KR19990007943A - 말초 감각 구심 작용을 변성할 수 있는 클로스트리디알 독소유도체 - Google Patents

말초 감각 구심 작용을 변성할 수 있는 클로스트리디알 독소유도체 Download PDF

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KR19990007943A
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clostridial neurotoxin
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키이스 알란 포스터
마이클 존 더간
클리포드 찰스 숀
Original Assignee
존 찰스 데이비스
더스페이우드라보라토리리미티드
제이 엠 하커
마이크로바이올로지컬리써치오쏘리티
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Abstract

본 발명은 말초 감각 유입물에 특이적인 제제에 관한 것이다. 이 제제는 1차 감각 유입물로부터의 신경전달물질 또는 신경조절물질의 방출을 조절하여 1차 감각 유입물과 투사 뉴런 간의 시그널 전달을 억제할 수 있다. 이 제제는 통증, 특히 만성 통증의 처치를 위한 약제에 또는 약제로서 유용하다.

Description

말초 감각 구심 작용을 변성할 수 있는 클로스트리디알 독소 유도체
지금까지, 촉감은 오감 중의 하나로 인식되어 왔으나, 실제로 상당히 복잡하고, 수많은 다른 감각을 변환시켜 왔다. 이러한 감각은 분화된 갖가지 신경의 끝부분과 연계된 조직에 의해서 말초 부위에서 인지되었다. 이들의 일부는 접촉, 압박, 진동 및 머리카락이나 수염의 변형과 같은 여러종류의 무의식적인 자극에 대해 특유하다. 다른 신경 집단은 열과 냉기에 의해 작용하게 되는 다른 섬유조직과 함께 온도를 인지할 수 있다. 게다가 신경 끝 부위의 개체군 집단은 부드러운 자극에 대해서는 보통 흥분하지 않지만, 강한 자극에 대해서는 흥분을 한다. 이러한 종류의 지작 신경은 하나의 자극 보다는 많은 자극에 대해 종종 반응을 하며, 이것은 고역 폴리모달(polymodal) 섬유조직으로서 알려져 있다. 이들은 잠재적으로 손상 상황이나 물체 대상을 지각하는데 사용된다. 상기 폴리모달 섬유조직은 까다로운 것으로 알려진 “강렬한” 감정과 같은 화학적인 신호를 변환시키게 된다. 따라서, 촉감은 물체 대상의 매우 상세한 묘사를 전달할 수 있으며, 사건의 알림과 경고를 하는데 보탬이 된다.
말초 부위에서 감각으로의 지각 신호 변환은 다중 신경 단위적 경로와 뇌의 정보 처리센타에 의해서 달성된다. 지각 자극의 전달에 포함되어 있는 상기 경로의 제 1신경 세포는 소위 제 1 지각 구심성 신경이라 부른다. 머리로 부터의 제 1 지작 구심성 신경을 위한 세포체부와 일부 내부기관에는 두 개골 신경과 연계되어 여러개의 신경절, 특히 3차 신경 세포핵과 단생관의 세포핵이 존재한다. 신체의 나머지 부분에 대한 제 1 지각 구심성 신경을 위한 세포체부는 척주의 배근 신경절에 놓여 있다. 제 1 지각 구심성 신경과 그의 처리는 조직학적으로 분류되어 왔으며, 세포체부는 두 개의 분류에 속한다. A-타입은 큰(60 내지 120 ㎛의 직경) 반면에 B-타입은 아주 작고(14 내지 30 ㎛), 셀수 없을 만큼 많다. 이와 유사하게 그 처리는 두 개의 두 개의 범주에 속한다. C-섬유조직은 A-섬유조직을 소유하고 있는 미엘린(myelin) 덮개가 부족하다. A-섬유조직은 추가로 Aβ-섬유조직으로 세분할 수 있다. 이 Aβ-섬유조직은 직경이 크고, 잘 발달된 미엘린이고, Aδ-섬유조직은 얇고 잘 발달되지 못한 미엘린이다. 일반적으로 Aβ-섬유조직은 A-타입 세포체부로부터 발생하게 되고, Aδ-섬유조직과 C-섬유조직은 B-타입의 세포체부로부터 발생된다. 이들 분류는 분자량 표시범위의 선택적인 표현을 연구함으로써 더 확장시켜 세분할 수 있다.
기능적인 분석은 정상적인 환경하에서 Aβ-섬유조직이 촉감 및 적당한 온도 식별을 전달하는 것을 가르키는 반면에, C-섬유조직은 주로 상기에 언급한 폴리모달 고역 섬유조직과 같다. Aδ-섬유조직의 역할은 고역 및 저역에서 여러 가지 민감한 방법을 가지는 것 처럼 보임으로써 보다 분명치 않다.
제 1 지각 구심성 신경의 활성화 이후에, 지각 신호의 변환시 그 다음 단계는, 시상 세포핵과 같은 중앙 신경시스템의 보다 높은 부위로 신호를 운반하게 되는 돌출 뉴런의 활성화이다. 이들 뉴런의 세포체부(두개골 신경으로 언급했던과는 다름)는 척수의 후각(後角)에 위치한다. 이것은 또한, 제 1구심성 신경과 돌출 뉴런 사이에 시냅스가 위치하는 곳에 있다. 상기 후각은 엷은 조각층 Ⅰ 다음에 엷은 조각층 Ⅱ이 적층되어 있는 일련의 엷은 조각층으로 조직되어 있다. 제 1구심성 신경의 다른 분류는 다른 엷은 조각층에 시냅스를 만든다. 피부의 제 1구심성 신경에 대해, C-섬유는 엷은 조각층 Ⅰ,Ⅱ에 시냅스를, 엷은 조각층 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅴ에 Aβ-섬유조직을, 엷은 조각층 Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ에 Aβ-섬유조직을 만든다. 보다 깊은 엷은 조각층(Ⅴ-Ⅶ,Ⅹ)은 근육 및 내장과 같은 보다 깊은 조직에서부터 도착하는 지각 통로에 포함되도록 생각하게 된다.
제 1구심성 신경과 돌출 뉴런 사이의 시냅스에 있는 우세한 신경전달물질은 글루타메이트이고, C-섬유조직이 물질 P와 펩타이드와 관련된 칼시토닌-젠(CGRP)와 같은 여러개의 뉴로펩타이드를 포함한다. A-섬유조직은 어떤 환경하에서도 뉴로펩타이드 Y와 같은 뉴로펩타이드를 발현하게 될 수도 있다.
이들 시냅스의 전달 효율은 강하하는 경로를 통해서 그리고 척수에 있는 국부적인 내부신경에 의해서 변경될 수 있다. 이들 변조 뉴런은 억제(예를 들면, 오피오이드 펩타이드, 글리신) 또는 흥분(예를 들면, 산화질소, 콜레시스토키닌)시킬 수 있는 다수의 매개자를 방출하여, 감각의 자각을 향상시키거나 감소시키기 위한 메카니즘을 제공하게 된다.
이러한 생리적인 변화가 요구되는 감각의 카테고리가 진통이다. 이 진통은 상해 또는 병을 경고할 수 있는 감각이며, 이러한 것은 매일매일의 생활에서 중요한 것이다. 거기에는 때가 있지만, 모르게 할 필요도 있으며, 생리학적으로 이것은 예를 들어 오피오이드 펩타이드의 작용이다. 불행히도, 이러한 생리학적인 메카니즘에도 불구하고, 그의 이용이 지나간 후 병을 앓는 동안 또는 상처를 입은 후에도 진통은 계속될 수 있다. 이러한 환경하에서, 진통은 질병의 증상을 좀더 완화시키게 한다.
임상적으로 진통은 3가지 카테고리로 나눌 수 있다. (1) 상처가 아물 때 사라지기를 기대하는 상처나 외과적인 수술로부터 야기되는 격렬한 진통; (2) 악성 질환으로부터 야기되는 만성적 진통; 암을 가진 대다수의 사람들은 심한 고통에 대해 절제를 하며, 이러한 고통은 질병에 대한 성공적인 치료나 환자의 죽음에 의해서만이 해결되게 된다. (3) 악성 질환에 의해서 야기되지 않는 만성적 진통; 이것은 이질적인 병으로서 관절염과 말초 신경장애를 포함하는 여러 가지 병에 의해서 야기되어진다. 즉, 진통의 수준이 상승되면서 오래갈 수 있지만, 생명에 지장을 주는 것은 아니다.
조직 손상에 기인한 생리학적인 진통은 중심 신경성 시스템 결함에 의해서 야기되는 것 보다 훨씬 낫게 이해되었다. 정상적인 환경하에서, 진통에 이르게 되는 감각은 고역 신호를 운반하는 Aδ-와 C-섬유조직에 의해서 먼저 변환된다. 따라서, 엷은 조각층 Ⅰ과 Ⅱ에 있는 시냅스는 글루타메이트와 C-섬유조직에 의해서 방출되는 펩타이드를 사용하는 진통 신호의 전달에 포함되어 있어 적당한 돌출 뉴런의 활성화를 생성하게 된다. 그러나, 일부 만성적 진통에서 다른 A-섬유조직(Aβ-섬유조직을 포함함)이 진통 신호를 운반할 수 있다는 것을 말하며, 따라서, 예를 들어, 신경병 진통와 연계된 통각과민과 심장쇠약에서 제 1유해 수용기의 구심성 신경으로서 작용하게 된다. 이러한 변화는 A 섬유조직에 있는 뉴로펩타이드 Y와 같은 펩타이드의 발현과 연계되어 왔다. 여러 가지 만성적 진통 조건시, 돌출 뉴런와 함께 여러 가지 지각 구심성 신경의 시냅스는 여러 가지 방법으로 변성될 수 있는 바, 다수의 시냅스의 증가에 따라 형태학적으로 변할 수 있고, 다른 펩타이드의 수준과 비율이 변할 수 있으며, 돌출 뉴런의 감도도 변할 수 있다.
통증에 의해 제공된 거대한 임상 문제로 인하여, 그 완화를 위한 방법을 찾는데 상당한 노력이 소모되었다. 이러한 통증의 완화를 위하여 주로 사용되는 약제는 두 개의 카테고리로 나눌 수 있는데, (1) 아스피린과 이브프로펜 등의 비스테로이드성 항염증 의약(NSAIDs)과 (2) 몰핀 등의 오피오이드(Opioid)가 있다.
NSAIDs는 손상된 조직에 의해 프로스타글란딘의 제조를 억제하여 말초에서 그들의 주진통제 작용을 갖는다. 프로스타글란딘은 고통과 염증의 말초 매개체인 것으로 나타났고, 그들의 농도의 감소가 환자를 구제하는 것으로 제공된다. 이것은 염증이 통증의 주 원인인 약한 관절 질병의 경우에 특별하다. 프로스타글란딘은 척추 대(帶)와 뇌에서 통증의 중개를 포함하는 것으로 제시되었고, 이것은 어떻게 NSAIDs가 염증 또는 말초 조직 손상을 포함하지 않는 일부 통증 상태에서 진통 효과를 갖는지를 설명할 수 있다. 그러나, 프로스타글란딘은 고통의 여러 가지 중개자의 하나이며, NSAIDs는 단독으로 허용가능한 수준으로 약한 통증의 일부 타입을 감소하는 효과만을 갖는다. 이들은 증가한 투여량이 통증 구제의 증가를 주는 것 없이 상기한 활성의 상한치를 갖는 것으로 간주된다. 또한 이들은 만성 호소의 그들의 유용함을 한정하는 부효과를 갖는다. NSAIDs의 사용은 위(胃)-장(腸) 트랙의 자극관 관련되고, 지나친 사용은 창자의 큰 궤양의 전개를 이끌어낼 수 있다. 이것은 예를 들면, 관절 환자의 큰 무리를 형성하는 노인 환자에서 특히 사실이다.
오피오이드(Opioids)는 초기 유해수용 섬유(주로, C-섬유) 및 보호 신경 사이에 신경전달의 효율을 금지하기 위하여 척추 대의 수준에서 작용한다. 그들은 이들 시냅스의 모든 엘레멘트의 연장된 고분극을 일으키는 것을 성취한다. 오피오이드의 사용은 급성 통증과 만성 악성 통증의 대부분의 타입을 완화하는데 효과적이다. 그러나, 오피오이드 무통각에 대해 부분적으로 또는 완전하게 내화성인 다수의 만성 악성 통증 상태는 특히, 종양 형성등의 신경 압축을 포함하는 것들이다. 또한, 불행하게도 오피오이드는 (1)뇌 스템의 호흡의 중심의 수준에서 호흡 시스템의 저하, (2)위-장 트랙의 부드러운 근조직에 다양한 영향을 갖는 변비의 유도, 및 (3) 진정과 다행증의 유도를 포함하는 정신활성 효과를 포함하는 바람직하지 않은 시스템성 부효과를 갖는다. 이들 부효과는 무통각증을 일으키느느 것들과 유사한 투여량에서 일어나고, 따라서 환자에 주어질 수 있는 투여량을 한정한다.
척추 수준에서 오피오이드의 전달은 부-효과 프로파일을 감소할 수 있으나, 빈번하게 반복되는 척추의 주입 또는 카테테르의 고정, 환자에 증가된 위험을 실행하는 모든 것을 요구한다. 카테테르의 고정은 환자가 침대에 실질적으로 한정되고, 따라서 삶의 질을 한정하는 것을 요구한다.
만성 고통의 일부 다름 타입의 치료를 위한 오피오이드의 사용은 일반적으로 효과적이지 않거나 또는 바람직하지 않다. 실시예는 신경 손상 후, 전개하는 류마티스성 관절염 및 신경종과 관련한 통증을 포함한다. 이들 환자의 오피오이드 치료의 바람직하지 못한 특성은 이미 상기 언급한 부-효과 뿐만아니라, 질병의 있을 만한 기간 동안, 또한 오피오이드의 주요 4가지 부효과(약물의존상태(dependence)에 관련된다. 몰핀과 헤로인과 같은 오피오이드는 육체적인 약물의존상태를 유발하는 남용 약제로 잘 알려져 있고, 이 마지막 부효과는 내성(동일한 마취 효과를 일으키도록 요구되는 약제의 투여량이 시간에 따라 증가하는)의 전개를 포함한다. 이것은 통증을 경감하는데 요구되는 투여량이 첫 번째 3가지 부효과로 인하여 삶을 협박하는 상태를 유발할 수 있다.
NSAIDs 및 오피오이드가 통증의 치료에 유용함을 갖을지라도, 이들이 일반적으로 통증, 특히 만성 및 심한 통증의 적합한 치료를 위해 종종 적당하지 않다.
또한, 말초 신경으로부터 배근(背根) 부분과 대(帶)를 통해 뇌하수체 파괴로 여러 가지 수준에서 통증 경로의 외과적인 병변을 포함하는 만성 심한 통증의 치료를 위해 사용된다. 그러나, 이들은 환자에 상당한 위험과 관련한 모든 가장 심한 조작이 된다.
따라서, 많은 타입의 통증의 치료를 위한 제약학적인 새로운 종류의 전개를 위한 커다란 필요성이 남아있음을 볼수 있다. 이런 신규한 치료제의 바람직한 특성은 다음과 같이 (1):심한 통증을 포함하는 통증의 큰 구제를 제공하는 능력;(2):환자의 삶의 질을 크게 손상시키는 시스템성 부효과의 결핍;(3):환자의 빈번한 주입 또는 오랜기간의 카테테르가 요구되지 않는 긴-지속성 작용;(4):내성 및 관련된 약물의존 상태를 유발하지 않는 제제의 공급량을 간단하게 나타낼 수 있다.
발명의 진술
본 발명은 말초 신경계로부터 중추 신경계로 통증 신호의 전달을 감소 및 바람직하게는 억제할 수 있으므로써, 통증의 감각을 완화할 수 있는 약제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유해수용 구심원으로부터 투사 신경으로 통증 신호의 전달을 감소 및 바람직하게는 억제할 수 있는 약제를 제공할 수 있다. 더욱 특히, 본 발명은 유해수용 구심원의 적어도 하나의 카테고리에서부터 적어도 하나의 신경전달체 또는 신경조절자 기질의 엑스시토시스(exocytosis)를 금지할 수 있는 약제를 제공할 수 있다.
본 발명의 첫 번째 개념은 시스템식으로 투여될 수 있고, 신경의 시냅스 말단으로부터 적어도 하나의 신경전달체 또는 신경조절자의 해방을 방지하는 유해수용 구심원의 한정된 집단을 특별하게 타겟으로 할 수 있는 약제를 제공한다.
본 발명의 두 번째 개념은 말초에서 국소 투여될 수 있고, 말초로부터 통증 신호를 전달하는 유해수용 구심원의 시냅스 말단으로부터 적어도 하나의 신경전달체 또는 신경조절자의 해방을 방지하는 것이 가능한 약제를 제공한다.
본 발명의 세 번째 개념은 척추 코드로 투여될 수 있고, 척추 코드의 영역중 전달하는 유해수용 구심원의 시냅스성 말단으로부터 적어도 하나의 신경전달체 또는 신경조절자의 해방을 방지할 수 있는 약제를 제공한다.
본 발명의 네 번째 개념은 약제의 효과가 셀 타입으로 한정되도록 구심의 산경의 한정된 집단을 특별히 타겟화할 수 있는 약제를 제공한다.
본 발명의 다섯 번째 개념은 본 발명에 따른 약제의 효과적인 투여량을 투여하는 것으로 이루어지는 통증의 치료의 방법을 제공한다.
본 발명의 여섯 번째 개념은 약제가 약제의 요구된 성분을 포함하는 융화 단백질로 재결합식으로 표현될 수 있다.
정의
다음의 정의로 한정되는 것이 없으면, 본 설명은 다음의 항이 다음의 의미를 갖는다.
라이트 사슬은 클로스트리디얼(clostridial) 신경소를 형성하는 두 폴리펩티드 사슬의 작은 것을 의미한다. 이것은 약 50kDa의 분자 질량을 갖고 L-사슬 또는 간단한 L로 통상 언급된다.
헤비 사슬은 클로스트리듐속의 신경독소을 형성하는 보다 큰 두개의 폴리펩티드 사슬을 의미하고, 이것은 대략 100kDa의 분자량을 가지며, 보통 H-사슬 또는 간단히 H로 언급된다.
Hc단편은 H-사슬의 아미노-말단 반과 대략 동등한 클로스트리듐속의 신경독소의 H-사슬로부터 유도된 단편, 또는 완전한 H-사슬에서 그 단편과 일치하는 도메인을 의미한다. 이것은 모터 뉴런에 결합하여 포함된 천연 독성의 도메인을 포함한다.
HN단편는 H-사슬의 아미노-말단 반과 대략 동등한 클로스트리듐속의 신경독소의 H-사슬로부터 유도된 단편, 또는 완전한 H-사슬에서 그 단편과 일치하는 도메인을 의미한다. 이것은 L-사슬 교차 적혈구 내질 멤브레인의 전좌에 포함된 천연 독성의 도메인을 포함한다.
LHN은 L-사슬을 포함한 클로스트리듐속의 신경독소으로부터 유도된 단편, 또는 HN단편에 커플된 이들의 기능적인 단편을 의미한다. 이것은 주로 단백질 분해에 의해 완전한 신경독소으로부터 유도된다.
표적 부분(Targeting Moiety)(TM)은 약품과 일차 감각 유입물의 표면 사이에 물리적 회합을 일으키는 결합 부위와의 기능적으로 상호작용하는 모든 약품의 화학적 구조를 의미한다.
결합 부위(BS)는 외인성 분자가 세포와 물리적 회합을 일으키는 방식으로 상호작용할 수 있는 세포의 표면에 대한 구조를 의미한다.
일차 감각 유입물은 중추 신경 시스템을 향해 외부로부터 감각 정보를 운반할 수 있는 신경세포이다.
일차 유해수용성(nociceptive) 유입물은 중추 신경 시스템을 향해 외부로부터 감각 정보를 운반할 수 있고, 여기서 정보가 통증의 감각을 일으킬 수 있는 신경 세포이다.
본 발명은 말초 구심성 신경 기능을 변성시킬 수 있는 신규한 약품에 관한 것이다. 이 약품은 뉴런의 분리된 개체군으로부터 방출되는 신경전달물질을 억제시켜서 감소시키거나 말초진통섬유조직에서 중심진통섬유조직으로의 구심성 신경 진통신호의 전달을 예방할 수 있다. 이 약품은 진통 치료를 위한 약제로서 사용될 수 있다.
도 1은 BoNT/A로부터 유도된 신경 성장 요소(NGF)와 유도된 LHN사이에 커플링 반응의 생성물을 크기-배제 크로마토그래피하여 얻은 분획(fraction)의 SDS-PAGE 분석의 쿠마시 스테인(Coomassie stain)을 나타낸다.
도 2는 환원 및 비-환원 조건하에서 NGF와 LHN의 공역의 SDS-PAGE 분석의 쿠마시 스테인을 나타낸다.
도 3은 BoNT/A의 L-사슬에 의해 SNAP-25의 단백질분해 생성물을 인식하는 항체로 탐침된 NGF와 LHN의 공역으로 처리된 PC12 세포로부터 얻은 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 4는 BoNT/A의 L-사슬에 의해 SNAP-25의 단백질분해 생성물을 인식하는 항체로 탐침된 NGF와 LHN의 공역으로 처리된 랫트 배쪽 루트 교감신경의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
말초, 유해수용성 유입 뉴런으로부터 투사(projection) 뉴런으로의 통증 신호의 전달을 감소 또는 방지하기 위한 약품은 통증의 감각, 특히, 혹독하고 만성적인 통증의 감소에서 많은 잠재적인 적용을 갖는다는 것을 알 수 있다.
본 발명에 따라서, 적어도 하나의 신경전달물질 또는 신경조절물질의 방출 또는 유해수용성 유입물의 시납스 말단으로부터 모든 것을 억제할 수 있는 약품을 제공하는 것이다.
약품은 다수의 불연속적인 기능을 갖는다;
1)이것은 어느 정도의 특이성을 갖는 유해수용성 유입 뉴런의 특징적인 표면 구조(결합 부위[BS])에 결합한다.
2)이것은 뉴런에 들어간다. 세포로의 분자의 진입은 엔도시토시스(endocytosis) 의 과정에 의해 발생할 수 있다. 일정한 세포 표면 BSs만 엔도시토시스를 진행하고, 바람직하게 약품이 결합하는 BS가 이들중의 하나이다. 본 발명의 한 면에서, BS는 유해수용성 유입 뉴런의 외면의, 감각적인 섬유에 존재하고, 내계투사(internalization)에 이어서 약품이 뉴런의 이들 영역으로 전달되는 방식으로 세포체와 뉴런의 중심 과정으로 퇴행의 이송이 진행된다. 본 발명의 또다른 면에서, 약품이 결합하는 BS는 유해수용성 유입 뉴런의 중심 과정 또는 세포체에 존재한다.
3)약품은 시토졸에 들어간다.
4)약품은 시납시스 말단으로부터 적어도 하나의 신경전달물질 또는 신경조절물질의 방출을 감소시키거나 또는 바람직하게 방지하는 방식으로 이들 뉴런의 중심 과정의 시납시스 말단에 존재하는 엑소시토시스 기구(exocytotic machinery)의 구성요소를 변형한다.
놀랍게도, 본 발명의 약품은 클로스트리듐속의 신경독소 또는 이것의 단편을 변형시키는 것에 의해 제조될 수 있다.
클로스트리듐속의 신경독소은 150kDa 정도의 분자량을 갖는 단백질이다. 이들은 다양한 종류의 유사 클로스트리듐(Clostridium), 가장 중요한 씨. 테타니(C. tetani), 및 씨.보출리늄(C. botulinum)의 여러 가지 스트레인에 의해 제조될 수 있다. 현재 8가지 다른 부류의 공지된 신경독소, 예를 들면 혈청형 A, B, C1, D, E, F 및 G의 테타누스(tetanus)독, 및 보출리늄(botulinum) 신경독소이 있고, 이들 모두는 유사한 구조 및 작용 방식을 공유한다. 클로스트리듐속의 신경독소은 디설피드 결합에 의해 함께 합쳐진 두개의 폴리펩티드 사슬을 형성하기 위해 후반-해석적으로 변형된 단일 폴리펩티드로서 박테리아에 의해 합성된다. 두 개 사슬은 헤비 사슬(H)로 명명되고, 이것은 대략 100kDa의 분자량을 가지면, 라이트 사슬(L), 이것은 대략 50kDa의 분자량을 갖는다. 클로스트리듐속의 신경독소은 신경근 연합에서 모터 뉴런의 세포 멤브레인상의 수용체 부위에 결합하고, 엔도시토시스 메카니즘에 의해 내계투사된다. 내계투사된 클로스트리듐속의 신경독소은 세개의 단백질, 시납토브레빈, 신타신(syntaxin) 또는 SNAP-25의 적어도 하나와 결합한 특이성 펩티드를 가수분해하는 높은 특이성 아연-의존 엔도펩티다제 활성을 갖고, 이것은 신경분비 방법의 결정적인 요소이고, 클로스트리듐속의 독성의 이 활성은 연장된 근육 마비를 초래한다. 클로스트리듐속의 신경독소의 아연-의존 엔도펩티다제 활성은 L-사슬에 잔류한다는 것이 밝혀졌다. 클로스트리듐속의 신경독소은 이들 뉴런에 있는 특이성의 수용 부위에 기인하여 모터 뉴런에 대해 매우 선택적이다. 클로스트리듐속의 신경독소의 활성을 결합한 특이성 신경근 연합은 디사슬(dichain) 신경독소 분자의 헤비 사슬 성분의 카르복시-말단 부분, Hc로서 알려진 영역에 잔류한다고 알려져 있다.
놀랍게도, 신규한 분자 또는 부분, 즉 감각 신경의 표면에서 BS에 결합하는 표적 부분(TM)에 클로스트리듐속의 신경독소 또는 두개의 클로스트리듐속의 신경독소의 하이브리드을 공유적으로 연결하는 것에 의해, 유해수용성 유입물로부터 신경전달물질 또는 신경조절물질중 적어도 하나를 방출하는 것을 억제할 수 있는 신규한 약품이 생산된다. 본 발명의 추가적인 놀라운 면은 클로스트리듐 속의 신경독소의 L-사슬, 또는 엔도펩티타제 활성을 포함한 L-사슬의 단편이 감각 신경의 세포질로 L-사슬, 또는 이들의 단편의 내계투사를 또한 효과적으로 할 수 있는 TM에 공유적으로 연결되는 경우, 이것은 또는 적어도 하나의 신경전달물질 또는 신경조절물질의 방출을 억제할 수 있는 신규한 약품을 또한 제조할 수 있다. 약품의 구성 부분을 연결하는데 사용되는 공유 연결은 적절한 스페이서 영역을 포함한다.
TM은 유해수용성 유입 뉴런에 BS를 위한 특이성을 제공한다. 약품의 TM 구성분은 많은 세포 결합 분자, 이것으로 제한하지 않지만 호르몬, 시토킨, 성장 인자 또는 신경펩티드를 위한 수용체에 대한 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편(Fab, F(ab)'2, Fv, ScFv, 등), 렉틴 및 리간드를 포함한다. 가능한 TM의 명단을 표 1에 나타내며, 이 명단은 예시적이고, 본 발명의 요구를 충족할 수 있는 TM의 범위를 한정하지 않는다. 본 발명의 하나의 구현예에서, TM은 퇴행의 이송을 진행하는 BS에 결합한다.
본 기술에서, 신경독소 분자의 HC부분은 LHN으로 알려진 단편을 제공하기 위해 HN단편이 신경독소의 라이트 사슬(L-사슬)에 결합된 디설피드에 남아있도록 HN으로 알려진 헤비 사슬의 다른 부분으로부터 제거될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현예에서, 클로스트리듐속의 신경독소의 LHN단편이 하나 또는 그 이상의 스페이서 영역을 포함할 수 있는 결합을 사용하여 TM에 공유적으로 연결된다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 클로스티리듐속의 신경독소의 HC도메인은 신경근 연합에서 수용체에 대한 신경독소를 결합하는 능력을 감소시키기거나 또는 바람직하게는 부적합하게 하도록 화학적 변형을 통해, 변이되거나 변형된다. 이 변형된 클로스트리듐속의 신경독소는 1 이상의 스페이서 영역을 포함할 수 있는 결합을 사용하여 TM에 공유적으로 결합된다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 신경독소를 신경근 연합에서 수용체와 결합시키는 능력을 감소시키거나 바람직하게 부적합하게 하는 클로스트리듐 속의 신경독소의 헤비 사슬(여기에서 HC도메인이, 예를들면 화학적 변형에 의해서 변이되고 변형된다) 은 다른 클로스트리듐 신경독소의 L-사슬과 결합한다. 혼성, 변형된 클로스트리듐 신경독소은 하나 또는 그 이상의 스페이서 영역을 포함할 수 있는 연결을 사용하여 TM 에 공유적으로 연결된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 클로스트리듐속의 신경독소의 HN부분은 다른 클로스트리듐속의 신경독소의 L-사슬과 결합된다. 이어서, 혼성 LHN은 하나 또는 그 이상의 스페이서 영역을 포함할 수 있는 연결을 사용하여 TM 에 공유적으로 연결된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 클로스트리듐속의 신경독소의 라이트 사슬, 또는 엔도펩티다제 활성을 함유하는 라이트 사슬 단편은 하나 또는 그 이상의 스페이서 영역을 포함할 수 있는 연결을 사용하여 라이트 사슬, 또는 엔도펩티다제 활성을 함유하는 그들의 단편이 세포의 시토플라즘속으로 또한 내부이행하게 할 수 있는 TM 에 연결된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 약품은 어느 바람직한 스페이서 도메인에 추가하여 표적 부분(Targeting Moiety)의 적당한 단편을 포함하는 융합 단백질로 재결합적으로 표현된다. 재결합적으로 표현된 약품은 한 혈청형의 신경도를 인코딩하는 유전자로부터 전체적으로 유도될 수 있고, 또는 두 개의 다른 혈청형을 인코딩하는 유전자로 부터 유도된 키마에라(chimaera)일 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상이한 클로스트리듐속의 독소유형으로 부터 L 및 HN의 혼성일 수 있는 요구된 LHN은 TM 과 융합단백질로 재결합적으로 표현되고, 또한 하나 또는 그 이상의 스페이서 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 클로스트리듐속의 신경독소의 라이트 사슬, 또는 엔도펩티다제 활성을 함유하는 라이트 사슬의 단편은 라이트 사슬, 또는 엔도펩타다제 활성을 함유하는 그들의 단편을 세포의 시토플라즘속으로 내부이행하게 할 수 있는 TM 과 융합 단백질로 재결합적으로 표현된다. 표현된 융합 단백질은 또한 하나 또는 그 이상의 스페이서 영역을 포함할 수 있다.
본 명세서의 기초는 제한되고 한정된 뉴런 부류(일차 감각기관 유입물)에 반해서 매우 특별하고 한정된 활성을 갖는 신규한 약품의 창조이고, 이렇게 약품은 신경독소의 형태를 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 천연 보틀리늄 신경독소의 치료학적 사용은 이전 기술에 있어서 잘 공지되어 있다. 보튤리늄 신경독소의 활동양식은 이전 기술에 설명된 바와 같이 아세틸콜린 분비의 억제 메카니즘에 의하고, 및 본명세서에 설명된 약품과는 명확하게 다른 운동성뉴런의 수출인 표적 뉴런의 부문에 반한다. 이전기술은 상기 설명된 약품의 활동성 뿐만 아니라 화학적 구조를 알려주지 못한다. 따라서, 비록 본 출원에서 논의된 바와 같이 이전기술은 천연 클로스트리듐속의 신경독소에 대하여 많은 것을 알려주지만, 천연의 변형되지 않은 클로스트리듐속의 신경독소은 본 명세서의 주제가 아니다. 본 발명의 약품은 이전 기술에서 알려진 표적 특성이 제거되는것 처럼 클로스트리듐속의 신경독소의 변형을 요구한다. 그리고, 천연 클로스트리듐속의 신경독소의 특성과는 다르고 이전 기술에서 알려지지 않은 새로운 생물학적 특성을 갖는 신규한 약품을 제공하기 위해서, 변형된 신경독소은 새로운 표적 기능에 결합된다. 본 명세서의 주제는 신규한 특성을 갖는 새로운 약품이다.
실시예 1
친액성화된 쥐의 2.5 S NGF 를 물을 첨가하여 녹이고 MES 완충액(0.1 M MES, 0.1 M 염화나트륨, pH 5.0)속으로 투석하였다. 이 용액(약 0.3mg/㎖의 농도)에 PDPH(DMF 중 100mg/㎖)를 첨가하여 최종 농도가 1 mg/㎖가 되게 하였다. 혼합 후에 고체 EDAC 를 첨가하여 최종 농도가 0.2 mg/㎖가 되게 하였다. 실온에서 적어도 30 분동안 반응을 진행 시켰다. 이어서, MES 완충액으로 미리 평형을 이룬 PD-10 칼럼(파마시아)에 의해 탈염하여 과량의 PDPH 를 제거하였다.
BoNT/A 의 LHN단편을 숀 씨.씨., 햄블톤, 피., 및 멜링, 제이. (Eur.J.Biochem.167,175-180)의 방법에 의해 본질적으로 제조하였다. 사용된 NGF 무게의 반과 같은 양의 LHN을 약 1 mg/㎖ 의 농도에서 트리에탄올아민 완충액(0.02 M 트리에탄올아민/HCl, 0.1M 염화나트륨, pH 7.8)속에 용해시켰고, 최종 농도 2 mM 에서 트라우트 시약(Traut's reagent)(1M 트리에탄올아민/HCl 중 100 mM 원액, pH 8.0)으로 반응시켰다. 한시간 후에 PD-10 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 LHN을 PBSE(1 mM EDTA 로 완충된 인산염)속으로 탈염화시켰다. 칼럼 용출액으로 부터 단백질 절정(peak)을 마이크로콘 50(Amicon)을 사용하여 약 2 mg/㎖ 의 농도로 한점에 모았다.
유도된 NGF 은 출발 부피의 10％ 이하의 부피로 감소된 마지막 농도단계에 맡겨지고, 유도된 LHN와 실온에서 밤새 혼합되었다. 반응 생성물을 소듐도데실 설페이트(SDS-PAGE) 존재하에 폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 분석하였다.
상기 반응의 결과인 접합체를 바이오-겔 P-100(Bio-Red) 에 걸쳐서 크기 제외 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정화시켰다. 용리 프로필은 280 nm 에서의 광학 농도와 일부분의 SDS-PAGE 분석을 측정하여 하기하였다.
도 1 은 상기한 바이오-겔 P-100 칼럼으로부터 일부분의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 자유 LHN및 접합체 (Mr100kDa 및 상기)는 다수의 자유 NGF (Mr13kDa)로부터 명확하게 분류되었다. 2.5 NGF 가 비공유 상호작용에 의해 형성된 호모-다이머이므로 SDS 로 처리해서 해리되었다. 따라서 단지 하나의 소단위를 통해서 LHN과 공유 가교를 형성한 분자는 SDS-PAGE 분석동안 해리될 것이고 부분 4-6 에서 보여지는 자유 NGF 띠를 만들 것이다. 이 결과는 NGF 의 호모-다이머 구조가 유도화 후에 손상되지 않고 남아있다는 것을 파괴한다. 이들 부분에서 보여지는 자유 LHN는 NGF 와 결합하지 않은 소수의 성분을 나타낸다.
도 2는 감소상태 및 비감소 상태에서의 SDS-PAGE 에 의한 접합체의 분석을 나타낸다. 레인 1 은 비감소 상태하의 자유 LHN,레인 2 는 50 mM 디티오트레이톨과 함께 감소된 동량의 LHN을 나타낸다. 레인 3 및 4 는 디티오트레이톨에 의한 (레인 3)의 감소가 없거나 또는 (레인 4)의 감소가 있는 크기 제외 크로마토그래피 후에 접합체를 나타낸다. 유사하게, 레인 5 및 6 은 각각 감소가 없거나 또는 감소가 있는 NGF 를 나타낸다. 상기 결과는 외관상 분자 질량이 100 kDa 이상인 레인 5 의 물질은 감소중에 단지 LHN및 NGF 의 성뷴띠만을 만들어 낸다. 추가로, 감소에 따른 띠의 강도는 감소되지 않은 샘플에서 관찰된 소량의 자유 LHN및 NGF 과는 다른 물질로부터 유도되었음에 틀림없는 띠와 같다. 초과량을 위한 오로지 가능한 원료는 외관상 분자의 질량이 100 kDa 이상인 물질이다. 따라서, 다음의 크기 제외 크로마토그래피로부터 얻어진 부분의 접합체는 감소가능한 디설파이드 연결에 의해 공유적으로 연결된 NGF 및 LHN을 나타낸다.
접합체를 함유하는 부분은 요구될 때까지 4℃에서 저장되었다.
실시예 2. PC-12 세포 내의 NGF와 LH N 의 접합 활성
PC12 세포는 신경 기능의 연구의 모델 시스템으로 일반적으로 사용되는 신경외배엽의 유도 세포계이다. NGF와 LHN의 접합 기능을 테스트하기 위한 모델 시스템으로서 이들은 2가지 필요한 특성을 갖고 있다: 첫째로, 이들은 저농도 NGF에 따라 분화 방법에 관련되어 있는 것으로 보여지는 NGF에 대한 세포-표면 수용기를 갖는 것으로 알려져 있다. 둘째로, 이들은 신경송신기 방출(중요한 예로는, SNAP-25를 비롯하여)에 대한 외세포성 기구를 함유하는 것으로 보여진다.
PC12 세포를, 밀도가 웰(well) 마다 약 5×105세포인 MATRIGEL 기초 막 기질(Collaborative Biomedical Products)로 피복되어 있는 24-웰 플레이트에 얇게 펼쳐 놓았다. 배양 몇일 후(2mM 글루타민, 10% 말 혈청 및 5% 태내 송아지 혈청으로된 RPMI 1640, 37℃, 5% CO2) 배지를, 접합체(실시예 1에 기재한 대로 제조) 또는 LHN이 첨가되어 있거나 또는 첨가되어 있지 않은 신선한 배지로 교체하였다. 하룻밤 동안 배양액내에 둔 후 배지를 제거하고 세포를 신선한 배지로 한 번 세척하였다. 이어서, 세포를 0.45㎖의 수산화나트륨(0.2M)을 첨가하여 30분 동안 용해하였다. 30분 후, 이 용액에 0.45㎖ 염산(0.2M)을 첨가하고, 0.1㎖ HEPES/NaOH(1M, pH7.4)를 첨가하여 중화하였다. 이들 혼합물로부터 막 단백질을 추출하기 위하여 트리톤-X-114(10%, v/v)를 첨가하고 4℃에서 60분 동안 배양하고, 불용성 물질을 원심분리하여 제거하고 상징을 30분 동안 37℃로 보온하였다. 생성된 2개의 층을 원심분리하여 제거하고 상층을 버렸다. 하층 내의 단백질을 웨스턴 블랏팅(Western blotting)으로 분석하기 위해 클로로포름/메탄올로 침전시켰다. 샘플을 SDS-PAGE로 분리하고 니트로-셀룰로스로 이동시켰다. 신경분비 과정의 결정적인 성분이며 BoNT/A의 아연-의존성 엔도펩티다제 활성에 대한 기질인 SNAP-25의 단백질 분해는, 갈라진 SNAP-25의 새로 발견된 카르복시 터미널을 인식하는 항체로 탐지함으로써 검출되었다(이 항체는 특허출원 PCT/GB95/01279에 기재되어 있다). 도 3은 이러한 웨스턴 블랏의 한 예를 보여준다. 대조 세포(레인 1과 2)의 샘플에서 중요한 면역반응성은 발견되지 않았지만, 29kDa의 분자 질량에 상응하는 밴드가 10㎎/㎖ LHN(레인 5와 6)로 배양된 샘플에서 약하게 관찰되었고, NGF와 LHN(레인 3과 4)의 접합의 10㎎/㎖로 배양된 샘플에서 강하게 관찰되었다. 접합체로 PC12 세포를 배양하는 것은, 접합체가 BoNT/A의 L-사슬의 아연-의존성 단백질분해 활성을 세포의 세포질로 도입시켰다는 것을 나타내는 SNAP-25의 현저한 단백질분해를 초래한다. 약간의 또는 전무한 활성은 접합체의 구성 성분에서 보여졌다.
과량의 유리 NGF의 존재속에서 접합체로 세포를 배양하는 것은 접합체만으로 배향하는 것보다 SNAP-25의 단백질분해성 생산물의 감소된 생산을 초래하였다. 이것은 접합체의 활동이 NGF에 있어서 세포표면 수용기와 상호작용하는 NGF 타겟 수분에 의해 발생한다는 것을 나타낸다.
실시예 3. 배측근 신경절 신경의 1차 배양에서 NGF와 LH N 의 접합체의 활성
배측근 신경절은 1차 유해수용성 구심체의 세포체를 함유한다. 이 조직의 1차 시험관 내 배양에서 신경이 유해수용성 구심체의 많은 특성을 보유하다는 것이 잘 알려져 있다. 이들 특성은 생체 내에서 고통을 발생시키는 것으로 알려진 화학적 자극(즉, 캅사이신)에 따라 P물질 등의 신경펩티드를 방출하는 능력을 포함한다. 또한 이 신경은 NGF의 수용기를 갖는다고 알려져 있다.
배측근 신경절 신경의 1차 배양을 태내 래트(발생학적 나이 12-15일)에서 절개된 신경절을 해리하여 실시하였다. 세포를, NGF를 함유하는(100ng/㎖) 배지 내에서 초기 밀도 3×105세포/웰로 12개의 웰 플레이트에 얇게 펼쳐 놓았다. 1일 후, 비신경성 세포를 치사하기 위해 배양 내에 사이토신 아라비노사이드(10mM)를 함유하는 신선한 배지를 첨가하였다. 2일 내지 4일 후, 사이토신 아라비노사이드를 제거하였다. 몇일후에, 배양 내의 배지를, NGF 없이 결합체 또는 LHN을 함유하는 신선한 배지로 교체하였다. 하룻밤 동안 37℃에서 배양하고, 배지를 제거하고, 세포를 용해하고 실시예 2에서 기재한 바와 같이 트리톤-X-114를 사용하여 소수성 단백질을 추출하였다.
실시예 2에서 기재한 바와 같이, 웨스턴 블랏팅에 의해 SNAP-25의 BoNT/A 단백질 분해 생성물을 인식하는 항체로 샘플을 분해하였다. 대조 세포(레인 4)의 샘플에서 면역반응성은 발견되지 않았지만, 29kDa의 분자 질량에 상응하는 밴드가 10㎎/㎖ LHN(레인 3)로 배양된 샘플에서 약하게 관찰되었고, NGF와 LHN(레인 1과 2)의 접합의 10㎎/㎖로 배양된 샘플에서 강하게 관찰되었다.
이 결과는 접합체가 BoNT/A의 단백질분해-활성 L-체인을, 생체내에서 1차 유해수용성 구심체를 형성하는 신경세포의 세포질로 운반할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4. L사슬이 BoNT/B로부터 유도되고 H N 조각이 BoNT/A로부터 유도된 키메릭 LH N 의 제조
Shone C.C.,Hambleton,P., 및 Melling,J.(1987, Eur.J.Biochem.167,175-180)에 의해 기재된 방법에 따라 BoNT/A의 HN조각을 제조하고 Sathyamoorthy,V.와 DasGupta,B.R.(1985,J.Biol.Chem.260,10461-10466)의 방법에 따라 BoNT/B의 L-사슬을 제조하였다. BoNT/A의 HN조각의 유리 시스테인을, 디피리디닐 디설파이드를 몰량의 10배 과량으로 첨가하여 유도해내고 하룻밤 동안 4℃에서 배양하였다. PD10 칼럼(Pharmacia)으로 단백질을 PBS로 탈염시켜 생산물에 의한 과량의 디피리딜 디설파이드와 티오피리돈을 제거하였다.
유도된 HN을, BoNT/B의 L-사슬의 동등한 몰량으로 혼합하기 전에 1㎎/㎖(PBS에서, 1㎎/㎖)의 과량으로 단백질 농도로 농축하였다. 실온에서 하룻밤 배양한 후, 혼합물을 Superose 6(Pharmacia)으로 크기 배제 크로마토그래피하여 분리하고, 이 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다. 키메릭 LHN을, 실시예 1에서 기재된 바와 같이 목적 접합체를 생성시키기 위해 유도하는데 사용할 수 있다.
상기 기재된 실시예는 본 발명의 순수한 예이다. 제제의 합성에 있어서, 개질된 클로스트리듐 속의 신경 독소 또는 이들의 조각에 대한 TM의 커플링은 이 기술분야의 숙련자들에게 알려진 시료와 기술을 사용하여 화학적 커플링을 통해 이루어진다. 따라서, 주어진 실시예가 PDPH/EDAC와 트라우트(Traut)의 시료 화학만을 사용한다 하더라도, 시료의 TM 성분을 클로스트리듐 속의 신경 독소에 공유적으로 부착시킬 수 있는 다른 커플링 화학이 성분을 유도하며 본 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있는 사항이 이 방법의 범위에 포함된다. 이와 유사하게, 전체 제제 또는 제제의조각의 DNA 코딩이 쉽게 이루어질 수 있고, 적당한 기관으로 발현될 때, 재조합적으로 제제 또는 제제의 조각을 생산해내는데 사용될 수 있다는 것이 본 기술분야의 숙련자들에게 명백하다. 본 기술분야의 숙련자들에게 알려진 기술에 의해 얻어진 발명의 제제의 이러한 유전적 구조는 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
표 1가능한 표적 부분(TM)
성장인자 :
1. 신경 성장인자 (NGF);
2. 백혈병 억제인자 (LIF);
3. 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF);
4. 뇌에서 유도된 신경 영양인자 (BDNF);
5. 뉴로트로핀-3 (NT-3);
6. 히드라 헤드 활성제 펩티드 (HHAP);
7. 형질전환 성장인자 1 (TGF-1);
8. 형질전환 성장인자 2 (TGF-2);
9. 형질전환 성장인자 (TGF);
10. 표피 성장인자 (EGF);
11. 모양체 신경 영양인자 (CNTF).
사이토킨 :
1. 종양 괴사인자 (TNF);
2. 인터루킨-1 (IL-1);
3. 인터루킨-1 (IL-1);
4. 인터루킨-8 (IL-8).
펩티드 :
1. 엔돌핀;
2. 메티오닌-엔케팔린;
3. D-Ala2-D-Leu5-엔케팔린;
4. 브래디키닌.
항체 :
1. 배면근 신경절 뉴런의 표면에서 발견되는 락토시리즈 탄수화물 에피토프에 대한 항체(예를들면, 모노클로날 항체 1B2 및 LA4);
2. 상기한 리간드의 수용체에 대한 항체;
3. 표면 발현 항원 Thy1에 대한 항체(예를들면, 모노클로날 항체 MRC OX7).
본 발명에서 설명된 약품은 통증을 치료하기 위해 직접 또는 제약학적으로 허용가능한 염으로서 생체 내에 사용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명에 따른 약품은 심한 만성통증의 치료를 위해 조직적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 특별한 예는 복합 관절을 침범하는 류마티즘성 관절염과 관련된 임상 통증의 치료를 위한 사용이다.
또 다른 예에 있어서, 본 발명에 따른 약품은 통증의 치료를 위해서 국부적으로 적용될 수 있다. 이것의 특별한 예는 염증성 통증에 의해 침범되는 관절속으로 국부주입함에 의한 치료이다.
추가의 예에 있어서, 본 발명에 따른 약품은 통증의 치료를 위해서 침범된 기관의 신경분포를 포함한 척수 환절의 수준에서 척수주입(경막외 또는 척추강내)에 의해 투약될 수 있다. 이것은 예를 들면 만성의 악성통증과 같은 깊은 조직의 통증 치료에 적용가능하다.
이제 본 발명은 다음의 제한하지 않는 실시예를 참고로 하여 설명될 것이다.

Claims (51)

  1. 표적 부분(TM)이 1차 감각 유입물 상의 세표 표면 결합부위에 대한 리간드이고 말초 감각 유입물에 대하여 특이성을 나타내는 비세포독성 제제와 1차 감각 유입물의 표면 사이에서 물리적 결합을 유발하는 결합부위와 작용적으로 상호작용할 수 있으며; 클로스트리디알 신경독소의 헤비 사슬(H-사슬)은 화학적 유도반응, 돌연변이 또는 단백질 분해에 의하여 제거되거나 또는 변성되어 모터 뉴런에 대한 본래의 결합 친화성이 감소되거나 제거되고; 클로스트리디알 신경독소 또는 그의 절편의 라이트 사슬(L-사슬)은 신경성분비 구조의 성분에 특이적인 프로테아제 활성을 유지하며; TM과 (존재한다면)변성된 H 사슬은 1차 감각 유입물의 사이토졸에 L 사슬 또는 그의 절편을 삽입한 분자를 생성하여 1차 감각 유입물로부터 신경전달물질 또는 신경조절물질의 방출을 조절하여 1차 감각 유입물과 투사 뉴런 간의 시그널 전달을 억제하는, 변성된 클로스트리디알 신경독소에 결합된 표적 부분으로 이루어지는 말초 감각 유입물에 대하여 특이성을 나타내는 비세포독성 제제.
  2. 제 1항에 있어서, H 사슬의 Hc 부분이 제거되거나 변성된 클로스트리디알 신경독소와 결합된 표적 부분으로 이루어지는 것인 제제.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 변성된 H-사슬이 클로스트리디알 신경독소의 HN-절편인 것인 제제.
  4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 하나의 항에 있어서, 클로스트리디알 신경독소 성분이 보툴리늄 속의 신경독소로부터 얻어지는 것인 제제.
  5. 제 1항 내지 제 4항중 어느 하나의 항에 있어서, 클로스트리디알 신경독소 성분이 보툴리늄 속의 신경독소 A형으로부터 얻어지는 것인 제제.
  6. 제 1항 내지 제 4항중 어느 하나의 항에 있어서, 클로스트리디알 신경독소 성분이 보툴리늄 속의 신경독소 B로부터 얻어지는 것인 제제.
  7. 제 1항 내지 제 4항중 어느 하나의 항에 있어서, 클로스트리디알 신경독소 성분이 보툴리늄 속의 신경독소 C1형으로부터 얻어지는 것인 제제.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 제제가 TM과 보툴리늄 속의 신경독소 A형의 LHN절편이 결합하여 생성되는 것인 제제.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 제제가 TM과 보툴리늄 속의 신경독소 B형의 LHN절편이 결합하여 생성되는 것인 제제.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 제제가 TM과 보툴리늄 속의 신경독소 C1형의 LHN절편이 결합하여 생성되는 것인 제제.
  11. 제 1항 내지 제 7항중 어느 하나의 항에 있어서, H 사슬이 L 사슬을 제공하는 클로스트리디알 신경독소와는 상이한 클로스트리디알 신경독소로부터 얻어지는 것인 제제.
  12. 제 11항에 있어서, H 사슬이 보툴리늄 속의 신경독소 A형으로부터 얻어지고 L 사슬은 보툴리늄 속의 신경독소 B형으로부터 얻어지는 것인 제제.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 제제가 보툴리늄 속의 신경독소 A형의 HN절편에 결합된 TM과 보툴리늄 속의 신경독소 B형의 L 사슬로 이루어지는 것인 제제.
  14. 제 1항 내지 제 13항중 어느 하나의 항에 있어서, L 사슬 또는 L 사슬 절편이 직접 공유결합에 의해 H 사슬에 결합되는 것인 제제.
  15. 제 1항 내지 제 13항중 어느 하나의 항에 있어서, L 사슬 또는 L 사슬 절편이 1 이상의 스페이서 영역을 포함하는 공유결합에 의해 H 사슬에 결합되는 것인 제제.
  16. 제 1항 내지 제 15항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 1차 감각 유입물 만의 사이토졸에 L 사슬 또는 L 사슬 절편을 전달할 수 있는 것인 제제.
  17. 제 1항 내지 제 16항중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 감각 유입물의 사이토졸로의 L 사슬 또는 L 사슬 절편의 전달능은 모두 TM 내에 함유되어 있는 것인 제제.
  18. 제 1항 내지 제 17항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 1차 감각 유입물의 특별히 정의된 개체군의 특징인 결합부위에 결합하는 것인 제제.
  19. 제 1항 내지 제 18항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 1차 유해수용성 유입물의 특별히 정의된 개체군의 특징인 결합부위에 결합하는 것인 제제.
  20. 제 1항 내지 제 19항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 1차 감각 유입물 내에서 역이송이 일어나는 결합부위와 결합하는 것인 제제.
  21. 제 1항 내지 제 20항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 1차 유해수용성 유입물 내에서 역이송이 일어나는 결합부위와 결합하는 것인 제제.
  22. 제 1항 내지 제 21항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 1차 감각 유입물 상의 세포 표면 수용체에 대한 리간드인 것인 제제.
  23. 제 1항 내지 제 22항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 1차 감각 유입물 상의 성장인자 수용체에 대한 리간드인 것인 제제.
  24. 제 1항 내지 제 22항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 1차 감각 유입물 상의 뉴로펩티드 수용체에 대한 리간드인 것인 제제.
  25. 제 1항 내지 제 22항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 1차 감각 유입물 상의 사이토킨 수용체에 대한 리간드인 것인 제제.
  26. 제 1항 내지 제 22항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 1차 감각 유입물 상의 호르몬 수용체에 대한 리간드인 것인 제제.
  27. 제 1항 내지 제 26항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 모노클로날 항체이거나 또는 1차 감각 유입물 상의 표면 항원에 대한 모노클로날 항체로부터 유도되는 것인 제제.
  28. 제 23항에 있어서, TM이 신경 성장인자 수용체에 대한 리간드인 것인 제제.
  29. 제 28항에 있어서, TM이 신경 성장인자인 것인 제제.
  30. 제 29항에 있어서, 보툴리늄 속의 신경독소 A형의 LHN절편에 결합된 신경 성장인자를 함유하는 것인 제제.
  31. 제 1항 내지 제 30항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 직공유결합에 의해 클로스트리디알 신경독소에서 유도된 성분에 결합되는 것인 제제.
  32. 제 1항 내지 제 31항중 어느 하나의 항에 있어서, TM이 1 이상의 스페이서 영역을 함유하는 공유결합에 의해 클로스트리디알 신경독소에서 유도된 성분에 결합되는 것인 제제.
  33. 제 1항 내지 제 32항중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 감각 유입물로부터 신경전달물질 또는 신경조절물질의 방출을 예방하는 것인 제제.
  34. 제 1항 내지 제 33항중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 감각 유입물로부터 신경전달물질 또는 신경조절물질의 방출을 억제하는 것인 제제.
  35. 변성된 클로스트리디알 신경독소 또는 클로스트리디알 신경독소의 절편에 TM을 공유결합시키는 것으로 이루어진 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제를 제조하는 방법.
  36. 변성된 클로스트리디알 신경독소 또는 클로스트리디알 신경독소의 절편에 TM을 공유결합시키고, 상기에서 공유결합은 1 이상의 스페이서 영역을 함유하는 것으로 이루어지는 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제를 제조하는 방법.
  37. 변성된 클로스트리디알 신경독소 또는 클로스트리디알 신경독소의 절편을 코드하는 유전자 구조물을 구성하고, 숙주 내에 상기 구조물을 삽입한 후, 상기 구조물을 발현하여 변성된 클로스트리디알 신경독소 또는 클로스트리디알 신경독소의 절편 및, 변성된 클로스트리디알 신경독소 또는 클로스트리디알 신경독소 절편과 TM의 공유결합을 생성시키는 것으로 이루어진 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제를 제조하는 방법.
  38. 변성된 클로스트리디알 신경독소 또는 클로스트리디알 신경독소의 절편을 코드하는 유전자 구조물을 구성하고, 숙주 내에 상기 구조물을 삽입한 후, 상기 구조물을 발현하여 변성된 클로스트리디알 신경독소 또는 클로스트리디알 신경독소의 절편 및, 변성된 클로스트리디알 신경독소 또는 클로스트리디알 신경독소 절편과 TM의 1 이상의 스페이서 영역을 가지는 공유결합을 생성시키는 것으로 이루어진 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제를 제조하는 방법.
  39. 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제를 코드하는 유전자 구조물을 구성하고, 숙주 내에 상기 구조물을 삽입한 후, 상기 구조물을 발현하여 상기 제제를 생산하는 것으로 이루어진 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제를 제조하는 방법.
  40. 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제를 이용하여 1차 감각 유입물로부터 신경전달물질 또는 신경조절물질의 방출을 조절하는 방법.
  41. 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제를 이용하여 1차 유해수용성 유입물로부터 신경전달물질 또는 신경조절물질의 방출을 조절하는 방법.
  42. 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제를 이용하여 1차 감각 유입물에서 투사 뉴런으로의 감각 정보 전달을 조절하는 방법.
  43. 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제를 이용하여 1차 유해수용성 유입물에서 투사 뉴런으로의 감각 정보 전달을 조절하는 방법.
  44. 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제를 이용하여 통증 감각을 조절하는 방법.
  45. 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제 또는 제약적으로 허용가능한 이들의 염의 통증 완화제로서의 용도.
  46. 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제 또는 제약적으로 허용가능한 이들의 염의 통증 예방제로서의 용도.
  47. 통증 완화제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제의 용도.
  48. 통증 예방제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제의 용도.
  49. 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제의 유효량을 투여하는 것으로 이루어진 통증을 완화하는 방법.
  50. 제 1항 내지 제 34항중 어느 하나의 항에 따른 제제의 유효량을 투여하는 것으로 이루어진 통증을 예방하는 방법.
  51. 1) 유해수용성 유입 뉴런의 특징이며 유해수용성 유입 뉴런에 대하여 특이성을 가지는 표면 구조(결합부위, BS)에 결합하고;
    2) 뉴런에 유입되고;
    3) 사이토졸에 유입되며;
    4) 시냅스 터미널로부터 신경전달물질 또는 신경조절물질의 방출을 감소시키거나 방지할 정도로 뉴런의 중추 프로세스의 시냅스 터미널에 존재하는 세포질외 구조의 성분을 변성하는, 상기한 작용 각각을 가지는, 유해수용성 유입물의 시냅스 터미널로부터 신경전달물질 및/또는 신경조절물질의 방출을 억제할 수 있는 말초 감각 유입물에 특이성을 나타내는 제제.
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