CZ260197A3 - Přesměrování buněčné imunity chimérami tyrosin-proteinkináz - Google Patents

Description

Přesisěrováni buněčné imunity chimérami tyrosin-proteinkináz

Oblast techniky

Tento vynález byl učiněn za finanční podpory vlády formou grantu NIH AI27849- Vláda má tedy na tento vynález urč i tá práva Vynález se týká funkčních tyrosin-proteinkinázových chimér, které jsou schopny přesměrovat funkci imunitního systému. Konkrétněji se vynález týká regulace lymfocytů, makrofágů, zabíječských buněk (natural killer cells) nebo granulocytů tak, že buňky exprimují tyto chiméry, a to jim dává schopnost odpovídat na cíle chimérami rozpoznávané.

Vynález se týká také takových funkčních proteinkinázových chimér, které jsou schopny nasměrovat terapeutické buňky tak, aby specificky rozpoznaly a likvidovaly buďto buňky infikované specifickým infekčním agens, infekční agens samotné, nádorovou buňku nebo také buňku vzniklou autoimunitním procesem (autoimunní buňku). Vynález se konkrétně týká tvorby tyrosin-proteinkinázových chimér schopných nasměrovat cytotoxické T lymfocyty tak, aby specificky rozpoznávaly a lyžovaly buňky exprimujíčí obalové proteiny HIV. Vynález proto poskytuje novou protinádorovou léčbu, a také léčbu nemocí, jako je AIDS (syndrom získaného deficitu imunity), způsobovaný virem HIV.

Dosavadní stav techniky

Rozpoznání antigenu T buňkou zprostředkované T buněčným receptorera je základem celé řady imunologických jevů.

T buňky řídí to, co se nazývá buněčná imunita (buňkami zprostředkovaná imunita). Ta zahrnuje likvidaci cizorodé tkáně nebo infikované buňky buňkami imunitního systému.

Existují různé typy T buněk, včetně pomahačských (helper“), a tlumivých (supresor), které modulují imunitní odpověď, a cytotoxických (killer”) buněk, které mohou likvidovat abnormální buňky přímo.

T buňka, která rozpoznává antigen prezentovaný na povrchu jiné buňky a váže se na něj, se tímto aktivuje a začne se množit, a jestliže se jedná o cytotoxickou buňku.

navázanou buňku zlikviduje.

Autoimunitní nemoc je charakterizována tím, že se při ní tvoří buď protilátky, které reagují s hostitelskou tkání, nebo efektorové T buňky, které jsou autoreaktivní.

V některých případech mohou autoproti 1átky vznikat při normální T a B buněčné odpovědí aktivované cizorodými látkami nebo organismy, které obsahují antigeny zkříženě reagující s podobnými látkami v tělesných tkáních. Příklady klinicky závažných autoproti látek jsou protilátky proti acetylcholinovým receptorúm při myasthenia gravis nebo protilátky namířené proti DNA, erytrocytům a trombocytům u systémového 1upus erythematodes.

HIV a imunopatogeneze

V roce 1984 bylo prokázáno, že HIV je etiologickou

I · · · · · · I • · · 4 • · · · • · · · · · » · · I·· ·· · příčinou AIDS. Od té doby prošla definice AIDS ranoha změnami v závislosti na tom, jaká kritéria diagnóza zahrnovalaAvšak přes proměny diagnostických parametrů, jednoduchým spolscíiýs 1-SEi “·θ infoizcp οΐτ^οτη HjE\Z 2í *isssciny vývoj persistujících tělesných symptomů a pro AIDS charakteristických onemocnění jako jsou druhotné infekce, no\?otvci2?y^z s ncurolo-f í £ká onemocnění (Hžrrison s Pirínc Ťplss of Irst-srns 1 Mod ΐ o i ne, 12- vyd- , McGrsv HilT, 1991).

HIV je lidský retrovirus ze skupiny lentivirů- Čtyři dosud — lidské rsiiOviry t-v/oří dvo odlisnd skupiny' lidské T lymfotropní (nebo leukemické) retroviry, HTLV-1 a HTLV-2, a lidské viry deficitu imunity, HIV-1 a HTV-2První skupina jsou transformující viry, zatímco viry druhé skupiny jsou cytopatickéHIV-1 byl identifikován jako nejčastější příčina AIDS na celém světě- Sekvenční homologie mezi HIV—2 a HIV—1 je asi 4.0^, př i čf^gně. HIV—2 je příbuznější některým členům skupiny virů deficitu imunity opic SIV (Curran et al-,

Science 329; 1357 - 1359, 1985, Vetss et al., Nátuře 324:

572 - 575, 1986).

HIV obsahuje kromě genů typických pro retroviry (env, gag a polI ještě šest dalších genů, které se účastní replikace a dalších biologických aktivit viru. Společným jmenovatelem AIDS je výrazné potlačení imunity, zejména buněčné. Toto potlačení imunity vede k řadě oportunních onemocnění, zejména určitých infekcí a novotvarů.

Za hlavní příčinu nedostatečné imunity při AIDS byl označen kvantitativní kvalitativní nedostatek subpopulace

T-lymfocytů (na thymu závislých), populace lymfocytQ T4-

Tato populace	buněk	je	fenotypicky	def inována přítomností
povrchové molekuly	CD4,	o níž	je	známo, že je buněčným
reeeptorem pro	HIV	(Dalgleish	et	al.. Nátuře 312: 763,
1984). I když	T4	je	hlavní	typ	buněk, které jsou HIV
infikovány, v	podstatě	každá	lidská buňka exprimující
molekulu CD4	na svém	povrchu	je	schopná vázat a být
i nf i kována HIV.
Tradičně	je	T	buňkám	CD4+ přisouzena role

pomahačských/indukujících (helper/inducer) buněk, nebot poskytují aktivující signál pro B buňky, či indukují

T lymfocyty nesoucí reciproký markér CD8, ze kterých se tak stávají cytotoxické/supresorové buňky (Reinherz and

Schlossman, Cell 19= 821 - 827, 1980, Goldstein et al.,

Immuno1 - Rev- 68^: 5 - 42, 1982).

HIV se váže specificky a s vysokou afinitou prostřednictvím vyčnívající skupiny aminokyselin z obalového proteinu (gpl20) na část oblasti VI molekuly CD4 lokalizovanou v blízkosti její N-koncové části. Po navázání víru fúzuje s buněčnou membránou a je interna1 izován buňkou.

Jakmile je uvnitř buňky, začne pomocí reverzní transkriptázy přepisovat svou genomovou RNA do DNA, která se integruje do buněčné DNft, kde dále existuje po celou dobu života buňky j ako prov i rus”.

Provirus může zůstat latentní nebo být aktivován k tomu, aby přepisoval raRNA a genomovou RNA, což vede k proteosyntéze, tvorbě nových virionfl a k pučení viru buněčnou membránou. Ačkoliv přesný mechanismus, kterým virus

• · ·· 1111 • · · · · • · · · • · · · · · • · · • · · · · · · způsobuje buněčnou smrt, není znám, má se zato, že je to především masivní pučení viru vedoucí k rozrušení buněčné membrány a následně k vychýlení osmotické rovnováhy.

V průběhu infekce si hostitelský organismus vyvíjí protilátky proti virovým proteinům včetně hlavních obalových glykoproteinů gpl20 a gp41. Pres tuto látkovou imunitu nemoc pokračuje a vede k letálnírau potlačení imunity charakterizované četnými oportunními infekcemi, přítomností parazitů, demencí a nakonec smrtí. Selhání schopnosti hostitelových protivirových protilátek zpomalit či zastavit progresi nemoci představuje jeden z nejobtížnějších a alarmujících aspektů infekce a dává také špatné vyhlídky snahám o očkování založeném na konvenčním přístupu.

Dva důležité faktory hrají roli v účinnosti látkové imunitní odpovědi na viry deficitu imunity. Prvním je to, že stejně jako ostatní RNA viry (a zejména retroviry), viry deficitu imunity odpovídají na hostitelský imunologický dozor vysokou rychlostí mutace. Druhým faktorem je to, že obalový glykoprotein sám je silně glykosylovaná molekula prezentující pouze několik málo epitopů schopných vysoce afinitní vazby s protilátkami. Málo antigenní cíl, jakým je virový obal, poskytuje hostiteli jen malou příležitost omezit virovou infekci produkcí specifických proti látek.

Buňky infikované HIV exprimují na svém povrchu glykoprotein gpl20. Tento glykoprotein zprostředkovává fúzi buněk CD4-+- podobnou reakcí, kterou virus vstupuje do neinfikované buňky, což vede ke vzniku obřích mnohojaderných buněk s krátkou životností. Tvorba takových syncycií je

závislá na přímé interakci mezí obalovým glykoproteinem gpl20 a proteinem CD4 CDalgleish et al-, výSe, Klatzman et al., Nátuře 312: 763, 1984, McDougal et al-, Science 231:

382, 1986, Sodroski et al., Nátuře 322= 470, 1986, Lifson et al., Nátuře 323: 725, 1986, Sodroski et al-, Nátuře 321

412, 1986).

Dflkaz, že vazba CD4-gpl20 ie zodpovědná za virovou infekci buněk nesoucích antigen CD4 zahrnuje zjištění, že mezi gpl20 a CD4 dochází ke vzniku specifického komplexu (McDougal et al-, výše)- Další badatelé ukázali, že buněčné linie, které byly vflči HIV imunní, se změnily na infikováte1né linie poté, co byly transfekovány cDNA pro lidský antigen CD4 a začaly ho exprimovat- (Maddon et al.,

Cell 46- 333 - 348, 1986).

Několika skupinami vědců byly navrženy, a také úspěšně in vitro demonstrovány, terapeutické programy, založené na rozpustném CD4 jako pasivním agens interferujícím s adsorpcí viru a transmisí pres syncycia (Deen et al-, Nátuře

3321^:82-84. 1988, Fisher et al., Nátuře 331: 76-78, 1988,

Hussey et al., Nátuře 331: 78-81 1988, Smith et al-, Science

238- 1704-1707, 1987, Traunecker et al., Nátuře 331: 84-86,

1988) a následně byly vyvinuty fúzované proteiny imunoglobul inu s CD4 s prodlouženým biologickým poločasem a mírnou biologickou aktivitou (Capon et al- , Nátuře 337 525-531, 1989, Traunecker et al., Nátuře 339: 68-70, 1989,

Byrn et al-, Nátuře 344- 667-670, 1990, Zettlmeissl et al.,

DNA Cell Biol. 9'- 347-353, 1990). Ačkoliv konjugáty CD4 imunotoxinu

CD4 nebo fúzované proteiny vykazují potenc i á1η í cytotoxi c i tu pro i nfi kované buňky i n v i tro (Chaudhary et al. , Nátuře 335- 369-372, 1988, Ti 11 et al-,

Science 242= 1166-1168, 1988), vzhledem k latenci syndromu deficitu imunity je účinnost jakékoliv jednozásahové terapie při eliminaci viru nepravděpodobná a antigenní schopnost cizorodých fúzovaných proteinů je činí nepoužitelnými pro opakovaně podávání- Pokusy na opicích infikovaných SIV ukázaly, že rozpustný CD4, pokud se podá zvířeti bez znatelné cytopenie, redukuje titr viru a zlepší myeloidní potenciál měřený in vitro (Vatanabe et al-, Nátuře 337267-270, 1989). Avšak ihned, jakmile bylo léčení přerušeno, virus se znovu objevil, což naznačuje, že k tomu, aby se zabránilo progresivnímu rozpadu imunitního systému, by bylo nutné celoživotní podávání přípravku.

Podstata vynálezu

Tyrosin-proteinkinázy asociované s receptory na buněčném povrchu

Počátečním požadavkem pro zapojení buněčných efektorových programů v imunitním systému je často rozpoznání shluklých ligandů buňkou. Mezi receptory, přenášející aktivační signál při agregaci, patří také antigenní receptory B a T buněk (DeFranco, Eur- J. Biochem.

210-381-388, 1992, Weiss, Annu. Rev- Genet. 25: 487-510,

1991), členové rodin Fc receptorů IgG a IgE (Fanger et al.,

Immunol. Today IQ: 92-99, 1989, Ravetch and Kinet, Annu.

Rev. Immunol. 9- 457-492, 1991) a řada pridatných receptorů včetně CD2, CD4, CD8 a CD28 u T buněk (Yokoyama and Shevach,

Year Immunol. 4- 110-146, 1989), CD19, CD20, CD21 a CD40 u B buněk (Clark and Ledbetter, Adv. Canc. Res. 52- 81-149,

1989) a CD44, CD45 a CD58 u monocytfl (Vebb et al. , Science

249- 1295-1297, 1990), Kromě toho velký počet proteinů spojených s fosfolipidy podporuje buněčnou aktivaci způsobem závislým na antigenním receptoru, když se navázaly na povrch

T buněk (Balk and Terhorst, Immunol, Ser. 45- 411-416,

1989, Krocsek et al,, Nátuře 322: 181-184, 1986, Yeh et al.,

J. Immunol, 138 - 91-97, 1987, Yokoyama and Shevach, Year

Immunol. 4- 110-146, 1989).

V současnosti není jasně, jak jednoduchá fyzikální událost, jako je agregace, může vést k jasně rozpoznatelnému fyziologickému signálu. Zapojení buněčných efektorových programů, zprostředkované antigenními receptory B a T buněk, a také různými formami receptoru Fc, může být napodobeno navázáním proteinových chimér nesoucích intracelulární domény jednotlivých řetězců receptorových komplexů (Irving and Veíss, Cell 64- 891-901, 1991, Kolanus et al., EMBO J.

11- 4861-4868, 1992, Letourneur and Klausner, Proč. Nati.

Acad. Sci. USA 88: 8905-8909, 1991, Letourneur and Klausner,

Science 255- 79-82, 1992, Romeo and Seed, Ce11 641037-1046, 1991, Vegener et al., Ce11 68 - 83-95, 1992).

Minimální efektivní spouštěcí prvek se zdá vyžadovat fylogenetícky konzervovanou (Reth, Nátuře 338:383-384.

1989) peptidovou sekvenci obsahující dva tyrosinové zbytky oddělené 10 či 11 aminokyselinami a obklopené aminokyselinami vytvářejícími hydrofi lni, typicky kyselé prostředí (Romeo et al-. Cell 68^: 889-897, 1992, Irving et al., J. Exp. Med. 177: 1093-1103, 1993). Shlukování receptorfl nesoucích tento prvek spouští aktivační kaskádu, pro kterou je nezbytná tyrosin proteinkinázová (PTK) aktivita, neboť inhibitory PTK blokují jak časné události v aktivaci B a T buněk, jako ie např. mobilizace kalcia, tak i pozdější následky uvolnění cytokinů a buněčnou proliferaci (June et al., J. Immunol. 144: 1591-1599, 1990, Lané et al.,

J. Immunol. 146- 715-722, 1991, Mustelin et al., Science

247 - 1548-84-1587, 1990, Stanley et al., J. Immunol. 145 =

2189-2198, 1990). Ačkoliv se vzdálenější důsledky aktivace receptorfl liší v závislosti na typu buňky, časné události jsou nápadně podobné i u buněk odlišných hematopoetických řad. Tak např. rychlé zvýšení aktivity PTK, které lze pozorovat po obsazení antigenních receptorů B buněk (Gold et al., Nátuře 345: 810-813, 1990, Campbell and Sefton, EMBO J.

9: 2125-2131, 1990), antigenních receptorů T buněk (June et al., Proč. Nat 1 - Acad. Sci USA 877722-7726, 1990, June et al., J. Immunol. 144~- 1591-1599,1990) a vysoce afinitních receptorů IgE (Eiseman and Bolen, Nátuře 355 = 78-80, 1992,

Li et al., Mol. Cell. Biol. 12= 3176-3182, 1992) má u všech zmíněných typů mezi časnými cílí fosforyláce gama izoformu fosfatidylinositol specifické fosfolipázy C (Carter et al.,

Proč. Nati. Acad. Sci- USA 88- 2745-2749, 1991, Li et al.,

Mol. Cell. Biol. 12= 3176-3182, 1992, Park et al . , J. Biol.

Chem 266: 24237-24240, 1991, Park et al., Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 88: 5453-5456, 1991, Secrist et al-, J. Biol- Chem.

266-12135-12139, 1991, Weiss et al., Annu. Rev. Genet. 25 10

487-510, 1991), která je přímo aktivovaná fosfory lácí tyrosinu (Nishibe et al., Science 250: 1253-1256, 1990).

Dosud známé aktivity PTK asociované s receptory na buněčném povrchu spadají do dvou tříd: jedna patří k rodině proto-onkogenu Src příbuzných kináz a druhou tvoří kinázy příbuzné nově charakterizované kináze Syk. Z první třídy je to kináza Fyn, která je asociována s receptory T buněk (Gassmann et al., Eur. J. Immunol. 22^: 283-286, 1992,

Samelson et al., Proč. Nati- Rcad. Sci. USft 87^: 4358-4362,

1990), kinázy Lyn, Fyn, Blk a Lek, které jsou asociovány s receptorem IgM B buněk (Burkhardt et al., Proč Nati.

Rcad. Sci- USft 88: 7410-7414, 1991, Campbell and Sefton,

Mol. Cell. Biol. 12: 2315-2321, 1992, Yamanshi et al.,

Science 251: 192-194, 1991) a kinázy Lyn a Yes asociované s vysokoafinitními receptory IgE (Eiseman and Bolen, Nátuře

355: 78-80, 1992, Hutchcroft et al., Proč. Nati. Rcad. Sci.

USft 89: 9107-9111, 1992, Hutchcroft et al., J. Biol. Chem.

267: 8613-8619, 1992). Mechanismus pozorované asociace nebyl dosud detailně objasněn, ale předběžná data ukazují na to, že intracelulární domény řetězců receptorových komplexů mohou fyzicky asociovat s kinázami rodiny Src (Clark et al.,

Science 258: 123-126, 1992, Timson Gauen et al., Mo1. Ce11.

Biol. 12: 5438-5446, 1992). V současnosti však není známo, zda se jedná o asociace přímé nebo nepřímé.

V současné době byly studiem kináz Fyn a Lek v T buňkách získány přesvědčivé důkazy o důležitosti kináz z rodiny Src pro buněčnou aktivaci. Nadměrná exprese (overexpression) Fyn u transgenní myši vede k fenotypu se zvýšenou odpovědí (hyper-responzivní) na antigen v T buňkách, zatímco nadměrná exprese katalyticky neaktivní formy blokuje proliferací T buněk zprostředkovanou receptory (Cooke et al., Cell 65: 281-291, 1991). T buňky izolované z thymu mutované myši bez Fyn kinázové aktivity vykazují zřetelně nedostatečnou proliferační odpověď při ošetření kombinací forboesteru s protilátkou anti-CD3 nebo konkavalinem A CAppleby et al. , Cell 70: 751-763, 1992,

Stein et al . , Cel 1 70 741-750, 1992). Buňky izolované ze sleziny takové myši vykazují sice mírnější, ale podstatné oslabení v aktivační odpovědi (Appleby et al., Cell 70:

751-763, 1992, Stein et al., Cell 70: 741-750, 1992).

V T buňkách kináza Lek asociuje nepřímo s TCR prostřednictvím receptorfl CD4 a CD8 <Rudd et al., Proč.

Nati. Acad. Sci. USA 85: 5190-5194, 1988, Shav et al., Cell

59: 627-636, 1989, Turner et al. , Cell 60: 755-765, 1990,

Veillette et al., Cell 55: 301-308, 1988). Nadměrná exprese

Lek v buňkách normálně odpovídajících na antigen zvyšuje citlivost receptorfl podobným způsobem jako lze pozorovat

s Fyn (Abraham	and Veillette, Mol.	Cell.	Biol-	10:
5197-5206,	1990,	Davidson et al.	, J-	Exp.	Med.	175:
1483-1492,	1982,	Luo and Sef ton,	Mol.	Cel l .	Biol .	12:
4724-4732,	1992).	U hybridomů myších	buněk	závislých na	CD4

bylo možné obnovit antigen-specifickou pomahačskou funkci pouze pomocí molekul CD4, které byly schopny reagovat s Lek (Glaichenhaus et al., Ce11 64^: 511-520, 1991).

Avšak nejsilnější důkaz pro přímou účast kinázy Lek v signální cestě zprostředkované antigenním receptorem

99 9 pochází ze studia mutantních buněčných linií, které úplně postrádají Lek. Byly zkoumány dvě takové linie, jedna pocházející z linie lidských leukemických T buněk Jurkat (Go1dsm i th and Ve i ss, Proč. Nati. ftead. Sci. USA 84:

6879-6883, 1987, Strauss and Veiss, Cell 70^: 585-593, 1992) a druhá z klonu CTLL-2 myších cytotoxických T buněk (Karnitz et al., Mol. Cell. Bioi- 12: 4521-4530, 1992). Obě buněčné linie postrádající Lek jsou defektní v signální cestě zprostředkované TCR, přičemž komplementace obou linií transfekcí plasmidem, který exprimuje Lek, obnovuje schopnost odpovídat na podněty, které vedou k obsazení TCR (Karnitz et al., Mol- Cell- Bioi- 12^: 4521-4530, 1992,

Strauss and Veiss, Cell 70- 585-593, 1992)V nedávné době se prokázalo, že členové nové rodiny tyrosinových kináz, původně reprezentované blízce příbuznými nebo dokonce totožnými s kinázou Syk (Taniguchí et al-. J.

Bioi- Chem- 266: 15790-15796, 1991) a PTK 72 (Zioncheck et al., J- Bioi- Chem- 261: 15637-15643, 1986, Zioncheck et al., J- Bioi. Chem. 263: 19195-19202, 1988), jsou asociovány s receptory na buněčném povrchu. Ačkoliv nebylo dosud s konečnou platností prokázáno, zda PTK 72 a Syk jsou totožné, sdílejí shodnou tkáňovou distribuci (thymus a slezina), molekulovou hmotnost a proteolytickou labilitu.

PTK 72 je asociována s receptorem IgM u B buněk (Hutchcroft et al., Proč. Nati- Aead. Sci- USA 89-9107-9111. 1992,

Hutchcroft et al., J. Bioi. Chem. 267: 8613-8619, 1992) a je fosforylována po navázání anti-IgM na receptor (Hutchcroft et al., J. Bioi. Chem. 266: 14846-14849, 1991). Průvodní

·· · · · · aktivace enzymu, měřená buď jako autofosforylace nebo fosforylace exogenního proteinového fragmentu, byla prokázána jako důsledek obsazení vazby povrchového IgM (Hutchcroft et al-, Proč. Nati. Acad- Sci- USA 89et a1., J. Bioi- Chem. 267^: asociována s vysokoafinitním linie buněk krysí bašofilní

Proč - Nati- ficad- Sci- USA 89et al., J, Bioi. Chem. 267:

9107-9111, 1992, Hutchcroft

8613-8619, 1992). PTK 72 je receptorera IgE u buněčné leukémie (Hutchroft et al.,

9107-9111, 1992, Hutchcroft

8613-8619, 1992)Druhý člen rodiny Syk, ZAP-70, je PTK, která asociuje s řetězcem zeta T buněčného receptorů (TCR) po obsazení receptorů (Chán et al., Proč - Nati- Acad- Sci- USA 889166-9170, 1991)- I přes expresi ZAP-70 v buňkách COS vede

Fyn nebo Lek k mírnému zvýšení celkového buněčného tyrosinfosfátu, společná exprese ZAP-70 s buď Lek nebo Fyn vede k dramatickému zvýšení čisté fosforylace tyrosinu (Chán et al., Ce11 71- 649-662, 1992). Pokud je také přítomen chimérický řetězec CD8, je chiméra fosforylována a ZAP-70 s ní asociuje (Chán et al-, Cell 71- 649-662, 1992). Zatím není jasné, zda ZAP-70 aktivuje kinázy rodiny Src a/nebo je to naopak, ani proč by měla společná exprese kináz vést ke zjevné konstituční aktivaci. Avšak aktivní asociace ZAP-70 s obsazeným TCR vede k domněnce, že PTK hraje roli v předávání odpovědi receptorů.

Na rozdíl od kináz z rodiny Src, nesou Syk a ZAP-70 dvě

SH2 domény a žádné myristylované místo na N-koncové části (Taniguchi et al-, J. Bioi. Chem. 266= 15790-15796, 1991 ·· ····

Chán et al-, Cell 71649-662, 1992). Přirozeně by se očekávalo, že mechanismus asociace kinázy a receptorů je takový, že dvě SH2 domény, jakmile jsou fosforylovány, vážou dvě molekuly tyrosinu ze spouštěcího motivu antigenního receptorů. Avšak to je zatím spíše hypotéza.

Předkládaný vynález ukazuje, že je možné vytvořit chiméry spojující intracelulární doménu molekuly tyrosin-proteinkinázy a extracelulární doménu, která je schopna plnit úkol rozpoznávání cíle. Konkrétně shlukování chimér nesoucích kinázové sekvence ze Syk nebo ZAP-70 spouští mobilizaci kalcia. Agregace samotné chiméry Syk, nebo společná agregace chimér nesoucích kinázy Fyn nebo Lek a ZAP-70, je dostatečná pro spuštění cytolytickě efektorové funkce. Taková efektorová funkce umožňuje specifické rozpoznání a likvidaci nežádoucích cílových buněk, např. patogenfl, patogenem infikovaných buněk, nádorových buněk nebo autoimunních buněk.

Na základě tohoto vynálezu může být zkonstruován jakýkoliv počet užitečných chimérických molekul- Např.

chiméry vytvořené složením intracelulární části tyrosin-proteinkinázy s extracelulární částí vhodně upraveně molekuly protilátky umožňují specificky přesměrovat rozpoznávací potenciál buněk imunitního systému k antigenu rozpoznávanému extracelulární částí protilátky. Takže s částí protilátky schopnou rozpoznat některé determinanty na povrchu patogenu, by buňky imunitního systému vybavené chimérou odpověděly na přítomnost patogenu efektorovým programem vlastním dané linii, tzn. pomahačské T lymfocyty ·· ·« • · • · by odpověděly cytotoxickou aktivitou proti cíli a B lymfocyty by aktivovaly syntézu protilátek- Makrofágy a granulocyty by spustily své efektorové programy, zahrnující uvolnění cytokinů, fagocytózu a reaktivní produkci kyslíku. Podobně by tomu bylo s částí protilátky rozpoznávající nádorové buňky, byla by příznivě stimulována odpověď imunitního systému na nádor. S protilátkou schopnou rozpoznat buňky imunitního systému, které nevhodně reagují s vlastními determinantami, by bylo možné selektivně cíleně zlikvidovat autoreaktivní buňky.

Ačkoliv tyto příklady upozorňují na užití proti látkových chimér jako vhodného expozičního nástroje, vynález se neomezuje pouze na proti látkové chiméry a skutečně, využití specifických neproti 1átkových extracelulárních domén má důležité výhody. Tak např.

s extracelulární částí, která je receptorem pro virus, bakterii nebo parazita, bude buňka vybavená chimérou specificky zacílena proti buňkám, které exprimují determinanty viru, baktérie nebo parazita. Výhoda tohoto přístupu ve srovnání s použitím protilátek je ta, že nativní receptor pro patogen má výjimečně vysokou selektivitu a afinitu pro patogen, a tím umožňuje vyšší stupeň přesnosti výsledné imunitní odpovědi- Podobně, je-li třeba zlikvidovat buňky imunitního systému, které nevhodně reagují s vlastními antigeny, stačí připojit antigen (buď jako intaktní protein v případě depléční léčby B buněk, nebo v podobě komplexu MHC v případě depleční léčby T buněk) (MHC - major histocompatibi1 ity complex hlavní histokompatibilni systém) k intracelulárnímu řetězci tyrosin-proteinkinázy, a tím ovlivnit specifické cílení buněk nepatřičně odpovídajících na vlastní determinanty.

Dalším využitím chimér je řízení buněčných populací in vivo následující po nějakém jiném genově manipulujícím zásahu- Tak např. bylo navrženo užití lymfocytů infiltrujících nádory nebo zabíječských (naturel killer) buněk k tomu, aby zprostředkovaly cytotoxický účinek až v místě nádorů. Předkládaný vynález poskytuje pohodlný prostředek k regulaci počtu a aktivity takových lymfocytů a buněk, aniž by musely být odstraněny z těla pacienta

Jelikož intracelulámí domény zprostředkovávají proliferační a pomnoženy i n v i tro.

chimérických receptorů odpověď buněk, koordinace extracelulárních domén řadou různých agregujících stimulů specifických pro extracelulární domény (např. protilátka specifická pro extracelulární doménu) povede k proliferaci buněk nesoucích chimérické molekuly.

Ačkoliv specifické ztělesnění předkládaného vynálezu zahrnuje chiméry obsahující Syk nebo tyrosin-proteinkinázy rodiny Syk a Src, pro účel zde popsaný se může použít jakákoliv tyrosin-kináza s podobnou funkcí jako tyto molekuly. K význačným rysům žádoucích spouštěcích molekul buněk imunitního systému patří autonomní exprese, schopnost fúze s extracelulární doménou (přímo nebo nepřímo prostřednictvím transmembránové domény), takže výsledná chiméra je přítomna na povrchu terapeutické buňky, a schopnost spouštět buněčné efektorové programy při ·· ··· ·

agregaci po setkání s cílovým ligandem.

V současnosti je nejpohodlnější metodou, jak dopravit chimérické molekuly do buněk imunitního systému, nějaká forma genové terapie. Avšak reorganizace buněk imunitního systému s chimérickými receptory smícháním buněk s vhodně solubi1izovaným a přečištěným chimérickým proteinem by také vedla ke vzniku populace zmanipulováných buněk schopných odpovědi na cíle, rozpoznávané extracelulární doménou chimér. Podobné přístupy byly využity např. pro zavedení intaktních receptorů CD4 pro HIV do erytrocytů pro terapeutické účely. V tomto případě by populace zmanipulováných buněk nebyla schopna se sama obnovovat.

Předkládaný vynález se týká funkčních zjednodušených tyrosin-proteinkinázových chimér, které jsou schopny přesměrovat funkci imunitního systému. Zvláště se pak týká regulace lymfocytů, makrofágů, zabíječských (natural killer) buněk nebo granulocytů expresí chiméry, která způsobí, že buňka reaguje na cíl chimérami rozpoznávaný. Vynález se také týká způsobu6, jak nasměrovat buněčnou odpověď na infekční agens, nádorovou nebo rakovinnou buňku a nebo autoimunní buňku. Způsob nasměrování imunitní odpovědi u savců spočívá v tom, že se příslušnému savci podá účinné množství terapeutických buněk, přičemž terapeutické buňky jsou schopny rozpoznat a likvidovat infekční agens. nádorovou, rakovinnou nebo autoimunní buňku. Buněčná odpověď je zprostředkována jedinou chimérou nebo je výsledkem spolupráce více chimér (např. sada dvou nebo více chimér, z nichž jedna obsahuje iňtracelulární doménu z CD28).

V jiném ztělesnění je způsob směrování buněčné odpovědi na infekční agens založen ná podání terapeutických buněk schopných rozpoznat a likvidovat infekční agens, přičemž infekčním agens je určitý virus, baktérie, prvok nebo houba.

Specifičtěji je způsob zaměřen proti takovým agens jako je

HIV a Pneumocystis carinii.

Zasáhnout proti infekci HIV znamená podat pacientovi účinné množství cytotoxických T lymfocytů exprimujících chimérický receptor, lymfocyty jsou pak schopny specificky rozpoznávat a lyžovat buňky infikované HIV stejně tak jako volně cirkulující virus.

Takže jedním ztělesněním vynálezu je způsob nasměrování buněčné odpovědi proti buňkám infikovaným HIV, což znamená podat pacientovi účinné množství cytotoxických T lymfocytů schopných specificky rozpoznat a lyžovat buňky infikované

HIV.

Další ztělesnění vynálezu poskytuje chimérické receptorové proteiny, které nasměrují cytotoxické

T lymfocyty tak, že rozpoznají a lyžují buňky infikované

HIV. Dalším ztělesněním vynálezu jsou tedy hostitelské buňky transformované vektorem, který obsahuje chimérické receptory.

Mnoho různých způsobů konstrukce a exprese chimérických imunitních receptorů, stejně jako řada možností jejich terapeutického využití, je detailně vysvětleno v U.S.S.N.

07/847 566 a 07/665 961, které jsou zde zahrnuty v odkazech.

Tato a neomezený počet dalších ztělesnění vynálezu budou odborníkovi zřejmá na základě následujícího podrobného

popisu vynálezu,

V následujícím podrobném popisu vynálezu budeme často odkazovat na základní metody obecně známé odborníkům v oborech molekulární biologie a imunologie. Publikace a další materiál představující takový známý materiál, na který odkazujeme, jsou plně citovány v následujícím odstave i.

Standardní referenční práce představující obecné principy molekulární biologie zahrnují práce: Vatson et al.,

Molecular Biology of the Gene, díly I a II, the

Benjamin/Cummings Publishing Company, lne., vydavatel, Menlo

Park, CA, 1987, Darnell et al., Molecular Cell Biology,

Scientific American Books, lne., vydavatel, Nev York, N.Y.,

1986, Levin, Genes II, John Wiley and Sons, vydavatelé, Nev

York, N,Y,, 1985» Old et al. » Principles of Gene

Manipulation- An Introduction to Genetic Engeneering, 2.

vydání» University of California Press, vydavatel, Berkeley,

CA, 1981, Maniatis et al-» Molecular Cloning: A Laboratory

Manual» 2, vyd, , Cold Spring Harbor Laboratory, vydavatel,

Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, Ausubel et al·, Current

Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, Nev York,

N.Y,, 1989,

Pod pojmem klonování se v následujícím textu rozumí užití technik rekombinace DNA i n v i tro ke vložení genu nebo určité sekvence DNA do molekuly vektoru. Aby bylo možné úspěšně klonovat požadovaný gen, je třeba využít metod, které umožní vytvořit fragmenty DNA, spojovat fragmenty DNA do vektorové molekuly, zavést složenou molekulu DNA do

hostitelské buňky, ve které se může replikovat a selekci klonu hostitelských buněk, který obsahuje cílový gen.

cDNA“ znamená komplementární DNA neboli DNA zkopírovanou podle RNA předlohy RNA-dependentní DNA polymerázou (reverzní transkriptázou). Takže cDNA klon znamená dvojřetězcovou sekvenci DNA, komplementární k molekule RNA, která je vnesena do klonovacího vektoru.

Knihovna cDNA označuje soubor rekombinantních molekul

DNA obsahujících vložené úseky cDNA, které jsou kopiemi mRNA exprimované buňkou v okamžiku přípravy knihovny. Taková knihovna se dá připravit způsoby, které jsou odborníkům známy a jsou popsány např. v publikaci Maniatis et al-,

Molecular Cloning- A Laboratory Manual. výše. Obecně řečeno,

RNA je nejdříve izolována z buněk organismu, z jehož genomu chceme požadovaný gen získat. V tomto vynálezu jsou výhodným zdrojem genfi buněčné linie savčích, nejvýhodněji pak lidských lymfocytů. Preferovaným vektorem je pak virus vakcínie kmen VR.

Vektor znamená molekulu DNA odvozenou např.

z plasmidu, bakteriofága nebo savčího či hmyzího viru, do kterého může být v1ožeň neboli k1onován fragment DNA. Vektor obsahuje jedno nebo více jedinečných restrikčních míst a je schopen autonomní replikace v určitém hostitelském organismu, takže klonovaná sekvence je reprodukovatelná. Cili DNA expresní vektor“ znamená jakýkoliv autonomní element, který je schopen řídit syntézu rekombinantního peptidu. Takové expresní vektory zahrnují bakteriální plasmídy, fágy a také savčí a hmyzí plasmidy a viry.

·· ···· • ·· · ·· ···· ···« · · · • · · · · · · • · · · · · ··· · • · · · · · ··· ·«·· ··· ···· ·· ·

Látkou v podstatě čistou rozumíme sloučeninu, např.

protein, polypeptid nebo protilátku, která ie v podstatě bez přítomnosti všech látek, které ji přirozeně doprovázejí.

Obecně látka je v podstatě čistá, pokud alespoň 60%, výhodněji nejméně 75% a nejvýhodněji nejméně 90% z celkové hmotnosti vzorku tvoří požadovaná sloučenina. Čistotu lze měřit příslušnou vhodnou metodou, např- užitím sloupcové chromatografie, eíektroforézou v polyakrylamidovém gelu nebo analýzou na HPLC- V souvislosti se sekvencemi nukleových kyselin znamená v podstatě čistý sekvenci, fragment nebo segment nukleové kyseliny, který bezprostředně nesousedí (tj. není kovalentně vázán) s kódujícími sekvencemi, které mu bezprostředně předcházejí nebo následují (tj. jedna na

5’ konci a druhá na 3' konci) v přirozené podobě genomu toho organismu, z něhož ie DNA použitá ve vynálezu odvozena.

Pojem funkční derivát označuje fragmenty, varianty, analogy a chemické deriváty molekul.

Fragment” molekuly jako např. kterékoliv sekvence cDNA v předkládaném vynálezu označuje jakýkoliv oligonukleotid nebo polynukleotid obsažený v původní molekule. Variantou takové molekuly se rozumí přirozeně existující molekula, která se v zásadě podobá buďto celé nebo části původní molekuly. O molekule se říká, že je v podstatě podobná jiné molekule, pokud sekvence aminokyselin obou molekul je v podstatě podobná. V podstatě podobná” sekvence aminokyselin je taková, která vykazuje alespoň 50%, výhodně

85% a nejvýhodněji 95% identitu se sekvencí přirozené nebo referenční molekuly a/nebo se od této přirozené nebo

referenční sekvence liší pouze konzervativními substitucemi aminokyselin. V podstatě podobné aminokyselinové molekuly vykazují také podobné biologické aktivity. Tak za předpokladu, že dvě molekuly mají podobné aktivity, jsou pak považovány za varianty ve smyslu zde užívaném i tehdy, jestliže jedna z molekul obsahuje méně nebo naopak více aminokyselinových zbytků, které v druhé molekule neexistují, nebo když sekvence aminokyselinových zbytků nejsou identické. Ve smyslu zde užívaném je molekula chemickým derivátem jiné molekuly pokud obsahuje další chemické skupiny, které normálně nejsou součástí původní molekuly.

Takové skupiny mohou zlepšit rozpustnost, absorpci, biologický poločas atd. původní molekuly. Případně tyto skupiny mohou snížit toxicitu molekuly, eliminovat či případně změnit nějaký nežádoucí vliv molekuly a pod.

Skupiny s takovýmto vlivem jsou uvedeny např. v publikaci

Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. vyd., Mack

Publishing Co-, Easton, PA (1980).

Podobně tedy funkčním derivátem genu receptorové chiméry v předkládaném vynálezu jsou myšleny fragmenty, “varianty nebo analogy genu, které mají podstatně podobnou nukleotidovou sekvenci a které kódují molekulu s podobnou aktivitou jako chiméra tyrosin-proteinkinázy. ”V podstatě podobné nukleové kyseliny kódují podstatně podobné sekvence aminokyselin (jak je definováno výše), a také zahrnují jakékoliv sekvence nukleových kyselin schopné za vhodných podmínek hybridizace s přirozenou nebo referenční sekvencí (vhodné hybridizační podmínky jsou uvedeny např. v Ausubel et al - , Current Protocols in

Molecular Biology, Viley Press, New York, N.Y., 1989).

Takže ve smyslu zde užívaném tyrosin-proteinkinázovou chimérou jsou myšleny jakékoliv funkční deriváty, fragmenty, varianty, analogy nebo chemické deriváty, které jsou v podstatě podobné chiméře divokého typu“ a které vykazují podobnou aktivitu (t.j. nejvýhodněji 90%, výhodněji

70%, výhodně 40% nebo alespoň 1O% aktivity receptorové chiméry divokého typu). Aktivita funkčních derivátů chimérických receptorů zahrnuje specifické navázání cílového agens (na extraceiulámí část receptoru) nebo buňky a následnou destrukci (řízenou intračelulámí částí receptoru) tohoto agens nebo buňky a může být ověřena, např.

některým testem zde popsaným.

Sekvence DNA kódující chiméru v předkládaném vynálezu, nebo její funkční deriváty, může být rekombinována s vektorovou DNA pomocí běžných technik, pomocí slepých nebo ostrých konců pro ligaci, digescí restrikčními enzymy, aby vznikly vhodné konce, vhodným doplněním kohezivních konců, ošetřením alkalickou fosfatázou, aby nedocházelo k nežádoucím spojením, a nakonec ligaci vhodnou ligázou.

Techniky pro takové manipulace jsou popsány v Maniatis et al-, výše, a odborníkům jsou dobře známy.

Molekula nukleové kyseliny, jako DNA, je označována za schopnou exprese pólypeptidu, jestliže obsahuje nukleotidové sekvence obsahující informace nutné pro jsou operativně spojeny s nukleotidovými sekvencemi, které transkripci a regulaci translace, přičemž takové sekvence

kódují polypeptid. Operativní spojení je takové spojení, při kterém regulační sekvence DNA a sekvence, které se mají exprimovat, jsou spojeny tak, že to dovoluje expresi genu.

Přesná povaha regulačních oblastí nutných k expresi genu se mění od organismu k organismu, ale zcela obecně vždy bude obsahovat promotorovou oblast, která se u prokaryot skládá .

jak z vlastního promotoru (který řídí iniciací transkripce

RNA), tak z dalších sekvencí DNA. které po přepsání do RNA iniciují syntézu proteinu. Za normálních okolností takové sekvence budou zahrnovat ty nekódující sekvence 5’ konce zapojené v transkripci a translaci, jako je např. TATA box, sekvence, která zajištuje opatření čepičkou, sekvence CAAT a podobně.

Pokud je třeba, je možné získat nekódující oblast sousedící se 3’ koncem sekvence genu pro protein výše popsanými metodami. Tato oblast může být ponechána pro své sekvence regulující terminaci transkripce. jako je např.

terminace a polyadenylace. Tak ponechání oblasti 3’ konce přirozeně sousedícího se sekvencí DNA kódující protein poskytne terminační signály. Jestliže signály pro terminaci transkripce nejsou uspokojivě funkční v exprimující hostitelské buňce, mflže být 3^J oblast nahrazena takovou, která je v hostitelské buňce funkční.

Dvě sekvence DNA (jako např. sekvence promotoru a sekvence kódující chiméru tyrosin-protelnkinázy) jsou operativně spojeny, jestliže spojení dvou sekvencí 1) nevede k mutaci posunem čtecího rámce, 2) nenarušuje funkci promotoru v řízení transkripce genu pro receptorovou

ti 9 chiméru, 3) nenarušuje transkripci sekvence pro receptářovou chiméru z promotoru- Promotorova sekvence byla operativně spojena se sekvencí DNA, jestliže promotor je schopen ovlivnit transkripci připojené DNA- Pro expresi proteinu jsou tedy nezbytné transkripční a translační signály, které vhodná hostitelská buňka rozpoznáváPředkládaný vynález zahrnuje expresi chimérického proteinu s vlastnostmi t-yrosin-proteinkinázy (nebo jejího funkčního derivátu) buď v prokaryotické nebo eukaryotické huňce, ačkoliv eukaryotická Ca zvláště lidský lymfocyt) je nejvýhodnější Protilátky dle předkládaného vynálezu je možno připravit některou z mnoha různých metod- Například buňky exprimující chimérický receptorový protein nebo jeho funkční derivát mohou být podány zvířeti, aby vyvolaly produkci séra obsahujícího polyklonální protilátky, které jsou schopny vázat chiméry- Výhodně jsou protilátky podle předkládaného vynálezu monoklonálni protilátky- Takové monoklonální protilátky mohou být připraveny užitím hybridomové technologie- CKohler et al-, Nátuře 256-495, 1975, Kohler et al-, Eur- J. Immunol, 6:511. 1976, Kohler et al-, Eur- J.

Immunol- 6-292, 1976, Hammerling et al-, In: Monoclonal

Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N-Y-, ss.

563-684, 1981). Obecně takové postupy zahrnují imunizaci zvířete chimérickým antigenem- Splenocyty takového zvířete jsou extrahovány a fúzovány s vhodnou myelomovou buněčnou linií. Může být použita jakákoliv vhodná myelomová buněčná linie v souladu s předkládaným vynálezem- Po fúzi jsou ·· vzniklé hybridomové buňky selektivně udržovány v médiu HAT a pak klonovány konečným ředěním, jak je popsáno ve Wands et al., Gastroenterology 80^225-232 (1981). Hybridomové buňky získané touto selekcí jsou poté testovány, aby se našly klony secernující protilátky schopné vazby s chimérou.

Protilátky předkládaného vynálezu mohou být také .

polyklonální nebo výhodně polyklonální protilátky namířené proti specifické oblasti.

Protilátky proti chiméře podle předkládaného vynálezu se mohou užít k monitorování množství chimérického receptoru (nebo buněk nesoucích chimérický receptor) u pacienta.

Takové protilátky jsou dobře uzpůsobeny k tomu, aby se daly využít ve standardních imunologických testech v oboru známých, včetně imunometrických nebo sendvičových testů, jako například forward sandvich, “reverse sandvich a simultaneous sandvich“- Protilátky se mohou použít v libovolném počtu kombinací, jak mohou odborníci určit, aniž by zbytečně experimentovali a ovlivňovali specifičnost, citlivost a přesnost imunotestů.

Standardní referenční práce vysvětlující obecné principy imunologie zahrnují- Roitt, Essent i a 1 Imiauno 1 ogy,

6. vydání, Blackwell Scientific publications, vydavatel,

Oxford, 1988, Kimball, Introduction to Immunology, 2- vyd.,

Macmillan Publishing Co., vydavatel, New York, 1986, Roitt et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., vydavatel, London, 1985, Campbell, Monoclonal Antibody

Technology, v Burdon et al., editor, Laboratory Technigues in Biochemistry and Molecular Biology, díl 13, Elsev i er, vydavatel, Amsterdam, 1984, Klein, Imrounology; The Science of Self-Nonself Discrimination, John Viley & Sons, vydavatel, New York, 1982 a Kennett et al., editor,

Monoclonal flntibodies, Hybridoma: A New Dimension In

Biological Analyses, Plenům Press, vydavatel, New York,

1980.

Detekcí se rozumí stanovení přítomnosti nebo nepřítomností určité látky nebo kvantifikace množství látky.

Termín se tak vztahuje k použití látek, sloučenin a způsobů kvalitativního a kvantitativního stanovení v předkládaném vynálezu.

Izolace dalších hybridomů secernujících monoklonální protilátky se stejnou specifičností jako protilátky popsané zde může být provedena technikou anti-idiotypového typování (Potocmjak et al., Science 215^:1637, 1982). Stručně, anti-idiotypová protilátka je protilátka rozpoznávající jedinečně determinanty protilátky produkované zkoumaným klonem. Anti-idiotypová protilátka se připraví imunizací zkoumanou monoklonální protilátkou zvířete stejného kmene, který byl užit jako zdroj monoklonálních protilátek.

Imunizované zvíře rozpozná, a tedy odpoví, na idiotypové determinanty imunizující protilátky tím, že bude produkovat protilátky k těmto idiotypovým determinantám (anti-idiotypové protilátky).

Hybridní buňky mohou být pro replikaci kultivovány jak in vitro, tak in vivo. Kultivace in vivo je preferovaným způsobem nebot dosahuje vysoké produkce. Stručně, buňky jednotlivého hybridního kmene se injikují intraperitoneálně • · · «· · · · · do myší kmene Balb/c stimulovaných Přistáném, což vede ke vzniku ascitu obsahujícího vysokou koncentraci požadovaných monoklonálních protilátek. Monoklonální protilátky izotypu

IgM nebo IgG se mohou čistit ze supernatantu užitím sloupcové chromatografie odborníkům dobře známé.

Protilátky předkládaného vynálezu jsou zvláště vhodné k užití v imunotestech, kde mohou být užity v kapalné fázi, nebo navázány na pevný nosič. Navíc mohou být protilátky v těchto imunotestech označeny různými způsoby pro detekci.

V oboru je známo mnoho různých značek a způsobů značení. Příklady druhů značek, které mohou být užity v předkládaného vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny pouze na ně, enzymy, radioizotopy, fluorescenční sloučeniny, chemiluminiscenční sloučeniny, bioluminiscenční sloučeniny a cheláty kovů. Odborníci budou běžně znát další značky vhodné k navázání na protilátky nebo budou schopni dosáhnout téhož užitím rutinních experimentů. Kromě toho navázání takových značek k protilátkám může být dosaženo standardními technikami, jež jsou odborníkům všeobecně známé.

Jedna z cest, jak mohou být protilátky předkládaného vynálezu označeny pro detekci, je navázání protilátky k enzymu. Tento enzym, je-li později zásoben substrátem.

bude s ním reagovat takovým způsobem, že se tvoří chemická látka detekovatelná například spektrofotometricky nebo f1uorometričky. Příklady enzymů, které mohou být použity k označení protilátek pro detekci, zahrnují enzymy jako malátdehydrogenáza, stafylokoková nukleáza, delta-V-steroidní izomeráza, kvasničná alkoholdehydrogenáza, • · I • · · · • · • · · alfa-glycerol-fosfát dehydrogenáza, triozofosfátizomeráza, peroxidáza, alkalická g1ukózoox i dáza, ureáza, kata1áza, g1ukoamy1áza biotinavidinperoxidáza, křenová fosfatáza, asparagináza, beta-ga1aktos i dáza, r i bonuk1eáza, g1ukózo-6-fosf átdehydrogenáza, a acetylcholinesteráza.

Přítomnost protilátek může být také detekována označením protilátek radioaktivním izotopem, který pak může být stanoven užitím gama počítače nebo scintilačního počítače. Izotopy zvláště vhodné pro účely předkládaného vynálezu jsou^{: 3}H, ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶C1, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Seje také možné detekovat protilátky značením fluorescenčními sloučeninami. Když je fluorescenčně značená protilátka exponovaná světlu vhodné vlnové délky, její přítomnost je detekována díky fluorescenci barevné látky.

Mezí všeobecně užívané fluorescenční značící sloučeniny patří fluorescein, izothiokyanát, rhodamin, fykoerytrin, fykocyanin, allofykocyanin, o-ftaldehyd a fluorescamin.

Prot i 1átky předk1ádaného vyná1ezu mohou být pro detekc i také značeny užitím kovfl emitujících fluorescenci, jako např. ¹⁵²Eu nebo dalších prvků lantanové skupiny. Tyto kovy mohou být připojeny k molekule protilátky užitím chelatačních činidel, jako je například dietylentriaminpentaoctová kyselina (DTPA) nebo ety1end i am i ntetraoctová kysel i na (EDTA).

Protilátky mohou být také označeny pro detekci spojením s chemi luminiscenční s1oučen i nou.

Přítomnost

• · · · · * • · · •·· ·» · chenti luminiscenčně značené protilátky je pak stanovena detekcí luminiscence, která je důsledkem chemické reakce.

Příklady zvláště vhodných chemi luminiscenčních značících sloučenin jsou luminal, izoluroinol, theromatický ester akridinu, imidazol, akridinové soli, ester oxalátu a dioxetan.

Podobně mohou být ke značení protilátek předkládaného vynálezu užity také bioluminiscenční sloučeniny.

Bioluffliniscence je druhem chemiluminiscence existující u biologických systémů, ve kterých katalytický protein zvyšuje účinnost chemi luminiscenční reakce. Přítomnost bioluminiscenční protilátky je stanovena detekcí přítomné luminiscence- Důležité bioluminiscenční sloučeniny pro účely značení jsou luciferin a luciferaseequorin.

Protilátky a v podstatě čistý antigen předkládaného vynálezu jsou ideálně vhodné pro přípravu diagnostické soupravy (kitu). Kit se skládá z obalu (nosiče) rozděleného tak, aby se do něho umístilo jeden nebo více kontejnerů jako např. lahviček, zkumavek apod., přičemž každý z těchto kontejnerů obsahuje samostatný prvek testu, který bude používán. Typů testů, které mohou být zahrnuty do podoby kitu, je mnoho a zahrnují například kompetitivní a nekompetitivní testy. Typickými příklady testů, které mohou využít protilátky dle předkládaného vynálezu, jsou radioimunotesty (RIA), enzymové imunotesty (EIA), imunosorbentní testy spojené s enzymem (enzyme-1 inked iromunosorbent assay - ELISA) a imunometrické nebo sendvičové imunotesty.

Termínem imunometrický test” nebo sendvičový iraunotest” se míní obsáhnout imunotesty typu simultaneous sandwich“, “forvard sandwich“ a reverse sandvich.

Odborníci těmto termínům dobře rozumějí- Odborníci také ocení, že protilátky podle předkládaného vynálezu budou použitelné v dalších variacích a formách testů, které jsou známy v současnosti nebo které mohou být vyvinuty v budoucnosti- Oblast předkládaného vynálezu zamýšlí obsáhnout také tyto testy.

Je důležité, že při preferovaném způsobu provádění testů jsou v inkubačním médiu přítomny určité blokátory (obvykle přidávané se značenou rozpustnou proti látkou). Blokátory se přidávají proto, aby se zajistilo, že nespecifické proteiny, proteázy nebo lidské protilátky k myším imunoglobulinům přítomné v pokusném vzorku nereagují zkříženě nebo neničí protilátky na pevném nosiči či radioaktivně značenou indikátorovou protilátku, takže nevznikají falešně pozitivní nebo negativní výsledky. Výběr “blokátorů proto podstatně přispívá ke specifičnosti testů popisovaných v předkládaném vynálezu.

Bylo nalezeno, že jako blokátory se může použít mnoho nerelevantních (tj. nespecifických) protilátek stejné třídy nebo podtřídy (izotyp) jako protilátky používané v testech (např. IgBi, IgG2a, IgM, apod). Koncentrace blokátorů (normálně 1-100 pg/μΙ) je důležitá pro udržení náležité citlivosti a současné zabránění jakékoliv nežádoucí interferencí společně se vyskytujících zkříženě reagujících proteinů lidského séra. Navíc potřebuje být optimalizován

J

pufrovací systém obsahující blokátory. Preferované pufry jsou ty, které jsou založené na slabých organických kyselinách, jako je imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS apod., ve fyziologickém rozmezí pH. Poněkud méně preferované pufry jsou anorganické pufry jako je fosfát, borát nebo karbonát- Nakonec jsou k pufrům obsahujícím blokátory výhodně přidávány známé inhibitory proteáz (normálně v rozmezí 0,01 až 10 pg/ml).

Je mnoho ímunoadsorbentfi pevné fáze, které jsou využívány a mohou být použity v předkládaném vynálezu. Dobře známé imunoadsorbenty zahrnují sklo, polystyren, polypropylen, dextran, nylon a další látky, ve formě zkumavek, kuliček a mikrotitračních destiček vytvořených z takových látek nebo jimi potažených, a podobně. Imobilizované protilátky mohou být k imunoadsorbentu v pevné fázi vázány buď kovalentní nebo fyzikální vazbou, užitím takových technik jako je vázání amidovou nebo esterovou vazbou nebo absorpcí- Odbornicí budou znát mnoho dalších

Ímunoadsorbentfi pevné fáze a způsobů, jak na nich imobilizovat protilátky, nebo budou schopni toto zajistit rutinním experimentem.

Pro diagnózu in vivo, i n v i tro nebo in šitu se mohou protilátky dle předkládaného vynálezu označit radionuklidy buď přímým navázáním nebo využitím intermediární funkční skupiny. Intermediární skupina. která se často užívá k navázání radioizotopů v podobě kationtů kovů k protilátkám, je dietylentriaminpentaoctová kyselina (DTPA). Typickými příklady kationtů kovů, které jsou tímto • ·· «· ···· • · · · · · · • · · · · • · · · · · · * · · · ······· ·· · způsobem vázány. jsou^{: 9gm}Tc. ¹²³I, ¹¹¹In. ¹³¹I. ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga a ⁶⁸Ga. Protilátky se pro účely diagnostiky mohou také označit neradioaktivními izotopy. Prvky, které jsou pro toto obzvláště vhodné, jsou^{: 157}Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr a ⁵⁶ Fe.

Antigen podle vynálezu se může izolovat v podstatě čisté formě užitím protilátek podle předkládaného vynálezu. Tak jedno ztělesnění předkládaného vynálezu poskytuje v podstatě čistou tyrosino-proteinkinázovou chiméru a uvedený antigen je charakterizován tím, že je rozpoznáván a váže se na protilátky podle předkládaného vynálezu. Jiné ztělesnění předkládaného vynálezu poskytuje způsob izolace nebo vyčištění chimérického receptorového antigenu tím. že uvedený antigen tvoří komplex s jednou nebo více protilátkami namířenými proti receptorové chiméře.

V podstatě čisté chimérické antigeny podle předkládaného vynálezu se mohou naopak užít pro detekci nebo měření protilátek k chiméře ve vzorku, jako je například sérum nebo moč. Tak jedno ztělesnění předkládaného vynálezu zahrnuje způsob detekce přítomnosti nebo množství protilátek proti tyrosin-proteinkinázovému antigenu ve vzorku, zahrnuje styk se vzorkem obsahujícím protilátku proti chimérickému antigenu s receptorovou chimérou označenou pro detekci, a uvedenou detekční značku. Je jasné, že se mohou také použít imunoreaktivní frakce a imunoreaktivní analogy chiméry. Termínem imunoreaktivní frakce se rozumí jakákoliv část chimérického antigenu, která způsobí ekvivalentní imunitní odpověď na protilátku namířenou proti

·· · receptorové chiméře. Termínem imunoreaktivní analog“ je míněn protein. který se liší od receptorového chimérického proteinu v jedné nebo více aminokyselinách, ale přitom projevuje shodnou imunitní odpověď na protilátku podle vynálezu.

Spojením specificky rozpoznat a vázat se rozumí to, že protilátka rozpozná a váže chimérický receptorový polypeptid, ale v podstatě nerozpozná a neváže jiné nepríbnzné molekuly ve vzorku, případně biologickém vzorku.

Termínem autoimunní buňky jsou označeny buňky produkující protilátky, které reagují s hostitelskými tkáněmi nebo T efektorovýml buňkami, které jsou autoreaktivní, takové buňky zahrnují protilátky proti acetylcholinovým receptorům, (což vede například k myasthenii gravis), nebo protilátky proti DNA, erytrocytům a trombocytům (což způsobuje lupus erythematodes).

Pod pojmem terapeutická buňka” se rozumí buňka, která byla transformována chimérou podle vynálezu, takže je schopna rozpoznat a likvidovat specifické infekční agens, buňku infikovanou specifickým agens, nádorovou a rakovinnou buňku nebo autoimunní buňku, výhodně jsou takovými terapeutickými buňkami hernatopoetícké buňky.

Termínem cílové infekční agens“ se označuje jakékoliv infekční agens (například virus, baktérie, prvok nebo houba), které může být rozpoznáno chimérickým receptorem neseným terapeutickou buňkou. Cílovou buňkou se označuje jakákoliv hostitelská buňka, která může být rozpoznána terapeutickou buňkou nesoucí chimérický receptor, přičemž

cílové buňky zahrnují bez omezení hostitelské buňky infikované virem, baktérií, prvokem nebo houbou, a také nádorové nebo rakovinné buňky a autoimunní buňky.

Termín ••extracelulární'’ znamená, že alespoň část molekuly je exponována na buněčném povrchu. '•Intracelulární'· znamená, že alespoň část molekuly je exponována v cytoplazmě terapeutické buňky. Transmembránový” znamená, že alespoň část molekuly prochází plazmatickou membránou- Termíny extracelulární část, intracelulární část, ·'transmembránová část” v tomto textu označují okolní sekvence aminokyselin, které zasahují do příslušných buněčných kompartmentůOligomerizace znamená tvořit s jinými proteiny dimery, trimery, tetramery nebo oligomery vyššího řádu. Takové oligomery mohou být homo-oligomery nebo hetero-oligomery. Oligomerizující část” je taková část molekuly, která řídí tvorbu komplexu (tj. oligomeru).

Pojem cytolytický'· znamená být schopen zlikvidovat buňku (například buňku infikovanou patogenem, nádorovou nebo rakovinnou buňku nebo autoimunní buňku) nebo zlikvidovat přímo infekční agens (například virus).

Termín “virus deficitu imunity označuje retrovirus, který je ve své divoké formě schopen infikovat buňky T4 hostitele primáta. Vyznačuje se morfogenezí a morfologickými charakteristikami podčeledi lentivirů- Termín zahrnuje bez omezení všechny varianty HIV a SIV včetně HIV-1, HIV-2,

SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand. SIVcpz.

Term í nem ”nezávislý na

MHC” se myslí buněčná

agens nebo buňku (v chimérického receptoru).

cytolytické odpověď, která nevyžaduje přítomnost antigenu

II. třídy MHC na povrchu cílové buňky.

Termín funkční cytolytický derivát přenášející signál znamená funkční derivát (jak je definován výše), který je schopen nasměrovat přinejmenším 10%, výhodně 40%, výhodněji 70% nebo nejvýhodněji alespoň 90% biologické aktivity molekuly divokého typu. Ve smyslu užívaném zde funkční cytolytický derivát přenášející signál přímo informuje terapeutickou buňku, aby zlikvidovala na receptor vázané případě intracelulární části nebo působí nepřímo tak. že podporuje oligomerizaci s proteiny signální transdukce vedoucí k cytolýze terapeutickou buňkou (v případě traňsmembránové domény). Účinnost takových derivátů je možné testovat užitím in vitro testů popsaných zde.

Funkční derivát vážící obal HIV označuje funkční derivát (ve smyslu definovaném výše), který je schopen se navázat na obalový protein HIV. Funkční deriváty lze definovat užitím i n v i tro testů popsaných zde.

Terapeutické podávání

Transformované buňky podle předkládaného vynálezu se mohou použít k léčbě mnoha nemocí- Současné způsoby podávání takových transformovaných buněk zahrnují adoptivní imunoterapii nebo léčbu buněčným přenosem. Tyto metody dovolují navrácení transformovaných buněk imunitního systému do krevního oběhu. Rosenberg, Sci. Am- 62, květen 1990,

Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323=570, 1990.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu se mohou podávat ·· ····

jakémukoliv zvířeti, které zakusí blahodárný vliv sloučenin podle vynálezu. Nejpřednější mezi takovými zvířaty jsou lidé, ačkoliv není úmyslem vynálezu omezit se pouze na člověka.

Popis obrázků

Obr. IA je schematický diagram ukazující organizaci fúzovaných proteinů receptorové kinázy vynálezu. Obr. IB ukazuje výsledky průtokové cytometrie pro CD16/7/zeta, CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk a CD16/7/ZAP-70 exprimované rekombinantami vakcíníe v buňkách Jurkat.

Obr. IC ukazuje testy aktivity kinázy in vitro imunoprecipitovaných CD16/7/zeta (negativní kontrola), CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk a CD16/7/ZAP-70, ještě musí být identifikován precipitát nižší molekulové hmotnosti objevující se v imunoprecipitátu chiméry Fyn.

Obr. 2 ukazuje odpověď cytosolového kalcia spouštěnou navázáním kinázových chimér v buňkách Jurkat bez TCR. Je ukázána relativní intracelulární koncentrace kalcia populace, která má TCR (měřeno poměrem Indo-1 violetí k modré fluorescenci). Buňky Jurkat infikované rekombinantami vakcíníe exprimujícími různé fúzované proteiny byly vystaveny anti-CD16 mAb 3G8 G8, což bylo následováno kozími protilátkami F(ab)2 (konjugovanými s fykoerytrinem) proti myším IgG v čase 0. Chiméry založené na řetězci zeta TCR a FcRIlB2 slouží jako pozitivní

• ·· · a negativní kontroly.

Obr. 3 ukazuje předčasné zapojení kalciové odpovědi u buněk s TCR exprimujících chiméru kinázy Syk. Infekce a analýza byly provedeny tak, jak je popsáno výše u obr. 2. Podstatná část buněk exprimujících chiméru Syk vykazovala před přidáním primární protilátky vysoký poměr fluorescence f ialová/modrá.

Obr. 4A a 4B ukazují smrtící test anti-hybridomfi.

Obr. 4A ukazuje procento ⁵¹Cr-chromanu uvolněného z hybridomových cílových buněk vyjádřené jako funkce poměru efektorových buněk (CTL exprimující kinázovou chiméru) k buňkám cílovým, buňky exprimující receptorové chiméry nesoucí intracelulární domény řetězce zeta TCR a FcRIIB2 slouží jako pozitivní a negativní kontroly- Obr. 4B ukazuje specifičnost usmiřování (nepřítomnost náhodného usmiřování). Buňky BV5147 (postrádající povrchovou protilátku anti-CD16) byly zatíženy ⁵¹Cr-chromanem a vystaveny CTL exprimujícím kinázové chiméry za stejných podmínek jako paralelní vzorek buněk 3G8 zatížených chromanem (exprimující protilátku anti-CD16). Z buněk BV5147 nebylo pozorováno detekovate1né uvolnění chromanu.

Obr. 5A, 5B a 5C ukazují, že společná exprese ZAP-70 a Fyn či Lek umožňuje indukci cytolýzy a snižuje latencí kalciové odpovědi. CTL byly infikovány společně rekombinantami vakcínie exprimujícími vyznačené chiméry a analyzovány na cytolytický potenciál nebo mobilizaci kalcia. Účinnost chimér je touto analýzou podceňována, protože frakce buněk exprimující obě chiméry nebyla měřena ·· ····

• · · + · nezávisle <k normalizaci aktivity byla použita frakce buněk exprimující alespoň jednu chiméru)- Obr, 5A ukazuje test cytolýzy za použití CTL exprimujících páry chimér CD16/7/kinázy. Obr. 5B ukazuje kalciovou odpověď buněk bez TCR, které exprimují páry chimér CD16/7/kinázy. Obr. 5C ukazuje test cytolýzy CTL společně exprimujících chiméry CD4/CD7/Fyn a CD16/7/ZAP-7Q. Chiméra CD16/7/zeta slouží jako pozitivní kontrola, zatímco chiméra CD16/7/FcRIIB2 slouží iako kontrola negativní.

Obr. 6A a 6B ukazují, že chiméry kinázy s delecí nebo bodovou mutací jsou v mobilizaci kalcia a přesměrování cytolýzy neúčinné- Negativní varianty fúzovaného proteinu kinázy byly konstruovány delecí (v případě Syk) nebo bodovou mutací (v případě ZAP-70) a testovány na kalciovou odpověď a cytolýzu. Obr. 6A ukazuje kalciovou odpověď u buněk bez TCR- Obr. 6B ukazuje test přesměrované cytolýzy.

Obr. 7A, 7B a 7C ukazují, že chiméry založené na lidském Syk jsou v podstatě ekvipotentní s chimérami založenými na Syk prasečím. Obr. 7A ie sekvence lidského Syk (sekvence identifikačního čísla 5) a srovnání s prasečím Syk (sekvence identifikačního čísla 6), prvních 11 a posledních aminokyselinových zbytků je určeno sekvencí příměrů- Obr.

7B ukazuje analýzu mobilizace kalcia buněk bez TCR exprimujících lidskou chiméru Syk. Obr- 7C ukazuje test přesměrované cytolýzy CTL exprimující chiméru lidského Syk.

Obr. 8 ukazuje změny ve vzorci fosforyláce tyrosinu po navázání kinázových chimér. Buňky Jurkat bez antigenu

T buněčného exprimující vyznačené chiméry nebo páry chimér ···· byly vystaveny anti-CD16 a kozí sekundární protilátce proti myšímu IgG a poté lyžovány, rozděleny do frakcí na polyakrylamidovém gelu, přeneseny na nitrocelulózu a inkubovány s anti-fosfotyrosinovou protilátkou- Dráhy označeny představují extrakty z buněk s navázanou protilátkou, zatímco dráhy označené byly lyžovány přímo bez předchozí expozice sekundární protilátce. Kontrolní dráhy byly vytvořeny obdobným ošetřením buněk bez TCR exprimujíeích fúzovaný protein CD16/7, který neobsahoval intračelulámí doménu. Pro srovnání, účinky ošetření buněk

Jurkat s TCR anti-CD3 (s nebo bez infekce virem divokého typu vakcínie), jsou ukázány vpravo- Výrazné pásy v blízkosti 100 kD v levé části tohoto panelu odpovídají očekávaným molekulovým hmotnostem kinázových chimér.

Obr. 9 ukazuje fosforylací tyrosinu fosfolipázy

C-garaal následující agregaci chimér. PLC-gamal byla imunoprecipitována z buněk s navázanou protilátkou a imunoprecipitáty byly rozděleny na gelech, přeneseny na prot i 1átkou prot i ve fosf ory1ováném nitrocelulózu a inkubovány s fosfotyrosinu. Podstatné zvýšení

PLC-gamal bylo pozorováno po agregaci chimér Syk, zatímco omezenější, ale snadno detekovatelné zvýšení je pozorováno po společné agregaci chimér Fyn a ZAP-70.

Obr. 10A a 10B ukazují kinázové testy in vitro. Buňky exprimujicí kinázové chiméry navázaly chimérické protilátky, poté byly kinázy imunoprecipitovány a imunoprecipitáty byly vyhodnoceny na fosforylací endogenního substrátu. Obr. 10A ukazuje srovnání aktivity imunoprecipítovaných kinázových ·· ····

chimér po inkubační dobu deseti minut, za použití imunoprecipítátů izolovaných z buněk s navázanou protilátkou <+> nebo bez ní (-). Obr. 10B ukazuje časový průběh asimilace fosfátu do endogenních substrátů chimérou kinázy Syk, s O) nebo bez <-) navázané protilátky.

Aktivace T buněk shluklými tyrosin-kinázami

Nyní následuje popis konkrétních ztělesnění vynálezu.

V tomto popise se demonstruje, že nereceptorové kinázy jsou aktivovány jednoduchými shlukovými událostmi. Byly tvořeny arteficiální receptorové kinázy, jejichž intracelulámí domény byly složeny z kompletních sekvencí kináz rodin Src nebo Syk a byly zkoumány důsledky agregace s externími vazebnými stimuly. Aktivity kináz z rodin Syk a Src se jasně lišily: vytváření vazeb kinázami Src nevedlo k významné buněčné aktivaci, zatímco tvoření vazeb kinázami Syk vedlo k výskytu volného intracelulámího kalciového iontu a, v případě Syk, cytolytického potenciálu. Selhání chimér ZAP-70 indukovat programy zprostředkované distálním receptorem může být překonáno současným shlukováním chiméry

ZAP-70 s kinázovými chimérami bud Fyn nebo Lek- Příklady nyní popsané jsou poskytnuty za účelem ilustrace vynálezu, ne jeho limitace.

Příklady provedení vynálezu

Konstrukce tyrosin-proteinkinázových chimér a demonstrace účinnosti

Fúzované geny kódující proteiny podobné buněčným

• ·· · receptorovým kinázám byly vytvořeny připojením DNA fragmentu kódujícího extřačelulámi doménu molekuly CD16 ke krátkému oddělovacímu segmentu kódujícímu juxtamembránovou a transmembránovou doménu CD7 spojenou postupně s kompletní kódující sekvencí tyrosinkináz lidského Lek (Koga et al., Eur. J- Immunol. 16-1643-1646, 1986), myšího Fyn(T) (Cooke and Perlmutter, New Biol. 1^66-74, 1989), prasečího Syk (Taniguchi et al., J. Biol. Chem. 266^:15790-15796, 1991) a lidského ZAP-70 (Chán et al., Ce11 71-649-662, 1992) (obr. ÍA). Výsledné trojité genové fúze byly včleněny do rekombinantních virů vakcínie homologní rekombinací a selekcí na společnou expresi genového produktu gpt E.

coli. Infekce buněk rekombinantami měla za následek účinnou expresí všech čtyřech kinázových chimér na buněčném povrchu (obr. 1B). Imunoprecipitace výsledných proteinových chimér protilátkami anti-CD16 odhalila přítomnost molekul očekávaných hmotností, které byly aktivní v testu fosforylace in vitro (obr. 1C)Dále jsme vyšetřovali, zda obsazení vazebných míst fúzovaných proteinů může umožnit akumulaci volného intracelulárního kalcia, podobně jako fúzované proteiny založené na intracelulárních doménách antigenů T buněčného receptoru. Abychom toho dosáhli, infikovali jsme různé buňky rekombinantami vakcínie a měřili relativní koncentraci cytoplazmatického kalcia po obsazení extracelulárních domén protilátkami- Byla provedena obě měření, jak spektrofluorometrické (kompaktní populace) tak průtokově cytometrické (jednotlivá buňka) s buňkami obarvenými • ·· ·

Indo-1 (Grynkiewicz et al . , J. Biol- Chem. 260-3440-3450, 1985, Rabínovitch et al., J. Immunol- 137^:952-961, 1986). Analýzy průtokovou cytometrií se prováděly z dat získaných z buněk, které exprimovaly na buněčném povrchu CD16, jak určováno intenzitou fluorescence fykoerytrinu, v relativně úzkém předem definovaném rozmezí. Ačkoliv v tomto rozmezí byly stále pozorovatelné menší odchylky od průměrné intenzity fluorescence (způsobené odlišností v distribuci chimér exprimovaných buňkami), tento přístup nám umožnil porovnat odpovědi buněk nesoucích přibližně stejný počet receptorů. Obrázek 2 ukazuje analýzu dat sebraných na buňkách mutantní varianty lidské T buněčné leukemické linie

Jurkat postrádající antigen T buněčného receptoru (Weiss a Stobo, J. Exp. Med. 160=1284-1299, 1984). V těchto buňkách neměla chiméra Lek ani Fyn schopnost mobilizovat kalcium po obsazení vazebných míst. V některých experimentech mělo shlukování fúzovaného proteinu Lek za následek slabé snížení klidové koncentrace kalcla, relativně k negativní kontrole, fúzovanému proteinu založenému na intracelulární doméně nízkoafinítního IgG receptoru FcRIIB2 (Kolanus et al., EMBQ

J. 11- 4861-4868, 1992). Agregace fúzovaných proteinů založená na obou ZAP-70 a Syk velice účinně podporovala výskyt volného cytoplazmatického kalciového iontu, zhruba tak účinně jako agregace podobné chiméry nesoucí intracelulární doménu řetězce zeta T buněčného receptoru.

U obou kinázových chimér ZAP-70 a Syk bylo pozorováno mírné zpoždění v nástupu kalciové odpovědi, odpovídající době nástupu mobilizace kalcia chimérou zeta. V buňkách

·· ··· · ·

obsahujících T buněčný receptor (obr. 3) bylo vyhodnocení toku chimér Syk částečně vyvráceno vysokou klidovou koncentrací volného kaleiového iontu, což by svědčilo pro konstitutivní zapojení kalciového regulačního aparátu. Začlenění chimér do cytolytické T buněčné linie nám poté umožnilo stanovit potenciál fúzovaných proteinů pro vykonávání efektorové funkce. V tomto testu jsou jako cílové buňky použity hybridómové buňky anti-CD16, které exprimují protilátku buněčného povrchu IgG proti CD16 (Fleit et al.,

Proč. Nati. Acad. Sej. USA 79' 3275-3279, 1982, Shen et al.,

Mol. Immúnoi. 26^: 959-969, 1989). Hybridómové buňky jsou značeny inkorporací ⁵¹Cr-chromanu a sedimentovány společně s efektorovými buňkami, připravenými infekcí lidské alospecifické cytotoxické T lymfocytární (CTL) linie rekombinantami vakcínie exprimujícími fúzované proteinové kinázy CD16/CD7. Exprese kinázových receptorových chimér umožňuje infikovaným buňkám CTL vázat se na cílové buňky, a jsou-li kompetentní, lyžovat je, což je proces, který je měřen uvolněním inkorporovaného ⁵¹Cr-chrcmanu. Relativní účinnost vybavených CTL je určována srovnáním poměru efektorových buněk k cílovým buňkám, který je nutný k dosažení dané části uvolněného ⁵¹Cr. Obr. 4A ukazuje, že

CTL exprimující chimérické receptory obsahující kinázy Lek nebo Fyn(T) z rodiny Src nebo kinázu ZAP-70 z rodiny Syk, jsou neschopné zprostředkovat cytolýzu proti hybridomovým cílům anti-CD16. Avšak CTL exprimující kinázovou chiméru založenou na proteinovém produktu Syk byly v podstatě stejně účinné jako CTL exprimující chiméru složenou z CD16 fúzované • · · · · · · • · · · ···· · • · · · · · • · ···· ·· ·· <Ϊ10 Ύι· stejným způsobem s intracélulární doménou řetězce zeta T buněčného receptorů. Cytolytická aktivita směrovaná kinázovými chimérami CD16/CD7 by nemohla být připisována nespecifickému uvolnění cytotoxických granul, protože společná sedimentace irelevantního cíle obsahujícího chrom s CTL vybavenými kinázou neměla za následek detekovatelné uvolnění značeného chrómu (obr. 4B).

Rozdílnost aktivity v testu cytolýzy pro Syk a ZAP-70 byla neočekávaná ve světle podobné aktivity těchto dvou chimér v testu kalciové odpovědi. Ve světle důkazu, že společná exprese nechimérických kináz rodin ZAP-70 a Src vedla k aktivaci v buňkách COS (Chán et al., Cé11

71,^649-662, 1992), jsme se pustili do hodnocení relativního potenciálu párů chimér provádět cytolýzu. Efektory CTL byly infikovány současně rekombinantními viry vakcínie kódujícími chiméry ZAP-70 a Lek, chiméry ZAP-70 a Fyn(T) nebo chiméry Lek a Fyn(T). Obr. 5A ukazuje, že společná exprese chimér

ZAP-70 a Fyn(T) nebo chimér ZAP-70 a Lek obdařila CTL aktivitou v podstatě ekvipotentní s aktivitou CTL exprimujících samotné kinázové chiméry CD16/CD7/Syk, aktivitou opět stejně silnou jako je ta projevovaná chimérami CD16/CD7/zeta. Společná exprese chimér Lek a Fyn(T) neumožnila, aby byl přesměrován významný cytolytický potenciál proti cílovým buňkám anti-CD16 (obr. 5A). Vyhodnocení potenciálu mobilizace kalcia buněk infikovaných současně páry fúzovaných proteinkináz ukázalo, že společná exprese chimér kináz rodin ZAP-70 a Src zvýšila rychlost, se kterou se kaleium mobilizovalo jako odpověď na ·· «··* • ··· · • « ·· · obsazení receptoru, a že společná exprese chimér Lek a Fyn(T) neměla za následek významnou akumulaci volného intracelulárního kalcia (obr. 5B). Aby se dále prozkoumala úloha chiméry Fyn v aktivační odpovědi indukované společnou agregací, připravili jsme chiméru Fyn skládající se z extracelulárních a transmembránových domén CD4 fúzovaných s Fyn způsobem podobným způsobu chimér CD16- Obr- 5C ukazuje, že účinnost této chiméry v testu řízené cytolýžy je deset až dvacetkrát nižší než účinnost srovnatelné chiméry GD16, což svědčí pro to, že fyzické spojení kínázových chimér je důležité pro aktivaci- Avšak cytolytická aktivita buněk exprimujících dvě chiméry je významně vyšší, než by byla pozorována pro buňky exprimující pouze chiméru ZAP-70.

Kvůli relativně vysoké úrovni exprese kináz v tomto systému nemůže být vyloučeno, že reziduální aktivita odráží náhodnou spontánní asociaci chiméry CD4/Fyn s CDÍ6/ZAP-70.

Aby se určilo, zda aktivace pozorovaná v testech kalciové odpovědi a cytolýžy byla přímo důsledkem aktivity relevantní kinázy, a ne pasivní asociací kináz s existujícími prvky signální transdukce, jejichž nepřímá agregace tedy spustila aktivační odpověď, vytvořili jsme varianty bez kinázové aktivity receptorových chimér prasečího Syk a lidského ZAP-70- Obr. 6 ukazuje, že receptorové chiméry, které buď postrádají v podstatě všechny kinázové domény (v případě Syk) nebo nesou bodovou mutaci rušící fosfotransferázovou aktivitu (v případě ZAP-70), neměly kinázovou aktivitu in vitro a byly neschopné zprostředkovat mobilizaci kalcia po obsazení receptorů nebo ·· ····

• · · • · · • ··· · • · ·· · zprostředkovat, receptorové přesměrovanou cytolýzu.

Protože interakce prasečího Syk s lidským buněčným aparátem nemusí být identická s interakcí lidského Syk, zkonstruovali jsme také podobné proteinové chiméry založené na lidském Syk, po izolaci sekvencí lidského Syk metodou PCR s primery odpovídajícími amino- a karboxyl- koncům prasečí proteinové sekvence. Obr. 7A ukazuje, že prasečí a lidský Syk jsou nápadně podobné proteiny, jak pro to svědčí analýza produktů PCR, které odpovídají částem kinázové a druhé SH2 domény (Chán et al., Cell 71=649-662, 1992). Ve shodě s tímto nálezem se proteiny chimérického receptorů lidského Syk chovaly v podstatě identicky s prasečími konstrukty při testech uvolňování kalcia a cytolýzy (obr. 7B a 70Aby se určilo, zda agregace tyrosin-kinázových chimér má za následek významnou změnu v nadbytku fosfotyrosinových proteinů, byly buňky bez T buněčného receptorů infikovány rekombinantami vakcinie kódujícími kinázové chiméry.

Extracelulární domény chimér byly obsazeny protilátkami a celkové buněčné lyzáty aktivovaných buněk byly rozděleny elektroforézou, přeneseny na membrány a analyzovány s protilátkou rozpoznávající fosfotyrosin. Lyzáty byly připraveny rozrušením buněk v neionogenních detergentech za přítomnosti vanadátu s nebo bez EDTA, nebo lyžovány za přítomnosti dodecylsulfátu sodného, následovanou sonifikací, aby se roztrhala uvolněná DNA. Vzorec fosfotyrosinových proteinů byl v každém případě odlišný a lyzáty připravené s vanadátem, ale bez EDTA, ukazovaly další druhy nepřítomné v lyzátech připravených pouze v SDS, což svědčí pro to, že

·· ·

EDTA mflže inhibovat činnost tyrosinových kináz po lýzi stejně jako fosfatáz. Shledalo se, že použití přímé lýze v SDS vede k reprodukovate1nějšímu vzorci proteintyros inové fosforylace než lýze s neionogenními detergenty v přítomnosti EDTA a vanadátu. Obr- 8 ukazuje, ze agregace chimér nesoucích Syk, ZAP-70 nebo Fyn a ZAP-70 vede _ k výskytu nebo zvýšené fosforyláci několika proteinových druhů migrujících společně s proteiny, které ukazují zvýšenou fosforylaci následující po navázání receptorového antigenu. Konkrétně vzorec pásů indukovaný shlukováním chiméry Syk je velmi podobný vzorci indukovanému protilátkou anti-CD3 v buňkách s T buněčným receptorem (obr. 8). Mezi těmito pásy je protein o velikosti přibližně 150 kD indukovaný agregací chiméry Syk, ale také indukovaný společnou agregací chimér Fyn a ZAP-70. V předběžných pokusech bylo pozorováno, že tento fosfoprotein migroval společně s fosfolipázou C-gama (data neuvedena).

Aby se stanovily přímo účinky shlukování kinázových chimér na PLC-gama, navázali jsme vazebně chiméry.

přecipitova1 i PLC-gama se směsí monoklonálních protilátek a analyzovali výsledné imunoprecipitáty na přítomnost fosfotyrosy1ových proteinů- Obr. 9 ukazuje, že shlukování

Syk vede k podstatnému zvýšení v obsahu tyrosinfosfátu

PLC-gama, zatímco navázání chimér Fyn a ZAP-70 má za následek méně dramatické, ale snadno detekovatelně zvýšení tyrosinfosfátu. Buňky exprimující samotnou chiméru Fyn ukazovaly mírnou základní fosforylaci PLC-gama, která se nezvyšovala po agregaci receptorů (obr. 9). Zdali jsou tytéž tyrosinové zbytky fosfory1ovány Syk, Fyn nebo ZAP-70 a Fyn, je v současnosti neznámo. Protože buňky exprimující chiméru Fyn nevykazovaly ani klidovou ani indukovanou mobilizaci kalcia, může fosfotyrosinový signál pozorovaný v těchto buňkách představovat používání jiných míst na PLC-gama, než těch, které zprostředkovávají aktivaci fosfolipázy.

V předběžném pokuse vysvětlit změny fosfotyrosinového vzorce jsme vyhodnocovali aktivitu různých kináz po shlukování v in vitro autofosforylačním testu. Chiméry byly agregovány, imunoprecipitovány a vyhodnocovány na schopnost inkorporovat fosfátové značení do proteinu přítomného v imunoprecipitátu. Obr- 10A ukazuje, že za těchto podmínek nebylo detekováno žádné zvýšení v aktivitě kinázy po obsazení vazeb, když byl test kinázy prováděn po dobu deseti minut. Ačkoliv inkorporace značeného fosfátu se v tomto testu plynule zvyšuje až 30 minut, je nejasné, které faktory omezují aktivitu, konkrétně pozorovaná kinetika může být ovládnuta rychlostí disociace imunních komplexů, což umožní difúzi kinázy k nespotřebovanému substrátu. Při pokuse potlačit tento účinek, stejně jako maximalizovat senzitivitu testu, jsme také vyhodnocovali aktivitu kinázy Syk s nebo bez předběžného obsazení vazeb po velmi krátkou dobu od 5 do sekund, avšak také zde nebylo žádné významné zvýšení kinázové aktivity (obr. 10B). Ačkoliv nemůžeme v současnosti vyloučit možnost, že zvýšení aktivity by bylo s příslušným substrátem prokazatelné, zvýšení aktivity chiméry Syk indukované agregací také nebylo pozorováno, když byl k měření kinázové aktivity použit exogenní peptidový substrát (Y 19 K substituce cdc 2 zbytky 6-20).

Možné mechanismy

Mechanismus, díky kterému má jednoduchý stimul fyzikální povahy, tedy agregace receptorů, za následek přenos zřetelného chemického signálu na buňky imunitního systému, zůstává neznámý. Předešlé studie prokázaly, že kinázy rodiny Src mohou být spojené s mnoha důležitými receptory imunitního systému, které jsou aktivovány agregac i, a že obsazen i takových receptorů Často vede ke zvýšené aktivitě kinázy. Nedávno bylo zjištěno, že příbuzné kinázy Syk a ZAP-70 jsou spojeny buď stabilně (v případě Syk) nebo přechodně (v případě ZAP-70) s antigeny Ba T buněčných receptorů a alespoň v případě Syk bylo publikováno, že obsazení receptorů vede ke zvýšené kinázové aktivitě.

V této prácí jsem ukázali, že agregace rodiny kináz Syk, ale již ne agregace kináz Lek nebo Fyn z rodiny Src, vede ke kalciové odpovědi v buňkách postrádajících T buněčný receptor- Odpověď se nezdá být důsledkem nepřímého spojení s dalšími T buněčnými receptory nebo složkami signální transdukce, protože mutanty bez kináz nemohou indukovat kalciovou odpověď. Agregace chimér obsahujících kinázu Syk je dostatečná k tomu, aby umožnila indukci specifické cytolýzy, zatímco indukce podobné cytolýzy chimérou ZAP-70 vyžaduje účast další kinázy rodiny Src. V současnosti je nejasné, která z kináz rodiny Src pravděpodobně hraje důležitější roli v T buněčné aktivaci'- obě ZAP-70 a Syk jsou exprimovány v T buňkách, včetně buněčných linií používaných

v této studii a přinejmenším jedna vnímavá lidská T buněčná linie obsahuje Syk, ale ne ZAP-70, jak se dá usuzovat ze specifických produktů PCR. Vzorec zvýšené tyrosinové fosforylace proteinu pozorovaný po shlukování chiméry Syk je velmi podobný vzorci pozorovanému po navázání antigenu

T buněčného receptoru.

Jeden jednoduchý model aktivace imunitního systému buňkami nereceptorových tyrosinkináz používá s receptorem spojenou tyrosinkinázu, jejíž agregace vede k aktivaci bud' fyzickou asociací (např. tvořením aktivních kinázových dimerů) nebo vzájemnou enzymatickou akcí (napřfosforylací), aktivovaný enzym působí na klíčové intracelulární substráty vyžadované pro mobilizaci kalcia a syntézu inositolfosfátu. Podklad pro tento sled událostí může být nalezen ve studiích popisujících zvýšení v aktivitě kinázy spojené s receptorem, které následuje po obsazení receptoru (např. Bolen et al., Adv. Cancer Res. 57=103-149,

1991, Burkhardt et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA

88- 7410-7414, 1991, Eiseman a Bolen, Nátuře 355 - 78-80,

1992, Hutchcroft et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA

89=9107-9111,	1992, Hutchcroft	et	al . ,	J. Biol.	Chem.
267=8613-8619,	1992,	Tsygankov	et	al . ,	J. Biol.	Chem.
267 = 18259-T8262	1992	, Vong et	al . ,	Oncogene 7=2407-241,5
1992)- Avšak	hlášené	změny v	k i názové	aktivitě	jsou ve

většině případů mírné a kontrastují s dramatickými změnami ve fosfotyrosinovém proteinovém vzorci pozorovaném in vivo.

Protože je obtížné jednoznačně vyloučit aktivaci slabými alosterickými interakcemi za použití kinázových testů in

vitro, nemůžeme nyní učinit definitivní prohlášení o relativní důležitosti kinázové aktivace v iniciaci signální transdukce. Ale data zde prezentovaná svědčí pro to, že agregací indukované opětovné rozdělení enzymu a substrátu může být důležitý faktor v nasměrování existující aktivity k příslušnému fyziologickému cíli.

Agregace chimér založených na kinázách rodiny Syk vedla ke kalciové odpovědi, která byla lehce opožděna, ale amplitudou podobná odpovědi pozorované po agregaci chimér receptoru zeta v buňkách bez endogenního T buněčného receptoru. Vážnější opoždění ve výskytu volného kalciového iontu bylo pozorováno po navázání chiméry ZAP-70 a toto opoždění mohlo být v podstatě odstraněno společným navázáním chimér ZAP-70 a Fyn. V současnosti je vysvětlení této pozorované latence nejasné. Protože společné obsazení vazeb urychlilo mobilizaci kalcia, je lákavé připsat opoždění relativní neúčinnosti ZAP-70 autoaktivaci zprostředkované agregací. Ale stejnou mírou mohou být důležité další faktory a dosah působnosti kináz ZAP a Syk na buněčném povrchu může být ve skutečnosti současně překážka aktivace při srovnání s normálním procesem, například jestliže v normálním průběhu událostí jsou kinázy rodiny Syk přechodně vychytány shlukovanými receptory, aktivovány a pak uvolňovány, aby mohly difundovat ke svým substrátům, permanentní vazba kinázové domény k plazmatické membráně by mohla být restriktivní tím, že brání přístupu k substrátu a/nebo omezuje zesílení signálu v důsledku neschopnosti chimérických receptorů fungovat jako druh katalytického

• ·

centra pro aktivaci kinázy.

Druhou zvláštností kalciové odpovědi bylo zjištění, že buňky s T buněčným receptorem exprimující chiméry založené na lidském nebo prasečím Syk vykazovaly vysokou bazální koncentraci volných kaletových iontfi, což zřejmě znamená, že uvolňování kalcia bylo spuštěno spontánně . Nic podobného nebylo pozorováno u buněk, které receptor neměly. Tyto výsledky protiřečí obecnému trendu, který jsme pozorovali, kdy mutanty lidských T buněk odvozené z nádorových linií bez T buněčných receptorfl zvýšeně odpovídají na exogenně dodané spouštěcí molekuly. K vysvětlení zjevné nezbytnosti T buněčného receptoru ve spontánním aktivačním procesu navrhujeme dvě možná vysvětlení. Jedno je to, že chimérická kináza Syk působí konstitutivně na intracelulární doméně T buněčného receptoru a vytváří tak fosfotyrosinové cíle pro domény SH2 receptorové chiméry, což v důsledku vede k intracelulární agregaci zprostředkované multivalentními můstky T buněčných receptorů, a opět podporuje aktivitu kinázy. Jinou možností je to, že buňky bez T buněčných receptorfl vyžadují nižší hladinu kinázy asociované s membránou pro aktivaci Syk, a to buď proto, že celkový regulační okruh sníží syntézu de novo hypotetické kinázy, nebo proto že nepřítomnost antigenního receptoru vede k poruše regulace buněčných signálních cest.

Kináza Syk je u B buněk konstitutivně asociována s intracelulámím i částmi antigenních receptorfl IgM (Hutchcroft et al., Proč. Nati. flcad. Sci. USA

89:9107-9111

1992

Hutchcroft et al,

J. Biol. Chem.

• ·· ·

267:8613-8619, 1992). Přesný mechanismus asociace je nejasný, ale jedna z možností je, že fosfotyrosin není nezbytný pro interakci domény SH2 ze Syk s tyrosinovým spouštěcím motivem přítomným v cytoplazmatické doméně receptorových řetězců mb-1 a B29

Částečným předpokladem pro tuto hypotézu je zpráva o tom, že genový produkt ber ve zlomové oblasti filadelfského chromozomu se váže k různým doménám SH2 typu způsobem nezávislým na fosfotyrosinu (Pendergast et al., Cell 66-161-171, 1991, Muller et al.,

Mol. Cell. Bioi, 12:5087-5093, 1992). V tomto případě se však zdá, že fosfoserinové a/nebo fosfothreoninové zbytky hrají v interakci klíčovou roli. Jinou možností je, že Syk je asociována s intracelulárním motivem receptorú IgM prostřednictvím jedinečné oblasti umístěné mezi elementy

SH2 a katalytickou doménou Syk. Třetí možností je, že pouze velmi malé množství peptidu s fosforylováným tyrosinem je nezbytné k tomu, aby přitáhlo funkčně významné množství Syk k vnitřnímu povrchu plazmatické membrány, a že toto nízké množství tyrosinfosfátu dosud unikalo detekci.

Ačkoliv u B buněk dosud nebylo s konečnou platností rozhodnuto o účasti kináz z rodiny Src v aktivaci, u T buněk byly zjištěny dvě kinázy Lek a Fyn(T), které hrají důležitou roli, jak bylo prokázáno somatickou genetikou nebo genetikou organismů (Appleby et al, , Cell 70:751-763, 1992, Karnitz et al,, Mol. Cell. Bioi, 12:4521-4530, 1992, Stein et al., Cell

70: 741-750, 1992, Strauss a Veiss, Cell 70:585-593, 1992),

V současnosti nejsme schopní rozumně stanovit, zda činnost těchto kináz předchází anebo následuje činnost kináz z rodiny Syk. Jedna hypotéza vysvětlující činnost ZAP-70 v aktivaci T buněk se dovolává kinázy z rodiny Src asociované s receptorem, jejíž agregace dovoluje dočasnou fosforylací receptorových řetězců, což opět vede k asociaci ZAP-70, a následně k buněčné aktivaci. Počáteční fosforylace receptorových řetězců navržená v tomto modelu musí být odlišena od stabilní fosforylace zety pozorované delší čas po obsazení receptoru.

U myších T buněk malý podíl T buněčných receptorových komplexů obsahuje molekulu zvanou eta příbuznou se zeta (Baniysh et al., J. Biol. Chem. 263=9874-9878, 1988), což představuje alternativně sestřiženou formu (Clayton et al - ,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88- 5202-5206, 1991). Eta se liší od zety karboxylovým koncem a postrádá nejvzdálenější ze šesti tyrosinů nalezených u myší zety (Jin et al., Proč.

Nati. Acad. Sci. USA 87-3319-3323, 1990), Áčko1 iv fosforylace řetězce zeta myších TCR izoform zeta-zeta se dá snadno detekovat po protilátkou zprostředkovaném obsazení receptoru, za podobných podmínek TCR řetězec eta není fosforylován na detekovatelné úrovni (Bauer et al., Proč.

Nati. Acad. Sci. USA 88-3842-3846, 1991). Stálá fosforylace řetězce zeta zřejmě vyžaduje dva přilehlé řetězce zeta, neboť izoformy TCR nesoucí zeta-eta heterodimery nejsou fosforylovány po obsazení receptoru (Bauer et al., Proč.

Nati. Acad, Sci. USA 88^3842-3846, 1991). I přes rozdíly ve fosforylací, buněčné linie obsahující izoformy TCR, které se skládají výhradně z homodimerů eta jsou funkčně nerozlišitelné od buněčných linií nesoucích pouze homodimery

zeta (Bauer et al . , Proč. Nati, Rcad. Sci. USR

88:3842-3846, 1991). Takže fosforylace zety, jak je pozorována 30 minut po agregaci receptorů zprostředkované protilátkou, nekoreluje s aktivací. Samostatná studie ověřující časový průběh akumulace tosfoproteinů s fosfotyrosinem po agregaci TCR ukázala, že dříve _r pozorované dva proteiny o molekulové hmotnosti 135 a 100 kD, jejichž fosforylace je poprvé detekovate1ná 5 a 15 sekund po obsazení vazeb a které dosahují 50¾ maximální fosforylace v obou případech přibližně v 30 sekundách, předchází čas, kdy je dosaženo poloviny maximální mobilizace vápníku a tvorby inosito1fosfátu (June et al., Proč. Nati. Rcad.

Sci. USR 87~- 7722-7726, 1990, June et al. , J. Immunol.

144:1591-1599, 1990). Naproti tomu rychlost fosforylace zety je podstatně pomalejší, poloviny maximální substituce je dosaženo přibližně 3 až 5 minut po stimulaci, tedy potom, co je pozorována akumulace kaleia a uvolnění inositolfosfátu (June et al., Proč. Nati. Rcad. Sci, USR 87^: 7722-7726,

1990, June et al-, J. Immunol. 144:1591-1599, 1990).

Takže jestliže dvoukrokový model je správný, fosforylace tyrosinu nezbytná k tomu, aby připoutala ZRP-70 k vnitrnímu povrchu plazmatické membrány musí být pravděpodobně dočasnou událostí a podstatně rychlejší než bylo pozorováno ve výše zmíněných studiích. Nedávno bylo zjištěno, že fosforylace tyrosinu spouštěná dostatečně rychle (přibližně během 15 sekund), může být detekována jak u zeta tak u řetězců epsilon CD3 po obsazení receptorů (Wange et al., J. Biol- Chem. 267: 11685-11688, 1992), a že

protein o velikosti 70 kD nesoucí tyrosinfosfát je asociován jak se zeta, tak epsilon řetězci. Dosud není jasné, zda stabilní asociace s fosforylováným receptorovým řetězcem je nezbytným předpokladem pro úspěšnou aktivaci T buněk.

Obecně lze tvrdit, že výsledky zmíněné zde ukazují, že kinázy rodiny Syk účinkují příměji na efektorový aparát T buněk než kinázy rodiny Src. Rostoucí počet důkazů ukazuje, že kinázy rodiny Src se mohou asociovat s mnoha molekulami na buněčném povrchu, které přitom nejsou členy žádné rodiny receptorů antigen/Fc včetně CD2 (Bell et al.,

Mol. Cell. Biol. 12: 5548-5554, 1992), CD23 (Sugie et al.

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88- 9132-9135, 1991), CD36 (Huang et al., J. Biol. Chem. 267: 5467-5473, 1992), beta řetězec

IL-2 (Hatakeyama et al., Science 252^: 1523-1528, 1991) a různé proteiny ukotvené fosfatidy1inositolem (Stefanova et al. , Science 254'- 1016-1019, 1991, Thomas a Samelson, J.

Biol. Chem. 267- 12317-12322, 1992). z nichž některé jsou známy tím, že vyžadují dodatečnou přítomnost antigenního receptoru k podpoře aktivace T buněk. Tento požadavek je možno jednoduše vysvětlit tím, že spouštěcí motivy na antigenním receptoru působí jako substráty pro kinázy rodiny

Src, čímž umožňují následné připojení kináz z rodiny Syk, následované zřejmě nějakými modifikujícími kroky, které podporují jejich aktivaci- Jelikož je těžké stanovit kauzální řetězec fosforylací a aktivací, je možné, že spouštěcí motivy hrají jenom přechodnou roli a účinkují jako určitý druh katalytického centra pro získání, aktivaci a uvolnění efektorových kináz.

·· ··· ·

Kinázy z rodiny Src jsou široce rozšířeny mezi různými typy buněk, které nejsou hematopoetického původu a současné studie na myších bez Fyn ukázaly na význam Fyn v udržení dlouhodobé potenciace, fenoménu usnadněného synaptického přenosu, který je považován za podklad počáteční konsolidace asociativní paměti (Grant et al., Science 258^:1903-1910, 1992). Kdyby podobné aktivační cesty zprostředkovávaly kinázy z rodiny Src v ostatních typech buněk, mohlo by se ukázat, že kinázy rodiny Syk jsou mnohem více rozšířeny v tělesných kompartměntěch mimo hematopoetický systém. Experimentální metody

Konstrukce chimér

Celá kódující oblast lidského genu pro kinázu Lek (Koga et al., Eur. J. Immunol. 16- 1643-1646, 1986), myšího

Fyn(T) (Cook and Perlmutter, New Biol. 1^: 66-74, 1989, prasečího Syk (Taniguchi et al., J. Biol. Chem- 266^:

15790-15796, 1991) a lidského ZAP-70 (Chán et al., Cell 71:

649-662, 1992) byla spojena s intracelulární doménou chimérického transmembránového proteinu, který se skládal z extracelulární domény CD16 spojené s krátkým stopkovým (stalk) segmentem a transmembránovou doménou CD7.

Intracelulární doména CD7 byla zkrácena ve transferové stopovací sekvenci přidáním místa pro restriktázu Mlu. Různé kinázy byly upraveny pomocí místa Mlu s vhodným čtecím rámcem tak, aby byla možná exprese trojitého fúzovaného proteinu. Prasečí sekvence Syk se získala reverzní transkripcí a provedením PCR celkové RNA z prasečích lymfocytů užitím primerů nesoucích vhodná restrikční místa.

• · ··· · • · · ··· ·· ·

Podobně byly získány sekvence ZAP-70 z cDNA knihovny lidských T buněk pomocí PCR. Několik izolátů bylo paralelně sekvencováno a kódující sekvence bez mutací pro každou kinázu byly odvozeny výměnou restrikčních fragmentů. Výsledné kódující sekvence byly vloženy do expresního vektoru z viru vakcínie po směru od CD16/CD7 sekvencí. Lidský Syk byl izolován z cDNA knihovny zabíječských (natural killer) buněk a z buněčné knihovny Daudi užitím primerů, které odpovídaly koncovým sekvencím prasečího Syk.

Sekvence forward primeru je atg gca gac agt gcc aac cac ttg ccc ttc ttc t (sekvence identifikačního čísla 73 a sekvence reverse primeru je cgc ggg gcg gcc gct tta att cac cac gtc gta gta gta (sekvence identifikačního čísla 8).

Po počáteční amplifikaci, která vedla ke vzniku pásu očekávané délky, byla provedena reamp1 ifikace (10 cyklů) s extenzním primerem na 5’ konci o složení cgc ggg acg cgt acc atg gca gac agt gcc aac (sekvence identifikačního čísla

9), což umožnilo, aby byl fragment vložen do vektoru naštěpeného Mlu,

Analýza mobilizace kalcia

Buňky exprimující rekombinantní kinázy byly analyzovány průtokovou cytometrií a spektrofotometrickou analýzou užitím fluoroforu Indo-1 citlivého ke kalciu, jak popsali (Romeo a Seed, Cell 64-1037-1046, 1991, Romeo et al , Cell 68:

889-897, 1992), Krátce, buňky mutantní subliníe JRT 3,T 3.5 linie Jurkat (Weiss a Stobo, J. Exp, Med. 160^: 1284-1299,

1984) byly infikovány rekombinantními viry vakcínie po dobu jedné hodiny v médiu IMDM bez séra desetinásobkem infekčního •9 999« • · 999 viru (moi = 10) a inkubovány po tri až devět hodin v IMDM,

10¾ FBS. Buňky byly sebrány centrifugací a resuspendovány v množství 3 x 10⁶/ml v kompletním médiu obsahujícím 1 mM Indo-1 acetometoxyester (Grynkievicz et al·, J. Biol. Chem. 260 - 3440-3450, 1985) (Molecular Probes, Eugene, OR) a inkubovány ve 37 °C po dobu 45 minut. Z buněk obsahujících . Indo-1 se vytvořila peleta a resuspendovala se v 1 x 10⁶/ml v séru bez IMDM a uložila se při teplotě místnosti v temnu.

V buňkách se analyzoval volný kalciový ion simultánním měřením fialové a modré fluorescenční emise průtokovou cytometrií (Rabínovitch et al.J. Immunol. 137: 952-961, 1986). Aby se inicioval tok kalcia, byla k buněčné suspenzi přidána buď nekonjugovaná 368 (anti-CD16) monoklonální protilátka (v koncentraci 1 pg/ml) následovaná fragmentem

F(ab’)2 kozího protimyšího IgG konjugovaného s fykoerytrinem (PE) o koncentraci 10 ng/ml v čase 0 nebo protilátka anti-CD4 konjugované s PE (Leu-3a, Becton Dickinson) a následovalo přidání druhé nekonjugované protilátky.

Z populace buněk obsahujících PE (infikovaných), které představují 40 až 80¾ všech buněk, byly sbírány histogramy poměru fialové/modré emise, Poměr fialově/modré emise před přidáním protilátky byl použit k normalizaci počátečního poměru a stanoven roven 1.

Test cytolýzy lymfocytů

Restriktivní cytolytické linie (VH3) buněk CD8⁺ CD4“

HLA B44 byla udržována v médiu IMDM s 10¾ lidského séra a 100 j./ml IL-2 a byla periodicky stimulována ozářenými (3000 rad) mononukleárními buňkami haplotypu HLA B44. Buňky byly pěstovány nejméně 10 dní po stimulaci před tím, než se použily pro test cytotoxicity. Buňky byly infikovány rekombinantní vakcínií nejméně desetinásobkem infekčního množství po jednu hodinu v médiu bez séra a následně byly buňky inkubovány v úplném médiu po tři hodiny. Buňky byly sbírány centrifúgací a resuspendovány na hustotu 1 x 10⁷/ml. 100 pl pak bylo přidáno do každé jamky mikrodestičky s dnem jamek tvaru U, přičemž jamky předem obsahovaly 100 pl úplného média. Buňky byly ředěny ve dvojnásobných sériových krocích. Dvě jamky pro každý vzorek neobsahovaly žádné lymfócyty, což umožnilo spontánní uvolnění chrómu a mohl být tak měřen celkový příjem chrómu.

Poměrná část 10⁶ cílových buněk 3G8 10-2 (Shen et al., Mol.

Immunol. 26- 959-969, 1989) byla centrifugována a pak resuspendována v 50 pl roztoku chromanu sodného s ⁵¹Cr (jeden mCi/ml, DuPont) a občasně míchána během hodinové inkubace ve 37 °C a pak byla třikrát opláchnuta v PBS. Do každé jamky bylo přidáno 100 pl označených buněk resuspendovaných v médiu na hustotu 10⁵/ml. Mikrotitrační destička byla stočena při 750 x g po jednu minutu a inkubována 4 hodiny při 37 °C. Na konci inkubačního období byly buňky v každé jamce jemným pipetováním resuspendovány, byl odebrán vzorek ke stanovení celkové inkorporované radioaktivity a destička byla znovu stočena při 750 x g jednu minutu. Odebraná poměrná část 100 μΐ supernatantu se měřila na přítomnost gama záření ve scinti lačním počítači.

Poměr efektorových a cílových buněk byl korigován podle procenta infikovaných efektorových buněk (obvykle > 70%).

·· ·

Vytvoření mutantních kinázových chimér

Fúzovaný protein neobsahující prasečí kinázu Syk se vytvořil štěpením chiméry pomocí Stul a Notl (místo Notl leží hned vedle 3’ karboxylového konce), doplněním místa Notl a vzájemným spojením konců. Výsledná sekvence spojuje prvních 298 zbytků prasečího Syk se 4 vnějšími zbytky (GPRL . před terminaci). Bodová mutace (K369G) ve vazebném místě pro ATP genu ZAP-70 byla vytvořena vložením dvojitého oligonukleotidového fragmentu mezi místa Balí a Earl, která leží mezi nukleotidy 1319 a 1345 vrchního řetězce sekvence popsané v Chán et al., Cell 71 = 649-662, 1992. Výsledná sekvence kóduje glycin v 369. poloze místo lysinu.

Imunoprecipitace a kinázový test

Přibližně 2 χ 10⁶ buněk HeLa S3 bylo infikováno jednu hodinu v médiu DME bez séra desetinásobným nadbytkem infekčního množství rekombinantní vakcínie- Buňky byly sebrány 5 hodin po infekci, opláchnuty 2 x v PBS a lyžovány v roztoku: 1% Triton X-100, 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES pH

7,3, 5 mM EDTA, 5 mM NaF, 0,2 mM Na3V&4, 10 pg/ml leupeptin, pg/ml aprotinin a 1 mM PMSF. Po desetiminutové inkubaci na ledu byla centrifugací odstraněna jádra a fúzované proteiny CD16 byly imunoprecipitovány protilátkou BMA 209/2 a sefarózou s proteinem A. Sefaróza s nachytaným fúzovaným proteinem byla třikrát propláchnuta lyzovacím pufrem a nakonec promyta 20 mM Hepes pH 7,3. Ke každému vzorku by1o přidáno 10 pl kinázového pufru (20 mM Hepes pH 7,3, 10 mM

MgCl2, 10 mM MnCl2) s deseti pCi lgama-³²Pl ATP O 3 000

Ci/mmol). Reakce se inkubovaly 10 minut při teplotě

místnosti a ukončily se přidáním 20 pl 2 x nanášecího pufru (4¾ SDS, 100 mM Tris. pH 6,8, 20¾ glycerol, 10¾ beta-merkaptoetáno1). Vzorky byly 3 minuty povařeny a pak byla poměrná množství nanesena na 4 až 15¾ gradientovy gel. Kinázové testy s rozpustným peptidem jako substrátem odpovídajícím polohám 6 až 20 z cdc2, ve kterém byl tyr 20 nahražen lysině·, byly provedeny podle doporučení výrobce (UBI).

Analýza fosforylace tyrosinu v proteinu pomocí imunoblotu

Buňky typu 3.5 bez TCR byly infikovány zásobním roztokem rekombinantního viru (desetinásobkem infekčního množství) po jednu hodinu. Pak byly buňky inkubovány v 37 °C po dobu 8 až 12 hodin, centrifugovány, promyty a resuspendovány v Iscoveho médiu bez séra na hustotu

10⁷ buněk/ml. Poměrná množství buněk byla inkubována s mAb anti-CD16 (3G8, Medarex nebo BMA209/2, Behrlngwerke) v množství 1 pg protilátky na 2 až 3 x 10⁶ buněk. Stimulované vzorky byly dále inkubovány s 3 až 5 násobným nadbytkem afinitně přečištěné protilátky protimyší IgGl (Southern Biotechnology) po dobu 5 minut. Dále byly buňky

Ošetřeny podle Secrist et al., J. Bioi. Chem. 268:

5886-5893, 1993, s drobnými modifikacemi. Inkubace byly ukončeny přidáním SDS na konečnou koncentraci 1¾ a vzorky byly 3 minuty povařeny. DNA byla roztrhána sonikací po dobu jedné minuty užitím Heat Systems Ultrasonics lne., byl přidán 2x nanášecí pufr a poměrná množství odpovídající 10⁵ až 2,5 x 105 b_uněk byla rozdělena na polyakrylamidovém gelu a proteiny byly přeneseny na nitrocelulózu (Schleicher

a Schuell BA45) polosuchým elektrobletováním (Hoefer).

Nitrocelulóžové filtry byly blokovány ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris s 0,05¾ Tween-20 (TBST) a 1,5¾ kuřecí vaječný albumin (Sigma), opláchnuty v TBST a přeneseny do roztoku obsahujícího protilátku 4G10 (UBI) proti fosfotyrosinu v ředění 1^:10 000 a inkubovány 1 až 2 _r hodiny ve 20 °C. Po několika promytích v TBST byly filtry inkubovány jednu hodinu v TBST a roztoku protimyší protilátky konjugované s křenovou peroxidázou v ředění 1=5 000. Pásy fosfory1ováných proteinů byly detekovány chemiluminiscencí (ECL, Amersham). Expoziční čas byl mezi sekundami a 5 minutami Konstrukce chimér spojujících proteintyrosinovou kinázu a lidský IgGl

Mohou být vytvořeny chimérické molekuly, které obsahují extracelulární doménu protilátky molekulově specifickou pro cílovou buňku a intracelulární doménu tyrosin-proteinkinázy (např. kinázy popisované zde). Aby se vytvořila taková molekula, jsou připraveny sekvence těžkého řetězce lidského

IgGl spojením sekvencí v doméně Ch3 s fragmentem cDNA odvozeným ze 3' konce transmembránové formy proti látkové mRNA. 3’ koncový fragment se získá polymerázovou řetězovou reakcí za použití tonzilární knihovny cDNA jako substrátu, a oligonukleotidů majících sekvence:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (sekvence identifikačního čísla 1) a

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT

GGG CCT CA (sekvence identifikačního čísla 2),

odpovídající koncům 5’ a 3* požadovaných fragmentů DNA. 5’ oligonukleotid je komplementární k místu v doméně ChI lidského IgGl a 3’ oligonukleotid je komplementární místu hned vedle 5’ sekvencí kódujících transmembránovou doménu.

Produkt PCR je štěpen BstXI a BamHI a vložen mezi BstXI a BamHI místa semisyntetického genu pro protilátku IgGl nesoucího variabilní a konstantní oblasti. Po vložení BstXI do fragmentu BamHI jsou amplifikované části konstruktu výměnou restrikčního fragmentu umístěny po směru k místu

Smál v Ch3, takže z reakce PCR se získává pouze část mezi místem Smál a 3’ oligonukleotidem.

Aby se vytvořil lidský chimérický receptor IgGl, je gen těžkého řetězce končící v místě BamHI spojen standardními technikami s intracelulární doménou požadované kinázy. Hladina exprese chimérického receptorů může být určována průtokovou cytometrií. Zvýšení v expresi může být dosaženo sooučasnou expresí plazmidu kódujícího cDNA lehkého řetězce proti látky.

Aby se vytvořila jednoduchá transkripční jednotka, která by umožnila oběma řetězcům, těžkému i lehkému, aby byly exprimovány z jednoho promotoru, vytvoří se plazraid kódující bícistronickou mRNA ze sekvencí kódujících těžký a lehký řetězec a z 5' nepřekládané části mRNA kódující protein o velikosti 78 kD regulovaný glukózou, jinak známý jako grp78 nebo BiP. Sekvence grp78 se získají metodou PCR z lidské genomové DNA za použití primerů o sekvencích CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (sekvence identifikačního čísla 3) a

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (sekvence identifikačního čísla 4) na koncích 5' a 3'. Polymerázové řetězové reakce s těmito o1 igonuk1eotidy se provádějí v přítomností 10¾ dimetylsulfoxidu. Fragment získaný PCR je štěpen Notl a HincII a vložen mezi místa Notl a Hpal po směru od , sekvence kódující lidský IgGl- Sekvence kódující cDNA lehkého řetězce kappa lidského IgG jsou poté vloženy po směru od zaváděcí sekvence (leader) grp78 za použití místa

HincII a dalšího místa ve vektoru. Expresní plazmid, který je výsledkem těchto manipulací se skládá z genu semisyntetického těžkého řetězce, následovaného zaváděcími sekvencemi grp78, následováno sekvencemi cDNA lehkého řetězce kappa, následováno polyadenylačními signály získanými z fragmentu DNA SV40. Již dříve jsme ukázali, že transfekce buněk COS tímto expresním plazmídem vedla k výrazně zvýšené expresi determinant těžkých řetězců ve srovnání s transfekci plazmidem kódujícím samotné determinanty těžkých řetězcůAby se vytvořil bicistronický gen obsahující chiméru těžký retězec/receptor a lehký řetězec, protisměrné sekvence těžkého řetězce se mohou nahradit jakýmkoliv genem chiméry těžký řetězec/receptor popsaným zde.

Jakmile jsou jednou zkonstruovány, chiméry

IgG-tyrosinkinázy se mohou klonovat do expresního vektoru, zavést do hostitelské buňky a testovat kterýmkoliv z testů popsaným zde (např. iraobilizací kalcia nebo cytolytickým testem).

Konstrukce chimér CD4-tyrosinkináza

Lze vytvořit chimérické molekuly, které obsahují extřačelulámi doménu molekuly CD4 a intracelulární doménu tyrosin-proteinkinázy (např. těch kináz popsaných zde). Pro vytvoření takové molekuly je sekvence kódující tyrosinkinázu (např. cDNA) izolována (např- jak je popsáno výše). Tato sekvence je pak spojena s extřačelulámi doménou upravené formy CD4, která má místo BamHI právě proti směru od domény procházející membránou, standardními technikami (Aruffo et al- Proč- Nati. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577, 1987.

Zettlmeissl et al. DNA Cell. Biol. 9- 347-353, 1990). Aby se vytvořil fúzovaný protein, místo BamHI se může vložit do sekvence ve vhodné pozici (opět standardními technikami).

Fúzované geny jsou zavedeny do expresního plazmidu viru vakcínie (jak je popsáno zde), a vloženy do genomu kmene WR vakcínie homologní rekombinací a selekcí na růst v mykofenolové kyselině (Falkner et al., J. Virol. 62:

1849-1854, 1988, Boyie et al., Gene 65- 123-128, 1988).

K ověření exprese fúzovaných proteinů CD4/tyrosinkináza rekombinantní vakcínie na buněčném povrchu je potom užita průtoková cytometrie. Imunoprecipitace buněk infikovaných rekombinantami vakcínie se užívá k potvrzení výsledků (jak je popsáno výše).

Účinnost chimér CD4 se může testovat kterýmkoliv testem mobilizace kalcia nebo cytolýzy popsanými zde. V jednom zvláštním příkladu je vytvořen modelový systém cíl:efektor založený na rozpoznání obalového komplexu gpl20/gp41 HIV receptorem CD4. HeLa buňky jsou infikovány rekombinantním ·· ··· ·

virem vakcíníe exprimujícím gpl20/gp41 (Chakrabarti et al-,

Nátuře 320: 535-537, 1986, Earl et al. J. Virol. 64:

2448-2451, 1990) a značeny ⁵¹Cr. Označené buňky jsou inkubovány s buňkami z linií lidských alospecifických (CD8⁺CD4) cytotoxickýeh T lymfocytů, které byly infikovány rekombinantami vakcínie exprimujícími chiméru ,

CD4-tyrosinkináza, a pak testovány na specifickou lýzi Aby se ověřila možnost, že infekce vakcínií může podporovat rozpoznávání CTL, podobné cytolytické pokusy se provádějí s cílovými buňkami infikovanými rekombinantami vakcínie exprimujícími formu CD16 spojenou s fosfatidylinositoiem (CD16pi) a značenými ⁵¹Cr, a s CTL infikovanými kontrolními rekombinantami, které exprimují chiméry CD16.

V jiném příkladu jsou neutrofilní granulocyty, které mají v oběhu velmi krátkou dobu života (asi 4 hodiny) a jsou silně cytolytické, atraktivními buňkami pro expresi chimér CD4-tyrosinkináza. Infekce neutrofilů HIV pravděpodobně nepovede k uvolnění viru a nadbytek těchto buněk (nejpočetnější skupina leukocytů) by měl umožnit obranu hostitele- Jinou atraktivní možností pro hostitelské buňky jsou zralé T buňky, což je populace v současnosti přístupná genové manipulaci retrovirovem (Rosenberg, Sc i - Am. 26262-69, 1990). Pomocí rekombinantního IL-2 může být populace

T buněk rozmnožena v kultuře relativně snadno a taková pomnožená populace má typicky omezenou dobu života po opětné infuzi (Rosenberg et al. N- Engl. J- Med- 323: 570-578,

1990).

• · · · · · »· · · • · »· ·

Za odpovídajících podmínek rozpoznávání HIV buňkami exprimujícími chiméry CD4 by mélo také poskytovat mitogenní stimul dovolující možnost, aby vybavená buněčná populace dynamicky odpovídala virové zátěži. Ačkoliv jsme se zde zaměřili na chování fúzovaných proteinů v cytolytických T lymfocytech, exprese chimér v poraahačských lymfocytech by mohla poskytnout HlVem mobilizovaný zdroj cytokinů, který by působil proti kolapsu subpopulace pomahačských buněk při AIDS. Současný popis několika schémat pro genetické manipulování rezistence k infekci v krocích jiných než je penetrace viru (Friedman et al., Nátuře 335^:452-454, 1988,

Green et al., Cell 58: 215-223. 1989, Malim et al., Cell 58:

205-214, 1989, Trono et al., Cell 59: 113-120, 1989,

Buonocore et al., Nátuře 345^; 625-628, 1990) předpokládá, že buňky nesoucí chiméry CD4 by byly upraveny tak, aby zastavily produkci viru tím, že by exprimovaly vhodné agens s intracelulárním místem úČinku.

Schopnost přenášet signály T lymfocytům prostřednictvím autonomních chimér také poskytuje možnost regulovat lymfocyty genově manipulované retrovirem in vivo. Vazebné stimuly zprostředkované např. specifickými protilátkami IgM upravenými tak, že odstraní domény vážící komplement, umožní takovým lymfocytům zvýšit jejich počet in šitu, zatímco ošetření podobnými specifickými protilátkami IgG (např.

rozpoznávající variaci aminokyselin vloženou genovými manipulacemi do chimérického řetězce) by mohl selektivně likvidovat manipulovanou populaci. Už dříve jsme stanovili, že protilátky IgM anti-CD4 nevyžadují dodatečné obsazení

vazeb k tomu, aby mobilizovaly kalcium v buňkách Jurkat exprimujících chiméry CD4:zeta. Možnost regulovat buněčné populace, aniž by se musely opakovaně množit mimo tělo, podstatně rozšíří rozsah a účinnost současného využití geneticky upravených T buněk.

Kombinační kontrola kinázových chimér a chimérických .

receptorfl CD28

Prflkaz toho, že některé kinázové chiméry (jako např.

ZAP-70 a kinázové chiméry rodiny Src) mohou fungovat jenom ve vzájemném souladu, aby řídily cytolytickou likvidaci, poskytuje příležitost řídit cytolytickou odpověď tím, že se použijí vhodné páry kinázových chimér. Tento přístup je zvláště výhodný v oblasti protinádorových terapií, protože extracelulární domény chimérických párfl mohou být upraveny tak, aby rozpoznaly a vázaly mnohonásobné determinanty na povrchu nádorových buněk. Jedině po navázání každé z mnohonásobných determinant (tedy poté, co jsou zahrnuty např. ZAP-70 a kinázy z rodiny Src) je ovlivněna silná cytolytické odpověď. Tento přístup zvyšuje terapeutickou specifičnost tím, že snižuje pravěpodobnost a frekvenci destrukce buněk jiných než nádorových.

V jednom zvláštním případu dvojice chimér obsahuje dvě rflzné extracelulární domény, z nichž každá rozpoznává určitou antigenní charakteristiku cílového nádoru. Taková dvojice chimér rozpoznává dvě nepříbuzné molekuly na povrchu nádoru (např. dva odlišné proteinové markéry na buněčném povrchu), nebo dvojice rozpoznává dvě odlišné vlastnosti téže molekuly (např. antigenní protein a antigenní sacharid • · · · • · ·· ·

Le*

CD40, sialyl-Le^y, antigen, antigeny T a Tn.

asociovaný s týmž proteinem na buněčném povrchu). Příklady nádorových antigenů zahrnují bez omezení kterýkoliv z mnohých sacharidů (např. Le^y.

a sialyl-Le*), karcinomeiabryonický modifikovaný CD44, alfa-fetoprotein, tenascin, a receptory růstového faktoru (např. HER2/neu).

Navíc, protože bylo ukázáno, že aktivace T buněk je zvýšena při zapojení CD28, vynález také zahrnuje terapeutické buňky exprimujicí sady chimérických receptorů, z nichž jeden zahrnuje intračelulámí doménu CD28 a další (nebo více) obsahuje kteroukoliv intračelulámí doménu tyrosin-proteinkináz popsaných zde. V daném souboru chimérických receptorů mohou být extraceiulámí domény shodné (např- všechny jsou odvozeny z proteinu CD4 a tudíž všechny rozpoznávají HIV nebo buňky infikované HIV) nebo, jak bylo diskutováno výše, každá je navržena tak, aby rozpoznala odlišnou cílovou molekulu na povrchu buňky nebo patogenu.

Tato metoda kombinované kontroly může být rozšířena na jakýkoliv počet spolupracujících chimérických receptorů (např. může být užita v kombinaci se ZAP-70 a chimérami rodiny Src nebo může být užita kombinace CD28, chiméry

ZAP-70 a chiméry z rodiny kináz Src, což umožní další kombinovanou kontrolu)- Navíc se toto dá využít k regulaci kterékoliv léčebného způsobu předkládaného vynálezu.

Chiméry CD28 jsou konstruovány a exprimovány způsobem popsaných zde. Sekvence CD28 je z Aruffo a Seed (Proč. Nati.

Acad. Sci. USA 84:8573-8577, 1987). V tomto odkazu je také • · · · · ·

·· · popis intracelulárních a transmembránových domén CD28. Příklad chiméry nesoucí intracelulární doménu CD28 je vyjeven v Romeo et al- (Cold Spring Harbor Symp. on Quant.

Biol. LVU = 117-125, 1992).

Další ztělesnění

Aby se vytvořily další chiméry obsahující . intracelulární sekvence proteinkináz, mohou se opatřit restrikčním místem v pozici právě před vybranou extracelulární doménou sekvence cDNA nebo genomové sekvence kódující extracelulární doménu receptoru. Fragment extracelulární domény zakončený v restrikčním místě pak může být připojen k sekvencím proteinkinázy. Typické extracelulární domény se mohou odvodit z receptorů, které rozpoznávají komplement, sacharidy, virové proteiny, bakterie, prvoky a vícebuněčné parazity nebo jimi indukované proteiny. Podobně se mohou připojit k sekvencím proteinkináz ligandy nebo receptory exprimované patogeny nebo nádorovými buňkami, což nasměruje imunitní odpovědi proti buňkám nesoucím receptory rozpoznávající tyto ligandy. Aby se identifikovaly nejmenší sekvence proteinkinázy nezbytné pro cytolýzu, připraví se série delečních mutant standardními technikami, ve kterých je postupně větší část intracelulární kinázové domény odstraněna. Účinnost takových delečních mutant je pak testována v jakémkoliv z testů popsaných zde.

Užitečné intracelulární domény proteinkinázy Syk zahrnují například aminokyseliny 336 až 628 ze sekvence prasečího Syk a aminokyseliny 338 až 630 z lidské sekvence Syk. Užitečné intracelulární domény kináz z rodiny Src jsou například ·· ··· · • · · · · 9

9 9 ···« · · · • · · · · · » • · · · 999999

9 9 9 9 9

999 9999 999 9999 99 9 domény SH2 a SH3Ačkoliv byl vynález popsán ve spojení se specifickými ztělesněními, rozumí se samosebou, že může být dále modifikován a tato přihláška zamýšlí pokrýt také odlišnosti, různá využití nebo adaptace vynálezu a zahrnuje také takové odchylky od současného objevu, jak přicházejí v oboru, kterého se vynález týká a jak mohou být aplikovány na podstatné charakteristické rysy výše uvedené, jak následuje v rámci připojených patentových nároků.

Průmyslová využitelnost

Tyrosin-proteinkinázové chiméry podle předkládaného vynálezu jsou schopny modulovat funkci imunitního systému, takže je možné specificky rozpoznávat a likvidovat buňky infikované infekčním agens, infekční agens samotné, nádorovou buňku nebo také buňku vzniklou autoimunitním procesem (autoimunní buňku). Dále jsou tyto chiméry schopny nasměrovat cytotoxické T lymfocyty tak, aby specificky rozpoznávaly a lyžovaly buňky exprimující obalové proteiny

HIV. Vynález proto poskytuje novou protinádorovou léčbu, a také léčbu nemocí, jako je AIDS (syndrom získaného deficitu imunity), způsobovaný virem HIV.

·· ·· ···· • · · · • t · · • · + ·· ♦ • · ·

SEZNAM SEKVENCÍ (1, GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT: Brian Seed

Charles Romeo Waldemar Kolanus (ii) TITLE OF INVENTION: REDIRECTION OF CELLULAR IMMUNITY BY

PROTEIN-TYROSINE KINASE CHIMERAS (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 9 {iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:

(A) ADDRESSEE: Fish £ Richardson P.C
(B)	STREET:	225 Franklin Street
(C)	CITY:	Boston
(D)	STATE:	Massachusetts
(E)	COUNTRY:	U.S.A.
(F)	ZIP:	02110-2804

(v) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: 3.5” Diskette, 1.44 Mb (B) COMPUTER: IBM PS/2 Model 50Z or 55SX (C) OPERATING SYSTEM: MS-DOS (Version 5.0) (D) SOFTWARE: WordPerfect (Version 5.1) (vi) CURRENT APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: PCT/US96/----(B) FILING DÁTE:

(vii) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: 08/394,177 (B) FILING DÁTE: February 24, 1995 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:

(A) NAME: Karen F. Lech, Ph.D.

(B) REGISTRATION NUMBER: 35,238 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 00786/271001 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:

(A) TEKEPHONE: (617) 542-5070 (B) TELEFAX: (617) 542-8906 (C) TELEX: 200154 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 1= (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 (B) TYP: nukleová kyselina <C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 1=

Ύ?

• •φφ

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 2=

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 3:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 33 ( B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE’· SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 4·

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 5:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 630 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: N/A (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 5=

Met Ala Asp Ser Ala Asn His Leu Pro Phe Phe Phe Gly His Ile Thr 15 10 15

Arg Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Leu Val Gin Gly Gly Met Ser Asp Gly 20 25 30 • · · · · ·

Leu

Tyr

Leu

Leu

Arg

Gin

Ser

Arg

Asn

Tyr

Leu

Gly

Gly

Phe

Ala

Leu

35

40

45

Ser

Val

Ala

His

Gly

Arg

Lys

Ala

His

Asn

Tyr

Thr

Ile

Glu

Arg

Glu

50

55

60

Leu

Asn

Gly

Thr

Tyr

Ala

Ile

Ala

Gly

Gly

Arg

Thr

His

Ala

Ser

Pro

65

70

75

80

Ala

Asp

Leu

Cys

Asn

Tyr

His

Ser

Gin

Glu

Ser

Asp

Gly

Leu

Val

Cys

85

90

95

Leu

Leu

Lys

Lys

Pro

Phe

Asn

Arg

Pro

Gin

Gly

Val

Gin

Pro

Lys

Thr

100

105

110

Gly

Pro

Phe

Glu

Asp

Leu

Lys

Glu

Asn

Leu

Ile

Arg

Glu

Tyr

Val

Lys

115

120

125

Gin

Thr

Met

Asn

Leu

Gin

Gly

Gin

Ala

Leu

Glu

Gin

Ala

Ile

Ile

Ser

130

135

140

Gin

Lys

Pro

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Ile

Ala

Thr

Thr

Ala

His

Glu

Lys

145

150

155

160

Met

Pro

Trp

Phe

His

Gly

Lys

Ile

Ser

Arg

Glu

Ile

Ser

Thr

Gin

Ile

165

170

175

Val

Leu

Ile

Gly

Ser

Lys

Thr

Asn

Gly

Lys

Phe

Leu

Ile

Arg

Ala

Arg

180

185

190

Asp

Asn

Asn

Gly

Ser

Tyr

Ala

Leu

Cys

Leu

Leu

His

Ile

Gly

Lys

Val

195

200

205

Leu

His

Tyr

Arg

Ile

Asp Lys

Asp

Lys

Thr

Gly

Lys

Leu

Ser

Ile

Pro

210

215

220

Glu

Gly

Lys

Lys

Phe

Asp

Thr

Leu

Trp

Gin

Leu

Val

Glu

His

Tyr

Ser

225

230

235

240

Tyr

Lys

Ala

Asp

Gly

Leu

Leu

Arg

Val

Leu

Thr

Val

Pro

Cys

Gin

Lys

245

250

255

Ile

Gly

Thr

Gin

Gly

Asn

Val

Asn

Phe

Gly

Gly

Arg

Pro

Gin

Leu

Phe

260

265

270

Gly

Ser

His

Pro

Ala

Thr

His

Ser

Ala

Gly

Gly

Ile

Ile

Ser

Arg

Ile

275

280

285

Lys

Ser

Tyr

Ser

Phe

Pro

Lys

Pro

Gly

His

Arg

Lys

Ser

Ser

Pro

Ala

290

295

300

Gin

Gly

Asn

Arg

Gin

Glu

Ser

Thr

Val

Ser

Phe

Asn

Phe

Tyr

Glu

Pro

305

310

315

320

Glu

Leu

Ala

Pro

His

Ala

Ala

Asp

Lys

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile

Ala

Leu

325

330

335

Pro

Met

Asp

Thr

Glu

Val

Tyr

Glu

Ser

Pro

Tyr

Ala

Asp

Pro

Glu

Glu

340

345

350

Ile

Arg

Pro

Lys

Glu

Val

Tyr

Leu

Asp

Arg

Lys

Leu

Leu

Thr

Leu

Glu

355

360

365

Asp

Lys

Glu

Leu

Gly

Ser

Gly

Asn

Phe

Gly

Thr

Val

Lys

Lys

Gly

Tyr

370

375

380

Tyr

Gin

Met

Lys

Lys

Val

Val

Lys

Thr

Val

Ala

Val

Lys

Ile

Leu

Lys

385

390

395

400

Asn

Glu

Ala

Asn

Asp

Pro

Ala

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu

Leu

Ala

Glu

Ala

405

410

415

Asn

Val

Met

Gin

Gin

Leu

Asp

Asn

Pro

Tyr

Ile

Val

Arg

Met

Ile

Gly

420

425

430

Ile

Cys

Glu

Ala

Glu

Ser

Trp

Met

Leu

Val

Met

Glu

Met

Ala

Glu

Leu

435

440

445

Gly

Pro

Leu

Asn

Lys

Tyr

Leu

Gin

Gin

Asn

Arg

His

Val

Lys

Leu

Lys

450

455

460

Asn

Ile

Ile

Glu

Leu

Val

His

Gin

Val

Ser

Met

Gly

Met

Lys

Tyr

Leu

465

470

475

480

Glu

Glu

Ser

Asn

Phe

Val

His

Arg

Asp

Leu

Ala

Ala

Arg

Asn

Val

Leu

485

490

495

Leu

Val

Thr

Gin

His

Tyr

Ala

Lys

Ile

Ser

Asp

Phe

Gly

Leu

Ser

Lys

500

505

510

Ala

Leu

Arg

Ala

Asp

Glu

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Ala

Gin

Thr

His

Gly

Lys

λ

Trp

Pro 530

Val

Lys

Trp

Tyr

Ala 535

Pro

Glu

Cys

Ile

Asn 540

Tyr

Tyr

Lys

Phe

Ser 545

Ser

Lys

Ser

Asp

Val 550

His

Ser

Phe

Gly

Val 555

Leu

Met

Asn

Glu

Ala 560

Phe

Ser

Tyr

Gly

Gin 565

Lys

Phe

Tyr

Arg

Gly 570

Met

Lys

Gly

Ser

Glu 575

Val

Ile

Ala

Met

Leu 560

Glu

Lys

Gly

Glu

Arg 585

Met

Gly

Cys

.Pro

Ala 590

Gin

Cys

Pro

Arg

Glu 595

Met

Tyr

Asp

Leu

Met 600

Asn

Leu

Cys

Trp

Thr 605

Tyr

Asp

Val

Glu Tyr 625

Asn 610 Tyr

Arg Asp

Pro Val

Gly Val

Phe Asn 630

Ala 615

Ala

Val

Glu

Leu

Arg 620

Leu

Arg

Asn

Tyr

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 6= (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA* 628 (B) TYP·' aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: N/A i D) TOPOLOGIE * 1 i neární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 6:

Met 1

Ala

Asp

Ser

Ala 5

Asn

His

Leu

Pro

Phe 10

Phe

Phe

Gly

Gin

Ile 15

Thr

Arg

Glu

Glu

Ala 20

Glu

Asp

Tyr

Leu

Val 25

Gin

Gly

Gly

Met

Ser 30

Asp Gly

Leu

Tyr

Leu 35

Leu

Arg

Gin

Ser

Arg 40

Asn

Tyr

Leu

Gly

Gly 45

Phe

Ala

Leu

Ser

Val 50

Ala

Tyr

Asp

Arg

Lys 55

Ala

His

His

Tyr

Thr 60

Ile

Glu

Arg

Glu

Leu 65

Asn

Gly

Thr

Tyr

Ala 70

Ile

Ser

Gly

Gly

Arg 75

Thr

His

Gly

Ser

Pro 80

Ala

Glu

Leu

Cys

His 85

Tyr

His

Ser

Gin

Glu 90

Leu

Asp

Gly

Leu

Val 95

Cys

Leu

Leu

Lys

Asn 100

Pro

Phe

Asn

Arg

Pro 105

Pro

Gly

Val

Gin

Pro 110

Lys

Thr

Gly

Pro

Phe 115

Glu

Asp

Leu

Lys

Glu 120

Asn

Leu

Ile

Arg

Glu 125

Tyr

Val

Lys

Gin

Thr 130

His

Asn

Leu

Gin

Gly 135

Gin

Ala

Leu

Glu

Gin 140

Ala

Ile

Ile

Ser

Gin 145

Lys

Pro

Gin

Leu

Glu 150

Lys

Leu

Ile

Ala

Thr 155

Thr

Ala

His

Glu

Lys 160

Met

Pro

Trp

Phe

His 165

Gly

Lys

Ile

Ser

Arg 170

Asp

Glu

Ser

Glu

Gin 175

Ile

Val

Leu

Ile

Gly 180

Ser

Lys

Ile

Asn

Gly 185

Lys

Phe

Leu

Ile

Arg 190

Ala

Arg

Asp

Met

Gly 195

Ser

Tyr

Ala

Leu

Gly 200

Leu

Leu

His

Ile

Gly 205

Lys

Val

Leu

Met

Tyr 210

Arg

Ile

Asp

Lys

Asp 215

Lys

Thr

Gly

Lys

Leu 220

Ser

Ile

Pro

Gly

Gly 225

Lys

Asn

Phe

Asp

Thr 230

Leu

Trp

Gin

Leu

Val 235

Glu

Lys

Tyr

Ser

Tyr 240

Lys

Ser

Asp

Gly

Leu 245

Leu

Arg

Val

Leu

Thr 250

Val

Pro

Cys

Gin

Lys 255

Ile

Gly

Gly

Gin

Thr 260

Gly

Asn

Asp

Ser

Phe 265

Arg

Pro

Gin

Leu

Phe 270

Ser

Ala

His

Ser

Ala 275

Thr

Trp

Ser

Ala

Gly 280

Gly

Ile

Ile

Ser

Arg 285

Ile

Lys

Ser

1-¾ ·· ·· » · · «

I · · · • · « · · ’ • · ¹ ft ···· ··

Sl-ůX

Tyr Ser Phe Pro Lys 290

Pro Gly His Arg Lys Ala Ser Ser Pro

Gin

Gly

295

300

•

Asn

Arg

Pro

Glu

Ser

Leu

Val

Ser

Tyr

Asn

Phe

Tyr

Glu

Ser

Asp

Arg

305

310

315

320

Gly

Phe

Trp

Ala

Asn

Glu

Arg

Glu

Ala

Gin

Arg

Glu

Ala

Leu

Pro

Met

325

330

335

Asp

Thr

Glu

Val

Val

Glu

Ser

Pro

Tyr

Ala

Asp

Pro

Glu

Glu

Ile

Arg

340

345

350

Pro

Lys

Glu

Val

Tyr

Leu

Asp

Arg

Lys

Leu

Leu

Thr

Leu

Glu

Asp

Lys

355

360

365

Glu

Leu

Gly

Ser

Gly

Asn

Phe

Gly

Thr

Val

Lys

Lys

Gly

Tyr

Tyr

Gin

370

375

380

-

Met

Lys

Lys

Val

Val

Lys

Thr

Val

Ala

Val

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Glu

385

390

395

400

Ala

Asn

Asp

Pro

Ala

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu

Leu

Ala

Glu

Ala

Asn

Val

405

410

415

•

Met

Gin

Gin

Leu

Asp

Asn

Pro

Tyr

Ile

Val

Arg

Met

Ile

Gly

Ile

Cys

420

425

430

Glu

Ala

Ser

Ser

Trp

Met

Leu

Val

Met

Glu

Met

Ala

Glu

Leu

Gly

Pro

435

440

445

Leu

Asn

Lys

Tyr

Leu

Gin

Gin

Asn

Arg

His

Val

Lys

Asp

Lys

Asn

Ile

450

455

460

Ile

Glu

Leu

Val

His

Gin

Val

Ser

Met

Gly

Met

Lys

Tyr

Leu

Glu

Glu

465

470

475

480

Cys

Asn

Pro

Val

His

Arg

Asp

Leu

Ala

Ala

Arg

Asn

Val

Leu

Leu

Val

485

490

495

Thr

Gin

His

Tyr

Ala

Lys

Ile

Ser

Asp

Phe

Gly

Leu

Ser

Lys

Ala

Leu

500

505

510

Arg

Ala

Asp

Glu

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Ala

Gin

Thr

His

Gly

Lys

Trp

Pro

515

520

525

Val

Lys

Trp

Tyr

Ala

Pro

Glu

Cys

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Phe

Ser

Ser

*

530

535

540

Lys

Ser

Asp

Val

Asn

Ser

Phe

Gly

Val

Leu

Met

Trp

Glu

Ala

Phe

Ser

545

550

555

560

Tyr

Gly

Gin

Lys

Phe

Tyr

Arg

Gly

Met

Lys

Gly

Ser

Glu

Val

Ser

Ala

565

570

575

Met

Leu

Glu

Lys

Gly

Glu

Arg

Met

Gly

Cys

Phe

Phe

Gly

Cys

Phe

Arg

580

585

590

Glu

Met

Tyr

Glu

Leu

Asn

Thr

Leu

Cys

Asn

Thr

Tyr

Asp

Val

Glu

Asn

595

600

605

Arg

Pro

Gly

Phe

Val

Ala

Val

Glu

Leu

Arg

Leu

Arg

Asn

Tyr

Tyr

Tyr

610

615

620

Asp

Val

Val

Asn

625 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 7(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineérní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 7ATGGCAGACA GTGCCAACCA CTTGCCCTTC TTCT 34 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

···· (A) DÉLKA- 39 <B) TYP^; nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 8:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAAT TCACCACGTC GTAGTAGTA 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 9= (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 (B) TYP= nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA’· jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 9=

CGCGGGACGC GTACCATGGC AGACAGTGCC AAC 33

Claims (35)

1. Způsob nasměrování buněčné imunitní odpovědi u savce vyznačující se tím, že obsahuje podávání účinného množství terapeutických buněk savci, terapeutické buňky exprimuji proteinový chimérický receptor vázaný na membránu, který se skládá:

a) z intracelulární částí tyrosin-proteinkínázy, která je schopna předat- terapeutické buňce signál k likvidaci cílové buňky vázané na receptor, nebo cílového infekčního agens vázaného na receptor a

b) z extracelulárňí části schopné specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, čímž je každá z terapeutických buněk schopna specificky rozpoznat a zlikvidovat cílovou buňku nebo cílové infekční agens.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že cílová buňka je hostitelská buňka infikovaná infekčním agens. nádorová nebo rakovinná buňka nebo buňka vzniklá autoimunitním mechanismem.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že tyrosin-proteinkináza je člen rodiny kináz Syk.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že tyrosin-proteinkináza je Syk.

····

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že intracelulární část obsahuje aminokyseliny 336 až

628 lidského Syk nebo aminokyseliny 338 až 630 prasečího

Syk.

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že každá terapeutická buňka exprimuje druhý proteinový chimérický receptor vázaný na membránu, přičemž druhý chimérický receptor obsahuje

a) intracelulární část druhé tyrosin-proteinkinázy, která je schopna předat terapeutické buňce signál k likvidaci cílové buňky vázané na receptor, nebo cílového infekčního agens vázaného na receptor a

b) extracelulární část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, čímž je každá z terapeutických buněk schopna specificky rozpoznat a zlikvidovat cílovou buňku nebo cílové infekční agens.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m, že jedna z tyrosin-proteinkináz je členem rodiny kináz Syk a druhá tyrosin-proteinkináza je členem rodiny kináz Src.

8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že jedna z tyrosin-proteinkináz je ZAP-70 a druhá tyrosin-proteinkináza je Fyn.

·· ····

9. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že jedna z tyrosin-proteinkináz je ZAP-70 a druhá tyrosin-proteinkináza je Lek.

10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že část ZAP-70 obsahuje Tyr v poloze 369 lidského ZAP-70.

11. Způsob podle nároku 1 nebo 6, vyznačující se tím, že buněčná odpověď je nezávislá na MHC (hlavní histokompatibilni systém).

12. Způsob podle nároku 1 nebo 6, vyznačující se tím, že terapeutické buňky jsou vybrány ze skupiny obsahující ^:

a) T lymfocyty

b) cytotoxické T lymfocyty

c) zabíječské buňky (natural killer)

d) neutrofily

e) granulocyty

f) makrofágy

g) žírné buňky

h) buňky HeLa a

i) embryonálni kmenové buňky (ES).

13- Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že cílové infekční agens je virus deficitu imunity.

·· ····

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že extracelulární část obsahuje část CD4, která váže obal HIV.

15. Způsob podle nároku 1 nebo 6, vyznačující se tím, že terapeutické buňky dále exprimují proteinový chimérický receptor vázaný na membránu a obsahující

a) extracelulární část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens

b) intracelulární část, která je odvozena z CD2816. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že terapeutické buňky likvidují cílovou buňku nebo cílové infekční agens vázané na receptor cytolýzou.

17. Buňka vyznačující se tím, že exprimuje proteinový chimérický receptor vázaný na membránu a obsahující

a) intracelulární část tyrosin-proteinkinázy, která je schopna předat terapeutické buňce signál k likvidaci cílové buňky vázané na receptor, nebo cílového infekčního agens vázaného na receptor a

b) extracelulární část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, čímž je každá z terapeutických buněk schopna specificky rozpoznat a zlikvidovat cílovou buňku nebo cílové infekční agens.

····

18. Buňka podle nároku 17, vyznačující se t í m, že tyrosin-proteinkináza je člen rodiny kináz Syk.

19. Buňka podle nároku 18, vyznačující se tím, že tyrosin-proteinkináza je Syk.

20. Buňka podle nároku 19, vyznačující se t i m, že intracélulární část obsahuje aminokyseliny 336 až 628 1idského Syk nebo aminokyseliny 338 až 630 prasečího Syk.

21. Buňka podle nároku 17, vyznačující se tím, že každá terapeutická buňka exprimuje druhý proteinový chimérický receptor vázaný na membránu, přičemž druhý chimérický receptor obsahuje

a) intracélulární část druhé tyrosin-proteinkinázy, která je schopna předat terapeutické buňce signál k likvidaci cílové buňky vázané na receptor, nebo infekčního agens vázaného na receptor a

b) extracelulární část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, čímž je každá z terapeutických buněk schopna specificky rozpoznat a zlikvidovat cílovou buňku nebo cílové infekční agens

22. Buňka podle nároku 21, vyznačující se tím, že jedna z tyrosin-proteinkináz je členem rodiny kináz Syk a druhá tyrosin-proteinkináza je členem rodiny kináz Src.

····

23. Buňka podle nároku 21, vyznačující se tím, že jedna z tyrosin-proteinkináz je ZAP-70 a druhá tyrosin-proteinkináza je Fyn.

24. Buňka podle nároku 21, vyznačující se tím, že jedna z tyrosin-proteinkináz je ZAP-70 a druhá .

tyrosin-proteinkináza je Lck

25. Buňka podle se tím, že lidského ZAP-70.

nároku 23 nebo 24, vyznačující část ZAP-70 obsahuje Tyr v poloze 369

26. Buňka podle nároku 17 nebo 21, vyznaču j i c i se tím, že terapeutické buňky jsou vybrány ze skupiny obsahující ^:

a) T lymfocyty

b) cytotoxické T lymfocyty

c) zabíječské buňky (natural killer)

d) neutrofily

e) granulocyty

f) makrofágy

g) žírné buňky

h) buňky HeLa a

i) embryonální kmenové buňky (ES).

27. Buňka podle nároku 17, vyznačující tím, že cílové infekční agens je virus deficitu imunity.

····

28- Buňka podle nároku 27, vyznačující se tím, že extřačelulámi část obsahuje část CD4, která váže obal HIV.

29. Buňka podle nároku 17 nebo 21, vyznačuj í c i se tím, že terapeutické buňky dále exprimuji proteinový chimérický receptor vázaný na membránu a obsahující

a) extřačelulámi část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens a

b) intracelulární část, která je odvozena z CD2830. Buňka podle nároku 17, vyznačující se tím, že terapeutické buňky likvidují cílovou buňku nebo cílové infekční agens vázané na receptor cytolýzou.

31. Buňka podle nároku 17 nebo 21,vyznačuj ící se tím, že vazba na receptor je nezávislá na MHC (hlavní histokompatibilni systém).

32. Buňka podle nároku 17 nebo 21,vyznačuj ící se tím, že extřačelulámi část obsahuje část receptoru vážící ligand, část ligandu vážící receptor, část protilátky vážící antigen nebo jejich funkční deriváty.

33. Buňka vyznačující se tím, že exprimuje proteinový chimérický receptor vázaný na membránu a obsahující

a) intracelulární část tyrosin-proteinkinázy a ···· ······· ·

b) extracelulámí část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens.

34. Buňka podle nároku 33, vyznačující se tím, že tyrosin-proteinkináza je vybrána z členů rodiny

Syk.

35. Buňka podle nároku 33, vyznačující se tím, že tyrosin-proteinkináza je vybrána z členů rodiny

Src.

36. Buňka podle nároku 33, vyznačující se tím, že tyrosin-proteinkináza je vybrána ze Syk, ZAP-70,

Fyn a Lek.

37. DMA kódující chimérický receptor kódující proteinový chimérický receptor vázaný na membránu a obsahující

a) intracelulární část tyrosin-proteinkinázy, která je schopna předat terapeutické buňce signál k likvidací cílové buňky vázané na receptor, nebo infekčního agens vázaného na receptor a

b) extracelulámí část schopnou specificky rozpoznat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, čímž je každá z terapeutických buněk schopna specificky rozpoznat a zlikvidovat cílovou buňku nebo cílové infekční agens.

• r * · · ·

38. DNA kódující proteinový chimérický receptor vázaný na membránu a obsahující

a) intračelulámí část tyrosin-proteinkinázy a

b) extraceiulámí část schopnou specificky rozpoznat a vázat

cílovou buňku nebo cílové i nf ekčn i agens. 39. Vektor obsahující DNA podle nároku 37 kódující chimérický receptor. 40. Vektor obsahující DNA pod1e nároku 38 kódující

chimérický receptor.