HU225689B1

HU225689B1 - Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras

Info

Publication number: HU225689B1
Application number: HU9800459A
Authority: HU
Inventors: Brian Seed; Charles Romeo; Waldemar Kolanus
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1996-01-24
Publication date: 2007-06-28
Also published as: HUP9800459A3; CA2209301A1; WO1996026265A1; DE69636053D1; FI973466A; US20020176851A1; CA2209301C; EP0812352A4; NZ501340A; NZ302090A; EP0812352B1; DK0812352T3; DE69636053T2; US5912170A; AU703125C; NO973863L; NO321459B1; AU4767596A; CZ260197A3; HUP9800459A2

Description

A találmány tárgyát funkcionális protein-tirozin kináz kimérák képezik, amelyek képesek immunrendszeri funkciók célzott irányítására. Közelebbről, a találmány tárgyát limfociták, makrofágok, természetes ölősejtek (,,killer”-sejtek) vagy granulociták szabályozása képezi, az említett sejtekben olyan kimérák expresszálásán keresztül, amelyek a sejtekben, a kimérák által felismert célpontokkal szemben válaszreakciót váltanak ki. A találmány tárgyát képezik továbbá funkcionális protein-tirozin kináz kimérák, melyek képesek terápiás sejteket úgy irányítani, hogy azok specifikus módon felismerjenek és elpusztítsanak adott fertőző ágenssel fertőzött sejteket, magát a fertőző ágenst, tumorsejteket vagy olyan sejteket, melyekben autoimmun folyamatok indultak meg. Közelebbről, a találmány tárgyát olyan protein-tirozin kináz kimérák előállítása képezi, amelyek képesek citotoxikus T-limfocitákat HlV-burokproteineket expresszáló sejtek specifikus felismerésére és lizálására késztetni.

A találmány tárgyát képezik ezenfelül a fenti protein-tirozin kináz kimérákat expresszáló sejtek, ilyen kimérákat kódoló DNS-ek, valamint a fenti DNS-eket tartalmazó vektorok. A találmány tárgyát képezik továbbá új, tumorellenes terápiás eljárások, valamint olyan betegségek kezelésére alkalmazható terápiás eljárások, mint például a HIV-vírus által okozott AIDS („Acquired Imminodeficiency Syndrome, szerzett immunhiányos szindróma).

A találmány szerinti eljárások alkalmazhatók tumorellenes terápia céljára, autoimmun betegségek kezelésére, valamint fertőző ágensek okozta betegségek, például a szerzett immunhiányos szindróma (AIDS) kezelésére.

Antigének T-sejtek által történő felismerése a T-sejt-receptoron keresztül immunológiai jelenségek széles skálájának alapját képezi. A T-sejtek irányítják az úgynevezett sejt által közvetített immunitást. Ez vonatkozik idegen szöveteknek vagy fertőzött sejteknek az immunrendszer sejtjei által történő elpusztítására. Különböző T-sejtek ismertek, ezen belül „helper”- és „szupresszor”-sejtek, amelyek az immunválasz szabályozásában játszanak szerepet, valamint citotoxikus („killer) sejtek, amelyek közvetlenül képesek rendellenes sejtek elpusztítására.

Egy másik sejt felszínén megjelenő egyedi antigén felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes T-sejt aktiválódik, majd osztódásnak indulhat, és amennyiben az citotoxikus sejt, képes a kötődött sejt elpusztítására.

Autoimmun betegségek létrejöttét gazdaszövettel reagálni képes ellenanyagok termelődése vagy autoreaktív immuneffektor T-sejtek jelenléte jellemzi. Egyes esetekben autoellenanyagok keletkezhetnek olyan idegen anyagok vagy organizmusok által aktivált, normális T-sejtes, valamint B-sejtes válaszon keresztül, amelyek a gazdaszervezet szövetében található, hasonló vegyületekkel keresztreagáló antigéneket tartalmaznak. Klinikai szempontból jelentős autoellenanyagok például myasthenia gravis esetében az acetil-kolin-receptorokkal szemben termelődő ellenanyagok; valamint a szisztémás lupus erythematosus esetében kimutatható anti-DNS, antieritrocita és antivérlemezke ellenanyagok.

HÍV és annak immunpatogenezise

1984-ben mutatták ki, hogy az AIDS kórokozója HIV-vírus. Azóta az AIDS definíciója többször változott arra vonatkozólag, hogy a diagnózisnak milyen ismérveken kell alapulnia. A diagnosztikai paraméterek változékonyságának ellenére azonban az AIDS egyszerű általános jellemzője a HIV-vírussal történő fertőződés, majd azt követően állandó szervi tünetek és az AIDS-tünetegyüttest meghatározó betegségek kifejlődése, úgymint másodlagos fertőzések, neoplazmák és idegrendszeri betegségek jelentkezése [„Harrison’s Principles of Internál Medicine, 12. kiadás, „McGraw Hill” (1991)].

A HÍV a lentivírusok csoportjába tartozó humán retrovírus. Az eddig ismert négy humán retrovírus két, egymástól elkülöníthető csoportra osztható: a humán T-limfotróp (vagy leukémia-) retrovírusok közé tartoznak a HTLV-1 és a HTLV-2, a humán immundeficiencia-vfrusok közé tartoznak a HIV-1- és a HIV-2-vírusok. Az előbbiek transzformációt előidéző vírusok, míg az utóbbiak citopatogén vírusok.

A HIV-1-vírust a világon az AIDS leggyakoribb okozójaként azonosították. A HIV-2 és HIV-1 között kimutatható szekvenciaazonosság körülbelül 40%, és a HIV-2 közelebbi rokonságban áll a majom-immundeficlenciavírusok (SIV) csoportjának egyes tagjaival [lásd Curran és munkatársai: Science 329, 1357 (1985); Weiss és munkatársai: Natúré 324, 572 (1986)].

A HÍV tartalmazza a szokásos retrovírusgéneket (env, gag és pol), ezenkívül tartalmaz hat olyan gént, amelyek a vírusreplikációjában és egyéb biológiai aktivitásaiban játszanak szerepet. Amint azt a fentiekben megállapítottuk, az AIDS szokásos ismérve súlyos immunszuppresszió, elsősorban a sejt által közvetített immunitás szuppressziója. Ez az immunszuppresszió különböző opportunista betegségekhez vezet, közelebbről bizonyos fertőzések és neoplazmák kialakulásához vezet.

Megállapították, hogy az immunhiány fő oka AIDSben a timuszeredetű (T) limfociták alcsoportjának, a T4-populációnak mennyiségi és minőségi elégtelensége. Ezt a sejtalcsoportot fenotípusosan CD4-molekulák sejtfelszíni jelenléte jellemzi, amelyről kimutatták, hogy a HÍV sejtreceptora [Dalgleish és munkatársai: Natúré 312, 763 (1984)]. Bár a T4-sejtek képviselik a HÍV által elsősorban fertőzött sejttípust, lényegében bármely, a felszínén CD4-molekulát expresszáló humán sejt képes HIV-hez történő kötődésre és azzal történő fertőződésre.

A CD4⁺-T-sejteknek hagyományosan „helper/inducer” szerepet tulajdonítanak, utalva arra, hogy funkciójuk aktiválószignál közvetítése a B-sejtek számára, vagy a reciprok, CD8-markerrel rendelkező T-limfociták indukálása citotoxikus/szupresszor sejtekké történő átalakulásra [Reinherz és Schlossman: Cell 19, 821 (1980); Goldstein és munkatársai: Immunoi. Rév. 68, 5 (1982)].

HU 225 689 Β1

A HÍV a vírusburokban található aminosavszakaszon keresztül (gp120) specifikusan és nagy affinitással kötődik a CD4-molekula N-terminális végének közelében található V1-régió részletéhez. A kötődést követően a vírus a célsejt membránjával fuzionálódik, és a sejtbe jut. Miután a sejtbe került, a vírus genomi RNS-e reverz transzkriptáz enzim segítségével DNS-sé íródik át, amely beépül a sejt DNS-ébe, ahol az a sejt további élete során „provírusként” van jelen.

A provírus maradhat latens állapotban, vagy aktiválódhat, ezáltal mRNS-sé és genomi RNS-sé íródhat át, ez pedig proteinszintézishez, összeépüléshez, új virionok keletkezéséhez, és a sejtfelszínen át vírusok kiszabadulásához vezethet. Bár annak a mechanizmusnak a részletei még nem ismertek, amelyen keresztül a vírus a sejt pusztulását okozza, feltehető, hogy a fő mechanizmus a sejtfelszínen át történő tömeges vírusfelszabadulás, amely a plazmamembrán károsodásához és az ozmotikus egyensúly felborulásához vezet.

A fertőzés folyamán a gazdaszervezetben ellenanyagok termelődnek a vírusproteinekkel szemben, például a gp120 és gp41 elnevezésű, fő burokglikoproteinekkel szemben. A humorális immunitás ellenére a betegség előrehalad, halálos kimenetelű immunszuppressziót eredményezve, melyet opportunista fertőzések sokasága, parazitémia, dementia és halál jellemeznek. Az a tény, hogy a gazdaszervezet vírusellenes ellenanyagai nem képesek megakadályozni a betegség előrehaladását, képezi a betegség legnyugtalanítóbb és legriasztóbb sajátságainak egyikét, és nem sok sikert jósol a szokásos eljárásokon alapuló vakcinázási próbálkozásoknak.

Az immundeficiencia-vírusokkal szemben létrejövő humorális válasz hatékonyságának meghatározásában két faktor játszhat szerepet. Először, más RNS-vírusokhoz hasonlóan (és különösen retrovírusokhoz hasonlóan), az immundeficiencia-vírusok magas mutációs aránnyal válaszolnak a gazdaszervezet immunrendszere által történő beavatkozásra. Másodszor, a burokglikoproteinek nagymértékben glikozilezett molekulák, amelyek nagy affinitású ellenanyag-kötődés számára kevés alkalmas epitópot mutatnak fel. A vírusburok által képviselt gyenge antigénhatású célpont a gazdaszervezet számára kevés lehetőséget teremt a vírusfertőzés specifikus ellenanyagok termelődésével történő visszaszorítására.

A HIV-vírussal fertőzött sejtek felszínükön expresszálják a gp120-glikoproteint. A gp120-burokprotein, hasonló reakción keresztül, mely révén a vírus a nem fertőzött sejtekbe bejut, fúzió létrejöttét közvetíti a CD4*-sejtek közt, rövid életű, többmagvú óriássejtek keletkezéséhez vezetve. A szincíciumképződés a gp120 elnevezésű burokglikoproteinnek a CD4-proteinnel történő közvetlen kölcsönhatásán alapul [Dalgleish és munkatársai: lásd fent; Klatzman és munkatársai: Natúré 312, 763 (1984); McDougal és munkatársai: Science 231, 382 (1986); Sodorski és munkatársai: Natúré 322, 470 (1986); Lifson és munkatársai: Natúré 323, 725 (1986); Sodorski és munkatársai: Natúré 321, 412(1986)].

A bizonyítékok között, melyek szerint a CD4-gp120-kötődés felelős a CD4-antigént hordozó sejtek vírussal történő fertőződéséért, megemlítendő az a tény, hogy a gp120 és CD4 specifikus komplexet képez [McDougal és munkatársai: lásd fent]. Más kutatók kimutatták, hogy HIV-vírussal nem fertőzhető sejtvonalak fertőzhető sejtvonalakká váltak azt követően, hogy azokat humán CD4-cDNS-génnel transzfektálták, és azokban a gén expresszálódott [Maddon és munkatársai: Cell 46, 333(1986)].

Számos kutatócsoport olyan terápiás programok kidolgozását javasolta, és azok alkalmazását in vitro sikeresen szemléltette, amelyek oldható CD4-antigén alkalmazásán alapulnak, melyet passzív ágensként, a vírusadszorpció gátlására és a szincícium által közvetített, sejtről sejtre történő vírusátvitel megakadályozására használtak [Deen és munkatársai: Natúré 3321, 82 (1988); Fisher és munkatársai: Natúré 331, 76 (1988); Hussey és munkatársai: Natúré 331, 78 (1988); Smith és munkatársai: Science 238, 1074 (1997); Traunecker és munkatársai: Natúré 331, 84 (1988)]; ezt követően elnyújtott felezési idővel és mérsékelt biológiai aktivitással rendelkező CD4-immunglobulin fúziós proteinek kifejlesztésére is sor került [Capon és munkatársai: Natúré 337, 525 (1989); Traunecker és munkatársai: Natúré 339, 68 (1989); Byrn és munkatársai: Natúré 344, 667 (1990); Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi. 9, 347 (1990)]. Bár a CD4-immunotoxin-konjugátumok vagy fúziós proteinek a fertőzött sejtekkel szemben in vitro jelentős citotoxikus hatást mutatnak [Chaudhary és munkatársai: Natúré 335, 369 (1988); Till és munkatársai: Science 242, 1166 (1988)], az immundeficiencia-szindróma kialakulásának latenciaideje valószerűtlenné teszi azt, hogy bármely egyszeri kezelésből álló terápia hatékony lehetne a vírusterhelés megszüntetésére, ezenfelül az idegen fúziós proteinek antigenitása valószínűleg korlátozza azok alkalmazhatóságát ismételt adagolást szükségessé tevő kezelésekben. SIV-vírussal fertőzött majmokon végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy oldható CD4, olyan állatoknak beadva, melyek nem szenvednek jelentős CD4-citopéniában, képes a SIV-titer csökkentésére és a mieloid funkciók in vitro fokmérőiként használt eredmények javítására [Watanabe és munkatársai Natúré 337, 267 (1989)]. A kezelés megszakítását követően azonban megfigyelhető volt a vírus azonnali újbóli megjelenése, ami azt jelenti, hogy az immunrendszer előrehaladó legyengülésének megelőzése érdekében a kezelésre az egész élet során szükség lehet.

Sejtfelszíni receptorral kapcsolódó protein-tirozin kinázok

Az immunrendszerben sejtek közreműködését igénylő effektorprogramok megindítására az első lökést gyakran csoportosult ligandumok sejtek által történő felismerése jelenti. Az ismereteink szerint aggregáció révén aktivációt kiváltó szignálokat közvetítő receptorok közé tartoznak a B-sejt- és T-sejt-antigén-receptorok [DeFranco: Eur. J. Biochem. 210, 381 (1992); Weiss: Annu. Rév. Génét. 25, 487 (1991)], az IgG- és

HU 225 689 Β1

IgE-Fc-receptor-családok tagjai [Fanger és munkatársai: Immunoi. Today 10, 92 (1989); Ravetch és Kínét: Annu. Rév. Immunoi. 9, 457 (1991)], ezenkívül számos járulékos receptor, például a T-sejteken található CD2-, CD4-, CD8- és CD28-receptorok [Yokoyama és Shevach: Year Immunoi. 4, 110 (1989)] és a B-sejteken található CD19-, CD20-, CD21- és CD40-receptorok [Clark és Ledbetter: Adv. Cancer Rés. 52, 81 (1989)], valamint monocitákon található CD44-, CD45- és CD58-receptorok [Webb és munkatársai: Science 249, 1295 (1990)]. Ezenkívül számos foszfolipiddel kapcsolódó protein antigénreceptor-függő módon elősegíti a sejtaktiválást, amennyiben T-sejtek felszínén keresztkötésekkel kapcsolódnak [Balk és Terhorst: Immunoi. Ser. 45, 411 (1989); Kroczek és munkatársai: Natúré 322, 181 (1986); Yeh és munkatársai: J. Immunoi. 138, 91 (1987); Yokoyama és Shevach: Year Immunoi. 4, 110(1989)].

Ma még nem világos, miként tud egy egyszerű fizikai esemény, nevezetesen az aggregáció, nyilvánvalóan megkülönböztethető fiziológiai jeleket létrehozni. A T-sejt- és B-sejt-antigén-receptorok és különböző Fc-receptor-formák által közvetített sejteffektorprogramok beindításának folyamatát utánozhatjuk az egyes receptor-komplex láncok intracelluláris doménjaival rendelkező kiméraproteinek közti keresztkötések létrehozásával [Irving és Weiss: Cell 64, 891 (1991); Kolanus és munkatársai: EMBO J. 11, 4861 (1992); Letourner és Klausner: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8905 (1991); Letournerés Klausner: Science 255, 79 (1992); Romeo és Seed: Cell 64, 1037 (1991); Wegener és munkatársai: Cell 68, 83 (1992)]. A legkisebb, még hatékony, aktivációt kiváltó elem úgy tűnik, 10-11 aminosavval elválasztott és hidrofil, tipikusan savas környezetbe ágyazott két tirozint tartalmazó, filogenetikailag konzervált peptidszekvencia [Reth: Natúré 338, 383 (1989)] [Romeo és munkatársai: Cell 68, 889 (1992); Irving és munkatársai: J. Exp. Med. 177, 1093 (1993)]. A fenti elemet tartalmazó receptorok csoportosulása aktivációs láncreakciót indít meg, melyben a protein-tirozin kináz (PTK) aktivitása alapvető fontosságúnak tűnik; PTK-inhibitorok mind a B-sejt- és T-sejt-aktiválásban szerepet játszó korai eseményeket - például a kalciummobilizációt -, mind a citokinfelszabadulással és sejtproliferációval járó késői következményeket megakadályozzák [June és munkatársai: J. Immunoi. 144, 1591 (1990); Lane és munkatársai: J. Immunoi. 146, 715 (1991); Mustelin és munkatársai: Science 247, 1584 (1990); Stanley és munkatársai: J. Immunoi. 145, 2189 (1990)]. Bár a receptoraktiválás távolabbi következményei sejttípustól függően változnak, a korai események meglepően hasonlóak a különböző hemopoetikus (vérképzőrendszeri) sejtvonalakhoz tartozó sejtek esetében. Például a B-sejt-antigén-receptorok [Gold és munkatársai: Natúré 345, 810 (1990); Campbell és Sefton: EMBO J: 9, 2125 (1990)], a T-sejt-antigén-receptorok [June és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7722 (1990); June és munkatársai: J. Immunoi. 144, 1591 (1990)] és a nagy affinitású IgE-receptorok [Eisman és Bólén: Natúré 355, 78 (1992); Li és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 3176 (1992)] közti keresztkötések kialakulását követően megfigyelhető gyorsan növekvő PTK-aktivitásban, valamennyi esetben, a korai foszforilezési célpontok között szerepel a foszfotidil-inozitol-specifikus foszfolipáz-C ünizoformja [Carter és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2745 (1991); Li és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 3176 (1992); Park és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 24 237 (1991); Park és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5453 (1991); Secrist és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 12 135 (1991); Weiss és munkatársai: Annu. Rév. Génét. 25, 487 (1991)], amely közvetlenül tirozinfoszforilezés révén aktiválódik [Nishibe és munkatársai: Science 250, 1253 (1990)].

Ismereteink szerint a sejtfelszíni receptorokkal kapcsolatos, PTK-aktivitású molekulák két csoportba oszthatók: a protoonkogénnel rokonságot mutató Src-kinázok családjába és a nemrégiben leírt Syk-kinázzal rokonságot mutató csoportba. Az előbbiek közül, a Fyn-kinázról kimutatták, hogy a T-sejt-receptorral kapcsolódik [Gassmann és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 22, 283 (1992); Samelson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4358 (1990)], a Lyn-, Fyn-, Blk- és Lck-kinázokról leírták, hogy a B-sejteken található IgM-receptorokkal kapcsolódnak [Burkhardt és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7410 (1991); Campbell és Sefton: Mól. Cell. Bioi. 12, 2315 (1992); Yamanashi és munkatársai: Science 251, 192 (1991)], és a Lyn-, valamint Yes-kinázokról kimutatták, hogy a nagy affinitású IgE-receptorral kapcsolódnak [Eiseman és Bólén: Natúré 355, 78 (1992); Hutchcroft és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992); Hutchcroft és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 8613 (1992)]. A megfigyelt kapcsolódás mechanizmusának részletei még nem tisztázottak, de előzetes adatok arra utalnak, hogy a receptor-komplex láncok intracelluláris doménja és az Src-családba tartozó kinázok között fizikai kapcsolat jön létre [Clark és munkatársai: Science 258, 123 (1992); Timson Gauen és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 5438 (1992)]. Még nem világos, hogy ez a kapcsolat közvetlen vagy közvetett.

Az Src-családba tartozó kinázok sejtaktiválásban betöltött fontos szerepére vonatkozólag eddig a legmeggyőzőbb bizonyítékot a T-sejtekben található Fynés Lck-kinázok vizsgálata szolgáltatta. A Fyn-kináz nagy mennyiségben történő expresszálása transzgenikus egerekben antigénhiperszenzitív fenotípust eredményez a keletkező T-sejtekben, míg a katalitikusán inaktív forma nagy mennyiségben történő expresszálódása gátolja a T-sejt-receptor által közvetített proliferációt [Cooke és munkatársai: Cell 65, 281 (1991)]. Fyn-kináz-aktlvitással nem rendelkező mutáns egerekből izolált, timuszeredetű T-sejtek azon képessége súlyosan károsodott, hogy forbol-észter, valamint anti-CD3-ellenanyag vagy konkavalin-A kombinációjával történő kezelés hatására proliferációval válaszoljanak [Appleby és munkatársai: Cell 70, 751 (1992); Stein és munkatársai: Cell 70, 741 (1992)]. Ilyen egerekből izolált, léperedetű T-sejtek kevésbé súlyos, de jelentős mértékben gyengült sejtaktivációs választ mutatnak

HU 225 689 Β1 [Appleby és munkatársai: Cell 70, 751 (1992); Stein és munkatársai: Cell 70, 741 (1992)].

T-sejtekben a Lck-kináz a CD4- és CD8-koreceptorokon keresztül, közvetett módon kapcsolódik a T-sejt-receptorral (TCR-receptorral) [Rudd és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5190 (1988); Shaw és munkatársai: Cell 59, 627 (1989); Tumer és munkatársai: Cell 60, 755 (1990); Veillette és munkatársai: Cell 55, 301 (1988)]. A Lck-kináz nagy mennyiségben történő expresszálása antigén-válaszreakcióra képes sejtvonalban, a Fyn-kináz esetében megfigyeltekhez hasonló módon, fokozza a receptorérzékenységet [Abraham és Viliette: Mól. Cell. Bioi. 10, 5197 (1990); Davidson és munkatársai: J. Exp. Med. 175, 1483 (1992); Luo és Sefton: Mól. Cell. Bioi. 12, 4724 (1992)]. Egy CD4-dependens, egérT-sejtes hibridómamodellben az antigénspecifikus „helper”-funkció helyreállítása csak CD4-molekulákkal volt elérhető, melyek képesek voltak Lck-kinázzal kölcsönhatásba lépni [Glaichenhaus és munkatársai: Cell 64, 511 (1991)].

A legmeggyőzőbb bizonyíték arra vonatkozólag, hogy az Lck-kináz közvetlenül részt vesz az antigénreceptor által közvetített jelátvielben, Lck-kinázt nem tartalmazó, mutáns sejtvonalak vizsgálatából származik. Két ilyen sejtvonalat tanulmányoztak, az egyik a Jurkat-féle humán T-sejtes leukémia-sejtvonalból [Goldsmith és Weiss: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6879 (1987); Straus és Weiss: Cell 70, 585 (1992)], a másik a CTLL2 jelzésű, egér citotoxikus T-sejtklónból származott [Karnitz és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 4521 (1992)]. Mindkét Lck-negatív, mutáns sejtvonalban károsodott a TCR-receptor által közvetített jelátvitel, és mindkét mutáns sejtvonalban, Lck-kinázt expresszáló plazmiddal végzett transzfekcióval történő komplementációval helyreállítható a TCR-keresztkötések által jelentett stimulusra létrejövő válaszkészség [Karnitz és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 4521 (1992); Straus és Weiss: Cell 70, 585 (1992)].

Nemrégiben a tirozinkinázok új családjának tagjairól mutatták ki, mely család első képviselői az egymással közeli rokonságban álló vagy egymással azonos, Syk-kináz [Taniguchi és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 15 790 (1991)] és ΡΤΚ-72-kináz [Zionochek és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 15 637 (1986); Zlonochek és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 19 195 (1988)] voltak, hogy sejtfelszíni receptorokkal kapcsolódnak. Bár a PTK-72- és Syk-kináz azonosságát nem bizonyították egyértelműen, azok szöveti megoszlása (timusz és lép), molekulatömege és proteolízissei szemben mutatott labilitása megegyezik. A ΡΤΚ-72-kinázról kimutatták, hogy a B-sejt IgM-receptorral kapcsolódik [Hutchroft és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992); Hutchroft és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 8613 (1992)], valamint azt, hogy a receptor és anti-lgM között történő keresztkötések kialakulása révén foszforileződik [Hutchroft és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 14846 (1991)]. Felszíni IgM-ek közti keresztkötések kialakulását követően kimutatták az enzim ezzel együtt járó aktiválódását, amely mind autofoszforileződés, mind exogén proteinfragmensek foszforileződése alapján mérhető volt [Hutchroft és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992); Hutchroft és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 8613 (1992)]. A ΡΤΚ-72-kináz szintén a nagy affinitású IgE-receptorokhoz kapcsolódik patkány bazofil leukémia-sejtvonalban [Hutchroft és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992); Hutchroft és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 8613 (1992)].

A Syk-kinázok családjának második tagja a ΖΑΡ-70-kináz, melyről kimutatták, hogy receptor-keresztkötések kialakulását követően a T-sejt-receptor zéta-láncával kapcsolódó PTK [Chan és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9166 (1991)]. Bár a ZAP-70-, Fyn- vagy Lck-kinázok expresszálódása COS-sejtekben a tirozin-foszfát-összmennyiséget csak mérsékelten növeli, a ZAP-70, valamint a Lek- vagy a Fyn-kináz együttes expresszálódása a tirozinfoszforileződés nagymértékű emelkedéséhez vezet [Chan és munkatársai: Cell 71, 649 (1992)]. Amennyiben CD8-zéta-lánc kimérák is jelen vannak, a kiméra foszforileződik, és ahhoz kapcsolódva ΖΑΡ-70-kináz található [Chan és munkatársai: Cell 71, 649 (1992)]. Jelenleg nem világos, hogy vajon a ΖΑΡ-70-kináz aktiválja-e az Src-családba tartozó kinázokat és/vagy fordítva, valamint az sem, hogy kinázok együttes expresszálódása COS-sejtekben miért vezet látszólag folyamatosan aktivált állapothoz. Mindazonáltal a ΖΑΡ-70-kináz aktív kapcsolódása a keresztkötésekkel összekapcsolódott TCR-receptorokkal arra utal, hogy ez a PTK szerepet játszik a receptoron keresztül végbemenő jelátvitelben.

Az Scr-családba tartozó kinázoktól eltérően a Sykés a ΖΑΡ-70-kinázok két SH2-doménnal rendelkeznek, és nem rendelkeznek N-terminális mirisztilezési hellyel [Taniguchi és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 15 790 (1991); Chan és munkatársai: Cell 71, 649 (1992)]. A kináz-receptor kapcsolódás mechanizmusának természetes módja az lenne, ha a két SH2-domén az antigénreceptor aktiválóelemének két tirozinjához kötődne, miután azok foszforileződtek. Jelenleg azonban ez csupán feltevés.

Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.

A leírásban protein-tirozin kináz molekulák intracelluláris doménjai, valamint a célpontfelismerés feladatának végrehajtására képes extracelluláris doménok közt létrehozott kimérák alkalmazási lehetőségeit ismertetjük. Közelebbről, Syk- vagy ΖΑΡ-70-kináz-szekvenciákat hordozó kimérák csoportosulása kalciummobilizációt vált ki. Csupán Syk-kimérák aggregációja, vagy Fyn- vagy Lek-, valamint ΖΑΡ-70-kinázok együttes aggregációja elegendő citolitikus effektorfunkciók beindításához. Ilyen effektorfunkciók elősegítik nemkívánatos célsejtek, például kórokozók, kórokozóval fertőzött sejtek, tumorsejtek vagy autoimmun sejtek felismerését és elpusztítását.

Számtalan, a találmány szerinti megoldásban alkalmazható kiméramolekula előállítható. Például olyan kimérák előállítása, melyekben protein-tirozin kináz intracelluláris része egy géntechnológiai úton, megfelelő5

HU 225 689 Β1 képp módosított ellenanyag-molekula extracelluláris részével kapcsolódik, lehetővé teszi, hogy az immunrendszer sejtjének célpont-felismerési képessége ezután specifikusan az extracelluláris ellenanyagrészlet által felismert antigénre irányuljon. Az immunrendszer kimérával felfegyverzett sejtjei a kórokozó felszínén valamely determináns felismerésére képes ellenanyagrészlet révén a kórokozó jelenlétére eredetüknek megfelelő effektorprogrammal válaszolnak, például „helper” T-limfociták a célzott sejttel szemben létrejövő citotoxikus aktivitással válaszolnak, B-limfociták aktiválódnak, majd ellenanyagokat termelnek. Makrofágok és granulociták saját effektorprogramjukat hajtják végre, amely citokinkibocsátást, fagocitózist és reaktív oxigén képzését foglalja magában. Hasonlóképp, tumorsejtek felismerésére képes ellenanyagrészlet esetében az immunrendszer tumorellenes válasza előnyösen fokozódik. Saját determinánsokkal szembeni rendellenes reaktivitással rendelkező immunsejtek felismerésére képes ellenanyag esetében az autoreaktív sejtek szelektív módon kiválaszthatók és elpusztíthatok.

Bár a fentiekben a találmány szerinti megoldást az egyszerűség kedvéért ellenanyag-kimérák alkalmazásán keresztül szemléltettük, a találmány nem korlátozódik ellenanyag-kimérák alkalmazására, és valójában specifikus, nem ellenanyag természetű extracelluláris doménok alkalmazása jelentős előnyökkel járhat. Például olyan extracelluláris részlet esetében, amely egy vírus, baktérium vagy parazita receptora, a kimérákkal felfegyverzett sejtek specifikusan a vírus-, baktériumvagy parazitadeterminánsokat expresszáló sejteket fogják célzottan megtámadni. Ennek a megoldásnak az ellenanyagok alkalmazásához képest az előnye, hogy egy kórokozó natív receptora, a kórokozóval szemben egyedülállóan magas szelektivitással vagy affinitással rendelkezhet, ami a létrejövő immunválasz sokkal pontosabb irányítását teszi lehetővé. Hasonlóképp, rendellenes módon saját antigénekkel reagáló immunrendszeri sejtek eltávolítására elegendő lehet az antigén (B-sejtek eltávolítását célzó terápiák esetében intakt proteinként, T-sejtek eltávolítását célzó terápiák esetében MHC-komplexként történő) összekapcsolása intracelluláris protein-tirozin kináz láncokkal, ezáltal elérhetjük a saját determinánsokra rendellenesen válaszoló sejtek specifikus, célzott elpusztítását.

A kimérák alkalmazásának másik területe sejtpopulációk in vivő szabályozása, egyéb géntechnológiai módosítások létrehozását követően. Például javasolták tumort beszűrő limfociták vagy természetes ölősejtek alkalmazását abból a célból, hogy azok a tumor helyére citotoxikus anyagokat juttassanak. A találmány tárgyát képezik ilyen limfociták, valamint sejtek számának és aktivitásának szabályozására könnyen alkalmazható eljárások, anélkül, hogy az említett sejteket in vitro amplifikálás céljából eltávolítanánk a beteg szervezetéből. Mivel tehát a sejtek proliferatív válaszreakcióját a kimérareceptorok intracelluláris doménjai közvetítik, az extracelluláris doménok elrendeződésének megváltoztatása különböző, az extracelluláris doménokra specifikus, aggregációt kiváltó stimulusok alkalmazásával (például az extracelluláris doménra specifikus ellenanyagok alkalmazásával) a kimérákat hordozó sejtek proliferációját eredményezi.

Bár a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a Syk-, vagy Syk- és Src-családba tartozó proteín-tirozin kinázok közt létesített kimérákat alkalmazunk, a leírásban megfogalmazott célokra bármely, a fenti molekulákhoz hasonló funkcióval rendelkező tirozinkináz alkalmazható. Előnyös immunsejt-indukáló molekuláknak az alábbi megkülönböztető tulajdonságokkal kell rendelkeznie: legyen képes autonóm expresszálódásra, legyen egy extracelluláris doménnal fuzionáltatható (közvetlenül vagy közvetett módon, egy transzmembrándoménon keresztül) úgy, hogy a kiméra megjelenjen a terápiás sejt felszínén, valamint célzott ligandummal történő találkozást követően létrejövő aggregáció révén képes legyen sejteffektorprogramok beindítására. Jelenleg kiméráknak az immunrendszer sejtjeibe való bejuttatására legelőnyösebben alkalmazható eljárások a génterápia valamilyen formáján alapulnak. Az immunrendszer sejtjeinek kimérareceptorokkal történő ellátása oly módon, hogy a sejteket megfelelőképp szolubilizált, tisztított kiméraproteinnel elegyítjük, szintén módosított sejtpopulációt eredményez, amely képes reagálni a kimérák extracelluláris doménja által felismert célsejtekre. Hasonló eljárást alkalmaztak például az intakt CD4 HÍV-receptornak terápiás célból, eritrocitákba történő bejuttatására. Ebben az esetben a módosított sejtpopuláció nem képes önmaga megújítására.

A találmány tárgyát képezik funkcionális, egyszerűsített protein-tirozin kináz kimérák, melyek képesek immunrendszeri funkciók célzott irányítására. Közelebbről, a találmány tárgyát limfociták, makrofágok, természetes ölősejtek vagy granulociták működésének szabályozása képezi az említett sejtekben kimérák expresszálásán keresztül, amely a sejtekben, a kimérák által felismert célponttal szemben válaszreakciót eredményez. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások sejtszintű válaszreakciók célzott irányítására, fertőző kórokozóval, tumorsejtekkel vagy rákos sejtekkel, vagy olyan sejtekkel szemben, melyekben autoimmun folyamatok indultak meg. Emlősben sejtszintű válaszreakciók célzott irányítására szolgáló eljárások szerint emlősnek terápiás sejtek hatékony mennyiségét adjuk be, amely sejtek képesek felismerni és elpusztítani a fent említett fertőző kórokozót, tumorsejtet, rákos sejtet vagy autoimmun sejtet. A sejt válaszreakciója létrejöhet egyetlen kiméra közvetítésével, vagy az lehet több kiméra közti kölcsönhatás eredménye (például két vagy több kiméra közti kölcsönhatás eredménye, amelyek egyike CD28-eredetü intracelluláris domént tartalmaz).

A találmány egy további megvalósítási módja szerint egy fertőző kórokozóval szemben létrejövő célzott sejtszintü válaszreakció kiváltására szolgáló eljárásban terápiás sejteknek az említett kórokozó felismerésére és elpusztítására képes hatékony mennyiségét adjuk be, ahol a kórokozó meghatározott vírus, baktérium, protozon vagy gomba. Még közelebbről, az eljárás

HU 225 689 Β1 olyan kórokozókkal szemben alkalmazható, mint HIV-vírus és Pneumocystis carinii.

HIV-fertőzés kezelése céljából betegeknek kimérareceptort expresszáló citotoxikus T-limfociták hatékony mennyiségét adjuk be; ezek a limfociták képesek specifikus módon felismerni és lizálni a HIV-vírussal fertőzött sejteket, valamint a keringésben található vírusokat.

Egyrészt a találmány tárgyát képezik eljárások sejtszintű válaszreakciók célzott irányítására HIV-vírussal fertőzött sejtekkel szemben, amely eljárások szerint betegnek citotoxikus T-limfociták hatékony mennyiségét adjuk be, amelyek képesek specifikus módon felismerni és lizálni HIV-vírussal fertőzött sejteket.

A találmány tárgyát képezik továbbá a kimérareceptor-proteinek, melyek a citotoxikus T-limfocitákat HIV-vírussal fertőzött sejtek felismerésére és lizálására késztetik. A találmány tárgyát képezik ezenfelül a kimérareceptorokat tartalmazó vektorral transzformált gazdasejtek.

Számos, kiméra-immunreceptorok előállítására és expresszálására szolgáló eljárás és azok alkalmazásán alapuló terápiás alkalmazási módok részletes leírását találjuk a 07/847 566 és 07/665 961 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben, amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik (közzétéve: 1992. 09. 17-én, WO92/15322 számon).

Ezek és a találmány további bemutatott, nem korlátozó jellegű megvalósítási módjai szakember számára világosak lesznek a találmány alábbi, részletes leírása alapján.

Az alábbi részletes leírás során utalunk molekuláris biológiában és immunológiában jártas szakember számára jól ismert eljárásokra. Az említett ismert eljárásokat ismertető közlemények és egyéb szakirodalmi helyek, amelyekre utalás történt, teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik, mintha azokat teljes egészükben közöltük volna.

Rekombináns DNS technológia általános elveit ismertetik például a felsorolt ismert szakirodalmi helyeken: Watson és munkatársai: „Molecular Biology of the Gene, 1. és 2. kötet, „Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987); Darnell és munkatársai: „Molecular Cell Biology”, „Scientific American Books, Inc., New York, N. Y. (1986); Lewin: „Genes II”, „John Wiley & Sons New York, N. Y. (1985); Old és munkatársai: „Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2. kiadás, „University of California Press”, Berkeley, CA (1981); Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, „Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989); valamint, Ausubel és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology „Wiley Press”, New York, NY (1989).

Annak érdekében, hogy a leírás és az igénypontok egyértelműen értelmezhetőek legyenek, az alábbi definíciókat adjuk meg.

„Klónozás” alatt in vitro rekombinációs technikák alkalmazását értjük adott génnek vagy egyéb DNS-szekvenciának vektormolekulába történő inszertálására. Egy meghatározott gén sikeres klónozásához szükség van DNS-fragmensek előállítására, a fragmensek vektormolekulákhoz történő kapcsolására, az összeállított DNS-molekulának olyan gazdasejtbe történő bejuttatására, amelyben az képes replikálódni, valamint a recipiens gazdasejtek közül a célzott gént tartalmazó kiónok szelektálására szolgáló eljárások alkalmazására.

A leírásban „cDNS” alatt olyan komplementer vagy másolat-DNS-t értünk, mely RNS-templát alapján jött létre RNS-függő DNS-polimeráz (reverz transzkriptáz) enzim közreműködésével. „cDNS-klón” alatt tehát klónozóvektor által hordozott, adott RNS-molekulával komplementer, kettős szálú DNS-szekvenciát értünk.

A „cDNS-génkönyvtár” kifejezés cDNS-inszerteket tartalmazó rekombináns DNS-molekulák gyűjteményére vonatkozik, mely DNS-molekulák olyan mRNS-ről készült DNS-kópiákat tartalmaznak, amelyek a sejtekben a cDNS-génkönyvtár előállításának idejében expresszálódtak. Ilyen cDNS-génkönyvtárat előállíthatunk szakember számára ismert eljárásokkal, ilyen eljárásokat ismertetnek például Maniatis és munkatársai (Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, lásd fent). Általánosságban először RNS-t izolálunk az organizmus sejtjeiből, amelynek genomjából egy adott gént klónozni kívánunk. A találmány céljára előnyös emlős-, és különösen humán limfocita-sejtvonalak alkalmazása. A találmány szerinti célra előnyös vektor a vacciniavírus WR-törzs.

„Vektor” kifejezés alatt például plazmid, bakteriofág, vagy emlős- vagy rovarvírus-eredetű DNS-molekulát értünk, amelybe DNS-fragmensek inszertálhatók vagy klónozhatok. Egy vektor egy vagy több egyedi restrikciós hasítási helyet tartalmaz, és meghatározott gazdaszervezetben vagy hordozószervezetben autonóm replikációra képes úgy, hogy a klónozott szekvencia reprodukálható. „DNS-expressziós vektorának tehát bármely olyan autonóm elemet nevezünk, amely egy rekombináns peptidszintézisét irányítani képes. Ilyen DNS-expressziós vektorok lehetnek bakteriális eredetű plazmidok és fágok, valamint emlős- és rovareredetű plazmidok és vírusok.

„Lényegében tiszta” kifejezés alatt olyan vegyületet, például proteint, polipeptidet vagy ellenanyagot értünk, amelyik a természetben azzal együtt előforduló összetevőktől lényegében mentes. Általánosságban egy vegyületről akkor mondjuk, hogy az „lényegében tiszta, ha a mintában az adott vegyület aránya legalább 60%, előnyösen 75% és legelőnyösebben 90%. A tisztasági fok bármely alkalmas eljárással meghatározható, például oszlopkromatográfiával, poliakrilamid-gélelektroforézissel vagy HPLC-analízissel. Nukleinsavak vonatkozásában a „lényegében tiszta” kifejezés olyan nukleinsavszekvenciát, -szegmenst vagy -fragmenst jelöl, amelyik nem csatlakozik közvetlenül (azaz nem kapcsolódik kovalensen) azokhoz a kódolószekvenciákhoz (azaz az 5’-végen, valamint a 3’-végen található szekvenciákhoz), melyekhez közvetlenül kapcsolódik az organizmus természetben előforduló genomjában, amelyből a találmány szerinti DNS származik.

HU 225 689 Β1 „Funkcionális származéknak” nevezzük egy molekula „fragmenseit, „variánsait, „analógjait vagy „kémiai származékait”. Egy molekula „fragmensének” ilyen például a találmány szerinti cDNS-szekvenciák bármelyike - a molekula valamely folyamatos nukleotid-alcsoportját nevezzük. Egy ilyen molekula „variánsa természetben előforduló molekulát jelent, amely lényegében hasonló a teljes molekulához vagy annak fragmenséhez. Egy molekula „analógjának” olyan, a természetben elő nem forduló molekulát nevezünk, amely lényegében hasonló a teljes molekulához vagy annak fragmenséhez. Egy molekuláról akkor mondjuk, hogy az egy másik molekulához „lényegében hasonló”, ha a két molekula aminosavszekvencája lényegében megegyezik. Közelebbről, „lényegében hasonló” aminosavszekvenciák legalább 50%-os, előnyösen 85%-os és legelőnyösebben 95%-os aminosavszekvencia-azonosságot mutatnak a természetben előforduló szekvenciával vagy a referenciaszekvenciával és/vagy egy olyan szekvenciával, amely a természetben előforduló szekvenciától vagy referenciaszekvenciától csak konzervatív aminosavszubsztitúciók tekintetében tér el. A lényegében hasonló aminosavszekvenciák lényegében hasonló biológiai aktivitással rendelkeznek. Feltéve tehát, hogy két molekula hasonló aktivitással rendelkezik, azokat a leírásban használt meghatározás szerint variánsoknak tekintjük, még abban az esetben is, ha a molekulák egyike a másikban nem található, további aminosavakat tartalmaz vagy annál kevesebb aminosavat tartalmaz, vagy azokban az aminosavak sorrendje nem azonos. A leírásban egy molekula „kémiai származékán” olyan molekulát értünk, amelyik a molekula részét rendesen nem képező kémiai csoportokat tartalmaz. Ilyen csoportok javíthatják a molekula oldhatóságát, felszívódását, biológiai felezési idejét stb. A csoportok csökkenthetik továbbá a molekula toxicitását, megszüntethetik vagy csökkenthetik a molekula valamely nem kívánt mellékhatását stb. Ilyen hatások közvetítésére képes csoportokat írnak le például az alábbi szakirodalmi helyen: „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 16. kiadás, „Mack Publishing Co.”, Easton, PA (1980).

Hasonlóképp, a találmány szerinti receptor-kiméragén „funkcionális származéka kifejezés vonatkozik a gén „fragmenseire”,„variánsaira” vagy „analógjaira”, melyek nukleinsavszekvenciája „lényegében hasonló”, és amelyek protein-tirozin kináz kimérához hasonló aktivitással rendelkező molekulát kódolnak. „Lényegében hasonlónak mondott nukleinsavak lényegében hasonló aminosavszekvenciákat kódolnak (a fenti meghatározás szerint), és azok lehetnek bármilyen, a természetben előforduló szekvenciával vagy referenciaszekvenciával megfelelő hibridizációs körülmények alkalmazása mellett hibridizálódni képes nukleotidszekvenciák [megfelelően sztringens hibridizációs körülményekre vonatkozó leírást lásd: Ausubel és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology” „Wiley Press”, New York, NY (1989)].

Protein-tirozin kináz kiméra proteinnek nevezünk továbbá minden olyan funkcionális származékot, fragmenst, variánst, analógot vagy kémiai származékot, amely lényegében hasonló a „vad típusú” kimérához, és amely ahhoz hasonló aktivitással rendelkezik (azaz a vad típusú receptorkimérák aktivitásának legelőnyösebben 90%-ával, előnyösebben 70%-ával, előnyösen 40%-ával és legalább 10%-ával rendelkezik). Egy funkcionális, kimérareceptor-származék aktivitása vonatkozik (annak extracelluláris részén keresztül) egy célzott ágenshez vagy sejthez történő specifikus kötődésre, és a kötődés következményeképp (a kimérareceptor intracelluláris része által irányítottan) az adott ágens vagy sejt elpusztítására; az aktivitás tesztelhető például valamely, a leírásban ismertetett vizsgálati eljárással.

A találmány szerinti kimérát vagy annak funkcionális származékát kódoló DNS-szekvenciát rekombináns úton vektor-DNS-sel kapcsolhatjuk össze a technika állása szerint ismert technikák alkalmazásával, például ligálás céljából tompa végek vagy lépcsőzetes végek létrehozásával, megfelelő végek kialakítása céljából restrikciós enzimekkel végzett emésztésekkel, szükség esetén a ragadós végek feltöltésével, a nem kívánt összekapcsolódás megelőzése céljából alkalikus foszfatázzal végzett kezeléssel, valamint megfelelő ligázokkal történő ligálással. Ilyen technikákat írnak le például Maniatis T. és munkatársai (lásd fent), és azok a technika állása szerint jól ismertek.

Egy nukleinsavmolekuláról, például DNS-ről akkor mondjuk, hogy „képes egy poiipeptid expresszálására”, ha transzkripciós és transzlációs szabályozó információkat hordozó nukleotidszekvenciákat tartalmaz, és az említett szekvenciák a polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciákkal „funkcionálisan kapcsoltak”. Funkcionális kapcsolódásnak olyan kapcsolódást nevezünk, amelyben a szabályozó DNS-szekvenciák és az expresszálandó DNS-szekvenciák oly módon kapcsolódnak, hogy génexpresszió jöhessen létre. A gén expresszálódásához szükséges szabályozórégiók közelebbi természete organizmusról organizmusra változhat, de általánosságban tartalmazniuk kell egy promoterrégiót, amely prokarióták esetében tartalmazza a promotert, valamint olyan DNS-szekvenciákat, melyek RNS-sé átíródva jelzést szolgáltatnak a proteinszintézis megindulása számára. Ezek a régiók általában tartalmazzák azokat az 5'-végi nem kódoló szekvenciákat, amelyek a transzkripció és a transzláció megindításában játszanak szerepet, például a „TATA-box” régiót, a „capping”-szekvenciát, CAAT-szekvenciát és hasonlókat.

Kívánt esetben a proteint kódoló génszekvenciától 3-irányban található nem kódoló régiót megkaphatjuk a fent leírt módszerek alkalmazásával. Ezt a régiót megtarthatjuk az abban található, transzkripciós terminációszabályozó szekvenciák, ezen belül a terminációt és poliadenilezést szabályozó szekvenciák kedvéért. Megtartva tehát a proteint kódoló DNS-szekvenciával természetben kapcsolódó 3’-régiót, a rendelkezésre állnak a transzkripció végét jelző szignálok. Amennyiben a transzkripció végét jelző szignálok nem működnek kielégítően az expresszálásra felhasznált gazda8

HU 225 689 Β1 sejtben, azt a gazdasejtben működőképes 3-régióval helyettesíthetjük.

Két DNS-szekvenciáról (például promoterrégió-szekvenciáról és protein-tirozin kináz kimérát kódoló szekvenciáról) akkor mondjuk, hogy azok „funkcionálisan kapcsoltak”, ha a két DNS-szekvencia közti kötődés természete (1) nem eredményez fáziseltolódással járó („frame shift”) mutációt, (2) nem gátolja a promoterrégiót alkotó szekvencia azon képességét, hogy irányítsa a receptorkiméra-génszekvencia transzkripcióját, vagy (3) nem gátolja a receptorkiméra-génszekvencia azon képességét, hogy az a promoterrégió-szekvencia által átíródjon. Egy promoterrégió funkcionálisan kapcsolt egy DNS-szekvenciával, ha a promoter képes létrehozni az adott DNS-szekvencia transzkripcióját. A protein expresszálódásához tehát szükség van megfelelő gazdasejt által felismert transzkripciós és transzlációs szignálokra.

A találmány tárgyát képezi protein-tirozin kináz kiméra protein (vagy funkcionális származéka) expresszálása prokarióta vagy eukarióta sejtekben, bár eukarióta sejtekben (különösen humán limfocitákban) történő expresszálás előnyösebb.

A találmány szerinti ellenanyagok számos különböző eljárással előáll íthatók. Például egy állatnak a receptorkiméra-proteineket vagy azok funkcionális származékát expresszáló sejteket adhatunk be, abból a célból, hogy a kimérához kötődni képes poliklonális ellenanyagokat tartalmazó szérum termelődését váltsuk ki.

Egy előnyös eljárás szerint a találmány szerinti ellenanyagok monoklonális ellenanyagok. Ilyen monoklonális ellenanyagokat előállíthatunk hibridómatechnológiával [Kohler és munkatársai: Natúré 256, 495 (1975); Kohler és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 6, 511 (1976); Kohler és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 6, 292 (1976); Hamerling és munkatársai: „Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas”, „Elsevier” N. Y., 563-684. oldal (1981)]. Általánosságban a fenti eljárásokban állatot immunizálunk a kiméraantigénnel. Az ilyen állat lépsejtjeit extraháljuk és megfelelő mielóma-sejtvonallal fuzionáltatjuk. A találmány szerinti megvalósítási módokban bármely alkalmas mielóma-sejtvonal alkalmazható. A fúziót követően az így kapott hibridómasejteket szelektív módon, HAT-tápfolyadékban tartjuk fönn, majd Wands és munkatársai módszere szerint [Gastroenterology 80, 225 (1981)], határhígításos eljárással klónozzuk. A fenti szelekcióval kapott hibridómasejteket ezután vizsgáljuk, hogy a kimérához kötődni képes ellenanyagokat szekretáló kiónokat azonosítsunk.

A találmány szerinti ellenanyagok lehetnek poliklonális ellenanyagok is, vagy előnyösen régióspecifikus poliklonális ellenanyagok.

A találmány szerinti kiméraellenes ellenanyagok alkalmazhatók betegben a kimérareceptor (vagy kimérareceptort hordozó sejtek) mennyiségének meghatározására. Ilyen ellenanyagok alkalmasak a technika állása szerint ismert, standard immundiagnosztikai vizsgálati eljárásokban történő alkalmazásra, például immunometriás vagy „szendvics” vizsgálati eljárásokban, mint például „forward-szendvics”, „reverz-szendvics” és „szimultán-szendvics” vizsgálati eljárásokban. Amint azt szakember további kísérletezés nélkül képes megállapítani, az ellenanyagokat alkalmazhatjuk bármilyen kombinációban, hogy megfelelő specificitással, érzékenységgel és pontossággal rendelkező immunvizsgálati eljárásokhoz jussunk.

Az immunológia általános elveit ismertető szokásos szakirodalmi helyek például az alábbiak: Roitt: „Essential Immunology”, 6. kiadás, „Blackwell Scientific Publications, Oxford (1988); Kimball: „Introduction to Immunology”, 2. kiadás, „Macmillan Publishing Co. New York (1986); Roitt és munkatársai: „Immunology”, „Gower Medical Publishing Ltd.” London (1985); szerk.: Burdon és munkatársai: „Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, 13. kötet, Campbell: „Monoclonal Antibody Technology”, „Elsevier, Amszterdam (1984); Klein: „Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, „John Wiley & Sons, New York, (1982); valamint szerk.: Kennett és munkatársai: „Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, „Plenum Press” New York (1980).

„Kimutatás kifejezésen egy anyag jelenlétének vagy hiányának kimutatását, vagy egy anyag mennyiségének meghatározását értjük. A kifejezés vonatkozik tehát a találmány szerinti anyagok, készítmények és eljárások alkalmazásával történő kvalitatív vagy kvantitatív meghatározásokra.

A leírásban feltártakkal megegyező specifitással rendelkező monoklonális ellenanyagokat szekretáló egyéb hibridómák izolálhatok antiidiotípus szűrési technika alkalmazásával [Potocmjak és munkatársai: Science 215, 1637 (1982)]. Röviden, antiidiotípus-ellenanyagnak olyan ellenanyagot nevezünk, amelyik a kérdéses klón által termelt ellenanyagon jelen levő egyedi determinánsokat ismer fel. Antiidiotípus-ellenanyagot úgy állíthatunk elő, hogy a monoklonális ellenanyag forrásául szolgáló fajhoz tartozó állatot a kérdéses monoklonális ellenanyaggal immunizálunk. Az immunizált állat az immunizálásra felhasznált ellenanyag idiotípusdeterminánsait felismeri, és azokra a fenti idiotípusdeterminánsokkal szembeni ellenanyagok (antiidiotípus-ellenanyagok) termelődésével válaszol.

Replikáció céljából a hibridsejtek tenyészthetők in vitro vagy in vivő. A nagyobb mennyiségű in vivő termelődés miatt ez utóbbi eljárás az előnyös tenyésztési módszer. Röviden, az egyes hibridtörzsekből származó sejteket intraperitoneálisan (hasüregbe), lökésszerűen pristane-nal kezelt Balb/c-egerekbe injektáltuk, hogy a kívánt monoklonális ellenanyagot magas koncentrációban tartalmazó aszciteszfolyadékot nyerjünk. IgM- vagy IgG-izotípusba tartozó monoklonális ellenanyagokat a tenyészet felülúszójából szakember számára jól ismert oszlopkromatográfiás eljárásokkal tisztíthatunk.

A találmány szerinti ellenanyagok különösen megfelelnek immunvizsgálati eljárásokban történő alkalmazás céljára, amelyekben azokat folyékony fázisban használjuk, vagy szilárd fázisú hordozóhoz kötjük.

HU 225 689 Β1

Ezenfelül az említett immunvizsgálati eljárásokban használt ellenanyagokat különböző módon jelölhetjük, hogy azok kimutathatóak legyenek.

A technika állása szerint számos különböző jelölőanyag és jelölésre alkalmazható eljárás ismert. A találmány szerinti megvalósítási módokban alkalmazható jelölőanyag-típusok, anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, például a felsoroltak: enzimek, radioizotópok, fluoreszcens vegyületek, kemilumineszcens vegyületek, biolumineszcens vegyületek és fémkelátok. Szakember számára ellenanyaghoz köthető más alkalmas jelölőanyagok is ismertek, vagy rutinszerű kísérletekkel képes ilyent kifejleszteni. Továbbá ezeknek a jelölőanyagoknak ellenanyagokhoz történő kötését szakember számára jól ismert standardtechnikák alkalmazásával végezhetjük.

A találmány szerinti ellenanyagok kimutatható módon jelölhetők például oly módon, hogy az ellenanyagokat enzimhez kötjük. Ez az enzim viszont, amikor azt később szubsztrátjával érintkeztetjük, reagálni fog a szubsztráttal úgy, hogy olyan kémiai csoport keletkezzen, amelyik például spektrofotometriás vagy fluorometriás eljárással kimutatható. Ellenanyagok kimutatható módon történő jelölésére alkalmazható enzimek például a felsoroltak: malát dehidrogenáz, staphylococcus nukleáz, delta-V-szteroid izomeráz, élesztő alkohol-dehidrogenáz, alfa-glicerofoszfát dehidrogenáz, trióz foszfát izomeráz, biotin-avidin peroxidáz, torma-peroxidáz, alkalikus foszfatáz, aszparagináz, glükóz oxidáz, β-galaktozidáz, ribonukleáz, ureáz, kataláz, glükóz-6-foszfát dehidrogenáz, glükoamiláz, valamint acetil-kolin észteráz.

Kimutatható módon jelölt ellenanyagok jelenlétét kimutathatjuk úgy is, hogy az ellenanyagokat radioaktív izotóppal jelöljük, melyet azután gamma-számláló vagy szcintillációs számláló alkalmazásával határozunk meg. A találmány szerinti célra különösen alkalmas izotópok a felsoroltak:

³H, ¹²⁵l, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶CI, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe és ⁷⁵Se.

Kimutatható módon jelölt ellenanyagok jelenlétét kimutathatjuk továbbá úgy is, hogy az ellenanyagokat fluoreszcens vegyülettel jelöljük. Amikor a fluoreszcens anyaggal jelölt ellenanyagot megfelelő hullámhosszú fénynek tesszük ki, az ellenanyag jelenlétét a festék fluoreszcenciája alapján mutathatjuk ki. A leggyakrabban használt fluoreszcens jelölőanyagok a felsoroltak: fluoreszcein izotiociocianát, rodamid, fikoeritrin, fikocianin, allofikocianin, o-ftaldehid és fluoreszcamine.

A találmány szerinti ellenanyagokat kimutatható módon jelölhetjük továbbá fluoreszcens jelet kibocsátó fémekkel, mint például ¹⁵²Eu-val vagy a lantánsorozat egyéb tagjaival. Ezek a fémek az ellenanyag-molekulához olyan fémkelátorcsoportok alkalmazásával kapcsolhatók hozzá, mint például dietil-enteriamin-pentaecetsav (DTPA) vagy etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA).

A találmány szerinti ellenanyagokat kimutatható módon jelölhetjük továbbá úgy, hogy azokat kemilumineszcens vegyülethez kapcsoljuk. A kemiluminszcens vegyülettel ellátott ellenanyag jelenlétét ezután lumineszcencia kimutatásával határozhatjuk meg, amely a kémiai reakció során keletkezik. A találmány szerinti célra különösen alkalmas kemiluminszcens jelölőanyagok a felsoroltak: luminal, izoluminol, theromatik akridinium-észter, imidazol, akridiniumsók, oxalát-észter és dioxetán.

Hasonlóképp, a találmány szerinti ellenanyagokat jelölhetjük biolumineszcens vegyülettel. A biolumineszcencia a kemilumineszcenciának biológiai rendszerekben található típusa, melyben egy katalitikus protein fokozza a kemilumineszcens reakció hatékonyságát. A biolumineszcens ellenanyag jelenlétét lumineszcencia kimutatásával határozzuk meg. Jelölésre felhasználható jelentősebb biolumineszcens vegyületek az alábbiak: luciferin és luciferáz-aequorin.

A találmány szerinti ellenanyagok és lényegében tisztított antigének ideálisan megfelelnek vizsgálati reagenskészlet előállítására. Ilyen vizsgálati reagenskészlet tartalmazhat rekeszekre osztott hordozóeszközt, hogy azokba szorosan, egy vagy több tartályt, például üvegcséket, csöveket és hasonlókat lehessen helyezni, és az említett tartályok mindegyike a vizsgálati eljárásban alkalmazandó egyes reagenselemeket tartalmaz.

Vizsgálati reagenskészlet formájában számos típusú vizsgálati eljárás kivitelezhető, azok lehetnek például kompetitív és nem kompetitív vizsgálati eljárások. A találmány szerinti ellenanyagok alkalmazhatók például az alábbi tipikus vizsgálati eljárásokban: radioimmunvlzsgálati eljárások (RIA), enzim-immunvizsgálati eljárások (EIA), enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati eljárások (ELISA), valamint immunometriás vagy szendvics-immunvizsgálati eljárások.

Az „immunometriás vizsgálati eljárás” vagy „szendvics-immunvizsgálati eljárás” kifejezés vonatkozik szimultán-szendvics, „forward’-szendvics és reverzszendvics immunvizsgálati eljárásokra. Ezek a kifejezések szakember számára jól ismertek. Szakember számára nyilvánvaló az Is, hogy a találmány szerinti ellenanyagok alkalmazhatók jelenleg ismert vagy a jövőben kifejlesztendő vizsgálati eljárások egyéb variációiban és formáiban is. Az utóbbiak szintén a találmány tárgyát képezik.

A találmány szerinti vizsgálati eljárások kivitelezésének egy előnyös módja szerint lényeges, hogy az inkubációs közegben bizonyos „blokkolóanyagok” legyenek jelen (melyeket rendszerint a jelölt, oldható ellenanyaggal együtt adunk a vizsgálati mintához). A „blokkolóanyagokat” abból a célból adjuk a mintához, hogy a nemspecifikus proteinek, proteázok vagy a kísérleti mintában található, egér-immunglobulinellenes humán ellenanyagok ne létesítsenek keresztkötéseket a szilárd fázisú hordozón található ellenanyagokkal, és azokat ne károsítsák, vagy ne létesítsenek keresztkötéseket a radioaktlvan jelölt indikátor-ellenanyagokkal, és azokat ne károsítsák; ellenkező esetben tévesen pozitív vagy tévesen negatív eredményeket kaphatnánk. „Blokkolóanyagok” helyes megválasztása tehát jelentősen hozzájárul a találmány szerinti vizsgálati eljárások specifitásához.

HU 225 689 Β1

Azt találtuk, hogy számos, a vizsgálati eljárásokban felhasználtakkal megegyező osztályba vagy alosztályba (izotlpusba) tartozó, oda nem tartozó (azaz más specifitással rendelkező) ellenanyag (azaz IgGi, lgG_2a, IgM stb.) alkalmazható „blokkolóanyagként. Lényeges a „blokkolóanyagok” koncentrációja (általában 1-100 ng/μΙ), hogy a megfelelő érzékenység fenntartása mellett megakadályozzunk minden nem kívánt gátlást, melyet a humán szérumban egyidejűleg előforduló, keresztreagáló proteinek okozhatnának. Továbbá a „blokkolóanyagokat tartalmazó pufferrendszert optimalizálnunk kell. Előnyös pufferek gyenge szerves savak fiziológiás pH-tartományban történő alkalmazásán alapulnak, ilyenek például a következők: imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS és hasonlók. Valamivel kevésbé előnyösen alkalmazható pufferek szervetlen pufferek, például foszfát-, borát- vagy karbonátpufferek. Végül a „blokkolóanyagokat tartalmazó pufferhez előnyösen ismert proteázinhibitorokat adunk (általában 0,01-10 pg/ml koncentrációban).

Számos szilárd fázisú immunadszorbens létezik, melyet alkalmaztak, és amely a találmány szerinti megvalósítási módokban is alkalmazható. Jól ismert immunadszorbensek például a felsoroltak: üveg, polisztirén, polipropilén, dextrán, nejlon és egyéb anyagok, melyek alkalmazhatók ilyen anyagból álló vagy ilyen anyagokkal bevont csövek, gyöngyök, mikrotitrálólemezek és hasonlók formájában. Az immobilizált ellenanyagokat kovalensen vagy fizikai módon a szilárd fázisú immunadszorbenshez köthetjük, például egy amid- vagy észterkötésen keresztül létrejövő kovalens kötés létrehozásával, vagy abszorbcióval. Szakember számára számos egyéb alkalmas szilárd fázisú immunadszorbens és ellenanyagoknak azokon történő immobilizálására szolgáló eljárás ismert, vagy szokásos módon végzett kísérletek során képes ilyenek kifejlesztésére.

In vitro, in vivő vagy in situ diagnózis céljára jelölőanyagokat, például radionuklidokat közvetlenül vagy egy közti funkcionális csoporton keresztül köthetünk a találmány szerinti ellenanyagokhoz. Fémkationokként létező radioizotópok ellenanyagokhoz történő kötésére gyakran használt közticsoport például a dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA). Ily módon kötést létesítő tipikus fémkationok például a felsoroltak: ^99mTc, ¹²³l, ¹¹¹IN, ¹³¹l, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, valamint ⁶⁸Ga. A találmány szerinti ellenanyagokat diagnosztikai célból jelölhetjük nem radioaktív izotópokkal is. Ily módon különösen előnyösen alkalmazható elemek a felsoroltak: ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr és ⁵⁶Fe.

A találmány szerinti antigének lényegében tiszta formában izolálhatok, a találmány szerinti ellenanyagok alkalmazásával. A találmány tárgyát képezik tehát lényegében tiszta protein-tirozin kinéz kimérák; az említett antigént az jellemzi, hogy azt a találmány szerinti ellenanyagok felismerik és azokhoz kötődik. A találmány tárgyát képezik továbbá a kimérareceptor-antigének izolálására vagy tisztítására szolgáló eljárások, amely eljárások szerint az említett antigének egy vagy több, a receptorkiméra ellen termelődött ellenanyaggal komplexet képeznek.

A találmány szerinti, lényegében tiszta kiméraantigének viszont alkalmazhatók mintában, például szérumban vagy vizeletben a kiméra ellen irányuló ellenanyagok kimutatására vagy azok mennyiségének meghatározására. A találmány tárgyát képezik tehát, mintában protein-tirozin kinéz kiméra antigénekkel szemben irányuló ellenanyagok jelenlétének kimutatására vagy azok mennyiségének meghatározására szolgáló eljárások, amely eljárások szerint a kiméraantigénnel szemben ellenanyagot tartalmazó mintát kimutatható módon jelölt receptorkimérával érintkeztetjük, és a jelölőanyagot kimutatjuk. Nyilvánvaló, hogy alkalmazhatók a kiméra immunreaktív frakciói vagy immunreaktív analógjai is. „Immunreaktív frakciónak nevezzük a kiméraantigén minden olyan részét, amely a receptorkiméra ellen irányuló ellenanyaggal a receptorkimérával megegyező mértékű immunválaszt ad. „Immunreaktív analógnak olyan proteint nevezünk, amely a receptorkiméra-proteintől egy vagy több aminosav vonatkozásában eltér, de amelyik a találmány szerinti ellenanyagokkal a receptorkimérával megegyező mértékű immunválaszt ad.

„Specifikus módon felismer és kötődik kifejezés alatt azt értjük, hogy az ellenanyag felismeri a kimérareceptor-polipeptidet, és ahhoz kötődik, de lényegében nem ismer fel a mintában, például biológiai mintában található egyéb, az adott ellenanyagokkal kapcsolatban nem levő molekulákat, és azokhoz nem kötődik.

„Autoimmun sejtnek” a gazdaszervezet szöveteivel szemben ellenanyagokat termelő sejteket vagy autoreaktív immuneffektor T-sejteket nevezünk; ilyen sejtek termelhetnek például acetil-kolin-receptorral szembeni ellenanyagokat (amelyek jelenléte például myasthenia gravis kialakulásához vezet), vagy anti-DNS, antieritrocita, antivérlemezke ellenanyagokat (amelyek jelenléte például lupus erythematosus kialakulásához vezet).

„Terápiás sejteknek” olyan sejteket nevezünk, amelyeket a találmány szerinti kimérával transzformáltunk úgy, hogy azok képesek meghatározott fertőző ágens, meghatározott fertőző ágenssel fertőzött sejt, tumoros vagy rákos sejt, vagy autoimmun sejt felismerésére és elpusztítására; a fenti terápiás sejtek előnyösen, vérképzőrendszeri sejtek.

„Célzott fertőző ágensnek” nevezünk minden olyan fertőző kórokozót (például vírust, baktériumot, protozoont vagy gombát), amelyet kimérareceptor-hordozó terápiás sejtek képesek felismerni. „Célzott sejtnek” nevezünk minden olyan gazdasejtet, amelyet kimérareceptort hordozó terápiás sejtek képesek felismerni; célzott sejtek - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk -, vírussal, baktériummal, protozoonnal vagy gombával fertőzött gazdasejtek, valamint tumoros vagy rákos sejtek és autoimmun sejtek.

„Extracelluláris” kifejezésen azt értjük, hogy a molekula legalább egy része a sejtfelszínen található. „Intracelluláris” kifejezésen azt értjük, hogy a molekula legalább egy része a terápiás sejt citoplazmájával érintkezik. A „transzmembrán” kifejezés arra vonatkozik, hogy

HU 225 689 Β1 a molekula legalább egy része átszeli a plazmamembránt. A leírás szerint egy „extracelluláris rész, „intracelluláris rész vagy „transzmembránrész tartalmazhat olyan határoló aminosavszekvenciákat, melyek szomszédos sejtterekbe nyúlnak át.

„Oligomerképzés” kifejezés alatt más proteinekkel történő komplexképzést értünk úgy, hogy dimerek, trimerek, tetramerek keletkezzenek vagy egyéb, több elemből álló oligomer jöjjön létre. Ilyen oligomerek lehetnek homooligomerek, vagy heterooligomerek. „Oligomerképző résznek” nevezzük egy molekula azon részét, amely a komplexképződést (azaz az oligomerképződést) irányítja.

„Citolitikusnak” mondunk valamit, ha az képes sejtek (például kórokozóval fertőzött sejt, tumor- vagy rákos sejt vagy autoimmun sejt) elpusztítására, vagy képes egy fertőző ágens (például vírus) elpusztítására.

„Immundeficiencia-vírusnak” olyan retrovírust nevezünk, amely vad típusú formában képes főemlős gazdaszervezet T4-sejtjeinek fertőzésére, és amelyet a lentivírusok alcsaládjának vírusmorfogenezise jellemez, és annak morfológiai sajátságaival rendelkezik. A kifejezés - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - vonatkozik a HÍV- és SIV-vírusok valamennyi variánsára, ezen belül a HIV-1-, HIV-2-, SIVmac-, SIVagm-, SlVmnd-, SlVsmm-, SlVman-, SIVmand- és SlVcpz-vírusokra.

„MHC-independens” kifejezésen azt értjük, hogy a celluláris citolitikus válasz létrejöttéhez nincs szükség a célzott sejt felszínén II. osztályba tartozó MHC-antigén jelenlétére.

„Funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származéknak” olyan (fentiekben meghatározott) funkcionális származékokat nevezünk, amelyek a vad típusú molekula biológiai aktivitásának legalább 10%-ával, előnyösen 40%-ával, még előnyösebben 70%-ával és legelőnyösebben legalább 90%-ával rendelkeznek. Egy „funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származék” a leírásban használt értelemben kifejtheti hatását közvetlenül, jelezve a terápiás sejtnek, hogy a receptorhoz kötődött ágenst vagy sejtet el kell pusztítania (például egy intracelluláris kimérareceptor-részlet esetében), vagy kifejtheti hatását közvetve, oly módon, hogy elősegíti a terápiás sejt citolitikus szignáltranszdukciós proteinjeivel történő oligomerizálódást (például egy transzmembrándomén esetében). Ilyen származékok hatékonyságát például a leírásban ismertetett in vitro vizsgálati eljárásokkal tesztelhetjük.

„HIV-burokhoz kötődő funkcionális származéknak” nevezünk minden olyan (fentiekben meghatározott) funkcionális származékot, amelyik képes valamely HIV-burokproteinhez kötődni. Funkcionális származékokat például a leírásban ismertetett in vitro vizsgálati eljárásokkal azonosíthatunk.

Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti transzformált sejtek terápiás alkalmazásának lehetőségét.

A találmány szerinti transzformált sejtek számos betegség terápiájában alkalmazhatók. Ilyen transzformáit sejtek beadására jelenleg ismert eljárások például az adoptív immunterápiás eljárás vagy a sejttranszfer-terápia. Ezek az eljárások lehetővé teszik transzformáit immunrendszeri sejtek visszajuttatását a vérkeringésbe [Rosenberg: Sci., Am. 62, (1990. május); Rosenberg és munkatársai: The New Engl. J. of Med. 323, 570 (1990)].

A találmány szerinti gyógyászati készítmények bármely olyan egyednek beadhatók, amelyben a találmány szerinti vegyületek előnyös hatást fejtenek ki. Az említett egyedek közül - anélkül, hogy igényünket az alábbira korlátoznánk - azok elsősorban embernek adhatók be.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

Először a csatolt ábrákat ismertetjük.

Az 1A. ábrán a találmány szerinti receptorkináz fúziós proteinek szerveződésének vázlatos ábrázolása látható. Az 1B. ábrán Jurkat-féle sejtekben, vacciniarekombinánsok által expresszált CD16/7/zéta, CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk és CD16/7/ZAP-70 fúziós proteinek vizsgálatával kapott „flow-citometrás” eredményeket mutatunk be. Az 1C. ábrán immunprecipitált CD16/7/zéta- (negatív kontroll), CD16/7/Lck-, CD16/7/Fyn(T)-, CD16/7/Sykés CD16/7/ZAP-70-kimérák aktivitásának in vitro vizsgálatával kapott eredmények láthatók; az immunprecipitált Fyn-kiméra esetében látható alacsony molekulatömegű csík még azonosításra vár.

A 2. ábra TCR-negatív Jurkat-sejtekben kináz-kimérák közti keresztkötések létrejötte által a citoszolban kiváltott kalciumválaszt mutatja. A pozitív populáció relatív intracelluláris kalciumkoncentrációját ábrázoltuk (melyet Indo-1-fluoreszcencia violából kékké történő átalakulásának aránya alapján határoztunk meg). A különböző fúziós proteineket expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőzött Jurkat-sejteket anti-CD16-3G8 jelű monoklonális ellenanyaggal érintkeztettük, majd „0” időpontban, egér IgG-vel szemben kecskében termelt, fikoeritrinnel konjugált, F(ab’)₂-ellenanyagokkal érintkeztettük. Pozitív és negatív kontrolokként TCR-zéta-lánc és FcRIIB2-alapú kimérákat alkalmaztunk.

A 3. ábra Syk-kináz-kimérát expresszáló TCR-pozitív sejtekben létrejövő korai kalciumválaszt mutatja. A fertőzést és az analízist a 2. ábránál, fent ismertetettek szerint végeztük. Syk-kináz-kimérát expresszáló sejtek jelentős része esetében megfigyelhető volt, hogy a violafloureszcencia nagy része kékké alakult az első ellenanyag-hozzáadást megelőzően.

A 4A. és 4B. ábrán hibridómasejtek elpusztításán alapuló vizsgálati eljárás eredményeit szemléltettük.

HU 225 689 Β1

A4A. ábrán hibridómacélsejtekből felszabaduló ⁵¹Cr-kromát arányát ábrázoltuk százalékban megadva, az effektorsejtek (kináz-kimérát expresszáló CTL-sejtek) és célsejtek arányának függvényében; pozitív és negatív kontrolokként a TCR-zéta-lánc és FcRIIB2 intracelluláris doménjait hordozó receptorkimérákat expresszáló sejteket alkalmaztunk.

A 4B. ábrán a sejtpusztítás specifitását ábrázolja (a környező sejtek elpusztításának hiányát). BW5147-sejteket (amelyek nem rendelkeznek felszíni anti-CD16-ellenanyagokkal), ⁵¹Cr-kromáttal telítettünk, és kromáttal telített 3G8-sejteket tartalmazó párhuzamos mintával megegyező feltételek mellett, kináz-kimérákat expresszáló CTL-sejtekkel érintkeztettünk. A BW5147-sejtekből nem volt kimutatható mértékű kromátfelszabadulás megfigyelhető.

Az 5A., 5B. és 5C. ábrán azt szemléltettük, hogy ZAP-70- és Fyn- vagy Lck-kinázok együttes expresszálódása lehetővé teszi a citolízis kiváltását, és csökkenti a kalciumválasz latenciaidejét. CTL-sejteket a fenti kimérákat expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőztünk, és azokat citolitikus képességre vagy kalciummobilizációra nézve analizáltuk. A fenti analízis a kimérák hatékonyságának alábecslését eredményezi, mivel nem határoztuk meg függetlenül a mindkét kimérát expresszáló sejtek frakcióját (az aktivitás normalizálásánál a legalább egyik kimérát expresszáló sejtek részarányát vettük figyelembe). Az 5A. ábrán CD16/7/kináz kiméra párokat expresszáló CTL-sejtekkel végzett citolitikus vizsgálat eredményeit mutatjuk be. Az 5B. ábrán CD16/7/kináz kiméra párokat expresszáló TCR-negatív sejtek kalciumválaszát ábrázolja. Az 5C. ábrán CD4/CD7/Fyn-kimérát és CD16/CD7/ZAP-70-kimérát együttesen expresszáló CTL-sejtek alkalmazásával végzett citolitikus vizsgálat eredményeit szemléltetjük. Pozitív kontrollként CD16/7/zéta-kiméra szolgált, negatív kontrollként pedig CD16/7/FcRIIB2-kimérát alkalmaztunk.

A 6A. és 6B. ábrán azt szemléltetjük, hogy deléciókat vagy pontmutációkat tartalmazó kináz-kimérák hatástalanok a kalciummobilizáció és az célzott citolízis kiváltásának vonatkozásában. Kinázaktivitással nem rendelkező fúziósprotein-variánsokat állítottunk elő delécióval (a Syk-kináz esetében) vagy pontmutációval (a ZAP-70 esetében), és azokat kalciummobilizációra és citolitikus képességre nézve teszteltük.

A 6A. ábrán a TCR-negatív sejtekben létrejött kalciumválaszt ábrázoltuk.

A 6B. ábrán célzott citolitikus vizsgálat eredményeit mutatjuk be.

A 7A., 7B. és 7C. ábrán az látható, hogy humán Syk-kiméra-alapú kimérák lényegében megegyező hatásúak a sertés Syk-kiméra-alapú kimérákkal. A 7A. ábra a humán Syk-kiméra szekvenciáját ábrázolja (5. azonosító számú szekvencia) összehasonlítva a sertés Syk-kiméra szekvenciájával (6. azonosító számú szekvencia); az első 11 aminosavat és az utolsó 7 aminosavat a láncindító oligonukleotidszekvenciák határozták meg. A 7B. ábrán humán Syk-kimérát expresszáló TCR-negatív sejtek alkalmazásával végzett kalciummobilizációs vizsgálat eredményeit szemléltetjük. A 7C. ábrán humán Syk-kimérát expresszáló CTL-sejtek alkalmazásával végzett célzott citolitikus vizsgálat eredményeit ábrázoltuk.

A 8. ábrán az látható, hogy kiméra-kinázok közti keresztkötések létrehozását követően megváltozott tirozinfoszforilezési minta figyelhető meg. A fenti kimérákat vagy kimérapárokat expresszáló, T-sejt-antigén-receptorra nézve negatív Jurkat-sejteket anti-CD16-ellenanyaggal és kecskében termelt antiegér IgG második ellenanyaggal kezeltünk, majd lizáltattunk, poliakrilamid-gélen frakcionáltunk, nitro-cellulózra vittünk át, és antifoszfotirozin-ellenanyaggal érintkeztettünk. A (+) jellel jelölt csíkok olyan sejtekből készített extraktumoknak felelnek meg, melyekben keresztkötéseket hoztunk létre, a (-) jellel jelzett csíkoknak megfelelő sejteket a másodlagos ellenanyag hozzáadását mellőzve, közvetlenül lizáltuk. Kontrollcsíkokat intracelluláris domént nem tartalmazó CD16/7 fúziós proteineket expresszáló TCR-negatív sejtek hasonló kezelésével kaptunk. Összehasonlításképp, a jobb oldalon anti-CD3-ellenanyaggal történő kezelés hatását ábrázoltuk TCR-pozitív Jurkat-sejtekben (vad típusú vacciniavírussal történt fertőzés mellett vagy anélkül). Az ábra bal oldalán, 100 kD közelében látható feltűnő csíkok megfelelnek a kináz-kimérák várható molekulatömegének.

A 9. ábra foszfolipáz-C-d tirozinfoszforileződését mutatja kimérák aggregációját követően. PLC-nl-et olyan sejtekből állítottunk elő immunprecipitációval, amelyekben ellenanyag-keresztkötések jöttek létre, az immunprecipitátumokat géleken frakcionáltuk, nitro-cellulózra vittük át, és antifoszfotirozin-ellenanyaggal érintkeztettük. Syk-kimérák aggregációját követően a foszforilezett PLC-D1 mennyiségének jelentős emelkedése volt megfigyelhető, míg Fyn- és ΖΑΡ-70-kimérák koaggregációját követően

HU 225 689 Β1 sokkal korlátozottabb, de könnyen észlelhető növekedés volt kimutatható.

A 10A. ábrán és 10B. ábrán in vitro kinázmeghatározási eljárásokat mutatunk be. Kiméra-kinázokat expresszáló sejteket ellenanyag által közvetített kiméra-keresztkötések létrehozásának vetettünk alá, melyet követően a kinázokat immunprecipitáltuk, és az immunprecipitátumokban meghatároztuk az endogén szubsztrát foszforileződését. A 10A. ábrán immunprecipitált kináz-kimérák aktivitását hasonlítottuk össze, tízperces inkubációs időszak során, keresztkötéseket tartalmazó (+) és keresztkötéseket nem tartalmazó (-) sejtekből izolált immunprecipitátumok alkalmazásával. A 10B. ábrán foszfátjelölés Syk-kináz-kiméra által kiváltott beépülése látható endogén szubsztrátokba, az idő függvényében, keresztkötések létrehozása mellett (+) vagy anélkül (-).

Aggregálódott tirozinkinázok közvetítésével létrejött T-sejt-aktiváció

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány előnyös megvalósítási módjait. A leírásban bemutatjuk, hogy nem receptor kinázok egyszerű, csoportosulással járó események révén aktiválódnak. Mesterséges receptorkinázokat állítottunk elő, melyek intracelluláris doménjai tartalmazták a teljes Src- vagy Syk-kinázok családjába tartozó kinázszekvenciákat, és vizsgáltuk külső, keresztkötéseket létrehozó stimulusok hatására létrejövő aggregációjuk következményeit. Nyilvánvaló eltérést tapasztaltunk a Syk- és Src-családba tartozó kinázok aktivitása között: az utóbbiak között létrejött keresztkötések nem vezettek szignifikáns sejtaktivációhoz, míg az előbbiek között létrejött keresztkötések szabad intracelluláris kalciumionok megjelenéséhez, és a Syk-kináz esetében citolitikus képességhez vezettek. Az a nehézség, hogy ΖΑΡ-70-kimérák esetében nem sikerült disztális receptor közvetítette programot kiváltani áthidalható oly módon, hogy a ΖΑΡ-70-kimérákat Fyn- vagy Lck-kináz-kimérákkal aggregáltatjuk. A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség céljából a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

Protein-tirozin kináz kimérák előállítása és hatékonyságuk kimutatása

Sejtfelszíni receptorkinázokra emlékeztető proteineket kódoló génfúziókat állítottunk elő oly módon, hogy a CD16-molekula extracelluláris doménját kódoló DNS-fragmenst a CD7 membránközeli és transzmembrándoménjait kódoló rövid betét- („spacer”) szegmenshez kapcsoltuk, amely utóbbit viszont a humán Lek [Koga és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 16, 1643 (1986)], az egér Fyn(T) [Cooke és Perimutter: New Bioi. 1, 66 (1989)], a sertés Syk [Taniguchi és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 15790 (1991)], valamint a humán ZAP-70 [Chan és munkatársai: Cell 71, 649 (1992)] tirozinkinázok teljes kódolószekvenciájához kötöttük (1 A. ábra). Az így kapott, három részből álló génfúziókat homológ rekombinációs technikával és az E. coli gpt-géntermék koexpressziójára történő szelekcióval rekombináns vacciniavírusokba juttattuk. Sejtek fertőzése a rekombinánsokkal mind a négy kináz-kiméra hatékony sejtfelszíni expresszálódását eredményezte (1B. ábra). A kapott proteinkimérák anti-CD16-ellenanyagokkal történő immunprecipitációjával a vártnak megfelelő molekulatömeggel rendelkező molekulák jelenlétét sikerült kimutatni, melyek in vitro foszforilezési vizsgálati eljárás szerint aktívnak bizonyultak (1C. ábra).

Ezt követően azt vizsgáltuk, hogy a fúziós proteinek közti keresztkötések kialakulása lehetővé teszi-e szabad intracelluláris kalcium felhalmozódását, hasonló módon ahhoz, ami T-sejt-antigén-receptor intracelluláris doménjain alapuló fúziós proteinek esetében megfigyelhető. Ebből a célból különböző sejteket vacciniarekombinánsokkal fertőztünk, és az extracelluláris doménok ellenanyagokkal történő keresztkötését követően mértük a citoplazmában a relatív kalciumkoncentrációt. Mind spektrofluorometriás (nagyobb sejtpopulációra vonatkozó), mind „flow-citometriás” (különálló sejtekre vonatkozó) méréseket végeztünk, lndo-1-festékkel telített sejtek alkalmazásával [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260, 3440 (1985); Rabinovitch és munkatársai: J. Immunoi. 137, 952 (1986)]. „Flow-citometriás” analíziseket olyan sejtekből származó adatok alapján végeztünk, melyeknek a fikoeritrinfluoreszcencia-intenzitás alapján meghatározott sejtfelszíni CD16-expressziója egy viszonylag keskeny, előre meghatározott tartományba esett. Bár a fenti tartományban az átlagos fluoreszcencia intenzitásának vonatkozásában kismértékű variációkat észleltünk (a sejtek által expresszált kimérák felszín alatti eloszlásában megfigyelhető eltérések következtében), ez a megközelítési mód lehetővé tette számunkra, hogy körülbelül azonos számú receptort hordozó sejtekben létrejött válaszreakciókat összehasonlítsunk. A 2. ábra Jurkat-féle, humán T-sejtes leukémia-sejtvonal mutációs variánsához tartozó sejtekből származó adatok analízisét mutatja, mely sejtvonalból hiányzik a T-sejt-antigén-receptor [Weiss és Stobo: J. Exp. Med. 160, 1284 (1984)]. Ezekben a sejtekben sem a Lek-, sem a Fyn-kimérák nem rendelkeztek azzal a képességgel, hogy keresztkötések létrejöttét követően kalciummobilizációt idézzenek elő. Néhány kísérletben az Lek fúziós proteinek csoportosulása a nyugalmi kalciumkoncentráció enyhe csökkenéséhez vezetett a negatív kontrolihoz képest, amely az FcRIIB2 jelű, alacsony affinitású IgG-receptor intracelluláris doménján alapuló fúziós protein volt [Kolanus és munkatársai: EMBO J. 11, 4861 (1992)]. Mind a ZAP-70-, mind a Syk-kinázokon alapuló fúziós proteinek aggregációja nagy hatékonysággal elősegítette az intracelluláris szabad kalciumion megjelenését, nagyjából olyan hatékonysággal, mint a Τ-sejt-receptor zéta-lánc intracelluláris doménját hordozó, hasonló kimérák aggregációja. A kal14

HU 225 689 Β1 ciumválasz kezdetének vonatkozásában mind a ZAP-70-, mind a Syk-kináz-kimérák esetében kismértékű késleltetést észleltünk a zéta-kiméra által történő kalciummobilizálódás kezdetéhez viszonyítva. T-sejtreceptor-pozitív sejtekben (3. ábra) a Syk-kimérák által létrehozott változások értékelését némileg zavarta a magas nyugalmi szabad kalciumion-koncentráció, ami a kalciumkoncentrációt szabályozó rendszer folyamatos működésére utal.

A kimérák citolitikus T-sejtvonalba történő juttatása lehetővé tette a fúziós proteinek effekorfunkciót kiváltó képességének vizsgálatát. Ebben a vizsgálati eljárásban anti-CD16 hibridómasejtekét alkalmaztunk célsejtekként, melyek CD16-receptorral szemben sejtfelszíni IgG-ellenanyagokat expresszálnak [Fleit és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3275 (1982); Shen és munkatársai: Mól. Immunoi. 26, 959 (1989)]. A hibridómasejteket ⁵¹Cr-kromát-beépüléssel jelöltük, és azokat olyan effektorsejtekkel együtt ülepítettük, amelyeket humán allospecifikus citotoxikus T-limfocita (CTL)-sejtvonalnak CD16/CD7/kináz fúziós proteineket expresszáló vacciniarekombinánsokkal történő fertőzésével állítottunk elő. A kimérareceptor-kinázok expresszálódása a fertőzött CTL-sejteket képessé teszi a célsejtekhez történő kötődésre, és amennyiben kompetens sejtekről van szó, azok lizálására, amely folyamatot a beépült ⁵¹Cr-kromát felszabadulásán keresztül mértünk. A felfegyverzett („armed”) CTL-sejtek relatív lizálóképességét oly módon határoztuk meg, hogy összehasonlítottuk a meghatározott mértékű ⁵¹Cr-felszabaduláshoz szükséges effektorsejt/célsejt arányokat. A 4A. ábra azt mutatja, hogy az Src-családba tartozó Lek- vagy Fyn(T)-kinázokat, vagy a Syk-kinázok családjába tartozó ZAP-70 kinázt tartalmazó kimérareceptorokat expresszáló CTL-ek nem képesek citolízis közvetítésére anti-CD16 hibridómacélsejtekkel szemben. A Syk-protein-termékeken alapuló kináz-kimérákat expresszáló CTL-ek hatékonysága azonban lényegében megegyezett olyan kimérákat expresszáló CTL-ek hatékonyságával, amelyek a CD16-ot az előzőhöz hasonló módon, T-sejt-receptor zéta-láncának intracelluláris doménjával fuzionáltatva tartalmazták. A CD16/CD7/kináz-kimérák által kiváltott citolitikus aktivitás nem magyarázható citotoxikus granulák nemspecifikus felszabadulásával, mivel krómmal telített semleges célsejtek együttes szedimentációja a kinázokkal felfegyverzett CTL-limfocitákkal nem eredményezte jelölt króm kimutatható mértékű felszabadulását (4B. ábra).

A citolitikus vizsgálati eljárásban a Syk- és ΖΑΡ-70-kinázok aktivitása közt tapasztalt eltérés nem felelt meg a várakozásnak, tekintve, hogy a két kiméra a kalciumválasz vizsgálatára szolgáló eljárásban hasonló aktivitást mutatott. Figyelembe véve, hogy nem kiméra ΖΑΡ-70-kináz és Src-családba tartozó kinázok koexpresszlója COS-sejtekben aktivációt hoz létre [Chan és munkatársai: Cell 71, 649 (1992)], megvizsgáltuk kináz-kiméra párok citolízist létrehozó relatív képességét. CTL-effektorsejteket egyszerre, ZAP-70- és Lck-kimérákat, ZAP-70- és Fyn(T)-kimérákat, vagy

Lek- és Fyn(T)-kimérákat expresszáló rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk. Az 5A. ábrán látható, hogy ZAP-70- és Fyn(T)-kimérák, vagy ZAP-70- és Lck-kimérák együttes expresszálódása CTL-limfocitákban a csak CD16/CD7/Syk-kináz-kimérákat expresszáló CTL-limfociták aktivitásával lényegében megegyező aktivitást hozott létre, amely aktivitás viszont megegyezett a CD16/CD7/zéta-kimérák által kiváltott aktivitással. A Lek- és Fyn(T)-kimérák együttes expresszálódása nem hozott létre jelentős célzott citolitikus hatást anti-CD16 célsejtekkel szemben (5A. ábra). A kalciummobilizációs képesség vizsgálata kináz fúziós protein párokkal fertőzött sejtekben azt mutatta, hogy a ZAP-70- és az Src-családba tartozó kináz-kimérák együttes expresszálódása növelte a receptor-keresztkötések hatására létrejövő kalciummobilizáció sebességét, valamint a Lek- és Fyn(T)-kimérák együttes expresszálódása nem eredményezte intracelluláris szabad kalcium jelentős mértékű felhalmozódását (5B. ábra). A Fyn-kimérák koaggregáció által kiváltott aktivációs válaszreakcióban betöltött szerepének további vizsgálata céljából olyan Fyn-kimérákat állítottunk elő, melyek a CD16-kimérákhoz hasonló módon Fyn-kinázhoz fuzionáltatva tartalmazták a CD4 extracelluláris és transzmembrándoménját. Az 5C. ábra azt mutatja, hogy ennek a kimérának a hatékonysága célzott citolitikus vizsgálati eljárásban tízszer-hússzor alacsonyabb volt, mint a hasonló CD16-kiméráé, ami arra utal, hogy a kiméra-kinázok között létrejövő fizikai kapcsolat lényeges az aktiváció szempontjából. A mindkét kimérát expresszáló sejtek citolitikus aktivitása azonban lényegesen nagyobb, mint a csupán ΖΑΡ-70-kimérát expresszáló sejtek esetében tapasztalható aktivitás. A fenti rendszerben a viszonylag magas szintű kinázexpresszálódás következtében nem lehet kizárni azt, hogy a maradékaktivitás a CD4/Fyn-kimérának CD16/ZAP-70-kimérával történő spontán, véletlenszerű kapcsolódását tükrözi.

Annak bizonyítása céljából, hogy a kalcium-válaszreakciós, valamint citolitikus vizsgálati eljárásokban megfigyelhető aktiválódás a megfelelő kinázaktivitás közvetlen következménye volt - és nem annak tudható be, hogy a kinázok meglevő szignáltranszdukciós elemekkel passzív módon összekapcsolódtak, majd azok közvetett aggregációja váltotta ki az aktivációs válaszreakciót -, mind a sertés Syk-, mind a humán ΖΑΡ-70-receptor-kimérák esetében kináznegatív variánsokat állítottunk elő. A 6. ábra azt mutatja, hogy a lényegében a teljes kinázdoméntól mentes receptorkimérák (a Syk-kináz esetében), vagy a foszfotranszferázaktivitást megszüntető pontmutációt hordozó receptorkimérák (a ZAP-70 esetében) nem rendelkeztek ín vitro kinázaktivitással, és keresztkötések létrejöttét követően nem voltak képesek kalciummobilizálás közvetítésére, és nem voltak képesek receptor közvetítette célzott citolízis kiváltására.

Mivel a sertés Syk-kináz és a humán sejtapparátus közti kölcsönhatás módja nem feltétlenül egyezik meg a humán Syk-kináz által kialakított kölcsönhatás módjával, humán Syk-kinázon alapuló, a fentiekhez hason15

HU 225 689 Β1 ló proteinkimérákat állítottunk elő azt követően, hogy humán Syk-szekvenciákat izoláltunk PCR-eljárással, a sertés-proteinszekvencia aminoterminális és karboxiterminális végeinek megfelelő láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. A 7A. ábrán az látható, hogy a sertés és humán Syk-kináz rendkívül hasonló proteinek, amint azt a kináz és a második SH2-domén-részeknek megfelelő PCR-termékek analízise bizonyítja [Chan és munkatársai: Cell 71, 649 (1992)]. Ezzel összhangban a humán Syk-kiméra-receptor-proteinek a kalciumfelszabadulási és citolitikus vizsgálati eljárásokban lényegében a sertéskonstrukciókkal megegyező módon viselkedtek (7B. és 7C. ábra).

Annak megállapítása céljából, hogy a protein-tirozin kináz kimérák aggregációja jelentős mértékű változást hoz-e létre a foszfotirozin-proteinek mennyiségében, T-sejt-receptor-negatív sejteket a kimérakinázokat kódoló vacciniarekombinánsokkal fertőztünk. A kimérák extracelluláris doménjai között ellenanyagokkal keresztkötéseket hoztunk létre, és az aktivált sejtek teljes lizátumát elektroforézissel frakcionáltuk, membránra vittük át és foszfotirozint felismerő ellenanyagok alkalmazásával analizáltuk. Lizátumokat a sejtek nemionos detergenssel, vanadát jelenlétében, EDTA alkalmazásával vagy anélkül történő roncsolásával, vagy nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében történő lizálással, majd a felszabadult DNS ultrahanggal történő darabolásával állítottunk elő. A foszfotirozin-proteinek mintája mindegyik esetben eltérő volt, és vanadát jelenlétében, de EDTA alkalmazása nélkül készült lizátumokban olyan további proteinek voltak megfigyelhetők, amelyek a csupán SDS-sel előállított mintákban nem voltak jelen, ami azt jelenti, hogy az EDTA a lízist követően gátolhatja a tirozinkinázok, valamint foszfatázok hatását. SDS-ben történő közvetlen lizálás sokkal reprodukálhatóbb protein-tirozin-foszforileződési mintákat eredményezett, mint nemionos detergensben, EDTA és vanadát jelenlétében végzett lizálás. A 8. ábra azt mutatja, hogy Syk-, ZAP70-, vagy Fyn- és ΖΑΡ-70-kinázokat hordozó kimérák aggregációja több olyan proteintípus fokozott foszforileződését eredményezi, melyek együtt vándorolnak antigénreceptor-keresztkötések létrejöttét követően fokozott foszforileződést mutató proteinekkel. Közelebbről, a Syk-kimérák csoportosulása által létrehozott csíkminta nagyon hasonló ahhoz, amelyet T-sejt-receptor-pozitív sejtekben anti-CD3-ellenanyagok váltanak ki (8. ábra). Ezek között található egy Syk-kiméra-aggregáció által kiváltott, körülbelül 150 kd protein, amelynek megjelenése Fyn- és ΖΑΡ-70-kimérák koaggregációjával szintén kiváltható. Előzetes kísérletek szerint ez a foszfoprotein együtt vándorol foszfolipáz-Cü-val (az adatokat nem tüntettük fel).

Abból a célból, hogy a kináz-kimérák csoportosulásának PCL-D-ra kifejtett közvetlen hatását megvizsgáljuk, kimérák között keresztkötéseket hoztunk létre, a PCL-ü-t monoklonális ellenanyagok elegyével precipitáltuk, és a kapott immunprecipitátumokban analizáltuk a foszfotirozil-proteinek jelenlétét. A 9. ábra azt mutatja, hogy a Syk-klnáz csoportosulása a PCL-ü tirozin-foszfát tartalmának jelentős emelkedéséhez vezetett, míg Fyn- és ΖΑΡ-70-kimérák közti keresztkötések létrehozása a tirozin-foszfát-tartalom kevésbé drámai, de könnyen kimutatható emelkedését eredményezte. A csupán Fyn-kimérát expresszáló sejtekben a PCL-ü mérsékelt, alapszintű foszforileződése volt kimutatható, amely receptoraggregációt követően nem növekedett (9. ábra). Még nem ismert, hogy ugyanazok a tirozin aminosavak foszforileződnek-e a Syk-, Fyn-, valamint ZAP-70- és Fyn-kimérák által. Mivel Fyn-kimérát expresszáló sejtekben sem nyugalmi, sem indukált kalciummobilizáció nem volt kimutatható, a fenti sejtek esetében megfigyelhető foszfotirozinszignál valószínűleg a foszfolipázaktivációt közvetítő helyektől eltérő PCL-O-helyek részvételét tükrözi.

Hogy a foszfotirozinmintában megfigyelhető változásokra magyarázatot kapjunk, előzetes kísérleteket végeztünk, melyekben a különböző kinázok aggregációjának kiváltását követően, egy in vitro autofoszforilezési vizsgálati eljárásban meghatároztuk azok aktivitását. A kimérákat aggregáltattuk, immunprecipitáltuk, és meghatároztuk azon képességüket, hogy mennyiben idézik elő foszfátjelölés beépülését az immunprecipitátumban található proteinfajtákba. A 10A. ábra azt mutatja, hogy ezen feltételek mellett, keresztkötések létrehozását követően nem volt megfigyelhető a kinázaktivitás növekedése, amennyiben a kinázaktivitási vizsgálatot tíz percig végeztük. Bár a jelölt foszfát beépülése a fenti vizsgálati eljárásban 30 percig folyamatosan növekedett, nem világos, milyen faktorok korlátozzák az aktivitást; az adott esetben a megfigyelt kinetika vonatkozásában döntő lehet az immunkomplexek disszociációjának aránya, amely lehetővé teheti a kináz fel nem használt szubsztrátokhoz történő diffúzióját. Az előbbi hatás kiküszöbölése, valamint a vizsgálati eljárás érzékenységének maximalizálása céljából meghatároztuk a Syk-kináz-aktivitást keresztkötések létrehozását követően, valamint azt megelőzően, egy igen rövid, 5-30 másodperces időtartam során; ebben az esetben sem volt azonban a kinázaktivitás jelentős növekedése megfigyelhető (10B. ábra). Nem zárható ki az a lehetőség, hogy megfelelő szubsztrát alkalmazásával az aktivitás növekedését tudnánk kimutatni; aggregáció által kiváltott fokozott Syk-kiméra-aktivitás akkor sem volt észlelhető, amikor a kinázaktivitás meghatározására exogén peptidszubsztrátot (a cdc-2 aminosavszekvencia 6-20. aminosavai, a 19. pozícióban Y-K szubsztitúcióval) alkalmaztunk.

Az alábbiakban részletesen tárgyaljuk a fenti jelenség lehetséges mechanizmusait.

Az a mechanizmus, amely révén egy egyszerű fizikai stimulus, nevezetesen receptoraggregáció, az immunrendszer sejtjei számára elkülöníthető kémiai szignál átvitelét eredményezi, nem ismert. Korábbi vizsgálatok során megállapították, hogy az Src-családba tartozó kinázok számos fontos, az immunrendszer aggregáció révén aktiválódó receptorával kapcsoltan megtalálhatók, és az ilyen receptorok közti keresztkötések létrehozása gyakran, fokozott kinázaktivitáshoz vezet. Nemrégiben az egymással rokonságban álló Syk- és

HU 225 689 Β1

ΖΑΡ-70-kinázokról mutatták, ki, hogy stabilan (a Syk esetében) vagy átmenetileg (a ZAP-70 esetében) Bés T-sejt-antigén-receptorokkal kapcsolódnak, és legalább a Syk-kináz esetében - receptor-keresztkötések létrejötte fokozott kinázaktivitást eredményez.

Vizsgálataink során kimutattuk, hogy a Syk-kinázok családjába tartozó kinázok aggregációja - de az Src-családba tartozó Lek- és Fyn-kinázok aggregációja nem - T-sejt-receptort nem hordozó sejtekben kalcium-válaszreakciót hoz létre. A válaszreakció úgy tűnik, nem más T-sejt-receptorokkal vagy szignáltranszdukciós összetevőkkel történő közvetett kapcsolódás révén jön létre, mivel kináznegatív mutánsok nem képesek a kalcium-válaszreakció kiváltására. A Syk-kinázt tartalmazó kimérák aggregációja elegendő specifikus citolízis kiváltásához, míg a ΖΑΡ-70-kimérával létrehozott hasonló citolízishez szükség van egy Src-kinázok családjába tartozó kináz további közreműködésére. Nem világos, hogy melyik, Syk-családba tartozó kináz játszik fontosabb szerepet a T-sejt-aktiválásban: mind a ZAP-70-, mind a Syk-kináz expresszálódik T-sejtekben, például a saját vizsgálatainkban alkalmazott sejtvonalakban, és specifikus PCR-amplifikációs termékek alapján, legalább egy, válaszreakcióra képes humán T-sejtvonalról megállapítottuk, hogy az tartalmaz Syk-kinázt, de nem tartalmaz ΖΑΡ-70-kinázt. A Syk-kimérák csoportosulását követően megfigyelhető, fokozott protein-tirozin-foszforileződésre utaló minta igen hasonló ahhoz a mintához, amelyet T-sejt-antigén-receptorok keresztkötését követően láthatunk.

Immunrendszert sejtek nem receptor tirozin kinázok által történő aktiválása egy egyszerű modell szerint receptorral kapcsolt kinázok közreműködésével történik, amelyek aggregációja fizikai kapcsolódás (például aktív kinázdimerek képződése révén) vagy egyidejű enzimatikus hatás révén (például keresztfoszforileződés révén) vezet aktiváláshoz; az aktivált enzim ezután a kalciummobilizációhoz és inozitol-foszfát-szintézishez szükséges, kulcsfontosságú intracelluláris szubsztrátokra fejti ki hatását. Ennek az eseménysornak a bekövetkeztét valószínűsítik azok a vizsgálatok, melyek receptorok közti keresztkötések létrejöttét követően fokozott, receptorral kapcsolatos kinázaktivitásról adnak hírt [lásd például Bólén és munkatársai: Adv. Cancer Rés. 57, 103 (1991); Burkhardt és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7410 (1991); Eisman és Bólén: Natúré 355, 78 (1992); Hutchroft és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992); Hutchroft és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 8613; Tsyganov és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 18 259 (1992); Wong és munkatársai: Oncogene 7, 2407 (1992)]. A legtöbb esetben azonban, a foszfotirozil-protein-mintában in vivő megfigyelhető drámai változásokkal szemben, a kinázaktivitás tekintetében csak mérsékelt változásokat tudtak kimutatni. Mivel in vitro kinázaktivitási vizsgálati eljárások alkalmazása mellett nehéz egyértelműen kizárni gyenge alloszterikus kölcsönhatások szerepét az aktiválásban, nem lehet határozott álláspontot elfoglalni a kinázaktiválásnak a szignáltranszdukció kiváltásában betöltött viszonylagos fontosságára vonatkozólag. Az itt feltárt adatok azonban arra utalnak, hogy enzim és szubsztrát aggregáció által kiváltott újraeloszlása lényeges faktor lehet egy meglevő aktivitásnak megfelelő fiziológiai célponttal szemben történő irányításában.

Syk-családba tartozó kinázokon alapuló kimérák aggregációja kalcium-válaszreakcióhoz vezetett, amely kismértékben késleltetett volt, de amplitúdója megfelelt az endogén T-sejt-receptort nem tartalmazó sejtekben zéta-receptor-kimérák aggregációját követően megfigyelhető válaszreakciónak. A ΖΑΡ-70-kimérák közti keresztkötések kialakulását követően a szabad kalciumion megjelenésében sokkal nagyobb késleltetés volt megfigyelhető, és ez a késleltetés ZAP-70- és Fyn-kimérák közti keresztkötések létrehozásával lényegében megszüntethető volt. A megfigyelt késleltetés magyarázata még nem ismert. Mivel a keresztkötések létrejötte felgyorsította a kalciummobilizációt, a késleltetés magyarázatául szolgálhat a ZAP-70 viszonylag kisebb hatékonyságú aggregáció által közvetített autoaktivációja. De egyéb faktorok épp ilyen fontosak lehetnek, és a ZAP-, valamint Syk-kinázok sejtfelszínhez történő „kipányvázása” az események rendes menetével összehasonlítva valójában gátolhatja az aktivációt; például ha az események rendes menete során a Syk-családba tartozó kinázok átmenetileg a csoportosult receptorok köré gyűlnek, aktiválódnak, majd felszabadulnak és szubsztrátjaikhoz diffundálnak, a kinázdomén állandó kapcsolódása a plazmamembránnal korlátozó hatást fejthet ki, gátolva a szubsztráthoz történő eljutást és/vagy korlátozva a szignálamplifikációt, mivel a kimérareceptor nem képes a kinázaktiválás számára egyfajta katalitikus centrumként funkcionálni.

A kalcium-válaszreakció másik különleges sajátossága az volt, hogy humán vagy sertés Syk-kinázokon alapuló kimérákat expresszáló T-sejt-receptor-pozitív sejtekben magas alapszintű szabad kalciumion-koncentráció volt megfigyelhető, ami azt jelenti, hogy a kalcium-válaszreakció spontán módon kiváltódott. Receptornegatív sejtekben nem sikerült hasonló jelenséget kimutatni. Ez az eredmény szemben áll az általunk megfigyelt általános tendenciával, mely szerint T-sejt-receptor-negatív mutáns, humán T-sejtes tumorsejtvonalak tipikusan hiperszenzitív válasszal reagálnak kívülről bejuttatott kiváltómolekulákra. A spontán aktivációs folyamatban T-sejt-receptorok részvételére való nyilvánvaló igény magyarázatára két lehetséges, egymáshoz közel álló feltevésünk van. Az egyik szerint a kiméra Syk-kináz folyamatosan fejti ki hatását a T-sejt-receptor intracelluláris doménjaira úgy, hogy a receptorkiméra SH2-doménjai számára foszfotirozin-célcsoportokat hoz létre, ily módon multivalens T-sejt-receptor-hídon keresztül intracelluláris aggregációhoz vezet, ami viszont kinázaktivációt eredményez. Egy másik lehetőség szerint T-sejt-receptor-negatlv sejtvonalakban a Syk-kináz aktiváláshoz szükséges, membránnal kapcsolatos kinázszint alacsonyabb; vagy azért, mert a teljes szabályozó kör a feltételezett kinéz

HU 225 689 Β1 csökkent de novo szintéziséhez vezet, vagy azért, mert az antigénreceptor hiánya szabályozatlan intracelluláris megoszlást eredményez.

B-sejtekben a Syk-kinázról leírták, hogy az állandó kapcsolatban van az IgM antigénreceptor intracelluláris elemeivel [Hutchroft és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992); Hutchroft és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 8613 (1992)]. Ennek a kapcsolódásnak a pontos mechanizmusa nem ismert, de lehetséges, hogy nincs szükség foszfotirozinra a Syk-kináz SH2-doménjai, valamint a mb-1 citoplazmatikus doménján és Β-29-receptorláncokon jelen levő tirozin kiváltóelemek közti kölcsönhatáshoz. Ezt a magyarázatot támasztja alá részben az a megfigyelés, hogy a Philadelphia-kromoszóma töréspont-csoportrégió („breakpoint cluster region) BCR-génterméke foszfotirozinindependens módon, különböző SH2-doménokhoz kötődik [Pendergast és munkatársai: Cell 66, 161 (1991); Muller és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 5087 (1992)]. Ebben az esetben azonban valószínűnek látszik, hogy a kölcsönhatásban foszfoszerin és/vagy foszfotreonin aminosavak játszanak kulcsfontosságú szerepet. Más magyarázat szerint a Syk-kináz az IgM-receptor intracelluláris elemeivel kapcsolódhat a Syk-kináz SH2-elemei és a katalitikus dómén között található egyedi régión keresztül. Egy harmadik lehetőség szerint igen kis mennyiségű tirozinfoszforilezett pepiidre van szükség funkcionálisan számottevő mennyiségű Syk-kináznak a plazmamembrán intracelluláris felszínéhez történő gyűjtéséhez, és ezt az kis mennyiségű tirozin-foszfátot eddig nem sikerült kimutatni.

Bár B-sejtek esetében az Src-családba tartozó kinázok aktivációs folyamatban betöltött szerepét nem mutatták ki határozottan, T-sejtekben található két kinázról, az Lek- és Fyn(T)-kinázokról szomatikus vagy teljes szervezeti genetikával kimutatták, hogy lényeges szerepet töltenek be [Appleby és munkatársai: Cell 70, 751 (1992); Karnitz és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 4521 (1992); Stein és munkatársai: Cell 70, 585 (1992)]. Jelenleg nem tudjuk határozottan megmondani, hogy a fenti kinázok működése normális körülmények között megelőzi vagy követi a Syk-családba tartozó kinázokét. Egy, a ZAP-70 T-sejt-aktivációban betöltött szerepét magyarázó feltevés szerint az aktiváció egy receptorral kapcsolódó, Src-családba tartozó kináz közreműködésével megy végbe, oly módon, hogy az előbbi aggregációja lehetővé teszi receptorláncok átmeneti foszforileződését, ami viszont ΖΑΡ-70-kináz kapcsolódásához, majd sejtaktivációhoz vezet. A fenti modellben a receptorláncok kezdeti fázisban történő foszforileződését meg kell különböztetnünk a zétaláncok stabil foszforileződésétől, ami hosszabb távon, receptor-keresztkötések létrejöttét követően megy végbe.

Egér T-sejtekben a T-sejt-receptor-komplexek kis része zétával rokonságot mutató éta-molekulát tartalmaz [Baniyash és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 9874 (1988)], amely egy alternatív összeállítási formát képvisel [Clayton és munkatársai: Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 88, 5202 (1991)]. Az éta- a zéta-molekulától annak karboxiterminális végén különbözik; az előbbi esetében, az egér zéta-molekulában található hat tirozinból a legszélső hiányzik [Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 (1990)]. Bár egér TCR zéta-zéta-izoformok zéta-láncának foszforileződése ellenanyag által közvetített receptor-keresztkötések létrehozását követően könnyen kimutatható, hasonló feltételek mellett a TCR éta-láncának foszforileződése nem mutatható ki [Bauer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3842 (1991)]. A zéta-lánc stabil foszforileződéséhez úgy tűnik, két egymáshoz közel elhelyezkedő zéta-láncra van szükség, mivel zéta-éta heterodimereket tartalmazó TCR-izoformok receptor-keresztkötések létrehozását követően nem foszforileződnek [Bauer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3842 (1991)]. A foszforileződésben megfigyelhető eltérés ellenére a csupán éta-homodimereket hordozó TCR-receptorokat tartalmazó sejtvonalak funkcionálisan nem különíthetők el a csak zéta-homodimereket hordozó sejtvonalaktól [Bauer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3842 (1991)]. A zéta-lánc foszforileződése tehát, amely 30 perccel az ellenanyag által közvetített receptor-keresztkötések létrehozását követően megfigyelhető, nincs összefüggésben az aktivációval. Egy másik tanulmányban, amelyben TCR-aggregációt követően a foszfotirozin-foszfoproteinek felhalmozódásának időbeni lefolyását vizsgálták, azt találták, hogy legkorábban két, 135 kD és 100 kD molekulatömegű protein figyelhető meg, melyek foszforileződése a keresztkötések létrejöttét követően először 5 és 15 másodperc elteltével mutatható ki, és amelyek esetében a maximális foszforileződés felének eléréséhez szükséges idő - ami mindkét esetben körülbelül 30 másodperc - kisebb, mint a maximális kalciummobilizációhoz és inozitol-foszfát-képződéshez szükséges idő [June és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7722 (1990); June és munkatársai: J. Immunoi. 144, 1591 (1990)]. Ezzel szemben a zéta-lánc foszforileződésének sebessége lényegesen kisebb, ez a maximális szubsztitúció felét a stimulációt követően körülbelül 3-5 perccel éri el, jóval azután, hogy a kalciumfelhalmozódás és az inozitol-foszfátok felszabadulása megfigyelhetővé válik [June és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7722 (1990); June és munkatársai: J. Immunoi. 144, 1591 (1990)].

Amennyiben tehát a két lépésből álló modell megfelel a valóságnak, a ΖΑΡ-70-kináz plazmamembrán belső felszínéhez történő „toborzásához szükséges tirozinfoszforileződésnek a fenti vizsgálatokban megfigyelhetőnél sokkal gyorsabb, feltehetően átmeneti eseménynek kell lennie. Nemrégiben leírták, hogy receptor-keresztkötések létrejöttét követően mind zéta-, mind CD3-epszilon-láncokon elég gyorsan (körülbelül tizenöt másodperc elteltével kezdődően) meginduló tirozinfoszforileződést lehet kimutatni [Wange és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 11 685 (1992)], és mind zéta-, mind epszilon-láncokkal kapcsolódva egy 70 kD molekulatömegű, tirozin-foszfát-tartalmú protein mutatható ki. Egyelőre nem világos, hogy a foszforilezett re18

HU 225 689 Β1 ceptorláncokkal történő stabil kapcsolódás létrejötte előfeltétele-e a sikeres T-sejt-aktiválásnak.

Általánosságban azonban kijelenthetjük, hogy az általunk feltárt eredmények szerint a Syk-családba tartozó kinázok sokkal közvetlenebb módon fejtik ki hatásukat a T-sejtek effektorapparátusára, mint az Src-családba tartozó kinázok. Egyre több bizonyíték támasztja alá azt, hogy az Src-családba tartozó kinázok számos olyan sejtfelszíni molekulával kapcsolódhatnak, amelyek nem tagjai az antigén/Fc-receptor-családnak, például CD2- [Bell és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 5548 (1992)], CD23- [Sugie és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9132 (1991)], CD36-molekulákkal [Huang és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 5467 (1992)], IL-2-receptor béta-lánccal [Hatakeyama és munkatársai: Science 252, 1523 (1991)], valamint különböző, foszfatidil-inozitol által lehorgonyzott proteinekkel [Stefanova és munkatársai: Science 254, 1016 (1991); Thomas és Samelson J. Bioi. Chem. 267, 12 317 (1992)], amelyek közül egyesekről ismert, hogy T-sejtekben az aktiváció előidézéséhez az antigénreceptor jelenlétét igénylik. Az utóbbi magyarázata egyszerűen az lehet, hogy az antigénreceptoron található kiváltóelemek az Src-családba tartozó kinázok szubsztrátját képezik, ezáltal lehetővé teszik Syk-családba tartozó kinázokkal történő összekapcsolódást, majd esetleg valamilyen módosító folyamatot követően elősegítik azok aktiválását. Figyelembe véve a foszforileződés és aktiválás közti ok-okozati lánc felállításának nehézségeit, lehetséges az is, hogy a kiváltóelemek csak átmeneti szerepet töltenek be, egyfajta katalitikus centrumként működve a „toborzáshoz”, aktiváláshoz és effektorkinázok felszabadításához.

Az Src-családba tartozó kinázok számos nemhematopoetikus sejtvonalban kimutathatók, és Fyn-negatív egereken végzett újabb vizsgálatok azt mutatták, hogy Fyn-kináz szerepet játszik a hosszú távú aktivált állapot fenntartásában, azaz a facilitált szinaptikus átvitel jelenségében, amiről feltételezik, hogy az asszociatív memória kezdeti rögzülésének alapját képezi [Grant és munkatársai: Science 258, 1903 (1992)]. Amennyiben más sejttípusokban hasonló aktivációs folyamatokat Src-családba tartozó kinázok közvetítenek, a Syk-családba tartozó kinázokról is kiderülhet, hogy sokkal elterjedtebbek a vérképző rendszeren kívüli terekben.

Az alábbiakban Ismertetjük a kísérleti eljárásokat.

Kimérák előállítása: A humán Lek- [Koga és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 16, 1643 (1986)], az egér Fyn(T)- [Cooke és Perimutter: New Bioi. 1, 66 (1989)], a sertés Syk- [Taniguchi és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 15 790 (1991)], valamint a humán ZAP-70- [Chan és munkatársai: Cell 71, 649 (1992)] kinázok teljes kódolórégióját egy olyan kiméra-transzmembránprotein intracelluláris doménjához kapcsoltuk, amely a CD16 extracelluláris doménját egy rövid „nyél-szegmenshez és a CD7 transzmembrándoménhoz kötve tartalmazta. A CD7 intracelluláris domént a stoptranszfer-szekvenciánál egy Miül hasítási hely hozzáadásával csonkítottuk. Az egyes kinázokat a megfelelő olvasási fázisba illeszkedő Miül hasítási hellyel láttuk el, hogy a három részből álló fúziós protein expresszálódását lehetővé tegyük. A sertés Syk-kinázt teljes, sertés-limfocita-RNS alapján végzett reverz transzkripcióval és PCR reakcióval kaptuk, megfelelő restrikciós helyeket tartalmazó láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. Hasonló módon nyertünk ΖΑΡ-70-szekvenciákat humán T-sejt cDNS-génkönyvtár alapján végzett PCR reakcióval. Több izolátumot szekvenáltunk párhuzamosan, és mindegyik kináz esetében restrikciós fragmens cserével mutációtól mentes kódolószekvenciát állítottunk elő. Az így kapott kódolószekvenciákat a CD16/CD7 szekvenciáktól 3’-irányban vacciniavírus expressziós vektorba inszertáltuk. Humán Syk-kinázt természetes ölősejt („killer”-sejt) cDNS-génkönyvtárból és Daudi-féle sejtkönyvtárból izoláltunk, a sertésszekvencia végeinek megfelelő láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. Az előreirányuló („forward”) láncindító oligonukleotid az alábbi szekvenciával rendelkezett: ATG GCA GAC AGT GCC AAC CAC TTG CCC TTC TTC T (7. azonosító számú szekvencia), a reverz láncindító oligonukleotid pedig a következő szekvenciát tartalmazta: CGC GGG GCG GCC GCT TTA ATT CAC CAC GTC GTA GTA GTA (8. azonosító számú szekvencia). Miután az első amplifikációt követően a vártnak megfelelő méretű csíkok jelenlétét mutattuk ki, egy második (10 ciklusból álló) amplifikációt végeztünk, az 5’-végen olyan láncnövelő láncindító oligonukleotid alkalmazásával, mely az alábbi szekvenciával rendelkezett: CGC GGG ACG CGT ACC ATG GCA GAC AGT GCC AAC (9. azonosító számú szekvencia), lehetővé téve a fragmens Mlul-enzimmel hasított vektorba történő ligálását.

Kalciummobilizációs vizsgálati eljárás

Áramlási citometriás, valamint a sejtek szétválasztása nélküli spektrofotometriás vizsgálatokat végeztünk rekombináns kinázokat expresszáló sejteken kalciumszenzitív fluorofór lndo-1-festék alkalmazásával, a korábbiakban leírtak szerint [Romeo és Seed: Cell 64, 1037 (1991); Romeo és munkatársai: Cell 68, 889 (1992)]. Röviden, Jurkat-féle sejtektől származó, JRT-3.T-3.5 jelzésű mutáns sejtvonalhoz tartozó sejteket [Weiss és Stobo: J. Exp. Med. 160, 1284 (1984)] egy órán át, szérummentes IMDM-tápfolyadékban, 10-es fertőzési többszörös („multiplicity of infection, MOI) érték alkalmazása mellett rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk, majd a sejteket 3-9 órán át, 10% FBS-t (totális szarvasmarha-szérumot) tartalmazó IMDM-tápfolyadékban inkubáltuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és milliliterenként 3*10® sejt sűrűségben, 1 mmol/l lndo-1-aceto-metoxi-észtert tartalmazó teljes tápfolyadékban szuszpendáltuk [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260, 3440 (1985)] (Molecular Probes, Eugene, OR), majd 45 percig, 37 °C-on inkubáltuk. Az lndo-1-festékkel feltöltött sejteket ülepítettük, milliliterenként 1*10® sejt sűrűségben szérummentes IMDM-tápfolyadékban szuszpendáltuk, és szobahőmérsékleten, sötétben tároltuk. A sejteket a szabad kalciumion-tartalomra nézve anali19

HU 225 689 Β1 záltuk oly módon, hogy áramlásos citometriás eljárással, egymással párhuzamosan mértük a kék és viola fluoreszcenciakibocsátást [Rabinovitch és munkatársai: J. Immunoi. 137, 952 (1986)]. A kalciumáramlás megindítása céljából a sejtszuszpenzióhoz nem konjugált, 3G8 jelzésű monoklonális ellenanyagot (anti-CD16-ellenanyagot) adtunk (1 pg/ml koncentrációban), és ezt követően 0 időpontban 10 pg/ml fikoeritrinnel (PE) konjugált, kecskében termelt, antiegér lgG-F(ab')2-fragmenst adtunk; vagy PE-konjugált anti-CD4-ellenanyagot (Leu-3a, Becton Dickinson), majd nem konjugált második ellenanyagot adtunk. A viola/kék kibocsátás arányát ábrázoló hisztogramokat gyűjtöttünk a PE-pozitív (fertőzött) sejtpopulációból, amely tipikusan a sejtek 40-80%-át képviselte. Az ellenanyag hozzáadását megelőzően mérhető viola/kék kibocsátási arányt - egységnek tekintve - használtuk a kiindulási arány normalizálásához.

Limfocitacitolízis vizsgálati eljárás

Egy CD8⁺-, CD4~, HLA-B44-antigénekre korlátozódó citolitikus sejtvonalat (WH3) 10% humán szérumot tartalmazó, 100 egység/ml IL-2-vel kiegészített IMDM-tápfolyadékban tartottunk fenn, és szabályos időszakonként besugárzott (3000 rád), HLA-B44-haplotípussal rendelkező mononukleáris sejtekkel stimuláltunk. A sejteket a stimulációt követően legalább 10 napig tenyésztettük, citotoxikus vizsgálati eljárásokban történő alkalmazásukat megelőzően. A sejteket egy órán át, szérummentes tápfolyadékban, legalább 10-es fertőzési multiplicitási érték (MOI) mellett rekombináns vacciniavírusokkal fertőztük, majd három óráig teljes tápfolyadékban inkubáltuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és milliliterenként 1*10⁷ sejt sűrűségben szuszpendáltuk. U alakú fenékkel rendelkező mikrotitrálólemezek egyes mélyületeihez, amelyek 100 pl teljes tápfolyadékot tartalmaztak, 100 pl sejtszuszpenziót adtunk. A sejteket felező tovafutó hígítással hígítottuk. Mindegyik minta vizsgálata esetében két mélyület nem tartalmazott limfocitákat, hogy a spontán krómfelszabadulás és összkrómfelvétel meghatározható legyen. 10⁶ 3G8-10-2-célsejtet tartalmazó mintát [Shen és munkatársai: Mól. Immunoi. 26, 959 (1988)] centrifugáltunk, és 1 órán át, 37 °C-on, időközönként megkeverve, 50 pl steril ⁵¹Cr-nátrium-kromát-oldatban szuszpendáltunk (1 mCi/ml, DuPont), majd háromszor PBSben mostunk. Valamennyi mélyülethez 100 pl térfogatú, tápfolyadékban 10⁵/ml sűrűségben szuszpendált jelölt sejtet adtunk. A mikrotitrálólemezeket 1 percig, 750 g mellett centrifugáltuk, és 4 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. Az inkubációs idő végén a sejteket valamennyi mélyületben óvatos pipettázással felszuszpendáltuk, a beépült összbeütésszám meghatározása céljából azokból mintát vettünk, és a mikrotitrálólemezeket 1 percig, 750 g mellett centrifugáltuk. A felülúszóból 100 pl térfogatú mintát eltávolítottunk, és gamma-szclntillációs számlálóban a beütésszámot meghatároztuk. Az effektorsejt/célsejt arányt a fertőzött effektorsejtek százalékos aránya (általában 70%) alapján korrigáltuk.

Mutáns kináz-kimérák előállítása

Sertés Syk-kináz-negatív fúziósprotein-variánst állítottunk elő oly módon, hogy a kimérát Stul- és Ntol-enzimekkel emésztettük (az utóbbi hasítási hely a karboxiterminális véghez közel, attól 3’-irányban található), a Notl hasítási helyet feltöltöttük, és a végeket egymással ligáltuk. A kapott szekvenciában a sertés Syk-kinázban található első 298 aminosav a terminációt megelőzően 4, az eredeti szekvenciához nem tartozó aminosavval (GPRL) kapcsolódik. A ΖΑΡ-70-kináz ATP-kötőhelyében pontmutációt [a 369. pozícióban K (lizin) helyett G-t (glicint) tartalmazó mutánst] úgy hoztunk létre, hogy a Chan által leírt szekvencia [Chan és munkatársai: Cell 71, 649 (1992)] felső szála szerint az 1319. és 1345. pozíciók között található nukleotidok közt található Ball és Earl hasítási helyek közé egy kettős szálú oligonukleotidfragmenst inszertáltunk. A kapott szekvencia a 369. pozícióban lizin helyett glicint kódolt.

Immunprecipitáció és kinázaktivitási vizsgálati eljárás

Körülbelül 2*10⁶ HeLa-S3-sejtet egy órán át, szérummentes DME-tápfolyadékban, legalább 10-es fertőzési multiplicitási érték mellett rekombináns vacciniavírussal fertőztünk. A fertőzést követően öt (5) órával a sejteket összegyűjtöttük, foszfátpufferes fiziológiás sóoldattal kétszer mostuk, és az alábbi összetételű pufferben lizáltuk: 1% Triton-X-100, 0,15 mol/l NaCI, 0,02 mol/l HEPES (pH=7,3), 5 mmol/l EDTA, 5 mmol/l NaF, 0,2 mmol/l Na3VO4, pg/ml leupeptin, 10 pg/ml aprotinin, és 1 mmol/l PMSF. Tíz (10) perces, jégen történő inkubációt követően a sejtmagokat centrifugálással eltávolítottuk, és a CD16 fúziós proteineket BMA209/2-ellenanyag és protein-A-sepharose alkalmazásával immunprecipitáltuk. A fúziós proteinnel feltöltött kromatográfiás töltetet háromszor lízispufferrel, végül 20 mmol/l HEPES-pufferrel (pH=7,3) mostuk. Mindegyik mintához 10 pl térfogatú, 10 pCi [□-³²P]ATP-t (>3000 Ci/mmol) tartalmazó kinázpuffert adtunk [20 mmol/l HEPES (pH=7,3), 10 mmol/l MgCI2 és 10 mmol/l MnCI₂]. A reakciókat 10 percig szobahőmérsékleten hagytuk inkubálódni, és azokat 20 pl, 2-szeres töménységű mintafelvivő puffer [4% SDS, 100 mmol/l Tris (pH=6,8), 20% glicerin, valamint 10% β-merkaptoetanol] hozzáadásával állítottuk le. Miután az elegyeket 3 percig forraltuk, azokból mintát vettünk, és azokat 4-15%-os gradiensgélen futtattuk. A cdc-2 6-20. pozícióinak megfelelő oldható peptidszubsztráttal végzett kinázaktivitási vizsgálati eljárásokat, amely peptidben a 20. pozícióban található tirozint lizinnel helyettesítettük, a gyártó (UBI) utasításai szerint végeztük.

Protein-tirozin-foszforileződés analízise immunbloteljárással

TCR-negatív 3.5 jelzésű sejteket egy órán át (legalább 10-es MOl-érték mellett) rekombináns vírus törzstenyészettel fertőztünk. A sejteket ezt követően 8-12 órán át, 37 °C-on inkubáltuk, centrifugáltuk, mos20

HU 225 689 Β1 tűk, és 10⁷ sejt/ml sűrűségben szérummentes Iscoveféle tápfolyadékban szuszpendáltuk. Sejtmintákat anti-CD16 monoklonális-ellenanyaggal (3G8, Medarex vagy BMA209/2, Behringwerke) inkubáltunk; 2-3*10⁶sejthez 1 pg ellenanyagot adtunk. A stimulált mintákat 5 percig, 3-5-szörös feleslegben alkalmazott, affinitásos eljárással tisztított antiegér IgG 1-ellenanyaggal (Southern Biotechnology) inkubáltuk tovább. A sejteket ezután Secrist és munkatársai kismértékben módosított eljárása szerint kezeltük [J. Bioi. Chem. 268, 5886 (1993)]. Az inkubálást 1% végkoncentrációig SDS hozzáadásával állítottuk le, és a mintákat három percig forraltuk. A DNS-t „Heat Systems Ultrasonics, Inc.” készülék alkalmazásával, 1 percig végzett ultrahangos kezeléssel daraboltuk, az elegyhez 2*mintapuffert adtunk, 10®-2,5*10® sejtet tartalmazó mintákat poliakrilamid-géleken szétválasztottunk, és a proteineket félszáraz elektrobloteljárással (Hoefer) nitro-cellulózra („Schleicher and Schuell”, BA45) vittük át. A filtereket egy órán át, 1,5% csirkeovalbumint (Sigma) tartalmazó, 0,05% Tween-20-detergenssel kiegészített Tris-pufferes fiziológiás sóoldatban (TBST) blokkoltuk, TBST-pufferben mostuk, és 1:10 000 hígításban 4G10 jelzésű antifoszfotirozin-ellenanyagot (UBI) tartalmazó oldatba vittük át, majd 1-2 óráig, 22 °C-on inkubáltuk. A TBST-pufferrel végzett mosást követően a filtereket 1 órán át, 1:5 000 hígításban, torma-peroxidázzal konjugált, antiegér ellenanyagot tartalmazó TBST-pufferben inkubáltuk. A foszforilezett proteincsíkokat kemilumineszcenciás eljárással (ECL, Amersham) mutattuk ki. A megvilágítási idő 2 másodperc és 5 perc közé esett.

Humán lgG1:protein-tirozin kináz kimérák előállítása

Előállíthatók olyan kiméramolekulák, melyek egy ellenanyag-molekula célsejtre specifikus extracelluláris doménját, valamint egy protein-tirozin kináz (például a leírásban ismertetett kinázok) intracelluláris doménját tartalmazzák. Ilyen molekulák előállítása céljából humán-lgG1 nehéz lánc szekvenciákat állítottunk elő oly módon, hogy a Cn3-doménban található szekvenciákat az ellenanyag-mRNS transzmembrán formájának 3'-végéből származó cDNS-fragmenshez kapcsoltuk. A 3'-végi fragmenst polimeráz-láncreakciós eljárással kaptuk, szubsztrátként tonsilla (mandula) cDNS-génkönyvtár és az alábbi szekvenciákkal rendelkező láncindító oligonukleotidok alkalmazásával:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (1. azonosító számú szekvencia), valamint

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (2. azonosító számú szekvencia);

amelyek a kívánt DNS-fragmensek 5'-, valamint 3’-végeinek feleltek meg. Az 5'-végi láncindító oligonukleotid komplementer a humán-lgG1 CH_rdoménjában található szekvenciával, a 3’-végi láncindító oligonukleotid pedig komplementer a membránt átszelő domént kódoló szekvenciától közvetlenül 5’-irányban található hellyel. A PCR-terméket BstXI- és BamHI-enzimekkel emésztettük, majd variábilis, valamint konstans régiókat hordozó, félszintetikus IgG 1-ellenanyag-gén BstXI és BamHI hasítási helyei közé ligáltuk. A BstXI-BamHI-fragmens inszertálását követően a konstrukció amplifikált részeit restrikciós fragmens cserével a C_H3-ban található Smal hasítási helyig terjedően helyettesítettük úgy, hogy csak a Smal hasítási hely és a 3'-végi oligonukleotid közt található rész származott a PCR reakcióból.

Humán lgG1 kimérareceptort úgy állítottunk elő, hogy egy BamHI-végben végződő nehéz lánc gént szokásos technikák alkalmazásával, az adott kináz intracelluláris doménjához kapcsoltunk. A kimérareceptor expresszálódásának szintje áramlásos citometriás eljárással határozható meg. Az expresszió szintje egy ellenanyag könnyű lánc cDNS-t kódoló plazmid koexpressziójával fokozható.

Olyan transzkripciós egység előállítása céljából, amely egyetlen promoterről kiindulva mind nehéz, mind könnyű láncok expresszálódását lehetővé teszi, nehéz láncot és könnyű láncot kódoló szekvenciákból, valamint a grp 78-proteinként vagy BiP-proteinként is ismert, 78 kD molekulatömegű, glükóz által szabályozott proteint kódoló mRNS 5’-végi nem transzlálódó részéből egy bicisztronos mRNS-t kódoló plazmidot állítottunk elő. A grp78-szekvenciákat humán genomi DNS alapján végzett PCR-eljárással kaptuk az 5’- és 3'-végeken az alábbi szekvenciákkal rendelkező láncindító oligonukleotidok alkalmazásával:

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (3. azonosító számú szekvencia); valamint

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (4. azonosító számú szekvencia).

A fenti láncindító oligonukleotidok alkalmazásával végzett polimeráz-láncreakciót 10% dimetil-szulfoxid jelenlétében végeztük. A PCR-eljárással kapott fragmenst Notl- és Hincll-enzimekkel emésztettük, és humán IgG 1-kódolószekvenciáktól 3'-irányban található Notl és Hpal hasítási helyek közé inszertáltuk. Ezután a Hindi hasítási hely és egy, a vektorban található másik hasítási hely felhasználásával a grp78 vezetőszekvenciájától 3’-irányban humán IgG-kappa könnyű láncot kódoló cDNS-szekvenciákat inszertáltunk. A fenti eljárással nyert expressziós plazmid a következő részeket tartalmazta: a félszintetikus nehéz lánc gént, ezt követően a grp78 vezetőszekvenciát, a kappa könnyű lánc cDNS-szekvenciát, valamint SV40 DNS-fragmensből származó poliadenilezési szignálokat. A korábbiakban kimutattuk, hogy COS-sejtek transzfekciója a fenti expressziós plazmiddal jelentősen megnövelte a nehéz lánc determinánsok expresszálódást, a csak nehéz lánc determinánsokat kódoló plazmiddal történő transzfekcióhoz képest.

Olyan bicisztronos gén előállítása céljából, amely nehéz lánc/receptor kimérát és könnyű láncot is tartalmaz, az 5’-irányban található nehéz lánc szekvenciákat a fent ismertetett bármely kiméra nehéz lánc/receptorgén szekvenciával helyettesíthetjük.

Előállításukat követően az IgG-tirozin kináz kimérákat expressziós vektorba klónozhatjuk, gazdasejtbe

HU 225 689 Β1 juttathatjuk, és bármely, a fentiekben ismertetett vizsgálati eljárással tesztelhetjük (például kalciummobilizációs vagy citolitikus vizsgálati eljárásokkal).

CD4-tirozin kináz kímérák előállítása

Előállíthatunk olyan kiméramolekulákat, melyek a CD4-molekula extracelluláris doménját és egy protein-tirozin kináz (például a fent leírt kinázok egyikének) intracelluláris doménját tartalmazzák. Ilyen molekula előállítása céljából a tírozinkinázt kódoló szekvenciát (például cDNS-t) izoláltuk (például a fent ismertetett eljárással). Ezt a szekvenciát ezután ismert technikák alkalmazásával a CD4 egy géntechnológiai eljárással módosított formájának extracelluláris doménjával kapcsoltuk össze, amelyik a membránt átszelő doméntól közvetlenül 5’-irányban egy BamHI hasítási helyet tartalmazott [Aruffo és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573 (1987b); Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi. 9, 347 (1990)]. A fenti fúziós protein előállítása céljából a szekvencián belül megfelelő pozícióban, géntechnológiai eljárással BamHI hasítási helyet hozhatunk létre (ismét szokásos eljárások alkalmazásával). A génfúziókat (a fent leírtak szerint) vacciniavírus expressziós plazmidba juttattuk, majd homológ rekombinációs technikával és mikofenolsav jelenlétében történő szaporodás alapján végzett szelekcióval WR jelzésű vacciniatörzs genomjába inszertáltuk [Falkner és munkatársai: J. Virol. 62, 1849 (1988); Boyle és munkatársai: Gene 65, 123 (1988)]. A vacciniarekombinánsokban a CD4-tirozin kináz fúziósproteinek sejtfelszínen történő expresszálódását áramlásos citometriás eljárással vizsgáltuk. Az eredményeket vacciniarekombinánsokkal fertőzött sejtek immunprecipitációjával igazoltuk (a fent leírtak szerint).

A CD4-kimérák hatékonyságát a fent ismertetett kalciummobilizációs vagy citolitikus vizsgálati eljárásokkal tesztelhetjük. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint olyan célsejt’.effektorsejt modellrendszert dolgoztunk ki, amelyik a gp120/gp41 jelű HIV-burokglikoprotein-komplex CD4 által történő felismerésén alapul. HeLa-sejteket gp120/gp41-glikoproteineket expresszáló rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk [Chakrabarti és munkatársai: Natúré 320, 535 (1986); Earl és munkatársai: J. Virol. 64, 2448 (1990)], és ⁵¹Cr-mal jelöltünk. A jelölt sejteket olyan humán allospecifikus (CD8⁺, CD4^-), citotoxikus T-limfocita-sejtvonalhoz tartozó sejtekkel inkubáltuk együtt, amelyet előzőleg a CD4-tirozin kináz kimérát expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőztünk, és a sejteket specifikus lizálódásra nézve vizsgáltuk.

Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy a vacciniafertőzés műtermékként idézi elő a CTL-limfociták által történő felismerést, hasonló citolitikus kísérleteket végeztünk a CD 16 foszfatidil-inozitolhoz kötött formáját (CD16_P|) expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőzött és ⁵¹Cr-mal jelölt célsejtek, valamint CD16-kimérákat expresszáló kontrollrekombinánsokkal fertőzött CTL-limfociták alkalmazásával.

A találmány egy további megvalósítási módja szerint a keringésben igen rövid (körülbelül 4 óra) élettartamú és erősen citotoxikus neutrofil granulocitákat alkalmazhatunk CD4-tirozin kináz kímérák expresszálására. Neutrofil sejtek HIV-vírussal történő fertőzése nem valószínű, hogy vírusfelszabaduláshoz vezetne, és a fenti sejtek nagy tömege (a leukociták között a legelterjedtebb típus) előmozdíthatja a gazdaszervezet védekezését. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint gazdasejtekként érett T-sejteket alkalmazhatunk, amely populáció napjainkban vált hozzáférhetővé retrovírussal történő géntechnológiai módosítás számára [Rosenberg: Sci. Am. 262, 62 (1990)]. Rekombináns IL—2 alkalmazásával T-sejtpopulációk viszonylag könnyen szaporíthatok tenyészetben, és a felszaporított populációk a keringésbe visszainfundálva általában korlátozott élettartammal rendelkeznek [Rosenberg és munkatársai: N. Engl. J. Med. 323, 570 (1990)].

Megfelelő feltételek mellett CD4-kimérákat expresszáló sejtek által történő HIV-felismerés mitogén stimulust is képezhet, lehetővé téve, hogy a „felfegyverzett” sejtpopuláció dinamikus módon reagáljon a vírusterhelésre. Bár a leírás során a fúziós proteinek citotoxikus T-limfocitákban megfigyelhető viselkedésére összpontosítottunk, a kímérák expresszálása „helper”-limfocitákban lehetővé teheti citokinek HÍV által kiváltott mobilizálását, ami AIDS-betegségben a „helper”-sejtek által képzett szubpopuláció csökkenésével szemben fejthet ki hatást. Napjainkban több olyan eljárást írtak le, melyek alkalmazásával géntechnológiai úton, a vírus behatolásának megakadályozásától eltérő fázisban történő beavatkozással fertőzéssel szembeni rezisztenciát hoztak létre [Friedman és munkatársai: Natúré 335, 452 (1988); Green és munkatársai: Cell 58, 215 (1989); Malim és munkatársai: Cell 58, 205 (1989); Trono és munkatársai: Cell 59, 113 (1989); Buonocore és munkatársai: Natúré 345, 625 (1990)], amelyek arra utalnak, hogy megtervezhetők olyan CD4-kimérákat hordozó sejtek, amelyek a vírustermelődést megfelelő, hatásukat intracellulárisan kifejtő doménokkal rendelkező molekulák expresszálásán keresztül akadályozzák meg.

Az, hogy T-limfociták számára autonóm kímérák alkalmazásával jelzéseket tudunk közvetíteni, retrovírus alkalmazásával géntechnológiai úton módosított llmfociták in vivő szabályozását is lehetővé teszi. Keresztkötéseket létrehozó stimulusok, például komplementkötő doménok eltávolítása céljából géntechnológiai eljárással módosított, specifikus IgM-ellenanyagok által közvetített stimulusok lehetővé tehetik az említett limfociták számának in situ növekedését, míg hasonló specifikus IgG-ellenanyagokkal (például a kiméraláncban génsebészeti úton létrehozott aminosaveltérést felismerő ellenanyagokkal) történő kezelés szelektív módon képes lehet a géntechnológiai eljárással módosított populációhoz tartozó sejtek számának csökkentésére. A korábbiakban kimutattuk, hogy antiCD4 IgM-ellenanyagok alkalmazása esetében ΰϋ4:ξkimérákat expresszáló Jurkat-féle sejtekben nem szükséges keresztkötések további létrehozása a kalciummobilizációhoz. Ha a szervezeten kívül végzett ismételt

HU 225 689 Β1 felszaporítás nélkül képesek lennénk sejtpopulációk szabályozására, az jelentősen kiterjeszthetné a géntechnológiai eljárással módosított T-sejtek jelenlegi alkalmazási körét és hatékonyságát.

Kombinációs szabályozás, kináz-kimérák és

CD28-kimérareceptorok együttes expresszálásával

Annak kimutatása, hogy egyes kináz-kimérák (például a Zap-70- és Src-kinázok családjába tartozó kinázok) csak együttesen képesek citolitikus válaszreakciót kiváltani, lehetőséget teremt arra, hogy a citolitikus válaszreakciót megfelelő kiméra-kináz párok alkalmazásával szabályozzuk. Ez a megközelítési mód különösen előnyös tumorellenes terápiás eljárások esetén, mivel a kimérapárok extracelluláris doménjait megtervezhetjük úgy, hogy azok több, tumorsejtek felszínén található determinánst ismerjenek fel, és azokhoz kötődjenek. Hatásos citolitikus válaszreakció csak akkor jön létre, ha a determinánsok mindegyike kötődött (és a kötődésben, például a ZAP-70- és Src-családba tartozó kinázok is részt vesznek). Ez a megközelítési mód fokozza a terápia specifitását, csökkentve a nem tumoros sejtek elpusztításának valószínűségét és gyakoriságát.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint egy kimérapár két különböző extracelluláris domént tartalmazhat, amelyek mindegyike, a célzott tumorra jellemző eltérő antigént ismer fel. Ilyen kimérapár felismerhet a tumor felszínén két egymással rokonságban nem álló molekulát (például két különböző, proteintermészetű sejtfelszíni markert), vagy a kimérapár felismerhet egyazon molekulán található két különböző részt (például ugyanazzal a sejtfelszíni proteinnel kapcsolódó antigéntermészetű proteinrészletet és antigéntermészetű szénhidrátrészletet). Tumorantigének például - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - a következők: valamely szénhidrát (például Le^Y, szialil-Le^Y, Le^x, és szialil-Le^x), karcinoembrionális antigén, CD40, módosított CD44, α-fötoprotein, a T- és Tn-antigének, tenascin és növekedési faktor receptorok (például HER2/neu).

Ezenfelül mivel a T-sejt-aktivációról kimutatták, hogy az CD28 részvételével fokozható, a találmány tárgyát képezik olyan kimérareceptor-kombinációkat expresszáló terápiás sejtek, amely kimérareceptorok közül az egyik a CD28-antigén intracelluláris doménját, a másik (vagy a többi) pedig valamely fenti protein-tirozin kináz intracelluláris doménját tartalmazza. Adott kimérareceptor-kombináció esetében az extracelluláris doménok lehetnek azonosak (például valamennyi származhat a CD4-proteinből; ez az eredményezi, hogy valamennyi HIV-vírust vagy HIV-fertőzött sejtet ismer fel), vagy - amint fent említettük - a kimérareceptorokat megtervezhetjük úgy, hogy azok adott sejt vagy kórokozó felszínén különböző célmolekulákat ismerjenek fel.

A kombinációs szabályozás fenti módja kiterjeszthető bármely együttműködő kimérareceptor-kombinációra (például alkalmazható a ZAP-70- és Src-kinázok családjába tartozó kináz kimérák kombinációjával, vagy alkalmazható CD28-kiméra, ΖΑΡ-70-kiméra és Src-családba tartozó kináz kimérák kombinációjával, további kombinációs szabályozás létrehozására). Ezenfelül az alkalmazható bármely, találmány szerinti terápiás eljárás szabályozására.

CD28-kimérákat a leírásban ismertetett módon állítottunk elő és expresszáltattunk. A CD28-szekvenciát Aruffo és Seed írták le [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573 (1987)]. A fenti szakirodalmi hivatkozásban ismertették továbbá, a CD28 intracelluláris és transzmembrándoménjait. Intracelluláris CD28-domént hordozó kimérát írtak le a következő szakirodalmi helyen: Romeo és munkatársai: „Cold Spring Harbor Symp. on Quant. Bioi. LVII 117-125 (1992).

A találmány egyéb lehetséges megvalósítási módjai

Proteinkináz intracelluláris szekvenciákat tartalmazó egyéb kimérákat előállíthatunk úgy, hogy egy receptor extracelluláris doménját kódoló cDNS-szekvenciákat vagy genomi eredetű szekvenciákat a választott extracelluláris domént közvetlenül megelőzően restrikciós hasítási hellyel látunk el. A restrikciós hasítási hellyel végződő extracelluláris dómén fragmenst ezután a proteinkináz-szekvenciákhoz kapcsolhatjuk. Tipikus extracelluláris doménokat nyerhetünk komplementet, szénhidrátokat, vírusproteineket, baktériumokat, protozoon- vagy metazoonparazitákat, vagy azok által indukált proteineket felismerő receptorokból. Hasonlóképp, kórokozók vagy tumorsejtek által expresszált ligandumokat vagy receptorokat is proteinkináz-szekvenciákhoz kapcsolhatunk, hogy az immunválaszt célzottan, a fenti ligandumokat felismerő receptorokat hordozó sejtekkel szemben irányítsuk.

A citolízis kiváltásához minimálisan szükséges proteinkináz-szekvenciák meghatározása céljából, szokásos technikák alkalmazásával, olyan deléciós mutánsokból álló sorozatokat állíthatunk elő, amelyekben a kináz intracelluláris doménjából egyre többet távolítottunk el. Az ilyen deléciós mutánsok hatékonyságát a fent ismertetett vizsgálati eljárások valamelyikével tesztelhetjük. A Syk protein kináz esetében alkalmazható intracelluláris doménok például a sertés Syk-szekvencia 336-628. pozíciójában található aminosavaknak megfelelő szekvencia és a humán Syk-szekvencía 338-630. pozíciójában található aminosavaknak megfelelő szekvencia. Az Src-családba tartozó kinázok esetében előnyösen alkalmazható intracelluláris doménok például az SH2- és SH3-doménok.

Bár a találmányt a fentiekben bizonyos konkrét megvalósítási módokon keresztül szemléltettük, nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás tovább módosítható, és az igényelt oltalmi kör kiterjed annak variációira, eltérő alkalmazásaira vagy adaptációira, amennyiben az alkalmazott változtatások a találmány szerinti megoldásra vonatkozó technika állásához tartoznak, és amennyiben rájuk olvashatók a találmány szerinti megoldás előzőekben bemutatott - és a csatolt igénypontokban megfogalmazott - lényegi sajátosságai.

HU 225 689 Β1

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 50

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 2. AZONOSfTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 630

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nincs adat

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Alá Asp 1

Ser Alá 20

Alá 5 Glu

Asn His

Leu Leu

Pro Val 25

Phe 10 Gin

Phe Gly

Gly Met

His Ser 30

Ile 15 Asp

Thr Gly

Arg Glu

Glu

Asp

Tyr

Leu

Tyr

Leu

Arg

Gin

Ser

Arg

Asn

Tyr

Leu

Gly

Phe

Alá

Leu

35

40

45

Ser

Val

Alá

His

Gly

Arg

Lys

Alá

His

Asn

Tyr

Thr

Ile

Glu

Arg

Glu

50

55

60

Leu

Asn

Gly

Thr

Tyr

Alá

Ile

Alá

Gly

Arg

Thr

His

Alá

Ser

Pro

65

70

75

80

Alá

Asp

Leu

Cys

Asn

Tyr

His

Ser

Gin

Glu

Ser

Asp

Gly

Leu

Val

Cys

85

90

95

HU 225 689 Β1

Leu Leu Lys Lys Pro Phe Asn Arg 100

Gly Pro Phe Glu Asp Leu Lys Glu 115 120

Gin Thr Met Asn Leu Gin Gly Gin 130 135

Gin Lys Pro Gin Leu Glu Lys Leu 145 150

Met Pro Trp Phe His Gly Lys Ile 165

Val Leu Ile Gly Ser Lys Thr Asn 180

Asp Asn Asn Gly Ser Tyr Alá Leu 195 200

Leu His Tyr Arg Ile Asp Lys Asp 210 215

Glu Gly Lys Lys Phe Asp Thr Leu 225 230

Tyr Lys Alá Asp Gly Leu Leu Arg 245

Ile Gly Thr Gin Gly Asn Val Asn 260

Gly Ser His Pro Alá Thr His Ser 275 280

Lys Ser Tyr Ser Phe Pro Lys Pro 290 295

Gin Gly Asn Arg Gin Glu Ser Thr 305 310

Glu Leu Alá Pro His Alá Alá Asp 325

Pro Met Asp Thr Glu Val Tyr Glu 340

Ile Arg Pro Lys Glu Val Tyr Leu 355 360

Asp Lys Glu Leu Gly Ser Gly Asn 370 375

Tyr Gin Met Lys Lys Val Val Lys 385 390

Asn Glu Alá Asn Asp Pro Alá Leu 405

Pro Gin Gly Val Gin Pro Lys Thr 105 110

Asn Leu Ile Arg Glu Tyr Val Lys 125

Alá Leu Glu Gin Alá Ile Ile Ser 140

Ile Alá Thr Thr Alá His Glu Lys 155 160

Ser Arg Glu Ile Ser Thr Gin Ile 170 175

Gly Lys Phe Leu Ile Arg Alá Arg 185 190

Cys Leu Leu His Ile Gly Lys Val 205

Lys Thr Gly Lys Leu Ser Ile Pro 220

Trp Gin Leu Val Glu His Tyr Ser 235 240

Val Leu Thr Val Pro Cys Gin Lys 250 255

Phe Gly Gly Arg Pro Gin Leu Phe 265 270

Alá Gly Gly Ile Ile Ser Arg Ile 285

Gly His Arg Lys Ser Ser Pro Alá 300

Val Ser Phe Asn Phe Tyr Glu Pro 315 320

Lys Gly Pro Gin Arg Ile Alá Leu 330 335

Ser Pro Tyr Alá Asp Pro Glu Glu 345 350

Asp Arg Lys Leu Leu Thr Leu Glu 365

Phe Gly Thr Val Lys Lys Gly Tyr 380

Thr Val Alá Val Lys Ile Leu Lys 395 400

Lys Asp Glu Leu Leu Alá Glu Alá 410 415

HU 225 689 Β1

Asn

Val

Met

Gin 420

Gin

Leu Asp Asn

Pro 425

Tyr

lle

Val

Arg

Met 430

He

Gly

He

Cys

Glu

Alá

Glu

Ser

Trp

Met

Leu

Val

Met

Glu

Met

Alá

Glu

Leu

435

440

445

Gly

Pro

Leu

Asn

Lys

Tyr

Leu

Gin

Asn

Arg

His

Val

Lys

Leu

Lys

450

455

460

Asn

lle

He

Glu

Leu

Val

His

Gin

Val

Ser

Met

Gly

Met

Lys

Tyr

Leu

465

470

475

480

Glu

Ser

Asn

Phe

Val

His

Arg

Asp

Leu

Alá

Arg

Asn

Val

Leu

485

490

495

Leu

Val

Thr

Gin

His

Tyr

Alá

Lys

He

Ser

Asp

Phe

Gly

Leu

Ser

Lys

500

505

510

Alá

Leu

Arg

Alá

Asp

Glu

Asn

Tyr

Lys

Alá

Gin

Thr

His

Gly

Lys

515

520

525

Trp

Pro

Val

Lys

Trp

Tyr

Alá

Pro

Glu

Cys

He

Asn

Tyr

Lys

Phe

530

535

540

Ser

Lys

Ser

Asp

Val

His

Ser

Phe

Gly

Val

Leu

Met

Asn

Glu

Alá

545

550

555

560

Phe

Ser

Tyr

Gly

Gin

Lys

Phe

Tyr

Arg

Gly

Met

Lys

Gly

Ser

Glu

Val

565

570

575

lle

Alá

Met

Leu

Glu

Lys

Gly

Glu

Arg

Met

Gly

Cys

Pro

Alá

Gin

Cys

580

585

590

Pro

Arg

Glu

Met

Tyr

Asp

Leu

Met

Asn

Leu

Cys

Trp

Thr

Tyr

Asp

Val

595

600

605

Glu

Asn

Arg

Pro

Gly

Phe

Alá

Val

Glu

Leu

Arg

Leu

Arg

Asn

Tyr

610

615

620

Tyr

Asp

Val

Asn

625 630

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 628

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nincs adat

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Alá

Asp

Ser

Alá 5

Asn

His

Leu

Pro

Phe 10

Phe

Gly

Gin

He 15

Thr

Arg

Glu

Alá 20

Glu

Asp

Tyr

Leu

Val 25

Gin

Gly

Met

Ser 30

Asp

Gly

Leu

Tyr

Leu 35

Leu

Arg

Gin

Ser

Arg 40

Asn

Tyr

Leu

Gly

Gly 45

Phe

Alá

Leu

Ser

Val 50

Alá

Tyr

Asp

Arg

Lys 55

Alá

His

Tyr

Thr 60

He

Glu

Arg

Glu

HU 225 689 Β1

Leu Asn Gly Thr Tyr Alá Ile Ser Gly Gly Arg Thr His Gly Ser Pro

70 75 80

Alá Glu Leu Cys His Tyr His Ser Gin Glu Leu Asp Gly Leu Val Cys

90 95

Leu Leu Lys Asn Pro Phe Asn Arg Pro Pro Gly Val Gin Pro Lys Thr 100 105 110

Gly Pro Phe Glu Asp Leu Lys Glu Asn Leu Ile Arg Glu Tyr Val Lys 115 120 125

Gin Thr His Asn Leu Gin Gly Gin Alá Leu Glu Gin Alá Ile Ile Ser 130 135 140

Gin Lys Pro Gin Leu Glu Lys Leu Ile Alá Thr Thr Alá His Glu Lys

145 150 155 160

Met Pro Trp Phe His Gly Lys Ile Ser Arg Asp Glu Ser Glu Gin Ile

165 170 175

Val Leu Ile Gly Ser Lys Ile Asn Gly Lys Phe Leu Ile Arg Alá Arg 180 185 190

Asp Met Gly Ser Tyr Alá Leu Gly Leu Leu His Ile Gly Lys Val Leu 195 200 205

Met Tyr Arg Ile Asp Lys Asp Lys Thr Gly Lys Leu Ser Ile Pro Gly 210 215 220

Gly Lys Asn Phe Asp Thr Leu Trp Gin Leu Val Glu Lys Tyr Ser Tyr

225 230 235 240

Lys Ser Asp Gly Leu Leu Arg Val Leu Thr Val Pro Cys Gin Lys Ile

245 250 255

Gly Gly Gin Thr Gly Asn Asp Ser Phe Arg Pro Gin Leu Phe Ser Alá 260 265 270

His Ser Alá Thr Trp Ser Alá Gly Gly Ile Ile Ser Arg Ile Lys Ser 275 280 285

Tyr Ser Phe Pro Lys Pro Gly His Arg Lys Alá Ser Ser Pro Gin Gly 290 295 300

Asn Arg Pro Glu Ser Leu Val Ser Tyr Asn Phe Tyr Glu Ser Asp Arg

305 310 315 320

Gly Phe Trp Alá Asn Glu Arg Glu Alá Gin Arg Glu Alá Leu Pro Met

325 330 335

Asp Thr Glu Val Val Glu Ser Pro Tyr Alá Asp Pro Glu Glu Ile Arg 340 345 350

Pro Lys Glu Val Tyr Leu Asp Arg Lys Leu Leu Thr Leu Glu Asp Lys 355 360 365

Glu Leu Gly Ser Gly Asn Phe Gly Thr Val Lys Lys Gly Tyr Tyr Gin 370 375 380

HU 225 689 Β1

Met Lys Lys Val Val Lys Thr Val Alá Val Lys Ile Leu Lys Asn Glu

385 390 395 400

Alá Asn Asp Pro Alá Leu Lys Asp Glu Leu Leu Alá Glu Alá Asn Val

405 410 415

Met Gin Gin Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg Met Ile Gly Ile Cys 420 425 430

Glu Alá Ser Ser Trp Met Leu Val Met Glu Met Alá Glu Leu Gly Pro 435 440 445

Leu Asn Lys Tyr Leu Gin Gin Asn Arg His Val Lys Asp Lys Asn Ile 450 455 460

Ile Glu Leu Val His Gin Val Ser Met Gly Met Lys Tyr Leu Glu Glu

465 470 475 480

Cys Asn Pro Val His Arg Asp Leu Alá Alá Arg Asn Val Leu Leu Val

485 490 495

Thr Gin His Tyr Alá Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys Alá Leu 500 505 510

Arg Alá Asp Glu Asn Tyr Tyr Lys Alá Gin Thr His Gly Lys Trp Pro 515 520 525

Val Lys Trp Tyr Alá Pro Glu Cys Ile Asn Tyr Tyr Lys Phe Ser Ser 530 535 540

Lys Ser Asp Val Asn Ser Phe Gly Val Leu Met Trp Glu Alá Phe Ser

545 550 555 560

Tyr Gly Gin Lys Phe Tyr Arg Gly Met Lys Gly Ser Glu Val Ser Alá

565 570 575

Met Leu Glu Lys Gly Glu Arg Met Gly Cys Phe Phe Gly Cys Phe Arg 580 585 590

Glu Met Tyr Glu Leu Asn Thr Leu Cys Asn Thr Tyr Asp Val Glu Asn 595 600 605

Arg Pro Gly Phe Val Alá Val Glu Leu Arg Leu Arg Asn Tyr Tyr Tyr 610 615 620

Asp Val Val Asn

625

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 34

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGGCAGACA GTGCCAACCA CTTGCCCTTC TTCT

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39

HU 225 689 Β1

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAAT TCACCACGTC GTAGTAGTA 39

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGACGC GTACCATGGC AGACAGTGCC AAC 33

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Legalább két, membránhoz kötött, proteintermészetű kimérareceptort expresszáló terápiás célra szolgáló immunsejtek (terápiás immunsejtek) alkalmazása emlősben fertőzés, tumoros megbetegedés vagy autoimmun megbetegedés elleni celluláris immunválasz 25 célzott irányítására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, amely immunterápiás sejtek a következő részeket tartalmazó receptorokat expresszálják:

az első receptor (i) egy, a Syk-kinázok családjába tartozó protein-tirozin kináz intracelluláris részét, amely 30 képes a terápiás sejt számára olyan jelzést közvetíteni, amely azt egy receptorhoz kötődött célsejt vagy receptorhoz kötődött, célzott fertőző ágens elpusztítására készteti, valamint (ii) egy extracelluláris részt, amely képes a célsejtet vagy célzott fertőző ágenst specifiku- 35 san felismerni és ahhoz kötődni; miáltal a terápiás immunsejtek képessé válnak a célsejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és elpusztítására;

a második receptor pedig (i) a célsejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) a CD28 egy intracelluláris részletét tartalmazza.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint fertőző ágenssel fertőzött gazdasejt, tumoros vagy karcinómás sejt vagy autoimmun sejt elpusztítására al- 45 kalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.
3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint intracelluláris részként a Syk-kináz egy részletét tartalmazó kimérareceptort expresszáló terápiás sejteket alkalmazunk.
4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint intracelluláris részként sertés Syk-kináz 336-628. pozícióinak vagy humán Syk-kináz 338-630. pozícióinak megfelelő aminosavszekvenciát tartalmazó kimérareceptort expresszáló terápiás sejteket alkalmazunk.
5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint terápiás immunsejtként egy membránhoz kötött, proteintermészetű, harmadik kimérareceptort is expresszáló sejtet alkalmazunk, amely kimérareceptor a következő részeket tartalmazza: (i) egy másik, a 60

Syk-kinázok családjába tartozó protein-tirozin kináz int20 racelluláris részét, amely intracelluláris rész az első kimérareceptorban található, Syk-kinázok családjába tartozó protein-tirozin kináz intracelluláris részétől eltérő, és amely képes a terápiás sejt számára olyan jelzést közvetíteni, amely azt egy receptorhoz kötődött célsejt vagy receptorhoz kötődött, célzott fertőző ágens elpusztítására készteti; valamint (ii) egy extracelluláris részt, amely képes a célsejtet vagy célzott fertőző ágenst specifikusan felismerni és ahhoz kötődni; miáltal az egyes terápiás sejtek képessé válnak a célsejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és elpusztítására.
6. Az 1. vagy 5. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint MHC-independens celluláris immunválaszt kiváltó terápiás sejteket alkalmazunk.
7. Az 1. vagy 5. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint terápiás immunsejtként a felsorolt sejtek bálmelyikét alkalmazzuk: (a) T-limfocitát; (b) citotoxikus T-limfocitát; (c) természetes ölősejtet („killer”-sejtet); (d) neutrofil sejtet; (e) granulocitát; (f) makrofágot

40 vagy (g) hízósejtet.
8. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint célzott fertőző ágensként immundeficiencia-vírus elpusztítására alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.
9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint extracelluláris részként CD4-antigén HIV-burokhoz kötődni képes részletét tartalmazó kimérareceptort expresszáló terápiás sejteket alkalmazunk.
10. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely sze50 rint terápiás immunsejtként receptorhoz kötődött célsejt vagy receptorhoz kötődött célzott fertőző ágens citolízis révén történő elpusztítására képes sejtet alkalmazunk.
11. Terápiás immunsejt, amely legalább két memb55 ránhoz kötött, proteintermészetű kimérareceptort expresszál, amely szerint az első expresszált receptor az alábbi részeket tartalmazza.^) egy, a Syk-kinázok családjába tartozó protein-tirozin kináz intracelluláris részét, amely képes a terápiás immunsejt számára olyan jelzést közvetíteni, amely azt egy receptorhoz kö29

HU 225 689 Β1 tődött célsejt vagy receptorhoz kötődött, célzott fertőző ágens elpusztítására készteti; valamint (ii) egy extracelluláris részt, amely képes a célsejtet vagy célzott fertőző ágenst specifikusan felismerni és ahhoz kötődni; miáltal az egyes terápiás immunsejtek képessé válnak a célsejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és elpusztítására; a második receptor pedig (i) a célsejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) a CD28 egy intracelluláris részletét tartalmazza.
12. A 11. igénypont szerinti terápiás immunsejt, amely intracelluláris részként a Syk-kináz egy részletét tartalmazza.
13. A 12. igénypont szerinti terápiás immunsejt, amely intracelluláris részként sertés Syk-kináz 336-628. pozícióinak vagy humán Syk-kináz 338-630. pozícióinak megfelelő aminosavszekvenciát tartalmaz.
14. A 11. igénypont szerinti terápiás immunsejt, amely egy membránhoz kötött, proteintermészetű, harmadik kimérareceptort is expresszál, amely kimérareceptor a következő részeket tartalmazza:(i) egy, a Syk-kinázok családjába tartozó másik protein-tirozin kináz intracelluláris részét, amely intracelluláris rész az első kimérareceptorban található, Syk-kinázok családjába tartozó protein-tirozin kináz intracelluláris részétől eltérő, és amely képes a terápiás sejt számára olyan jelzést közvetíteni, amely azt egy receptorhoz kötődött célsejt vagy receptorhoz kötődött, célzott fertőző ágens elpusztítására készteti; valamint (ii) egy extracelluláris részt, amely képes a célsejtet vagy célzott fertőző ágenst specifikusan felismerni és ahhoz kötődni; miáltal az egyes terápiás immunsejtek képessé válnak a célsejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és elpusztítására.
15. A 11. vagy 14. igénypont szerinti terápiás immunsejt, amely a felsoroltak bármelyike: (a) T-limfocita; (b) citotoxikus T-limfocita; (c) természetes ölősejt („killer”-sejt); (d) neutrofil sejt; (e) granulocita; (f) makrofág és (g) hízósejt.
16. A 11. igénypont szerinti terápiás immunsejt, amely célzott fertőző ágensként immundeficiencia-vírus felismerésére képes.
17. A 16. igénypont szerinti terápiás immunsejt, amely extracelluláris részként CD4-antigén HlV-burokhoz kötődni képes részletét tartalmazza.
18. A 11. igénypont szerinti terápiás immunsejt, amely a receptorhoz kötődött célsejt vagy célzott fertőző ágens citolízis révén történő elpusztítására képes.
19. A 11. vagy 14. igénypont szerinti terápiás immunsejt, amely a célzott sejtekhez/fertőző ágensekhez MHC-independens módon kötődik.
20. A 11. vagy 14. igénypont szerinti terápiás immunsejt, amely által expresszált extracelluláris rész a következők bármelyikét tartalmazza: egy receptor IIgandumkötő doménját; egy ligandum receptorkötő doménját; egy ellenanyag antigénkötő részét; vagy ezek funkcionális származékát.