KR20010031938A

KR20010031938A - 삼산화비소 조성물을 생산하는 방법 및 삼산화비소 또는멜랄소프롤을 이용하여 암을 치료하는 방법

Info

Publication number: KR20010031938A
Application number: KR1020007005045A
Authority: KR
Inventors: 레이몬드피.주니어. 월렐; 피어파올로 판돌피; 자니스엘. 가브릴러브
Original assignee: 추후제출; 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터
Priority date: 1997-11-10
Filing date: 1998-11-10
Publication date: 2001-04-16
Also published as: US20040146576A1; EP1964557A1; CA2309652A1; EP1037625A4; US20040146581A1; US20040146571A1; US20040146577A1; AU747474B2; US20040146569A1; US20040146578A1; PL343868A1; ES2395515T3; US20040146575A1; EP1037625A1; US20020013371A1; US6982096B2; BR9814857A; US20040146583A1; NO20002409L; EP2255800B1

Abstract

본 발명은 다양한 백혈병, 림프종, 고형암을 치료에 사용하는 삼산화비소의 용도에 관한다. 또한, 비소화합물은 레티노이드와 같은 다른 치료요법적 약물과 병용하여 사용한다. 본 발명은 또한 삼산화비소 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

삼산화비소 조성물을 생산하는 방법 및 삼산화비소 또는 멜랄소프롤을 이용하여 암을 치료하는 방법{PROCESS FOR PRODUCING ARSENIC TRIOXIDE FORMULATIONS AND METHODS FOR TREATING CANCER USING ARSENIC TRIOXIDE OR MELARSOPROL}

2.1 암

암은 일차적으로 임의의 정상세포에서 유도한 비정상세포의 수적증가, 이들 비정상 세포의 인접조직으로의 침투, 악성세포의 주변 림프절 및 멀리 떨어진 조직(전이)으로의 림프성 또는 혈액-기원 확산으로 특징지어진다. 임상적 자료 및 분자생물학 연구에서 암은 작은 선종양 변화에서 시작하는 다단계 과정으로, 상기 변화는 특정 조건하에서 종양으로 발전한다.

선-악성 비정상 세포생장은 과형성, 이형성, 형성장애(Robbins 및 Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79, 비정상적 생장조건 검토를 위해)를 전형적인 예로 들 수 있는데, 이것은 종양병소 형성에 선행하여 일어난다. 종양병소는 집락형태로 생장하여 고형종양으로 발전하고, 종양세포가 숙주의 면역감독을 회피하는 조건하에서 침투, 생장, 전이, 이형성에 대한 능력을 개발한다(Roitt, I., Brostoff, J 및 Kale, D.,1993, Immunology, 3rd ed., Mosby, St. Louis, pps. 17.1-17.12).

백혈병은 혈액-형성 조직의 악성 종양을 의미한다. 악성으로의 변환은 단일 세포에서 일반적으로 연속적 확산 및 집락 팽창과 같은 두 단계이상의 단계로 일어난다. 일부 백혈병에서, 특정 크로모좀 전좌는 백혈병성 세포의 지속적인 형태 및 특이한 임상적 특징(예, 만성 골수성 백혈병에서 9, 22의 전좌, 급성 전골수구 백혈병에서 15, 1의 전좌)으로 확인하였다. 급성 백혈병은 주로 비분화된 세포 개체군이고, 만성 백혈병은 좀더 성숙한 세포형태다.

급성 백혈병은 림프아구형(ALL) 및 비-림프아구형(ANLL)으로 나눈다. 이들은 프랑스-미국-영국(FAB) 분류에 따른 형태 및 세포화학특성 또는 분화의 형태 및 정도에 따라 세분한다. 특이적 B- 및 T-세포, 골수-항원 단클론항체를 사용하는 것이 분류에 가장 바람직하다. ALL은 주로 소아병으로 실험실 발견 및 뼈 골수 검사에 의해 확인하다. ANLL(급성 골수아구성 백혈병(AML)이라고도 함)은 모든 세대에서 발생하며, 성인에게서 가장 흔한 급성 백혈병이다; 이 질병은 일반적으로 원인약물로 방사선과 관계한다.

만성 백혈병은 림프구성(CLL) 또는 골수구성(CML)으로 설명한다. CLL은 혈액, 뼈 골수, 림프양 기관에서 성숙 림프구의 출현으로 특징지어진다. CLL의 성질은 지속적이고, 절대 림프구증가증(〉 5,000/㎕), 뼈 골수상의 림프구증가로 입증된다. 대부분의 CLL 환자는 B-세포 특징을 지닌 림프구의 집락 팽창을 갖는다. CML에서 특이적 특징은 혈액, 뼈 골수, 간, 비자, 다른 기관에서 모든 분화단계의 과립백혈구 세포가 주도적으로 출현한다는 점이다. 진단시 증상이 드러난 환자에서, 전체 WBC 수는 일반적으로 200,000/㎕이지만, 최대 1,000,000/㎕에 이른다. CML은 상대적으로 쉽게 진단되는데, 그 이유는 필라델피아 크로모좀이 존재하기 때문이다.

조혈 암의 이런 특징으로 인해, 전신 화학요법을 일차 치료양식으로 사용한다. 특정 백혈병의 민감성에 따라 선별한 약물은 일반적으로 임의병용하여 사용한다. 방사선 치료는 백혈병성 세포의 국소적 축척을 치료하는 보조약으로 사용한다. 수술은 일차 치료양식으로는 거의 필요하지 않지만, 일부 복합증세를 관리하는데 사용한다. HLA-일치 후손으로부터 뼈 골수 이식은 때때로 필요하다.

2.2. 비소 및 이의 치료용도

비소는 서구 및 중국 의료 시술자사이에서 오랫동안 독약과 약물 둘 모두로 인식되어 왔다. 19세기 후반, 서구에서 비소는 혈액질환의 치료에 빈번하게 사용되었다. 1878년, 포울러(Fowler) 용액(아비산칼륨을 함유한 용액, 수가 +5)으로 백혈병 환자를 치료하면, 백혈구 수가 현저하게 감소하는 것으로 알려졌다(Cutler Bradford, Am. J. Med. Sci., January 1878, 81-84). 만성 골육종 백혈병(CML)을 치료하기 위한 고식(姑息)제로 사용하는 포울러 용액의 용도에 대한 또 다른 관심은 1931년에 Forkner 및 Scott(J. Am. Med. Assoc., 1931, iii, 97)가 제시하고, 이후, 1936년에 Stephens 및 Lawrence가 확인하였다(Ann. Intern. Med. 9, 1488-1502). 하지만, 포울러 용액의 활성 화학성분이 결정되지 않아, 포울러 용액은 엄격하게 경구조성물로 투여하고, 백혈구 세포의 수준이 적당한 수준까지 하락하거나 또는 독성(예, 피부 각질섬유, 과착색)이 발생할 때까지, 용액으로 백혈병 환자에게 투여하는데, 환자는 다양한 기간동안 질병의 호전을 향유했다. 1960년대에도, 포울러 용액은 CML의 치료에 자주 사용되었지만, CML에 걸린 대부분의 환자는 부설펀과 같은 화학치료법, 또는 방사선치료법으로 치료하였다(Monfardini et al., Cancer, 1973, 31:492-501).

역설적으로, 출처가 주변환경 또는 의약치료인 가에 상관없이, 오랫동안 인식된 비소에 노출효과는 피부암이다(Hutuchinson, 1888, Trans. Path. Soc. Lond., 39:352; Neubauer, 1947, Br. J. Cancer, 1:192). 전염병자료에서도 포울러 용액을 장기간 사용하면 내부 위치에서 암의 발병이 증가한다는 것을 알 수 있었다(Cuzick et al., Br. J. Cancer, 1982, 45:904-911; Kasper et al., J. Am. Med. Assoc., 1984, 252:3407-3408). 비소의 발암성은 이후로 이것이 크로모좀 변이, 유전자 증폭, 딸 크로마티드 교환, 세포 형질전환을 유도한 다는 사실에서 확실히 알 수 있다(Lee et al., 1988, Science, 241:79-81; Germolec et al., Toxicol. Applied Pharmacol,, 1996, 141:308-318). 비소의 공지된 발암성 효과로 인해, 오늘날 서구의학에서 비소의 인체상의 치료요법적 용도는 국소성 질병, 예를 들면, 아프리카 트리파노소마증의 치료에 한한다(유기비소, 멜랄소프롤; Goodman ＆ Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th edition, chapter 66, 1659-1662, 1997).

전통적인 중국 의술에서, 비소산 또는 삼산화비소 파스타를 사용하여 치아 골수질환, 건선, 매독, 류머티스를 치료하였다(Chen et al., 195, in Manual of Clinical Drugs, Shanghi, China, Shanghi Institute of Science and technology, p.830). 1970년대 중국에서, 삼산화비소는 실험적으로 급성 전골수성 백혈병(APL)을 치료하는데 사용하였다(Mervis, 1996, Science, 273;578). 최근에, 삼산화비소의 임상적 효능은 난치성 APL에 걸린 15명의 환자중 14명에서 재조사하였는데, 여기서, 4-9주동안 10mg/일 약량으로 정맥투여하면, 관련된 뼈골수억제없이 완전한 형태상의 차도가 나타났다(Shen et al., 1997, Blood, 9:3354-3360). 삼산화비소는 NB4 세포(APL 세포계)에서 아팝토시스(예정된 세포 죽음)를 유도하고, 아팝토시스는 분명하게 종양유전자 bcl-2의 하향-조절 및 APL 세포에 독특한 키메라 PML/RAR?? 단백질의 세포내 재분배와 관계하는 것으로 밝혀졌다(Chen et al., 1996, Blood, 88:1052-1061; Andre et al., 1996, Exp. Cell Res. 229:253-260). 비소의 생물학적 활성은 비소가 PML의 종양분취물을 분해용 핵체로 유도할 수 있다는 점에 기인한다(Zhu et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:3978-3983).

비록 비소는 독성 및 발암성 물질 모두로 공지되어 있지만, 의약치료에 사용하는 비소의 용도와 많이 보고되고 있다. 또한, 상기에서, 많은 형태의 백혈병이 있으며, 이들 각각은 독특한 치료 프로토콜을 필요로 하고, 상기 프로토콜은 치료위험을 예견할 수 있는 인자의 존재에 따라 변형되어야 한다는 것은 명백하다. 따라서, 단독 또는 다른 기존의 약물과 병용하여 사용될 수 있는 광범위한 항-백혈병 약물의 개발은 극히 바람직하다.

3. 본 발명의 요약

당분야에서, 비소를 환자에 투여하는 경우의 이익과 위험성의 상충되는 보고에도 불구하고, 본 출원인들은 삼산화비소 및 유기비소(멜랄소프롤)가 다양한 백혈병, 림프종, 고형암의 치료에 광범위하게 적용될 수 있다는 것을 발견했다.

이 글에서 제시한 발명은 백혈병, 림프종, 고형암을 치료하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 삼산화비소 또는 멜랄소프롤의 치료요법적 비-치사 효과량을 이런 치료를 필요로 하는 사람에게 투여하는 것으로 이루어진다. 전술한 본 발명은 또한, 백혈병, 특히, 다른 형태의 치료로는 난치성인 백혈병을 치료하기 위하여 사용하는 병용요법의 용도를 포함한다.

본 발명은 또한 삼산화비소로 이루어진 제약학적 조성물의 제조방법을 포함한다.

본 발명에 따라, 삼산화비소 또는 멜랄소프롤 화합물은 환자의 생활 질을 향상하거나, 또는 백혈병, 림프종 또는 고형암을 치료하기 위하여, 단독으로 또는 다른 공지된 치료요법적 약물(화학요법약물, 방사성 방호약, 방사성치료약 포함) 또는 기술과 병용하여 사용할 수 있다. 비소화합물은 하나 또는 복수의 공지된 화학치료약물(항종양 약물포함)의 투여전, 투여동안 또는 투여이후에 사용할 수 있다. 또한, 비소화합물은 방사선 치료전, 방사선 치료동안 또는 방사선 치료이후에 사용할 수 있다.

본 발명의 제약학적 조성물은 정맥 주사 또는 주입에 적당한 멸균용액이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 경구전달에 적당한 조성물을 포함한다; 삼산화비소 또는 멜랄소프롤 및 제약학적으로 수용가능한 부형제 또는 담체로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에는 또한 국소 또는 경피전달에 적당한 조성물이 포함되는데, 상기 조성물의 예로 이온도입방법을 들 수 있지만, 이것에 한정하지 않는다. 특정 치료요법, 제약학적 조성물, 장치 또한 본 발명에서 제시한다.

본 발명의 특정 조성물 및 이들의 용도는 아래의 섹션 및 소섹션에서 밝힌다.

본 발명은 백혈병, 림프종, 다른 특정 암의 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한다.

좀더 구체적으로, 본 발명은 급성 백혈병 및 만성 백혈병을 치료에 사용하는 삼산화비소의 신규한 용도에 관한다.

백혈병, 림프종 또는 고형암의 치료에 사용하는 방법 및 조성물을 이 글에서 밝힌다. 본 발명은 사람에서 급성 또는 만성 백혈병, 림프종 또는 고형암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 삼산화비소 또는 멜랄소프롤과 같은 하나 또는 복수의 비소화합물의 제약학적 비-치사 효과량을 이런 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것으로 이루어진다.

본 발명은 또한 사람에서 다른 형태의 치료로는 난치성인 백혈병을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다른 화학치료요법약물, 예를 들면, 모든-트랜스 레티논산(ATRA)과 병용하여 삼산화비소 또는 멜랄소프롤을 사람에게 투여하는 것으로 이루어진다.

본 발명은 또한 삼산화비소로 이루어진 제약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한다. 본 발명의 제약학적 조성물은 감소된 독성, 향상된 효능, 저장 및 사용동안 향상된 안정성을 보이고, 조성물은 생리적으로 수용가능한 pH를 갖는 것이 바람직하다.

4.1. 비소화합물

이 글에서 사용한 ″비소화합물″은 삼산화비소(As₂O₃)의 제약학적으로 수용가능한 형태를 의미한다. 멜랄소프롤은 유기비소화합물로, 산화멜랄센과 디멀캐프롤과 혼합하여 합성하거나 또는 상업적으로 구매할 수 있다(Arsobal^??by RhonePoulenc Rorer, Collegeville, PA). 본 발명의 비-제약학적으로 만들어진 원료물질은 공지된 것이기 때문에, 이들은 당분야에 공지된 화학기술로 만들 수 있다(참고, Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology 4th ed. volume 3 pps.633-655 John Wiley ＆ Sons).

이 글에서 사용한 ″치료약물″, ″치료요법″, ″방사성 방호약″, ″화학치료요법″은 통상적인 약물 및 약물요법을 의미하며, 상기 약물의 예로는, 암, 바이러스 감염, 다른 악성 종양암을 치료하기 위한 백신을 들 수 있고, 상기 백신은 당분야에 공지된 것이다.

본 발명에 따라, 삼산화비소 또는 멜랄소프롤 화합물은 환자의 생활 질을 향상하거나, 또는 백혈병, 림프종 또는 고형암을 치료하기 위하여, 단독으로 또는 다른 공지된 치료요법적 약물(화학요법약물, 방사성 방호약, 방사성치료약 포함) 또는 기술과 병용하여 사용할 수 있다. 가령, 비소화합물은 하나 또는 복수의 공지된 항종양 약물의 투여전, 투여동안 또는 투여이후에 사용할 수 있는데, 상기 약물의 예로 겨자화합물, 질소화합물, 클로람부실, 멜팔란, 사이클로포스파미드, 6-멀캡토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오르라실, 플록시우리딘, 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 탁솔, 에토폭시드, 테미포시드, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신, 시스플라틴, 카르보플라틴, 인산에스트라무스틴, 수산화뇨소, BCNU, 프로카르바진, VM-26, 인터페론, 모든-트랜스 레티논산(ATRA) 또는 다른 레티노이드를 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다(the Physician Desk References, 1997 참고). 또한, 비소화합물은 방사선 치료전, 방사선 치료동안 또는 방사선 치료이후에 사용할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 비소화합물 및 ATRA는 혼합물로 투여할 수 있다. 적절한 측면에서, 병용요법으로 치료받는 사람에서 림프종, 백혈병 또는 고형암은 일반적 치료방법으로는 난치성이거나 또는 백혈병이 재발한 경우다.

임의의 적절한 투여형태는 본 발명에 따라 사용하는데, 상기 투여형태의 예로 정맥, 피하, 근육내, 척수강내 투여와 같은 장관외 투여, 경구 및 비강내 투여, 흡입을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다. 투여형태는 암의 종류, 사람의 상태에 따라 달라질 것이다.

사용하는 제약학적 조성물은 수용성 또는 유기성 멸균용액, 콜로이드 현탁액, 알약, 정제, 캡슐의 형태가 된다.

4.2. 치료방법

이 글에서 ″백혈병을 치료하는 방법″은 상기 질병 및 질병과 관련된 증상이 호전, 감소, 치료 또는 차도가 있는 것을 의미한다. 가령, 본 발명의 치료방법이 백혈구 수를 감소시키거나 또는 치료받고 있는 사람에서 림프구증가증을 감소시키는 것을 의미한다.

이 글에서 ″림프종을 치료하는 방법″은 상기 질병 및 질병과 관련된 증상이 호전, 감소, 치료 또는 차도가 있는 것을 의미한다.

이 글에서 이 글에서 사용한 ″고형암을 치료하는 방법″은 상기 질병 및 질병과 관련된 증상이 호전, 감소, 치료 또는 차도가 있는 것을 의미한다.

또한, ″백혈병 침윤을 치료하는 방법″은 순환계외부로의 백혈병성 세포의 침윤 및 이런 침윤과 관련된 증상이 호전, 감소, 치료 또는 차도가 있는 것을 의미한다.

이 글에서 ″난치성″은 백혈병이 일반적으로 처리 또는 치료에 저항성을 나타내는 것을 의미한다.

이 글에서 ″전종양성″세포는 정상에서 종양형태로 전이하고 있는 세포; 또는 정상적으로 분화하지 못하는 세포를 의미하고, 분자생물연구에 기초한 형태학적 증거에서, 선종양은 여러 단계를 거쳐 발전한다.

한 구체예에서, 본 발명은 사람에서 백혈병을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 삼산화비소 또는 멜랄소프롤의 치료요법적 비-치사 효과량을 사람에게 투여하는 것으로 이루어진다. 본 발명은 또한 체중-기초의 약량요법(여기에서 밝히지 않음)을 제공하는데, 상기 요법은 사람에서 이들 고-독성 화합물의 안정성을 최대화한다.

삼산화비소(As₂O₃)는 NB4 급성 전골수성 백혈병세포에서 생장을 억제하고 아팝토시스를 유도한다. 급성 전골수성 백혈병(APL)은 t(15;17) 전좌와 관계하고, 상기 전좌에 의해 PML과 RARα사이에 PML/RARα융합단백질이 만들어지는데, PML은 핵메트릭스-결합체상에 위치하는 생장억제물질이고, RARα은 레티논산(RA)에 대한 핵수용체이다. PML/RARα는 음성 주도적인 RARα돌연변이와 같이 핵수용체 반응의 억제를 통해 골수분화를 봉쇄하는 것으로 여겨졌다. 또한, APL세포에서, PML/RARα는 PML 및 다른 핵체(NB)의 위치를 핵 마이크로스펙클로 옮겨, 유사하게, PML 그리고/또는 NB 기능을 상실시킨다. 고농도의 삼산화비소는 아팝토시스를 촉진하고, 반면에, 저농도는 APL 환자에게서 얻은 세포를 비롯하여 NB4 세포에서 부분적인 분화를 유도하는 것으로 알려지고 있다. (As₂O₃)는 APL 세포에서 PML-RARα가 특이적으로 핵체로 옮겨져 분해되도록 하는 능력을 통하여 작용하는 것으로 추정되었다(Zhu et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3978-3983). 하지만, 이들 발견은 삼산화비소의 용도를 백혈병의 발병에만 한정한다(Konig et al., 1997, Blood, 90:562-570, 참조).

예상치 않게, 본 발명들은 As₂O₃및 멜랄소프롤 둘 모두 PML 및 PML-RAR??와는 무관한 방식으로, 세포 성장을 억제하고, 다양한 골수성 백혈병 세포에 아팝토시스를 유도한다는 것을 발견했다. 따라서, 본 발명자들은 이전의 발견과는 대조적으로, 삼산화비소 및 멜랄소프롤이 종양을 유발하는 분자기작에 상관없이 광범위한 백혈병에 효과적이라는 것을 발견했다. 다수의 백혈병세포계에 대한 비소화합물 효과의 작업 실시예는 섹션 5.1 및 5.2에서 제시한다.

따라서, 본 발명의 비소화합물은 다양한 백혈병에 대하여 사용할 수 있는데, 이런 백혈병의 예로는:

급성 림프아구성 백혈병(ALL), 급성 림프아구성 B-세포 백혈병, 급성 림프아구성 T-세포 백혈병, 급성 골수아구성 백혈병(AML), 급성 전골수성 백혈병(APL), 급성 단구종 백혈병, 급성 거핵아구성 백혈병, 급성 골수성단구 백혈병, 급성 비분화 백혈병, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프성 백혈병(CLL)을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다.

당업자는 다른 백혈병도 본 발명에 따라 치료할 수 있음을 알 수 있을 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람에서 림프종을 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 삼산화비소 또는 멜랄소프롤의 치료요법적 비-치사 효과량을 사람에게 투여하는 것으로 이루어진다. 본 발명 방법에 의해 치료할 수 있는 림프종의 예로 고등급 림프종, 중간등급 림프종, 저등급 림프종, 다양한 소분류를 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 전이를 비롯하여 고형암의 치료방법을 제공하는데, 상기 방법은 삼산화비소 또는 멜랄소프롤의 치료요법적 비-치사 효과량을 사람에게 투여하는 것으로 이루어진다. 본 발명 방법에 따라 고형암에는 소화관, 식도, 간, 위, 결장, 피부, 뇌, 뼈, 유방, 폐, 연조직의 암; 다양한 육종(가급적 전립선암)이 포함되지만, 이들에 한정하지 않는다.

다양한 구체예에서, 백혈병세포 또는 종양세포는 사람에서 다른 기관 또는 시스템, 예를 들면, 중추신경계로 침윤한다. 본 발명의 방법은 사람에서 다수의 전종양 세포수를 감소시키는데 적용가능한데, 다수의 전종양 세포에서 이들 세포수는 비정상적으로 증가한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 사람에서 급성 전골수성 백혈병(APL)의 치료방법을 제공하는데, 상기 방법은 멜랄소프롤의 치료요법적 비-치사 효과량을 사람에게 투여하는 것으로 이루어진다. 섹션 5.2에서 밝힌 바와 같이, 본 발명자들은 in vitro에서는 세포독성을 나타내는 멜랄소프롤의 농도를 in vivo에서 쉽게 얻을 수 있음을 발견했다.

특정 구체예에서, 본 발명은 사람에서 만성 골육종 백혈병(CML)의 치료방법을 제공하는데, 상기 방법은 멜랄소프롤의 치료요법적 비-치사 효과량을 사람에게 투여하는 것으로 이루어진다. 섹션 5.3에서 밝힌 바와 같이, 본 발명자들은 삼산화비소가 CML 세포계에서 아팝토시스를 유도할 수 있다는 것을 발견했다. 본 발명의 제약학적 조성물의 치료요법적 이점은 일반적으로 포울러 용액으로 제조되는 아비산칼륨보다 훨씬 우월하다는 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람에서 급성 전골수성 백혈병(APL) 의 치료방법을 제공하는데, 여기서 APL은 크로모좀 17 내지 크로모좀 11상의 RARα좌위의 전좌와 관계하고, 상기 방법은 산화비소 또는 멜랄소프롤의 치료요법적 효과량을 사람에게 투여하는 것으로 이루어진다. 대부분의 APL 경우에, 크로모좀 17상의 RARα좌위가 전좌되고 크로모좀 15, 즉, t(15;17)상에 위치한 PML 유전자와 융합한다. 극소수의 경우에, RARα는 크로모좀 11로 전좌하고, 여기서 PLZF 유전자와 융합한다. t(15;17)를 보유한 환자는 독특하게도 모든-트랜스 레티논산(ATRA) 치료에 민감해 75% 내지 95%의 완전 호전율을 보인다. t(11;17) (PLZF-RARα)과 관련된 APL은 예후가 더 나빠 화학치료요법에 반응을 잘 보이지 않고, ATRA 처리에 거의 반응을 나타내지 않아, 새로운 APL 증상을 한정한다. 본 발명은 삼산화비소 또는 멜랄소프롤을 사용하여 APL의 이런 경우를 치료할 수 있다고 제시한다. 본 발명의 비소화합물의 치료요법적 이점과 약량을 검증하기 위해 t(15;17) 및 t(11;17)와 관련된 APL의 이종원성 동물 모델은 아래의 5.4 섹션에서 밝힌다.

백혈병에 걸린 사람은 때때로 항-백혈병 치료법(예, 화학치료요법)에 의해 통상적인 치료방법에 반응을 보이지 않는다. 따라서, 본 발명은 통상적인 치료법에 반응을 보이지 않는 사람에서 백혈병의 치료방법을 제공하며, 상기 방법은 비소화합물 및 다른 화학치료요법 약물(예를 들면, 모든-트랜스 레티논산(ATRA) 또는 다른 레티노이드, 이들 예에 한정하지 않음)의 화합물의 치료요법적 비-치사 효과량을 사람에게 투여하는 것으로 이루어진다. 비소화합물은 비소화합물 또는 멜랄소프롤, 또는 제약학적으로 수용가능한 이들의 염이 된다. 본 발명은 또한 레티노이드-저항 환자의 비소화합물로의 처리를 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 비소화합물 및 화학치료요법은 혼합하거나 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 순차적으로 투여하는 경우, 두 번째 약물이 투여될 때, 첫 번째로 투여된 약물이 여전히 사람에게 항-백혈병 활성을 제공하는 동안, 비소화합물은 화학요법약물 이전 또는 이후에 투여한다. 이 글에서 밝힌 임의의 투여형태로 화합물을 전달한다. 적절한 측면에서, 화합물로 치료할 사람의 백혈병은 일반적 치료방법에 반응을 보이지 않거나 또는 백혈병이 재발한 경우이다.

4.3. 삼산화비소 멸균용액의 제조방법

본 발명의 비소화합물은 백혈병, 림프종, 고형암을 치료를 위해 사람에게 투여하는 제약학적 멸균조성물로 만들어진다. 호환성 담체로 제조한 본 발명화합물로 이루어진 조성물은 치료용으로 제조하고, 포장하고, 라벨을 붙이고, 백혈병, 림프종 또는 고형암의 치료를 위해 사용한다.

한 측면에서, 본 발명은 삼산화비소(As₂O₃)의 치료요법적 비-치사 효과량으로 이루어진 제약학적 조성물의 제조방법을 제공한다. 삼산화비소(원료 물질)는 무기 고체화합물로 극히 정제된 형태로 상업적으로 구매가능하다. 하지만, 수용성 용액에 As₂O₃을 녹이는 것은 힘들다. 또한 본 발명자는 기존의 어떤 문헌에서도As₂O₃을 사람에게 직접주사 하는데 적당한 제약학적 조성물로 제조하는 방법에 관해 밝힌 적이 없다고 알고 있다. 비소는 +5 수가상태(5가) 또는 +3 수가상태(3가)로 용액상에 존재한다. 가령, 아비산칼륨(KAsO₂; 이것은 포울러 용액상에 존재한다) 및 아세니산의 염은 5가 비소를 함유한다. 비소의 한 형태가 다른 것보다 훨씬 더 독하다는 것은 공지된 것이다(Goodman ＆ Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th edition, chapter 66, 1660, 1997). 3가상태인 삼산화비소의 새로운 용액은 장기간 공기에 노출되면, 점진적으로 5가 상태로 산화되고, 이로 인해 5가비소가 축척되고, As₂O₃용액의 상대적 독성(Id.)은 시간에 따라 변한다. 또한 용액상의 전체 비소량은 시간의 추이에 따라 감소한다. 이런 물질손실은 용액상의 비소가 점진적으로 알신(arsine)(AsH₃)으로 전환됨으로써 발생하는데, 상기 알신은 실온에서 기체상태의 화합물이다. 주사되는 물질을 통제할 수 없는 경우, 이것은 특히 제약학적 목적으로는 문제가 된다. 알신이 용액에서 대기로 빠져나가는 것은 바람직하지 못한데, 그 이유는 알신 또한 독성물질이기 때문이다.

본 발명자들은 상기 전술한 용해성 및 안정성 문제를 극복한 삼산화비소의 제조방법을 시험하고 성공적으로 개발하였다. 이 방법은 고-정제 고체 As₂O₃을 고pH(예를 들면, 12이상의 pH)상의 수용액에 녹이는 것으로 이루어진다. 가령, 5 M의 수산화나트륨 용액을 사용한다. 용해를 보조하고 투명하고 균질화된 용액을 얻기 위하여, 기계적 교반 및/또는 부드러운 가열을 가한다. As₂O₃용액은 또한 하룻밤 동안 고형화합물를 분해하여 얻을 수 있다. 일반적으로, 1 M As₂O₃용액은 이런 방법으로 얻는다. 하지만, 이 용액은 너무 염기성이라 제약학적 조성물로 사용할 수 없다.

As₂O₃용액의 pH를 조정하기 위하여, 용액은 물에서 먼저 희석한다, 예를 들면, 대략 1 mg/mL, pH 12의 농도로 희석한다. As₂O₃

용액은 이후 산(예를 들면, 1 M 내지 5 M Hcl)으로 역적정하고 지속적으로 교반하여, pH가 8.0 내지 8.5가 되게 한다. 고도로 농축된 Hcl은 적당하지 않은데, 그 이유는 이것이 As₂O₃용액에 침전을 일으키기 때문이다. 부분적으로 중화된 As₂O₃

용액은 이후 여과(예, 0.22 ㎛ 여과지를 통해)와 같은 방법으로 멸균하고, 멸균 바이알에 저장한다.

개체에 직접주사할 수 있는 제약학적 조성물을 만들기 위하여, 조성물은 멸균해야 하는데, 당업자에게 공지된 표준기술을 이용하여 멸균을 실시한다(Remington's Pharmaceutical Science, 참조). 부분적으로 중화된 As₂O₃용액의 pH는 제약학적 담체(예, 5% 포도당 용액)로 희석(10-100 배)하여 추가로 생리학적 pH로 조정한다. 가령, 10ml의 부분적으로 중화된 As₂O₃용액은 500ml의 5% 포도당용액에 첨가하여 대략 6.5 내지 7.5의 최종 pH를 만든다. 본 발명의 방법은 용액에서 비소의 산화를 감소시킨다. 본 발명 방법에 의해 만들어진 삼산화비소를 함유한 제약학적 조성물은 향상된 안정성 및 긴 저장주기를 보인다.

4.4. 제약학적 조성물 및 투여형태

본 발명에 따라, 비소화합물 및 이들의 생리학적 수용가능 용매화합물은 경구 또는 장관외투여용으로 제조한다.

경구 투여의 경우, 제약학적 조성물은 액체 형태, 예를 들면, 용액, 시럽 또는 현탁액이 되거나, 또는 사용전 물 또는 다른 적절한 담체와 재구성용 약물산물로 제공한다. 이런 액체 제제는 현탁물질(예, 소르비톨 시럽, 셀룰로즈 유도체 또는 수소첨가된 식용지방)과 같은 제약학적으로 수용가능한 첨가제; 에멀젼화 약물(예, 레시틴 또는 아카시아); 비-수용성 담체(예, 알몬드 기름, 유성 에스테르 또는 분류된 야채기름); 방부제(예, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 사용하여 통상적인 방법으로 제조한다. 제약학적 조성물은 소결제(예, 선젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 필터(예, 락토오스, 미크로크리스탈린 셀룰로즈 또는 수소인산칼슘); 윤활제(예, 감자 전분 또는 당 글리콜산나트륨); 또는 습윤제(예, 라우릴 황산나트륨)를 사용한 통상적인 방법으로 만든 정제 또는 캡슐과 같은 형태를 취한다.

흡입 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하는 화합물은 적당한 산화제(예, 디클로로디플루오르메탄, 트리클로로디플루오르메탄, 디클로로테트라플루오르에탄, 이산화탄소 또는 다른 적당한 기체)를 사용하여 일정 기압이 유지되는 팩 또는 약액 형태로 용이하게 전달한다. 압력을 일정하게 유지한 에어로졸의 경우에, 약량단위는 미터단위로 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정한다. 흡입기 또는 취입기에 사용하는 젤라틴의 캡슐 또는 약포는 화합물 및 락토오스 또는 자당과 같은 적당한 분말의 혼합분말을 함유하도록 제조한다.

화합물은 주사, 예를 들면, 거환주사 또는 연속주입하여 장관외 투여용으로 제조한다. 주사용 조성물은 첨가된 방부제로 단위 약량형태, 예를 들면, 앰플 또는 단위약량 용기형태로 제조한다. 조성물은 현탁액, 용액, 또는 유성이나 수용성 담체에 녹인 유제와 같은 형태를 취하고, 현탁약물, 안정화약물 및/또는 확산제와 같은 조성약물을 함유한다. 다른 방법으로, 활성성분은 사용전 적당한 담체, 예를 들면, 피로겐-무(無) 멸균수와 함께 구성되는 분말형태로 존재한다.

본 발명은 본 발명의 치료요법을 실행하기 위한 장치를 제공한다. 이런 장치는 하나 또는 복수의 용기에 담긴 제약학적으로 수용가능한 형태의 비소화합물의 치료요법적 효과량으로 이루어진다. 본 발명장치의 바이알상의 비소화합물은 제약학적으로 수용가능한 용액형태, 예를 들면, 멸균 식염수, 포도당 용액 또는 완충용액과 병용한 형태, 또는 제약학적으로 수용가능한 멸균유체 형태가 된다. 다른 방법으로, 복합체는 동결건조하거나 또는 물기를 제거하여 보관한다; 이런 경우에, 장치는 선택적으로 용기에 제약학적으로 수용가능한 용액, 가급적 멸균된 용액을 함유하고, 복합체를 재구성하여 주사목적의 용액을 형성한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 장치는 또한 복합체를 주사하기 위한 바늘 또는 주사기, 가급적 멸균형태로 싸여진 바늘 또는 싸여진 알코올 패드를 포함한다. 지시사항은 임상의 또는 환자에 의한 비소화합물의 투여를 위해 선택적으로 동봉한다.

백혈병의 급성 또는 만성관리에서 비소 화합물의 치료요법적 약량의 정도는 치료할 질환의 정도, 투여경로에 따라 달라질 것이다. 약량, 투여빈도는 또한, 개별 환자의 나이, 체중, 질환, 반응에 따라 달라질 것이다. 이 글에서 밝힌 비소화합물의 일일 약량범위는 일반적으로 분할 약량으로 0.05 내지 5 mg/체중kg이 되고, 장관외 또는 경구 또는 국소적으로 투여한다. 적절한 전체 일일 약량은 2.5 내지 40 mg의 비소화합물이 된다. 가급적 본 발명의 삼산화비소화합물은 호전될 때까지 최대 60일동안 일일 투여하고, 이후 이 과정을 2 내지 10번 반복하고, 각각의 지속시간은 25일 된다. 가령, 급성 전골수성 백혈병에 걸린 환자의 체중에 따라, 10 mg 정도의 삼산화비소 일일약량을 투여할 수 있다. 다른 방법으로, 체중-기초한 약량요법을 따라, 치료요법적 효과는 10 mg이하 삼산화비소의 일일약량으로 얻을 수 있다.

고형암 치료의 경우, 절절한 약량요법에는 5일동안 0.1 내지 5mg/체중kg의 정맥주입이 포함된다. 5일 치료 프로토콜은 종양생장이 억제되거나 또는 종양이 호전의 기미를 보일 때까지 한달에 한번 반복한다.

멜랄소프롤의 경우, 이 글에서 제시한 이상의 전체 일일 약량범위는 일반적으로 분할 약량으로 0.1 내지 5 mg/체중kg이 되고, 장관외 또는 경구 또는 국소적으로 투여한다. 적절한 전체 일일 약량은 체중 kg당 0.5 내지 4 mg 멜랄소프롤이 된다.

삼산화비소 또는 멜랄소프롤의 암의 발달과 진전에 대한 치료효과는 당분야에 공지된 임의의 방법으로 모니터할 수 있는데, 이런 방법의 예로는 특정 종양 항원 및 추정 생리표지의 수준(예, 태아성 암 항원(CEA), 알파-페토단백질)); 자동화된 X선 단층스캔 또는 소노그래프를 이용한 형태 및/또는 크기의 변화를 들 수 있는데, 이들 예에 한정하지 않는다.

바람직한 혈액 수준은 비소화합물을 연속 주입하여 유지시키고, 혈장수준으로 확인한다. 참석한 수술의는 종결하는 방법과 시점을 알고, 독성, 또는 뼈골수, 간 또는 신장의 이상으로 인해 치료를 중단하거나 또는 약량을 줄일 것이다. 반대로, 참석한 수술의는 임상 반응이 적당하지 않은 경우(독성 부작용 배제), 더 높은 수준의 치료로 조정하는 방법 및 시기를 알 것이다.

다시 말하면, 임의의 적당한 투여경로는 환자에 비소화합물의 효과량을 제공하기 위하여 이용한다. 가령, 경구, 경피, 이온도입, 장관외(피하, 근육내, 척수강내등)를 이용한다. 약량형태는 정제, 알약, 캡슐, 분산액, 현탁액, 용액, 막낭, 패치등이 된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 참조).

본 발명의 제약학적 조성물은 활성성분으로 비소화합물, 제약학적으로 수용가능한 이의 염을 함유하고, 또한 제약학적으로 수용가능한 담체, 선택적으로 다른 치료요법적 성분(예, 모든 트랜스 레티논산)을 함유한다. ″제약학적으로 수용가능한 염″은 유??무기산을 비롯하여 제약학적으로 수용가능한 비-독성산 및 염기로부터 만들어진 염을 의미한다.

제약학적 조성물에는 경구, 점막경로, 경피, 이온도입, 장관외(피하, 근육내, 척수강내, 정맥내)에 적당한 조성물이 포함되지만, 임의의 경우에서, 가장 적절한 경로는 치료할 질환의 성격 및 정도에 따라 달라진다.

정맥내 주사 또는 주입 조성물을 이용하는 경우, 사용하기 위한 적당한 약량범위는 일일 전체 1 내지 40 mg 삼산화비소; 일일 체중 kg당 전체 0.001 내지 10mg 삼산화비소, 또는 일일 체중 kg당 0.1 내지 10 mg 삼산화비소가 된다.

또한, 삼산화비소는 셀룰로즈 아세테이트 막과 같은 약물전달장치로 사용하는 극성 및 비극성 모체를 통해 전달할 수 있지만, 또한 항체 또는 특정 항원과 결합한 방추원성 리포좀을 통하여 전달할 수 있다.

실제적으로, 비소화합물은 혼합물상의 활성성분으로 통상적인 제약화합물기술에 따른 제약학적 담체와 결합할 수 있다. 담체는 투여(예, 경구 또는 장관외(정제, 캡슐, 분말, 정맥내주사 또는 주입포함))에 적당한 제조물 형태에 따라 다양한 형태를 취한다. 경구 투약용 조성물의 제조시, 일상적인 제약학적 임의 배지, 예를 들면, 물, 글리콜, 기름, 알코올, 향료, 방부제, 색소등을 이용하고; 경구 액체 제제의 경우 현탁액, 용액, 연금약액, 리포좀 및 에어로졸, 전분, 당, 마이크로크리스탈린 셀룰로오스, 희석제, 과립제, 윤활제, 소결제, 이완제등을 이용하고, 경구 고형 제제의 경우, 분말, 캡슐, 정제를 이용한다. 정맥내 주사 또는 주입과 같은 장관외 투여용 조성물의 제조시, 유사한 제약학적 배지, 예를 들면, 물, 글리콜, 기름, 완충용액, 당, 방부제등을 이용하는데, 이들 배지는 당분야에 공지된 것이다. 이런 장관외 조성물의 예로는 5%w/v 포도당, 정상적인 식염수 또는 다른 용액을 들 수 있는데, 이들 예에 한정하지 않는다. 비소화합물의 전체 약량은 정맥내 유체의 바이알에 투여하는데, 예를 들면, 이들 약량은 2 ml 내지 2000ml가 된다. 희석 유체의 부피는 투여하는 전체 약량에 따라 달라질 것이다. 가령, 1mg/ml 농도의 10 ml 수용성 용액으로 제공된 3산회비소는 10 내지 500 ml의 5% 포도당 용액에 녹여 희석하고, 10분 내지 4시간의 시간동안 정맥주입용으로 사용한다.

백혈병, 림프종 또는 고형암에 걸린 환자의 치료의 전형적인 과정에는 환자의 체중 kg당 0.01 내지 1mg의 삼산화비소 일일약량으로, 수용성 용액에 녹인 삼산화비소를 정맥내 주입하는 일일 투여가 포함된다. 바람직하게는 체중 kg당 0.15 mg 삼산화비소를 사용한다. 치료과정은 뼈골수 호전이 관찰되거나 또는 부작용이 심해질 때까지 지속한다. 치료과정은 대략 열달동안 최대 10번 반복하는데, 과정사이의 휴식기는 3 내지 6주가 된다. 치료의 호전-후 과정에는 최장 25일동안 일일 또는 몇주를 기초로 하여, 환자의 체중 kg당 0.15 mg의 일일약량으로 삼산화비소를 주입하는 것이 포함된다.

아래에 제시한 것은 다양한 형태의 백혈병의 치료에 사용하는 본 발명의 비소화합물의 용도의 실시예이다. 이런 실험을 통하여, 본 발명의 삼산화비소 조성물은 사람에서 잘 수용되는 것으로 밝혀졌다. 가령, 세 명의 APL 환자는 일일 한번 1회 분량으로 본 발명의 비소화합물 10 mg을 정맥내로 섭취했다.

5.1. 삼산화비소 및 멜랄소프롤은 골수성 백혈병 세포계에서 아팝토시스를 유도한다.

APL 세포계 NB4-306(NB4에서 유도한 레티논산-저항성 세포계이며, 더 이상 손상되지 않은 PML-RARα융합단백질을 발현하지 못한다), HL60, KG-1, 골수성 단구 세포계 U937을 비롯하여, 골수성 백혈병 세포계에 대항하는 As₂O₃및 멜랄소프롤의 활성을 조사하였다. 비소활성의 조절시, PML의 역할을 검사하기 위하여, 본 발명자들은 또한 뮤린 태아성 섬유아세포종(MEFs) 및 뼈골수(BM) 양친을 이용하여 이들 약물을 시험하였는데, 여기서 PML 유전자는 상동성 재조합에 의해 불활화되었다. 예상치 않게, 두 화합물 모두 세포 생장을 억제하고, 시험한 모든 세포에서 아팝토시스를 유발하는 것으로 밝혀졌다. 멜랄소프롤은 10^-7내지 10^-5mol/L 범위의 동몰량 농도에서, As₂O₃보다 더 강력했다.

As₂O₃

은 PML 및 PML-RARα를 핵체로 옮기고, 이 핵체는 이후 HL60 및 U937 세포계를 비롯하여 NB4세포에서 PML 분해된다. 비록 멜랄소프롤이 생장을 억제하고 아팝토시스를 유발하는 데에는 더 강력하지만, PML 및/또는 PML-RARα핵국소화에는 어떠한 영향을 미치지 않는다. 게다가, As₂O₃과 PML-RARα둘 모두 유사하게 생장을 억제하고, PML+/+ 및 PML-/-MEF의 아팝토시스를 유도하고, PML+/+ 및 PML-/-양친의 BM 배양물상에 집락-형성 적혈구단위(CFU-E) 및 CFU 과립-단구형성을 억제한다. 본 실험의 방법, 재료, 결과의 상세한 설명은 Wang et al., Blood, 1998, 92:1497-1504에서 제시한다.

실험에서 얻은 결과로부터 이들 세포계에서 양 비소화합물의 세포독성 효과가 PML 또는 PML-RARα발현에 의존한다는 것을 알 수 있다. 대개의 라인에서, 멜랄소프롤은 생장을 억제하고, 아팝토시스를 유도하는 데 있어 As₂O₃과 비교할 경우, 다소 더 강력하고, 두 약물의 효과는 약량에 의존하였다. 이전에 보고한 바와 같이, As₂O₃은 PML 단백질을 핵체로 옮기고, NB4세포에서 PML 및 PML-RARα분해를 유도하여 아팝토시스를 촉발시킨다. 하지만, 유사한 결과는 HL60 및 U937 세포에서 관찰되었는데, 이들은 PML-RARα융합 유전자를 보유하지 않는다. 게다가, 멜랄소프롤은 PML 및/또는 PML-RARα를 변형하지 않고 실험한 모든 세포계에서 아팝토시스를 유도하였다.

As₂O₃및 멜랄소프롤의 상이한 작용은 시험관내에서 거의 무시할 정도이고, PML 및/또는 PML-RARα의 발현 및 조절에 의존하지 않는 것으로 보였다. 실제로, 장기간 배양(최대 2주)에서 본 발명자에 의해 관찰된 조그만 효과들은 양 화합물로 시험한 모든 세포계에서 거의 동등했다.

APL에서 As₂O₃의항백혈병 효과와 이전에 관계했던 bcl-2 하향조절은 PML-RARα의 발현에 의존하지 않는데, 그 이유는 이런 하향조절이 NB4 소클론 306에서 일어나며, 상기 소클론에서는 손상되지 않은 단백질이 검출되지 않기 때문이다. 최종적으로, PML 발현이 비소화합물의 항백혈병 효과에 필수적인지를 시험하기 위하여, 두 약물은 쥐 태아 섬유아세포종 및 동물에서 얻은 BM 세포에서 실험하였는데, 여기서 야생형 PML은 상동성 재조합으로 제거하였다. PML 발현이 완전히 소실된 이들 세포에서, As₂O₃과 멜랄소프롤 둘 모두 생장을 억제하고 아팝토시스를 유도함에 있어 동등하게 효과적이었고, 둘은 정상적인 CFU-E 및 CFU-GM 집락형성에 유사한 효과를 미친다. 게다가, 야생형 및 PML-/- 세포사이에서 어떠한 차이도 발견되지 않았다. 임의의 이론에 한정하지 않고, 이들 자료는 이들 비소화합물의 항백혈병 효과가 PML 및 PML-RARα발현과는 독자적으로 일어난다는 것을 강하게 암시한다. 이들 결과는 PML 단백질상의 변형으로 특징지어지지 않는 질병(예를 들면, 만성 골수성 백혈병)에 대한 비소화합물의 병력(病歷)과 일치한다.

결과에서, As₂O₃과 멜랄소프롤 둘 모두 골수양 및 림프양 질병 모두에 항백혈병 약물로 광범위하게 사용되고 있음을 알 수 있다. 결론적으로, 이들 자료에서, 세포독성 활성은 PML 단백질에 의해 매개되지 않기 때문에, PML 발현상의 변형과 관련된 질환에 한정하지 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 비소화합물은 APL에 한정하지 않고 잠재적으로 더 광범위한 치료요법적 역할을 갖는다.

5.2 백혈병이 진전된 환자에서 멜랄소프롤의 임상적 연구

멜랄소프롤은 산화멜랄센과 디멀캐프롤을 복합하여 합성한 유기 비소화합물로 주로 아프리카 트리파노소마증의 치료에 사용한다. 만성적 B-세포 림프확대 질환의 대표적인 세포계에서 아팝토시스의 유도에 대한 멜랄소프롤 효과를 조사하였는데, 결과는 아래와 같다.

멜랄소프롤(Rhone Poulenc Rorer, Collegeville이 Arsobal [36 mg/mL]로 공급, PA)은 10^-4mol/L의 원농도로 프로필렌 글리콜에서 희석하고 실온에서 저장한다. As₂O₃(Sigma, St. Louis, Mo)은 10^-3mol/L의 원농도로 1.65 mol/L 수산화나트륨(NaOH)에 녹였다. 연속희석(10^-6to 10^-9mol/L)은 RPMI 1640 배지에서 실시하였다. 엡스테인-바르 바이러스(EBV)-형질전환된 B-전림프구 세포계(JVM-2), EBV-형절전환된 B-세포 만성 림프구 백혈병(B-CLL) 세포계(I83CLL), 비-EBV-형절전환된 B-CLL 세포계(WSU-CLL)를 표적으로 사용하였다. 멜랄소프롤(10^-6to 10^-9mol/L) 약량-반응 실험은 96시간동안 실시하였다.

예상치 않게, 본 발명자는 세 개의 세포계 모두에서 멜랄소프롤이 약량- 및 시간-의존하여 생존 및 생장을 억제한다는 것을 발견했다. 대조적으로, 유사한 농도의 As₂O₃은 생존 또는 생장에 어떠한 효과를 미치지 않았다. 24시간후, 멜랄소프롤(10^-7mol/L)을 처리한 세 개의 세포계 모두에서 아팝토시스의 형태특성이 나타났다. WSU-CLL 183 CLL 및 JVM-2에서 멜랄소프롤에 노출된지 24시간후의 bcl-2 mRNA의 농도-의존 주도적 하향조절을 관찰하였다. bcl-2 단백질 발현의 감소는 세 개의 세포계 모두에서 관찰된 반면에, As₂O₃은 이런 변수에 아무런 영향을 주지 않았다.

상기 시험관내 자료에서, 일반적으로 As₂O₃보다 낮은 농도에서 골수양 및 림프양 세포에 대항하는 멜랄소프롤의 예기치 않게 넓은 항백혈병 활성이 밝혀진 점을 고려하여, 재발된 또는 난치성의 백혈병에 걸린 사람환자에서 멜랄소프롤의 약리유전학, 안전도, 잠재적 효능을 평가하기 위한 연구가 시작되었다.

자격이 되는 환자는 3일 동안 간단한 IV주사를 일일 처리하고, 3주동안 주마다 반복하고, 반응 pts에 따라 3주 추가하였다. 초기 약량은 1일에 1 mg/kg, 2일에, 2 mg/kg, 3일 이후에 3.6 mg/kg으로 하였다. 시험관내 연구에는 병행하여 멜랄소프롤 및 As₂O₃에 대한 새로운 백혈병 세포의 배양민감성이 포함되고, 또한 표면항원발원의 연속유출 혈구연구, 아팝토시스, bcl-2 발현이 포함된다. AML에 걸린 세 명의 환자와 CML에 걸린 한 명의 환자를 연구하였다.

대략 10 mg/ml에 민감한 고성능 액체 크로마토그래피에 기초한 방법을 이용한 예비 약리유전학 자료에서, 최고혈장 약물 농도는 1.2 ng/ml(1일째) 내지 2.4 ng/ml(3일째)범위의 Cmax 주사직후 얻었다. 초기 분포기는 신속한 반면에, 연장된 T1/2γ은 깊숙한 부분으로부터의 방출을 의미한다. 농도 X 시간 곡선(AUCs)아래의 혈장영역은 투여한 약량에 비례하는데, 이의 범위는 0.48 ng.hr/ml(1일째) 내지 1.48 ng.hr/ml(3일째)가 된다. 약물의 검출가능한 농도는 초기 복용후 1주후에 관찰되었다. 약물은 상대적으로 잘 받아들여졌다. 부작용에는 주사위치에서의 일시적인 통증 및 경미한 메스꺼움이 있다. ″반응성 뇌병″(일반적으로 CNS 트리파노소마증의 치료동안 관찰됨)의 징후는 발견되지 않는다.

이들 연구결과에서 멜랄소프롤은 무기 As₂O₃보다 더 광범위한 활성을 갖고, 시험관내의 백혈병 세포에 세포독성을 띠는 치료요법적 농도는 생체내에서 쉽게 얻을 수 있음을 알 수 있다.

5.3 K562 만성 골육종 백혈병(CML) 세포에서 삼산화비소는 아팝토시스를 유도한다.

필라델피아 크로모좀 양성 CML 세포계 K562를 사용하여 삼산화비소(As₂O₃)가 CML에서 아팝토시스를 촉진하는지를 결정한다. 로그기(log phase)에서 세포의 현탁배양물은 1 x 10^-5M, 5 X 10^-6M, 1 X 10^-6M의 농도로 As₂O₃에 노출시켰다. 세포의 일정부분은 72시간 과정동안의 다양한 시점에서 분석하여 생존 및 아팝토시스를 평가하였다. 생존은 트립판 블루 배제를 이용하여 측정하였다; 동일시간에 아팝토시스는 형태, 유출혈구계산, DNA 겔 전기영동으로 검출하였다.

1 x 10^-6M 농도의 삼산화비소는 K562 세포 생장 또는 생존에 어떠한 효과도 미치지 않았다. 세포 생장 및 생존에 대한 가장 큰 효과는 1 x 10^-5M As₂O_3.농도에서 보였다. As₂O₃에 노출된 지 72시간후의K562 세포 생장 및 생존 자료는 표1에 기록한다.

	% 세포생장 손상	% 생존	p 수치
컨트롤	0	92.1 ± 0.9
5 x 10^-6M As₂O₃	63.0	78.8 ± 0.5	0.0001
1 x 10^-5M As₂O₃	75.3	61.9 ±2.9	0.0223

아팝토시스를 대표하는 이런 비소-유도의 생존감소의 증거를 분석하였다. 막 기포 및 핵 응축을 비롯하여 아팝토시스의 형태특성은 72시간동안 10^-5M As₂O₃으로 배양한 K562 세포의 착색된 사이토스핀에서 확실히 드러났다. 이것은 DNA 뉴클레오좀 사이의 손상 증거와 관계하며, 10^-5M As₂O₃에 노출된 K562 세포로부터 추출한 DNA의 겔 전기영동으로 시각화하였다.

TUNEL 방법으로 측정한 것과 같은 아팝토시스의 정량 평가에서, 75.6% ±8.6 (1 x 10^-5M As₂O₃)세포는 72시간에서의 6.3%±3.0 (컨트롤)세포와 유사한 아팝토시스를 보였다. 10^-5M As₂O₃으로 K562 세포를 처리하면, 노잔 분석으로 탐지한 바와 같이 p21 mRNA의 상향조절이 발생하는데, 이는 세포의 G1 단계에서 세포의 정지를 암시한다. 이들 자료에서 삼산화비소가 CML에 대한 치료요법적 약물임을 알 수 있다.

5.4. PML-RARα 및 PLZF-RARα이종원성 생쥐에서 삼산화비소(As₂O₃) 치료요법적 시도

급성 전골수성 백혈병(APL)은 크로모좀 전좌와 관계하고, 상기 전좌에는 게놈상의 다른 좌위로 크로모좀 17상의 레티논산 수용체 α(RARα)좌위의 이동이 반드시 포함되는데, 상기 다른 좌위의 예로는 대부분의 APL 경우에, 크로모좀 15상에 위치한 PML 유전자, 몇몇 경우에 크로모좀 11상의 PLZF 유전자를 들 수 있다. t(15;17)를 보유한 환자는 모든 트랜스 레티논산(ATRA) 치료에 민감해 75% 내지 95%의 완전 호전율을 보인다. t(11;17) (PLZF-RARα)과 관련된 APL은 ATRA에 거의 반응을 보이지 않는다.

APL 치료에서 As₂O₃의 효능을 시험하기 위하여, 이종원성 쥐에서 질병모델을 개발하였다. 이종원성 생쥐는 표준기술로 만들었는데, 여기서 PML-RARα또는 PLZE-RARα융합 단백질은 골수성-전골수구 특이적 사람 캐테프신-G(hCG) 소유전자의 조절하에 둔다. hCG-PML/RARα와 hCG-PLZF-RARα이종원성 생쥐 모두에서 사람에서 APL의 특징과 유사한 특징을 가진 골수성 백혈병이 발병했다.

백혈병 생쥐에 대한 치료요법적 시도는 다음의 처방으로 실시한다: 1) ATRA: 일일 1.5㎍/체중g, 경구로 투여; 2) ATRA: 일일 6㎍/체중g, 복강내 투여. 생쥐는 일주일에 한번 방혈하여 반응을 평가하였다.

PML/RARα백혈병은 ARTA에 잘 반응하여 호전율이 높았다(처방 1에서 80%). 놀랍게도, in vitro에서, ATRA는 분화를 유도하고, 백혈병 세포의 생장을 억제하고 또한, PML-RARα와 PLZF-RARα백혈병에 대한 뼈골수 및 비자 양친분석에서 백혈병성 집락형성을 억제하였다. 또한, 탈체 실험에서, PLZF-RARα생쥐로부터 얻은 백혈병 세포는 ATRA로 선배양후 누드 생쥐 수용체로 이식되는 경우 종양원성 능력을 상실한 반면에, 처리하지 않은 세포는 종양원성을 능력을 유지했다. 하지만, 생체내에서, PLZF-RARα백혈병은 ATRA에 거의 반응을 보이지 않은 반면(처방 1에서 28%), 고 약량의 ATRA은 더 효과적인 것으로 보였다(처방 2에서 50%). 결론적으로 PLZF-RARα이종원성 생쥐에서 백혈병은 ATRA 치료에 민감하지만, 고약량의 ATRA 치료요법을 필요로 하는 것 같다. 이들 발견은 t(11; 17)를 가진 APL 환자의 치료와 직접적인 관계를 가진다.

PML-RARα와 PLZF-RARα백혈병 모두에서, ATRA는 생존을 연장시키기는 하지만 병이 호전된 직후에 백혈병이 재발했고, 추가의 ATRA 치료에 대해서는 거의 반응을 보이지 않았다. 두 마리의 이종원성 생쥐 모델을 사용하여 As₂O₃및 ATRA+As₂O₃(ATRA에 저항하는 APL 환자의 치료 및 t(11;17)와 관련된 APL의 경우)의 효능과 약량을 검사한다. 일일 6㎍의 As₂O₃, 또는 일일 체중g당 6㎍ As₂O₃및 1.5 또는 6 ㎍ ATRA의 화합물은 복강내로 투입한다. 생쥐는 주단위로 방혈하여 APL의 호전을 평가한다.

5.5. 제약학적 조성물의 제조 및 안정성

초순도 고형 삼산화비소(As₂O₃)는 5 M 수산화나트륨(NaOH) 용액에서 용해시켰다. 현탁액은 5분동안 주변온도에서 교반하여 투명하고, 균질한 용액을 만들었다. As₂O₃용액(2 mL, 1.0 M)은 500 ml 엘렌메어(Erlenmeyer) 플라스크상의 393.6 mL H₂O에 첨가하여, As₂O₃농도를 1mg/mL가 되게 하였고, 이때 pH = 12였다. 5.0 M HCl 용액은 HCl(49.26 mL, 37% wt/wt, 10/15 M)를 250 mL HCl 엘렌메어 플라스크상의 H₂O(50.74mL)로 희석하여 만들었다. HCL 용액은 이후 주사기를 통하여 1000 mL 빈 용기로 옮겼다. As₂O₃용액은HCl(0.725 mL, 5.0 M)로 역적정하여 pH를 8.0이 되게 하였다. 대략 10 mL의 역적정된 As₂O₃용액은 Millex-GS 0.22 ㎛ 단위필터를 통하여 여과하고, 30개의 멸균바이얼 각각에 첨가하였다. 환자의 정맥으로 주사할 제약학적 조성물을 만들기 위하여, 10 mL의 상기 용액을 2개의 바이알에서 뽑아내고, 500 mL 5%-포도당 용액에 첨가하여 최종 pH가 6.5가 되게 하였다.

고순도의 시작물질은 원자 흡수계산으로 확인하였다(표1). 4개의 중단단계 및 최종단계 용액의 복제샘플은 전체 비소함량을 분석하였다. 분말용적 분석에서 극순도의 시작물질을 확인하였다. 중간단계 및 최종생산용액의 비소함량에 대한 자료는 아래의 표2에 제시한다.

이들 자료에서, 시간의 경과에 따른 비소의 중량손실 징후가 전혀 나타나지 않는다는 점에서 이들 용액은 안정하다.

삼산화비소의 중간단계 조성물 및 최종생산용액의 비소함량(ppm)

샘플 코드	A-01*	A-02	A-03	A-04	A-05
일정부분 A	140,600	600	707	629	680
일정부분 B	139,000	564	703	688	687
분석변이	1.1%	6%	0.57%	8.7%

* 샘플 코드의 확인:

A-01: NaOH에 초기 용해이후 중간단계 생산용액

A-02: HCl 적정이전 중간단계 생산용액

A-03: 밀렉스 여과이전 중간단계 산물

A-04: 제조직후 10ml 충전바이알로부터 나온 최종 산물

A-05: 제조 2개월후 밀봉된 바이얼 에서 나온 최종 산물

6. 실시예: APL 환자에서 임상적 시도

삼산화비소는 APL에 걸린 환자에서 평가하여 이들 약물이 세포분화 또는 아팝토시스를 유도하는 지를 결정하였다. 광범위한 이전 치료법에서 재발한 12명의 환자는 뼈골수 호전이 있을 때까지, 일일 0.06 내지 0.2 mg/kg범위의 약량으로 삼산화비소 처리하였다. 뼈골수 단핵세포는 유출 혈구계산으로 면역표현형, 형광 In situ 혼성화(FISH), PML/RAR-α발현을 위한 역전사 중합효소 연속 반응(RT-PCR), 아팝토시스-관련 단백질(카스파제 1,2,3)의 웨스턴 블랏 발현을 연속으로 모니터하였다. 결과에서 저-약량의 삼산화비소는 APL에 걸린 재발환자에서 완전호전의 유도에 매우 효과적인 것을 알 수 있다. 임상적 반응은 백혈병세포에서 불완전한 세포분화 및 카스파제 활성화를 통한 아팝토시스의 유도와 관계한다.

6.1. 방법

임상 프로토콜: 적합 요구사항에는 APL의 진단이 포함되며, 이런 진단은t(15:17)전좌에 대한 세포 유전학 또는 형광 in situ 혼성화(FISH)분석, 또는 PML-RAR α에 대한 역전사 중합효소 연속반응(RT-PCR)분석으로 확인한다. 환자는 모든-트랜스 레티논산+세포독성 약물의 화합물을 포함한 기존의 표준치료법에서 재발한 환자이어야 한다. 환자의 동의를 받고, 프로토콜은 검토위원회로부터 검증 및 승인을 받았다.

삼산화비소 처리: 삼산화비소는

1 mg/ml의 약물을 보유한 10 ml 바이알에 담긴 수용성 용액으로 공급하였다. 약물은 추가로 500 ml 5%-포도당 용액에 희석하고, 하루에 한번씩 2 내지 4시간동안 정맥주입하였다. 초기 환자들은 플래트(FLAT)약량으로 10 또는 15 mg/일일을 섭취하였는데, 두 명의 어린이 환자를 다른 병원으로 보내면서 이전에는 알려지지 않았던 본 발명의 체중-기초 처방(0.15mg/kg/day)이 도출되었다. 약물은 뼈골수 호전이 관찰될 때까지 일일 투여하였다. 완전히 호전된 환자는 선행과정이후 추가의 3 내지 6주 치료를 받았다. 연이은 과정동안 일반적으로 대략 10개월 동안, 최대 6번 과정에, 최고 25일동안, 일일 또는 몇주-단위로 0.15 mg/kg/day의 약량으로 투여하였다. 조사동안 모니터함: 응혈장애를 지닌 환자는 혈소판 및 새로운 동결 혈장을 수혈하여 혈소판수 및 피브리노겐을 각각 목표수준 ≥50,000 cells/cu mm, ≥100 mg/dL으로 유지하였다. 혈구수, 응집연구, 혈청화학외형, 검뇨, 심전도를 연속적으로 얻는다. 뼈골수 흡출 및/또는 생검은 호전이 기록될 때까지, 기준선 및 그 이후에서 주기적으로 실시하였다. 통상적인 반응 기준을 관찰하였는데, 상기 기준에서, 뼈골수 회복은 ≤5%, 말초혈 백혈구 ≥3,000 cells/cu mm, 혈소판 ≥100,000cells/cu mm가 된다.

세포 면역표현형 연구: 헤파린 처리한 뼈골수 또는 혈액샘플은 수거하고 단핵세포는 피콜-하파크 원심분리로 분리하였다. 표면막항원은 형광 이세티오시아나이트(FITC) 또는 피코에리트린 접합된 단클론항체: CD16 (Leu 11a), CD11b, CD33(Leu M9), HLA-DR, CD45, CD14를 사용하여 직접 면역형광 착색하여 검출하였는데, 상기 항체들은 벡톤-딕킨선(Mountainview, CA) 또는 이뮤노테크 이뮤날러지(Marseille, France)에서 구입하였다. 이중-색깔 착색은 세포를 두 개의 단클론 항체와 동시에 세포를 배양하여 실시하였는데, 상기 항체는 CD-33-PE/CD11b-FITC와 CD33-PE/CD16-FITC가 된다. 동 기준표본의 무관한 단클론 면역글로불린을 사용한 네거티브 조절을 동시분석하였다. 유출 혈구계산분석은 488 nm 아르곤 레이저가 장착된 EPICS 프로파일 II 유출 혈구계산기(Coulter Electronics)에서 실시하였다. 전방 및 측면-분산 세포 파라메터를 측정하고, CD45/CD14 착색제와 결합하여 관심있는 개체군을 확인하고, 분석 게이트로부터 단핵 백혈구를 제외시켰다. 다중파라메터 데이터 인식 및 전시 시스템(MDADS, Coulter Electronics)을 사용하여 자료를 얻고 분석하였다.

형광 in situ 혼성화(FISH): CD33 및 CD11b에 대하여 면역형광 착색시킨 선별 표본들은 FACStar PLUS 세포-분류기(Becton-Dickinson)를 사용하여, 양 항원을 공동발현하는 세포를 분류하였다. 분리된 세포는 배양배지에서 1시간동안 37℃에 배양항고 고장용액 0.075M KCl로 5분동안 처리하고, 3:1 메탄올: 아세트산 고정제에 고정시키고, 공기-건조시켰다. 간기 FISH는 특정 PML/RAR-α전좌 이중-칼라 프로브(Vysis; Downer's Grove, IL)를 사용하여 실시하였다. 간단히 말하면, 간기 세포에서 얻은 DNA는 5분동안 73℃에서 슬라이드를 50% 포름아마이드/2xSSC 용액에 적셔 변형시켰다; 슬라이드는 이후 알코올에서 탈수시키고 공기건조시켰다. 혼성혼합물상태의 프로브 혼합물은 도포하고, 뚜껑 슬립을 덮고, 고무시멘트로 봉합한다. 혼성화는 대략 12 내지 16시간동안 습기찬 방에서 37℃로 실시하였다. 혼성화 이후, 결합하지 않은 프로브는 세번 10분동안 50% 2xSSC 용액에서 45℃로 슬라이드를 세척하여 제거하고, 이후 2xSSC/0.1 NP-40 용액에서 5분동안 45℃로 세척한다. 슬라이드는 이후 공기 건조하였고 4',6-디아미디노-2-페닐인돌로 탈색하고, 유리 뚜껑으로 덮었다. 형광시그널에 대한 간기 세포 분석은 Zeiss axioscope에 맞춰진 광도 센스 카메라로 실시하였다. 각 샘플에 대해 최소 300 세포를 연구하였다.

웨스턴 블랏 분석: 세포는 50 mM Rris-HCl, 0.5 mM 에틸렌글리콜[비스]-[아미노아실] 테트라 아세트산, 170 mM NaCl, 1mM 디티오트레이톨, 0.2% NP-40, 0.01 U/mL 아프로티닌, 10 ㎍/mL 레우펩틴, 10㎍/mL 펩스타틴, 1 μM페닐메틸설포닐 플루오리드(모두 Sigma에서 구매)를 함유한 버퍼에서 용해시켰다. 용해질은 이후 초음파 균질화기(471C Series, Cole Parmer Instriments, Chicago, IL)를 사용하여 음파처리고, 7,500 g(Sorvall Instruments, Newtown, CT)로 원심분리하였다. 용해질의 단백질 함량은 BioRad 단백질 분석장치(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 BSA 표준의 595 nm에서 결정하였다. 10% 글리세롤, 0.4% SDS, 0.3% 브로모페놀 블루, 0.2% 피로닌 Y, 1x 충적버퍼(Tris 염기 0.5M, 0.8% SDS), 20% 2-멀캡토에탄올을 함유한 샘플버퍼는 세포 용해질에 첨가하고, 상기 용해질은 3분동안 95℃로 열-변성시켰다. 계속해서, 15㎍/라인의 단백질은 12.5% 폴리아크릴아마이드을 함유한 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 적하하고, 전기영동하여 크기에 따라 분류하였다. 단백질은 Tras-Blot 전이배지(Bio-Rad)로 전기블랏하고, Ponceau-S를 내부 적하 컨트롤로 하여 착색하였다. 카스파제1,2(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 카스파제 3(PharMingen, San Diego, CA)을 비롯한 토기 항-혈청 단클론항체를 첨가하고, 결합 항체는 ECL^TM화학형광검출장치(Amersham, Arlington Heights, IL)를 사용하여 검출하였다. 단백질 밴드는 컴퓨터 농도계로 정량하였다. PML/RARα에 대한 RT-PCR 분석: RT-PCR은 전술한 방법을 이용하여 실시하였다(Miller et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:2694-8; Miller et al., 1993, Blood, 82:1689-94).

6.2 결과

환자: 재발된 또는 난치성 APL에 걸린 12명의 환자를 치료하였다. 모든 환자는 이전에 광범위한 레티노이드 및 세포독성 약물 치료를 받았었다. 2명의 환자는 동종 뼈골수 이식에서 재발했고, 이들 중 한 명은 또한 T-세포 재주입도 실패했었다. 한 환자는 만성신부전으로 혈액투석을 받고 있었다.

임상효능: 12명의 환자중 11명이 삼산화비소 치료후 완전히 호전되었다. 투석을 받던 환자는 1일째 두개강내 출혈이 일어나 5일째 사망했다. 반응한 환자에서 평균 치료기간은 33일(범위, 12 내지 39일)이었고, 평균 일일약량은 0.16 mg/kg(범위, 0.06 내지 0.2 mg/kg)이었고, 유도동안 평균최고 약량은 360 mg(범위, 160 내지 515 mg)이었다(표3). 모든 기준에서 완전호전은 치료시작후, 평균적으로 47일째(범위, 24 내지 83 일)에 이루어졌다. 뼈골수 기준에 의한 호전-치료중단의 결정요인-가 가장 먼저 이루어졌고, 뒤이어 말초혈 백혈구 및 혈소판의 회복이 이루어졌다. 이번 연구에서 사용한 약량의 범위에서, 반응효능 또는 반응시간에 차이는 별로 없었다. 2번의 치료과정후, 검사한 11명의 환자중 8명에서, PML/RAR-α에 대한 RT-PCR분석이 양성에서 음성으로 바뀌었다.

완전호전상태의 11명 환자 모두 적어도 한번은 호전후 삼산화비소 처리과정을 완수했다. 4명, 2명, 1명의 환자 각자가 전체 3번, 4번, 5번 처리과정을 각각 완수했다. 평균 호전기간은 5+개월(범위, 1 내지 9+개월)이었다. 하지만, 11명의 환자중 3명은 두 번째 치료과정동안 재발했다: 이들 환자에서는 RT-PCR 분석의 변화가 없었고, 각각은 빠르게 약물에 저항성을 나타내는 것으로 보였다. 이들중 2명은 이후 백혈병이 진전되어 사망하였다.

부작용: 이들 연구에서 환자의 임상상태는 매우 다른데, 이것은 이들 환자의 광범위한 선치료를 반영한 것이다. 프로토콜은 입원을 필요로 하지 않았다; 3명의 환자는 외래환자로 전체 유도치료를 완수했고, 다른 한 사람은 정맥 카테테르를 설치할 때만 입원했었다. 하지만, 8명의 환자는 백혈병의 합병증으로 입원했고, 이들 중 5명은 중환자실로 옮겨져, 기관내삽관 및 합병증에 대한 보조 환기를 필요로 했는데, 상기 합병증에는 폐출혈, 신부전, 패혈증, 이식편-대-숙주 질병, 비-특이적 폐 침윤 또는 저혈압이 포함된다. 한 명의 환자는 악성 대사 산과다증, 칼륨과잉혈, 저혈압 상태에서 이차 심장마비가 일어난 후 영구 페이스메이커를 삽입해야 했다. 하지만, 심장 블록은 추가의 삼산화비소 처리에도 불구하고 역류되었다. 약물은 심각한 병발성 합병증으로 인해 5명의 환자에서 평균 2일(범위, 1 내지 5일)동안 일시중단했다. 2명의 환자에서 ″레티논산 증후군″과 유사한 증상이 발생했다; 두 사람 모두 덱사메타손으로 추정치료하여 증세를 호전시켰다. 단지 2명의 환자에서만 혈소판 수혈이 필요치 않았다. 수혈한 혈소판의 평균수는 61(범위, 0 내지 586)이었다.

평균 전체 말초혈 백혈구수는 4,700 cells/cu mm(범위, 500 내지 144,000 cells/cu mm)이었다. 6명의 환자에서 백혈구증가증(예, ≥20,000 cells/cu mm)(범위, 20,800 내지 144,200 cells/cu mm)이 발생했다. 이들 환자에게는 추가의 치료약물이 투여되지 않았고, 모든 경우에 백혈구증가증은 추가의 조정없이 해결되었다. 공통된 부작용에는 주입동안의 경미한 두통, 피로, 근골격통, 경미한 고혈당증이 포함된다. 세명의 환자에게서 말초 신경장애로 인한 이상감각이 발생했다. 하지만, 이들 환자중 2명은 보조환기동안 장기간 움직이지 못했고, 다른 한 명의 환자는 이전에 신경이상의 병력이 있었다.

면역표현형 연구: APL은 CD33을 발현하는 세포에 의해 특징지어지는데, CD33은 미성숙 골수성 세포와 일반적으로 관계하는 항원이다. 삼산화비소치료법은 단지 CD33만을 발현하는 세포의 비율을 점진적으로 감소시키고, CD11b를 발현하는 세포의 비율을 증가시키는데, CD11B는 성숙 골수성 인자와 관계하는 항원이다. 이들 변화는 APL에서 호전을 유도하는 임의의 약물에서 기대할 수 있는 것이긴 하지만, 삼산화비소는 이외에도 동시에 두 항원을 발현하는 세포의 발현을 유도한다. 대개의 경우에, 이들 이중-발현 세포는 골수양 세포 개체군을 주도하고, 임상기준으로 완전호전이 이루어질 때까지 연장된 기간동안 계속 존재한다.

형광 in situ 혼성화분석: 완전호전전후에 환자에게서 뽑은 뼈골수 단핵세포는 CD33 및 CD11b의 공동발현에 대한 유출 혈구계산으로 분류하였다. 형광 in situ 혼성화(FISH)분석을 이용하여, 300개의 세포를 호전초기에 검사하였다. 컨트롤 APL 세포와 유사하게, 대다수의 세포들이 하이브리드 시그널을 보내는데, 이것은 PML과 RAR-α유전자사이의 전좌 및 이들의 종양 클론기원을 암시한다. 하지만, 동일환자에게서 얻은 세포를 호전후기에 동일한 파라메타를 이용하여 분류할 경우, 단지 형광시그널의 정상패턴만 검출되는데, 이것은 정상 조혈 양친으로부터 이들이 분화되었다는 것을 암시한다.

웨스턴 블랏 분석: 뼈골수 단핵세포로부터 단백질 추출물은 웨스턴 블랏 분석으로 연속분석하였다. 상기 분석에서, 카스파제 2,3의 전구형태가 생체내에서 삼산화비소처리에 반응하여 상향조절된다는 것을 알 수 있다. 또한, 이들 치료는 카스파제 1의 절단된 단편의 발현을 유도했는데, 이것은 상기 효소의 활성화를 암시한다. 카스파제 3의 절단된 형태의 발현이 증가한다는 몇 가지 증거가 있다. 이들 실험에서 사용한 항체는 절단된 형태의 카스파제 2와는 반응하지 않는다.

6.3 논의

이번 연구에서, 거의 예외없이, 치료를 받은 환자는 계속해서 여러 번 재발하고, 기존의 화학요법, 레티노이드 또는 뼈골수이식에 저항성을 나타냈다. 이번 연구를 시작할 때, 환자는 수많은 백혈병-관련 합병증에 시달리고 있었는데, 합병증에는 호흡중단, 흩뿌려진 수두 대상포진 감염, 공동성 아스페르길루스증, 만성신부전, 이식편-대-숙주 질환이 포함된다. 또한, 12명의 환자중 5명이 중환자실로 옮겨져, 보조환기와 집중보호를 필요로 했지만, 이들 합병증은 삼산화비소치료법과 직접적인 관련이 없었다.

실제적으로 APL로 확실하게 진단된 모든 환자가 레티노이드 치료와 관련된 조기사망없이 병세가 호전되었다. 비록 모든-트랜스 레티논산 치료법과 비교하여 공통적으로 관찰되는 것이 별로 없긴 하지만, 삼산화비소는 몇 명의 환자에게 림프구증가증을 두드러지게 유도했다. 다른 세포독성 약물을 보류한 직후, 림프구 증가증은 사라지고 환자의 병세는 호전되었다. 3번의 조기재발에도 불구하고, 검사한 11명의 환자중 8명에서 PML/RAR-α(잔존 질병의 분자표지)에 대한 RT-PCR 분석이 음성(NEGATIVE)으로 바뀌었는데, 이런 현상은 모든-트랜스 레티논산 치료법만으로는 거의 일어나지 않는다. 결론적으로 말하면, 삼산화비소는 APL에서 0.06 내지 0.20 mg/kg 약량범위의 세배이상 활성을 보인다.

모든-트랜스 레티논산은 APL 세포의 ″말기″분화를 유도하지만, 삼산화비소의 세포분화효과는 불충분한 것으로 보인다. 비소는 성숙 및 미성숙 세포(즉, CD11b, CD33)모두에서 특징적인 표면항원을 동시에 발현하는 세포개체군을 유도한다. 유도초기에, 이들 세포는 APL을 특징짓는 t(15;17)전좌를 보유한다. 예상치 않게, 이들 세포는 임상적으로 완전한 호전이 이루어진 뒤에도 뼈골수세포에 계속 존재했다; 하지만, 호전이후에, 공동발현세포-여전히 쉽게 검출가능-은 더 이상 in situ 혼성화에 의해 양성을 띠지 않았다. 치료동안 백혈병 세포의 형태특성은 모든-트랜스 레티논산 치료동안 관찰되는 것과 그다지 구분되지 않는다. 사실, 많은 환자의 백혈병세포는 10일이상 형태변화를 거의 보이지 않는데, 이 기간 이후에는 백혈병세포의 비율이 점진적으로 감소했다.

″비-말기″ 분화이후, 삼산화비소는 아팝토시스를 유도하는 것으로 보였는데, 이것은 발현증가 및 시스테인 프로테아제(일명: 카스파제)의 불활성 전구물질에서 활성효소로의 전환과 부합한다. 카스파제 경로는 최근까지 예정된 세포 죽음의 중요한 경로로만 인식되어 왔다. 초기에는 캐노르하브디티스 엘레간스(C.elegans) 단백질 CED-3 및 포유류 인터루킨-1β전환효소(ICE)사이의 상동성으로 인해 인지되었던 카스파제 페밀리는 현재 다수의 폴리펩티드를 절단하는 10개 이상의 상이한 단백질을 포함한다. 백혈병성 세포계에서, 카스파제 활성화는 모든-트랜스 레티논산을 비롯하여 다수의 세포독성 약물로 유도할 수 있다. 이들 효소는 광범위한 단백질분해를 유도하는 점에서, PML/RAR-α이 카스파제 기질임을 알 수 있다.

삼산화비소 및 모든-트랜스 레티논산이 공유하는 최종적인 유사성은 일부 개체에서 임상저항이 급속하게 진전된다는 점이다. 병이 재발한 두 명의 환자에서 뽑은 백혈병세포는 10^-4M TO 10^-7M 범위의 농도에서 시험관내 민감성을 계속 유지했다. 세포내 전달감소에 기인한 비소저항은 박테리아 세포에서 ars 오페론에 의해 인코드된 막 전달물질의 하향조절과 관련하여 기술되었다. 포유류 세포에서 저항은 특성화가 아직 이루어지지 않았지만, 막 전달 또는 발산상의 변형은 중요한 인자로 여겨진다.

요약하면, 삼산화비소는 광범위한 선치료에서 APL이 재발한 환자의 완전호전을 유도한다. 이 약물은 백혈병세포의 부분적이지만 불완전한 세포분화를 유발하여, 이후에 카스파제 활성화 및 아팝토시스가 일어난다. 모든 환자는 이전에 하나 또는 복수의 모든-트랜스 레티논산+앤트라사이클린 항생제+시토신 아라비노시드 과정을 거쳤다. *은 입증된 레티노이드 저항성(즉, 레티노이드가 지속되면서도 재도입 또는 재발에 대한 반응없음)을 가진 개체를 의미한다. +는 조기에 사망한 환자를 의미한다. 다른 치료:^a미톡산트론/에토포시드;^c동종 뼈골수 이식;^b메톡트렉세이트/빈크리스틴/6-멀캡토퓨린;^d9-시스 레티논산+M195(항-CD33 단클론 항체).

7. 실시예: 림프종에서 임상적 용도

B-세포 림프구계에 대한 시험관내에서 삼산화비소의 항종양 효과의 초기발견에 기초하여, 본 발명자는 자가 뼈골수 이식을 비롯하여 다양한 형태의 통상적인 치료에서 중간등급의 세포 림프종이 재발한 환자를 치료하였다. 삼산화비소치료를 시작하기전 급속한 병의 진전에도 불구하고, 삼산화비소 처리는 암성 림프절 및 비자의 크기를 상당히 축소시켰는데(〉50%), 이것은 또한 삶의 질과 향상과 밀접한 관계를 가졌다.

8. 실시예: 비-조혈 암에서의 임상적 용도

삼산화비소는 결장암을 치료하는데 또한 사용하였다. 예비 실험에서, 삼산화비소 치료를 받은 한 명의 결장암 환자에서, 혈청 CEA(태아성 암 항원)수준이 상당히 감소하였다. 환자는 5일동안 체중 kg당 0.1-5 mg 삼산화비소를 매일 섭취하였다. 19,901 ng/ml에서 15,266 ng/ml로 CEA 수준변화(23% 감소)가 관찰되었다. 혈청 CEA가 항종양반응과 연관한다는 것은 공지의 사실이다.

임상자료는 삼산화비소가 또한 결장암과 같은 다른 비-조혈암의 치료에도 사용할 수 있음을 입증한다.

9. 실시예: 약리동태학 연구

몇몇 약량-범위 연구를 실시하여, APL에 걸린 환자와 다른 혈액질환에 걸린 환자에서 As₂O₃의 약리동태(PK) 및 생리적 효과를 검사하였다. APL에 걸린 환자에서, 골수 단핵세포는 아팝토시스 관련 단백질(카스파제 1,2,3)의 면역표현형, 형광 in situ 혼성화(FISH), 웨스턴 블랏 발현을 유출 혈구계산으로 모니터하였다. CD11b, CD33을 동시발현하고, FISH 분석으로 t(15; 17)전좌를 수행하는 세포는 치료동안 점진적으로 증가하고, 완전호전의 초기까지 계속 존재한다. As₂O₃은 또한 카스파제 2, 3 전효소의 생체내 발현 및 카스파제 1,3의 활성화를 유도하였다. 일차비소(As)함양에 대한 혈액 및 오줌의 PK 분석에서, As가 전체 혈액의 혈장 및 적혈구로 분산되는 것으로 밝혀졌다. 평행 제거곡선은 이들 두 개의 소포가 자유롭게 교환가능하고, 최고수치에서 감소하기 시작하여 60분정도 지나면 반감함을 암시한다. 1일째 평균 AUC는 대략 400 nghr/ml였다. 투여된 약량중 대략 20%정도가 첫 24시간동안 오줌으로 회수된다.

이후, APL이 아닌 다른 질병에 걸린 환자에서 약량-범위 연구를 시작하였는데, 이때 매 3-5주의 치료과정당 최고 25일동안의 일일 투여계획을 이용하고, 약량 수준은 체중 kg당 0.1 및 0.15mg/일이 된다. CLL에 걸린 환자(2명), AML에 걸린 환자(3명), 림프종에 걸린 환자(4명), CML에 걸린 환자(1명)를 포함하여, 지금까지, 10명의 환자가 치료되었다. 5명의 환자는 급속한 병의 호전으로 초기에 연구에서 배제하였고, 다섯명은 계획된 25일 과정을 완수했다. 이 약량범위에서, 약물은 잘 받아들여졌다; 부작용에는 피부 발진, 주입동안의 경미한 두통, 피로, EKG에서 QTc 연장이 포함된다. 이런 연구에서, As₂O₃을 임상적으로 사용하면 APL에서 부분적 분화와 아팝토시스가 유도된다는 것이 밝혀졌지만, 이 약물의 치료요법적 효과는 이런 질환에 한정하지 않는다.

본 발명은 이 글에서 밝힌 특정 구체예의 범위에 한정하지 않는다. 실제로, 이 글에서 제시한 것들을 포함하여 본 발명의 다양한 변형은 앞서 밝힌 명세서로부터 당업자들에게 명확해 질 것이다. 이런 변형은 아래의 청구항의 범위안에 속한다.

이 글에서 언급한 다양한 자료는 여기에 순전히 참고문헌으로 한다.

Claims

사람에서 급성 골수성 백혈병을 치료하는 방법에 있어서, 삼산화비소의 제약학적 효과량을 급성 골수성 백혈병에 걸린 사람에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
사람에서 만성 골수성 백혈병을 치료하는 방법에 있어서, 삼산화비소의 제약학적 효과량을 만성 골수성 백혈병에 걸린 사람에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
사람에서 고형암을 치료하는 방법에 있어서, 삼산화비소의 제약학적 효과량을 고형암에 걸린 사람에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 고형암은 소화관, 연조직, 식도, 간, 위, 결장, 폐, 피부, 뇌, 뼈, 유방, 또는 전립선의 암인 것을 특징으로 하는 방법
사람에서 레티노이드 치료에 내성을 보이는 백혈병을 치료하는 방법에 있어서, 삼산화비소 또는 멜랄소프롤의 제약학적 효과량을 이를 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
사람에서 백혈병, 림프종 또는 고형암을 치료하는 방법에 있어서, 멜랄소프롤의 제약학적 효과량을 이를 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, 일일 2.5 내지 4.5 mg의 삼산화비소를 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, 사람의 체중 kg당 0.15 mg의 삼산화비소를 일일 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, 삼산화비소는 정맥주입으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항, 2항 또는 5항에 있어서, 삼산화비소의 투여는 뼈골수호전이 사람에서 관찰될 때까지 매일 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 3 내지 6주동안 치료를 일시중단하고, 최고 25일동안 주당 5번 내지 7번 삼산화비소의 일일투여를 재개하는 단계를 한번 내지 10번 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항, 2항 또는 5항에 있어서, 모든-트랜스 레티논산은 또한 사람에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항 또는 4항에 있어서, 삼산화비소의 투여는 5일동안 매일 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13항에 있어서, 한달에 한번 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 사람의 체중 kg당 0.5 내지 5 mg의 멜랄소프롤을 일일 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
사람에게 투여하기 적절한 제약학적 멸균조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 조성물은 삼산화비소로 이루어지고, 상기 방법은

(a) 삼산화비소를 수용성 용액에 용해시키고, 이때 pH는 12이상이 되고;

(b) 삼산화비소 용액을 염산으로 중화하여 pH가 8.5정도 되게 하고;

(c) (b)단계에서 얻은 삼산화비소 용액을 제약학적 담체에서 희석하고, 상기 담체는 안정화시켜 pH를 7정도로 낮추고;

(d) 제약학적 조성물을 멸균하는 것을 특징으로 하는 방법.
사람에게 주사하기에 적절한 제약학적 멸균조성물에 있어서, 제약학적으로 수용가능한 담체에 녹인 삼산화비소 및 포도당으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 17항에 있어서, 1mg/ml의 삼산화비소를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.