可能なもの力《 I nv i t r o ge n 社により開発され、市販されている。したがって、このような昆虫細胞を用いれば、精製が容易で高次構造をも再現されたタンパク質粒子が得られる。

この出願の発明のタンパク質中空ナノ粒子では、以上のような種々の方法によって得られた粒子表面のレセプターを任意の生体認識分子に改変したり、種々の物質（ D N A、 R N A、タンパク質、ペプチド、および薬剤等）を粒子内に導入することにより、肝細胞以外にも、任意の細胞及び組織に極めて高い特異性で物質を運搬、導入することが可能となる。

もちろん、粒子形性能を有するタンパク質は、前記の B型肝炎ゥィルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、粒子を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを生体認識分子として用いてもよい。

粒子形成能を有するタンパク質に導入される生体認識分子としては、たとえば成長因子、サイトカイン等の細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的抗原、レセプターなどの細胞および組織を識別するための分子、ウィルスおよび微生物に由来する分子、抗体、糖鎖、脂質などが好ましく用いられる。これらは、目的とする細胞、あるいは組織に応じて適宜選択される。

この出願の発明では、以上のとおりのタンパク質中空ナノ粒子に、目的細胞または組織に導入したい物質（細胞導入物質）を内包させることによって、細胞特異性を有する物質運搬体が得られる。この物質運搬体に内包される細胞導入物質とは、例えば D N A、 R N A などの遺伝子、天然あるいは合成タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド、薬剤、天然あるいは合成化合物など、どのようなものであってもよい。

具体的には、既に発明者らにより報告されたヒ卜 R N a s e 1 J i nno H , Ueda Μ, Ozawa S, I keda T , Enomoto K, Psar ras K, Kitaj ima M, Yamada H, Seno M L ife Sc i . 1996 ; 58 (21 ) : 1901 -8 ) または R N a s e 3 (另 lj名 E C P : eos i noph i I cat i on i c prote i n ； Ma i I orqu i -Fernandez G, Pous J , Peracau la R, Aymam i J , Maeda T, Tada H, Yamada H, Seno M, de し lorens R, Gomi s-Ruth FX, Co I I ； J Mo I Biol. 2000 Ju l 28 ; 300 (5) : 1297-307. ) 等力《適用される。

これらのタンパク質は、細胞外で作用させても細胞傷害活性を示さないが、細胞内に取り込まれると細胞傷害活性を示すことが分かつている。そこで、これらの R N a s e を内包させた本願発明の物質運搬体を用いれば、細胞や組織に選択的に細胞傷害活性のあるタンパク質の強制発現を行うことができ、新しい癌治療方法として期待される。

また、これらの細胞導入物質を上記の中空ナノ粒子に導入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方まが適用される。たとえば、エレクト口ポレーシヨン法、超音波法、単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。

そして、これらのタンパク質中空ナノ粒子、あるいは物質運搬体を用いて、 in vivo あるいは in vitro で細胞、または組織に特異的に物質を導入することが可能となる。さらには、前記の R N a s e を用いた例のように、以上のとおりのタンパク質中空ナノ粒子や物質運搬体を用いて、特定細胞または組織に物質を導入することを各種疾患の治療法あるいは治療法の 1 ステップとして行うことも可能になるのである。

以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。実施例

以下の実施例において、 H B s A g とは、 B型肝炎ウィルス表面キ几原 Hepat it i s B i rus surface Ant i gen) を不す。 H B s A g は、 H B Vの外被タンパク質であり、図 1 の摸式図に示すように、 H B s A gには、 Sタンパク質、 Mタンパク質、 Lタンパク質の 3 種類がある。このうち、 Sタンパク質は、 3種のタンパク質に共通した、重要な外被タンパク質であり、 Mタンパク質は、 Sタンパク質の N末端側に 5 5アミノ酸（pre - S2 pept i de) が付加したものである。また、 Lタンパク質は、 Mタンパク質の N末端側に、 1 0 8 もしくは 1 1 9アミノ酸（pre- S1 pept i de) が付加したものである。

H B s A g Lタンパク質の Pre- S 領域（pre- S1 , pre-S2) は、 H B Vが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。 Pre-SI は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、 pre - S2 は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブミンレセプタ一を有するのである。

真核細胞で H B s A g を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。 H B s A gの Lタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でル一メン側に粒子として放出される。

以下の実施例では、 H B s A gの Lタンパク質を用いた。また、図 2に以下の実施例に記載される H B s A g粒子の発現および精製操作の概略説明図を示した。

実施例 A 遺伝子組換え酵母による H B s A g粒子の発現

発明者らによって報告された J. Bio. Chem. , Voに 267, No. 3, 1953-1961 , 1992 記載の方法に基づいて、 p G L D L I I Ρ 3 9 — R c T $- ^ f$ L f aafe 7r ¾S }¾ l. if ¾ ( Saccna romyces Cerev i s i ae AH22R—株）を、合成培地 H igh-Pi および 8S5N-P400中で培養し、 H B s A g Lタンパク質粒子を発現させた。（図 2 a、 b )

定常成長期（約フ 2時間後）にある遺伝子組換え酵母から、 Yeast Prote i n Extract i on Reagent (Pi erce Chemi ca l Go. ¾^ ¾r ftし ^λて、 who le ee l I extract を準備し、ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S — P A G E ) を用いて分離して、銀染色によって試料中の H B s A gの同定を行なった。

これより、 H B s A gは分子量約 5 2 k D aのタンパク質であることが明らかとなった。

実施例 B H B s A g粒子の遺伝子組換え酵母からの精製

( 1 ) 合成培地 8 S 5 N— P 4 0 0で培養された遺伝子組換え酵母（湿重量 2 6 g ) を buffer A溶液（フ . 5 M 尿素、 0. 1 M リン酸ナトリウム、 p H 7. 2、 1 5 m M E D T A、 2 m M P M S F、 0. 1 % T w e e n 8 0 ) 1 0 O m I に懸濁し、グラスビーズを用いてビードビータ一（BEAD-BEATER) にて酵母を破砕した。破碎後、上清を遠心分離により回収した。（図 2 c、 d )

( 2 ) 次に、上清を 0. 7 5倍容の 3 30/0 (wZw) P E G 6 0 0 0 と混合し、 3 0分間氷冷した。その後、遠心分離（フ 0 0 0 r p m、 3 0分間）を行い、ペレットを回収した。同ペレットは、 T w e e n 8 0を含まない buffer A溶液中で再懸濁した。

( 3 ) 再懸濁した液を、 1 0〜 4 0 %の勾配をかけた C s C I に重層し、 2 8 0 0 0 r p m、 1 6時間の超遠心分離を行なった。遠心分離後の試料を 1 2画分に分け、ウェスタンブロット法（Western B I ott i ng) ( 1 次抗体は、 a n t i — H B s A gモノクロ一ナル抗体）により H B s A g を含む画分を同定した。さらに、 H B s A g を含む画分を T w e e n 8 0を含まない buffer A溶液で透析した。

( 4 ) ( 3 ) で得られた透析液（ 1 2 m I ) を 5〜 5 0 o/oの勾配をかけたショ糖に重層し、 2 8 0 0 0 r p m、 1 6時間の超遠心分離を行なった。遠心分離後、（ 3 ) と同様に、 H B s A g を含む画分を同定し、 H B s A g を含む画分を尿素と T w e e n 8 0は含まず、代わりに 0. 8 5 %の N a C I を含む buffer A 溶液で透析した。（（ 2 ) 〜（ 4 ) ：図 2 e ) ( 5 ) ( 4 ) と同様の操作を繰り返し、透析後の試料をウルトラフィルタ一（Ultra Fi lter) Q 2 0 0 0 (ァドノくンテック社製）を用いて濃縮し、使用する時まで 4 °Cにて冷蔵保存した。（図 2 f )

C s C I 平衡遠心分離後のウェスタンブロット（ 3 ) の結果から、 H B s A gは、分子量 5 2 k D aで S抗原性を有するタンパク質であることが分かった。最終的に、培地 2. 5 L由来、湿重量 2 6 g の菌体から、約 2 4 m gの精製 H B s A g粒子を得た。

—連の精製過程における画分を銀染色 S D S— P A G Eで解析した。また、精製により酵母由来のプロテアーゼが除去されていることを確認するために、（ 5 ) で得られた H B s A g粒子を 3 フ °Cで 1 2時間インキュベートした後、 S D S— P A G Eを行い、銀染色により同定を行なつた。

その結果、酵母由来のプロテアーゼは、一連の精製過程において完全に除去されていることが確認された。

実施例 1 ヒト肝癌細胞 H e _P G 2における H B s A g粒子による遺伝子導入

指数増殖期にあるヒ卜肝癌細胞 H e p G 2 を 1 X 1 0 ⁵ ce I I s/we I I になるように、 3. 5 c mガラス底皿シャーレに植菌し、 3 フ °C、 5 % C O ₂ 存在下で 1 0 %ゥシ胎児血清を含む D-MEM を用いて一晩培養した。翌日、 H B s A g粒子と緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（GFP expression pi asm id pTB701 - hGFP) を混合し、エレクトロボレ一シヨンを行なった後、この試料を H e p G 2 培養液へ混合し、 3 7。C、 5 % C〇₂存在下で 4 日間培養した。

H e p G 2内での G F Pの発現の様子を共焦点レーザ一蛍光顕微鏡にて観察した。

H e p G 2を用いて H B s A g粒子の遺伝子導入効率を評価した ₍ 間隔 4 mmのキュベットを使用して、 1 1 0 V、 9 5 0 / Fの条件でエレクトロポレーシヨンを行なった H B s A g—プラスミドを H e p G 2へ形質移入させ、 3 7 °C、 5。/₀ < Ο₂ 存在下で D— M E M を用いて 4 日間培養した。

H e p G 2の共焦点レ一ザ一写真を図 3に示した。図 3 ( a ) を図 3 ( b )、 ( c ) と比較すると、図 3 ( a ) は図 3 ( b ) の約 2 0 0倍の効率を示しており、 H B s A g粒子による GFP express ion p I asm i dの導入効率は非常に高いものであることが分かった。

実施例 2 H e _P G 2以外のヒト肝癌細胞における H B s A g粒子による遺伝子導入

実施例 1 に記載の方法に従って、ヒト肝癌由来細胞として H u H — フ（JCRB0403) および N U E (防衛医科大学校寄生虫学講座多田隈卓史教授より分譲）を準備した。

また、陰性対照として、ヒ卜大腸癌由来細胞 W i D r ( ATCC CCL-218) 、 H T 2 9 (ATCC HTB-38) 、 S W 1 1 1 6 (ATCC CCL-233) , ヒト悪性黒色腫由来細胞 S E K I (JCRB0620) 、ヒト扁平上皮癌由来細胞 A 4 3 1 ( JC B9009) を、それぞれ 3. 5 c mガラス底皿シャ一レ上に培養し、 G F P発現プラスミド（pEGFP-F(C lontech社）） 8 n g を含む H B s A g粒子を 1 0⁵細胞に感染させ、 4 日間培養を継続した。その後、各細胞内での G F Pの発現の様子を共焦点レ一ザ一蛍光顕微鏡で観察した。

その結果、 H u H— 7及び N U E細胞で、 H e p G 2細胞と同程度の蛍光が観察された（図 4 ) 。

—方、ヒト肝臓由来でない細胞では、いずれも G F Pの蛍光が観察されなかった。

以上より、この発明の H B s A g粒子を用いて、培養細胞レベルで、ヒト肝細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子を導入できることが示された。

実施例 3 ヒト肝癌を移植したヌードマウスに対する H B s A g粒子による遺伝子導入

胆癌マウスは、ヌ一ドマウス（系統： BALB/c nu/nu, 微生物学的品質： S P F、性別：ォス 5週齡）の両側背部皮下に、実施例 2で使用したヒト腫瘍株（ H u H— 7及び W i D r ) をそれぞれ 1 x 1 0⁷ 細胞皮下に注射し、移植腫瘍が直径 2 c m程度の固形癌になるまで 2〜 6週間生育させて得た。

実施例 2 で記載した方法により得た G F P発現プラスミド (pEGFP-F) 2. を含む H B s A g粒子 1 0 ;u g を、マウス腹腔内に 2 6 G注射針を使用して投与した。投与後 4 日目にマウスを屠殺し、腫瘍部、肝臓、脾臓、腎臓、腸管を摘出し、 G F P用樹脂包埋キット（Technov it7100) を用いて組織を固定 · 包埋した。具体的には、固定は 4 %中和ホルムアルデヒドに浸漬して行い、脱水はフ 0 % E t O Hで室温 2時間、 9 6⁰/o E t 〇 Hで室温 2時間、 1 0 0 % E t 〇 Hで室温 "！時間、予備浸漬は 1 0 0 % E t O Hノ Technovit7100 等量混合液で室温 2 時間行った。その後、 Technov i 17100 で室温 2 4時間以内の浸漬を行い、取り出した後、室温で 1 時間および 3 フ °Cで 1 時間静置して重合反応させた。

常法に従って、切片を作製し、同時にへマトキシンェォリン染色 (一般的な組織染色）を行って、蛍光顕微鏡により H B s A g粒子投与群と非投与群の G F Pによる蛍光を比較した（図 5 ) 。

図 5より、ヒト肝癌由来 H u H— 7細胞による胆癌マウスの腫瘍部に G F Pに由来する蛍光を認めた。しかし、同マウスより同時に摘出した肝臓、脾臓、腎臓、腸管には蛍光を認めなかった。さらに、ヒト大腸癌由来 W ί D r細胞による胆癌マウスの腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、腸管及び、 H B s A g粒子非投与群にも蛍光を認めなかった。以上より、 H B s A g粒子を用いることにより、実験動物レベルでも、ヒト肝細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子導入が可能であることが示された。したがって、この発明の物質運搬体は、極めて有効であることが確認された。

実施例 C 生体認識分子提示用汎用型 H B s A g粒子（ H B s A g - N u I I 粒子）の作製

H B s A g粒子はヒト肝細胞特異的に感染することができるが、その高い感染性を担う同粒子表面に提示されている肝細胞認識部位は、 _Pre_S1 領域の 3から 7 7アミノ酸残基に含まれていることが半 ϋ ί してしヽる、し e c>eyec J, Chouteau P, Cann ι e I , Guguen-Gui I louzo C, Gr i pon P. , J. Virol. 1999, Mar ; 73 (3) : 2052— 7)。

ここでは、 H B s A g粒子の粒子形成能を保ちながら、肝細胞に対する高い感染能を欠失し、かつ任意の生体認識分子を粒子表面に提示することができる改変 H B s A g粒子（以降 H B s A g - N u I I 粒子と呼称）の作製法を記す。

実施例 Aに記載された p G L D L I I P 3 9 - R c Tプラスミドのヒト肝細胞認識部位をコードする遺伝子領域を欠失させ、同時に制限酵素 Not\ サイト（gcggccgc) を挿入するために、配列番号 1 のオリゴヌクレ才チドと配列番号 2のオリゴヌクレオチドを P C R用プライマ一として使用して、 Qu i ckChange^TM S i te-D i rected Mutagen es is Kit ( Stratagene 社）を用しヽた P C R法を p G l_ D L I I P 3 9 - R c Tプラスミドに対して行った。

具体的には、耐熱性 D N A ポリメラ一ゼとして Pfu DNA polymerase (Stratagene) を用し、、 P C Rスケジュ一ノレは、 9 5 °C 3 0秒間の変性、 5 5 °C 1 分間のアニーリング、 6 8 °C 3 0分間の合成反応を 3 0回繰り返した。その後、 P C R産物を制限酵素 I で処理し、大腸菌 D H 5 αに形質転換し、出現コロニ一からべクタ一 D N Aを抽出し、塩基配列から変異導入された p G L D L I I Ρ 3 9 — R c Tプラスミドを選抜した。（以下、 p G L D L I I P 3 9— R c T ( n u I I ) と呼ぶ）。

実施例 A記載の方法で、 p G L D L I I P 3 9— R c T ( n u I I ) プラスミドを形質転換し、合成培地 High-Pi 及び 8S5N-P400中で培養し、 H B s A g— N u I I 粒子を発現させた。

定常成長期（培養開始からフ 2時間後）にある遺伝子組換え酵母力 ^λ b、 Yeast Protein Extraction Reagent Pierce Chemical 社製）を用いて菌体粗抽出液を作製し、 S D S— P A G Eを用いて分離し、銀染色並びに抗 Sモノクローナル抗体（フナコシ社）を用いる Western法により H B s A g— N u I I の同定を行った。

これより、 H B s A g— N u l I は分子量約 4 2 k D aのタンパク質であることが明らかになった。

さらに、実施例 Bに記載の方法に従って、培地 2. 5 L由来の上記菌体（約 2 6 g ) 力、ら、約 3 m gの精製 H B s A g — N u I I 粒子を得た。 H B s A g の粒子構造のみを検出することができる Auszyme I I E I A キット（ダイナボット社）を用いて、 H B s A g 粒子及び H B s A g— N u I I 粒子の S抗原性（ H B s A gの粒子化度合い）を測定したところ、両者とも同等の値が観察された。実施例 4 ヒト由来癌細胞における H B s A g— N u l I 粒子による遺伝子導入

実施例 2に記載の方法に従って、実施例 Cで得られた肝細胞に対する高い感染能を欠失し、かつ任意の生体認識分子を粒子表面に提示することができる H B s A g— N u I I 粒子内部に G F P発現用プラスミド（pEGFP- F (Clontech 社））を封入し、 H e p G 2細胞と実施例 2に記載した各種ヒト由来癌細胞への遺伝子導入を培養細胞レベルで行った。

しかし、いずれの細胞からも G F Pによる蛍光は観察されなかつた。このことから、 H B s A g— N u l I 粒子がヒト肝臓由来細胞に対する高い感染能を消失していることが示された。

実施例 5 ヒト由来癌細胞を移植したヌードマウスに対する H B s A g - N u I I 粒子による遺伝子導入

実施例 3に記載の方法に従って、ヒト腫瘍株（ 1"1 1_) 1"1ー 7及び\^ i D r ) を移植した胆癌マウスを作製し、 G F P発現プラスミド (pEGFP-F (Clontech 社））を含む H B s A g — N u I I 粒子を投与したが、腫瘍部、及び全ての主要臓器において G F Pによる蛍光は観察されなかった。

このことから、 H B s A g— N u I I 粒子があらゆる臓器に対して感染性を有さないことが確認された。

実施例 D 上皮成長因子（ E G F ： Epidermal Growth Factor) 提示型 H B s A g粒子（ H B s A g— E G F粒子）の作製

E G F受容体は極めて多くの細胞が細胞表層に発現していることが知られており、特にある種の癌（食道癌、大腸癌等）の憎悪に関係していることが分かっている。そこで、 E G F受容体を標的とする H B s A g粒子を作製すれば、 E G F受容体を発現する癌組織に対する有効な治療手段になると考えられる。

ここでは、実施例 C記載の方法による H B s A g — N u I I 粒子を基にした、 E G F提示型 H B s A g粒子（ H B s A g— E G F粒子）の作製法を記す。ヒト由来 E G F前駆体 c D N A断片（Be l l GI , Fong M, Stempi en MM, Wormsted MA, Caput D, Ku LL, Urdea MS, Ra i l LB, Sanchez - Pescador R Nucleic Acids Res 1986 No 11； 14 (21) :8427-46) を錶型として、成熟型ヒト E G F領域（ 5 3アミノ酸残基）をコ一ドする遺伝子断片を P C R法により常法どおり増幅した。

用いた 2種類の P C Rプライマ一は、センス側が配列番号 3のォリゴヌクレオチド、アンチセンス側が配列番号 4のオリゴヌクレオチドで、両方とも 5 ' 末端側に制限酵素 Not\ サイト（gcggccgc) を有するように設計した。

P C R産物をァガロース電気泳動で分離した後、目的の c D N A を含むバンド（約 1 フ 0 b p ) を回収し、 T0P0 TA Cl oni ng kit ( I nv itrogen ft) を用しヽて pCR2. 1 -T0P0ベクタ一 ( I nv itrogen tt) にサブクローニングした。塩基配列を確認した後、制限酵素 Not l で切断して、約 1 フ O b pの目的 D N A断片を回収し、 p G L D L I I P 3 9 - R c T ( n u I I ) を制限酵素 Not\ で開裂させたものと TaKaRa Li gat ion kit ver. 2 (TaKaRa tt ) を用しヽて閉環結合させ、大腸菌 D H 5 αを形質転換した。

塩基配列解析により選抜を行い、挿入した E G F遺伝子が H B s A g遺伝子と読み取り枠が一致して融合したものを選抜し、プラスミドを p G L D L I I P 3 9 — R c T — E G F と命名した _¾

実施例 Aの方法に基づいて、 p G L D L I I P 3 9 - R c T - E G Fプラスミドを形質転換し、合成培地 Hi gh- Pi 及び 8S5N- P400中で培養して、 H B s A g — E G F粒子を発現させた。

定常成長期（培養開始からフ 2時間後）にある遺伝子組換え酵母カヽ b、 Yeast Prote i n Extract i on Reagent (Pi erce Chemi ca l 社 ) を用いて、菌体粗抽出液を作製し、 SDS-PAGE を用いて分離して、銀染色並びに抗ヒト E G Fポリクロ一ナル抗体（Santa Cruz 社）を用いる Western法により H B s A g— E G Fの同定を行った。

これより、 H B s A g — E G Fは分子量約 5 0 k D aのタンパク質であることが明らかになつた。

実施例 Bに記載の方法に従って、培地 2. 5 L由来の上記菌体（約 2 6 g ) から、約 3 m gの精製 H B s A g— E G F粒子を得た。 H B s A gの粒子構造のみを検出することができる Auszyme I I El A キット（ダイナボット社）を用いて、 H B s A g粒子および H B s A g— E G F粒子の S抗原性（ H B s A gの粒子化度合い）を測定したところ、両者とも同等の値が観察された。

したがって、 H B s A g— E G F粒子が H B s A g粒子と同様に得られていることが示された。

実施例 6 ヒト由来癌細胞における H B s A g— E G F粒子による遺伝子導入

実施例 2に記載の方法に従って、 H B s A g— E G F粒子内部に G F P発現用プラスミド p E G F P— Fベクタ一（CI ontech 社）を封入し、 H e p G 2細胞及び実施例 2に記載した各種ヒト由来癌細胞への遺伝子導入を培養細胞レベルで行った。

その中で、 E G F レセプターを大量に細胞表面に発現している A 4 3 1 細胞において G F Pによる強い蛍光を観察することができた _c これよリ、 H B s A g一 E G F粒子が E G F レセプタ一発現細胞に対する高い感染能を有することが確認された。また、培養細胞レベルで改造 H B s A g粒子に任意の生体認識能を付与できることが示された。

実施例フヒ卜由来癌細胞を移植したヌードマウスに対する H B s A g _ E G F粒子による遺伝子導入実施例 3に記載の方法に従って、ヒト腫瘍株（ A 4 3 1 、 H u H _ 7 、 W i D r ) を移植した胆癌マウスを作製し、 G F P発現ブラスミド（p E G F P — F (Clontech 社））を含む H B s A g — E G F粒子を投与したところ、 A 4 3 1 による腫瘍部に強力な G F Pによる蛍光が観察された。一方、他細胞による腫瘍部及び主要臓器においては G F Pによる蛍光は観察されなかった。

これより、 H B s A g — E G F粒子が E G F レセプタ一を著量発現している細胞に特異的に感染できること、および主要臓器に対しては感染性を有していないことが確認された。

したがって、任意の生体認識分子を融合もしくは付加した H B s A g - N u I I 粒子は、実験動物レベルでも、あらゆる組織及び臓器に物質を特異的に運搬できる粒子となることが示された。

実施例 E ベータセルリン（ B T C ： Betace I l u l i n) 提示型 H B s A g粒子（ H B s A g _ B T C粒子）の作製

B T Cは E G Fフアミリーの一種であるが、発現部位は E G 「と異なる。特に、血糖調節機構に重要な役割を担う降臓内ランゲルハンス島 /3細胞の分化に重要な役割を担うことが判明している。そこで、 B T C受容体を標的とする H B s A g粒子を作製すれば、 B T C受容体を発現する組織に対する有効な物質運搬手段とすることができ、 ^細胞に起因する糖尿病の治療にも役立つことが期待される。

ここでは、実施例 C記載の方法によって作製された H B s A g — N u I I 粒子を基に、 B T C提示型 H B s A g粒子（ H B s A g — B T C粒子）の作製法を記す。

ヒト由来 B T C前駆体 c D N A断片（Sasada R, Ono Y, Tani yama Y, Sh I ng Y, Fo I kman J, I ga r as h ι K； B ι ochem. B ι ophys. Res. Commun. 1993 Feb 15 ; 190 (3) : 1173-9. ) を錶型として、 B T C受容体に結合能を示すことが知られている部分（GHFSR VDLFY の 4 8ァミノ酸残基）をコードする遺伝子断片を P C R法により常法どおり増幅した。

用いた 2種類の P C Rプライマ一は、センス側が配列番号 5のォリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号 6のオリゴヌクレオチドで、両方とも 5 ' 末端側に制限酵素 Not\ サイト（_gCggCCgc) を有するように設計した。

P C R産物をァガロース電気泳動で分離した後、目的の c D N A を含むバンド（約 1 6 0 b p ) を回収し、 T0P0 TA Cloning kit ( I nv itrogen tt) を用しヽて pCR2. 1 - T0P0ベクタ一 ( Invitrogen tt) にサブクローニングした。塩基配列を確認した後、制限酵素 Notl で切断して、約 1 6 0 b pの目的 D N A断片を回収し、 p G L D L I I P 3 9 - R c T ( n u I I ) を制限酵素 Notl で開裂させたものと TaKaRa Ligation kit ver.2 (TaKaRa社）を用いて閉環結合させ、大腸菌 D H 5 αを形質転換した。塩基配列解析により選抜を行い、挿入した B T C遺伝子が H B s A g遺伝子と読み取リ枠が一致して融合したものを選抜し、プラスミドを p G L D L I I P 3 9 — R c T — B T Cと命名した。

実施例 Aと同様の方法で p G L D L I I P 3 9 - R c T - B T C プラスミドを形質転換し、合成培地 High-Pi 及ぴ 8S5N-P400中で培養し、 H B s A g — B T C粒子を発現させた。

定常成長期（培養開始から 7 2時間後）にある遺伝子組換え酵母刀ヽ b、 Yeast Protein Extraction Reagent (Pierce Chemical 卞土製）を用いて、菌体粗抽出液を作製し、 S D S — P A G Eを用いて分離し、銀染色並びに抗 B T Cポリクローナル抗体（岡山大工学部妹尾氏作製）を用いる Western法により H B s A g — B T Cの同定を行った。

これより、 H B s A g— B T Cは分子量約 5 0 k D aのタンパク質であることが明らかになった。

実施例 Bに記載の方法に従って、培地 2. 5 L由来の上記菌体（約 2 6 g ) 力、ら、約 3 m gの精製 H B s A g— B T C粒子を得た。 H B s A gの粒子構造のみを検出することができる Auszyme I I El A キット（ダイナボット社）を用いて、 H B s A g粒子及び H B s A g— B T C粒子の S抗原性（ H B s A gの粒子化度合い）を測定したところ、両者とも同等の値が観察された。

実施例 8 ヒト由来癌細胞における H B s A g -B T C粒子による遺伝子導入

実施例 2に記載の方法に従って、 H B s A g— B T C粒子内部に G F P発現用プラスミド（ p E G F P _ F (Clontech 社））を封入し、 B T C レセプタ一発現しているラット降臓由来細胞 A R 4 2 J、 B T C レセプタ一を発現していないヒト肺癌由来 H 6 9細胞、さらには、実施例 2に記載した各種ヒト由来癌細胞への遺伝子導入を培養細胞レベルで行った。

その中で、 B T C レセプターを大量に細胞表面に発現している A R 4 2 J細胞において G F Pによる強い蛍光を観察することができた。

これより、 H B s A g _ B T C粒子が B T C レセプタ一発現細胞に対する高い感染能を有することが確認された。

実施例 F 塩基性線維芽細胞增殖因子（ b F G F ： basic f ibroblast growth factor) 提示型 H B s A g粒子（ H B s A g — b F G F粒子）の作製

個体内での癌組織の増殖において、癌細胞は周辺組織に対し血管誘導を促すシグナルを発することが知られている（血管新生または angi ogenes i s)_c これには、数多くの成長因子 (另 IJ名 ang i ogenes i s factor) が関与することが知られているが、その中心的な役割を担つているのが b F G Fであり、周辺組織では b F G F レセプターが： it進してし\るとの幸艮告もある (Li VW, Fo Ikerth RD, atanabe H, Yu C, Rupnick M, Barnes P, Scott R , Black PM , Sal Ian SE, Fo I kman J Lancet 1994 Jul 9; 344 (8915) : 82 - 6. )。

そこで、 b F G F受容体を標的とする H B s A g粒子を作製すれば、 b F G F受容体を発現する組織に対する有効な物質運搬手段になると考えられ、癌周辺組織における血管新生現象の抑制を効果的に誘導する治療に役立たせることも可能である。

ここでは、実施例 C記載の方法によって作製された H B s A _g — N u I I 粒子を基に、 b F G F提示型 H B s A g粒子（ H B s A g — b F G F粒子）の作製法を記す。

ヒ卜由来 b F G F前駆体 c D N A断片（Kurokawa T, Sasada R, I wane M, I garash i K FEBS Lett. 1987 Mar 9;213 (1) ： 189-94. ) を錶型として、 b F G F受容体に結合能を示すことが知られている部分 ( PALPED PMSAKS の 1 4 6アミノ酸残基）をコードする遺伝子断片を P C R法により常法どおり増幅した。

用いた 2種類の P C Rプライマーは、センス側が配列番号フのォリゴヌクレオチドと、アンチセンス側が配列番号 8のオリゴヌクレ才チドで、両方とも 5'末端側に制限酵素〃 I サイト（gcggccgc) を有するように設計した。

P C R産物をァガロース電気泳動で分離した後、目的の c D N A を含むバンド（約 4 5 0 b p ) を回収し、 T0P0 TA Cloning kit ( Invitrogen 社）を用しヽて c C R 2 . 1 — T O P O ベクター ( Invitrogen 社）にサブクロ一ニングした。塩基配列を確認した後、制限酵素 Λ/otl で切断して、約 4 5 0 b pの目的 D N A断片を回収し、 p G L D L I I P 3 9— R e t ( n u l I ) を制限酵素〃 oil で開裂させたものと TaKaRa Ligation kit ver.2 (TaKaRa tt) を用いて閉環結合させ、大腸菌 D H 5 αを形質転換した。塩基配列解析により選抜を行い、挿入した b F G F遺伝子が H B s A _g遺伝子と読み取り枠が一致して融合したものを選抜し、プラスミドを p G L D L I I P 3 9— R c T— b F G Fと命名した。

実施例 Aと同様の方法で、 p G L D L I I P 3 9 - R c T - b F G Fプラスミドを形質転換し、合成培地 High- Pi 及び 8S5N- P400中で培養して H B s A g— b F G F粒子を発現させた。

定常成長期（培養開始から 7 2時間後）にある遺伝子組換え酵母か b、 Yeast Protein Extract i on Reagent (Pierce Chemical 子: L製) を用いて、菌体粗抽出液を作製し、 S D S— P A G Eを用いて分離し、銀染色並びに抗 b F G Fモノクローナル抗体 3 H 3 (和光純薬）を用いる Western法により H B s A g— b F G Fの同定を行った。

これより、 H B s A g - b F G Fは分子量約 5 8 k D aのタンノク質であることが明らかになった。

実施例 Bに記載の方法に従って、培地 2. 5 L由来の上記菌体（約 2 6 g ) から、約 2 m gの精製 H B s A g— b F G F粒子を得た。 H B s A gの粒子構造のみを検出することができる Auszytre I I El A キット（ダイナボット社）を用いて、 H B s A g粒子及び H B s A g— b F G F粒子の S抗原性（ H B s A gの粒子化度合い）を測定したところ、両者とも同等の値が観察された。

実施例 9 ヒ卜由来癌細胞における H B s A g - b F G F粒子による遺伝子導入実施例 2に記載の方法に従って、 H B s A g — b F G F粒子内部に G F P発現用プラスミド（ p E G F P — F (C lontech 社））を封入し、 b F G F レセプタ一発現しているヒ卜乳癌由来細胞 M D A — M B — 2 3 1 、 b F G F レセプターを発現していないヒト扁平上皮癌由来 A 4 3 1 細胞および実施例 2に記載した各種ヒト由来癌細胞への遺伝子導入を培養細胞レベルで行った。

その中で、 b F G F レセプタ一を大量に細胞表面に発現している M D A - M B - 2 3 1 細胞において G F Pによる強い蛍光を観察することができた。

これより、 H B s A g _ b F G F粒子が b F G F レセプタ一発現細胞に対する高い感染能を有することが確認された。

実施例 G H B s A g粒子内部に封入するヒト R N a s e発現べクターの構築

ここでは、前記 R N a s e を細胞内で発現させるベクタ一を構築した。まず、ヒト R N a s e 1 遺伝子（ Seno, M. , Futami , J. , Kosaka, Μ. , Seno, S. and Yamada , H. B i och i m. B i ophys. Acta 1218 (3) , 466-468 1994)を錶型にして配列番号 9のオリゴヌクレオチド（ / ?ol サイト ctcgag を有する）と配列番号 1 0のオリゴヌクレオチド ( Hind\ I I サイ卜 aagctt を有する）をプライマ一として用いた P C Rにより、シグナルペプチドを含んだヒト R N a s e 1 ( 1 5 6 アミノ酸残基）をコードする遺伝子断片（R0断片）を増幅した。次に、ヒト R N a s e 1 遺伝子を錶型にして配列番号 1 1 のオリゴぺプチド（ οΙ サイト ctcgag を有する）と配列番号 1 2のオリゴペプチド（〃/ ο Ι Ι サイト aagctt を有する）を用いた P C Rにより、シグナルペプチドを含まないヒ卜 R N a s e 1 ( 1 2 8アミノ酸残基）をコードする遺伝子断片（RM断片）を増幅した。また、ヒト E C P遺伝十 (Rosenber HF, Acke rman S J and Tenen DG. J. Exp. Med. 170 (1) , 163-176 1989) を錶型にして配列番号 1 3のオリゴペプチド（ 7。1 サイト ctcgag を有する）と配列番号 1 4のオリゴペプチド（ Hind\ I I サイト aagctt を有する）を用いた P C Rにより、シグナルペプチドを含んだヒト E C P ( 1 6 0 アミノ酸残基）をコードする遺伝子断片（E0断片）を増幅した。

さらに、ヒト E C P遺伝子を錶型にして配列番号 1 5のオリゴぺプチド（ T70I サイト ctcgag を有する）と配列番号 1 6のオリゴぺプチド（ Hind\ I I サイト aagctt を有する）を用いた P C Rにより、シグナルペプチドを含まないヒト E C P ( 1 3 3アミノ酸残基）をコードする遺伝子断片（EM断片）を増幅した。

以上の操作により得られた R0, RM, ΕΟ, ΕΜ 断片を一度 pGEM-Teasy ベクタ一（Promega 社）にサブクロ一ニングした後、塩基配列を確認後、 f co ?l と Hind\ I I で切断して、上記断片を含む D N A断片を切り離し、ァガロース電気泳動を用いて回収した。一方、発現べクタ一 pTr i Ex-1 (Novagen社 ) を EcoR\ と H i nd\ I I で開裂させたものを用意し、上記断片を TaKaRa Ligat ion k i t ver. 2 (TaKaRa ¾ ) を用いて、それぞれ閉環結合させた。その結果、得られたプラスミドを、 pTr i Εχ-1-RO, pTr i Ex-1 -RM, pTr i Ex_1 _E0 及び pTr i Ex - 1 - EM と命名した。

実施例 H 培養細胞を用いたヒト RNase発現べクタ一による細胞傷害効果

アフリカミドリサル腎臓由来 C O S —フ細胞を 1 X 1 0⁴ 細胞ずつ 1 6穴ゥエルプレートの各ゥエルに播種し、 3 7 °C、 5 % C O ₂ 存在下で 1 0 <½ゥシ胎仔血清を含む D-MEM を用いて一晩培養した。翌日、 ρΤ Εχ- 1- RO, pTr i Εχ-1-RM, pTr i Εχ-1-ΕΟ 及び pTr i Εχ-1-ΕΜ の各プラスミドを 0 , 0 · 2， 0. 5 , 1 - 0， 5. O ^i gに分注し、 3 1 の遺伝子導入用脂質 FuGene 6 (ロシュ社）と激しく混合し、さらに、血清を含まない D- MEM培地 1 0 ◦ I を加えたものを各ゥェルに添加した。

3 7 °C；、 5 % C 0₂存在下で 1 ◦ %ゥシ胎仔血清を含む D- MEM を用いてニ晚培養した。その後、 M T T溶液 [5mg/ml MTT (和光純薬）を含む PBS (リン酸食塩バッファ一） ]を 1 0 0 μ I ずつ各ゥエルに加え、 3 フ °Cで 4時間静置した後、さらに、溶解液 [0.04N 塩酸を含むイソプロパノール]を 1 m I 加えて、室温で 1 時間振盪し、 5 7 0 n mと 6 3 0 n mの吸光度を測定した。

各サンプルは 3連で用意し、 5 7 0 n mでの吸光度を 6 3 0 n m での吸光度で割った値を測定値とした。結果を表 1 に示した。 «1

生存率（％)

DNA量 ―

, 、 RO RM EO EM

(mg)

(シグナル付）（シグナルなし）（シグナル付）（シグナルなし）

0 100.0 100.0 100.0 100.0

0.2 87.9 87.8 97.4 93.3

0.5 81.3 11.1 80.8 94.9

1 77.3 84.9 86.0 89.0

5 69.2 79J 70.0 96J

その結果、全ての発現系において細胞傷害誘導能が観察された。これより、これらの R N a s e発現用べクタ一をこの出願の発明の各種のタンパク質中空ナノ粒子に封入すれば、細胞特異的に前記の R N a s eが導入され、細胞内で細胞傷害効果を発揮して有効な疾患治療法となることが期待できる。

実施例 I 無血清培養の昆虫細胞による H B s A g粒子作製実施例 Aに記載されている遺伝子組換え酵母による H B s A g粒子の発現は、菌体内の可溶性タンパク質の約 4 0 0/0が H B s A g として産生される極めて高い効率の H B s A g粒子生産法であるが、精製 H B s A g粒子を得るためには実施例 Bに示すような複雑な操作が必要である。また、酵母は高等動物由来のタンパク質を発現するに適している小胞体膜等のタンパク質合成系を有してはいるが、下等真核生物であるため糖鎖等の高次構造は再現できないことが知られている。

そこで、以下にバキュロウィルスを介さず、無血清培養が可能な昆虫細胞系で H B s A g粒子を作製する方法を説明する。

実施例 Aに記載されている酵母用 H B s A g発現プラスミド p G L D L I I P 3 9 — R c T力ヽら、配列番号 1 フのオリゴヌクレオチド ( Kpn\ サイト ggtacc を有する）及び配列番号 1 8のオリゴヌクレォチド（Sacl I サイト ccgcgg を有する）のプライマ一を用いて P C Rにより、ニヮトリ由来リゾチーム分泌シグナルべプチド融合型 H B s A g遺伝子断片を増幅した。

P C R産物をァガ口一ス電気泳動で分離し、約 1 . 3 k b pの目的バンドを回収した後、 TOPO TA Cloni ng kit ( I nv itrogen 社）を用いて pGR2. 1-T0P0 ( I nv itrogen社）にサブクロ一ニングし、大腸菌 D H 5 αに形質転換した。塩基配列解析によリ目的の遺伝子が正しく組み込まれているプラスミドを選抜し、その後、 Κρη I Sac I I で処理して、ァガ口一ス電気泳動で分離後、約 1 . 3 k b pの Kpn\ Sac\ I 断片をァガロース電気泳動により回収した。

次に、昆虫細胞安定発現用べクタ一 P I Z T Z V 5 — H i s ( I nv itrogen 社）の Kpn\ サイトと《 acl I サイ卜の間に、上記遺伝子断片を TaKaRa Li gat ion kit ver.2 (TaKaRa ¾) を用しヽて、閉環結合させた。

塩基配列を確認した後、プラスミドを、 P I Z T Z V 5 — H i s — H B s A g と命名した。同様に、実施例 C記載の p G L D L I I P 3 9 - R c T ( n u I I ) 及び実施例 D記載の p G L D L I I P 3 9 一 R c T - E G Fのプラスミドから改変 H B s A g遺伝子を抜き出し、 p I Z TZV 5 — H i s に挿入し、それぞれ、 p I Z T ZV 5 - H i s - n u I I 及び p I Z T / V 5 - H i s — E G F と命名した。

—方、昆虫細胞 High Five 株 (BTI-TN-5B1-4： Invitrogen 社）を、約 1 ヶ月かけて次第に牛胎仔血清入り培地から無血清培地 (Ultimate Insect i>e r um-Fr ee Medium : Invitrogen 社) 馴化させた。次に、 P I Z T / V 5 - H i s _ H B s A g を遺伝子導入用脂質 Insectin- Plus ( I nv i t r ogen社）を用いて無血清培地に馴化させた High Five 株に形質転換した。その後、無血清培地で 27°C48 時間培養し、抗生物質 zeocin ( Invitrogen 社）を 400 g/mL 含有する無血清培地で更に細胞が conf luent になるまで 4~7 日間培養した。

1500 X g、 5分間遠心により培養上清を回収し、 Auszymel l El Aキット（ダイナボット社）により、培地中の H B s A g粒子の発現測定したところ、 H B s A g粒子が発現していることが確認された。

以上の様にして得られた培養上清 1 Lは、限外濾過器（使用フィルタ一は UK-20Q： ADVANTEC 社、排除分子量 2 0 0 K) で濃縮した後、陰イオン交換カラム（DEAE-Toyopear I 650M、東洋ソ一ダ社）により均一な H B s A g粒子 2 m gを精製することができた。

実施例 J 抗原性を減少させた H B s A g粒子の作製

H B s A g粒子は接種されたヒトにおいて抗 H B s A g抗体を惹起する可能性がある。そこで、 H B s A g粒子内部の主要抗原である Sタンパク質の抗原性を低下させた改変 H B s A g粒子を作製した。

具体的には、 H Bワクチン接種者でありながらも B型肝炎を発症した患者から単離された H Bウイルスの変異型（Carman WF, Zanett i AR, Kar ay I ann I s P, Water s J, Manz ι I I o G, Tanz i E, 乙 uckerman A J, Thomas HC； Lancet 1990 Aug 11 ;336 (8711)： 325-9； Ghi ou HL, Lee TS, uo J, Mau YC, Ho MS J Gen Virol 1997 Oct； 78 (Pt 10)： 2639-45) を H B s A g粒子に導入した。

実施例 Aに記載される p G L D L I I P 3 9 — R c Tプラスミドの Sタンパク質部分の 1 4 5番目 Gl y残基を Arg残基に置換するため（変異部分は下線で表示;）に、 5し GCTGTAGAAAAGCTTCGGAG^GAAACTGGA CTTGTATTCC-3' (酉己列番号 1 9 ) とその相補酉己列 5 -GGAATACAAG TGCAGTTTCTGTCCGAAGGTTTTGTACAGC-3' (配列番号 2 0 ) をコ一ドする P C R用プライマ一 2種類を使用して、 Qu ickChange^TM Site- Di rected Mutagenes i s Kit ^ St r atagene 子エノ 2：用しヽた P C F ijを p G L D L I I P 3 9 — R c Tプラスミドに対して行った。

具体的には、耐熱性 D N A ポリメラ一ゼとして Pfu DNA pol ymerase ( St r atagene ) を用し、、 P C Rスケジュ一レは、 9 5 °C 3 0秒間の変性、 5 5 °C 1 分間のアニーリング、 6 8 °C 3 0分間の合成反応を 3 0回繰り返した。その後、 P C R産物を制限酵素 / 7_P/7 I で処理し、大腸菌 D H 5 αに形質転換した後、出現コロニーからべクタ一 D N Aを抽出し、塩基配列から変異導入された p G L D L I I P 3 9 — R c Tプラスミドを選抜した。（以下、 p G L D L I I P 3 9 - R c T ( G 1 4 5 R ) と呼ぶ。）

実施例 Aと同様の方法で p G L D L I I P 3 9 - R c T ( G 1 4 5 R ) プラスミドを形質転換し、合成培地 High-Pi 及び 8S5N-P400 中で培養し、 H B s A g ( G 1 4 5 R ) 粒子を発現させた。

定常成長期（培養開始からフ 2時間後）にある遺伝子組換え酵母かり、 Yeast Protein Extract ion Reagent (Pierce Chemical 千土製) を用いて、菌体粗抽出液を作製し、 S D S — P A G Eを用いて分離し、銀染色並びに抗 Sモノクロ一ナル抗体（フナコシ社）を用いる Western法により H B s A g ( G 1 4 5 R ) の同定を行った。

これより、 H B s A g ( G 1 4 5 R ) は分子量約 5 2 k D aのタンパク質であることが明らかになった。

実施例 Bに記載の方法に従って、培地 2. 5 L由来の上記菌体（約

2 6 g ) 力ヽら、約 2 0 m gの精製 H B s A g ( G 1 4 5 R ) 粒子を得た。 H B s A gの S抗原性に基づいて粒子構造のみを検出することができる Auszyme I I EIA キット（ダイナボット社）を用いて、 H B s A g粒子及び H B s A g ( G 1 4 5 R ) 粒子の S抗原性を測定したところ、前者 1 に対し後者 0. 2であった。

上記 p G L D L I I P 3 9 - R c T ( G 1 4 5 R ) プラスミドの Sタンパク質部分の 1 2 9番目 Gin残基をコ Arg残基に置換するため（変異部分は下線で表示）に、 5'-GCACGATTCCTGCTCGAGGAACCTCTATG 一 3' (酉己列番号 2 1 )とそのネ目補酉己列 5'-CATAGAGGTTCCTCGAGCAGGAATCG TGC-3' (配列番号 2 2 ) をコードする P C R用プライマー 2種類を使用して、 0u I ckChange™ Site-Di rected Mutagenesis Kit (Stratagene 社）を用し、た P C R法を p G L D L I I P 3 9 — R c T ( G 1 4 5 R ) プラスミドに対して行った。

具体的には、耐熱性 D N A ポリメラ一ゼとして Pfu DNA polymerase (Stratagene) を用しヽ、 P C Rスケジュールは、 9 5 °C

3 0秒間の変性、 5 5 °C 1 分間のアニーリング、 6 8 °C 3 0分間の合成反応を 3 O回繰り返した。

その後、 P C R産物を制限酵素 / で処理し、大腸菌 D H 5 a に形質転換した後、出現コロニーからベクター D N Aを抽出し、塩基配列から変異導入された P G L D L I I P 3 9— R c T ( G 1 4 5 R ) プラスミドを選抜した。（以下、 P G L D L I I P 3 9 — R c T ( Q 1 2 9 R， G 1 4 5 R ) と呼ぶ。）

実施例 Aと同様の方法で、 p G L D L I I P 3 9— R c T ( Q 1 2 9 R， G 1 4 5 R ) プラスミドを形質転換し、合成培地 High- Pi 及び 8S5N- P400中で培養し、 H B s A g ( Q 1 2 9 R , G 1 4 5 R ) 粒子を発現させた。

定常成長期（培養開始から 7 2時間後）にある遺伝子組換え酵母カヽり、 /east Protein Extraction Reagent (Pierce Chemical 子ェ ) を用いて、菌体粗抽出液を作製し、 S D S— P A G Eを用いて分離し、銀染色並びに抗 Sモノクローナル抗体（フナコシ社）を用いる Western 法により H B s A g ( Q 1 2 9 R， G 1 4 5 R ) の同定を行った。

これより、 H B s A g (Q 1 2 9 R, G 1 4 5 R ) は分子量約 5 2 k D aのタンパク質であることが明ら力、になった。

実施例 Bに記載の方法に従って、培地 2. 5 L由来の上記菌体（約 2 6 g ) から、約 2 0 m gの精製 H B s A g ( Q 1 2 9 R , G 1 4 5 R ) 粒子を得た。 H B s A gの S抗原性に基づいて粒子構造のみを検出することができる Auszyme I I E I Aキット（ダイナボット社）を用いて、 H B s A g粒子及び H B s A g ( Q 1 2 9 R , G 1 4 5 R ) 粒子の S抗原性を測定したところ、前者 1 に対し後者 0. 0 1 未；であった。

以上より、 H B s A g ( Q 1 2 9 R , G 1 4 5 R ) 粒子は低抗原性であることが明らかになり、同粒子を使用して生体内でも安定した有効な物質運搬手段に適用できることが明らかになった。産業上の利用可能性

以上詳しく説明したとおり、この発明によって、細胞または組織に特異的に物質を運搬、導入する運搬体として用いられる新しい中空ナノ粒子が提供される。この中空ナノ粒子は、特定細胞あるいは組織に対する強い感染機構を保持するものの、ウィルスゲノムを持たないため、安全性が高く、遺伝子治療や D D S として広く応用できる。また、大量発現系を用いて生産することができ、産業上の利用性も高い。

Claims

請求の範囲

1 . 粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が導入されていることを特徴とする中空ナノ粒子。

2 . 真核細胞でタンパク質を発現させて得られるタンパク質粒子に生体認識分子が導入されていることを特徴とする中空ナノ粒子,

3 . 真核細胞が酵母または遺伝子組換え酵母のいずれかから選択される請求項 2の中空ナノ粒子。

4 . 真核細胞が昆虫細胞である請求項 2の中空ナノ粒子。

5 . 粒子を形成するタンパク質が B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であることを特徴とする請求項 1 ないし 4のいずれかの中空ナノ粒子。

6 . B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質が抗原性を減少させた B 型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質である請求項 5の中空ナノ粒子。

フ . 生体認識分子が細胞機能調節分子であることを特徴とする請求項 1 ないし 6のいずれかの中空ナノ粒子。

8 . 生体認識分子が抗原であることを特徴とする 1 ないし 6のいずれかの中空ナノ粒子。

9 . 生体認識分子が抗体であることを特徴とする 1 ないし 6のいずれかの中空ナノ粒子。

1 0 . 生体認識分子が糖鎖であることを特徴とする 1 ないし 6のいずれかの中空ナノ粒子。

1 1 . 請求項 1 ないし 1 0の中空ナノ粒子に細胞導入物質が内包されていることを特徴とする物質運搬体。

1 2 . 細胞導入物質が遺伝子であることを特徴とする請求項 1 1 の物質運搬体。

. 細胞導入物質がタンパク質であることを特徴とする請求項 1 1 の物質運搬体。

. 細胞導入物質が細胞内で細胞傷害性を示す R N a s eである請求項 1 1 の物質運搬体。

. 細胞導入物質が化合物であることを特徴とする請求項 1 1 の物質運搬体。

. 請求項 1 ないし 1 0のいずれかの中空ナノ粒子に、エレクト口ポレーシヨン法により細胞導入物質を内包させることを特徴とする請求項 1 1 ないし 1 5記載のいずれかの物質運搬体の製造方法。

. 請求項 1 ないし 1 0のいずれかの中空ナノ粒子に、超音波法により細胞導入物質を内包させることを特徴とする請求項 1 1 ないし 1 5記載のいずれかの物質運搬体の製造方法。

. 請求項 1 ないし 1 0のいずれかの中空ナノ粒子に、単純拡散法により細胞導入物質を内包させることを特徴とする請求項 1 1 ないし 1 5記載のいずれかの物質運搬体の製造方法。

. 請求項 1 ないし 1 0のいずれかの中空ナノ粒子に、電荷を有する脂質を用いて細胞導入物質を内包させることを特徴とする請求項 1 1 ないし 1 5記載の物質運搬体の製造方法。

. 請求項 1 ないし 1 0のいずれかの中空ナノ粒子を用いることを特徴とする細胞または組織への物質導入方法。

. 請求項 1 1 ないし 1 5のいずれかの物質運搬体を用いることを特徴とする細胞または組織への物質導入方法。

. 少なくとも請求項 2 0または 2 1 のいずれかの物質導入方法を用いて特定細胞または組織へ物質を運搬する操作を含むことを特徴とする疾患の治療方法。