NO321459B1

NO321459B1 - Terapeutisk T-lymfocyttcelle som uttrykker kimaere reseptorer, DNA som koder for et sett av kimaere reseptorer, samt vektor omfattende den kimaere reseptor-DNA.

Info

Publication number: NO321459B1
Application number: NO19973863A
Authority: NO
Inventors: Brian Seed; Charles Romeo; Waldemar Kolanus
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2006-05-15
Also published as: EP0812352B1; EP0812352A1; US6410014B1; WO1996026265A1; NO973863D0; HUP9800459A3; AU703125B2; HU225689B1; ATE323755T1; ES2258772T3; DK0812352T3; HUP9800459A2; RU2225870C2; CA2209301A1; ZA961476B; KR19980702451A; US20020176851A1; CZ260197A3; JP4170389B2; US5912170A

Description

Oppfinnelsen vedrører funksjonelle protein-tyrosin-kinasekimærer som er i stand til å omdirigere immunsystemets funksjon. Nærmere bestemt vedrører den terapeutisk T-lymfocyttcelle som uttrykker kimære reseptorer, DNA som koder for et sett av kimære reseptorer, samt vektor omfattende den kimære reseptor-DNA. Oppfinnelsen involverer funksjonelle protein-tyrosin-kinasekimærer som er i stand til å styre terapeutiske celler slik at de spesifikt gjenkjenner og ødelegger celler som er infisert med et bestemt infeksiøst agens, det infeksiøse agens som sådant, en tumorcelle eller en autoimmun-utviklet celle. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen terapeutiske T-lymfocytter som omfatter protein-tyrosin-kinasekimærer som er i stand til å styre cytotoksiske T-lymfocytter for spesifikt å gjenkjenne og lysere celler som uttrykker HIV-kappeproteiner. Oppfinnelsen muliggjør derfor en ny anti-tumorterapi så vel som en terapi for slike sykdommer som AIDS (ervervet immunsviktsyndrom) som forårsakes av HIV-viruset.

T-cellers gjenkjenning av antigen ved hjelp av T-cellereseptoren, danner grunnlaget for en rekke immunologiske fenomener. T-cellene styrer det som er kalt cellemediert immunitet. I denne inngår immunsystem-cellers ødeleggelse av fremmed vev eller infiserte celler. Det eksisterer en rekke T-celler inklusivt «hjelper-, og «suppressor»-ceiler som modulerer immunresponsen, og cytotoksiske (eller

«dreper-») celler som direkte kan drepe abnorme celler.

En T-celle som gjenkjenner og binder et unikt antigen som opptrer på overflaten av en annen celle, blir aktivert. Den kan deretter formeres og kan dersom den er en cytotoksisk celle, drepe den bundne celle.

Autoimmunsykdom karakteriseres ved produksjon av antistoffer som reagerer med vertsvev eller immuneffektor-T-celler som er autoreaktive. I enkelte tilfeller kan det oppstå autoantistoffer av en normal T- og B-cellerespons som er aktivert av fremmede substanser eller organismer som inneholder antigener som kryssreagerer med lignende forbindelser i kroppsvev. Eksempler på klinisk relevante autoantistoffer er antistoffer mot acetylkolinreseptorer ved myastenia gravis; og anti-DNA, anti-erytrocytt- og anti-blodplate-antistoffer ved systemisk lupus erytematose.

HIV og immunopatogenese

11984 ble HIV vist å være det etiologiske agens for AIDS. Siden den gang har definisjonen av AIDS vært revidert en rekke ganger med hensyn til hvilke kriterier som

bør inngå i diagnosen. På tross av svingningene i diagnostiske parametere, er imidlertid den enkle fellesnevner for AIDS-infeksjonen med HIV og påfølgende utvikling av vedvarende konstitusjonelle symptomer og AIDS-definerende sykdommer, så som sekundærinfeksjoner, neoplasmer og nevrologisk sykdom.

Harrisor<T>s Principles of Internal Medicine, 12.utg., McGraw Hill (1991).

HIV er et humant retrovirus innen lentivirusgruppen. De fire anerkjente humane retrovirus tilhører to adskilte grupper: de humane T-lymfotrope (eller leukemi) retrovirus, HTLV-1 og HTLV-2, og de humane immunsviktvirus HIV-1 og HIV-2. De førstnevnte er transformerende virus, mens de sistnevnte er cytopatiske virus.

HIV-1 er påvist å være den vanligste årsak til AIDS i verden. Sekvens-homologi mellom HIV-2 og HIV-1 er ca. 40%, hvor HIV-2 er nærmere beslektet med enkelte medlemmer av en gruppe av SIV (ape immunsviktvira). Se Curran et al., Science 329:1357-1359 (1985); Weiss et at., Nature 324:572-575 (1986).

HIV har de vanlige retrovirale genene ( env, gag og pol) så vel som seks ekstra gener som er involvert i replikasjonen og andre biologiske aktiviteter i viruset. Som tidligere nevnt er fellesnevneren for AIDS en dyp immunsuppresjon, hovedsakelig av cellemediert immunitet. Denne immunsuppresjon fører til en rekke opportunistiske sykdommer, særlig visse infeksjoner og neoplasmer.

Hovedårsaken til immundefekten ved AIDS har vist seg å være en kvantitativ og kvalitativ svikt i subsettet av tymus-avledede (T) lymfocytter, T4-populasjonen. Dette celle-subsett defineres fenotypisk av nærværet av CD4-overflatemolekylet som har vært vist å være den cellulære reseptor for HIV. Dalgleish et al., Nature, 312:763

(1984). Selv om T4-cellen er den hovedcelletype som infiseres med HIV, er i det vesentlige en hvilken som helst humancelle som uttrykker CD4-molekylet på sin overflate, i stand til å bindes til og infiseres med, HIV.

Tradisjonelt har CD4<+> T-celler vært tilordnet hjelper/inducer-rollen, hvilket antyder deres funksjon ved å sørge for et aktiveringssignal til B-celler, eller indusere T-lymfocytter som bærer den resiproke CD8-markør, til å bli cytotoksiske/-suppressor-celler. Reinherz & Schlossman, Cell, 19:821-827 (1980); Goldstein et al., Immunot. Rev. 68:5-42(1982).

HIV binder seg spesifikt og med høy affinitet, via en strekning av aminosyrer i viruskappen (gp120), til en del av den V1-regionen av CD4-molekylet som er lokalisert nær dets N-terminal. Etter binding smelter viruset sammen med mål-cellemembranen og internaliseres. Når det først er internalisert benytter det enzymet revers transkriptase til å transkribere dets genomiske RNA til DNA, som integreres i det cellulære DNA, hvor det foreligger som et «provirus» i cellens levetid.

Proviruset kan forbli latent eller aktiveres tii å transkribere mRNA og genomisk RNA og føre til proteinsyntese, sammensetning, ny viriondannelse og knoppskyting av virus fra celleoverflaten. Selv om den nøyaktige mekanisme som virus induserer celledød med, ikke er fastslått, antas det at hovedmekanismen er en massiv viral knoppskyting fra celleoverflaten som fører til opprivning av plasmamembranen og en resulterende mangel på osmotisk likevekt.

Under infeksjonen danner vertsorganismen antistoffer mot virale proteiner, inklusivt de viktigste kappe-glykoproteinene gp120 og gp41. På tross av denne humorale immunitet utvikler sykdommen seg og resulterer i en letal immunsuppresjon som kjennetegnes ved mange opportunistiske infeksjoner, parasittemi, demens og død. Vertens antivirale antistoffers svikt når det gjelder å stanse sykdomsutviklingen utgjør én av de mest opprørende og alarmerende aspekter ved infeksjonen og lover ikke godt for vaksinasjonsbestrebelser basert på konvensjonelle tilnærmingsmåter.

To faktorer kan spille en rolle for effektiviteten av den humorale respons på immunsviktvirus. For det første oppviser immunsviktvirus i likhet med andre RNA-virus (og særlig i likhet med retrovirus) en høy grad av mutasjon som respons på vertens immunologiske overvåkning. For det andre er kappe-glykoproteinene selv sterkt glykosylerte molekyler som presenterer få egnede epitoper for høyaffinitets-antistoffbinding. Det antigent svake mål som viruskappen presenterer gir verten liten mulighet for å begrense virusinfeksjon gjennom spesifikk antistoffprodukjson.

Celler infisert med HIV-viruset uttrykker gp120 glykoproteinet på deres overflate. gp120 medierer fusjonsbegivenheter blant CD4<+->celler via en reaksjon som ligner den hvorved viruset kommer inn i ikke-infiserte celler, og fører til dannelse av flerkjernede kjempeceller med kort levetid. Syncytiumdannelse avhenger av en direkte interaksjon mellom gp120 kappeglykoproteinet og CD4-proteinet. Dalgleish et al., supra; Klatzman et al., Nature, 312:763 (1984); McDougal et al., Science 231:382

(1986); Sodroski et al., Nature 322:470 (1986); Ltfson, et al., Nature 323:725 (1986); Sodroski et al., Nature 321:412 (1986).

Indikasjoner på at CD4-gp120-binding er ansvarlig for virusinfeksjon av celler som bærer CD4-antigenet, innbefatter det funn at det dannes et spesifikt kompleks mellom gp120 og CD4 (McDougal et al., supra). Andre forskere har vist at de cellelinjene som var ikke-infeksiøse for HIV, ble omdannet til infiserbare cellelinjer etter transfeksjon og ekspresjon av det humane CD4 cDNA-gen. Maddon et al., Cell, 46:333-348 (1986).

Terapiprogrammer basert på løselig CD4 som er et passivt middel til å gripe inn i virus-adsorpsjon og syncytium-mediert cellulær transmisjon, har vært foreslått og in vitro vist seg å være vellykket av en rekke forskergrupper (Deen et al. Nature, 331:82-84 (1988); Fisher et al. Nature, 331:76-78 (1988); Hussey et al., Nature, 331:78-81

(1988); Smith et al., Science 238:1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988)); og CD4 immunglobulin-fusjonsproteiner med forlengede halveringstider og en beskjeden biologisk aktivitet har deretter vært utviklet (Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Byrn et al., Nature, 344:667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347-353 (1990)). Selv om CD4 immuntoksin-konjugater eller fusjonsproteiner oppviser potent cytotoksisitet for infiserte celler in vitro (Chaudhary et al., Nature, 335:369-372 (1988); Till et al., Science 242:1166-1168 (1988)) gjør latensen av immunsvikt-syndromet det usannsynlig at noen enkelt behandlingsterapi vil kunne eliminere virusbelastningen, og antigeniteten av fremmede fusjonsproteiner vil sannsynligvis begrense deres godtagbarhet for behandlinger som fordrer gjentagende dosering. Forsøk med aper som lider av SIV, har vist at løselig CD4, dersom det administreres til dyr uten merkbar CD4-cytopeni, kan redusere SIV-titer og forbedre in vitro forholdsregler av myeloid potensiale (Watanabe et al., Nature, 337:267-270 (1989)). En raskt viral gjenoppblomstring ble imidlertid iakttatt etter at behandlingen var avbrutt, hvilket tyder på at administrering gjennom hele levetiden ville kunne være nødvendig for å forhindre progressiv immunsystemsvekkelse.

Celleoverflate reseptor-assosiert protein-tyrosin-kinaser

Det første incitament for engasjement av kimære effektorprogrammer i immunsystemet, er ofte cellegjenkjenning av ligand-ansamlinger. Blant de reseptorene som er kjent for å overføre aktiveringssignaler etter aggregasjon, er B-celle- og T-celle-antigenreseptorer (DeFranco, Eur. J. Biochem., 210:381-388 (1992); Weiss, Annu. Rev. Genet. 25:487-510 (1991)), medlemmer av IgG- og IgE Fc-reseptorfamiliene (Fanger et al., Immunol. Today 10:92-99 (1989); Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)) og en rekke hjelpe-reseptorer, inklusivt CD2, CD4, CD8 og CD28 i T-celler (Yokoyama & Shevach, Year Immunol. 4:110-146

(1989)), CD19, CD20, CD21 og CD40 i B-celler (Clark & Ledbetter, Adv. Cancer Res. 52:81-149 (1989)) og CD44, CD45 og CD58 i monocytter (Webb et al., Science 249:1295-1297 (1990)). I tillegg fremmer et stort antall fosfolipid-koblede proteiner på reseptor-avhengig måte cellulæraktivering i et antigen, når disse kryssbindes på overflaten av T-celler (Balk & Terhorst, Immunol. Ser. 45:411-416 (1989); Kroczek et al., Nature, 322:181-184 (1986); Yeh et al., J. Immunol. 138:91-97 (1987); Yokoyama & Shevach, Year Immunol. 4:110-146 (1989)).

Det er for tiden ikke klart hvorledes en enkel fysisk begivenhet som aggregasjon, resulterer i et klatt fremtredende fysiologisk signal. Medvirkning av cellulære effektorprogrammer mediert av T-celle- og B-celle-antigenreseptorer og ulike former av Fc-reseptorer, kan etterlignes ved kryssbinding av kimære proteiner som bærer de intracellulære domener av de enkelte kjeder av reseptorkompleksene (Irving & Weiss, Cell 64:891-901 (1991); Kolanus et al., EMBO J 11:4861-4868

(1992); Letourneur & Klausner, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:8905-8909 (1991); Letourneur & Klausner, Science 255:79-82 (1992); Romeo & Seed, Cell 64:1037-1046 (1991); Wegener et al., Cell 68:83-95 (1992)). Det minimalt effektive utløserelement synes å fordre en fylogenetisk konservert (Reth, Nature 338:383-384

(1989)) peptidsekvens som inneholder to tyrosinrester adskilt med 10 eller 11 rester innesluttet i en hydrofil, typisk sur omgivelse (Romeo et al., Cell 68:889-897 (1992); Irving et al., J. Exp. Med. 177:1093-1103 (1993)). Ansamling av reseptorer som bærer dette element, initierer en aktiveringskaskade som protein-tyrosin-kinase (PTK) aktivitet synes å være essensiell for. PTK-inhibitorer blokkerer både tidlige begivenheter i B- og T-celleaktivering, så som kalsium-mobilisering og den senere følge av cytokinfrigjøring og cellulær proliferasjon (June et al., J. Immunol. 144:1591-1599 (1990); Lane et al. J. Immunol. 146:715-722 (1991); Mustelin et al., Science 247:1584-1587 (1990); Stanley et al., J. Immunol. 145:2189-2198 (1990)). Selv om de mer fjerntliggende konsekvenser av reseptoraktivering adskiller seg med celletypen, er de tidlige begivenheter slående like blant celler av vesensforskjellig hematopoietisk herkomst. For eksempel har den hurtige økning av PTK-aktivitet som sees etter kryssbinding av B-celle-antigenreseptoren (Gold et al., Nature, 345:810-813 (1990); Campbell & Sefton, EMBO J. 9:2125-2131 (1990)), T-celle-antigenreseptoren (June et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:7722-7726 (1990); June et al., J. Immunol. 144:1591-1599 (1990)) og høy-affinitets IgE-reseptoren (Eiseman & Bolen, Nature 355:78-80 (1992); Li et al., Mol. Cell. Biol. 12:3176-3182 (1992)) blant deres tidlige fosforyleringsmål, y-isoformen av fosfatidylinositol-spesifikk fosfolipase C (Carter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:2745-2749 (1991); Li et al., Mol. Cell Biol. 12:3176-3182 (1992); Park et al., J. Biol. Chem. 266:24237-24240 (1991); Park et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:5453-5456 (1991); Secrist et al., J. Biol. Chem. 266:12135-12139 (1991); Weiss et al., Annu. Rev. Genet. 25:487-510 (1991)), som direkte aktiveres ved tyrosinfosforylering (Nishibe et al., Science 250:1253-1256 (1990).

De PTK-aktiviteter som så langt er kjent for å assosiere med celleoverflatereseptorer, faller inn under to klasser: de som tilhører familien av Src-proto-onkogen-relaterte kinaser og de som er beslektet med den nylig karakteriserte Syk-kinase. Av de førstnevnte har Fyn-kinaser vært vist å assosiere med T-cellereseptoren (Gassmann et al., Eur. J. Immunol. 22:283-286 (1992); Samelson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:4358-4362 (1990)), Lyn-, Fyn-, Blk- og Lck-kinaser har vært rapportert å assosiere med B-celle IgM-reseptoren (Burkhardt et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:7410-7414 (1991); Campbell & Sefton, Mol. Cell. Biol. 12:2315-2321 (1992); Yamanashi et al., Science 251:192-194 (1991)) og Lyn- og Yes-kinaser har vært vist å assosiere med høy-affinitets IgE-reseptoren (Eiseman & Bolen, Nature, 355:78-80 (1992); Hutchroft et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-9111 (1992); Hutchroft et al., J. Biol. Chem 267:8613-8619 (1992)). Mekanismen for den observerte assosiasjon er ikke fastlagt i detalj, men foreløpige data tyder på at de intracellulære domener av reseptorkomplekskjedene fysisk kan assosiere med kinaser av Src-familie (Clark et al., Science 258:123-126 (1992); Timson Gauen et al., Mol. Cell. Biol. 12:5438-5446 (1992)). For øyeblikket er det ikke klart hvorvidt disse assosiasjonene er direkte eller indirekte.

Den hittil mest overbevisende indikasjon på betydningen av kinaser av Src-familie ved celleaktivering, er fremkommet gjennom studiet av Fyn- og Lck-kinaser i T-celler. Overekspresjon av Fyn i transgene mus fører til en antigen hyper-responsiv fenotype i de resulterende T-celler, mens overekspresjon av en katalytisk inaktiv form blokkerer T-cellereseptor-mediert proliferasjon (Cooke et al., Cell 65:281-291 (1991)). Thymiske T-celler isolert fra mutante mus som mangler Fyn-kinaseaktivitet, viser en uttalt defekt med hensyn til evnen til å utløse en proliferativ respons som respons på behandling med en kombinasjon av forbolester med enten anti-CD3-antistoff eller Koncanavalin A (Appleby et al., Cell 70:751-763 (1992); Stein et al., Cell 70:741-750

(1992)). Spleniske T-celler isolert fra slike mus, oppviseren mindre alvorlig, men betydelig, svekkelse av celleaktiveringsresponsen (Appleby et al., Cell 70:751-763

(1992); Stein et al., Cell 70:741-750 (1992)).

I T-celler assosierer Lck-kinase indirekte med TCR via CD4- og CD8-ko-reseptorene (Rudd et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:5190-5194 (1988); Shaw et ai., Cell 59:627-636 (1989); Turner et al. Cell 60.755-765 (1990); Veillette et al., Cell 55:301-308 (1988)). Overekspresjon av Lek i en antigen-responsiv cellelinje potensierer reseptor-sensitivitet på en måte som ligner den som sees med Fyn (Abraham & Veillette Mol. Cell. Biol. 10:5197-5206 (1990); Davidson et al., J. Exp. Med. 175:1483-1492 (1982); Luo & Sefton, Mol. Cell. Biol. 12:4724-4732 (1992)). I en CD4-avhengig murin T-celle hybridom-modell kunne rekonstituering av antigen-spesifikk hjelperfunksjon oppnås kun med CD4-molekyler som var i stand til å gi interaksjon med Lek (Glaichenhaus et al., Cell 64:511-520 (1991)).

Den sterkeste indikasjon på den direkte medvirkning av Lck-kinase ved antigen-reseptor-mediert signalisering kommer fra studier av mutantcellelinjer som mangler Lek. To slike linjer, den ene avledet fra Jurkat human T-celle leukemilinjen (Goldsmith & Weiss, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:6879-6883 (1987); Straus & Weiss, Cell 70:585-593 (1992)) og den andre fra den murine cytotoksiske T-celleklon CTLL-2 (Karnitz et al., Mol. Cell. Biol. 12:4521-4530 (1992)), er blitt undersøkt. Begge Lck-negative mutantlinjene er defekte med hensyn til TCR-mediert signalisering, og komplettering av mutantlinjen ved transfeksjon med et Lck-ekspresjonsplasmid, gjenoppretter responsivitet for TCR-kryssbindende stimuli (Karnitz et al., Mol. Cell. Biol. 12:4521-4530 (1992); Straus & Weiss, Cell 70:585-593 (1992)).

Nylig har det vært vist at medlemmer av en ny familie av tyrosinkinaser, opprinnelig representert gjennom de nær beslektede eller identiske kinasene Syk (Taniguchi et al., J. Biol. Chem. 266:15790-15796 (1991)) og PTK 72 (Zioncheck et al., J. Biol. Chem. 261:15637-15643 (1986); Zioncheck et al., J. Biol. Chem. 263:19195-19202 (1988)), vært vist å assosiere med celleoverflatereseptorer. Selv om PTK 72 og Syk ikke definitivt er vist å være identiske, har de til felles en vevsfordeling (tymus og milt), molekylmasse og labilitet overfor proteolyse. PTK 72 har vært vist å assosiere med B-celle IgM-reseptoren (Huthcroft et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-9111 (1992); Hutchcroftet al., J. Biol. Chem. 267:8613-8619

(1992)) og til å bli fosforylert etter kryssbinding av reseptoren med anti-lgM (Hutchcroftet a I., J. Biol. Chem. 266:14846-14849 (1991)). En samtidig aktivering av enzymet, målt både ved autofosforylering og fosforylering av et eksogent protein-fragment, ble demonstrert etter overflate IgM kryssbinding (Hutchcroft et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-9111 (1992); Hutchcroftet al., J. Biol. Chem. 267:8613-8619 (1992)). PTK 72 er også vist å assosiere med høy-affinitets IgE-reseptoren i en basofil leukemicellelinje fra rotte (Hutchcroft et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-9111 (1992); Hutchcroft et al., J. Biol. Chem. 267:8613-8619 (1992)).

En annet medlem av Syk-familien, ZAP-70, har vært vist å være en PTK som assosierer med zeta-kjeden av T-cellereseptoren etter reseptor-kryssbinding (Chan et al., Proe. Nati. Acad. Ser. USA 88:9166-9170 (1991)). Selv om ekspresjon i COS-celler av ZAP-70, Fyn eller Lek fører til beskjedne økninger i totalt celletyrosinfosfat, fører koekspresjon av ZAP-70 og enten Lek eller Fyn, til en dramatisk økning i netto tyrosinfosforylering (Chan et al., Cell 71:649-662 (1992)). Dersom det også er tilstede en CD8-zetakjedekimær, blir kimæren fosforylert, og ZAP-70 viser seg å være assosiert med den (Chan et al., Cell 71:649-662 (1992)). For øyeblikket er det ikke klart hvorvidt ZAP-70 aktiverer kinasene av Src-familie og/eller vice versa, eller hvorfor koekspresjon av kinaser i COS-celler skulle føre til en tilsynelatende konstitutiv aktivering. Ikke desto mindre tyder den aktive assosiering av ZAP-70 med kryssbundet TCR på at denne PTK spiller en rolle ved utbredelsen av reseptor-responsen.

Til forskjell fra kinasene av Src-familie, har Syk og ZAP-70 to SH2-domener og intet N-terminalt myristoyleringssete (Taniguchi et al., J. Biol. Chem. 266:15790-15796 (1991); Chan et al., Cell 71:649-662 (1992)). For mekanismen for kinase-reseptor-assosiering ville en naturlig forventning være at de to SH2-domenene binder de to tyrosinene i antigenreseptor-utløsermotivene straks de er fosforylert. For øyeblikket forblir imidlertid dette kun en hypotese.

WO 95/02686 beskriver celler som uttrykker kimære reseptorer som inkluderer en ekstracellulær del i stand til spesifikt å gjenkjenne og binde en målcelle eller et målinfektiøst agens, og en intracellulær del av en protein-tyrosinkinase i stand til å signalisere til cellen om å ødelegge et reseptorbundet mål. WO 95/02686 verken beskriver eller foreslår en kimær reseptor som har en intracellulær del av CD28.

Foreliggende oppfinnelse viser muligheten av å frembringe kimærer mellom det intracellulære domenet av et protein-tyrosin-kinasemolekyl og et ekstracellulært domene, som kan løse målgjenkjenningsoppgaven. Særlig utløser ansamling av kimærer som bærer Syk- eller ZAP-70-kinasesekvenser, kalsium-mobilisering. Aggregasjon bare av en Syk-kimær, eller koaggregasjon av kimærer som bærer Fyn-eller Lek- og ZAP-70-kinaser, er tilstrekkelig til å initiere en cytolytisk effektorfunksjon. En slik effektorfunksjon letter den spesifikke gjenkjenning og ødeleggelse av uønskede målceller, for eksempel patogener, patogen-infiserte celler, tumorceller eller autoimmunceller.

Et hvilket som helst antall egnede kimære molekyler kan konstrueres. For eksempel gjør dannelsen av kimærer bestående av den intracellulære del av en protein-tyrosin-kinase, koblet til den ekstracellulære del av et passende manipulert antistoff-molekyl, det mulig spesifikt å omdirigere en immunsystem-celles måigjenkjennende evne til det antigen som gjenkjennes av den ekstracellulære antistoff-del. Med en antistoff-del som er i stand til å gjenkjenne en eller annen determinant på patogenoverflaten, vil immunsystemceller armert med kimærene, kunne gi respons på patogen-nærværet med det effektorprogram som er passende for deres herkomst For eksempel ville hjelper-T-lymfocytter respondere med cytotoksisk aktivitet mot målet, og B-lymfocytter aktiveres til å syntetisere antistoff. Makrofager og granulocytter ville utføre deres effektorprogrammer, inklusivt frigjøring av cytokin, fagocytose og utvikling av reaktivt oksygen. Med en antistoff-del som er i stand til å gjenkjenne tumorceller, vil immunsystemets respons på svulsten likeledes bli fordelaktig forsterket. Med et antistoff som er i stand til å gjenkjenne immunceller som har en uhensiktsmessig reaktivitet med selv-determinanter, ville autoreaktive celler kunne målsøkes selektivt for destruksjon.

Selv om disse eksemplene medfører anvendelsen av antistoff-kimærer som et hensiktsmessig forklarende middel, er omfanget av oppfinnelsen ikke begrenset til antistoff-kimærer, og anvendelsen av spesifikke ikke-antistoff ekstracellulære domener kan faktisk ha vesentlige fordeler. Med en ekstracellulær del som er reseptoren for et virus, en bakterie eller parasitt, ville celler armert med kimærene spesifikt kunne målsøke celler som uttrykker de virale, bakterielle eller parasittiske determinantene. Fordelen ved denne fremgangsmåte fremfor bruken av antistoffer, er at den native reseptor for patogen kan ha en unik høy selektivitet eller affinitet for patogenet, hvilket muliggjør en høyere grad av presisjon ved den resulterende immunrespons. For å utelate immunsystemceller som reagerer uhensiktsmessig med et selv-antigen, kan det på lignende måte være tilstrekkelig å forbinde antigenet (enten som et intakt protein, når det er tale om terapier basert på B-celle-overforbruk, eller som et MHC-kompleks når det er tale om terapier basert på T-celle-overforbruk) med intracellulære protein-tyrosin-kinasekjeder, og derved bevirke spesifikk målsøkning av de celler som gir uhensiktsmessig respons på selv-determinanter.

En annen anvendelse av kimærene er kontrollen av cellepopulasjoner in vivo etter andre former av genetisk manipulering. For eksempel har det vært foreslått å benytte tumor-infiltrerende lymfocytter elier naturlige dreperceller til å frakte cytotoksiske prinsipper til svulststedet Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en hensiktsmessig måte å regulere antallet og aktiviteten av slike lymfocytter og celler på, uten å fjerne dem fra pasientens kropp for forsterkning in vitro. Siden de kimære reseptorers intracellulære domener medierer de proliferative responser i cellene, vil koordinasjonen av de ekstracellulære domener gjennom en rekke aggregerende stimuli som er spesifikke for de ekstracellulære domener (f.eks. et antistoff som er spesifikt for det ekstracellulære domene) således resultere i proliferasjon av de cellene som bærer kimærene.

Selv om spesifikke utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse omfatter kimærer mellom Syk- eller Syk- og Src-familiene av protein-tyrosin-kinaser, ville en hvilken som helst tyrosinkinase som har en lignende funksjon som disse molekylene kunne benyttes for de her beskrevne formål. De trekk som skiller ønskelige immuncelle-utløsermolekyler fra hverandre omfatter evnen til å uttrykkes autonomt, evnen til å fusjoneres til et ekstracellulært domene (direkte eller indirekte gjennom et transmembrant domene) slik at den resulterende kimær forekommer på overflaten av en terapeutisk celle, og evnen til å initiere cellulære effektorprogrammer etter aggregasjon sekundært til møtet med en mål-ligand.

For tiden er den mest hensiktsmessig metode for avgivelse av kimærene til immunsystemets celler, via en eller annen form av genetisk terapi. Rekonstttuering av immunsystemceller med kimære reseptorer gjennom blanding av cellene med passende solubilisert, renset kimært protein, ville imidlertid også resultere i dannelse av en manipulert cellepopulasjon som kan gi respons på de mål som gjenkjennes av kimærenes ekstracellulære domene. Lignende tilnærmingsmåter har vært benyttet for eksempel for å innføre den intakte HIV-reseptor, CD4, i erytrocytter for terapeutiske formål. I dette tilfelle ville den manipulerte cellepopulasjon ikke være i stand til selv-fomyelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører funksjonelle forenklede protein-tyrosin-kinasekimærer som er i stand til å omdirigere immunsystemets funksjon. Nærmere bestemt vedrører den reguleringen av lymfocytter, ved at det i cellene uttrykkes kimærer som får cellene til å respondere på mål som gjenkjennes av kimærene. Det beskrives en fremgangsmåte for å rette cellulære responser mot et infeksiøst agens, en svulst eller cancercelle eller en autoimmun-utviklet celle. Fremgangsmåten for å styre den cellulære respons i et pattedyr består i å administrere pattedyret en effektiv mengde terapeutiske celler som er i stand til å gjenkjenne og ødelegge nevnte infeksiøse agens, svulst, cancercelle eller autoimmun-utviklede celle. Den cellulære respons kan medieres av en enkelt kimær eller være resultatet av samarbeid mellom flere kimærer (for eksempel et sett på to eller flere kimærer, hvorav ett inkluderer et CD28 intracellulært domene).

Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes terapeutisk T-lymfocyttcelle som uttrykker en første membran-bundet, proteinaktig kimær reseptor, kjennetegnet ved at den omfatter;

(a) en intracellulær del av en protein-tyrosin-kinase, og

(b) en ekstracellulær del som er i stand til spesifikt å gjenkjenne og binde en reseptorbundet målcelle eller et reseptorbundet mål-infeksiøst agens, og en

andre membranbundet proteinaktig kimær reseptor omfattende;

(a) en ekstracellulær del som er i stand til å binde nevnte målcelle eller nevnte

mål-infektiøse agens, og

(b) en intracellulær del som er avledet fra CD28, hvor nevnte første og nevnte andre reseptorer spesifikt gjenkjenner og binder nevnte målcelle eller nevnte

infektiøse agens, og

hvor hver av nevnte terapeutiske celler er i stand til spesifikt å gjenkjenne og ødelegge nevnte målcelle eller nevnte mål-infeksiøse agens.

Ifølge en utførelsesform er de terapeutiske celler i stand til å gjenkjenne og ødelegge det nevnte agens, hvor dette er et spesifikt virus, en bakterie, protozo eller sopp. Nærmere bestemt er det infektiøse agens HIV eller Pneumocystis carinii.

For å behandle en HIV-infeksjon administreres pasienten en effektiv mengde av kimær reseptorekspresjon cytotoksiske T-lymfocytter; hvor lymfocyttene er i stand til spesifikt å gjenkjenne og lysere celler infisert med HIV så vel som sirkulerende virus.

Ifølge én utførelse er T-lymfocyttcellen ifølge foreliggende oppfinnelse en cytotoksisk T-lymfocytt som er i stand til spesifikt å gjenkjenne og lysere celler som er infisert med HIV.

Ifølge et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et DNA som koder for et sett av kimære reseptorer, nevnte sett er

kjennetegnet ved at det omfatter en første membran-bundet, proteinaktig kimær reseptor omfattende;

(a) en intracellulær del av en protein-tyrosin-kinase, og

(b) en ekstracellulær del som er i stand til spesifikt å gjenkjenne og binde en reseptor-bundet målcelle eller et reseptor-bundet mål-infeksiøst agens, og en

andre membran-bundet proteinaktig kimær reseptor omfattende;

(a) en ekstracellulær del som er i stand tii å binde nevnte målcelle eller nevnte

mål-infektiøse agens, og

infektiøse agens, og

hvor hver av nevnte terapeutiske celler er i stand til spesifikt å gjenkjenne og ødelegge nevnte målcelle eller nevnte mål-infektiøse agens. Nok et annet aspekt av oppfinnelsen omfatter en vektor som omfatter den kimære-reseptor-DNA ifølge oppfinnelsen.

En rekke fremgangsmåter for å konstruere og uttrykke kimære immunreseptorer så vel som diverse terapeutiske anvendelser av disse, er utførlig forklart i U.S.S.N. 07/847.566 og 07/665.961, som herved er referert tii.

I den etterfølgende detaljerte beskrivelse vil det finnes henvisninger til ulike metodikker som vil være kjent på det molekylærbiologiske og immunologiske området. Publikasjoner og annet materiale som beskriver slike kjente metodikker henvises det til i foreliggende beskrivelse.

Standardverker som beskriver de generelle prinsippene ved rekombinante DNA-teknikker, er bl.a. Watson et al. Molecular Biology of the Gene, Bd. I og II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., forlegger Menlo Park, CA (1987); Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., forlegger New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, forleggere New York, N.Y.

(1985); Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2.utg. University of California Press, forlegger Berkeley, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.utg. Cold Spring Harbor Laboratory, forlegger, Cold Spring Harbor, NY (1989); og Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989).

DEFINISJONER

Med «kloning» menes anvendelsen av in vitro rekombinasjonsteknikker for å sette inn et bestemt gen eller en annen DNA-sekvens i et vektormolekyl. For med hell å klone et ønsket gen er det nødvendig å benytte metoder for å frembringe DNA-fragmenter for å forene disse fragmentene med vektormolekyler, for å innføre det sammensatte DNA-molekyl i en vertscelle, hvori det kan replikeres, og for å selektere den klon som har mål-genet blant vertens mottagerceller.

Med «cDNA» menes komplementært eller kopi DNA frembragt fra en RNA-templat gjennom virkningen av RNA-avhengig DNA-polymerase (revers transk rip tase). En «cDNA-klon» betyr således en dupleks DNA-sekvens som er komplementær til et aktuelt RNA-molekyl, båret i en kloningsvektor.

Med «cDNA-bibliotek» menes en samling av rekombinante DNA-molekyler inneholdende cDNA-innskudd som omfatter DNA-kopier av mRNA som uttrykkes av cellen på det tidspunktet cDNA-biblioteket ble fremstillet Et slikt cDNA-bibliotek kan fremstilles etter kjente metoder, som for eksempel beskrevet i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra. I alminnelighet isoleres RNA først fra cellene til en organisme fra hvis genom det er ønskelig å klone et bestemt gen. For foreliggende formål foretrekkes lymfocyttiske cellelinjer fra pattedyr, særlig humane. En vektor som for tiden foretrekkes for formålet er vaccinia virus WR-stammen.

Med «vektor» menes et DNA-molekyl som er avledet, f.eks. fra et plasmid, en bakteriofag eller pattedyr- eller insekt-virus, hvori fragmenter av DNA kan skytes inn eller klones i. En vektor vil inneholde ett eller flere unike restriksjonsseter og være i stand til autonom replikasjon i en definert vert eller bærerorganisme slik at den klonede sekvens er reproduserbar. Med «DNA-ekspresjonsvektor» menes således et hvilket som heist autonomt element som er i stand til å styre syntesen av et rekombinant peptid. Slike DNA-ekspresjonsvektorer inkluderer bakterielle plasmider og fag samt pattedyr- og insekt-plasmider og virus.

Med «tilnærmet ren» menes en forbindelse, f.eks. et protein, et polypeptid eller et antistoff som er tilnærmet fritt for komponenter som naturlig følger denne. I alminnelighet er en forbindelse tilnærmet ren når minst 60%, fortrinnsvis minst 75% og helst minst 90%, av det totale materialet i en prøve er den aktuelle forbindelse. Renhet kan måles med en hvilken som helst passende metode, f.eks. kolonnekromatografi, polyakrylamid-gelelektroforese eller HPLC-analyse. I sammenheng med en nukleinsyre betyr «tilnærmet ren» en nukleinsyresekvens, segment eller fragment, som ikke er umiddelbart sammenhengende med (dvs. kovalent bundet til) begge de kodende sekvenser som de er umiddelbart sammenhengende med (dvs. én i 5'-enden og én i 3'-enden) i det naturlig forekommende genom til den organismen som DNA ifølge oppfinnelsen skriver seg fra.

Med «funksjonelt derivat» menes «fragmentene», «variantene», «analogene» eller «kjemiske derivater» av et molekyl. Et «fragment» av et molekyl, som f.eks. en hvilken som helst av cDNA-sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse, er ment å referere seg til et hvilket som helst nukleotid-subsett av molekylet. En «variant» av et slikt molekyl er ment å referere seg til et naturlig forekommende molekyl tilnærmet likt enten hele molekylet eller et fragment derav. En «analog» av et molekyl er ment å referere seg til et ikke-naturlig molekyl som er tilnærmet likt enten hele molekylet eller et fragment derav. Et molekyl angis å være «tilnærmet likt» et annet molekyl dersom aminosyresekvensen i begge molekylene er tilnærmet like. Spesielt er en «tilnærmet lik» aminosyresekvens en sekvens som oppviser minst 50%, fortrinnsvis 85 og helst 95% aminosyresekvens-identitet med den naturlige sekvens eller referansesekvensen, og/eller som bare adskiller seg fra den naturlige eller referanse-aminosyresekvensen ved konservative aminosyre-substitusjoner. Tilnærmet like aminosyremolekyler har lignende biologisk aktivitet. Forutsatt at to molekyler har lignende aktivitet ansees de således som varianter siden den betegnelse her benyttes selv om det ene av molekylene inneholder flere eller færre aminosyrerester som ikke finnes i den andre, eller dersom sekvensen av aminosyrerestene ikke er identisk. I denne sammenheng sies et molekyl å være et «kjemisk derivat» av et annet molekyl når det inneholder ytterligere kjemiske deler som ikke normalt utgjør del av molekylet. Slike deler kan forbedre molekylets løselighet, absorpsjon, biologiske halveringstid, etc. Delene kan alternativt nedsette molekylets toksisitet, eliminere eller svekke eventuelt uønskede bivirkninger av molekylet, etc. Deler som er i stand til å mediere slike effekter er beskrevet, for eksempel i Remingtor<T>s Pharmaceutical Sciences, 16.utg. Mack Publishing Co., Easton, PA (1980).

Tilsvarende er et «funksjonelt derivat» av et reseptor-kimærgen ment å inkludere «fragmenter», «varianter» eller «analoger» av genet som kan være «tilnærmet likt» i nuklelotidsekvens og som koder for et molekyl som har lignende aktivitet som en protein-tyrosin-kinasekimær. «Tilnærmet like» nukleinsyrer koder for tilnærmet de samme aminosyresekvenser (som definert ovenfor) og kan også inkludere en hvilken som helst nukleinsyresekvens som er i stand til å hybridisere til den naturlige eller referanse-nukleinsyresekvensen under passende hybridiseringsbetingelser (se for eksempel Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989) for passende stringensbetingelser ved hybridiseringen).

I denne sammenheng er et protein-tyrosin-kinase-kimærprotein således også ment å inkludere et hvilket som helst funksjonelt derivat, fragmenter, varianter, analoger eller kjemiske derivater som kan være tilnærmet like «villtype»-kimæren og som har lignende aktivitet (dvs. mest foretrukket, 90%, mer foretrukket, 70%, fortrinnsvis 40% eller minst 10% av villtype-reseptorkimærens aktivitet). Aktiviteten av et funksjonelt kimært reseptorderivat inkluderer spesifikk binding (med dens ekstracellulære del) til et målsøkt agens eller celle og resulterende ødeleggelse (styrt av dens intracellulære del) av vedkommende agens eller celle. Slik aktivitet kan undersøkes, f.eks. ved å benytte en hvilken som helst av de her beskrevne bestemmelsesmetoder.

En DNA-sekvens som koder for kimæren eller dens funksjonelle derivat, kan rekombineres med vektor DNA i henhold til konvensjonelle teknikker, inklusivt rettavkortede eller ende-forskjøvede terminaler for ligering, restriksjonsenzymkutting for å oppnå passende ender, eventuell utfylling av klebrige ender, alkalisk fosfatase-behandling for å unngå uønsket sammenbinding, og ligering med passende ligaser. Teknikker for slike manipulasjoner er omtalt av Maniatis et al., supra og er velkjent på området.

Et nukleinsyremolekyl, så som DNA, sies å være «i stand til å uttrykke» et polypeptid dersom det inneholder nukleotidsekvenser som inneholder transkripsjons-og translasjonsregulerende informasjon, og slike sekvenser er «operativt koblet» til nukleotidsekvenser som koder for polypeptidet. En operativ kobling er en kobling hvor de regulerende DNA-sekvenser og DNA-sekvenser som ønskes uttrykt, er forbundet på en slik måte at den tillater genekspresjon. Den nøyaktige natur av de regulatorregioner som trengs for genekspresjon, kan variere fra organisme til organisme, men må i alminnelighet innbefatte en promotorregion som, i prokaryoter, inneholder både promotoren (som styrer initieringen av RNA-transkripsjon) så vel som de DNA-sekvenser som når de transkriberes til RNA, vil signalisere initieringen av proteinsyntese. Slike regioner vil normalt inkludere de 5'-ikke-kodende sekvenser som er involvert i initieringen av transkripsjon og translasjon, så som TATA-boksen, capping-sekvensen, CAAT-sekvensen og lignende.

Den ikke-kodende region 3' for den gensekvens som koder for proteinet, kan oppnås ved hjelp av de ovenfor beskrevne metoder. Denne region kan bibeholdes med tanke på dens transkripsjonene terminerings-regulatorsekvenser, som f.eks. terminering og polyadenylering. Ved å bibeholde 3'-regionen naturlig sammenhengende med den DNA-sekvens som koder for proteinet, kan således de transkripsjonene termineringssignalene skaffes tilveie. Dersom de transkripsjonene termineringssignalene ikke funksjonerer tilfredsstillende i ekspresjonsvertscellen, kan en 3'-region som er funksjonell i vertscellen, benyttes i stedet.

To DNA-sekvenser (så som en promotor-regionsekvens og en sekvens som koder for en protein-tyrosin-kinasekimær) sies å være operativt koblet dersom naturen av koblingen mellom de to DNA-sekvensene ikke (1) resulterer i innføring av en ramme-skiftmutasjon, (2) griper inn i promotor-regionsekvensens evne til å styre transkripsjonen av reseptorkimærens gensekvens, eller (3) griper inn i evnen til reseptorkimærens gensekvens til å transkriberes av promotor-regionsekvensen. En promotor-region ville være operativt koblet til en DNA-sekvens dersom promotoren var i stand til å bevirke transkripsjon av vedkommende DNA-sekvens. For å uttrykke proteinet er således transkripsjons- og translasjons-signaler som gjenkjennes av en passende vert, nødvendige.

Det beskrives ekspresjon av et protein-tyrosin-kinase-kimærprotein (eller et funksjonelt derivat derav) i prokaryote eller i eukaryote celler. Foreliggende oppfinnelse omfatter human T-lymfocyttcelleekspresjon.

Antistoffer kan fremstilles ved hjelp av én av flere metoder. For eksempel kan celler som uttrykker reseptorkimærproteinet, eller et funksjonelt derivat derav, administreres til et dyr for å indusere produksjonen av sera som inneholder polyklonale antistoffer som kan binde kimæren.

I henhold til en foretrukket metode er antistoffene monoklonale antistoffer. Slike monoklonale antistoffer kan fremstilles ved å benytte hybridomteknologi (Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Kohler et al.., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al. i: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. s. 563-684 (1981)). I alminnelighet inngår det i slike prosedyrer at et dyr immuniseres med kimær-antigenet. Splenocyttene til slike dyr ekstraheres og fusjoneres med en egnet myelomcellelinje. En hvilken som helst egnet myelomcellelinje kan benyttes. Etter fusjonering holdes de resulterende hybridomceller selektivt i HAT-medium og klones deretter ved begrensende fortynning som beskrevet av Wands et al., (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). De hybridomcellene som er oppnådd gjennom en slik seleksjon, analyseres deretter for å identifisere kloner som utskiller antistoffer som kan binde kimæren.

Antistoffer kan også være polyklonale, eller fortrinnsvis, regionspesifikke polyklonale antistoffer.

Antistoffer mot kimæren kan benyttes til å overvåke mengden av kimær reseptor (eller kimær reseptor-bærende celler) i en pasient. Slike antistoffer er velegnet for anvendelse ved kjente standard-immundiagnostiske bestemmelser, inklusivt slike immunometriske eller «sandwich» bestemmelser som "forover sandwich-", "revers sandwich-" og "simultan sandwich-"bestemmelse. Antistoffene kan benyttes i et hvilket som helst antall kombinasjoner, fastlagt av fagmannen uten urimelig eksperimentering, for å foreta immunoassays med akseptabel spesifisitet, følsomhet og nøyaktighet.

Standard referanseverker som beskriver generelle immunologiske prinsipper inkluderer Roitt, Essential Immunology, 6.utg. Blackwell Scientific Publications, utgiver, Oxford, (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2.utg. MacMillan Publishing Co., utgiver, New York (1986); Roitt et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., utgiver, London (1985); Campbell, «Monoclonal Antibody Technology», i Burdon et al., red. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 13, Elsevier, utgiver, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, utgiver, New York

(1982); og Kennett et el., red. Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, utgiver, New York (1980).

Med «påvisning» er det ment å inkludere bestemmelse av nærvær eller fravær av en substans eller kvantifisering av mengden av en substans. Betegnelsen refererer seg således til anvendelsen av materialene, blandingene og metodene heri beskrevet for kvalitative og kvantitative bestemmelser.

Isoleringen av andre hybridomer som utskiller monoklonale antistoffer av samme spesifisitet som de som her er beskrevet, kan oppnås ved anti-idiotypisk screeningteknikk (Potocmjak et al., Science 215:1637 (1982)). Kort fortalt er et anti-iodiotyptsk antistoff et antistoff som gjenkjenner unike determinanter som forekommer på det antistoff som produseres av den aktuelle klon. Det anti-idiotypiske antistoff fremstilles ved å immunisere et dyr av den stamme som benyttes som kilde for det monoklonale antistoff, med det interessante monoklonale antistoff. Det immuniserte dyr vil gjenkjenne og respondere på de idiotypiske determinantene til det immuniserende antistoff ved å produsere antistoff mot disse idiotypiske determinantene (anti-idiotypisk antistoff).

For replikasjon kan hybridcellene dyrkes både in vitro og in vivo. Høy in vivo produksjon gjør dette for tiden til den foretrukne dyrkningsmåte. Herunder injiseres celler fra den individuelle hybridstamme intraperitonealt i pristane-primede BALB/c-mus for å produsere ascitesvæske som inneholder høye konsentrasjoner av de ønskede monoklonale antistoffene. Monoklonale antistoffer av isotype IgM eller IgG kan renses fra kultursupernatanter ved å benytte velkjente søylekromatografiske metoder.

Antistoffer er særlig egnet for anvendelse ved immunoassays, hvor de kan benyttes i flytende fase eller bundet til en fast bærer. Antistoffene som inngår i disse immunoassays kan dessuten på forskjellige måter merkes slik at de kan påvises.

Mange ulike merkinger og merkingsmetoder er kjent på området. Eksempler på merkingstyper som kan benyttes innbefatter, men er ikke begrenset til, enzymer, radioisotoper, fluorescerende forbindelser, kjemiluminescerende forbindelser, bioluminiscerende forbindelser og metallchelater. Fagmannen vil være kjent med andre egnede merkinger for binding til antistoffer, eller vil være i stand til å komme frem til slike gjennom rutinemessig eksperimentering. Bindingen av disse merkingene til antistoffer kan dessuten oppnås ved å benytte standardteknikk som er alminnelig kjent for fagmannen.

En av de måter hvorved antistoffer kan merkes slik at de kan påvises, er ved å koble antistoffet til et enzym. Dette enzym vil når det senere eksponeres for dets substrat, reagere med substratet på en slik måte at det produseres en kjemisk del som kan påvises, for eksempel ved spektrofotometri eller fluorometri. Eksempler på enzymer som kan benyttes for å merke antistoffer slik at de kan påvises, er bl.a. malat-dehydrogenase, stafylokokk-nuklease, delta-V-steroid-isomerase, gjær-alkoholdehydrogenase, alfa-glycerofosfat-dehydrogenase, triosefosfat-isomerase, biotinavidin-peroksydase, pepperrot-peroksydase, alkalisk fosfatase, asparaginase, glukose-oksydase, p-galaktosidase, ribonuklease, urease, katalase, glukose-VI-fosfat-dehydrogenase, glukoamylase og acetylcholinesterase.

Nærværet av merkede antistoffer som kan påvises, kan også påvises ved å merke antistoffene med en radioaktiv isotop som så kan bestemmes ved hjelp av en gammateller eller en scintillasjonsteller. Isotoper som er særlig anvendelige for foreliggende formål er <3>H, <12>5l, 3<2>P, <35>S, UC, <51>Cr, ^Cl, <57>Co, <M>Co, <59>Fe, og <75>Se.

Det er også mulig å påvise bindingen av merkede antistoffer som kan påvises, ved å merke antistoffene med en fluorescerende forbindelse. Når et fluorescensmerket antistoff eksponeres for lys av riktig bølgelengde, kan nærværet av dette påvises på grunn av farvestoffets fluorescens. Blant de mest vanlig anvendte fluorescensmerkingsforbindelsene er fluorescein, isotiocyanat, rhodamin, fykoerytrin, fykocyanin, allofykocyanin, o-ftalaldehyd og fluorescamin.

Antistoffene kan også merkes slik at de kan påvises, ved å benytte fluorescens-emitterende metaller som <1S2>Eu, eller andre lantanider. Disse metallene kan kobles til antistoffmolekylet ved å benytte slike metallchelaterende grupper som dietylen-triaminpentaeddiksyre (DTPA) eller etylendiamin-tetraeddiksyre (EDTA).

Antistoffer kan også merkes slik at de kan påvises, ved å kobie dem til en kjemiluminescent forbindelse. Nærværet av det kjemiluminescent merkede antistoff bestemmes deretter ved å påvise forekomsten av luminescens som dannes i løpet av den kjemiske reaksjon. Eksempler på særlig egnede kjemiluminescens-merkingsforbindelser er luminal, isoluminol, «theromatic» akridiniumester, imidazol, akridiniumsalter, oksalatester og dioksetan.

Likeledes kan en bioluminescent forbindelse benyttes til å merke antistoffene. Bioluminescens er en type av kjemiluminescens som forekommer i biologiske systemer, hvori et katalytisk protein øker effekten av kjemiluminescens-reaksjonen. Nærværet av et bioluminescent antistoff bestemmes ved å påvise forekomsten av luminescens. Viktige bioluminescente forbindelser for merking er bl.a. luciferin og luciferase-aequorin.

Antistoffene og tilnærmet rent antigen er ideelle for fremstilling av et analysesett. Et slikt sett kan omfatte en bærer-anordning som er inndelt i tettsittende rom for å oppta én eller flere beholderanordninger, så som ampuller, rør og lignende, hvor hver beholderanordning omfatter de separate elementer som skal benyttes for bestemmelsen.

De typer av bestemmelser som kan inngå i form av et sett er mange og innbefatter for eksempel kompetitive og ikke-kompetitive bestemmelser. Typiske eksempler på bestemmelser som kan gjøre bruk av antistoffene er RIA

(radioimmunoanalyser), EIA (enzymimmunoanalyser), ELISA (enzymbundet immunosorbentanalyser) og immunometriske eller sandwich-immunoanalyser.

Med betegnelsen «immunometrisk bestemmelse» eller «sandwich-immuno-assay» er det meningen å inkludere simultan sandwich-, forover sandwich- og revers sandwich-immunoassays. Disse betegnelsene er velkjente for fagmannen. For fagmannen vil det også være klart at antistoffer vil være nyttige i andre variasjoner og former av bestemmelser som er kjent på det nåværende tidspunkt eller som vil bli utviklet i fremtiden.

I henhold til den foretrukne måte å foreta bestemmelsene på er det viktig at visse «blokkere» forekommer i inkubasjonsmediet (vanligvis tilsatt sammen med det merkede løselige antistoff). Disse «blokkere» tilsettes for å sikre at ikke-spesifikke proteiner, proteaser eller humane antistoffer mot mus immunglobuliner som forekommer i forsøksprøven, ikke kryssbinder eller ødelegger antistoffene på den faste bæreren eller det radioaktivt merkede indikator-antistoff, som ville kunne føre til falske positive eller falske negative resultater. Valget av «blokkere» bidrar derfor vesentlig til spesifisiteten av de her beskrevne bestemmelser.

Det har vist seg at en rekke ikke-relevante (dvs. ikke-spesifikke) antistoffer av samme klasse eller subklasse (isotype) som de som benyttes i bestemmelsene (f.eks. IgGt, lgG2a, IgM, etc.) kan benyttes som «blokkere». Konsentrasjonen av «blokkere»

(vanligvis 1-100 ng/^L) er viktig for å beholde den riktige følsomhet, men likevel inhibere all uønsket interferens av gjensidig forekommende kryssreaktive proteiner i humanserum. I tillegg må buffersystemet som inneholder «blokkere» optimaliseres. Foretrukne buffere er slike som er basert på svake organiske syrer, så som imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS og lignende, i fysiologiske pH-områder. Noe mindre aktuelle buffere er uorganiske buffere som f.eks. fosfat, borat eller karbonat. Kjente proteaseinhibitorer tilsettes fortrinnsvis (vanligvis som 0,01-10 ng/mL) til bufferen som inneholder blokkere.

Det finnes mange immunadsorbenter av fastfasetype som har vært benyttet, og som kan benyttes. Velkjente immun-adsorbenter er glass, polystyren, polypropylen, dekstran, nylon og andre materialer i form av rør, kuler og mikrotiterplater fremstillet av, eller overtrukket med, slike materialer. De immobiliserte antistoffene kan være bundet enten kovalent eller fysisk til fastfase immunadsorbenten, ved hjelp av slike teknikker som kovalent binding via en amid-eller ester-binding, eller ved absorpsjon. Fagmannen vil kjenne til mange andre egnede fastfase immunadsorbenter og fremgangsmåter for immobilisering av antistoffer på disse, eller være i stand til å finne frem til slike uten anvendelse av annet enn rutinemessig eksperimentering.

For in vivo, in vitro eller in situ diagnostisering, kan merkinger så som radio-nuklider, bindes til antistoffer, enten direkte eller ved å benytte en intermediær funksjonell gruppe. En intermediær gruppe som ofte benyttes for å binde radioisotoper som foreligger som metalliske kationer, til antistoffer er dietylentriamin-pentaeddiksyre (DTPA). Typiske eksempler på metalliske kationer som er bundet på denne måte er: <Mm>Tc, 123l,111 In, <131>l, <97>Ru, 6<7>Cu, <67>Ga og 68Ga. Antistoffene kan også merkes med ikke-radioaktive isotoper for diagnostiske formål. Elementer som er særlig egnet på denne måte er <157>Gd, ^Mn, <162>Dy, 52Cr og <56>Fe.

Antigenet kan isoleres i tilnærmet ren form ved å benytte antistoffene som heri beskrevet. Det tilveiebringes tilnærmet rene protein-tyrosin-kinasekimærer, hvor antigenet kjennetegnes ved at det gjenkjennes av og binder seg til, antistoffer som heri beskrevet. Ifølge en annen utførelsesform tilveiebringes en fremgangsmåte for å isolere eller rense reseptorkimærantigenet ved å danne et kompleks av det nevnte antigen med ett eller flere antistoffer rettet mot reseptorkimæren.

De tilnærmet rene kimære antigener kan i neste omgang benyttes til å påvise eller måle antistoffer mot kimæren i en prøve, som f.eks. serum eller urin. En utførelsesform omfatter derfor en fremgangsmåte for å påvise forekomsten eller mengden av antistoff mot protein-tyrosin-kinaseantigen i en prøve, og som består i å kontakte en prøve som inneholder et antistoff mot det kimære antigen med reseptorkimærer som er merket slik at de kan påvises, og påvise nevnte merking. Det er klart at immunreaktive fraksjoner og immunreaktive analoger av kimæren også kan benyttes. Med betegnelsen «immun-reaktiv fraksjon» menes en hvilken som helst del av det kimære antigen som oppviser en likeverdig immunrespons mot et antistoff rettet mot reseptorkimæren. Med beteg-nelsen «immunreaktiv analog» menes et protein som adskiller seg fra reseptorkimær-proteinet ved én eller flere aminosyrer, men som oppviser en tilsvarende immunrespons mot antistoffet.

Med «spesifikt gjenkjenner og binder» menes at antistoffet gjenkjenner og binder det kimære reseptor-polypeptid, men ikke i vesentlig grad gjenkjenner og binder andre ubeslektede molekyler i en prøve, f.eks. en biologisk prøve.

Med «autoimmun-utviklet celle» menes celler som produserer antistoffer som reagerer med vertens vev eller immuneffektor-T-celler som er autoreaktive. Slike celler innbefatter antistoffer mot acetylcholinreseptorer (som fører f.eks. til myastenia gravis) eller anti-DNA, anti-erytrocytt og anti-blodplate autoantistoffer (som fører til f.eks. lupus erytematose).

Med «terapeutisk celle» menes en celle som er blitt transformert med en kimær ifølge oppfinnelsen, slik at den er i stand til å gjenkjenne og ødelegge et spesifikt infeksiøst agens, en celle infisert med et spesifikt agens, en svulst eller kreftcelle eller en autoimmun-utviklet celle. Slike terapeutiske celler er fortrinnsvis celler fra det hematopoietiske system.

Med et «mål-infeksiøst agens» menes et hvilket som helst infeksiøst agens (f.eks. et virus, en bakterie, protozo eller sopp) som kan gjenkjennes av en kimær reseptorbærende terapeutisk celle. Med en «målcelle» menes en hvilken som helst vertscelle som kan gjenkjennes av en kimær reseptorbærende terapeutisk celle. Målceller innbefatter, uten begrensning, vertsceller som er infisert med et virus, en bakterie, protozo eller sopp, så vel som tumor- eller kreftceller og autoimmun-utviklede celler.

Med «ekstracellulær» menes at i det minste en del av molekylet er eksponert på celleoverflaten. Med «intracellulær» menes at minst en del av molekylet er eksponert for den terapeutiske celles cytoplasma. Med «transmembran» menes at minst en del av molekylet strekker seg over plasmamembranen. En «ekstracellulær del», en «intracellulær del» og en «transmembran-del» kan i denne sammenheng inkludere flankerende aminosyresekvenser som strekker seg inn i tilstøtende cellulære rom.

Med «oligomerisere» menes kompleksdannelse med andre proteiner for å danne dimerer, trimerer, tetramerer eller andre høyere oligomerer. Slike oligomerer kan være homo-oligomerer eller hetero-oligomerer. En «oligomeriserende del» er den region av et molekyl som styrer kompleks- (dvs. oligomer) dannelse.

Med «cytolytisk» menes å være i stand til å ødelegge en celle (f.eks. en celle infisert med et patogen, en tumor eller cancerøs celle, eller en autoimmun-utviklet celle) eller være i stand til å ødelegge et infeksiøst agens (f.eks. et virus).

Med «immunsviktvirus» menes et retrovirus som i villtypeform er i stand til å infisere T4-celler i en primat-vert og som har en viral morfogenese og morfologi som er karakteristisk for lentivirus-subfamilien. Betegnelsen innbefatter, uten begrensning, alle varianter av HIV og SIV, inklusivt HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand og SIVcpz.

Med «MHC-uavhengig» menes at den cellulære cytolytiske respons ikke fordrer nærvær av et MHC-klasse 11-antigen på overflaten av den målsøkte celle.

Med et «funksjonelt cytolytisk signaloverførende derivat» menes et funksjonelt derivat (som definert ovenfor) som er i stand til å styre minst 10%, fortrinnsvis 40%, mer foretrukket 70% eller mest foretrukket, minst 90%, av den biologiske aktivitet av villtypemolekylet. I denne betydning kan et «funksjonelt cytolytisk signaloverførende derivat» virke ved å styre signaliseringen av den terapeutiske celle til å ødelegge et reseptorbundet agens eller celle (f.eks. når det er tale om en intracellulær kimær reseptor-del) eller virke indirekte ved å fremme oligomerisering med cytolytiske signaloverførende proteiner i den terapeutiske celle (f.eks. når det er tale om et transmembrant domene). Slike derivater kan testes med henblikk på effektivitet, f.eks. ved å benytte de her beskrevne in vitro bestemmelser.

Med et «funksjonelt HIV-kappebindende derivat» menes et funksjonelt derivat (som definert ovenfor) som er i stand til å binde et hvilket som helst HIV-kappeprotein. Funksjonelle derivater kan identifiseres, f.eks. ved å benytte de her beskrevne in vitro bestemmelser.

De transformerte cellene ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes terapeutisk for en rekke sykdommer. Dagens metoder for administrering av slike transformerte celler innebærer adoptiv immunterapi eller celleoverføringsterapi. Disse metodene muliggjør returnering av de transformerte immunsystem-cellene til blodstrømmen. Rosenberg, Sei. Am. 62 (mai, 1990); Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323:570 (1990).

De farmasøytiske blandingene kan administreres til et hvilket som helst dyr som kan oppleve de fordelaktige virkningene av cellene ifølge oppfinnelsen. Fremst blant slike dyr er mennesker, selv om oppfinnelsen ikke er ment å begrenses i så henseende.

Beskrivelse av tegningene

FIG. 1A er et skjematisk diagram som viser organiseringen av reseptor-kinasefusjonsproteiner. FIG. 1B viser strømningscytometri-resultater for CD16/7/zeta, CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk og CD16/7/ZAP-70 uttrykt av vaccinia rekombinanter i Jurkatceller. FIG. 1C viser in vitro kinaseaktivitetsbestemmelser av immunpresipiterte CD16/7/zeta (negativ kontroll), CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T),

CD16/7/Syk og CD16/7/ZAP-70; artene med lavere molekylmasse som fremkommer i Fyn-kimær-immunpresipitatet gjenstår å identifiseres. FIG. 2 viser kalsiumcytosol-respons utløst gjennom kryssbinding av kinasekimærer i TCR-negative Jurkat-celler. Den relative intracellulære kalsiumkonsentrasjon av den positive populasjon (målt ved forholdet mellom lndo-1 fiolett og blå fluorescens) er vist. Jurkat-celler infisert med vaccinia rekombinanter som uttrykker de forskjellige fusjonsproteinene, ble eksponert for anti-CD16 mAb 3G8 etterfulgt av fykoerytrin-konjugert geit F(ab')2 antistoffer mot mus IgG på tidspunktet 0. Kimærer basert på TCR zetakjede og FcRIIB2 tjener som henholdsvis positive og negative kontroller. FIG. 3 viser den for tidlig innsettende kalsiumrespons i TCR-positive celler som uttrykker Syk-kinasekimæren. Infeksjon og analyse ble foretatt som beskrevet ovenfor for FIG. 2. En vesentlig del av celler som uttrykker Syk-kimæren, oppviste et høyt forhold mellom fiolett og blå fluorescens før tilsetning av primært antistoff.

FIG. 4A og 4B viser en anti-hybridom-drepetest.

FIG. 4A viser prosentandelen frigjort <51>Cr-kromat fra hybridom-målceller som funksjon av forholdet mellom effektorceller (CTL-uttrykkende kinasekimær) og målceller. Celler som uttrykker reseptorkimærer som bærer de intracellulære domenene av TCR-zetakjeden og FcRIIB2 tjener som henholdsvis positive og negative kontroller. FIG. 4B viser spesifisiteten av drepingen (fravær av «bystander killing»). BW5147-celler (som mangler overflate anti-CD16-antistoff) ble ladet med <51>Cr-kromat og eksponert for CTL som uttrykker kinasekimærer under de samme betingelser som for en parallell prøve av kromat-ladede 3G8-celler (som uttrykker anti-CD16-antistoff. Det ble ikke iakttatt noen frigjøring av kromat fra BW5147-cellene. FIG. 5A, 5B og 5C viser at koekspresjon av ZAP-70 og Fyn eller Lek muliggjør induksjon av cytolyse og nedsetter latensen av kalsiumresponsen. CTL ble koinfisert med vaccinia rekombinanter som uttrykker de angitte kimærer, og analysert med henblikk på cytolytisk potensiale eller kalsium-mobilisering. Kimærenes effektivitet underestimeres i denne analysen siden den fraksjon av celler som uttrykker begge kimærer, ikke ble målt uavhengig av hverandre (den del av celler som uttrykker minst én kimær ble benyttet til å normalisere aktiviteten). FIG. 5A viser en cytolysebestemmelse som gjør bruk av CTL-uttrykkende CD16/7/kinase-kimærpar. FIG. 5B viser kalsiumrespons av PCR-negative celler som uttrykker CD16/7/kinase-kimærpar. FIG. 5C viser en cytolysebestemmelse av CTL som samtidig uttrykker en

CD4/CD7/Fyn-kimær og en CD16/CD7/ZAP-70 kimær. CD1677/zeta-kimæren tjener som den positive kontroll, mens CD16/7/FcRIIB2-kimæren tjener som den negative kontroll. FIG. 6A og 6B viser at kimærer som er bærere av kinasedelesjoner eller punktmutasjoner, er ineffektive med hensyn til kalsium-mobilisering og omdirigert cytolyse. Kinase-negative fusjonsproteinvarianter ble konstruert ved delesjon (når det gjelder Syk) eller punktmutasjon (når det gjelder ZAP-70) og undersøkt med henblikk på kalsiumrespons og cytolyse.

FIG. 6A viser kalsiumrespons i TCR-negative celler.

FIG. 6B viser en bestemmelse av omdirigert cytolyse.

FIG. 7A, 7B og 7C viser at kimærer basert på human Syk i det vesentlige er ekvipotente med kimærer basert på porcint Syk. FIG. 7A er sekvensen av humant Syk (SEKV. ID. NR:5) sammenlignet med porcint Syk (SEKV. ID. NR:6); de første 11 og siste 7 restene bestemmes av primersekvensene. FIG. 7B viser kalsium-mobiliseringsanalyse av TCR-negative celler som uttrykker human Syk-kimær. FIG. 7C viser en omdirigert cytolysebestemmelse av CTL som uttrykker human Syk-kimær. FIG. 8 viser endringer i tyrosinfosforyleringsmønsteret etter kryssbinding av kimære kinaser. T-celle-antigenreseptor-negative Jurkatceller som uttrykker de angitte kimærer eller kimærpar, ble behandlet med anti-CD16 og geit anti-mus IgG sekundært antistoff og deretter lysert, fraksjonert på en polyakrylamidgel, overført til nitrocellulose og probe-undersøkt med anti-fosfotyrosin antistoff. Baner merket«+» representerer ekstrakter fra celler underkastet kryssbinding, mens de som er merket med «-« ble lysert direkte uten forutgående eksponering for sekundært antistoff. Kontrollbaner ble frembragt ved lignende behandling av TCR-negative celler som uttrykker et CD1677-fusjonsprotein som ikke inneholdt et intracellulært domene. Til sammenligning er virkningene av anti-CD3-behandling av TCR-positive Jurkat-celler (med eller uten villtype vaccinia virusinfeksjon) vist til høyre. De fremtredende bånd i nærheten av 100 kD på venstresiden i denne rute tilsvarer kinasekimærenes forventede molekylmasser. FIG. 9 viser tyrosinfosforylering av fosfolipase C-y1 etter aggregasjon av kimærer. PLC-y1 ble immunpresipitert fra celler som var underkastet antistoff-kryssbinding, og immunpresipitatene ble fraksjonert på gel, overført til nitrocellulose og probe-undersøkt med anti-fosfotyrosin-antistoff. En betydelig økning av fosforylert

PLC-y1 ble registrert etter aggregasjon av Syk-kimærer, mens en mer begrenset, men lett påvisbar, økning sees etter koaggregasjon av Fyn og ZAP-70 kimærer. FIG. 10A og 10B viser in vitro kinasebestemmelser. Celler som uttrykker kimære kinaser ble underkastet antistoff-mediert kimær kryssbinding, hvoretter kinasene ble immunpresipitert og immunpresipitatene undersøkt med henblikk på fosforylering av endogent substrat. FIG. 10A viser en sammenligning av aktiviteten av immunpresipiterte kinasekimærer i løpet av en inkubasjonstid på 10 minutter, ved å benytte immunpresipitater isolert fra kryssbundne (+) eller ikke-kryssbundne (-) celler. FIG. 10B viser tidsforløpet for assimilasjon av fosfatmerking i endogene substrater med Syk-kinase-kimær med (+) eller uten (-) kryssbinding.

T-celleaktivering med ansamlede tyrosin-kinaser

Det etterfølgende er en beskrivelse av bestemte utførelsesformer av oppfinnelsen. I denne beskrivelsen vises det at ikke-reseptorkinaser aktiveres ved enkle ansamlings-begivenheter. Det ble frembragt kunstige reseptorkinaser hvis intracellulære domener besto av de fullstendige kinasesekvenser av Src- eller Syk-familie, og disse ble undersøkt med henblikk på konsekvensene av aggregasjon gjennom eksterne kryssbindende stimuli. Det fremkom en klar forskjell mellom Syk-og Src-familienes kinaseaktiviteter. Kryssbinding av sistnevnte førte ikke til vesentlig cellulær aktivering, mens kryssbinding av den førstnevnte førte til opptreden av frie intracellulære kalsiumioner, og, når det gjaldt Syk, av cytolytisk evne. ZAP-70-kimærers sviktende evne til å indusere distale reseptor-medierte programmer, kunne unngås ved samtidig av ansamlingsdannelse av ZAP-70-kimæren enten med Fyn-eller Lck-kinasekimærer. Eksemplene som beskrives nedenfor, har til hensikt å illustrere oppfinnelsen.

Konstruksjon av protein-tyrosin-kinase-kimærer og påvisning av effektivitet

Genfusjoner som kodet for proteiner som lignet celleoverflate-reseptorkinaser, ble konstruert ved å tilføye et DNA-fragment som kodet for det ekstracellulære domenet av CD16-molekylet, til et kort spacer-segment som kodet for membran-sammenstøtende og transmembrane domener av CD7, som på sin side var forbundet med de fullstendig kodende sekvenser av de humane Lek (Koga et al. Eur. J. Immunol. 16:1643-1646 (1986)), murine Fyn (T) (Cooke & Perlmutter, New Biol. 1:66-74 (1989)), porcine Syk (Taniguchi et al., J. Biol. Chem. 266:15790-15796 (1991)) og humane ZAP-70 (Chan et al., Cell 71:649-662 (1992)) tyrosinkinaser (Fig. 1A). De resulterende tredelte genfusjoner ble innført i rekombinante vaccinia virus ved homolog rekombinasjon og seleksjon for koekspresjon av E. coli gpt-genproduktet. Infeksjon av celler med rekombinantene resulterte i effektiv celleoverflate-ekspresjon av samtlige fire kinasekimærer (Fig. 1B). Immunpresipitering av de resulterende proteinkimærer med anti-CD16-antistoff, viste nærvær av molekylarter med forventede masser, som var aktive i en in vitro fosforyleringsbestemmelse (Fig. 1C).

Vi undersøkte deretter hvorvidt kryssbinding av fusjonsproteinene ville muliggjøre akkumuleringen av fritt intracellulært kalsium på en lignende måte som den man fant ved fusjonsproteiner basert på T-celle-antigenreseptorers intracellulære domener. For dette formål infiserte vi forskjellige celler med vaccinia rekombinanter og målte den relative kalsiumkonsentrasjon i cytoplasma etter kryssbinding av de ekstracellulære domener med antistoffer. Både spektrofluorimetriske (hovedpopulasjon) og strømningscytometriske (enkeltcelle) målinger ble foretatt med celler ladet med farvestoffet lndo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3440-3450

(1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952-961 (1986)). Strømningscytometriske analyser ble foretatt på data oppnådd fra celler hvis celleoverflate-ekspresjon av CD16, bestemt ved hjelp av fykoerytrin-fluorescensintensitet, falt innenfor et relativt snevert forutbestemt område. Selv om mindre variasjoner i den gjennomsnittlige fluorescensintensitet fremdeles ble observert innenfor dette området (som følge av forskjeller i den underliggende distribusjon av kimærer uttrykt av cellene), ga denne fremgangsmåte oss anledning til å holde responsene av celler som var bærere av tilnærmet samme antall reseptorer, opp mot hverandre. Figur 2 viser en analyse av data tatt fra celler av en mutasjonsvariant av Jurkat human T-celle leukemilinjen som manglet T-celle-antigenreseptor (Weiss & Stobo, J. Exp. Med. 160:1284-1299

(1984)). I disse cellene hadde hverken Lek- eller Fyn-kimærer evne til å mobilisere kalsium etter kryssbinding. I flere eksperimenter resulterte ansamling av Lck-fusjonsproteinet i en svak nedgang i hvilende kalsiumkonsentrasjon i forhold til den negative kontroll, et fusjonsprotein basert på det intracellulære domene av lavaffinitets IgG-reseptoren FcRIIB2 (Kolanus et al., EMBO J. 11:4861-4868 (1992)). Aggregasjon av fusjonsproteiner basert på både ZAP-70 og Syk, var meget effektive i å fremme forekomsten av frie kalsiumioner i cytoplasma, tilnærmet tike effektiv som aggregasjon av en lignende kimær som var bærer av det intracellulære domenet av T-cellereseptorens zetakjede. En svak forsinkelse i utløsningen av kalsiunvresponsen ble registrert med både ZAP-70- og Syk-kinasekimærer i forhold til tidspunktet for utløsning av kalsium-mobilisering gjennom zeta-kimæren. I T-cellereseptor-positive celler (Fig. 3), ble fluks-evaluering av Syk-kimærer delvis ødelagt av en høy hvilekonsentrasjon av frie kalsiumioner, hvilket tyder på et konstitutivt engasjement av kalsiumregutatorapparatet. Innføring av kimærene i en cytolytisk T-cellelinje ga oss deretter anledning til å bestemme fusjonsproteinenes evne til å gripe inn i effektorfunksjonen. Ved denne bestemmelse benyttes anti-CD16 hybridomceller som uttrykker celleoverflate IgG antistoff mot CD16 (Fleit et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79: 3275-3279 (1982); Shen et al., Mol. Immunol. 26:959-969 (1989)) som målceller. Hybridomcellene merkes ved inkorporering av <51>Cr-kromat og ko-sedimenteres med effektorceller, fremstillet ved infeksjon av en human allospesifikk cytotoksisk T-lymfocyttlinje (CTL) med vaccinia rekombinanter som uttrykker CD167CD7/kinase-fusjonsproteiner. Ekspresjon av de kimære reseptorkinasene gjør det mulig for de infiserte CTL-cellene å binde seg til målcellene, og om de er kompetente, til å lysere dem, en prosess som måles gjennom frigjøring av det inkorporerte <51>Cr-kromat. Den relative styrke av det armerte CTL bestemmes ved sammenligning av det forhold mellom effektor- og målceller som er nødvendig for å oppnå en gitt andel av <s1>Cr-frigjøring. Fig. 4A viser at CTL som uttrykker kimære reseptorer, omfattende Src-familiens kinaser Lek eller Fyn (T) eller Syk-familiens kinase ZAP-70, er ute av stand til å mediere cytolyse mot anti-CD16-hybridom-mål. CTL som uttrykker en kinasekimær basert på Syk-proteinproduktet, var imidlertid i det vesentlige like effektiv som CTL i å uttrykke en kimær sammensatt av CD16 fusjonert på samme måte til det intracellulære domene av T-cellereseptorens zetakjede. Den cytolytiske aktivitet som er styrt av CD16/CD7/kinasekimærene, kunne ikke tilskrives en uspesifikk frigjøring av cytotoksiske granuler siden ko-sedimentering av et irrelevant krom-ladet mål med det kinase-utstyrte CTL ikke resulterte i påvisbar frigjøring av merket krom (Fig. 4B). Vesensforskjellen mellom Syk- og ZAP-70-virkningene i cytolyse-bestemmelsen var uventet i betraktning av de lignende aktiviteter av de to kimærer i kalsiumrespons-bestemmelsen. I betraktning av påvisningen av at koekspresjon av ikke-kimære ZAP-70 og Src-familienes kinaser førte til aktivering i COS-celler (Chan et al., Cell 71:649-662 (1992)), foretok vi en vurdering av kinasekimærpars relative evne til å bevirke cytolyse. CTL-effektorer ble koinfisert med rekombinante vaccinia virus som kodet for ZAP-70- og Lck-kimærer, ZAP-70- og Fyn (T) kimærer eller Lek-og Fyn (T)-kimærer. Fig. 5A viser at koekspresjonen av ZAP-70- og Fyn (T)- kimærer eiler ZAP-70- og Lck-kimærer, forsynte CTL med aktivitet som i det vesentlige var tilsvarende sterk som den for CTL som uttrykker CD16/CD7/Syk-kinasekimærer alene, en aktivitet som på sin side er like sterk som den som oppvises av CD16/CD7/zeta-kimærer. Koekspresjon av Lek- og Fyn- (T) kimærer tillot ikke vesentlig den cytolytiske evne å bli omdirigert mot anti-CD16 målceller (Fig. 5A). Evaluering av den kalsium-mobiliserende evne til celler koinfisert med kinase-fusjonsproteinpar, viste at koekspresjon av ZAP-70- og Src-familie-kinasekimærer øket farten som kalsium ble mobilisert med som respons på reseptor-kryssbinding, og at koekspresjon av Lek- og Fyn (T) kimærer ikke resulterte i en signifikant akkumulering av fritt intracellulært kalsium (Fig. 5B). For ytterligere å utforske hvilken rolle Fyn-kimæren spiller for aktiveringsresponsen indusert gjennom koaggregasjon, fremstillet vi en Fyn-kimær bestående av de ekstracellulære og transmembrane domener av CD4 fusjonert til Fyn på lignende måte som den for CD16-kimærene. Fig. 5C viser at effektiviteten av denne kimær i der dirigerte cytolyse-bestemmelser, er 10 til 20 ganger lavere enn for den sammenlignbare CD16-kimær, hvilket tyder på at fysikalsk assosiering av de kimære kinaser er viktig for aktivering, den cytolytiske aktivitet av celler som uttrykker de to kimærene er imidlertid betydelig høyere enn hva som ville bli observert for celler som kun uttrykker ZAP-70-kimæren. På grunn av det relativt høye nivå av kinase-ekspresjon i dette system, kan det ikke utelukkes at den gjenværende aktivitet gjenspeiler spontan vilkårlig assosiasjon mellom CD4/Fyn-kimæren og CD16/ZAP-70. For å fastslå at aktiveringen som sees både i kalsiumrespons- og cytolyse-bestemmelsen direkte kunne tilskrives den relevante kinaseaktivitet, og ikke tii passiv assosiasjon av kinasene med eksisterende signaloverføringselementer, hvis indirekte aggregasjon deretter initierte aktiveringsresponsen, frembragte vi kinase-negative varianter av både de porcine Syk- og humane ZAP-70-reseptorkimærene. Fig. 6 viser at reseptorkimærer som enten manglet hele det vesentlige kinase-domenet (når det gjelder Syk) eller som bærer en punktmutasjon som opphever fosfotransferaseaktivitet (når det gjelder ZAP-70) manglet in vitro kinaseaktivitet og var ute av stand til å mediere kalsium-mobilisering etter kryssbinding eller til å mediere reseptor-omdirigert cytolyse. Siden interaksjonen mellom porcint Syk og det humane celleapparat ikke nødvendigvis er identisk med interaksjonen av humant Syk, konstruerte vi også lignende proteinkimærer basert på humant Syk, etter isolering av humane Syk-sekvenser ved hjelp av PCR med primere som tilsvarte amino- og karboksyl-endene av den porcine proteinsekvens. Fig. 7A viser at Syk fra svin og menneske er slående like proteiner, hvilket fremgår av analyse av PCR-produkter som tilsvarer deler av kinasen og de sekundære SH2-domenene (Chan et al., Cell 71:649-662 (1992)). I overensstemmelse med dette oppførte humane Syk-kimære reseptorproteiner seg i det vesentlige identisk med de porcine konstruksjonene i kalsiumfirgjørings- og cytolyse-bestemmelser (Fig. 7B og 7C). For å fastslå hvorvidt aggregasjon av de kimære tyrosin-kinasene resulterte i en vesentlig endring i rikeligheten av fosfotyrosin-protetner, ble T-cellereseptor-negative celler infisert med vaccinia rekombinanter som kodet for de kimære kinasene. De ekstracellulære domenene av kimærene ble kryssbundet med antistoffer, og totale cellelysater fra de aktiverte cellene ble fraksjonert ved elektroforese, overført til membraner og analysert med et antistoff som gjenkjenner fosfotyrosin. Lysatene ble fremstillet ved sprengning av celler i ikke-ioniske overflateaktive midler i nærvær av vanadat, med eller uten EDTA, eller ved lyse i nærvær av natriumdodekylsulfat og påfølgende ultralydbehandling for å kutte det frigjorte DNA. Mønsteret for fosfotyrosinproteinene var i hvert av tilfellene forskjellig, og lysater fremstillet med vanadat, men uten EDTA, viste ytterligere arter som ikke forekom i lysater fremstillet bare i SDS, hvilket tyder på at EDTA kan inhibere post-fyse-virkningen av tyrosinkinaser så vel som fosfataser. Anvendelsen av direkte lyse i SDS ble funnet å føre til mer reproduserbare mønstere for protein-tyrosin-fosforylering enn lyse med ikke-ioniske overflateaktive midler i nærvær av EDTA og vanadat. Fig. 8 viser at aggregasjon av kimærer som bære Syk, ZAP-70 eller Fyn pluss ZAP-70, resulterer i opptreden, eller øket fosforylering, av flere proteinarter som migrerer sammen med proteiner som oppviser øket fosforylering etter antigenreseptor-kryssbinding. Særlig er mønsteret av bånd som induseres av Syk-kimæransamling meget likt det mønster som induseres av anti-CD3-antistoff i T-cellereseptor-positve celler (Fig. 8). Blant disse er et ca. 150 kD protein indusert ved aggregasjon av Syk-kimærer, og også indusert ved koaggregasjon av Fyn- og ZAP-70-kimærer. I foreløpige forsøk ble det observert at dette fosfoprotein komigrerte med fosfolipase C-y (data ikke vist). For direkte å fastslå virkningene av kinase-kimæransamling på PLC-y, krysskoblet vi kimærer, presipiterte PLC-y med en blanding av monoklonale antistoffer og analyserte de resulterende immunpresipitater på nærvær av fosfotyrosyl-proteiner. Fig. 9 viser at ansamling av Syk resulterer i en vesentlig økning i tyrosinfosfat-innholdet i PLC-y, mens samtidig kryssbinding av Fyn- med ZAP-70-kimærer, resulterer i en dramatisk, men lett påvisbar økning av tyrosinfosfat. Celler som kun uttrykker Fyn-kimærer oppviste en beskjeden basal fosforylering av PLC-y som ikke øket etter reseptor-aggregasjon (Fig. 9). Hvorvidt de samme tyrosinrester fosforyleres av Syk, Fyn eller ZAP-70 pluss Fyn, er for tiden ukjent. Siden celler som uttrykker Fyn-kimæren hverken oppviste hvilende eller indusert kalsium-mobilisering, kan de fosfotyrosinsignaler som sees i disse cellene, representere utnyttelse av andre seter på PLC-y enn de som medierer fosfolipaseaktivering. I et foreløpig forsøk på å ta hensyn til endringer i fosfotyrosin-mønster, vurderte vi aktiviteten av de ulike kinaser etter ansamling (clustering) i en in vitro autofosforyleringstest. Kimærer ble aggregert, immunpresipitert og vurdert med henblikk på deres evne til å inkorporere fosfatmerking i proteinarter som forekom i immunpresipitatet. Fig. 10A viser at det under disse betingelsene ikke ble påvist noen økning i kinaseaktivitet etter kryssbinding, når kinasebestemmelsen ble foretatt i 10 minutter. Selv om inkorporering av merket fosfat fortsetter å øke i opptil 30 minutter under denne test, er det uklart hvilke faktorer som begrenser aktiviteten. Særlig kan de observerte kinetiske forhold være dominert av dissosiasjons-hastigheten av immunkompleksene som muliggjør kinase-diffusjon til uutnyttet substrat. I et forsøk på å styre denne effekt og på å maksimalisere testens følsomhet, bestemte vi også Syk-kinaseaktivitet med eller uten forutgående kryssbinding, over et meget kort tidsforløp fra 5 til 30 sekunder. Heller ikke her var det noen vesentlig økning i kinaseaktivitet (Fig. 10B). Selv om vi for øyeblikket ikke kan utelukke muligheten for at en aktivitetsøkning ville kunne påvises med et passende substrat, ble det heller ikke observert noen aggregasjons-indusert økning i Syk-kimæraktivitet når et eksogent peptidsubstrat (en Y19K substitusjon av cdc 2 restene 6-20) ble benyttet for å måle kinaseaktivitet.

Mulige mekanismer

Den mekanisme hvorved en enkel fysisk stimulus, reseptoraggregasjon, resulterer i overføring av et distinkt kjemisk signal til immunsystem-celler, er fremdeles ukjent. Tidligere studier har fastslått at kinaser av Src-familie kan finnes assosiert med mange av de viktige aggregasjonsaktiverte reseptorene i immunsystemet, og at kryssbinding av slike reseptorer ofte fører til øket kinaseaktivitet. Mer nylig har det vist seg at de beslektede Syk- og ZAP-70-kinasene assosierer enten stabilt (når det gjelder Syk) eller forbigående (når det gjelder ZAP-70) med henholdsvis B- og T-celleantigenreseptorer, og at reseptor-kryssbinding, i det minste når det gjelder Syk, har vært rapportert å resultere i øket kinaseaktivitet.

I dette arbeidet har vi vist at aggregasjon av kinaser av Syk-familie, men ikke Src-kinasene Lek eller Fyn, fører til en kalsiumrespons i celler som mangler T-cellereseptor. Responsen synes ikke å skyldes en indirekte assosiasjon med andre T-cellereseptor- eller signal-overførings-komponenter siden kinase-negative mutanter ikke kan indusere kalsiumresponsen. Aggregasjon av kimærer som inneholder Syk-kinasen er tilstrekkelig tit å tillate induksjon av spesifikk cytolyse, mens induksjon av lignende cytolyse med ZAP-70-kimær fordrer ytterligere deltagelse av en kinase av Src-familie. Det er for tiden uklart hvilke av kinasene av Syk-familie som sannsynligvis spiller en mer betydningsfull rolle ved T-celleaktivering, idet både ZAP-70 og Syk uttrykkes i T-celler, inklusivt de cellelinjer som er benyttet i denne undersøkelse, og minst én responderende human T-cellelinje ifølge spesifikke PCR-amplifikasjonsprodukter inneholder Syk, men ikke ZAP-70. Det mønster av øket protein-tyrosin-fosforylering som sees etter Syk-kimær-ansamling, er meget likt det mønster som sees etter kryssbinding av T-celle-antigenreseptoren.

En enkel modell for aktivering av immunsystemceller med ikke-reseptor tyrosin-kinaser påkaller en reseptor-assosiert kinase hvis aggregasjon fører til aktivering enten gjennom fysisk assosiasjon (f.eks. ved å danne aktive kinase-dimerer) eller ved gjensidig enzymatisk virkning (f.eks. kryss-fosforylering); hvoretter det aktiverte enzym virker på intracellulære nøkkelsubstrater som fordres for kalsium-mobilisering og inositolfosfat-syntese. Støtte for denne rekke av begivenheter finnes i studier som rapporterer økninger i reseptor-assosiert kinaseaktivitet etter reseptor-kryssbinding (f.eks. Bolen et al., Adv. Cancer Res. 57:103-149 (1991); Burkhardt et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:7410-7414 (1991); Eiseman & Bolen Nature 355:78-80 (1992); Hutchcroft et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-9111 (1992); Hutchcroft et al., J. Biol. Chem. 267:8613-8619 (1992); Tsygankovetal., J. Biol. Chem. 267:18259-18262

(1992); Wong et al., Oncogene 7:2407-2415 (1992)). De rapporterte endringer i kinaseaktivitet er imidlertid i de fleste tilfellene beskjedne og står i kontrast til de dramatiske endringer i fosfotyrosyl-proteinmønsteret som sees in vivo. Siden det er vanskelig utvetydig å avskrive aktivering gjennom svake allosteriske interaksjoner ved å benytte in vitro kinasebestemmelser som hjelpemiddel, kan vi på dette tidspunkt ikke gi et definitivt utsagn om den relative betydning av kinaseaktivering ved initieringen av signaltransduksjon. Men de her presenterte data tyder på at aggregasjonsindusert omfordeling av enzym og substrat kan være en viktig faktor ved styring av en eksisterende aktivitet mot det passende fysiologiske mål.

Aggregasjon av kimærer basert på kinaser av Syk-familie førte til en kalsiumrespons som var litt forsinket, men i amplitude tilsvarte den respons som sees etter aggregasjon av zeta-reseptorkimærer i celler som mangler endogen T-cellereseptor. En mer uttalt forsinkelse av opptredenen av frie kalsiumioner ble iakttatt etter 2AP-70-kimær kryssbinding, og denne forsinkelse kunne i det vesentlige oppheves ved samtidig kryssbinding av ZAP-70 og Fyn-kimærer. For øyeblikket er forklaringen for den observerte latens uklar. Siden den samtidige kryssbinding aksellererte kalsium-mobilisering, er det fristende å tilskrive forsinkelsen til den relative ineffektivitet av ZAP-70 for aggregasjons-mediert autoaktivering. Men andre faktorer kan være like viktige, og tjoringen av ZAP- og Syk-kinaser til celleoverflaten kan faktisk utgjøre en hindring for aktivering sammenlignet med den normale prosess. Dersom kinaser av Syk-familie i det normale begivenhetsforløp for eksempel forbigående rekrutteres til reseptor-ansamlinger, aktiveres og deretter frigjøres for å diffundere til deres substrater, vil den permanente kobling av kinase-domenet til plasmamembranen kunne virke innskrenkende ved å hindre adgang til substrat og/eller begrense signalforsterkning på grunn av at kimær-reseptorene ikke er i stand til å virke som et slags katalytisk senter for kinaseaktivering.

En annen særegenhet ved kalsiumresponsen var det funn at T-cellereseptor-positive celler som uttrykker kimærer basert på humant eller porcint Syk, oppviste en høy basislinjekonsentrasjon av frie kalsiumioner, som tyder på at kalsium-firgjøring var utløst spontant. Et lignende funn ble ikke observert i reseptor-negative celler. Dette resultat strider mot en generell tendens som vi har observert, hvor T-cellereseptor-negative mutanter av humane T-celle-tumorlinjer i alminnelighet er hyper-responsive for eksogent innførte utløsermolekyler. For å forklare det tilsynelatende behov for T-cellereseptor under den spontane aktiveringsprosess, foreslår vi to mulige og beslektede forklaringer. Den ene er at kimær Syk-kinase kan virke konstitutivt på T-cellereseptorers intracellulære domener for å frembringe fosfotyrosin-mål for SH2-domenene til reseptorkimæren, hvilket fører til intracellulær aggregasjon gjennom en multivalent T-cellereseptor-bro som så fremmer kinaseaktivering. En annen mulighet er at den T-cellereseptor-negative cellelinje kan ha lavere nivåer av en membran-assostert kinase som fordres for aktivering av Syk, enten på grunn av at en global regulatorkrets resulterer i nedgang i de novo syntese av den hypotetiske kinase, eller fordi fravær av antigenreseptor resulterer i en feilregulert intracellulær trafikkering.

I B-celler har Syk-kinasen vært rapportert å være konstitutivt assosiert med de intracellulære elementene av IgM-antigenreseptoren (Hutchcroft et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-9111 (1992); Hutchcroftet al., J. Biol. Chem. 267:8613-8619

(1992)). Den nøyaktige mekanisme for denne assosiasjon er uklar, men en mulighet er at fosfotyrosin ikke fordres for interaksjon mellom Syk SH2-domener og det tyrosin-utløsermotiv som forekommer i det cytoplasmatiske domene av mb1- og B29-reseptorkjedene. En delvis presedens for denne antydning er rapporten om at genproduktet for Philadelphia kromosom BCR (breakpoint duster region) binder seg til en rekke SH2-domener på en fosfotyrosin-uavhengig måte (Pendergast et al., Cell 66:161-171 (1991); Muller et al., Mol. Cell. Biol. 12:5087-5093 (1992)). I dette tilfelle synes det likevel sannsynlig at fosfoserin- og/eller fosfotreonin-rester spiller en avgjørende rolle for interaksjonen. Alternativt kan Syk assosiere med intracellulære IgM-reseptormotiver gjennom den unike region som er lokalisert mellom Syk SH2-elementene og det katalytiske domenet. En tredje mulighet er at bare en meget liten andel av tyrosin-fosforylert peptid fordres for å rekruttere funksjonelt viktige nivåer av Syk til den indre overflate av plasmamembranen og at dette lave tyrosin-fosfat-nivå så langt har unndratt seg påvisning.

Selv om behovet for en kinase av Src-familie for aktivering i B-celler ikke definitivt er fastslått, har to kinaser, Lek og Fyn (T) i T-celler ved somatisk eller «organismic» genetikk, vært vist å spille betydelige roller (Appleby et al., Cell 70:751-763 (1992); Karnitz et al., Mol. Cell. Biol. 12:4521-4530 (1992); Stein et al., Cell 70:741-750 (1992); Straus & Weiss, Cell 70:585-593 (1992)). For øyeblikket kan vi ikke med sikkerhet avgjøre hvorvidt virkningene av disse kinasene normalt går forut for, eller følger virkningen av, kinasene av Syk-familie. En hypotese som kan forklare virkningen av ZAP-70 ved T-celleaktivering, påberoper seg en reseptor-assosiert kinase av Src-familie, hvis aggregasjon tillater en forbigående fosforylering av reseptorkjeder som så fører til assosiering av ZAP-70 og påfølgende cellulær aktivering. Den initiale fosforylering av reseptorkjeder som er foreslått for denne modell, må holdes adskilt fra den stabile fosforylering av zeta som sees over lengre tid etter reseptor-kryssbinding.

I murine T-celler inneholder en liten del av T-cellereseptorkomplekser et zeta-beslektet molekyl betegnet eta (Baniyash et al., J. Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988)) som representerer en alternativt spleiset form (Clayton et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:5202-5206 (1991)). Eta adskiller seg fra zeta i karboksylenden og mangler den mest distale av de seks tyrosiner som forekommer i murin zeta (Jin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:3319-3323 (1990)). Selv om fosforyleringen av zetakjeden av murine TCR zeat-zeta-isoformer lett kan påvises etter antistoff-mediert reseptor-kryssbinding, er TCR-etakjeden under lignende omstendigheter, ikke-fosforylert slik at den kan påvises (Bauer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:3842-3846 (1991)). Stabil fosforylering av zetakjeden synes å fordre to nær anbragte zetakjeder siden TCR-isoformer som er bærere av zeta-eta heterodimerer ikke fosforyleres etter reseptor-kryssbinding (Bauer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:3842-3846 (1991)). På tross av forskjellene I fosforylering er cellelinjer som omfatter TCR-isoformer som kun består av eta-homodimerer, funksjonelt ikke å skjelne fra cellelinjer som kun bærer zeta-homodimerer. (Bauer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:3842-3846

(1991)). Fosforylering av zeta, som observert 30 minutter etter antistoff-mediert reseptoraggregasjon, korrelerer således ikke med aktivering. I en separat undersøkelse har eksaminering av tidsforløpet for akkumulering av fosfotyrosin-fosfoproteiner etter TCR-aggregasjon, vist at de tidligst registrerbare arter er to proteiner med masse 135 og 100 kD, hvis fosforylering først lar seg påvise henholdsvis 5 og 15 sekunder etter kryssbinding, og hvis halve maksimale fosforylering, i begge tilfeller ved ca. 36 sekunder, går forut for tidspunktene for halv maksimal kalsium-mobilisering og inositolfosfat-dannelse (June et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:7722-7726 (1990); June et al., J. Immunol. 144:1591-1599

(1990)). Derimot er fosforyleringshastigheten for zeta vesentlig langsommere og fører til halv maksimal substitusjon ca. tre til fem minutter etter stimulering, godt etter at kalsium-akkumulering og frigjøring av inositolfosfater er observert (June et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:7722-7726 (1990); June et al., J. Immunol. 144:1591-1599

(1990)).

Dersom totrinnsmodellen er korrekt, må den nødvendige tyrosinfosforylering for å rekruttere ZAP-70 til den innvendige overflate av plasmamembranen, være en hurtigere, antagelig forbigående, begivenhet, enn observert i studiene ovenfor. Det har nylig vært foreslått at tyrosinfosforylering med en passende hurtig (ca. 15 sekunder) inntreden kan påvises på både zeta- og CD3 epsilonkjeder etter reseptor-kryssbinding (Wange et al., J. Biol. Chem. 267:11685-11688 (1992)), og at et 70 kD protein som bærer tyrosinfosfat, kan finnes assosiert med både zeta- og epsilonkjeder. Det er for tiden ikke klart hvorvidt en stabil assosiasjon med fosforylerte reseptorkjeder er en forutsetning for vellykket T-celleaktivering.

Som en generefl påstand tyder de her rapporterte resultater likevel på at kinaser av Syk-familie virker mer direkte på effektorapparatet av T-celler enn kinaser av Src-familie. En økende mengde av indikasjoner tyder på at kinaser av Src-familie kan assosiere med en rekke celleoverflatemolekyler som ikke er medlemmer av antigen/Fc-reseptorfamilien, inklusivt CD2 (Bell et al., Mol. Cell. Biol. 12:5548-5554

(1992)), CD23 (Sugie et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:9132-9135 (1991)), CD36 (Huang et al., J. Biol. Chem. 267:5467-5473 (1992)), IL-2 reseptor betakjeden (Hatakeyama et al., Science 252:1523-1528 (1991)) og forskjellige fosfatidylinositol-forankrede proteiner (Stefanova et al., Science 254:1016-1019 (1991); Thomas & Samelson, J. Biol. Chem. 267:12317-12322 (1992)), hvorav enkelte som kjent fordrer ytterligere nærvær av antigenreseptoren for å fremme aktivering i T-celler. En enkel forklaring for sistnevnte krav kan være at utløsermotivene på antigenreseptoren virker som substrater for kinaser av Src-familie, hvilket muliggjør den senere plassering av kinaser av Syk-familie, muligens etterfulgt av en annen modifiserende begivenhet som fremmer deres aktivering. I betraktning av vanskeligheten med å etablere en årsakskjede av fosforylering og aktivering, kan det også hende at utløsermotivene bare har en forbigående rolle, nemlig å virke som et slags katalytisk sentrum for rekruttering, aktivering og frigjøring av effektorkinaser.

Kinaser av Src-familie er vidt utbredt gjennom de ikke-hematopoietiske opphav, og nylige studier ved å benytte Fyn-negative mus, har vist at Fyn spiller en rolle for underholdet av langstids potensiering, det fenomen av forenklet synaptisk transmisjon som antas å ligge til grunn for den initiale konsolidering av assosiativ hukommelse (Grant et al., Science 258:1903-1910 (1992)). Dersom lignende aktiveringsbaner medieres av kinaser av Src-familie i andre celletyper, kan kinaser av Syk-familie også vise seg å være mer utstrakt fordelt i de ekstra hematopoietiske rom.

Eksperimentelle metoder

Konstruksjon av kimærer. Hele de kodende regioner av det humane Lek (Koga et al., Eur. J. Immunol. 16:1643-1646 (1986)), murine Fyn (T) (Cooke & Perlmutter, New Biol. 1:66-74 (1989)), porcine Syk (Taniguchi et al., J. Biol. Chem. 266:15790-15796

(1991)) og humane ZAP-70 (Chan et al., Cell 71:649-662 (1992)) kinaser ble forbundet med det intracellulære domenet av et kimært transmembrant protein bestående av det CD16 ekstracellulære domenet forbundet med et kort «stilk» segment og transmembrandomenet av CD7. Det intracellulære CD7-domenet ble trunkert ved stopp-overføringssekvensen ved addisjon av et Mlu-sete. De forskjellige kinasene ble forsynt med et Mlu-sete i passende leseramme for å kunne uttrykke et tredelt fusjonsprotein. Syk-sekvensen fra svin ble oppnådd ved revers transkripsjon og PCR av totalt lymfocytt RNA fra svin ved å benytte primere som var bærere av passende restriksjonsseter. ZAP-70-sekvenser ble oppnådd på lignende måte ved PCR fra et humant T-celle cDNA-bibliotek. Flere isolater ble sekvensert parallelt, og en mutasjonsfri kodende sekvens for hver kinase ble fremskaffet ved restriksjonsfragment-utskiftning. De resulterende kodende sekvenser ble satt inn i en vaccinia virus ekspresjonsvektor nedstrøms fra CD16/CD7-sekvensene. Human Syk ble isolert fra et cDNA-bibliotek fra en naturlig drepercelle og fra et Daudi-cellebibliotek ved å benytte primere som tilsvarte endene av den porcine sekvens. Forover primeren hadde sekvensen atg gca gac agt gcc aac cac ttg ccc ttc ttc t (SEKV. ID. NR:7) og den reverse primer hadde sekvensen cgc ggg gcg gcc gct tta att cac cac gtc gta gta gta (SEKV. ID. NR:8). Etter at den første amplifisering viste nærvær av bånd med den forventede størrelse, ble det foretatt en reamplifisering (10 runder) ved å benytte en ekstensjonsprimer i 5'-enden som hadde sekvensen cgc ggg acg cgt acc atg gca gac agt gcc aac (SEKV. ID. NR:9) som gjorde det mulig å ligere fragmentet til en Mlu l-kuttet vektor.

Kalsium-mobiliseringsanalyse.

Strømningscytometriske og hovedspektrofotometriske analyser ble foretatt på celler som uttrykker rekombinante kinaser ved å benytte den kalsium-følsomme fluorofor, lndo-1, som tidligere beskrevet (Romeo & Seed, Cell, 64:1037-1046 (1991); Romeo et al., Cell 68:889-897 (1992)). I korthet ble celler av den mutante Jurkat-sublinje JRT 3.T 3.5 (Weiss & Stobo, J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984)) infisert med rekombinante vaccinia virus i 1 time i serumfritt IMDM ved en MOI på 10 og inkubert i 3 til 9 timer i IMDM, 10% FBS. Celler ble oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert som 3 x 10<6> celler/mL i komplett medium inneholdende 1 mM lndo-1 - acetometoksyester (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3440-3450 (1985))

(Molecular Probes, Eugene, OR) og inkubert ved 37°C i 45 minutter. De lndo-1-

ladede cellene ble pelletert og resuspendert som 1 x 10<6>/mL i serumfritt IMDM og oppbevart ved romtemperatur i mørke. Cellene ble analysert på frie kalsiumioner ved samtidig måling av den fiolette og blå fiuorescens-emisjon ved strømningscytometri (Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952-961 (1986)). For å initiere kalsium-strømningen ble enten ukonjugert 3G8 (anti-CD16) monoklonalt antistoff (som 1 fi<g>/mL) tilsatt til cellesuspensjonen, etterfulgt av 10 ng/mL fykoerytrin (PE) - konjugert F(ab')2 geit anti-mus IgG på tidspunktet 0, eller et PE-konjugert anti-CD4-antistoff (Leu-3a, Becton Dickinson) tilsatt, etterfulgt av det ukonjugerte andre antistoff. Histogrammer av fiolett/blått emisjonsforholdet ble samlet fra den PE-posttive (infiserte) cellepopulasjon som i alminnelighet utgjorde 40-80% av cellene. Forholdet fiolett/blått emisjon før tilsetningen av antistoff, ble benyttet for å fastlegge det normaliserte initiale forhold som ble satt lik 1.

Lymfocytt-cytolysebestemmelse

En CD8<+> CD4" HLA B44-begrenset cytolytisk linje (WH3), ble opprettholdt i IMDM, 10% humant serum med 100 U/mL IL-2 og periodevis stimulert med bestrålte (3000 rad) mononukleære celler som hadde HLA B44 haplotypen. Cellene ble dyrket i minst 10 dager etter stimulering før bruk i cytotoksisitetsbestemmelser. Cellene ble infisert med rekombinant vaccinia med en MOI på minst 10, i serumfritt medium i 1 time og deretter inkubert i komplett medium i 3 timer. Cellene ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i en tetthet på 1 x 107/mL 100 nL ble tilsatt til hver brønn i en mikrotiterplate med U-formet bunn inneholdende 100 nL/brønn komplett medium. Cellene ble fortynnet til det halve i en rekke trinn. To brønner for hver prøve inneholdt ikke lymfocytter for å kunne måle spontan kromfrigjøring og totalt kromopptak. En alikvot på 10<6> 3G810-2 målceller (Shen et al., Mol. Immunol. 26:959-969 (1989)) ble sentrifugert og resuspendert i 50 \ iL sterilt <51>Cr-natriumkromat (1 mCi/mL, Dupont) i 1 time ved 37°C under leilighetsvis blanding, og deretter vasket tre ganger med PBS. 100 \ iL merkede celler, resuspendert i medium til 105 celler/mL, ble tilsatt til hver brønn. Mikrotiterplaten ble sentrifugert ved 750 x g i 1 minutt og inkubert i 4 timer ved 37°C. Etter inkuberingsperioden ble cellene i hver brønn resuspendert ved forsiktig pipettering, en prøve tatt ut for å bestemme den totalt inkorporerte telling og mikrotiterplaten sentrifugert ved 750 x g i 1 minutt. 100 pi. supernatant-alikvoter ble tatt ut og tellet i en gamma scintillasjonsteller. Forholdet mellom effektor og mål ble korrigert for prosentandelen infiserte effektor-celler (vanligvis >70%).

Konstruksjon av mutante kinase-kimærer

En variant av et porcint Syk-kinase-negativt fusjonsprotein ble frembragt ved å spalte kimæren med Stu I og Not I (hvor sistnevnte ligger umiddelbart 3' for karboksylenden), utfylling av Not l-setet og sammenligering av endene. Den resulterende sekvens koblet de første 298 restene av Syk fra svin til fire fremmede rester (GPRL) før terminering. En punktmutasjon (K369G) i ATP-bindingssetet til ZAP-70 ble skapt ved insersjon av et dupleks oligonukleotid-fragment mellom Ball- og Earl-setene lokalisert mellom nukleotidrestene 1319 og 1345 av den øverste kjede av sekvensen rapportert av (Chan et al., Cell 71:649-662 (1992)). Den resulterende sekvens koder for glycin i rest 369 i stedet for lysin.

Immunpresipitasjon og kinase-bestemmelse

Ca. 2 x 10<6> HeLa S3-celler i serumfritt DME-medium, ble infisert i 1 time med rekombinant vaccinia ved en MOI på minst ti. 5 timer etter infeksjon ble cellene høstet, vasket to ganger med fosfatbuffret saltvann og lysert i 1% Triton X-100,

0,15 M NaCI, 0,02 M HEPES, pH 7,3, 5 mM EDTA, 5 mM NaF, 0,2 mM Na3V04,

10 ng/mL leupeptin, 10 jag/mL aprotinin og 1 mM PMSF. Etter inkubering på is i 10 minutter, ble kjernene fjernet ved sentrifugering og CD16-fusjonsproteinene immunpresipitert med antistoff BMA209/2 og protein-A sepharose. Den fusjonsprotein-ladede harpiks ble vasket tre ganger med lyseringsbuffer etterfulgt av en avsluttende vask med 20 mM HEPES, pH, 7,3, Hver prøve ble deretter tilsatt 10 nl_ kinasebuffer (20 mM HEPES, pH, 7,3,10 mM MgCI2,10 mM MnCI2), inneholdende 10 \ iCi fy-<32>P]ATP (>3000 Ci/mmol). Blandingen fikk inkuberes ved romtemperatur i 10 minutter, hvorpå reaksjonen ble avbrutt ved tilsetning av 20 \ iL av 2X prøve-ladningsbuffer (4% SDS, 100 mM Tris, pH 6,8, 20% glycerol og 10% p-merkatoetanol). Etter at prøven var kokt i 3 minutter, ble alikvoter kjørt på en 4-15% gradientgel. Kinase-bestemmelser med et løselig peptidsubstrat tilsvarende posisjon 6-20 av cdc 2, hvor tyr 20 var erstattet med lys, ble foretatt i henhold til produsentens anbefalinger (UBI).

Immunblott-analyse av protein-tyrosin-fosforylering

TCR negative 3.5 celler ble infisert med rekombinante virus-forråd (MOI på minst 10) i 1 time. Celler ble deretter inkubert ved 37°C i 8-12 timer, sentrifugert, vasket og resuspendert i lscove's medium med serum til 107 celler per mL Alikvoter av celler ble inkubert med anti-CD16 mAb (3G8, Medarex eller BMA209/2, Behringwerke) til 1 \ ig antistoff per 2-3 x 10<6> celler. Stimulerte prøver ble inkubert ytterligere med et 3-5 gangers overskudd av et affinitetsrenset anti-mus lgG1 antistoff (Southern Biotechnology) i 5 minutter. Celler ble deretter behandlet i henhold til Secrist et al., J. Biol. Chem. 268:5886-5893 (1993) med visse små modifikasjoner. Inkuberingen ble avbrutt ved tilsetning av SDS til en sluttkonsentrasjon på 1% og prøvene kokt i 3 minutter. DNA ble kuttet ved ultralydbehandling i 1 minutt ved å benytte en Heat Systems Ultrasonics, Inc., 2X prøvebuffer ble tilsatt, og alikvoter tilsvarende 10<5> til 2,5 x 10<5> celler ble separert på polyakrylamidgel og proteinene overført gjennom halvtørr elektrobiotting (Hoefer) over på nitrocellulose (Schleicher & Schuell BA45). Filterne ble blokkert i 1 time i Trisbuffret saltløsning med 0,05% Tween-20- (TBST) holdig 1,5% hønse-ovalbumin (Sigma), vasket i TBST og overført til en løsning inneholdende anti-fosfotyrosin-antistoff 4G10 (UBI) i en 1:10.000 fortynning og inkubert ved 22°C i 1-2 timer. Etter vask med TBST ble filterne inkubert i TBST og en 1:5000 fortynning av anti-mus pepperrotperoksydase-konjugat i 1 time. Fosforylerte proteinbånd ble påvist ved kjemiluminescens (ECL, Amersham). Eksponeringstidene varierte fra 2 sekunder til 5 minutter.

Konstruksjon av humane IgGLprotein-tyrosin-kinase-kimærer

Det kan fremstilles kimære molekyler som innbefatter det ekstracellulære domene av et antistoffmolekyl som er spesifikt for en målcelle, og det intracellulære domenet av en protein-tyrosin-kinase (f.eks. de her beskrevne kinaser). Humane lgG1 tungkjede-sekvenser ble fremstillet ved å koble sekvenser i CH3-domenet til et cDNA-fragment avledet fra 3'-enden av den transmembrane form av antistoff mRNA. 3'-endefragmentet ble oppnådd ved PCR (polymerase chain reaction) ved å benytte et tonsill cDNA-btbliotek som substrat og oligonukleotider med sekvensene:

som tilsvarer henholdsvis 5'- og 3'-endene av de ønskede DNA-fragmentene. 5'-oligonukleotidet er komplementært til et sete i CH1-domenet av humant lgG1, og 3'-oligonukleotidet er komplementært til et sete umiddelbart 5' for de sekvensene som

koder for det membran-omspennende domenet. PCR-produktet ble kuttet med BstXI og BamHI og ligert mellom BstXI- og BamHI-setene av et halvsyntetisk lgG1-antistoffgen som bærer variable og konstante regioner. Etter insersjon av BstXI til BamHI-fragmentet, ble de amplifiserte deler av konstruksjonen erstattet opp til Smal-setet i CH3 ved restriksjonsfragment-utveksling slik at bare delen mellom Smal-setet og 3-oligonukleotidet skrev seg fra PCR-reaksjonen.

For å frembringe en human lgG1 kimær-reseptor ble genet for den tunge kjede som ender i BamHI-setet, koblet til det interessante intracellulære kinasedomenet ved hjelp av standardteknikk. Graden av kimær reseptorekspresjon kan bestemmes ved strømningscytometri. Øket ekspresjon kan oppnås gjennom koekspresjon av et plasmid som koder for en antistoff lettkjede cDNA.

For å frembringe en enkelt transkripsjonsenhet som ville tillate at både tunge og lette kjeder ble uttrykt fra en enkelt promotor, ble et plasmid som koder for et bisistronisk mRNA fremstillet fra tung- og lett-kjede kodende sekvenser, og den 5'-utranslaterte del av det mRNA som koder for det 78 kD glukoseregulerte protein som ellers er kjent som grp78 eller BiP. grp78-sekvenser oppnås ved PCR av human genomisk DNA ved å benytte primere med sekvensene:

henholdsvis i 5'- og 3'-endene. Med disse oligonukleotidene ble PCR foretatt i nærvær av 10% dimetylsulfoksyd. Fragmentet oppnådd ved PCR ble kuttet med Noti og Hincll og satt inn mellom Noti- og Hpal-seter nedstrøms fra humane lgG1-kodende sekvenser. Sekvenser som koder for en human IgG-kappa lettkjede cDNA, ble deretter satt inn nedstrøms fra grp78-ledersekvensen ved å benytte Hincll-setet og et annet sete i vektoren. Det ekspresjonsplasmid som var resultat av disse manipulasjonene besto av det halvsyntetiske tungkjede-genet, etterfulgt av grp78-ledersekvensene, etterfulgt av kappa lettkjede cDNA-sekvensene, etterfulgt av polyadenyleringssignaler avledet fra et SV40 DNA-fragment. Vi har tidligere vist at transfeksjon av COS-celler med ekspresjonsplasmidet ga en markert forbedret ekspresjon av tungkjede determinanter sammenlignet med transfeksjon av plasmid som kun koder for tung-kjede determinanter.

For å frembringe et bisistronisk gen som omfatter en tungkjedeAreseptorkimær og en lett kjede, kan oppstrøms tungkjede-sekvensene erstattes med et hvilket som helst av de her beskrevne kimære tungkjede/reseptorgener.

Når IgG-tyrosin-kinase-kimærene er konstruert, kan de klones inn i en ekspresjonsvektor, innføres i en vertscelle og testes ved hjelp av en hvilken som helst av de her beskrevne bestemmelser (f.eks. ved bestemmelse av kalsium-mobilisering eller cytolyse).

Konstruksjon av CD4 tyrosin-kinase-kimærer

Det kan fremstilles kimære molekyler som inkluderer det ekstracellulære domenet av CD4 molekylet og det intracellulære domenet av en protein-tyrosin-kinase (f.eks. de beskrevne kinaser). For å fremstille et slikt molekyl isoleres den tyrosin-kinase-kodende sekvens (for eksempel cDNA) (for eksempel som beskrevet ovenfor). Denne sekvens kobles deretter til det ekstracellulære domenet av en manipulert form av CD4 som har et BamHI-sete umiddelbart oppstrøms for det membran-omspennende domene (Aruffo et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 84:85738577

(1987); Zettlmeissel et al., DNA Cell Biol. 9 347-353 (1990)) ved hjelp av standardteknikker. For å danne dette fusjonsprotein, kan et BamHI-sete settes inn i sekvensen i den riktige lokalisering (igjen ved hjelp av standardteknikker). Genfusjonene innføres i et vaccinia virus-ekspresjonsplasmid (som her beskrevet), og settes inn i genomet til vaccinia WR-stammen ved homolog rekombinasjon og seleksjon med henblikk på vekst i mykofenolsyre (Falkner et al., J. Virol. 62:1849-1854 (1988); Boyle et al., Gene 65:123-128 (1988)). Strømningscytometrisk analyse benyttes for å undersøke ekspresjon av vaccinia rekombinantene av CD4-tyrosin-kinase-fusjonsproteinene på celleoverflaten. Immunpresipitasjon av celler infisert med vaccinia rekombinantene benyttes for å bekrefte resultatene (som beskrevet ovenfor).

Effektiviteten av CD4-kimærer kan testes ved hjelp av en av de her beskrevne kalsium-mobiliserings- eller cytolyse-bestemmelser. I et bestemt eksempel frembringes en modell av et måheffektor-system basert på CD4 gjenkjenning av HIV-kappe gp120/gp41 -komplekset. HeLa-celier infiseres med rekombinante vaccinia virus som uttrykker gp120/gp41 (Chakrabarti et al., Nature 320:535-537 (1986), Earl et al., J. Virol. 64:2448-2451 (1990)) og merkes med51 Cr. De merkede cellene inkuberes med celler fra en human allo-spesifikk (CD8<+>, CD4") cytotoksisk T-lymfocyttlinje som er blitt infisert med vaccinia rekombinanter som uttrykker CD4-tyrosin-kinase-kimæren, og undersøkes på spesifikk lyse.

Som kontroll for den mulighet at vacctnia-infeksjon skulle kunne fremme artefaktisk gjenkjenning av CTL, foretas lignende cytolyseforsøk med målceller infisert med vaccinia rekombinanter som uttrykker den fosfatidyl-inositol-koblede form av CD16 (CD16pi) og merkes med 51 Cr og med CTL infisert med kontroll-rekombinanter som uttrykker CD16-kimærer.

I henhold til et annet eksempel er nøytrofile granulocytter, som har en meget kort levetid («4 timer) i kretsløpet og er intenst cytolytiske, attraktive celler for ekspresjon av CD4-tyrosin-kinase-kimærer. Infeksjon av nøytrofiler med HIV forventes ikke å resultere i virus-frigjøring, og rikeligheten av disse cellene (de mest fremherskende av leukocyttene) burde lette vertens forsvar. En annen tiltalende mulighet for vertsceller er modne T-celler, en populasjon som for tiden er tilgjengelig for retroviral manipulering (Rosenberg, Sei. Am. 262:62-69 (1990)). Ved hjelp av rekombinant IL-2, kan T-cellepopulasjoner relativt lett ekspanderes i kultur, og de ekspanderte populasjonene har i alminnelighet en begrenset levetid etter at de er reinfusert (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323:570-578 (1990)).

Under de rette betingelsene burde HIV-gjenkjenning av celler som uttrykker CD4-kimærer også gi mitogene stimuli og gi mulighet for at den armerte cellepopulasjon kan gi dynamisk respons på virusbelastningen. Selv om vi her har fokusert på fusjonsproteinenes oppførsel i cytolytiske T-lymfocytter, vil ekspresjon av kimærene i hjelper-lymfocytter kunne gi en HIV-mobilisert kilde av cytokiner som kunne motvirke sammenbruddet av hjelpercelle-subsettet ved AIDS. Nylige beskrivelser av flere skjemaer for å frembringe resistens mot infeksjon på andre trinn enn virus-penetrering (Friedmann et al., Nature 335:452-454 (1988); Green et al., Cell 58:215-223 (1989); Malim et al., Cell 58:205-214 (1989); Trono et al., Cell 59:113-120

(1989); Buonocore et al., Nature 345:625-628 (1990)) tyder på at celler som bærer CD4-kimærer, kunne konstrueres for å forpurre virusproduksjon gjennom ekspresjon av passende midler som har et intracellulært virkningssete.

Evnen til å overføre signaler til T-lymfocytter gjennom autonome kimærer gir også mulighet for regulering av retroviralt konstruerte lymfocytter in vivo. Kryssbindende stimuli, mediert for eksempel av spesifikke IgM-antistoffer konstruert for å fjerne komplement-bindingsdomener, kan la slike lymfocytter få anledning til å øke i antall in situ, mens behandling med lignende spesifikke IgG-antistoffer (som for eksempel gjenkjenner en aminosyre-variant manipulert inn i den kimære kjede) selektivt kunne utarme den manipulerte populasjon. Vi har tidligere fastslått at anti-CD4 IgM-antistoffer ikke fordrer ytterligere kryssbinding for å mobilisere kalsium i Jurkatceller som uttrykker CD4:i;-kimærer. Evnen til å regulere cellepopulasjoner uten å gripe til gjentatt ekstrakorporeal amplifikasjon, kan i vesentlig grad utvide området og effektiviteten av nåværende anvendelser foreslått for genetisk manipulerte T-celler.

Kombinasjonskontroll av kinase-kimærer og CD28 kimære reseptorer

Påvisningen av at enkelte kinase-kimærer (som ZAP-70 og kinase-kimærer av Src-familie) bare kan virke i fellesskap med direkte cytolytisk dreping, gir en mulighet for å kontrollere den cytolytiske respons gjennom bruk av passende kimære kinasepar. Denne tilnærmingsmåte er særlig fordelaktig på området anti-tumorterapi, siden de ekstracellulære domenene av kimærparene kan konstrueres slik at de gjenkjenner og binder flere determinanter på tumorcelleoverflater. Først etter binding av hver enkelt av determinantene (og dermed etter involvering for eksempel av ZAP-70 og kinaser av Src-familie) effektueres en sterk cytolytisk respons. Denne måte øker terapeutisk spesifisitet ved å minske sannsynligheten og hyppigheten av destruksjon av ikke-cancerøse celler.

I et spesielt eksempel kan et kimærpar innbefatte to ulike ekstracellulære domener som hver gjenkjenner et distinkt antigen som er karakteristisk for en målsøkt tumor. Et slikt kimærpar kan gjenkjenne to ubeslektede molekyler på tumoroverflaten (for eksempel to distinkte proteinaktige celleoverflatemarkører), eller paret kan gjenkjenne to forskjellige attributter på det samme molekyl (for eksempel et antigent protein og et antigent karbohydrat assosiert med det samme celloverflate-protein). Eksempler på tumorantigener innbefatter, uten begrensning, et hvilket som helst av en rekke karbohydrater (f.eks. Le<Y>, sialyl-Le<Y>, Lex, og sialyl-Le<x>), karsinoembryonalt antigen, CD40, modifisert CD44, ot-føtoprotein, T- og Tn-antigenene, tenascin og vekstfaktor-reseptorer (f.eks. HER2/neu).

Siden T-celleaktivering har vært vist å økes gjennom deltagelse av CD28 inkluderer oppfinnelsen dessuten også terapeutiske celler som uttrykker kimær-reseptor-sett, hvorav det ene inkluderer det intracellulære domenet av CD28 og et annet (eller flere) som inkluderer et hvilket som helst av de her beskrevne intracellulære protein-tyrosin-kinase-domener. I et gitt sett av kimære reseptorer, kan de ekstracellulære domenene være identiske (for eksempel kan alle være avledet av CD4-proteinet og alle således gjenkjenne HIV eller en HlV-infisert celle), eller som diskutert ovenfor, hver være konstruert for å gjenkjenne et forskjellig mål-molekyl på overflaten av en celle eller et patogen.

Denne kombinasjons-kontrollmetode kan utvides til et hvilket som helst antall samvirkende kimære reseptorer (for eksempel kan den benyttes med kombinasjoner av ZAP-70 og kinasekimærer av Src-familie eller, alternativt kan den benyttes med en kombinasjon av en CD28-kimær, en ZAP-70-kimær og en kinasekimær av Src-familie for å lette videre kombinasjonskontroll). Den kan dessuten benyttes for å regulere en hvilken som helst terapeutisk metode ifølge oppfinnelsen.

CD28 kimærer konstrueres og uttrykkes i henhold til de metodene som her er beskrevet. CD28-sekvensen er angitt i Aruffo & Seed (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:8573-8577 (1987)). Denne referanse innbefatter også beskrivelser av de CD28 intracellulære og transmembrane domenene. Et eksempel på et kimær som har et intracellulært CD28-domene er omtalt av Romeo et al., (Cold Spring Harbor Symp. On Quant. Biol. LVII:117-125 (1992)).

Andre utførelsesformer

For å frembringe andre kimærer bestående av protein-kinase intracellulære sekvenser, kan cDNA- eller genomiske sekvenser som koder for et ekstracellulært domene av reseptoren, utstyres med et restriksjonssete som innføres på et sted umiddelbart foran det foretrukne ekstracellulære domenet. Det ekstracellulære domenefragment som ender i restriksjonssetet, kan deretter forbindes med protein-kinase-sekvensene. Typiske ekstracellulære domener kan avledes fra reseptorer som gjenkjenner komplement, karbohydrater, virusproteiner, bakterier, protozo- eller metazo-parasitter eller proteiner som induseres av disse. Likeledes kan ligander eller reseptorer som uttrykkes av patogener eller tumorceller, kobles til protein-kinase-sekvenser for å rette immunresponser mot celler som bærer reseptorer som gjenkjenner disse ligandene.

For å påvise de protein-kinase-sekvenser som i det minste trengs for cytolyse, kan en rekke delesjonsmutanter fremstilles ved hjelp av standardteknikker hvor suksessivt mer av det intracellulære kinasedomenet fjernes. Slike delesjonsmutanter testes med henblikk på effektivitet etter en hvilken som helst av de her beskrevne bestemmelsesmetoder. Egnede intracellulære domener for Syk proteinkinasen innbefatter for eksempel aminosyrene 336-628 av den porcine Syk-sekvens og aminosyrene 338-630 av den humane Syk-sekvens. Egnede intracellulære domener for kinaser av Src-familie innbefatter for eksempel SH2- og SH3-domenene.

Idet oppfinnelsen her er beskrevet i sammenheng med spesifikke utførelsesformer av denne, vil det være klart at den kan modifiseres ytterligere, og at denne patentsøknad er ment å dekke variasjoner, anvendelser eller tilpasninger av oppfinnelsen, og inkluderer slike avvik fra den foreliggende beskrivelse som ligger innenfor det fagområde som oppfinnelsen tilhører og som kan anvendes for de essensielle trekk som er omtalt ovenfor og som følger av rammen for de etterfølgende patentkrav.

Claims

1. Terapeutisk T-lymfocyttcelle som uttrykker en første membran-bundet, proteinaktig kimær reseptor, karakterisert ved at den omfatter; (a) en intracellulær del av en protein-tyrosin-kinase, og (b) en ekstracellulær del som er i stand til spesifikt å gjenkjenne og binde en reseptorbundet målcelle eller et reseptorbundet mål-infeksiøst agens, og en andre membranbundet proteinaktig kimær reseptor omfattende; (a) en ekstracellulær del som er i stand til å binde nevnte målcelle eller nevnte mål-infektiøse agens, og (b) en intracellulær del som er avledet fra CD28, hvor nevnte første og nevnte andre reseptorer spesifikt gjenkjenner og binder nevnte målcelle eller nevnte infektiøse agens, og hvor hver av nevnte terapeutiske celler er i stand til spesifikt å gjenkjenne og ødelegge nevnte målcelle eller nevnte mål-infeksiøse agens.

2. T-lymfocyttcelle ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte protein-tyrosin-kinase tilhører kinasefamilen Syk.

3. T-lymfocyttcelle ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte protein-tyrosin-kinase er Syk.

4. T-lymfocyttcelle ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte intracellulær del innbefatter de svin Syk-aminosyrene 336-628 eller human Syk-aminosyrene 338-630.

5. T-lymfocyttcelle ifølge krav 1, hvor hver av nevnte terapeutiske celler uttrykker en tredje membran-bundet, proteinaktig kimær reseptor, hvor nevnte tredje kimære reseptor omfatter; (a) en intracellulær del av en andre protein-tyrosin-kinase som er i stand til å gi signal til nevnte terapeutiske celle om å ødelegge en reseptor-bundet målcelle eller et reseptor-bundet mål-infeksiøst agens og (b) en ekstracelluær del som er i stand til spesifikt å gjenkjenne og binde nevnte målcelle eller nevnte mål-infeksiøse agens, hvorved hver av de nevnte terapeutiske cellene er i stand til spesifikt å gjenkjenne og ødelegge en målcelle eller et mål-infeksiøst agens.

6. T-lymfocyttcelle ifølge krav 5, karakterisert ved at én av nevnte protein-tyrosin-kinaser tilhører kinasefamilien Syk og den andre av nevnte protein-tyrosin-kinaser tilhører kinasefamilien Src.

7. T-lymfocyttcelle ifølge krav 5, karakterisert ved at en av nevnte protein-tyrosin-kinaser er ZAP-70 og den andre av nevnte protein-tyrosin-kinaser er Fyn.

8. T-lymfocyttcelle ifølge krav 5, karakterisert ved at en av nevnte protein-tyrosin-kinaser er ZAP-70 og den andre av nevnte protein-tyrosin-kinaser er Lek.

9. T-lymfocyttcelle ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at nevnte ZAP-70 del innbefatter humant ZAP-70 Tyr 369.

10. T-lymfocyttcelle ifølge krav 1 eller 5, karakterisert ved at nevnte T-lymfocyttcelle er en cytotoksisk T-lymfocyttcelle.

11. T-lymfocyttcelle ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte mål-infeksiøse agens er et immunsviktvirus.

12. T-lymfocyttcelle ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte ekstracellulære del omfatter en HIV-kappebindende del av CD4.

13. T-lymfocyttcelle ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte terapeutiske celler ved cytolyse, ødelegger nevnte reseptor-bundne målcelle eller mål-infeksiøse agens.

14. T-lymfocyttcelle ifølge krav 1 eller 5, karakterisert ved at nevnte binding er MHC-uavhengig.

15. T-lymfocyttcelle ifølge krav 1 eller 5, karakterisert ved at nevnte ekstracellulære del omfatter den ligand-bindende del av en reseptor, den reseptor-bindende del av en ligand, den antigen-bindende del av et antistoff, eller et funksjonelt derivat derav.

16. DNA som koder for et sett av kimære reseptorer, nevnte sett er karakterisert ved at det omfatter en første membran-bundet, proteinaktig kimær reseptor omfattende; (a) en intracellulær del av en protein-tyrosin-kinase, og (b) en ekstracellulær del som er i stand til spesifikt å gjenkjenne og binde en reseptor-bundet målcelle eller et reseptor-bundet mål-infeksiøst agens, og en andre membran-bundet proteinaktig kimær reseptor omfattende; (a) en ekstracellulær del som er i stand til å binde nevnte målcelle eller nevnte mål-infektiøse agens, og (b) en intracellulær del som er avledet fra CD28, hvor nevnte første og nevnte andre reseptorer spesifikt gjenkjenner og binder nevnte målcelle eller nevnte infektiøse agens, og hvor hver av nevnte terapeutiske celler er i stand til spesifikt å gjenkjenne og ødelegge nevnte målcelle eller nevnte mål-infektiøse agens.

17. Vektor, karakterisert ved at den omfatter den kimære reseptor DNA ifølge krav 16.