KR19980702451A - 단백질-티로신 키나제 키메라에의한 세포 면역성의 방향전환 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유동물 세포에서 세포로 하여금 감염성 병원체, 감염성 병원체에 의해 감염된 세포, 종양 또는 암세포, 또는 자가면역발생세포를 특이적으로 인식해서 파괴하도록 지시하는 키메라 수용체를 발현시킴으로써 포유동물에서 세포반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 키메라 수용체는 표적 세포 또는 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식해서 파괴할 수 있는 세포외 부분과 치료 세포에게 수용체-결합 표적 세포 또는 수용체-결합 표적 감염성 병원체를 파괴하도록 신호할 수 있는 단백질-티로신 키나제의 세포내 부분을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 키메라 수용체를 발현하는 세포 및 상기 키메라 수용체를 코드화하는 DNA에도 관계한다.

Description

단백질-티로신 키나제 키메라에 의한 세포 면역성의 방향전환

T 세포 수용체를 통한 항원의 T 세포 인식은 광범위한 면역현상의 기초이다. T 세포는 소위 세포매개성면역(cell-mediated immunity)을 지시한다. 이것은 면역 시스템 세포들에 의한 이종 조직 또는 감염된 세포의 파괴를 포함한다. 면역반응을 조절하는 헬퍼(helper) 및 서프렛서(suppressor) 세포 및 비정상적인 세포들을 직접적으로 치사시킬 수 있는 세포독성(또는 킬러) 세포를 포함하여 다양한 T 세포들이 존재한다.

다른 세포의 표면상에 나타나는 독특한 항원을 인식하고 결합하는 T 세포는 활성화되고; 이어서 증식할 수 있고, 그것이 세포독성 세포(cytotoxic cell)라면 결합된 세포를 치사시킬 수 있다.

자가면역질환(Autoimmune disease)은 숙주 조직과 반응하는 항체 또는 자가반응성인 면역 이펙터 T 세포를 만들어내는 것을 특징으로 한다. 몇몇 경우에, 체조직내 유사 화합물과 교차 반응하는 항원들을 포함하는 이종 물질(foreign substances) 또는 생물체에 의해 활성화된 정상적인 T- 세포 및 B- 세포 반응에 의해 자가항체(autoantibodies)가 만들어질 수 있다. 임상적으로 관련된 자가 항체들의 예로는 중증근무력증(myasthenia gravis)에서의 아세틸콜린 수용체에 대한 항체; 및 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)에서의 항-DNA, 항-적혈구, 및 항-혈소판 항체들을 들 수 있다.

HIV 및 면역병인론(Immunopathogenesis)

1984년 HIV는 AIDS의 병인 병원체(etiologic agent)인 것으로 밝혀졌다. 그 이래로 AIDS의 정의는 진단에 어떤 기준이 포함되어야 하는가와 관련하여 여러 차례 수정되어 왔다. 그러나, 진단 피라미터에 있어서의 변동에도 불구하고, AIDS의 간단하고 일반화된 공통 특징은 HIV에 의한 감염 및 지속되는 체질성 증상(constitutional symptoms) 및 2차 감염, 종양 및 신경계 질환과 같은 AIDS-한정 질환들의 뒤이은 발병이다.Harrison's Principles of Internal Medicine, 12th ed., McGraw Hill (1991).

HIV는 렌티바이러스 그룹의 사람 레트로바이러스이다. 인식된 4 종류의 사람 레트로바이러스는 2개의 상이한 그룹에 속한다: 사람 T 림프종(또는 백혈병) 레트로바이러스, HTLV-1 및 HTLV-2 그리고 사람 면역결핍바이러스, HIV-1 및 HIV-2. 후자는 세포변성 바이러스(cytopathic virus)임에 반하여, 전자는 형질전환 바이러스(transforming virus)이다.

HIV-1은 전세계를 통해서 AIDS의 가장 보편적인 원인인 것으로 확인되어 왔다. HIV-2 및 HIV-1 사이의 서열 상동성은 HIV-2가 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV) 그룹의 일부 구성원에 더 밀접하게 관련된다고 하더라도 약 40%이다. Curran et al.,Science329:1357-1359 (1985); Weiss et al.,Nature324:572-575 (1986) 참고.

HIV는 복제 및 기타의 바이러스의 생물학적 활동에 관계되는 여섯 개의 여분의 유전자는 물론 통상의 레트로바이러스 유전자들(env,gag, 및pol)을 갖는다. 전술한 바와 같이, AIDS의 일반적인 공통 특징은 심각한 면역억제(immunosuppression), 주로 세포매개성면역의 억제이다. 이러한 면역억제는 여러가지 기회감염성 질환, 특히 특정한 감염 및 종양을 유발한다.

AIDS에 있어서 면역 장애의 주원인은 흉선-유래(T) 림프구(thymus-derived (T) lymphocytes) 아집단, T4 집단의 양적 및 질적 결핍인 것으로 확인되었다. 이러한 세포들의 아집단은 표현형상으로 CD4 표면 분자의 존재에 의해 정의되는데, 이러한 CD4 표면 분자는 HIV에 대한 세포 수용체인 것으로 확인되었다. Dalgleish et al.Nature312:763 (1984). T4 세포가 HIV에 의해 감염되는 주된 세포 유형이지만, 본질적으로 그 표면에 CD4 분자를 발현하는 모든 사람 세포가 HIV에 결합하고 HIV에 의해 감염될 수 있다.

전통적으로, CD4⁺T 세포들은 B 세포에 활성화 신호를 제공하거나 또는 상호 CD8 마커(reciprocal CD8 marker)를 포함하는 T 세포를 세포독성/서프렛서 세포로 되도록 유도하는 기능을 나타내는 헬퍼/인듀서(helper/inducer)의 역할을 담당해왔다. Reinherz and Schlossman,Cell,19:821-827 (1980); Goldstein et al.,Immunol. Rev.,68:5-42, (1982).

HIV는 바이러스 엔벨로프내 아미노산의 스트레치(gp120)에 의해 CD4 분자의 N-말단 부근에 위치된 CD4 분자의 V1 부위의 일부분에 특이적으로 고친화성을 갖고 결합한다. 결합에 이어, 바이러스는 표적 세포막과 융합되어 세포내로 들어간다. 일단 세포내로 들어가면, 그것은 역전사효소를 이용하여 자신의 게놈성 RNA를 DNA로 전사하고, 이러한 DNA는 세포 DNA에 삽입되어 세포의 생존기간내내 프로바이러스로 존재하게 된다.

프로바이러스는 계속 잠복되어 있거나, 또는 활성화되어 mRNA 및 게놈성 RNA를 전사하여 단백질 합성, 조립, 새로운 비리온 형성 및 세포 표면으로 부터의 바이러스의 버딩을 초래할 수 있다. 바이러스가 세포치사를 유발하는 정확한 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았지만, 주된 메카니즘은 원형질막의 파괴를 초래하여 삼투압 불균형을 결과시키는 세포 표면으로 부터의 바이러스의 대량 버딩인 것으로 생각된다.

감염 과정중에, 숙주 생물은 주된 엔벨로프 당단백질인 gp120 및 gp41을 포함하는 바이러스 단백질에 대한 항체를 만든다. 이러한 체액 면역(humoral immunity)에도 불구하고, 질병들은 진행되어 다수의 기회감염성 감염, 기생충혈증, 치매 및 사망을 특징으로 하는 치명적인 면역억제를 초래한다. 숙주의 항-바이러스 항체들이 질환의 진행을 정지시키지 못하는 것은 감염의 가장 난처하고 무서운 일면으로, 종래의 접근방법에 기초한 백신접종 노력을 예고한다.

두 가지의 인자가 면역결핍 바이러스에 대한 체액 반응의 효능에 있어서 일정한 역할을 담당한다. 첫 째, 다른 RNA 바이러스(특히 레트로바이러스와 마찬가지로)와 마찬가지로, 면역결핍 바이러스들은 숙주 면역 감시에 대해 높은 돌연변이율을 나타낸다. 둘 째, 엔벨로프 당단백질 그 자체가 고친화성 항체 결합에 적합한 에피톱을 거의 제공하지 않는 고도로 포도당화된 분자라는 것이다. 바이러스 엔벨로프가 제공하는 항원성이 약한 표적은 숙주가 특이적인 항체 생산에 의해 바이러스 감염을 제한할 수 있는 기회를 거의 갖지 못하게 한다.

HIV에 의해 감염된 세포들은 그들의 표면상에 gp120 당단백질을 발현한다. gp120은 바이러스가 비감염 세포내로 들어가는 것과 유사한 반응을 통해서 CD4⁺세포들 사이의 융합(fusion)을 매개하여, 수명이 짧은 다핵 거대세포(short-lived multinucleated giant cells)들을 형성시킨다. 신시튬(syncytium) 형성은 gp120 엔벨로프 당단백질과 CD4 단백질 사이의 직접적인 상호작용에 의존한다. Dalgleish et al.,supra; Klatzman et al.,Nature312:763 (1984); McDougal et al.,Science231:382 (1986); Sodroski et al.,Nature322:470 (1986); Lifson et al.,Nature323:725 (1986); Sodroski et al.,Nature321:412 (1986).

CD4-gp120 결합이 CD4 항원을 포함하는 세포의 바이러스 감염을 담당한다는 사실에 대한 증거는 CD4와 gp120 사이에 특수한 복합체가 형성된다는 발견을 포함한다 (McDougal et al.,supra.). 다른 연구자들은 HIV에 대해 비감염성인 세포주들이 사람 CD4 cDNA 유전자의 트렌스펙션 및 발현에 이어 감염가능한 세포주로 전환되었다는 사실을 밝혀내었다. Maddon et al.,Cell 46:333-348 (1986).

바이러스의 흡착 및 신시튬-매개 세포전달(syncytium-mediated cellular transmission)을 저지하는 작동제로서 용해성 CD4에 기초하는 치료 프로그램들이 제안되어 왔고 여러 그룹(Deen et al.,Nature331:82-84 (1988); Fisher et al.,Nature331:76-78 (1988); Hussey et al.,Nature331:78-81 (1988); Smith et al.,Science 238:1704-1707 (1987); Traunecker et al,Nature331:84-86 (1988))에 의해 성공적으로 생체외(in vitro)에서 증명되어 왔으며; 그 후 긴 반감기와 중간 정도의 생물학적 활성을 갖는 CD4 면역글로불린 융합 단백질이 개발되었다(Capon et al.,Nature337:525-531 (1989); Traunecker et al,Nature339:68-70 (1989); Byrn et al.,Nature344:667-670 (1990); Zettlmeissl et al.,DNA Cell Biol.9:347-353 (1990). CD4 면역독 접합체(immunotoxin conjugates) 또는 융합 단백질들이생체외(in vitro)에서 감염된 세포에 대해 강력한 세포독성을 시현한다고 하더라도(Chaudhary et al.,Nature335:369-372 (1988); Till et al.,Science242:1166-1168 (1988)), 면역결핍증후군의 잠복성 때문에 어떠한 단일-처리요법(single-treatment therapy)도 바이러스 걱정을 더는데 효과적일 수 없고, 이종 융합 단백질의 항원성 때문에 반복 투약을 필요로 하는 치료에 이들을 이용하는 것이 제한될 것이다. SIV에 의해 감염된 원숭이를 이용하여 행한 실험들을 통해서 용해성 CD4가, 만약 현저한 혈구감소증 없이 동물에 투여된다면, SIV 역가를 감소시키고 척수성 포텐셜(myeloid potential)의생체외(in vitro) 치수를 증가시킬 수 있다는 것이 확인되었다(Watanabe et al.,Nature337:267-270 (1989)). 그러나, 치료가 중단된 후 즉각적인 바이러스의 재출현이 발견되었는바, 이는 점진적인 면역시스템의 약화를 방지하기 위해 평생 투여가 필요할 수도 있다는 것을 시사한다.

세포 표면 수용체-결합 단백질-티로신 키나제

면역시스템에서 세포 이펙터 프로그램의 관여에 대한 초기 자극은 종종 집합된(clusterd) 리간드들의 세포 인식이다. 집합(aggregation)시에 활성화 신호를 전달하는 것으로 알려진 수용체들 중에는 B 세포 및 T 세포 항원 수용체들(DeFranco,Eur. J. Biochem. 210:381-388 (1992); Weiss,Annu. Rev. Genet. 25:487-510 (1991)), IgG 및 IgE Fc 수용체 군의 구성원들(Fanger et al.,Immunol. Today 10:92-99 (1989); Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)) 그리고 T 세포에 있는 CD2, CD4, CD8 및 CD28(Yokoyama and Shevach,Year Immunol. 4:110-146 (1989)), B 세포에 있는 CD19, CD20, CD21 및 CD40 (Clark and Ledbetter,Adv. Cancer Res. 52;81-149 (1989)), 및 단핵구에 있는 CD44, CD45 및 CD58 (Webb et al.,Science 249:1295-1297 (1990))을 포함하는 다수의 보조 수용체(accessory receptors)들이 있다. 또한, 다수의 인지질 결합 단백질들(phospholipid linked proteins)은 T 세포의 표면상에서 교차결합될 때 항원 수용체-의존 방식(antigen receptor-dependent manner)으로 세포 활성화를 증진한다(Balk and Terhorst,Immunol. Ser. 45:411-416 (1989); Kroczek et al.,Nature 322:181-184 (1986); Yeh et al.,J. Immunol. 138:91-97 (1987); Yokoyama and Shevach,Year Immunol. 4:110-146 (1989)).

현재 어떻게 단순한 물리적 이벤트인, 집합(aggregation)이 명확하게 구분되는 생리적 신호를 초래하는지 분명하지 않다. B 세포 및 T 세포 항원 수용체들 및 여러가지 형태의 Fc 수용체들에 의해 매개되는 세포 이펙터 프로그램의 관여는 수용체 복합체의 개개의 쇄의 세포내 도메인을 갖는 키메라 단백질들의 교차결합에 의해 모의될 수 있다(Irving and Weiss,Cell 64:891-901 (1991); Kolanus et al.,EMBO J. 11:4861-4868 (1992); Letourneur and Klausner,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8905-8909 (1991); Letourneur and Klausner,Science 255:79-82 (1992); Romeo and Seed,Cell 64:1037-1046 (1991); Wegener et al.,Cell 68:83-95) (1992). 최소한의 효과 개시 요소(minimal effective trigger element)는 10 또는 11 잔기 만큼 분리되어 있는 두 개의 티로신 잔기들을 포함하고 친수성, 전형적으로 산성 분위기에 묻혀 있는 계통발생상 보존된(Reth,Nature 338:383-384 (1989)) 펩타이드 서열을 필요로 하는 것으로 보인다(Romeo et al.,Cell 68:889-897 (1992); Irving et al.,J. Exp. Med. 177:1093-1103 (1993)). 이러한 요소를 포함하는 수용체들의 집합(clustering)은 단백질 티로신 키나제(PTK) 활성이 필수적인 것으로 보이는 활성화 폭포(activation cascade)를 개시시키고; PTK 억제자는 칼슘 가동화 및 후속 싸이토카인 방출의 결과 및 세포증식과 같은 B 세포 및 T 세포 활성화에서의 초기 이벤트를 봉쇄한다(June et al.,J. Immunol. 144:1591-1599 (1990); Lane et al,.J. Immunol. 146:715-722 (1991); Mustelin et al.,Science 247:1584-1587 (1990); Stanley et al.,J. Immunol. 145:2189-2198 (1990)). 수용체 활성화의 후반의 결과는 세포 유형에 따라 달라지지만, 초기 이벤트는 별개의 조혈 계통들로 부터의 세포들 사이에 놀라울 정도로 유사하다. 예를 들어, B 세포 항원 수용체(Gold et al.,Nature 345:810-813 (1990); Campbell and Sefton,EMBO J. 9:2125-2131 (1990)), T 세포 항원 수용체(June et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7722-7726 (1990); June et al.,J. Immunol. 144:1591-1599 (1990)) 및 고친화성 IgE 수용체(Eiseman and Bolen,Nature 355:78-80 (1992); Li et al.,Mol. Cell. Biol. 12:3176-3182 (1992))의 교차결합후에 관찰된 PTK 활성의 신속한 증가는 모두 그들의 초기 인산화 표적중에서 포스파타이딜이노시톨-특이성 포스포리파제 C의 γ 이소폼을 갖는데(Carter et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2745-2749 (1991); Li et al.,Mol.Cell. Biol. 12:3176-3182 (1992); Park et al.,J. Biol. Chem. 266:24237-24240 (1991); Park et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5453-5456 (1991); Secrist et al.,J. Biol. Chem. 266:12135-12139 (1991); Weiss et al.,Annu. Rev. Genet. 25:487-510 (1991)), 포스포리파제 C는 티로신 인산화에 의해 직접적으로 활성화된다(Nishibe et al.,Science 250:1253-1256 (1990)).

지금까지 세포 표면 수용체와 결합하는 것으로 알려진 PTK 활성은 두개의 군으로 분류된다: Src 원시종양유전자-관련 키나제군에 속하는 것들과 최근에 규명된 Syk 키나제에 관련된 것들이다. 전자중에서, Fyn 키나제가 T 세포 수용체와 결합하는 것으로 밝혀졌고(Gassmann et al.,Eur, J. Immunol. 22:283-286 (1992); Samelson et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4358-4362 (1990)), Lyn, Fyn, Blk, 및 Lck 키나제들은 B 세포 IgM 수용체와 결합하는 것으로 보고되었으며(Burkhardt et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7410-7414 (1991); Campbell and Sefton,Mol. Cell. Biol. 12:2315-2321 (1992); Yamanashi et al.,Science 251:192-194 (1991)) 그리고 Lyn 및 Yes 키나제들은 고친화성 IgE 수용체와 결합하는 것으로 확인되었다 (Eiseman and Bolen,Nature 355:78-80 (1992); Hutchcroft et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9107-9111 (1992): Hutchcroft, et al.,J. Biol. Chem. 267:8613-8619 (1992)). 관찰된 결합의 메카니즘은 상세하게 확립되어 있지 않지만, 예비 데이타는 수용체 복합체 쇄의 세포내 도메인이 Src군 키나제들과 물리적으로 결합할 수 있다는 것을 암시해준다(Clark et al.,Science 258:123-126 (1992); Timson Gauen et al.,Mol. Cell. Biol. 12:5438-5446 (1992)). 현재 이러한 결합들이 직접적인지 아니면 간접적인지는 분명하지 않다.

현재까지, 세포 활성화에 있어서의 Src군 키나제들의 중요성에 관한 가장 그럴듯한 증거는 T 세포에서의 Fyn 및 Lck 키나제들의 연구로 부터 수득되었다. 형질전환 마우스에 있어서 Fyn의 과발현(overexpression)은 그 결과로서 생긴 T 세포에서 항원 과반응성 표현형(antigen hyperresponsive phenotype)을 초래하는 반면에, 촉매 불활성 형태의 과발현은 T 세포 수용체 매개 증식을 차단한다(Cooke et al.,Cell 65;281-291 (1991)). Fyn 키나제 활성이 없는 돌연변이 마우스로 부터 분리된 흉선 T 세포들은 포르볼(phorbol) 에스테르와 항-CD3 항체 또는 콘카나발린 A중 하나와의 조합의 처리에 대한 증식반응의 상승능력면에서 심각한 결함을 나타낸다(Appleby et al.,Cell 70:751-763 (1992); Stein et al.,Cell 70:741-750 (1992)). 이러한 마우스로 부터 분리된 비장 T 세포들은 덜 심각하기는 하지만, 여전히 세포 활성화 반응의 상당한 감소를 나타낸다(Appleby et al.,Cell 70:751-763 (1992); Stein et al.,Cell 70:741-750 (1992)).

T 세포에서 Lck 키나제는 CD4 및 CD8 보조수용체(coreceptor)를 통해서 간접적으로 TCR과 결합한다 (Rudd et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5190-5194 (1988); Shaw et al.,Cell 59:627-636 (1989); Turner et al.,Cell 60:755-765 (1990); Veillette et al.,Cell 55;301-308 (1988)). 항원-반응성 세포주(antigen-responsive cell line)에 있어서의 Lck의 과발현은 Fyn에서 발견되는 것과 유사한 방식으로 수용체 감수성(receptor sensitivity)을 강화시킨다(Abraham and Veillette,Mol. Cell. Biol. 10:5197-5206 (1990); Davidson et al.,J. Exp. Med. 175:1483-1492 (1982); Luo and Sefton,Mol. Cell. Biol. 12:4724-4732 (1992)). CD4-의존성 쥐 T 세포 하이브리도마 모델에 있어서, 항원-특이성 헬퍼 기능의 재구성은 Lck와 상호작용할 수 있는 CD4 분자들에 의해서만 이루어질 수 있다(Glaichenhaus et al.,Cell 64:511-520 (1991)).

그러나, 항원 수용체-매개 신호법(antigen receptor-mediated signalling)에 있어서의 Lck 키나제의 직접적인 관여에 대한 가장 유력한 증거는 Lck를 갖지 않는 돌연변이 세포주의 연구로 부터 수득된다. 두 가지의 이러한 세포주들이 연구되었는데, 하나는 Jurkat 사람 T 세포 백혈병 세포주로 부터 유래된 것이고(Goldsmith and Weiss,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6879-6883 (1987)); Straus and Weiss,Cell 70:585-593 (1992)), 다른 하나는 쥐의 세포독성 T 세포 클론 CTLL-2로 부터 유래되는 것이다 (Karnitz et al.,Mol. Cell. Biol. 12:4521-4530 (1992)). 양자의 Lck-음성 돌연변이주들은 TCR 매개 신호법에 있어서 결함을 갖고, Lck 발현 플라스미드의 트렌스펙션에 의한 양자의 돌연변이주의 보완(complementation)은 TCR 교차결합 자극에 대한 반응성을 회복시킨다(Karnitz et al.,Mol. Cell. Biol. 12:4521-4530 (1992)); Straus and Weiss,Cell 70:585-593 (1992)).

최근 초기에는 밀접하게 관련되거나 또는 동일한 키나제 Syk(Taniguchi et al.,J. Biol. Chem. 266;15790-15796 (1991)) 및 PTK 72 (Zionchek et al.,J. Biol. Chem. 261:15637-15643 (1986); Zionchek et al.,J. Biol. Chem. 263:19195-19202 (1988))로 표현되었던 티로신 키나제의 신규 군의 구성원들이, 세포 표면 항원 수용체들과 결합하는 것으로 확인되었다. PTK 72 및 Syk가 동일한 것으로 확실히 증명되지는 않았지만, 이들은 공통된 조직 분포(흉선 및 비장), 분자량, 및 단백질분해에 대한 불안정성을 공유한다. PTK 72는 B 세포 IgM 수용체와 결합하고(Hutchcroft et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9107-9111 (1992); Hutchcroft, et al.,J. Biol. Chem. 267:8613-8619 (1992)), 항-IgM과의 수용체의 교차결합시에 인산화되는 것으로 증명되었다(Hutchcroft, et al.,J. Biol. Chem. 266:14846-14849 (1991)). 외인성 단백질 단편의 자동인산화 및 인산화에 의해 측정되는 효소들의 부수적인 활성화가 표면 IgM 교차결합후에 확인되었다 (Hutchcroft et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9107-9111 (1992); Hutchcroft, et al.,J. Biol. Chem. 267:8613-8619 (1992)). PTK 72도 쥐 호염기성 백혈병 세포주에서 고친화성 IgE 수용체와 결합하는 것으로 밝혀졌다(Hutchcroft et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9107-9111 (1992); Hutchcroft, et al.,J. Biol. Chem. 267:8613-8619 (1992)).

Syk군의 두 번째 구성원인 ZAP-70은 수용체 교차결합후 T 세포 수용체의 제타 쇄와 결합하는 PTK인 것으로 밝혀졌다(Chan et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9166-9170 (1991)). ZAP-70, Fyn 또는 Lck의 COS 세포에서의 발현이 총 세포 티로신포스페이트상의 약간의 증가를 초래하기는 하지만, ZAP-70과 Fyn 및 Lck 둘 중 하나의 동시발현은 순수한 티로신 인산화를 급격하게 증가시킨다(Chan et al.,Cell 71:649-662 (1992)). 만약 CD8-제타 쇄 키메라도 존재한다면, 키메라는 인산화되고 ZAP-70은 그것과 결합하는 것으로 발견될 것이다(Chan et al.,Cell 71:649-662 (1992)). 현재 ZAP-70이 Src 군 키나제를 활성화하는지 및/또는 그 반대인지 명확하게 밝혀져있지 않을뿐만 아니라, COS 세포에서 키나제들의 동시발현이 왜 현저한 항구적 활성화(aparent constitutive activation)를 초래하는지 분명하지 않다. 그럼에도 불구하고 ZAP-70과 교차결합된 TCR의 활성적 결합이 이러한 PTK의 수용체 반응의 증가에 있어서의 역할을 암시해준다.

Src 군 키나제들과 달리, Syk 및 ZAP-70은 두 개의 SH2 도메인을 갖고 N-말단 미리스토일화 부위(N-terminal myristoylation site)를 갖지 않는다(Taniguchi et al.,J. Biol. Chem. 266: 15790-15796 (1991); Chan et al.,Cell 71:649-662 (1992)). 키나제-수용체 결합에 대한 하나의 가능한 메카니즘은 두 개의 SH2 도메인이 일단 인산화된 후 항원 수용체 개시 모티브의 두 개의 티로신과 결합하는 것이다. 그러나, 이것은 아직까지 가설일 뿐이다.

발명의 요약

본 발명은 단백질-티로신 키나제 분자의 세포내 도메인과 표적인식 작업을 수행할 수 있는 세포외 도메인 사이의 키메라 형성의 가능성을 증명한다. 특히, Syk 또는 ZAP-70 키나제 서열을 포함하는 키메라의 집합은 칼슘 가동화를 개시시킨다. Syk 키메라만의 집합 또는 Fyn 또는 Lck 및 ZAP-70 키나제를 갖는 키메라의 공동집합(coaggregation)은 세포용해 이펙터 기능을 개시시키는데 충분하다. 이러한 이펙터 기능은 바람직하지 못한 표적세포, 예컨대, 병원체, 병원체-감염세포, 종양세포, 또는 자가면역세포의 특이적인 인식과 파괴를 촉진한다.

본 발명에 따른 임의의 수의 유용한 키메라 분자들이 구성될 수 있다. 예를들어, 적절하게 유전자조작된 항체 분자의 세포외 부분에 결합된 단백질-티로신 키나제의 세포내 부분으로 구성되는 키메라의 형성은 면역 시스템 세포의 표적인식능력이 세포외 항체 부분에 의해 인식되는 항원쪽으로 특이적으로 방향전환되도록 할 수 있다. 따라서 병원체 표면상의 일부의 결정부위를 인식할 수 있는 항체부분에 의해, 키메라가 실장된 면역시스템 세포들은 그들의 계통에 적합한 이펙터 프로그램에 따라 병원체의 존재에 반응할 것이다. 예를들어, 헬퍼 T 림프구들은 표적에 대해 세포독성 활성으로 반응할 것이고, B 림프구는 항체를 합성하도록 활성화될 것이다. 마크로파지 및 과립구들은 싸이토카인 방출, 식작용, 및 반응성 산소 생산을 포함하는 그들의 이펙터 프로그램을 실행할 것이다. 마찬가지로, 종양세포를 인식할 수 있는 항체부분에 의해, 종양에 대한 면역 시스템 반응은 바람직하게 향상될 것이다. 자가 결정부위에 대한 부적절한 반응성을 갖는 면역세포를 인식할 수 있는 항체에 의해, 자가반응 세포(autoreactive cells)들은 파괴를 위해 선택적으로 표적화될 수 있다.

이러한 실례들이 편리한 설명 수단으로서 항체 키메라의 이용에 관하여 작성되었지만, 본 발명은 항체 키메라의 범주로 국한되지 않으며, 실제로는 특이적인 비항체 세포외 도메인의 이용이 중요한 이점을 구비할 수 있다. 예를 들어, 바이러스, 세균 또는 기생충에 대한 수용체 세포외 부분에 의해, 키메라가 실장된 세포들은 바이러스, 세균 또는 기생충 결정부위를 발현하는 세포들을 특이적으로 표적화할 것이다. 항체 이용을 능가하는 이러한 접근방법의 이점은 병원체에 대한 천연 수용체(native receptor)가 병원체에 대하여 유일하게 높은 선택성 또는 친화성을 구비하여, 그 결과 면역반응에 있어 높은 정도의 정확성을 기할 수 있다는 것이다. 마찬가지로, 자가항원과 부적절하게 반응하는 면역시스템 세포를 제거하기 위해서는, 항원(B 세포 고갈요법(depletion therapies)에 있어서는 완전한 단백질로 또는 T 세포 고갈요법에 있어서는 MHC 복합체로)을 세포내 단백질-티로신 키나제 쇄와 결합시켜, 자가결정부위에 부적절하게 반응하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것으로 충분할 수 있다.

키메라의 다른 용도는 다른 형태의 유전자 조작후의 생체내(in vivo )에서의 세포 집단의 제어이다. 예를 들어, 종양부위에 세포독 원리를 적용하기 위한 종양침윤림프구 또는 자연살세포의 이용이 제안되어 있다. 본 발명은 생체외(in vitro)에서 증폭시키기 위해 환자의 체내로 부터 적출해내지 않고도, 이러한 림프구 및 세포의 수 및 활성을 조절하는 편리한 수단을 제공한다. 따라서, 카메라의 세포내 도메인이 세포의 증식반응을 매개하기 때문에, 세포외 도메인에 대해 특이적인 자극(예컨대, 세포외 도메인에 대해 특이적인 항체)의 여러 가지 집합에 의한 세포외 도메인들의 협조는 키메라를 포함하는 세포의 증식을 초래할 것이다.

본 발명의 특정한 실시양태가 Syk 또는 Syk 및 Src군 단백질-티로신 키나제들 사이의 키메라를 포함하기는 하지만, 이러한 분자들과 유사한 기능을 갖는 어떠한 티로신 키나제라도 본원에 개시된 목적을 위해 이용될 수 있다. 바람직한 면역세포 개시 분자들의 독특한 특징은 자발적으로 발현되는 능력, 결과 키메라가 치료 세포의 표면상에 존재하도록 세포외 도메인에 융합되는 능력(직접적으로 또는 막간 단백질을 통해 간접적으로), 및 표적 리드간와의 대면에 이어 집합할 때 세포 이펙터 프로그램을 개시하는 능력을 포함한다.

현재 키메라를 면역시스템 세포로 전달하는 가장 편리한 방법은 몇몇 형태의 유전자 요법(genetic therapy)을 통하는 것이다. 그러나, 세포들을 적절하게 용해화된 정제 키메라 단백질과 혼합함으로써 키메라 수용체를 갖는 면역시스템 세포를 재구성하는 것도 키메라의 세포외 도메인에 의해 인식되는 표적에 반응할 수 있는 유전자조작된 세포 집단의 형성을 초래한다. 예를 들어, 유사한 접근방법이 완전한 HIV 수용체, CD4를 치료목적을 위해 적혈구내로 도입하는데 이용되어 왔다. 이 경우에, 유전자조작된 세포 집단은 자가 복제할 수 없을 것이다.

본 발명은 면역시스템 기능을 방향전환시킬 수 있는 기능성 단순화 단백질-티로신 키나제 키메라(simplified protein-tyrosine kinase chimeras)에 관계한다. 더욱 상세하게, 본 발명은 림프구, 마크로파지, 자연살세포 또는 과립구로 하여금 키메라에 의해 인식되는 표적에 대해 반응하도록 하는 키메라의 상기 세포내에서의 발현에 의한 상기 세포들의 조절에 관계한다. 본 발명은 또한 감염성 병원체(infective agent), 종양 또는 암세포, 또는 자가면역-발생 세포에 대하여 세포반응을 유도하는 방법에도 관계한다. 포유동물에 있어서 세포 반응을 유도하는 방법은 상기 포유동물에 상기 감염성 병원체, 종양, 암세포, 또는 자가면역-발생 세포를 인식해서 파괴할 수 있는 유효량의 치료세포를 투여하는 과정을 포함한다. 세포 반응은 하나의 키메라에 의해 매개되거나 또는 복수의 키메라들의 협동작용의 결과일 수 있다 (예를 들어, 한 셋트의 두 개 이상의 키메라들, 이들 중 하나는 CD28 세포내 도메인 포함).

다른 실시양태에 있어서, 감염성 병원체에 대하여 세포반응을 유도하는 방법은 상기 병원체를 인식해서 파괴할 수 있는 치료세포를 투여하는 과정을 포함하는데, 여기서 상기 병원체는 특수한 바이러스, 세균, 원생동물 또는 진균류이다. 더욱 상세하게, 상기 방법은 HIV 및 주폐포자충(Pneumocystis carinii)과 같은 감염성 병원체에 대항하는 것에 관계한다.

HIV 감염을 치료하기 위해서, 유효량의 키메라-수용체 발현 세포독성 T 림프구가 환자에게 투여된다; 상기 림프구는 순환하는 바이러스는 물론 HIV에 의해 감염된 세포를 특이적으로 인식해서 용해시킬 수 있다.

따라서, 하나의 실시양태에 있어서, 본 발명에 따라 HIV에 의해 감염된 세포를 특이적으로 인식해서 용해시킬 수 있는 유효량의 세포독성 T 림프구를 환자에게 투여하는 과정을 포함하는, HIV 감염된 세포에 대하여 세포반응을 유도하는 방법이 제공된다.

다른 실시양태에 있어서 세포독성 T 림프구로 하여금 HIV 감염된 세포를 인식해서 용해시키도록 지시하는 키메라 수용체 단백질이 제공된다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 키메라 수용체를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 포함한다.

다수의 키메라 면역 수용체의 제조방법 및 발현방법은 물론 이들의 여러 가지 치료적 이용이 본원에 참고자료로 첨부된 미합중국 특허출원 제 07/847,566호 및 동 07/665,961호에 상세하게 설명되어 있다.

이들 및 본 발명의 기타의 비제한적 실시양태들은 본 발명의 후술하는 상세한 설명으로 부터 당업자들에게 자명해질 것이다.

후술하는 발명의 상세한 설명에 있어서는, 분자생물학 및 면역학 분야의 당업자들에게 공지되어 있는 여러가지 방법론을 참고할 것이다. 본 발명이 참고로 한 이러한 공지의 방법론이 기술된 간행물 및 기타의 자료들은 본원에서 충분하게 기술하였지만 그래도 전문을 참고자료로 첨부한다.

재조합 DNA 기술의 일반적인 원리를 기술한 표준 참고문헌으로는 Watson, et al.,Molecular Biology of the Gene, Volumes Ⅰ and Ⅱ, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell, et al.,Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin,Genes Ⅱ, John Wiley Sons, publishers, New York, N.Y. (1985); Old, et al.,Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2nd edition, University of California Press, publisher, Berkeley CA (1981); Maniatis, et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989); 및 Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Press, New York, N.Y. (1989).

정 의 (DEFINITIONS)

클로닝(cloning)”이라 함은 생체외(in vitro) 재조합 기술을 이용하여 특정한 유전자 또는 다른 DNA 서열을 벡터 분자내로 삽입하는 것을 뜻한다. 목적 유전자를 성공적으로 클로닝하기 위해서, 벡터분자에 단편을 연결시키 위한 DNA 단편을 만드는 방법, 합성 DNA 분자를 그 안에서 합성 DNA가 복제할 수 있는 숙주세포내로 도입하는 방법, 수용숙주세포 중에서 표적 유전자를 포함하는 클론을 선별하는 방법을 이용할 필요가 있다.

cDNA라 함은 RNA 주형으로 부터 RNA-의존성 DNA 폴리머라제(역전사효소)의 작용에 의해 만들어진 상보성 DNA 또는 사본 DNA(copy DNA)를 말한다. 따라서 cDNA 클론은 클로닝 벡터에 실린 목적 RNA 분자에 대해 상보성인 이중쇄 DNA 서열을 의미한다.

cDNA 도서관이라 함은 cDNA 도서관이 만들어졌을 때 세포에 의해 발현될 mRNA의 DNA 사본을 갖는 cDNA 삽입물을 포함하는 재조합 DNA 분자들의 수집물을 의미한다. 이러한 cDNA 도서관은 당업자들에게 공지되어 있고 예컨대, Maniatis등에 의해 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual,supra) 기술된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 일반적으로, 우선 그의 게놈으로 부터 특정한 유전자를 클로닝하고자 하는 생물체의 세포로 부터 RNA를 분리해낸다. 본 발명의 목적상 바람직한 것은 포유동물, 및 특히 사람 림프구 세포주이다. 현재 이러한 목적을 위한 바람직한 벡터는 백시니아 바이러스 WR 균주이다.

벡터(vector)라 함은 예컨대, 플라스미드, 박테리오파아지, 또는 포유동물 또는 곤충 바이러스로 부터 유래된, 그 내부에 DNA 단편이 삽입되거나 또는 클로닝될 수 있는 DNA 분자를 뜻한다. 하나의 벡터는 하나 이상의 독특한 제한부위(restriction site)를 포함하고, 클로닝된 서열이 재생될 수 있도록 제한된 숙주 또는 비히클 생물체내에서 스스로 복제할 수 있다. 따라서, DNA 발현 벡터(DNA expression vector)라 함은 재조합 펩타이드의 합성을 지시할 수 있는 임의의 자율적인 요소(autonomous element)를 의미한다. 이러한 DNA 발현 벡터들은 세균 플라스미드 및 파아지 및 포유동물 및 곤충 플라스미드와 바이러스를 포함한다.

실질상 순수하다(substantially pure)는 것은 자연적으로 그에 부수되는 성분들을 갖고 있지 않은 화합물, 예컨대, 단백질, 폴리펩타이드, 또는 항체를 의미한다. 일반적으로, 화합물은 시료내 총물질의 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 75%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 90%가 목적 화합물인 경우에 실질상 순수하다. 순도는 임의의 적당한 방법, 예컨대, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다. 핵산의 경우에, 실질상 순수하다는 것은 본 발명의 DNA가 유래되는 생물체의 자연발생 게놈에서는 그것이 바로 옆에 접해있는(즉 하나는 5' 말단에 그리고 하나는 3'말단에) 양자의 암호서열에 직접적으로 인접해있지 않은(즉, 공유결합되어 있지 않은) 핵산서열, 분절, 또는 단편을 의미한다.

기능성 유도체(functional derivative)라 함은 일정한 분자의 단편(fragments), 변형물(variants), 유사체(analogues) 또는 화학적 유도체(chemical derivatives)를 의미한다. 본 발명의 임의의 cDNA 서열과 같은 분자의 단편(fragments)은 분자의 임의의 뉴클레오티드 아집단(subset)을 말한다. 이러한 분자의 변형물(variants)은 전체 분자 또는 그의 단편과 상당히 유사한 자연발생 분자(naturally occuring molecule)를 의미한다. 분자의 유사체(analog)라 함은 전체 분자 또는 그의 단편과 상당히 유사한 인조 분자(non-natural molecule)를 말한다. 양 분자에 있어서의 아미노산 서열이 실질상 동일할 때 하나의 분자는 다른 분자와 실질상 유사하다고 일컬어진다. 특히, 실질상 유사한 아미노산 서열은 천연 또는 레퍼런스 서열과 적어도 50%, 바람직하게 85% 그리고 가장 바람직하게 95%의 서열 동일성을 시현하는 것 및/또는 천연 또는 레퍼런스 아미노산 서열과 단지 보존적 아미노산 치환만 차이나는 아미노산 서열이다. 실질상 유사한 아미노산 분자들은 유사한 생물학적 활성을 갖는다. 따라서, 두 분자가 유사한 활성을 갖는다면, 분자들중 하나가 다른 하나에서는 발견되지 않는 아미노산 잔기를 부가적으로 포함하거나 더 적은 수의 아미노산을 포함하거나 또는 아미노산 잔기의 서열이 동일하지 않다고 하더라도, 그들은 그 용어가 본원에 이용될 때 변형물(variants)로 간주된다. 본원에서 이용될 때, 분자가 통상적으로는 그 분자의 일부분이 아닌 부가적인 화학적 부분들(chemical moieties)을 포함할 때 그 분자는 다른 분자의 '화학적 유도체(chemical derivative)라고 말해진다. 이러한 부분들은 분자들의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 향상시킬 수 있다. 그렇지 않으면 이 부분들은 분자의 독성을 감소시키거나, 분자의 바람직하지 못한 임의의 부작용을 제거하거나 감약화할 수 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 부분들은 예컨대,Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)에 기술되어 있다.

마찬가지로, 본 발명의 수용체 키메라 유전자의 기능성 유도체는 뉴클레오티드 서열면에서 실질상 유사하고, 단백질-티로신 키나제 키메라와 유사한 활성을 갖는 분자를 코드화하는 수용체 키메라 유전자의 단편, 변형물, 또는 유사체를 포함하는 것을 의미한다. 실질상 유사한 핵산은 실질상 유사한 아미노산 서열(위에서 정의한 바와 같은)을 코드화하고 적당한 혼성화 조건(예컨대, 적당한 혼성화 엄격성 조건에 대해 Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989) 참조)하에서 천연 또는 레퍼런스 핵산 서열과 혼성화할 수 있는 임의의 핵산서열을 포함할 수도 있다.

따라서, 본원에서 사용되는 경우에, 단백질-티로신 키나제 키메라 단백질은 야생형(wild-type) 키메라와 실질상 유사하고 유사한 활성을 갖는(즉, 야생형 수용체 키메라 활성의 적어도 10%, 바람직하게 40%, 더욱 바람직하게 70%, 가장 바람직하게 90%) 모든 기능성 유도체, 단편, 변형물, 유사체 또는 화학적 유도체를 포함하는 의미이다. 기능성 키메라 수용체 유도체의 활성은 표적 병원체 또는 세포에 대한 특이적 결합(세포외 부분에 의한) 및 그 결과의 그 병원체 및 세포의 파괴 (그 세포내 부분에 의해 지시되는)를 포함하고; 이러한 활성은 예컨대, 본원에 개시된 임의의 검정법을 이용함으로써 시험될 수 있다.

본 발명의 키메라를 코드화하는 DNA 서열 또는 그의 기능성 유도체들은 적절한 말단을 제공하기 위한 제한효소분해, 적절한 돌출말단(cohesive end)의 부가, 원치않는 연결을 방지하기 위한 알칼리성 포스파타아제의 처리, 및 적당한 리가아제에 의한 연결(ligation)을 포함하는 종래의 방법에 따라 연결을 위한 평활말단 또는 교차말단(staggered-ended termini)을 갖는 벡터 DNA내에 재조합될 수 있다. 이러한 조작 기술들은 Maniatis 등의 상술한 것과 동일한 문헌에 기술되어 있고 당업계에 잘 알려져 있다.

DNA와 같은 핵산 분자는 전사 및 해독 조절 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열들을 구비하고 이러한 서열들이 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는(operably linked) 경우 폴리펩타이드를 발현할 수 있다(capable of expressing)고 한다. 작동가능한 연결(operable linkage)이란 조절 DNA 서열들과 발현되어야 할 DNA 서열들이 유전자 발현이 가능하도록 연결되어 있는 것을 의미한다. 유전자 발현에 필요한 조절 부위의 정확한 특성은 생물체 마다 다를 수 있지만, 보편적으로는 원핵생물의 경우에, 프로모터(RNA 전사의 개시를 지시하는)와 RNA로 전사될 경우 단밸질 합성의 개시를 신호할 DNA 서열을 포함하는 프로모터 부위를 포함한다. 이러한 부위는 보통 TATA 박스, 캐핑 서열(capping sequence), CAAT 서열 등과 같은 전사(transcription) 및 해독(translation) 개시에 관계되는 5'-비암호 서열(5'-non-coding sequence)들을 포함한다.

요구되는 경우, 단백질을 코드화하는 유전자 서열에 대한 비암호 부위 3′가 상술한 방법에 의해 수득될 수 있다. 이 부위는 종결 및 폴리아데닐화 부위와 같은 전사 종결 조절서열을 포함할 수 있다. 따라서, 단백질을 코드화하는 DNA 서열에 자연적으로 인접하는 3'-부위를 보유함으로써, 전사종결신호가 제공될 수 있다. 전사종결신호가 발현 숙주 세포에서 만족스러운 기능을 발휘하지 못하는 경우에는, 그 숙주세포에서 기능성인 3' 부위로 대체될 수 있다.

두 개의 DNA 서열들(프로모터 부위 서열 및 단백질-티로신 키나제 키메라-코드화 서열과 같은)은 두 가지의 DNA 서열들간의 연결의 성격이 (1) 틀변경 돌연변이(frame-shift mutation)의 도입을 초래하지 않고, (2) 수용체 키메라 유전자 서열의 전사를 지시하는 프로모터 부위 서열의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 프로모터 부위 서열에 의해 전사될 수용체 키메라 유전자 서열의 능력을 방해하지 않는 경우, 작동가능하도록 연결되었다고 한다. 프로모터가 그 DNA 서열의 전사를 달성할 수 있는 경우 프로모터 부위는 DNA 서열에 작동가능하도록 연결된다. 따라서, 단백질을 발현하기 위해서는, 적당한 숙주에 의해 인식되는 전사 및 해독 신호가 필요하다.

본 발명은 진핵세포(특히, 사람 림프구)에서의 발현이 바람직하기는 하지만, 원핵 또는 진핵세포에서의 단백질-티로신 키나제 키메라 단백질(또는 그의 기능성 유도체)의 발현을 포함한다.

본 발명에 따른 항체들은 여러 가지 방법중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라에 결합할 수 있는 다클론 항체들을 포함하는 혈청을 생산하기 위해서, 수용체 키메라 단백질 또는 그의 기능성 유도체를 발현하는 세포들이 동물에 투여될 수 있다.

바람직한 방법에 있어서, 본 발명에 따른 항체들은 단클론 항체들이다. 이러한 단클론항체들은 하이브리도마 기술을 이용하여 제조할 수 있다 (Kohler et al.,Nature256:495 (1975); Kohler et al.,Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al.,Eur. J. Immunol.6:292 (1976); Hammerling et al., In:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. pp.563-684 (1981)). 일반적으로, 이러한 방법들은 동물을 키메라 항원으로 면역화하는 과정을 포함한다. 이러한 동물들의 비세포(splenocytes)를 추출하여 적당한 골수종 세포주(myeloma cell line)와 융합시킨다. 본 발명에 따라 임의의 적당한 골수종 세포주가 이용될 수 있다. 융합 후, 그 결과로서 생긴 하이브리도마 세포를 HAT 배지에서 선택적으로 증식시킨다음, Wands 등에 의해 기술된 대로 제한 희석(limiting dilution)에 의해 클로닝한다 (Wands et al.,Gastroenterology 80:225-232 (1981). 이어서 이러한 선별과정을 통해서 수득된 하이브리도마 세포들을 키메라에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 확인하기 위해 분석한다.

본 발명에 따른 항체들은 다클론 항체 또는 바람직하게 부위 특이성 다클론 항체(region specific polyclonal antibodies)일 수도 있다.

본 발명에 따른 키메라에 대한 항체들은 환자에 있어서 키메라 수용체(또는 키메라 수용체-함유 세포)의 양을 모니터하는데 이용될 수 있다. 이러한 항체들은 면역측정법(immunometric assay) 또는 전위 샌드위치 면역 분섭법(forward sandwich), 역위 샌드위치(reverse sandwich) 면역분석법, 및 동시 샌드위치(simultaneous sandwich) 면역분석법과 같은 샌드위치 면역분석법을 포함하는 당업계에 공지되어 있는 표준 면역진단검정법(immunodiagnostic assays)에 매우 적절하게 이용될 수 있다. 항체들은 면역측정법의 허용가능한 특이성, 감수성 및 정확성을 달성하기 위한 번거로운 실험을 거치지 않고도 당업자에 의해 정해지는 대로 임의의 수의 조합으로 이용될 수도 있다.

면역학의 개괄적인 원리를 기술한 표준 참고문헌은 Roitt,Essential Immunology, 6th ed., Blackwell Scientific Publications, publisher, Oxford (1988); Kimball,Introduction to Immunology, 2nd ed., Macmillan Publishing Co., publisher, New York (1986); Roitt, et al.,Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., publisher, London (1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology in, Burdon, et al., eds.,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, volume 13, Elsevier, publisher, Amsterdam (1984); Klein,Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley Sons, publisher, New York (1982); 및 Kennett et al., eds.,Monoclonal Antibodies Hybridoma: A New dimension In Biological Analyses, Plenum Press, publisher, New York (1980)를 포함한다.

검출(detecting)이라 함은 어떤 물질이 존재하는지 존재하지 않는지를 확인하는 과정 또는 그 물질의 양을 정량하는 과정을 포함하는 것으로 정해진다. 따라서 상기 용어는 정성측정 및 정량측정을 위한 본 발명의 물질, 조성물 및 방법의 이용을 의미한다.

본원에 기술된 것과 동일한 특이성을 갖는 단클론 항체를 분비하는 다른 하이브리도마의 분리는 항-이디오타입 스크리닝 기술 (anti-idiotypic screening)(Potocmjak, et al.,Science 215:1637 (1982))을 이용하여 이루어질 수 있다. 간단히 말해서, 항-이디오타입 항체는 목적 클론에 의해 생산된 항체상에 존재하는 독특한 결정부위를 인식하는 항체이다. 항-이디오타입 항체는 단클론 항체의 소스로 이용된 것과 동일한 계통의 동물을 목적 단클론 항체로 면역화함으로써 제조될 수 있다. 면역화된 동물은 이러한 이디오타입 결정부위(항-이디오타입 항체)에 대한 항체를 생산함으로써 면역화 항체의 이디오타입 결정부위를 인식하여 이에 반응할 것이다.

복제(replication)를 위해, 잡종 세포(hybrid cell)들은생체내(in vivo) 및생체외(in vitro)에서 배양될 수 있다. 높은 생체내(in vivo) 생산은 이것을 현재의 바람직한 배양 방법으로 만든다. 간략히 설명하면, 개개의 잡종 균주로 부터의 세포들을 프리스테인-프라임드 (pristane-primed) BALB/C 마우스의 복강내에 주사하여 고농도의 목적 단클론 항체들을 포함하는 복수(ascites fluid)를 만든다. 아이소타입 IgM 또는 IgG의 단클론 항체들은 당업자들에게 공지되어 있는 컬럼 크로마토그래피 방법에 의해 배양 상청액으로 부터 정제될 수 있다.

본 발명에 따른 항체들은 항체가 액체상으로 이용되거나 또는 고체상 담체에 결합될 수 있는 면역검정법에 이용하기에 특히 적합하다. 또한, 이들 면역검정법에서 항체들은 여러 가지 수단에 의해 검출가능하도록 표지될 수 있다.

본 발명이 속하는 기술분야에는 다수의 서로 상이한 표지(label) 및 표지방법이 알려져 있다. 본 발명에서 이용가능한 유형의 표지의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 형광화합물, 화학발광 화합물, 생물발광 화합물 및 금속 킬레이트 등을 포함하나 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. 당업자들은 항체에 결합시키기 위한 다른 표지들을 알 수 있거나, 또는 그것을 통상의 실험을 이용함으로써 확인할 수 있을 것이다. 더우기, 이러한 표지들의 항체에 대한 결합은 통상적으로 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에게 공지되어 있는 표준 기술을 이용함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 항체를 검출가능하도록 표지할 수 있는 하나의 방법은 항체를 효소에 연결시키는 방법에 의한 것이다. 다음으로 이러한 효소는 그의 기질에 노출되는 경우에, 예컨대, 분광측정 또는 형광측정 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 부분을 만들어내도록 하는 방법으로 기질과 반응할 것이다. 항체를 검출가능하도록 표지하는데 이용될 수 있는 효소의 예들은 말레이트 탈수소효소, 스태필로코컬 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이성질화효소, 효모 알콜 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오즈 포스페이트 이성질화효소, 바이오틴아비딘 과산화효소, 호스래디쉬 과산화효소, 알칼리성 포스파타아제, 아사파라지나제, 글루코스 옥시다아제, β-갈락토시다아제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코오스-Ⅵ-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린 에스테라제를 포함한다.

또한 검출가능하도록 표지된 항체의 존재는 감마 카운터 또는 신틸레이션 카운터를 이용하는 것과 같은 수단에 의해 측정될 수 있는 방사성 동위원소로 항체를 표지함으로써 검출될 수도 있다. 본 발명의 목적상 특히 유용한 동위원소는³H,¹²⁵I,³²P,³⁵S,¹⁴C,⁵¹Cr,³⁶Cl,⁵⁷Co,⁵⁹Fe 및⁷⁵Se이다.

검출가능하도록 표지된 항체의 결합은 항체를 형광 화합물(fluorescent compound)로 표지함에 의해서도 검출될 수 있다. 형광 표지된 항체가 적당한 파장의 광에 노출되는 경우에, 그의 존재는 염료의 형광에 의해서 검출될 수 있다. 가장 흔히 사용되는 형광 표지 화합물로는 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프트알데하이드 및 플루오레스아민이다.

본 발명의 항체들은 또한¹⁵²Eu 또는 기타의 란탄족 원소와 같은 형광 방사 금속을 이용함으로써 검출가능하도록 표지될 수 있다. 이러한 금속들은 디에틸렌트리아민펜타초산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라초산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트 원자단을 이용하여 항체 분자에 부착될 수 있다.

항체들은 또한 그들을 화학발광 화합물에 커플링시킴으로써 검출가능하도록 표지될 수 있다. 이어서 화학발광-표지된 항체의 존재는 화학반응중에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 측정된다. 특히 유용한 화학발광 표지 화합물의 예로는 루미날, 이소루미놀, 써모메틱 아크리디니움 에스테르, 이미다졸, 아크리디니움 염, 옥살레이트 에스테르 및 다이옥스에탄을 들 수 있다.

마찬가지로, 생물발광 화합물(bioluminescent compound)은 본 발명에 따른 항체들을 표지하는데 이용될 수 있다. 생물발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효능을 증가시키는 생물 시스템에서 발견되는 화학발광의 일 유형이다. 생물발광 항체의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 측정될 수 있다. 표지(labeling)의 목적상 중요한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 애쿠오린(luciferase aequorin)을 포함한다.

본 발명의 항체들 및 실질상 정제된 항원은 키트(kit)의 제조에 매우 적합하다. 이러한 키트는 바이알, 튜브 등과 같은, 이용될 별개의 검정 요소(element of the assay)를 포함하는 하나 이상의 용기 수단을 단단히 수용하도록 구획화되는 캐리어 수단(carrier means)을 포함할 수 있다.

키트 형태에 통합될 수 있는 검정법의 유형은 많은데, 예컨대, 경쟁 및 비경쟁 검정법(competitive and non-competitive assays)을 포함한다. 본 발명의 항체를 이용할 수 있는 검정법의 대표적인 예로는 방사선면역측정법(RIA), 효소면역측정법(EIA), 효소결합면역흡착검사(ELISA) 및 면역측정, 또는 샌드위치 면역분석법을 들 수 있다.

용어 면역측정 검정법(immunometric assay) 또는 샌드위치 면역분석법(sandwich immunoassay)은 동시 샌드위치(simultaneous sandwich), 전위 샌드위치(forward sandwich), 및 역위 샌드위치(reverse sandwich) 면역측정법을 포함하는 의미이다. 이들 용어들은 당업자들에게 잘 이해될 것이다. 당업자들은 또한 본 발명에 따른 항체들이 현재 공지되어 있거나 또는 장래에 개발될 수 있는 다른 변형된 검정방법 및 다른 형태의 검정방법에 유용할 것이라는 사실을 이해할 수 있을 것이다. 이들은 본 발명의 범주내에 포함되는 것으로 의도된다.

검정을 실행하기 위한 바람직한 모드에 있어서, 배양 배지(보통 표지된 용해성 항체와 함께 첨가되는)내에 특정한 차단제(blocker)가 존재하는 것이 중요하다. 상기 차단제는 시험 시료내에 존재하는 마우스 면역글로불린에 대한 비특이적인 단백질, 프로테아제, 또는 사람 항체가 고체상 지지대(solid support) 위에 있는 항체 또는 방사성표지된 인디케이터 항체들을 교차결합시키거나 또는 파괴하지 않도록 하여 허위 양성(false positive) 또는 허위 음성(false negative) 결과를 수득하는 일이 없도록 확실히 하기 위해 첨가된다. 따라서, 차단제의 선택은 본 발명에 기술된 검정방법의 특이성을 현저하게 향상시킨다.

검정방법에서 사용된 것과 동일한 클래스 또는 서브클래스(아이소타입)에 속하는 다수의 관련없는(즉, 비특이성인) 항체(예컨대, IgG₁, IgG_2a, IgM 등)들이 차단제로 이용될 수 있다는 사실이 밝혀졌다. '차단제의 농도(보통 1-100 ㎍/㎕)는 적당한 감수성(sensitivity)을 유지하고, 더 나아가서 사람 혈청내의 상호간에 발생되는 교차반응성 단백질들에 의한 원치 않는 방해를 방지하기 위해 중요하다. 또한, “차단제를 포함하는 버퍼 시스템은 최적화될 필요가 있다. 바람직한 버퍼는 생리적 pH 범위의 이미다졸, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS 등과 같은 약유기산(weak organic acids)에 기초한 것들이다. 다소 덜 바람직한 버퍼들은 인산염, 붕산염 또는 탄산염과 같은 무기 버퍼이다. 최종적으로, 기지의 프로테아제 억제제들이 바람직하게 차단제를 포함하는 버퍼에 첨가된다(보통 0.01-10 ㎍/㎖).

본 발명에서 사용되었고 또 사용될 수 있는 다수의 고체상 면역흡착제(solid phase immunoadsorbents)가 존재한다. 잘 알려져 있는 면역흡착제들은 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 덱스트란, 나이론 및 기타의 재료를 포함하며, 이러한 물질 등으로 부터 제조되거나 이러한 물질에 의해 코팅된 튜브, 비드 및 마이크로타이터 플레이트 형태이다. 고정화 항체(immobilized antibodies)들은 아미드 또는 에스테르 결합을 통한 공유결합 또는 흡착과 같은 기술에 의해 고체상 면역흡착제에 공유결합되거나 또는 물리적으로 결합될 수 있다. 당업자들은 기타 다수의 적합한 고체상 면역흡착제 및 그 위에 항체들을 고정화하는 방법을 알 수 있을 것이고 일상적인 실험에 의해 그러한 것을 확인할 수 있을 것이다.

생체내( in vivo ), 생체외( in vitro ) 또는 반응계 자체내( in situ ) 진단법에 있어서, 방사성 핵종과 같은 라벨들은 직접적으로 또는 매개 작용기(intermediary functional group)를 이용하여 본 발명에 따른 항체에 결합될 수 있다. 금속 양이온으로 존재하는 방사성 동위원소를 항체에 결합시키는데 자주 사용되는 매개 작용기는 디에틸렌트리아민펜타초산(DTPA)이다. 이러한 방법에서 결합되는 금속 양이온의 전형적인 예는:^99mTc,¹²³I,¹¹¹In,¹³¹I,⁹⁷Ru,⁶⁷Cu,⁶⁷Ga 및⁶⁸Ga이다. 본 발명의 항체들은 진단목적상 비-방사성 동위원소로 표지될 수도 있다. 이 방법에 있어 특히 유용한 원소들은¹⁵⁷Gd,⁵⁵Mn,¹⁶²Dy,⁵³Cr, 및⁵⁶Fe이다.

본 발명의 항원은 본 발명에 따른 항체를 이용함으로써 실질상 순수한 형태로 분리될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시양태는 실질상 순수한 단백질-티로신 키나제 키메라를 제공하고, 상기 항원은 본 발명에 따른 항체에 의해 인식되고 그것에 결합하는 것을 특징으로 한다. 다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 수용체 키메라 항원과 수용체 키메라에 대한 하나 이상의 항체의 복합체를 형성함으로써 수용체 키메라 항원을 분리하거나 또는 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 실질상 순수한 키메라 항원은 그 다음으로 혈청 또는 요와 같은 시료내에 있는 키메라에 대한 항체를 검출하거나 또는 측정하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시양태는 키메라 항원에 대한 항체를 함유하는 시료를 검출가능하도록 표지된 수용체 키메라와 접촉시키는 단계 및 상기 표지를 검출하는 단계를 포함하는, 시료내에 있는 단백질-티로신 키나제 항원에 대한 항체의 존재 여부 및 그 양을 검출하는 방법을 포함한다. 키메라의 면역반응성 분획 및 면역반응성 유사체(immunoreactive analogues)도 이용될 수 있다. 면역반응성 분획(immunoreactive fraction)이라는 용어는 수용체 키메라에 대해 지향된 항체에 대해 동등한 면역반응을 나타내는 키메라 항원의 임의의 일부분을 의미한다. 면역반응성 유사체(immunoreactive analogue)라는 용어는 수용체 키메라 단백질과는 하나 이상의 아미노산이 상이하지만, 본 발명의 항체에 대해 동등한 면역반응을 나타내는 단백질을 의미한다.

특이적으로 인식하여 결합한다(specifically recognize and binds)는 것은 항체가 키메라 수용체 폴리펩타이드는 인식하여 결합하지만, 생물시료와 같은 일례의 시료내에 있는 관련이 없는 다른 분자들은 인식하여 결합하지 않는 것을 의미한다.

자가 면역-발생 세포(autoimmune-generated cell)라 함은 숙주 조직과 반응하는 항체 또는 자가반응성인 면역 이펙터 T 세포를 만들어내는 세포를 의미하며; 이러한 세포들은 아세틸콜린 수용체에 대한 항체들(예컨대, 중증근무력증을 유발하는) 또는 항-DNA, 항-적혈구, 및 항-혈소판 자가항체(예컨대, 홍반성 낭창 유발)들을 포함한다.

치료 세포 (therapeutic cell)라 함은 특수한 감염성 병원체, 특수한 감염성 병원체에 의해 감염된 세포, 종양 또는 암세포 또는 자가면역-발생 세포를 인식해서 파괴할 수 있도록 본 발명의 키메라에 의해 형질전환된 세포를 뜻한다; 바람직하게 이러한 치료 세포들은 조혈계(hematopoietic system)의 세포들이다.

표적 감염성 병원체 (target infective agent)라 함은 키메라 수용체-포함 치료 세포에 의해 인식될 수 있는 모든 감염성 병원체(예컨대, 바이러스, 세균, 원생생물, 또는 진균류)를 의미한다. 표적 세포라 함은 키메라 수용체-포함 치료 세포에 의해 인식될 수 있는 임의의 숙주 세포를 말한다; 이러한 표적 세포들은 제한 없이 종양 또는 암세포 및 자가면역-발생 세포는 물론 바이러스, 세균, 원생생물, 또는 진균류에 의해 감염된 숙주세포를 포함한다.

세포외(extracellular)라 함은 세포 표면에 노출된 적어도 일부의 분자를 갖는 것을 의미한다. 세포내(intracellular)라 함은 치료세포의 세포질에 노출된 적어도 일부의 분자를 갖는 것을 의미한다. '막간(transmembrane)이라 함은 원형질막에 걸쳐 있는 적어도 일부의 분자를 갖는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 경우에, 세포외 부분, 세포내 부분 및 막간 부분은 인접하는 세포 구획으로 확장하는 측면에 접하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

올리고머화(oligomerize)'라 함은 다른 단백질과 복합되어 이합체, 삼합체, 사합체 또는 그 이상의 고차 올리고머를 형성하는 것을 의미한다. 이러한 올리고머들은 동종-올리고머(homo-oligomer) 또는 이종-올리고머(hetero-oligomer)일 수 있다. 올리고머화 부분(oligomerizing portion)이라 함은 복합체(즉, 올리고머)를 형성시키는 분자의 부분을 의미한다.

세포용해성(cytolytic)이라 함은 세포(예컨대, 병원체에 의해 감염된 세포, 종양 또는 암세포 또는 자가면역-발생 세포)를 파괴할 수 있거나 또는 감염성 병원체(예컨대, 바이러스)를 파괴할 수 있는 것을 의미한다.

면역결핍 바이러스(immunodeficiency virus)라 함은 야생형 형태일 때 영장류 숙주의 T4 세포를 감염시킬 수 있고 렌티바이러스 아과의 바이러스 형태발생 및 모르폴러지 특성을 갖는 레트로바이러스를 의미한다. 이 용어는 제한 없이 HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmn, SIVman, SIVmand, 및 SIVcpz을 포함하는 HIV 및 SIV의 모든 변이체를 포함한다.

MHC-독립성이라 함은 세포의 세포용해 반응이 표적 세포의 표면상에 있는 MHC 클래스 Ⅱ 항원의 존재를 필요로 하지 않는 것을 의미한다.

기능성 세포용해성 신호-변환 유도체 (functional cytolytic signal-transducing derivative)라 함은 야생형 분자의 생물학적 활성의 적어도 10%, 바람직하게 40%, 더욱 바람직하게 70%, 가장 바람직하게 적어도 90%를 유도할 수 있는 기능성 유도체(위에서 정의된 바와 같은)들을 의미한다. 본원에서 사용되는 경우에, 기능성 세포용해성 신호-변환 유도체는 치료세포로 하여금 수용체-결합 병원체 또는 세포를 파괴하도록 직접적으로 신호함으로써 작용할 수 있거나(예컨대, 세포내 키메라 수용체 부분의 경우), 또는 치료 세포의 세포용해성 신호­변환 단백질들과의 올리고머화를 촉진함으로써 간접적으로 작용할 수도 있다(막간 단백질의 경우). 이러한 유도체들은 예컨대, 본원에 개시되어 있는생체외( in vitro ) 검정법을 이용함으로써 그 효능에 대해 시험될 수 있다.

기능성 HIV 엔벨로프-결합 유도체라 함은 임의의 HIV 엔벨로프 단백질에 결합할 수 있는 기능성 유도체(위에서 정의된 바와 같은)를 뜻한다. 기능성 유도체들은 예컨대 본원에 기술되어 있는생체외( in vitro ) 검정법을 이용함으로써 동정될 수 있다.

치료 투여

본 발명의 형질전환된 세포들은 다수의 질환에 대한 치료에 사용될 수 있다. 이러한 형질전환된 세포들을 투여하는 현재의 방법은 양자면역법(adoptive immunotherapy) 또는 세포-전이 요법(cell-transfer therapy)을 포함한다. 이들 방법들은 형질전환된 면역-시스템 세포의 혈류로의 복귀를 가능케한다. Rosenberg,Sci. Am., 62(May 1990); Rosenberg et al.,N. Engl. J. Med. 323:570 (1990).

본 발명의 제약학상의 조성물들은 본 발명의 화합물의 유리한 효과를 경험할 수 있는 임의의 동물에 투여될 수 있다. 이러한 동물중에서 으뜸가는 것은 사람인데, 본 발명이 이렇게 한정되도록 의도되는 것은 아니다.

본 발명은 NIH 인가 제 AI27849호하에 정부의 지원에 의해 성안되었다. 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.

본 발명은 면역 시스템 기능을 방향전환(redirecting)시킬 수 있는 기능성 단백질-티로신 키나제 키메라들에 관계한다. 더욱 상세하게 본 발명은 림프구, 마크로파지, 자연살세포(natural killer cell) 또는 과립구(granulocyte)들이 키메라에 의해 인식되는 표적에 반응하도록 유발하는 키메라의 발현에 의한 림프구, 마크로파지, 자연살세포 또는 과립구의 조절에 관계한다. 또한 본 발명은 치료 세포들이 특수한 감염성 병원체에 의해 감염된 세포, 감염성 병원체 그 자체, 종양세포, 또는 자가면역-발생 세포를 특이적으로 인식하여 파괴할 수 있도록 지시할 수 있는 기능성 단백질-티로신 키나제 키메라에도 관계한다. 더욱 상세하게, 본 발명은 세포독성 T 림프구로 하여금 HIV-엔벨로프 단백질을 발현하는 세포들을 특이적으로 인식하여 용해시키도록 지시할 수 있는 단백질-티로신 키나제 키메라의 제조에도 관계한다. 따라서 본 발명은 HIV 바이러스에 의해 발병되는 AIDS(후천성면역결핍증후군)와 같은 질병의 치료법은 물론 신규한 항-종양 치료법(anti-tumor therapy)을 제공한다.

도 1A는 본 발명의 수용체-키나제 융합 부분들의 구성을 도시한 개략도이다.도 1B는 Jurkat 세포에서 백시니아 재조합체에 의해 발현된 CD16/7/제타, CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk 및 CD16/7/ZAP-70의 유동 세포분석 결과(flow cytometry result)를 도시한 것이다.도 1C는 면역침강된 CD16/7/제타(음성 대조표준), CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk 및 CD16/7/ZAP-70의생체외키나제 활성 검정결과를 도시한 것으로; Fyn 키메라 면역침강체에서 나타나는 저분자질량 종들은 아직 확인되지 않고 있다.

도 2는 TCR-음성 Jurkat 세포에서 키나제 키메라들의 교차결합에 의해 개시된 사이토솔 칼슘 반응(cytosolic calcium response)을 도시한 것이다. 양성 집단의 상대적인 세포내 칼슘 농도(청색 형광에 대한 인도-1 보라 형광의 비율에 의해 측정된)를 나타내었다. 상이한 융합 단백질들을 발현하는 백시니아 재조합체에 의해 감염된 Jurkat 세포들은 항-CD16 mAb 3G8에 노출된 후, 시간 0에서 마우스 IgG에 대한 피코에리트린 접합 염소 F(ab')₂항체에 노출되었다. TCR 제타 쇄 및 FcRⅡB2에 기초한 키메라들은 각각 양성 및 음성 대조표준으로 기능한다.

도 3은 Syk 키나제 키메라를 발현하는 TCR 양성 세포에 있어서의 칼슘 반응의 조기 관여를 도시한 것이다. 감염 및 검정은 상기 도 2에 도시된 대로 수행되었다. Syk 키메라를 발현하는 세포의 상당 부분은 1차 항체의 첨가 이전에 높은 청색 형광에 대한 보라색 형광의 비율을 시현하였다.

도 4A및4B는 항-하이브리도마 치사 분석(anti-hybridoma killing assay)을 도시한 것이다.도 4A는 하이브리도마 표적 세포로 부터 방출된 퍼센트⁵¹Cr-크롬산염을 표적 세포에 대한 이펙터 세포(키나제 키메라 발현 CTL) 비율의 함수로 도시한 것이다; TCR 제타 쇄 및 FcRⅡB2의 세포내 도메인을 포함하는 수용체 키메라를 발현하는 세포들은 각각 양성 및 음성 대조표준으로 기능한다.도 4B는 치사의 특이성(방관자 치사가 없는)을 도시한 것이다. BW5147 세포(표면 항-CD16 항체가 없는)들에⁵¹Cr-크롬산염을 로딩하고 크롬산염-로딩된 3G8 세포의 유사 시료와 동일한 조건하에서 키나제 키메라를 발현하는 CTL에 노출시켰다. BW5147 세포로 부터는 검출가능한 크롬산염의 방출이 관찰되지 않았다.

도 5A, 5B및5C는 ZAP-70, 및 Fyn 또는 Lck의 동시발현(coexpression)이 세포용해를 유도하고 칼슘 반응에 대한 잠복기를 감소시킨다는 것을 도시한 것이다. CTL을 표시된 키메라를 발현하는 백시니아 재조합체로 동시 감염시켜 세포용해 효능 또는 칼슘 가동화에 대해 분석하였다. 양자의 키메라들을 발현하는 세포들의 분획이 독립적으로 측정되지 않았기 때문에(적어도 하나의 키메라를 발현하는 세포들의 분획은 활성을 기준화하는데 이용되었다) 이러한 분석에 의해 키메라의 효능은 과소평가된다.도 5A는 여러 쌍의 CD16/7/키나제 키메라들을 발현하는 CTL을 이용한 세포용해 분석을 도시한 것이다.도 5B는 여러 쌍의 CD16/7/키나제 키메라들을 발현하는 TCR 음성 세포들의 칼슘 반응을 도시한 것이다.도 5C는 CD4/CD7/Fyn 키메라 및 CD16/CD7/ZAP-70 키메라를 동시에 발현하는 CTL의 세포용해 분석을 도시한 것이다. CD16/7/제타 키메라는 양성 대조표준으로 기능하는 반면에, CD16/7/FcRⅡB2 키메라는 음성 대조표준으로 기능한다.

도 6A및6B는 키나제 결실 또는 점돌연변이를 포함하는 키메라들이 칼슘 가동화와 전환된 세포용해(redirected cytolysis)에 있어 비효율적임을 나타낸 것이다. 키나제 음성 융합 단백질 변이체들을 결실(Syk의 경우) 또는 점돌연변이(ZAP-70의 경우)에 의해 구성하여 칼슘반응 및 세포용해에 대해 시험하였다.도 6A는 TCR 음성세포에 있어서의 칼슘반응을 나타낸 것이고,도 6B는 전환된 세포용해 분석을 도시한 것이다.

도 7A, 7B, 및7C는 사람 Syk에 기초한 키메라들이 돼지의 Syk에 기초한 키메라들과 기본적으로 동등한 효능을 갖는다는 사실을 나타낸 것이다.도 7A는 사람 Syk 서열(서열 5)과 돼지의 Syk 서열(서열 6)을 비교도시한 것이다; 처음 11 및 마지막 7 잔기들은 프라이머 서열에 의해 결정된다.도 7B는 사람 Syk 키메라를 발현하는 TCR 음성 세포의 칼슘 가동화 분석을 도시한 것이다.도 7C는 사람 Syk 키메라를 발현하는 CTL의 전환된 세포용해 분석을 도시한 것이다.

도 8은 키메라 키나제들의 교차결합후의 티로신 인산화 패턴의 변화를 도시한 것이다. 표시된 키메라 또는 여러 쌍의 키메라들을 발현하는 T 세포 항원 수용체-음성 Jurkat 세포들을 항-CD16 및 염소 항-마우스 IgG 2차 항체로 처리한 후 용해시키고 폴리아크릴아마이드상에서 분획화한 후 니트로셀룰로오스로 전이하여 항-포스포티로신 항체로 프로빙하였다. +로 표기된 레인은 교차결합된 세포로 부터의 추출물을 나타내는 것이고, 이에 반해 -로 표기된 레인은 2차 항체에 대한 사전 노출 없이 직접 용해된 것이다. 대조표준 레인들은 세포내 도메인을 포함하지 않는 CD16/7 융합 단백질을 발현하는 TCR-음성 세포들의 유사한 처리에 의해 만들어졌다. 비교를 위해, TCR-양성 Jurkat 세포(야생형 백시니아 바이러스 감염을 포함하거나 또는 포함하지 않는)의 항-CD3 처리 효과를 우측에 도시하였다. 이 판넬의 좌측 부분상의 100kD 근방에 있는 두드러진 밴드는 키나제 키메라들의 예상 분자질량에 상당한다.

도 9는 키메라들의 집합후의 포스포리파제 C-γ1의 티로신 인산화를 도시한 것이다. PLC-γ1은 항체 교차결합된 세포로 부터 면역침강되었고, 면역침강체들은 겔상에서 분획화되어 니트로셀룰로오스로 전이된다음 항-포스포티로신 항체로 프로빙되었다. Fyn과 ZAP-70 키메라들의 집합후에는 보다 제한되기는 하지만 쉽게 검출할 수 있는 인산화 PLC-γ1의 증가가 관찰되는 반면에, Syk 키메라들의 집합후에는 상당한 인산화 PLC-γ1 증가가 관찰되었다.

도 10A및10B는생체외(in vitro) 키나제 분석을 도시한 것이다. 키메라 키나제를 발현하는 세포들은 항체-매개 키메라 교차결합되었고, 그 후, 키나제들은 면역침강되었고 면역침강체들은 내인성 기질(endogenous substrate)의 인산화에 대하여 평가되었다.도 10A는 교차결합되거나(+) 또는 교차결합되지 않은(-) 세포들로 부터 분리된 면역침강체를 이용하여 10분간의 인큐베이션 기간에 걸친 면역침강된 키나제 키메라들의 활성을 비교도시한 것이다.도 10B는 교차결합되거나(+) 또는 교차결합되지 않은(-), Syk 키나제 키메라에 의한 포스페이트 라벨의 내인성 기질로의 동화의 시간에 따른 추이를 도시한 것이다.

집합된 티로신 키나제에 의한 T 세포 활성화

이하에서 본 발명의 구체적인 실시양태를 설명한다. 본 설명에서, 비수용체 키나제(nonreceptor kinases)들이 단순한 집합 이벤트(simple clustering event)에 의해 활성화된다는 사실이 입증된다. 세포내 도메인이 완전한 Src 또는 Syk 군 키나제 서열로 구성된 인조 수용체 키나제(artificial receptor kinases)를 제조하여, 외부 교차결합 자극에 의한 집합의 결과를 조사하였다. Src 및 Syk 군 키나제 활성 사이에는 뚜렸한 차이가 나타났다: 후자의 교차결합은 상당한 세포 활성화를 초래하지 않은 반면에, 전자의 교차결합은 유리 세포내 칼슘 이온의 출현을 초래하였고, Syk의 경우 세포용해 효능의 출현을 초래하였다. ZAP-70 키메라들의 후기 수용체 매개 프로그램의 유도 실패는 ZAP-70 키메라들을 Fyn 또는 Lck 키나제 키메라들과 집합시킴으로써 극복될 수 있다. 이하에서 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 이러한 실시예들은 설명 목적만을 위한 것으로 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

단백질-티로신 키나제 키메라의 구성 및 효능입증

CD16 분자의 세포외 도메인을 코드화하는 DNA 단편을 CD7의 방막(juxtamembranous) 및 막간 도메인을 코드화하는 짧은 스페이서 세그멘트에 부착시킨 후 사람 Lck (Koga et al.,Eur.J. Immunol. 16:1643-1646 (1986)), 쥐 Fyn(T) (Cooke and Perlmutter,New. Biol. 1:66-74 (1986), 돼지 Syk (Taniguchi et al.,J. Biol. Chem. 266:15790-15796 (1991)) 및 사람 ZAP-70 (Chan et al.,Cell 71:649-662 (1992)) 티로신 키나제의 완전한 암호화 서열에 연결함으로써 세포 표면 수용체 키나제를 닮은 단백질들을 코드화하는 유전자 융합체를 구성하였다(도 1A). 그 결과로서 생긴 3부분으로 구성된 유전자 융합체들을 상동재조합 및 이. 콜라이(E. coli) gpt 유전자 생성물의 동시발현에 대해 선별함으로써 재조합 백시니아 바이러스내로 도입하였다. 재조합체에 의한 세포의 감염은 네 가지 키나제 키메라 모두의 효과적인 세포 표면 발현을 초래하였다(도 1B). 그 결과로서 생긴 단백질 키메라들의 항-CD16 항체와의 면역침강에 의해생체외인산화 검정법에서 활성적인 예상 질량의 분자 종의 존재가 밝혀졌다(도 1C).

다음으로 우리는 T 세포 항원 수용체 세포내 도메인에 기초한 융합 단백질에서 발견되는 것과 유사한 방식으로 융합 단백질들의 교차결합이 유리 세포내 칼슘의 축적을 초래하는지를 조사하였다. 이것을 하기 위하여, 우리는 여러 세포들을 백시니아 재조합체로 감염시키고 항체와 세포외 도메인의 교차결합후에 상대적인 세포질 칼슘 농도를 측정하였다. 염료 인도-1이 로딩된 세포에 대해 분광형광측정(spectrofluorimetric)(큰 집단) 및 세포유동분석(flow cytometric)(단일 세포) 측정을 행하였다 (Grynkiewicz et al.,J. Biol. Chem. 260:3440-3450 (1985); Rabinovitch et al.,J. Immunol. 137:952-961 (1986)). CD16의 세포 표면 발현이 피코에리트린 형광 강도에 의해 측정될 때, 상대적으로 좁은 소정의 범위내에 속하는 세포로 부터 수득된 데이타에 대해 유동 세포분석 검정을 실시하였다. 이 범위내에서도 여전히 평균 형광 강도에 있어서의 미세한 변동이 관찰되었지만(세포에 의해 발현되는 키메라들의 하부 분포에 있어서의 차이에 기인하는), 이러한 접근방법은 대략적으로 동일한 수의 수용체들을 포함하는 세포들의 반응을 비교할 수 있게 해준다. 도 2는 T 세포 항원 수용체가 없는 Jurkat 사람 T 세포 백혈병 세포주의 돌연변이체 세포로 부터 수집된 데이타의 분석결과를 나타낸 것이다 (Weiss and Stobo,J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984)). 이들 세포들에 있어서는 Lck 및 Fyn 키메라 모두 교차결합후 칼슘을 가동화할 수 있는 능력을 갖지 않았다. 몇몇 실험에서 Lck 융합 단백질의 집합(clustering)은 음성 대조표준, 저친화성 IgG 수용체 FcRⅡB2 세포내 도메인에 기초한 융합 단백질과 비교할 때 정지 칼슘 농도의 약간의 감소를 초래하였다 (Kolanus et al.,EMBO J. 11:4861-4868 (1992)). ZAP-70 및 Syk 양자에 기초한 융합 단백질들의 집합(aggregation)은 유리 세포질 칼슘 이온의 출현을 효과적으로 향상시켰는데, 대략적으로 T 세포 수용체 제타 쇄의 세포내 도메인을 포함하는 유사한 키메라의 집합 만큼 효과적이었다. ZAP-70 및 Syk 키나제 키메라 모두에서 제타 키메라에 의한 칼슘 가동화 개시 시간에 비해, 칼슘 반응의 개시에 있어서 약간의 지연이 나타났다. T 세포 수용체 양성 세포(도 3)에서, Syk 키메라의 유출 평가(flux evaluation)는 유리 칼슘 이온의 높은 정지 농도에 의해 부분적으로 혼동되었는데, 이것은 칼슘 조절 기구의 항구적 관여를 암시한다.

키메라의 세포용해성 T 세포주로의 도입은 융합 단백질의 이펙터 기능을 유도하는 효능을 사정할 수 있게 해준다. 이러한 검정에 있어서, CD16에 대한 세포 표면 IgG 항체를 발현하는 항-CD16 하이브리도마 세포들 (Fleit et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3275-3279 (1982); Shen et al.,Mol. Immunol. 26:959-969 (1989))을 표적 세포로 이용하였다. 상기 하이브리도마 세포들을⁵¹Cr-크롬산염을 도입하여 표지하였고, 사람 동종특이성(allospecific) 세포독성 T 림프구(CTL) 세포주를 CD16/CD7/키나제 융합 단백질을 발현하는 백시니아 재조합체로 감염시켜 제조된 이펙터 세포와 함께 공동침강시켰다. 키메라 수용체 키나제의 발현은 감염된 CTL 세포가 표적세포에 결합하게 하고, 만약 능력이 있다면, 그들을 용해키도록 하는데, 이러한 과정은 도입된⁵¹Cr-크롬산염의 방출에 의해 측정된다. 실장된 CTL의 상대적인 효능은 일정한 비율의⁵¹Cr-크롬산염 방출을 달성하기 위하여 요구되는 표적세포에 대한 이펙터의 비율을 비교함으로써 측정된다. 도 4A는 Src군 키나제 Lck 및 Fyn (T), 또는 Syk군 키나제 ZAP-70을 포함하는 키메라 수용체들을 발현하는 CTL이 항-CD16 하이브리도마 표적들에 대한 세포용해를 매개할 수 없다는 것을 보여준다. 그러나, Syk 단백질 생성물에 기초한 키나제 키메라를 발현하는 CTL은 본질적으로 T 세포 수용체 제타 쇄의 세포내 도메인에 유사한 방식으로 융합된 CD16으로 구성된 키메라를 발현하는 CTL 만큼 효과적이었다. 무관한 크롬- 적재 표적의 키나제-실장 CTL과의 공침강이 표지된 크롬을 검출가능한 정도로 방출하지 않았기 때문에, CD16/CD7/키나제 키메라에 의해 유도된 세포용해 활성은 세포독성 과립의 비특이적인 방출에 기인하는 것으로 볼 수는 없다(도 4B).

세포용해 검정에 있어서의 Syk 및 ZAP-70 활성 사이의 상이는 이 두 키메라들이 칼슘 반응 검정에서 유사한 활성을 나타내었기 때문에 예상되지 않았다. 비키메라 ZAP-70 및 Src-군 키나제의 동시발현이 COS 세포(Chan et al.,Cell 71:649-662 (1992))에서의 활성화를 초래한다는 증거에 비추어, 우리는 여러 쌍의 키나제 키메라들의 세포용해를 달성하는 상대적인 효능을 평가하였다. CTL 이펙터들을 ZAP-70 및 Lck 키메라, ZAP-70 및 Fyn (T) 키메라, 또는 Lck 및 Fyn (T) 키메라를 코드화하는 재조합 백시니아 바이러스에 의해 동시에 감염시켰다. 도 5A는 ZAP-70 및 Lck 키메라, 또는 ZAP-70 및 Fyn (T) 키메라의 동시발현이 본질적으로 CD16/CD7/Syk 키나제 키메라만을 발현하는 CTL과 동등한 효능의 활성, CD16/CD7/제타 키메라에 의해 나타나는 것 만큼 강한 활성을 CTL에 부여한다는 것을 보여준다. Lck 및 Fyn (T) 키메라의 동시발현은 항-CD16 표적세포에 대해 방향전환될 상당한 세포용해 효능을 허용하지 않는다(도 5A). 여러 쌍의 키나제 융합 단백질들에 의해 동시감염된 세포들의 칼슘 가동화 효능 평가는 ZAP-70 및 Src군 키나제 키메라의 동시발현이 수용체 교차결합에 반응하는 칼슘 가동화 속도를 증가시키고, Lck 및 Fyn (T) 키메라의 동시발현은 유리 세포내 칼슘의 상당한 축적을 결과시키지 않는다는 것을 보여준다(도 5B). 집합(coaggregation)에 의해 유도되는 활성화반응에 있어서의 Fyn 키메라의 역할을 더 자세히 밝히기 위하여, 우리는 CD16 키메라들의 그것과 유사한 방식으로 Fyn에 융합되어 있는 CD4의 세포외 및 막간 도메인으로 구성된 Fyn 키메라를 제조하였다. 도 5C는 유도된 세포용해 검정에 있어서 이러한 키메라들의 유효성이 비교대상 CD16 키메라의 유효성에 비해 10 배지 20배 낮다는 것을 보여주는데, 이는 키메라 키나제들의 물리적 결합이 활성화에 중요하다는 것을 말해준다. 그러나, 두 키메라들을 발현하는 세포의 세포용해 활성은 ZAP-70 키메라만을 발현하는 세포에 대해 관찰되는 것보다 훨씬 높다. 이러한 시스템에서 키나제 발현이 상대적으로 높기 때문에, 잔류 활성이 CD4/Fyn 키메라의 CD16/ZAP-70과의 자발적이고 무작위적인 결합을 반영한다는 사실을 배제할 수 없다.

칼슘 반응 및 세포용해 검정 양자에서 관찰되는 활성화가 관련 키나제 활성에 직접적으로 기인하고, 키나제의 그의 간접적인 집합이 활성화 반응을 개시시키는 기존의 신호변환 요소와의 수동적인 결합에 기인하지 않는다는 사실을 입증하기 위해서, 우리는 돼지 Syk 및 사람 ZAP-70 수용체 키메라 양자의 키나제 음성 변이체를 만들었다. 도 6은 실질상 모든 키나제 도메인이 없거나(Syk의 경우) 또는 포스포트랜스페라제 활성을 제거하는 점돌연변이를 포함하는(ZAP-70의 경우) 수용체 키메라는생체외키나제 활성이 결여되어 있고, 교차결합후의 칼슘 가동화 또는 수용체 전환 세포용해(receptor redirected cytolysis)를 매개할 수 없다는 것을 보여준다.

돼지 Syk와 사람 세포 기구와의 상호작용이 사람 Syk의 상호작용과 동일하지 않을 수 있기 때문에, 우리는 돼지 단백질 서열의 아미노 및 카르복실 말단에 상당하는 프라이머를 가지고 PCR에 의해 사람 Syk 서열을 분리한 후에, 사람 Syk에 기초한 유사한 단백질 키메라를 구성하였다. 도 7A는 키나제 및 2차 SH2 도메인 부분들에 상응하는 PCR 생성물의 분석에서 암시되는 바와 같이, 돼지 및 사람 Syk가 매우 유사한 단백질임을 입증해 준다 (Chan et al.,Cell 71:649-662 (1992)). 이와 일치되게, 사람 Syk 키메라 수용체 단백질들은 칼슘 방출 및 세포용해 검정에서 돼지 구조물과 본질적으로 동일하게 거동하였다(도 7B 및 7C도).

키메라 티로신 키나제들의 집합이 포스포티로신 단백질들의 양에 있어서 상당한 변화를 초래하는지 여부를 확인하기 위하여, T 세포 수용체 음성 세포들을 키메라 키나제들을 코드화하는 백시니아 재조합체로 감염시켰다. 키메라들의 세포외 도메인을 항체들과 교차결합시키고, 활성화된 세포의 전체 세포 용해물을 전기영동에 의해 분획화한 후, 막으로 전이시키고 포스포티로신을 인식하는 항체로 검정하였다. 용해물은 EDTA를 포함하거나 포함하지 않는 바나듐산염의 존재하에서 비이온계 세제로 세포를 파괴시킴으로써 제조되거나, 또는 소디움 도데실 설페이트의 존재하에서 용해시킨 후 유리된 DNA를 절단하기 위해 음파파쇄하여 제조되었다. 각각의 경우에 포스포티로신 단백질의 패턴은 상이하였으며, EDTA를 포함하지 않는 바나듐산염으로 제조된 용해물은 SDS에 의해서만 제조된 용해물에는 존재하지 않는 부가적인 종을 나타내었는데, 이는 EDTA가 포스파타아제는 물론 티로신 키나제의 용해후 작용(postlysis action)를 억제할 수 있다는 것을 암시한다. SDS에 의한 직접적인 용해의 이용은 EDTA 및 바나듐산염의 존재하의 비이온계 세제에 의한 용해에 비해 더욱 더 재현성 있는 단백질 티로신 인산화 패턴을 결과시킨다는 사실이 밝혀졌다. 도 8은 Syk, ZAP-70, 또는 Fyn+ZAP-70을 포함하는 키메라의 집합이 항원 수용체 교차결합후의 증가된 인산화를 시현하는 단백질과 함께 이동하는 몇몇 단백질 종들의 인산화의 출현 및 증가를 결과시킨다는 것을 보여준다. 특히, Syk 키메라 집합에 의해 유도된 밴드의 패턴은 T 세포 수용체-양성 세포에 있어서의 항-CD3 항체에 의해 유도된 패턴과 매우 유사하다(도 8). 이들 중에서 하나는 Syk 키메라의 집합에 의해서뿐만 아니라 Fyn 및 ZAP-70의 공동집합에 의해 유도된 약 150kD 단백질이다. 예비실험에서 이러한 인단백은 포스포리파제 C-γ와 함께 이동하는 것으로 관찰되었다(데이타는 도시하지 않음).

PLC-γ에 대한 키나제 키메라 집합의 효과를 직접적으로 확인하기 위해서, 우리는 키메라를 교차결합시키고, PLC-γ을 단클론항체의 혼합물로 침전시켜, 그 결과로서 생긴 면역침전체를 포스포티로실 단백질의 존재에 대해 검정하였다. 도 9는 Fyn+ZAP-70 키메라의 공동교차결합이 티로신 포스페이트에 있어서 극적인 증가는 아니지만 쉽게 검출가능한 증가를 초래하는 반면에, Syk의 집합은 PLC-γ의 티로신 포스페이트 함량을 현저하게 증가시킨다는 것을 보여준다. Fyn 키메라만을 발현하는 세포들은 수용체 집합후에 증가되지 않는 PLC-γ의 약간의 기본 인산화를 시현하였다(도 9). 동일한 티로신 잔기들이 Syk, Fyn 또는 ZAP-70+Fyn에 의해 인산화되는지 여부는 현재까지 알려져 있지 않다. Fyn 키메라를 발현하는 세포들은 정지 및 유도 칼슘 가동화를 모두 나타내지 않기 때문에, 이들 세포들에서 발견되는 포스포티로신 신호는 포스포리파제 활성화를 매개하는 것과 다른 PLC-γ상의 부위의 이용을 의미할 수 있다.

예비시도에서 포스포티로신 패턴에 있어서의 변화를 설명하기 위해서 우리는생체외자동인산화 검정법에 의해 집합 후의 여러가지 키나제의 활성을 평가하였다. 키메라들을 집합시키고, 면역침강시키고, 면역침강체에 존재하는 단백질 종들내로 포스페이트 라벨을 혼입시키는 그들의 능력을 평가하였다. 도 10A는 이러한 상태하에서 키나제 검정이 10분간 수행된 경우에, 교차결합후 키나제 활성의 증가가 검출되지 않았음을 보여준다. 이러한 검정에 있어서 표지된 포스페이트의 혼입이 30분까지 계속 증가되지만, 어떤 인자가 활성을 제한하는지는 분명하지 않다; 특히 관찰된 반응속도는 키나제가 이용되지 않은 기질로 확산되도록 하는 면역복합체의 분해 속도에 의해 지배될 수 있다. 검정법의 감수성을 최대화함은 물론 이러한 효과를 억제하기 위한 시도에서, 우리는 5 내지 30초간의 매우 짧은 기간에 걸쳐 사전에 교차결합되거나 교차결합되지 않은 Syk 키나제 활성을 평가하였다; 그러나 여기서도 키나제 활성의 현저한 증가는 없었다(도 10B). 아직까지 활성의 증가가 적당한 기질에 의해 증명될 수 있는 가능성을 배제할 수는 없지만, 외인성 펩타이드 기질(cdc 2 잔기 6-20의 Y 19 K 치환)이 키나제 활성의 측정에 이용된 경우에는 Syk 키메라 활성의 집합-유도 증가가 관찰되지 않았다.

가능한 메케니즘

단순한 물리적 자극, 수용체의 결합(receptor aggregation)이 면역 시스템 세포에 대한 특유한 화학적 신호의 전달을 초래하는 메카니즘은 아직 밝혀지지 않고 있다. 종전의 연구들은 Src군 키나제들이 면역 시스템의 다수의 중요한 집합-활성화 수용체들에 결합하는 것으로 발견되고, 이러한 수용체들의 교차결합이 자주 키나제 활성을 증가시킬 수 있다는 것을 증명해주었다. 보다 최근에는 관련 Syk 및 ZAP-70 키나제들이 각각 안정적으로(Syk의 경우) 또는 일시적으로(ZAP-70의 경우) B 및 T 세포 항원 수용체와 결합하는 것으로 발견되었고, 적어도 Syk의 경우는 수용체 교차결합이 키나제 활성을 증가시키는 것으로 보고되었다.

본 연구에서 우리는 Src군 키나제들 Lck 및 Fyn은 아니지만 Syk-군 키나제들의 집합은 T 세포 수용체가 없는 세포에서 칼슘 반응을 초래한다는 것을 입증하였다. 키나제 음성 돌연변이체들은 칼슘 반응을 유도할 수 없기 때문에, 상기 반응은 다른 T 세포 수용체 또는 신호 변환 성분과의 간접적인 결합에 기인하지 않는 것으로 보인다. Syk 키나제를 포함하는 키메라의 집합은 특이적인 세포용해를 유도하는데 충분한데 반하여, ZAP-70 키메라에 의한 유사한 세포용해의 유도는 Src군 키나제의 추가적인 관여를 필요로 한다. 현재 Syk-군 키나제들중 어느 것이 T 세포 활성화에서 보다 중요한 역할을 담당할지는 분명하지 않다: ZAP-70 및 Syk 양자 모두는 본 연구에 이용된 세포주를 포함하는 T 세포에서 발현되고 적어도 하나의 반응성 사람 T 세포주는 특이성 PCR 증폭 생성물에 의해 판단할 때 ZAP-70은 포함하지 않지만 Syk를 포함한다. Syk 키메라 집합 후에 나타난 증가된 단백질 티로신 인산화의 패턴은 T 세포 항원 수용체의 교차결합후에 발견되는 패턴과 매우 유사하다.

비수용체 티로신 키나제(nonreceptor tyrosine kinase)들에 의한 면역 시스템 세포 활성화에 대한 하나의 간단한 모델은 그들의 집합이 물리적 결합(예컨대, 활성 키나제 이합체를 형성함에 의해)에 의해 또는 상호간의 효소작용(예컨대, 교차인산화(crossphosphorylation))에 의해 활성화를 초래하는 수용체-결합 키나제들을 연상시킨다; 이어서 활성화된 효소들은 칼슘 가동화 및 이노시톨포스페이트 합성에 요구되는 중요한 세포내 기질에 작용한다. 이러한 수순의 이벤트에 대한 뒷받침은 수용체 교차결합후의 수용체-결합 키나제 활성의 증가를 보고하는 연구들에서 찾을 수 있다 (예컨대, Bolen et al.,Adv. Cancer Res. 57:103-149 (1991); Burkhardt et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7410-7414 (1991); Eiseman and Bolen,Nature 355:78-80 (1992); Hutchcroft et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9107-9111 (1992); Hutchcroft et al.,J. Biol. Chem. 267:8613-8619 (1992); Tsygankov et al.,J. Biol. Chem. 267:18259-18262 (1992); Wong et al.,Oncogene 7:2407-2415 (1992)). 그러나, 대부분의 경우에 키나제 활성에 대해 보고된 변화는 미약하였고,생체내에서 발견되는 인산화 단백질 패턴에 있어서의 극적인 변화와는 뚜렷한 차이를 나타내었다.생체외키나제 검정을 수단으로 이용할 때 약한 알로스테릭 상호작용에 의한 활성화를 확실하게 배제하는 것은 어렵기 때문에, 우리는 이 점에서 신호 변환 개시에 있어서의 키나제 활성화의 상대적인 중요성에 관하여 명확하게 설명할 수는 없다. 그러나, 본원에 제공된 데이타는 효소 및 기질의 집합-유도 재분할(aggregation-induced repartitioning)이 적당한 생리적 표적에 대한 기존의 활성을 지시하는데 있어 중요한 인자일 수 있다는 것을 암시해준다.

Syk군 키나제에 기초한 키메라의 집합은 약간 지연되기는 하지만 폭 면에서 내인성 T 세포 수용체가 없는 세포에서 제타 수용체 키메라의 집합 후에 발견되는 반응과 유사한 칼슘 반응을 초래한다. 유리 칼슘 이온의 출현에 있어서의 보다 심각한 지연은 ZAP-70 키메라 교차결합 후에 관찰되었는데, 이러한 지연은 ZAP-70 및 Fyn 키메라의 교차결합에 의해서 상당 부분 제거될 수 있다. 현재 관찰된 지연에 대해서는 명확하게 설명할 수 없다. 교차결합이 칼슘 가동화를 촉진시켰기 때문에, 지연이 집합-매개 자동활성화에 대한 ZAP-70의 상대적인 비효율성에서 비롯되는 것으로 생각된다. 그러나, 다른 인지들도 동등하게 중요할 수 있고, 세포표면에서의 ZAP-70 및 Syk 키나제들의 속박은 정상적인 과정과 비교할 때 활성화에 대해 실제적으로 장애가 될 수 있다; 예를들어, 이벤트의 정상적인 과정에서 Syk군 키나제들이 집합된 수용체들쪽으로 일시적으로 모집되고, 활성화되고, 이어서 그들의 기질로 확산되도록 방출된다면, 키나제 도메인의 원형질막에 대한 영구적인 결합은 키메라 수용체가 키나제 활성화에 대한 일종의 촉매 센터(catalytic center)로 기능하지 못하는 것에 기인하는 기질에 대한 방해적 접근(hindering access) 및/또는 제한적 신호증폭에 의해 제한될 수 있다.

칼슘 반응의 두 번째 특색은 사람 또는 돼지 Syk에 기초한 키메라를 발현하는 T 세포 수용체 양성 세포들이 유리 칼슘 이온의 높은 기본 농도를 시현하였다는 연구결과인데, 이는 칼슘 방출이 자발적으로 개시되었다는 것을 시사해준다. 유사한 연구결과가 수용체 음성 세포에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 사람 T 세포 종양 세포주의 T 세포 수용체 음성 돌연변이체들이 전형적으로 외부로 부터 도입된 개시분자(trigger molecule)에 대해 과반응성인 우리가 관찰했던 일반적인 경향에 배치되는 것이다. 자발적인 활성화 과정에서 T 세포 수용체에 대한 명백한 요구를 설명하기 위해서, 우리는 두 개의 가능한 관련 설명을 제안한다. 하나는 키메라 Syk 키나제가 T 세포 수용체 세포내 도메인에 항구적으로 작용하여 수용체 키메라의 SH2 도메인에 대한 포스포티로신 표적을 만들어, 다가 T 세포 수용체 다리(multivalent T cell receptor bridge)를 통한 세포내 집합을 초래한다음 키나제 활성화를 촉진할 수 있다는 것이다. 다른 가능성은 전체적인 조절 회로(global regulatory circuit)가 가설 키나제의 드 노보(de novo) 합성을 감소시키거나 또는 항원 수용체의 결핍이 조절되지 않은 세포내 통행을 초래하기 때문에, T 세포 수용체 음성 세포주가 Syk의 활성화를 위해 요구되는 막 결합 키나제를 낮은 농도로 포함할 수 있다는 것이다.

B 세포에서, Syk 키나제는 IgM 항원 수용체의 세포내 요소와 항구적으로 결합되어 있는 것으로 보고되었다 (Hutchcroft et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9107-9111 (1992); Hutchcroft et al.,J. Biol. Chem. 267:8613-8619 (1992). 이러한 결합의 정확한 메카니즘은 분명하지는 않지만, 하나의 가능한 메카니즘은 포스포티로신이 Syk SH2 도메인의 mb-1 및 B29 수용체 쇄의 세포질 도메인에 존재하는 티로신 개시 모티브(tyrosine trigger motif)와의 상호작용에 요구되지 않는다는 것이다. 이러한 제안에 대한 부분적인 선례는 필라델피아 염색체 브레이크포인트 클러스터 부위 유전자 생성물 BCR(Philadelphia chromosome breakpoint cluster region gene product BCR)이 포스포티로신에 대해 독립적인 방식으로 여러가지 SH2 도메인에 결합한다는 보고이다 (Pendergast et al.,Cell 66:161-171 (1991); Muller et al.,Mol. Cell. Biol. 12:5087-5093 (1992)). 이 경우에, 포스포티로신 및/또는 포스포트레오닌 잔기들이 상호작용에 있어서 핵심적인 역할을 담당할 것으로 보인다. 그렇지 않으면, Syk는 Syk SH2 요소와 촉매 도메인 사이에 위치된 유일 부위를 통해서 IgM 수용체 세포내 모티브와 결합할 수 있다. 세 번째 가능성은 매우 소량의 티로신 인산화 펩타이드만이 기능상 중요한 농도의 Syk를 원형질막의 내면으로 모집하는데 요구되고, 따라서 이러한 낮은 농도의 티로신 포스페이트는 잘 검출되지 않는다는 것이다.

B 세포에서는 활성화에 있어서의 Src군 키나제에 대한 요구가 분명하게 입증되지는 않았지만, T 세포에서는 두 개의 키나제, Lck 및 Fyn (T)가 신체 및 유기체 유전학에 의해 중요한 역할을 담당하는 것으로 증명되었다 (Appleby et al.,Cell 70:751-763 (1992); Karnitz et al.,Mol. Cell. Biol. 12:4521-4530 (1992); Stein et al.,Cell 70:741-750 (1992); Straus and Weiss,Cell 70:585-593 (1992)). 현재 우리는 이러한 키나제들의 작용이 통상적으로 Syk군 키나제들의 작용에 우선하는지 또는 후속되는지 확고하게 입증할 수 없다. T 세포 활성화에 있어서 ZAP-70의 작용을 설명할 수 있는 하나의 가설은 그의 결합이 수용체 쇄의 일시적인 인산화를 허용하고 이어서 ZAP-70의 활성화 및 후속되는 세포 활성화를 초래하는 수용체-결합 Src군 키나제(receptor-associated Src family kinase)를 연상시킨다. 이 모델에서 제안된 수용체 쇄의 초기 인산화는 수용체 교차결합후 장시간 후에 관찰되는 제타의 안정한 인산화와 구분되어야 한다.

쥐 T 세포에서 작은 비율의 T 세포 수용체 복합체는 다르게 슬라이싱된 형태(Clayton et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5202-5206 (1991))인 에타(eta) (Baniyash et al.,J. Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988))라고 불리우는 제타-관련 분자를 포함한다. 에타는 제타와 카르복실 말단이 다르고, 쥐의 제타에서 발견되는 여섯 개의 티로신의 최말단이 없다 (Jin et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)). 쥐의 TCR 제타-제타 이소폼의 제타 쇄의 인산화는 항체-매개 수용체 교차결합후에 쉽게 검출될 수 있지만, 유사한 상황하에서 TCR 에타 쇄는 검출가능할 정도로 인산화되지 않는다 (Bauer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3842-3846 (1991)). 제타-에타 이종이합체를 포함하는 TCR 이소폼들은 수용체 교차결합후에 인산화되지 않기 때문에, 제타 쇄의 안정한 인산화는 두 개의 가까이 나란히 놓여 있는 제타 쇄를 필요로 하는 것으로 보인다 (Bauer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3842-3846 (1991)). 인산화 면에 있어서의 차이에도 불구하고, 에타 동종이합체만으로 구성된 TCR 이소폼들을 포함하는 세포주는 제타 동종이합체만을 포함하는 세포주와 기능적으로 구분되지 않는다 (Bauer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3842-3846 (1991)). 따라서, 항체 매개 수용체 집합후 30분 경과한 후에 관찰되는 것과 같은, 제타의 인산화는 활성화와 서로 연관되지 않는다. 다른 연구에서, TCR 집합후의 포스포티로신 인단백의 축적의 시간에 따른 추이를 조사해 본 결과 가장 빨리 관찰되는 종들은 질량 135 및 100kD의 두 개의 단백질이고, 이들의 인산화는 교차결합후 각각 5초 및 15초 후에 우선적으로 관찰할 수 있으며, 이들의 반최대 인산화(half maximal phosphorylation)는 양자의 경우에 약 30초로, 칼슘 가동화 및 이노시톨 포스페이트 생성의 반최대 시간 보다 빠르다 (June et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7722-7726 (1990); June et al.,J. Immunol. 144:1591-1599 (1990)). 이와 대조적으로 제타의 인산화속도는 상당히 낮아, 칼슘 축적 및 이노시톨 포스페이트의 유리가 관찰된 후 한참 후인, 대략 자극후 3분 내지 5분 후에 반최대 치환(half maximal substitution)을 초래한다 (June et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7722-7726 (1990); June et al.,J. Immunol. 144:1591-1599 (1990)).

따라서 2 단계 모델이 정확하다면, ZAP-70을 원형질막의 내면으로 모집시키는 것을 필요로 하는 티로신 인산화는 상술한 연구에서 관찰되는 것 보다 빠르고, 아마도 일시적인 이벤트임에 틀림이 없다. 최근 적당히 빨리(약 15초) 개시되는 티로신 인산화가 수용체 교차결합후 제타 및 CD3 입실론 쇄 모두에서 검출될 수 있고(Wange et al.,J. Biol. Chem. 267:11685-11688 (1992)), 티로신 포스페이트를 포함하는 70kD 단백질이 제타 및 입실론 쇄 모두와 결합된 것으로 발견될 수 있다는 사실이 제안되었다. 아직까지 인산화된 수용체 쇄와의 안정한 결합이 성공적인 T 세포 활성화에 필수적인 것인지는 명확하게 밝혀지지 않았다.

그러나, 일반적인 주장으로, 본원에 보고된 결과들은 Syk군 키나제들이 Src군 키나제에 비해 T 세포의 이펙터 기구에 보다 직접적으로 작용한다는 사실을 암시해준다. 많은 증거들은 Src군 키나제들이 CD2 (Bell et al.,Mol. Cell. Biol. 12:5548-5554 (1992)), CD23 (Sugie et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9132-9135 (1991)), CD36 (Huang et al.,J. Biol. Chem. 267:5467-5473 (1992)), IL-2 수용체 베타 쇄 (Hatakeyama et al.,Science 252:1523-1528 (1991)) 및 여러가지 포스파타이딜이노시톨 부착 단백질 (Stefanova et al.,Science 254:1016-1019 (1991); Thomas and Samelson,J. Biol. Chem. 267:12317-12322 (1992))들을 포함하는 항원/Fc 수용체 군의 일원이 아닌 다수의 세포 표면 분자들과 결합할 수 있다는 것을 암시해주는데, 이들중 일부는 T 세포에서의 활성화를 증진시키기 위해 항원 수용체의 부가적인 존재를 필요로 하는 것으로 알려져 있다. 후자의 요구에 대한 간단한 설명은 항원 수용체에 대한 개시 모티브가 Src군 키나제에 대한 기질로 작용하여, Syk군 키나제의 후속 도킹 및 그 이후의 그들의 활성화를 증진하는 약간의 변형 이벤트를 허용할 것이라는 것이다. 인산화 및 활성화의 원인이 되는 쇄를 증명하는 것이 곤란하기는 하지만, 개시 모티브가 모집, 활성화 및 이펙터 키나제의 방출을 위한 일종의 촉매 센터로서 작용하는 일시적인 역할만 갖을 수도 있을 것이다.

Src군 키나제들은 비조혈 계통에 광범위하게 분포되어 있고, Fyn 음성 마우스를 이용한 최근의 연구들은 장기 효능강화(long term potentiation)의 유지, 연합 메모리(associative memory)의 초기 강화의 기초로 생각되는 촉진된 시냅스 전달 현상에 있어 Fyn의 역할을 입증하였다(Grant et al.,Science 258:1903-1910 (1992)). 만약 유사한 활성화 경로가 다른 세포 유형에 있는 Src군 키나제에 의해 매개된다면, Syk군 키나제들은 조혈외 구획 전반에 보다 광범위하게 분포되어 있는 것으로 입증될 수도 있다.

실험 방법

키메라의 구성.사람 Lck (Koga et al.,Eur J. Immunol. 16:1643-1646 (1986)), 쥐 Fyn (T) (Cooke and Perlmutter,New. Biol. 1:66-74 (1989)), 돼지 Syk (Taniguchi et al,J. Biol. Chem. 266:15790-15796 (1991)) 및 사람 ZAP-70 (Chan et al.,Cell 71:649-662 (1992)) 키나제들의 전체 코드화 부위들을 짧은 스톡(stalk) 세그멘트에 연결된 CD16 세포외 도메인 및 CD7의 막간 도메인으로 구성된 키메라 막간 단백질의 세포내 도메인에 부착하였다. CD7 세포내 도메인은 Mlu 부위의 부가에 의해 종결 전이 서열(stop transfer sequence)에서 절단되었다. 여러가지 키나제들은 세 부분으로 구성된 융합 단백질들이 발현될 수 있도록 적당한 해독틀에 있는 Mlu 부위에 의해 개조되었다. 돼지 Syk 서열은 적당한 제한부위를 포함하는 프라이머를 이용함으로써 전체 돼지 림프구 RNA의 역전사 및 PCR에 의해 수득되었다. ZAP-70 서열은 유사한 방법으로 사람 T 세포 cDNA 도서관으로 부터 PCR에 의해 수득되었다. 몇몇 분리체들을 나란히 서열결정하고, 제한 단편 교환에 의해 각 키나제에 대해 돌연변이 없는 코드화 서열(mutant-free coding sequence)을 수득하였다. 그 결과로서 생긴 코드화 서열들을 백시니아 바이러스 발현 벡터내에 CD16/CD7 서열로 부터 하류에 삽입하였다. 사람 Syk를 돼지 서열의 말단에 상응하는 프라이머를 이용함으로써 자연살세포 cDNA 도서관 및 Daudi 세포 도서관으로 부터 분리하였다. 정방향 프라이머(forward primer)는 서열 atg gca gac agt gcc aac cac ttg ccc ttc ttc t (서열 7)를 포함하였고, 역방 프라이머(reverse primer)는 서열 cgc ggg gcg gcc gct tta att cac cac gtc gta gta gta (서열 8)를 포함하였다. 최초 증폭에 의해 예상 크기의 밴드를 찾은 후 서열 cgc ggg acg cgt acc atg gca gac agt gcc aac(서열 9)을 갖는 5' 말단에 있는 연장 프라이머를 이용함으로써 재증폭(10 사이클)을 수행하여, 단편을 Mlu Ⅰ-커트 벡터에 연결하였다.

칼슘 가동화 검정 (calcium mobilization analysis). 재조합 키나제를 발현하는 세포에 대해 전술한 바와 같이 칼슘 감수성 형광단 인도-1을 이용하여 유동 세포분석 및 용적 분광광도 검정(bulk spectrophotometric analyses)을 실시하였다 (Romeo and Seed,Cell 64:1037-1046 (1991); Romeo et al.,Cell 68:889-897 (1992)). 간단히 설명하면, Jurkat 돌연변이 아세포주 JRT 3.T 3.5 (Weiss and Stobo,J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984)) 세포들을 혈청이 없는 IMDM내에서 moi 10으로 1시간 동안 재조합 백시니아 바이러스로 감염시킨후 IMDM, 10% FBS에서 3시간 내지 10시간 동안 인큐베이션하였다. 원심분리하여 세포들을 회수하여 1mM 인도-1 아세토메톡시에스테르(Grynkiewicz et al.,J. Biol. Chem. 260:3440-3450 (1985))(Molecular Probes, Eugene, OR)를 포함하는 완전 배지에 3 × 10⁶/㎖로 재현탁시켜, 37℃에서 45분간 인큐베이션하였다. 인도-1 로딩된 세포들을 펠렛화하고 혈청이 없는 IMDM에 1 × 10⁶/㎖로 재현탁시켜, 실온 암소에서 저장하였다. 세포들을 유동 세포분석법에 의해 보라색 및 청색 형광 방사를 동시에 측정함으로써 유리 칼슘 이온에 대해 검정하였다 (Rabinovitch et al.,J. Immunol 137:952-961 (1986)). 칼슘 유동을 개시시키기 위해, 시간 0에서 접합되지 않은 3G8(항-CD16) 단클론 항체(1㎍/㎖)를 세포현탁액에 첨가한 후 10㎍/㎖의 피코에리트린(PE)-접합 F(ab')₂염소 항-마우스 IgG를 첨가하거나, 또는 PE-접합 항-CD4 항체(Leu-3a, Becton Dickinson)을 첨가한 후 비접합 2차 항체를 첨가하였다. PE 양성(감염된) 세포 집단으로 부터 보라색/청색 방사 비율(violet/blue emission ratio)의 히스토그램을 수집하였는데, 이것은 전형적으로 세포의 40-80%를 나타내었다. 항체를 첨가하기 이전의 보라색/청색 방사 비율은 1로 설정된 표준화된 초기 비율을 구하기 위해 이용되었다.

림프구 세포용해 검정. CD8⁺CD⁴HLA B44 제한 세포용해 주(WH3)를 100U/㎖의 IL-2를 함유하는 IMDM, 10% 사람 혈청에서 유지하였고, HLA B44 반수체형을 갖는 조사된(300rad) 단핵세포로 주기적으로 자극하였다. 세포들을 세포용해 검정에 사용하기 전에 자극후 적어도 10일간 생장시켰다. 세포들을 혈청이 없는 배지에서 1시간 동안 가염중복도(multyplicity of infection)가 적어도 10이 되도록 재조합 백시니아로 감염시킨다음, 완전 배지에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 세포들을 원심분리에 의해 회수하여 밀도 1 × 10⁷/㎖로 재현탁시켰다. 100㎕/웰의 완전배지를 포함하는 바닥이 U자형으로 생긴 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 첨가하였다. 세포들을 연속적으로 2-배 희석하였다. 각 시료당 두 개의 웰들은 자발적인 크롬 방출 및 총 칼슘흡수가 측정될 수 있도록 림프구를 포함시키지 않았다. 10⁶3G8 10-2 표적 세포 (Shen et al.,Mol. Immunol. 26:959-969 (1989))의 분취량을 원심분리하고 50㎕의 멸균⁵¹Cr 소디움 크롬산염(1 mCi/ml, Dupont)에 37℃에서 1시간 동안 간헐적으로 혼합하면서 재현탁시킨다음, PBS로 3회 세정하였다. 배지에 10⁵/㎖로 재현탁된 표지 세포들 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. 마이크로타이터 플레이트를 750×ｇ로 1분간 회전시킨후 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 말기에 각 웰에 있는 세포들을 살살 파이펫팅하여 재현탁시키고, 시료들을 꺼내어 혼입된 총 카운트를 측정하고 마이크로타이터 플레이트를 750×ｇ로 1분간 회전시켰다. 상층액의 100㎕ 분취량을 취하여 감마선 신틸레이션 카운터로 카운팅하였다. 이펙터 대 표적 비율은 감염된 이펙터 세포의 백분율(보통 70%)에 대해 보정하였다.

돌연변이 키나제 키메라의 제조. 키메라를 Stu Ⅰ 및 Not Ⅰ(후자는 카르복실 말단 3'쪽에 바로 존재)으로 절단한 후 Not Ⅰ 부위를 채우고 말단들을 서로 연결함으로써 돼지 Syk 키나제 음성 융합 단백질 변이체를 제조하였다. 그 결과로서 생긴 서열은 돼지 Syk의 처음 298 잔기를 종결전 4개의 외인성 잔기(GPRL)에 연결하였다. ZAP-70의 ATP 결합 부위에 있어서의 점 돌연변이(K369G)는 2중 올리고뉴클레오티드 단편(duplex oligonucleotide fragment)을 Chan 등(Chan et al.,Cell 71:649-662 (1992))에 의해 보고된 서열의 상단 가닥의 뉴클레오티드 잔기 1319와 1345 사이에 위치하는 BalⅠ 및 EarⅠ 부위 사이에 삽입함으로써 제조하였다. 그 결과로서 생긴 서열은 잔기 369에 리신 대신에 글리신을 코드화하였다.

면역침강 및 키나제 검정. 약 2 × 10⁶헬라 S3 세포들을 혈청을 포함하지 않는 DME 배지에서 1시간 동안 재조합 백시니아로 감염중복도가 적어도 10이 되도록 감염시켰다. 감염후 5시간이 경과된 후에, 세포들을 회수하여 PBS로 2회 세정하고 1% Triton X-100, 0.15M NaCl, 0.02M HEPES(pH 7.3), 5mM EDTA, 5mM NaF, 0.2mM Na₃VO₄, 10㎍/㎖ 류펩틴, 10㎍/㎖ 아프로티닌 및 1mM PMSF로 용해시켰다. 얼음에서 10분간 인큐베이션한 후, 핵을 원심분리에 의해 제거하고, CD16 융합 단백질을 항체 BMA209/2 및 단백질-A 세파로오스와 면역침강시켰다. 융합 단백질이 로딩된 수지들을 용해 버퍼(lysis buffer)로 3회 세정한 다음 최종적으로 20mM HEPES(pH 7.3)로 세정하였다. 각 시료에 10μCi의 [γ-³²P] ATP(3000 Ci/mmole)을 함유하는 10㎕의 키나제 버퍼(20mM HEPES(pH 7.3), 10mM MgCl₂, 10mM MnCl₂)를 첨가하였다. 반응은 실온에서 10분간 인큐베이션하도록 방치하였고, 20㎕의 2×시료 로딩 버퍼(4% SDS, 100mM Tris(pH 6.8), 20% 글리세롤, 및 10% β-멀캅토에탄올)를 첨가하여 종결시켰다. 시료를 3분간 끓인 후, 분취량들을 4-15% 경사 겔상에서 주행시켰다. 티로신 20이 리신으로 치환되어 있는 cdc2의 위치 6-20에 상당하는 용해성 펩타이드 기질을 이용한 키나제 검정을 제조자의 권유에 따라 수행하였다(UBI).

단백질 티로신 인산화의 면역블롯 검정. 1시간 동안 TCR 음성 3.5 세포들을 재조합 바이러스 스톡으로 감염시켰다(moi가 적어도 10이 되도록). 이어서 세포들을 37℃에서 8-12 시간 동안 인큐베이션하고, 원신분리 및 세정한 후 혈청을 포함하지 않는 Iscove's 배지에 10⁷세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포들의 분취량을 1㎍ 항체/2-3×10⁶세포들로 항-CD16 mAb (3G8, Medarex 또는 BMA209/2, Behringwerke)와 함께 인큐베이션하였다. 자극된 시료들은 3-5배 과량의 친화성 정제 항-마우스 IgG 1 항체(Southern Biotechnology)와 함께 추가로 인큐베이션하였다. 이어서 세포들을 약간 변형시켜 Secrist, et al.,J. Biol. Chem. 268:5886-5893 (1993))에 따라 처리하였다. 최종 농도 1%로 SDS를 첨가함으로써 인큐베이션을 종결시키고, 시료들을 3분간 끓였다. Heat Systems Ultrasonics, Inc.을 이용하여 DNA를 음파파쇄에 의해 절단하였고, 2× 시료 버퍼를 첨가하고 10⁵내지 2.5 ×10⁵세포들에 상당하는 분취량을 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분리시키고 단백질들을 반건조 전기블로팅(Hoefer)에 의해 니트로셀룰로오스(Schleicher and Schuell BA45)로 전이하였다. 필터들을 1시간 동안 트리스 버퍼 염수와 1.5% 닭 오브알부민(Sigma)을 포함하는 0.05%의 Tween-20(TBST)로 블로킹하고, TBST로 세정한다음 항-포스포티로신 항체 4G10(UBI)를 포함하는 용액내로 1:10000 희석되도록 옮겨 22℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. TBST로 세정한 후, 필터들을 TBST 및 항-마우스 당근무 과산화효소 컨쥬게이트의 1:5000 희석물에서 인큐베이션하였다. 인산화된 단백질 밴드를 화학발광에 의해 검출하였다(ECL, Amersham). 노출시간은 2초와 5분 사이에서 변화시켰다.

사람 IgG1: 단백질-티로신 키나제 키메라의 구성

표적세포에 대해 특이적인 항체 분자의 세포외 도메인 및 단백질-티로신 키나제(예컨대, 본원에 개시된 바와 같은)의 세포내 도메인을 포함하는 키메라 분자들이 제조될 수 있다. 이러한 분자를 만들기 위해서, 사람 IgG1 중쇄(heavy chain) 서열들을 C_H3 도메인에 있는 서열들을 항체 mRNA의 막간 형태의 3' 말단으로 부터 유래된 cDNA 단편에 연결함으로써 제조하였다. 3' 말단 단편은 기질로 톤실 cDNA 도서관 및 각각 목적 DNA 단편의 5' 및 3' 말단에 상응하는 다음과 같은 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써 폴리머라제 연쇄반응법(PCR)에 의해 수득된다:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (서열 1) 및

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (서열 2).

5' 올리고는 사람 IgG1의 C_H1 도메인에 있는 부위에 대해 상보성이고, 3' 올리고는 막주사 도메인을 코드화하는 서열의 5' 부위에 대해 상보성이다. PCR 생성물을 BstⅩⅠ 및 BamHⅠ으로 절단하고 가변 및 불변 부위를 포함하는 반합성 IgG1 항체 유전자의 BstⅩⅠ과 BamHⅠ 부위 사이에 연결하였다. BstⅩⅠ 내지 BamHⅠ 단편의 삽입후에, SmaⅠ 부위 및 3' 올리고 사이의 부분만이 PCR 증폭에 의해 유래되도록 구조물의 증폭된 부분들을 C_H3 도메인에 있는 SmaⅠ 부위까지 제한 단편 교환(restriction fragment interchange)에 의해 대체하였다.

사람 IgG1 키메라 수용체를 만들기 위해, BamHⅠ 부위에서 끝나는 중쇄 유전자 말단부를 표준 기술에 의해 목적으로 하는 키나제 세포내 도메인에 연결하였다. 키메라 수용체의 발현 수준은 유동 세포분석법에 의해 측정될 수 있다. 발현의 증가는 항체 경쇄(light chain) cDNA를 코드화하는 플라스미드의 동시 발현에 의해 달성될 수 있다.

하나의 프로모터로 부터 중쇄 및 경쇄 모두가 발현될 수 있도록 하는 단일 전사 단위(single transcription unit)를 만들기 위해서, 중쇄 및 경쇄 코드화 서열 및 다르게 grp78, 또는 BiP로도 알려진, 78kD 글루코오스 조절 단백질을 코드화하는 mRNA의 5' 비해독 부위로 부터 바이시스트론(bicistronic) mRNA를 코드화하는 플라스미드들 제조하였다. grp78 서열은 각각 5' 및 3' 말단에 있는 다음과 같은 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 사람 게놈성 DNA의 PCR에 의해 수득된다:

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (서열 3) 및

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (서열 4).

이들 올리고들을 이용한 PCR 반응은 10% 디메틸술폭시드의 존재하에서 수행되었다. PCR에 의해 수득된 단편들을 NotⅠ 및 HincⅡ로 분해하고, 사람 IgG1 코드화 서열로 부터 하류의 NotⅠ와 HpaⅠ 부위 사이에 삽입하였다. 이어서 사람 IgG 카파 경쇄 cDNA를 코드화하는 서열을 HincⅡ 부위 및 벡터상의 다른 부위를 이용함으로써 grp78 리더로 부터 하류에 삽입한다. 이러한 조작으로 부터 결과되는 발현 플라스미드는 반합성 중쇄 유전자, 그 다음의 grp78 리더 서열, 그 다음의 카파 경쇄 cDNA 서열, 그 다음의 SV40 DNA 단편으로 부터 유래된 폴리아데닐화 신호로 구성된다. 우리는 이전에 이러한 발현 플라스미드에 의한 COS 세포의 트랜스펙션이 중쇄 결정부위만을 코드화하는 플라스미드의 트랜스펙션에 비해 중쇄 결정부위의 발현을 현저하게 향상시킨다는 것을 증명하였다.

중쇄/수용체 키메라 및 경쇄를 포함하는 바이시스트론 유전자를 만들기 위해, 상류 중쇄 서열들을 본원에 기술된 임의의 키메라 중쇄/수용체 유전자로 대체할 수 있다.

일단 구성되면, IgG-티로신 키나제 키메라들은 발현 벡터내로 클로닝되어 숙주세포내로 도입될 수 있으며, 본원에 개시된 임의의 검정법(예컨대, 칼슘 가동화 또는 세포용해 검정)에 의해 시험될 수 있다.

CD4-티로신 키나제 키메라의 구성

CD4 분자의 세포외 도메인 및 단백질-티로신 키나제(예컨대, 본원에 개시된 바와 같은)의 세포내 도메인을 포함하는 키메라 분자들이 제조될 수 있다. 이러한 분자를 만들기 위해서, 티로신 키나제-코드화 서열(예컨대, cDNA)이 분리된다(예컨대, 상술한 바 대로). 이어서 이들 서열들은 막주사 도메인의 직상류에 있는 BamHⅠ 부위를 갖는 조작된 형태의 CD4의 세포외 도메인에 표준기술에 의해 연결된다 (Aruffo et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987); Zettlmeissl et al.,DNA Cell. Biol.9:347-353 (1990)). 이러한 융합 단백질들을 형성하기 위해서, BamHⅠ 부위가 적당한 위치의 서열내에 조작될 수 있다(표준기술에 의해). 유전자 융합체는 백시니아 바이러스 발현 플라스미드내에 도입되어(본원에 기술된 바와 같이), 상동재조합에 의해 백시니아 WR 균주의 게놈내로 삽입된 후 미코페놀산내에서의 성장에 대해 선별된다(Falkner et al.,J. Virol.62:1849-1854 (1988); Boyle et al.,Gene,65:123-128 (1988)). 유동 세포분석 검정이 백시니아 재조합체에 의한 세포 표면에서의 CD4-티로신 키나제 융합 단백질의 발현을 조사하기 위해 이용되었다. 백시니아 재조합체에 의해 감염된 세포들의 면역침강은 상기 결과를 확인하는데 이용되었다(상술한 바와 같이).

CD4 키메라들의 효능은 본원에 기술되어 있는 칼슘 가동화 또는 세포용해 검정중 임의의 것에 의해 시험될 수 있다. 하나의 특정한 실시예에서, HIV 엔벨로프 gp120/gp41 복합체의 CD4 인식에 기초한 모델 표적:이펙터 시스템이 만들어졌다. HeLa 세포들을 gp120/gp41를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스로 감염시키고(Chakrabarti et al.,Nature320:535-537 (1986); Earl et al.,J. Virol.64:2448-2451 (1990))⁵¹Cr로 표지하였다. 표지된 세포들을 CD4-티로신 키나제 키메라를 발현하는 백시니아 재조합체에 의해 감염된 사람 알로스페시픽(CD8⁺, CD4^-) 세포독성 T 림프구 세포주로 부터의 세포와 함께 인큐베이션하고 특이적인 세포용해에 대해 조사하였다.

백시니아 감염이 CTL에 의한 인위적 인식을 증가시킬 수 있는 가능성을 억제하기 위해서, 유사한 세포용해 실험을 CD16의 포스파타이딜이노시톨 결합된 형태(CD16_PI)를 발현하는 백시니아 재조합체에 의해 감염되고⁵¹Cr로 표지된 표적세포 및 CD16 키메라를 발현하는 대조군 재조합체에 의해 감염된 CTL에 대해 실시하였다.

다른 실시예에서, 순환중에 매우 짧은(∼4시간) 수명을 갖고 강한 세포용해성인 호중성 과립구들은 CD4-티로신 키나제 키메라의 발현과 관련하여 관심을 끄는 세포들이다. 호중구의 HIV에 의한 감염은 바이러스의 방출을 초래하지는 않을 것이고, 이러한 세포들(림프구중에서 가장 우세한)이 많음은 숙주의 방어를 촉진해야만 한다. 다른 가능한 숙주세포는 성숙한 T 세포들인데, 이 군은 현재 레트로바이러스 유전자조작에 이용할 수 있다(Rosenberg,Sci. Am.,262:62-69 (1990)). 재조합 IL-2의 도움으로, T 세포 집단은 컬처 내에서 상대적으로 쉽게 팽창될 수 있고, 팽창된 집단은 다시주입될 때 전형적으로 제한된 수명을 갖는다(Rosenberg, et al.,N. Engl. J. Med.,323:570-578 (1990)).

적당한 조건하에서, CD4 키메라를 발현하는 세포에 의한 HIV 인식은 또한 유사분열촉진 자극을 제공하여, 실장된 세포 집단이 바이러스 부담에 대해 역동적으로 반응할 수 있는 가능성을 제공할 것이다. 본 발명자들이 본원에서 세포독성 T 림프구에서의 융합단백질들의 거동에 촛점을 맞추었지만, 헬퍼 림프구에서의 키메라의 발현은 AIDS에서 헬퍼 세포 아집단의 파괴를 방해할 수 있는 싸이토카인의 HIV-가동화 소스를 제공할 수 있다. 바이러스 침투이외의 단계에서의 감염에 대한 저항성을 조작하는 몇몇 스킴 (Friedman et al.,Nature335:452-454 (1988); Green et al.,Cell,58:215-223 (1989); Malim et al.,Cell,58:205-214 (1989); Trono et al.,Cell, 59:113-120 (1989); Buoncore et al.,Nature345:625-628 (1990))의 최근 설명은 CD4 키메라를 포함하는 세포들이 세포내 작용부위를 갖는 적당한 병원체의 발현에 의해 바이러스 생산을 방해할 수 있도록 설계될 수 있다는 것을 암시한다.

자율성 키메라를 통해서 T 림프구에 신호를 전달하는 능력은 또한생체내(in vivo)에서 레트로바이러스 유전자조작된 림프구의 조절 능력을 제공해준다. 예컨대, 보체-결합 도메인이 제거되도록 조작된 특이성 IgG 항체에 의해 매개되는 교차결합 자극은, 그러한 림프구를 반응계 자체내에서 수적으로 증가시키는 반면에, 유사한 특이성 IgG 항체(예컨대, 키메라 쇄내에 조작된 아미노산 변이를 인식하는)로의 처리는 선택적으로 조작된 집단을 제거할 수 있다. 우리는 이전에 항-CD4 IgM 항체들이 CD4:ζ 키메라를 발현하는 Jurkat 세포에서 칼슘을 가동화하기 위해 추가의 교차결합을 필요로 하지 않는 것으로 결론내렸다. 반복되는 체외 증폭에 의지하지 않고 세포 집단을 조절할 수 있는 능력은 유전자조작된 T 세포에 대해 제안된 현재의 용도의 범위와 효능을 상당히 확장시킨다.

키나제 키메라와 CD28 키메라 수용체의 연계 조절

일부의 키나제 키메라 (ZAP 70 및 Src 군 키나제 키메라)들이 직접적인 세포용해성 치사(direct cytolytic killing)와 연계해서만 기능할 수 있다는 확증은 적당한 키메라 키나제 쌍들의 이용을 통해 세포용해 반응을 조절할 수 있는 기회를 제공한다. 키메라 쌍들의 세포외 도메인들은 종양 세포 표면상의 다수의 결정부위를 인식하여 결합하도록 설계될 수 있기 때문에, 이러한 접근방법은 항-종양 치료법 분야에서 특히 유용하다. 다수의 결정부위들 각각의 결합시(따라서 예컨대, ZAP-70 및 Src 군 키나제들의 관여시)에만 강력한 세포용해 반응이 일어난다. 이러한 접근방법은 암세포가 아닌 세포가 파괴될 가능성 및 빈도를 감소시켜 치료의 특이성을 향상시킨다.

하나의 특정한 실시양태에 있어서, 한 쌍의 키메라들은 각각 표적 종양의 상이한 항원 특성을 인식하는 두 개의 상이한 세포외 도메인들을 포함할 수 있다. 이러한 쌍의 키메라들은 종양 표면상의 두 개의 관련되지 않은 분자들 (예컨대, 두 개의 서로 상이한 단백질 세포 표면 마커들)을 인식할 수 있거나 또는 이 쌍은 동일한 분자의 두 개의 상이한 속성(예컨대, 동일한 세포 표면 단백질에 결합된 항원성 단백질 및 항원성 탄수화물)을 인식할 수 있다. 종양 항원(tumor antigen)들의 예들은, 제한 없이, 다수의 탄수화물 (예컨대, Le^Y, sialyl-Le^Y, Le^x및 sialyl-Le^x), 암배아 항원(carcinoembryonic antigen), CD40, 변현된 CD44, α-페토프로테인(fetoprotein), T 및 Tn 항원, 테나신(tenacin), 및 성장인자수용체(예컨대, HER2/neu) 중의 임의의 것을 포함한다.

더욱이, T 세포 활성화는 CD28의 관여에 의해 증가되는 것으로 확인되었기 때문에, 본 발명은 키메라 수용체 쌍들을 발현하는 치료 세포도 포함하는데, 이들중 하나는 CD28의 세포내 도메인을 포함하고, 다른 하나(또는 그 이상의) 키메라는 본원에 기술된 임의의 단백질-티로신 키나제 세포내 도메인을 포함한다. 일정한 세트의 키메라 수용체들에 있어서, 세포외 도메인들은 동일하거나 (예컨대, 모두 CD4 단밸질로 부터 유래되어 모두 HIV 또는 HIV-감염 세포를 인식하는) 또는 상술한 바와 같이, 각각 하나의 세포 또는 병원체의 표면상의 상이한 표적 분자를 인식하도록 설계될 수 있다.

이러한 연계 조절 방법(method of combinatorial control)은 임의의 수의 협력하는 키메라 수용체들(예컨대, 그것은 ZAP-70 및 Src 군 키나제 키메라의 조합에 의해 이용될 수 있거나 또는 그렇지 않으면, 연계 조절을 더욱 더 촉진하기 위해서 CD28, ZAP-70 키메라 및 Src 군 키나제 키메라들의 조합에 의해 이용될 수 있다)에 까지 확장될 수 있다. 더욱이, 그것은 본 발명의 치료방법을 조절하는데 이용될 수 있다.

CD28 키메라들은 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제작되고 발현된다. CD28 서열은 Aruffo 및 Seed (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987))에 기술되어 있다. 이러한 레퍼런스에는 CD28 세포내 및 막간 도메인의 설명도 포함되어 있다. 세포내 CD28 도메인을 포함하는 키메라의 일례는 Romeo 등(Cold Spring Harbor Symp. on Quant. Biol. LVⅡ:117-125 (1992)에 기술되어 있다.

기타의 실시양태

단백질 키나제 세포내 서열로 구성되는 다른 키메라들을 제조하기 위해, 수용체의 세포외 부분을 코드화하는 cDNA 또는 게놈성 서열에 선택된 세포외 도메인의 바로 앞 위치에 도입된 제한부위를 제공할 수 있다. 이어서 제한부위에서 끝나는 세포외 도메인 단편은 단백질 키나제 서열들에 연결될 수 있다. 전형적인 세포외 도메인은 보체, 탄수화물, 바이러스 단백질, 세균, 원생생물 또는 후생동물 기생충, 또는 이들에 의해 유도된 단백질들을 인식하는 수용체들로 부터 유래될 수 있다. 마찬가지로, 병원체 또는 종양세포에 의해 발현된 리간드 또는 수용체들은 이들 리간드를 인식하는 수용체들을 포함하는 세포에 대하여 면역반응을 유도하기 위해 단백질 키나제 서열에 부착될 수 있다.

세포용해에 필요한 최소 단백질 키나제 서열을 확인하기 위해, 키나제 세포내 도메인의 점점 더 많은 부분이 제거된 일련의 결실 돌연변이들이 표준기술에 따라 제작될 수 있다. 이러한 결실 돌연변이체들은 본원에 기술된 임의의 검정법에 의해 그 효능에 대해 시험된다. Syk 단백질 키나제에 대한 유용한 세포내 도메인들은 예컨대, 돼지 Syk 서열의 336-628 아미노산들 및 사람 Syk 서열의 338-630 아미노산들을 포함한다. Src 군 키나제에 대한 유용한 세포내 도메인들은 예를 들어, SH2 및 SH3 도메인을 포함한다.

본 발명이 특정한 실시양태와 관련하여 설명되기는 하였지만, 추가의 변형이 가능하고 본 발명이 본 발명의 변경, 이용 또는 개조를 포괄하고 본 발명이 속하는 기술분야에 속하고, 하기 첨부된 특허청구범위의 범주에 기술된 본질적인 특징을 갖는 약간 벗어난 것들을 포함하도록 의도되었다는 것이 이해될 것이다.

서열 목록

(1) 일반 정보:

(ⅰ) 출원인: 브라이언 시드

찰스 로미오

웰드마 콜라누스

(ⅱ) 발명의 명칭: 단백질-티로신 키나제 키메라에 의한 세포 면역성의 방향전환

(ⅲ) 서열의 수: 9

(ⅳ) 통신주소:

(A) 수신인: 피시 앤드 리차드슨 피. 씨.

(B) 거리: 프랭클린 스트리트 225

(C) 도시: 보스톤

(D) 주: 메사추세츠

(E) 나라: 미합중국

(F) 우편번호: 02110-2804

(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 미디엄 타입: 3.5 디스켓, 1.44 Mb

(B) 컴퓨터: IBM PS/2 모델 50Z 또는 55SX

(C) 작동 시스템: MS-DOS(버젼 5.0)

(D) 소프트웨어: 워드퍼펙트(버젼 5.1)

(ⅵ) 현출원 데이타

(A) 출원번호: PCT/US96/-----

(B) 출원일:

(ⅶ) 이전 출원 데이타

(A) 출원번호: 08/394,177

(B) 출원일: 1995. 2. 24

(ⅷ) 변호사/대리인 정보:

(A) 성명: 카렌 에프. 리치 박사

(B) 등록번호: 35,238

(C): 참고/도킷 번호: 00786/271001

(ⅸ) 전기통신 정보:

(A) 전화번호: (617) 542-5070

(B) 팩스번호: (617) 542-8906

(C): 테렉스: 200154

(2) 서열 번호 1에 대한 정보: 1:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 33

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33

(2) 서열 번호 2에 대한 정보: 2:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 50

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50

(2) 서열 번호 3에 대한 정보: 3:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 33

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33

(2) 서열 번호 4에 대한 정보: 4:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 33

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33

(2) 서열 번호 5에 대한 정보: 5:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 630

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: N/A

(D) 형태: 직쇄상

(2) 서열 번호 6에 대한 정보: 6:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 628

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: N/A

(D) 형태: 직쇄상

(2) 서열 번호 7에 대한 정보: 7:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 34

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

ATGGCAGACA GTGCCAACCA CTTGCCCTTC TTCT 34

(2) 서열 번호 8에 대한 정보: 8:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 39

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

CGCGGGGCGG CCGCTTTAAT TCACCACGTC GTAGTAGTA 39

(2) 서열 번호 9에 대한 정보: 9:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 33

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

CGCGGGACGC GTACCATGGC AGACAGTGCC AAC 33

먼저 도면에 관하여 설명한다.

Claims (40)

1. 포유동물에 막-결합, 단백질 키메라 수용체를 발현하는 유효량의 치료세포를 투여하는 과정을 포함하는 포유동물에서 세포 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 여기서 상기 단백질 키메라 수용체가 (a) 치료세포에게 수용체-결합 표적세포 또는 수용체-결합 표적 감염성 병원체를 파괴하도록 신호할 수 있는 단백질-티로신 키나제의 세포내 부분 및 (b) 상기 표적세포 또는 상기 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 세포외 부분을 포함하여, 상기 치료 세포 각각이 표적 세포 또는 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식해서 파괴할 수 있는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 표적 세포가 감염성 병원체에 의해 감염된 숙주세포, 종양 또는 암세포, 또는 자가면역-발생 세포인 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 단백질 티로신 키나제가 Syk 키나제 군의 일원인 방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 단백질 티로신 키나제가 Syk인 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 세포내 부분이 사람 Syk 아미노산 336-628 또는 돼지 Syk 아미노산 338-630을 포함하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 치료세포 각각이 제 2의 막-결합 단백성 키메라 수용체를 발현하는 방법으로, 여기서 상기 제 2의 키메라 수용체가 (a) 치료세포에게 수용체-결합 표적세포 또는 수용체-결합 표적 감염성 병원체를 파괴하도록 신호할 수 있는 제 2의 단백질-티로신 키나제의 세포내 부분 및 (b) 상기 표적세포 또는 상기 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 세포외 부분을 포함하여, 상기 치료 세포 각각이 표적 세포 또는 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식해서 파괴할 수 있는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 단백질-티로신 키나제중 하나는 Syk 키나제 군의 일원이고, 상기 단백질-티로신 키나제의 다른 것은 Src 키나제 군의 일원인 방법.
8. 제 6항에 있어서, 상기 단백질-티로신 키나제중 하나는 ZAP-70이고, 상기 단백질-티로신 키나제의 다른 것은 Fyn인 방법.
9. 제 6항에 있어서, 상기 단백질-티로신 키나제중 하나는 ZAP-70이고, 상기 단백질-티로신 키나제의 다른 것은 Lck인 방법.
10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 ZAP-70 부분이 사람 ZAP-70 Tyr 369를 포함하는 방법.
11. 제 1항 또는 제 6항에 있어서, 상기 세포 반응이 MHC-독립성인 방법.
12. 제 1항 또는 제 6항에 있어서, 상기 치료세포가 (a) T 림프구; (b) 세포독성 T 림프구; (c) 자연살세포; (d) 호중구; (e) 과립구; (f) 마크로파지; (g) 비만세포; (h) 헬라(HeLa) 세포; 및 (i) 배성간세포(ES)로 구성되는 군으로 부터 선택되는 방법.
13. 제 1항에 있어서, 상기 표적 감염성 병원체가 면역결핍 바이러스인 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 세포외 부분이 CD4의 HIV-엔벨로프-결합 부분을 포함하는 방법.
15. 제 1항 또는 제 6항에 있어서, 상기 치료 세포가 (a) 상기 표적 세포 또는 상기 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식해서 결합할 수 있는 세포외 부분 및 (b) CD28로 부터 유래된 세포내 부분을 포함하는 막-결합 단백질 키메라 수용체를 추가로 발현하는 방법.
16. 제 1항에 있어서, 상기 치료 세포가 상기 수용체-결합 표적 세포 또는 표적 감염성 병원체를 세포용해에 의해 파괴하는 방법.
17. 막-결합, 단백질 키메라 수용체를 발현하는 세포로서, (a) 치료세포에게 수용체-결합 표적세포 또는 수용체-결합 표적 감염성 병원체를 파괴하도록 신호할 수 있는 단백질-티로신 키나제의 세포내 부분 및 (b) 상기 표적세포 또는 상기 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식하여 결합할 수 있는 세포외 부분을 포함하여, 각각의 치료 세포들이 상기 표적 세포 또는 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식해서 파괴할 수 있는 세포.
18. 제 17항에 있어서, 상기 단백질 티로신 키나제가 Syk 키나제 군의 일원인 세포.
19. 제 18항에 있어서, 상기 단백질 티로신 키나제가 Syk인 세포.
20. 제 19항에 있어서, 상기 세포내 부분이 사람 Syk 아미노산 336-628 또는 돼지 Syk 아미노산 338-630을 포함하는 세포.
21. 제 17항에 있어서, 상기 치료세포 각각이 (a) 치료세포에게 수용체-결합 표적세포 또는 수용체-결합 표적 감염성 병원체를 파괴하도록 신호할 수 있는 제 2의 단백질-티로신 키나제의 세포내 부분 및 (b) 상기 표적세포 또는 상기 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 세포외 부분을 포함하는 제 2의 막-결합 단백성 키메라 수용체를 발현하여, 각각 표적 세포 또는 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식해서 파괴할 수 있는 세포.
22. 제 21항에 있어서, 상기 단백질-티로신 키나제중 하나는 Syk 키나제 군의 일원이고, 상기 단백질-티로신 키나제의 다른 것은 Src 키나제 군의 일원인 세포.
23. 제 21항에 있어서, 상기 단백질-티로신 키나제중 하나는 ZAP-70이고, 상기 단백질-티로신 키나제의 다른 것은 Fyn인 세포.
24. 제 21항에 있어서, 상기 단백질-티로신 키나제중 하나는 ZAP-70이고, 상기 단백질-티로신 키나제의 다른 것은 Lck인 세포.
25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 상기 ZAP-70 부분이 ZAP-70 Tyr 369를 포함하는 세포.
26. 제 17항 또는 제 21항에 있어서, 상기 치료세포가 (a) T 림프구; (b) 세포독성 T 림프구; (c) 자연살세포; (d) 호중구; (e) 과립구; (f) 마크로파지; (g) 비만세포; (h) 헬라(HeLa) 세포; 및 (i) 배성간세포(ES)로 구성되는 군으로 부터 선택되는 세포.
27. 제 17항에 있어서, 상기 표적 감염성 병원체가 면역결핍 바이러스인 세포.
28. 제 27항에 있어서, 상기 세포외 부분이 CD4의 HIV-엔벨로프-결합 부분을 포함하는 세포.
29. 제 17항 또는 제 21항에 있어서, 상기 치료 세포가 (a) 상기 표적 세포 또는 상기 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식해서 결합할 수 있는 세포외 부분 및 (b) CD28로 부터 유래된 세포내 부분을 포함하는 막-결합 단백질 키메라 수용체를 추가로 발현하는 세포.
30. 제 17항에 있어서, 상기 치료 세포가 상기 수용체-결합 표적 세포 또는 표적 감염성 병원체를 세포용해에 의해 파괴하는 세포.
31. 제 17항 또는 제 21항에 있어서, 상기 세포 반응이 MHC-독립성인 세포.
32. 제 17항 또는 제 21항에 있어서, 상기 세포외 부분이 수용체의 리간드-결합 부분, 리간드의 수용체-결합 부분, 항체의 항원-결합 부분 또는 이들의 기능성 유도체를 포함하는 세포.
33. (a) 단백질-티로신 키나제의 세포내 부분 및 (b) 표적 세포 또는 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식해서 파괴할 수 있는 세포외 부분을 포함하는 막-결합, 단백질 키메라 수용체를 발현하는 세포.
34. 제 33항에 있어서, 상기 단백질 티로신 키나제가 Syk 키나제 군의 일원으로 부터 선택되는 세포.
35. 제 33항에 있어서, 상기 단백질 티로신 키나제가 Src 군의 일원으로 부터 선택되는 세포.
36. 제 33항에 있어서, 상기 단백질 티로신 키나제가 Syk, ZAP-70, Fyn, 및 Lck로 부터 선택되는 세포.
37. 막-결합, 단백질 키메라 수용체를 코드화하는 키메라 수용체를 코드화하는 DNA로서, (a) 치료세포에게 수용체-결합 표적세포 또는 수용체-결합 표적 감염 병원체를 파괴하도록 신호할 수 있는 단백질-티로신 키나제의 세포내 부분 및 (b) 상기 표적세포 또는 상기 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 세포외 부분을 포함하여, 각각의 상기 치료 세포들이 상기 표적 세포 또는 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식해서 파괴할 수 있는 DNA.
38. (a) 단백질-티로신 키나제의 세포내 부분 및 (b) 표적 세포 또는 표적 감염성 병원체를 특이적으로 인식해서 파괴할 수 있는 세포외 부분을 포함하는 막-결합, 단백질 키메라 수용체를 코드화하는 DNA.
39. 제 37항의 키메라 수용체 DNA를 포함하는 벡터.
40. 제 38항의 키메라 수용체 DNA를 포함하는 벡터.