FI121012B - T-lymfosyytteja sisältävä lääkeaine soluimmuniteetin suuntaamiseen uudelleen proteiinityrosiinikinaasikimeerojen avulla - Google Patents

Description

T-lymfosyytteja sisältävä lääkeaine soluimmuniteetin suuntaamiseen uudelleen proteiinityrosiinikinaasikimeerojen avulla 5 Tämä keksintö on tehty hallituksen tuella NIH:n apurahalla AI27849. Hallituksella on tiettyjä oikeuksia tähän keksintöön.

Tämä keksintö koskee toimivia proteiinityrosiini-kinaasikimeeroja, joilla on kyky suunnata uudelleen im-10 muunijärjestelmän toimintaa. Tarkemmin määriteltynä se koskee lääkeainetta, joka mahdollistaa lymfosyyttien, makrofa-gien, luonnollisten tappajasolujen tai granulosyyttien säätelyä ilmentämällä mainituissa soluissa kimeeroja, jotka saavat solut reagoimaan kimeerojen tunnistamiin kohteisiin. 15 Tässä kuvataan myös toimivia proteiinityrosiinikinaasiki-meeroja, joilla on kyky ohjata terapeuttisia soluja tunnistamaan ja tuhoamaan spesifisesti joko jonkin määrätyn in-fektionaiheuttajan infektoimia soluja, itse infenktionai-heuttaja, kasvainsolu tai autoimmuunimekanismin synnyttämä 20 solu. Tarkemmin kuvataan määriteltynä sellaisten proteiini-tyrosiinikinaasikimeerojen tuottamista, joilla on kyky ohjata sytotoksisia T-lymfosyyttejä tunnistamaan ja lysoimaan spesifisesti HIV:n vaippaproteiineja ilmentäviä soluja.

Keksinnön tausta 25 T-solun tekemä antigeenin tunnistus, joka tapahtuu T-solureseptorin kautta, on pohjana joukolle erilaisia immunologisia ilmiöitä. T-solut ohjaavat ilmiötä, jota kutsutaan soluvälitteiseksi immuniteetiksi. Siinä immuunijärjestelmän solut tuhoavat vieraita kudoksia tai infektoituneita 30 soluja. On olemassa joukko erilaisia T-soluja, mukaan luettuina "auttajasolut" ja "suppressorisolut", jotka moduloivat immuunivastetta, ja sytotoksiset solut (eli "tappajasolut"), jotka pystyvät suoraan tappamaan epänormaaleja soluja.

35 Toisen solun pinnalla olevan ainutkertaisen anti geenin tunnistava ja sitova T-solu aktivoituu; se voi sit- 2 ten lisääntyä ja, jos se on sytotoksinen solu, tappaa sitoutuneen solun.

Autoimmuunisairaudelle on tunnusmerkillistä joko isännän kudoksen kanssa reagoivien vasta-aineiden tai auto-5 reaktiivisten efektori-T-solujen tuotanto. Joissakin tapauksissa autoantibodeja voi synnyttää normaali T- ja B-solu-vaste, joka aktivoituu vierasaineiden tai sellaisten organismien vaikutuksesta, jotka sisältävät elimistön kudoksissa olevien vastaavanlaisten yhdisteiden kanssa ristireagoi-10 via antigeenejä. Esimerkkejä kliinisesti merkitsevistä au-toantibodeista ovat asetyylikoliinireseptorien vastaiset vasta-aineet myasthenia graviksen ollessa kyseessä ja DNA:n, erytrosyyttien ja verihiutaleiden vastaiset vasta-aineet systeemisessä lupus erythematosuksessa.

15 HIV ja immuunipatogeneesi

Vuonna 1984 osoitettiin, että HIV on AIDSin aiheuttaja. Sen jälkeen AIDSin määritelmää on uudistettu useita kertoja sen suhteen, mitkä kriteerit tulisi sisällyttää diagnoosiin. Diagnostisten parametrien heilahtelusta huoli-20 matta yksinkertaisena yhteisenä nimittäjänä AIDSissa on HIV-infektio ja sitä seuraava itsepintaisten luontaisten oireiden ja AIDSille ominaisten sairauksien, kuten sekundaaristen infektioiden, kasvainten ja hermosairauksien, kehittyminen. Katso Harrison's Principles of Internal Medici-25 ne, 12. p., McGraw Hill 1991.

HIV on lentivirusryhmään kuuluva ihmisen retrovirus. Neljä tunnistettua ihmisen retrovirusta kuuluvat kahteen toisistaan erottuvaan ryhmään: ihmisen T-lymfotrooppi-set (eli leukemiaan liittyvät) retrovirukset, HTLV-1 ja 30 HTLV-2, ja ihmisen immuunikatovirukset, HIV-1 ja HIV-2. Ensin mainitut ovat transformoivia viruksia, kun taas viimeksi mainitut ovat sytopaattisia viruksia.

HIV-1 on identifioitu yleisimmäksi AIDSin aiheuttajaksi kaikkialla maailmassa. Sekvenssihomologia HIV-2:n ja 35 HIV-1: n välillä on noin 40 % ja HIV-2 on läheisempää sukua joillekin apinan immuunikatovirusten ryhmän (SIV) jäsenil- 3 le. Katso Curran et ai., Science 329 (1985) 1357 - 1359;

Weiss et ai., Nature 324 (1986) 572 - 575.

HIV:ssä on tavalliset retrovirusgeenit (env, gag ja pol) samoin kuin kuusi lisägeeniä, jotka ovat osallisina 5 viruksen replikaatiossa ja muissa biologisissa aktiviteeteissa. Kuten aiemmin mainittiin, AIDSin yhteisenä nimittäjänä on perustavaa laatua oleva, etupäässä soluvälitteisen immuniteetin, immuunisuppressio. Tämä immuunisuppressio johtaa erilaisiin opportunistisiin sairauksiin, erityisesti 10 tiettyihin infektioihin ja kasvaimiin.

AIDSissa tapahtuvan immuunikadon pääsyyksi on todettu kvantitatiivinen ja kvalitatiivinen kato kateenkorva-peräisten lymfosyyttien (T-lymfosyyttien) alaryhmässä, T4-populaatiossa. Tälle solualaryhmälle on fenotyypin suh-15 teen ominaista CD4-pintamolekyylin läsnäolo, jonka molekyylin on osoitettu olevan HIV:n solureseptori. Katso Dalgleish et ai., Nature 312 (1984) 763. Vaikka T4-solu on tärkein HIV:n infektoima solutyyppi, lähes mikä tahansa ihmisen solu, jonka pinnalla esiintyy CD4-molekyyli, on kykenevä si-20 toutumaan HIV:hen ja tulemaan sen infektoimaksi.

CD4+-T-soluilla on perinteisesti katsottu olevan auttajan/indusoijan rooli, mikä viittaa niiden tehtävään aktivointisignaalin antamisessa B-soluille tai käänteisen CD8-markkerin sisältävien lymfosyyttien indusoinnissa 25 muuttumaan sytotoksisiksi soluiksi/suppressorisoluiksi. Katso Reinherz ja Schlossman, Cell 19 (1980) 821 - 827; Goldstein et ai., Immunol. Rev. 68 (1982) 5 - 42.

HIV sitoutuu spesifisesti ja suurella affiniteetilla viruksen vaipassa olevan aminohappoketjun (gpl20) kautta 30 CD4-molekyylin Vl-alueen osaan, joka on lähellä sen N-päätä. Sitoutumisen jälkeen virus fuusioituu kohdeso-lun kalvon kanssa ja menee solun sisälle. Solun sisälle mentyään se käyttää käänteistranskriptaasientsyymiä genomi-RNA:nsa kopiointiin DNA:ksi, joka integroituu solun DNA:hän, 35 jossa se on solun eliniän ajan "proviruksena".

4

Provirus voi pysyä latenttina tai aktivoitua kopioimaan mRNA:ta ja genomi-RNA:ta, mikä johtaa proteiinisynteesiin, ryhmittymiseen, uuden virionin muodostumiseen ja viruksen silmikoitumiseen solun pinnasta. Vaikka tarkkaa 5 mekanismia, jolla virus aiheuttaa solun kuoleman, ei ole vahvistettu, tuntuu siltä, että päämekanismi on viruksen massiivinen silmikoituminen solun pinnasta, joka johtaa plasmakalvon rikkoutumiseen ja osmoottiseen epätasapainoon.

Infektion edetessä isäntäorganismi kehittää vasta-10 aineita virusproteiineille, mukaan luettuina tärkeimmät vaippaglykoproteiinit gpl20 ja gp41. Tästä humoraalisesta immuniteetista huolimatta sairaus etenee ja johtaa tappavaan immuunisuppressioon, jolle ovat tunnusmerkillistä useat opportunistiset infektiot, parasitemia, dementia ja kuo-15 lema. Isännän viruksen vastaisten vasta-aineiden kyvyttö myys pysäyttää sairauden eteneminen on yksi tämän infektion kiusallisimmista ja hälyttävimmistä puolista ja antaa huonon ennusteen tavanomaisiin lähestymistapoihin perustuville rokotusyrityksille.

20 Kahdella tekijällä saattaa olla rooli immuunikato- viruksiin kohdistuvan humoraalisen vasteen tehossa. Immuunikatoviruksilla on ensinnäkin muiden RNA-virusten (ja erityisesti retrovirusten) tavoin suuri mutaationopeus vasteena isännän immuunivalvontaan. Toiseksi itse vaippaglykopro-25 teiinit ovat voimakkaasti glykosyloituneita molekyylejä, joilla on harvoja affiniteetiltaan suureen vasta-ainesi-toutumiseen soveltuvia epitooppeja. Viruksen vaipalla oleva heikosti antigeeninen kohde antaa isännälle vähän mahdollisuuksia vastustaa virusinfektiota spesifisen vasta-ainetuo-30 tannon kautta.

HIV:n infektoimien solujen pinnalla esiintyy gpl20- glykoproteiinia. gpl20 välittää fuusiotapahtumia CD4+-so-lujen kesken reaktiolla, joka on vastaavanlainen kuin reaktio, jonka kautta virus tulee infektoitumattomaan soluun, 35 mikä johtaa lyhytikäisten monitumaisten jättiläissolujen muodostumiseen. Solusitkoksen muodostuminen riippuu gpl20- 5 vaippaglykoproteiinin suorasta vuorovaikutuksesta CD4-pro-teiinin kanssa. Katso Dalgleish et ai., supra; Klatzman et ai., Nature 312 (1984) 763; McDougal et ai., Science 231 (1986) 382; Sodroski et ai., Nature 322 (1986) 470; Lifson 5 et ai., Nature 323 (1986) 725; Sodroski et ai., Nature 321 (1986) 412.

Osoituksiin siitä, että CD4-gpl20-sitoutuminen on vastuussa CD4-antigeenin sisältävien solujen virusinfektiosta, kuuluu havainto, että gpl20:n ja CD4:n välille muo-10 dostuu spesifinen kompleksi (McDougal et ai., supra). Toiset tutkijat ovat osoittaneet, että solulinjat, joita HIV ei pystynyt infektoimaan, muuttuivat infektoituvissa oleviksi solulinjoiksi ihmisen CD4-cDNA-geenillä tehdyn trans-fektoinnin ja geenin ilmentämisen jälkeen. Katso Maddon et 15 ai., Cell 46 (1986) 333 - 348.

On ehdotettu hoito-ohjelmia, jotka perustuvat liukoiseen CD4:n käyttöön passiivisena aineena viruksen adsorption ja solusitkosvälitteisen soluunsiirtymisen häiritsemiseksi, ja joukolla ryhmiä on niistä menestyksellistä 20 näyttöä in vitro [Deen et ai., Nature 3321 (1988) 82 - 84; Fisher et ai., Nature 331 (1988) (76 - 78; Hussey et ai., Nature 331 (1988) 78 - 81; Smith et ai., Science 238 (1987) 1704 - 1707; Traunecker et ai., Nature 331 (1988) 84 - 86]; myöhemmin on myös kehitetty CD4-immunoglobuliinifuusiopro-25 teiineja, joilla on pitkitetty puoliintumisaika ja kohtalainen biologinen aktiivisuus [Capon et ai., Nature 337 (1989) 525 - 531; Traunecker et ai., Nature 339 (1989) 68 - 70; Byrn et ai., Nature 344 (1990) 667 - 670; Zettl-meissl et ai., DNA Cell Biol. 9 (1990) 347 - 353]. Vaikka 30 CD4-immunotoksiinikonjugaatit tai -fuusioproteiinit ovat voimakkaasti sytotoksisia infektoitouneiden solujen suhteen in vitro [Chaudhary et ai., Nature 335 (1988) 369 - 372; Till et ai., Science 242 (1988) 1166 - 1168], immuunikato-oireiston latenttisuus tekee epätodennäköiseksi sen, että 35 mikään kertahoito olisi tehokas viruskuormituksen eliminoinnissa, ja vieraiden fuusioproteiinien antigeenisuus ra- 6 joittaa todennäköisesti niiden hyväksyttävyyttä toistuvaa annostelua vaativissa hoidoissa. SIV-positiivisilla apinoilla tehdyt kokeet ovat osoittaneet, että liukoinen CD4, jos sitä annetaan eläimille, joilla ei esiinny huomattavaa 5 CD4-sytopeniaa, voi alentaa SIV-tiitteriä ja parantaa mye-loidisen potentiaalin arvoja in vitro [Watanabe et ai., Nature 337 (1989) 267 - 270]. Havaittiin kuitenkin viruksen nopea ilmaantuminen takaisin hoidon keskeyttämisen jälkeen, mikä viittaa siihen, että elinikäinen anto saattaisi olla 10 välttämätön immuunijärjestelmän etenevän heikkenemisen välttämiseksi .

Solun pintareseptoriin liittyvät proteiinityrosii-nikinaasit

Alkusysäyksenä soluefektoriohjelmien käyttöönotolle 15 immuunijärjestelmässä on usein yhteenkerääntyneiden ligandien solutunnistus. Reseptoreihin, joiden tiedetään välittävän ak-tivointisignaaleja aggregoitumisen jälkeen, kuuluvat B-so-lu- ja T-soluantigeenireseptorit [DeFranco, Eur. J. Biochem. 210 (1992) 381 - 388; Weiss, Annu. Rev. Genet. 25 (1991) 20 487 - 510], IgG- ja IgE-Fc-reseptoriryhmien jäsenet [Fanger et ai., Immunol. Today 10 (1989) 92 - 99; Ravetch ja Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457 - 492] ja joukko apuresep-toreja, mukaan luettuina CD2, CD4, CD8 ja CD29 T-soluissa [Yokoyama ja Shevach, Year Immunol. 4 (1989) 110 - 146], 25 CD19, CD20, CD21 ja CD40 B-soluissa [Clark ja Ledbetter,

Adv. Cancer Res. 52 (1989) 149] ja CD44, CD45 ja CD58 mono-syyteissä [Webb et ai., Science 249 (1990) 1295 - 1297].

Lisäksi suuri joukko fosfolipidiin kytkeytyneitä proteiineja edistää solujen aktivaatiota antigeenireseptorista riip-30 puvalla tavalla ollessaan ristiliittyneinä T-solujen pin nalla [Balk ja Terhorst, Immunol. Ser. 45 (1989) 411 - 416; Korczek et ai., Nature 322 (1986) 181 - 184; Yeh et ai., J. Immunol. 138 (1987) 91 - 97; Yokoyama ja Shevach, Year

Immunol. 4 (1989) 110 - 146].

35 Tällä hetkellä ei ole selvää, miten yksinkertainen fysikaalinen tapahtuma, aggregoituminen, johtaa selvästi huo- 7 mättävään fysiologiseen signaaliin. Soluefektoriohjelmien käyttöönottoa T-solu- ja B-soluantigeenireseptorien ja Fc-reseptorin eri muotojen välityksellä voidaan jäljitellä ristiliittämallä kimeerisiä proteiineja, joissa on solun-5 sisäisiä yksittäisistä reseptorikompleksiketjuista koostuvia domeeneja [Irving ja Weiss, Cell 64 (1991) 891 - 901;

Kolanus et ai., EMBO J. 11 (1992) 4861 - 4868; Letourneur ja Klausner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 8905 - 8909; Letourneur ja Klausner, Science 255 (1992) 79 - 82; 10 Romeo ja Seed, Cell 64 (1991) 1037 - 1046; Wegener et ai.,

Cell 68 (1992) 83 - 95] . Pienin mahdollinen tehokas lau- kaisuelementti näyttää vaativan fylogeneettisesti säilyneen [Reth, Nature 338 (1989) 383 - 384] peptidisekvenssin, joka sisältää kaksi tyrosiiniryhmää 10 tai 11 ryhmän erottamina 15 ja on hydrofiilisessä, tyypillisesti happamassa ympäristössä Romeo et ai., Cell 68 (1992) 889 - 897; Irving et ai., J. Exp. Med. 177 (1993) 1093 - 1103]. Tämän elementin sisältävien reseptorien kerääntyminen yhteen käynnistää akti-vaatiokaskadin, jonka kannalta proteiinityrosiinikinaasi 20 (PTK) -aktiivisuus näyttää olevan välttämätön; PKT-inhi-biittorit estävät sekä B- ja T-solujen aktivaation varhaisia tapahtumia, kuten kalsiumin mobilisaatiota, että myöhempää sytokiinin vapautumista ja solujen proliferaatiota [June et ai., J. Immunol. 144 (1990) 1591 - 1599; Lane et 25 ai., J. Immunol. 146 (1991) 715 - 722; Mustelin et ai.,

Science 247 (1990) 1584 - 1587; Stanley et ai., J. Immunol. 145 (1990) 2189 - 2198] . Vaikka reseptoriaktivaation kau kaisemmat seuraukset ovat erilaisia solutyypin mukaan, varhaiset tapahtumat ovat silmiinpistävän samanlaisia erilai-30 sista hematopoieettisista linjoista peräisin olevien solujen kesken. Esimerkiksi PTK-aktiivisuuden nopeilla nousuilla, joita havaitaan B-soluantigeenireseptorin [Gold et ai., Nature 345 (1990) 810 - 813; Campbell ja Sefton, EMBO J. 9 (1990) 2125 - 2131], T-soluantigeenireseptorin [June et 35 ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 7722 - 7726; June et ai., J. Immunol. 144 (1990) 1591 - 1599] ja suuriaffini- 8 teettisen IgE-reseptorin [Eiseman ja Bolen, Nature 355 (1992) 78 - 80; Li et al., Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 3176 - 3182] ristiliittymisen jälkeen, on kaikilla yhtenä varhaisena fosforylaatiokohteena fosfatidyyli-inositolispesi-5 fisen fosfolipaasi C:n γ-isomuoto [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 2745.- 2749; Li et al., Mol. Cell Biol. 12 (1992) 3176 - 3182; Park et al., J. Biol.

Chem. 266 (1991) 24237 - 24240; Park et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 88 (1991) 5453 - 5456; Secrist et al., J.

10 Biol. Chem. 266 (1991) 12135 - 12139; Weiss et al., Annu.

Rev. Genet. 25 (1991) 487 - 510], joka aktivoituu suoraan tyrosiinin fosforylaation vaikutuksesta [Nishibe et al., Science 250 (1990) 1253 - 1256].

PTK-aktiivisuudet, joiden tähän mennessä tiedetään 15 liittyvän solun pintareseptoreihin, kuuluvat kahteen ryh mään; Src-proto-onkogeeniin liittyvien kinaasien ryhmään kuuluvat ja jokin aika sitten karakterisoituun Syk-kinaa-siin liittyvät. Ensin mainituista Fyn-kinaasin on osoitettu liittyvän T-solureseptoriin [Gassmann et al., Eur. J. Immu-20 nol. 22 (1992) 283 - 286; Samelson et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 87 (1990) 4358 - 4362], Lyn-, Fyn-, Blk- ja

Lck-kinaasien on raportoitu liittyvän B-solun IgM-resepto-riin [Burkhardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 7410 - 7414; Campbell ja Sefton, Mol. Cell Biol. 12 25 (1992) 2315 - 2321; Yamanashi et al., Science 251 (1991) 192 - 194] ja Lyn- ja Yes-kinaasien on osoitettu liittyvän suuriaffiniteettisen IgE-reseptoriin [Eiseman ja Bolen, Nature 355 (1992) 78 - 80; Hutchcroft et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 89 (1992) 9107 - 9111; Hutchcroft et al., 30 J. Biol. Chem. 267 (1992) 8613 - 8619]. Havaitun liittymi sen mekanismia ei ole selvitetty yksityiskohtaisesti, mutta alustavat tulokset viittaavat siihen, että solunsisäiset reseptorikompleksiketjudomeenit saattavat liittyä fysikaalisesti Src-ryhmän kinaaseihin [Clark et al., Science 258 35 (1992) 123 - 126; Timson Gauen et al., Mol. Cell. Biol. 12 9 (1992) 5438 - 5446]. Tällä hetkellä ei ole selvää, ovatko nämä liittymiset suoria vai epäsuoria.

Tähän mennessä varmimmat todisteet Src-ryhmän ki-naasien tärkeydestä soluaktivaatiossa on kehitetty tutki-5 maila T-soluissa olevia Fyn- ja Lck-kinaaseja. Fyn:n yli-ilmentyminen siirtogeenisissä hiirissä johtaa antigeeniin hyperreagoivaan fenotyyppiin tuloksena olevissa T-soluissa, kun taas katalyyttisesti inaktiivisen muodon yli-ilmentymi-nen estää T-solureseptorivälitteisen proliferaation [Cooke 10 et ai., Cell 65 (1991) 281 - 291]. Kateenkorvan T-soluissa, jotka on eristetty mutanttihiiristä, joilta puuttuu Fyn-kinaasiaktiivisuus, esiintyy perustavaa laatua oleva puute kyvyssä saada aikaan proliferaatiovaste reaktiona hoitoon forboliesterin ynnä joko anti-CD3-vasta-aineen tai kon-15 kanavaliini A:n yhdistelmällä [Appleby et ai., Cell 70 (1992) 751 - 763; Stein et ai., Cell 70 (1992) 741 - 750]. Mainitunlaista hiiristä eristetyissä pernan T-soluissa esiintyy vähemmän vakava mutta olennainen soluaktivaatiovasteen heikkeneminen [Appleby et ai., Cell 70 (1992) 751 - 763; 20 Stein et ai., Cell 70 (1992) 741 - 750].

T-soluissa Lck-kinaasi liittyy epäsuorasti TCR:ään CD4- ja CD8-koreseptorien kautta [Rudd et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988) 5190 - 5194; Shaw et ai., Cell 59 (1989) 627 - 636; Turner et ai., Cell 60 (1990) 755 - 765; 25 Veillette et ai., Cell 55 (1988) 301 - 308]. Lck:n yli-ilmentyminen antigeeniin reagoivassa solulinjassa vahvistaa reseptorin herkkyyttä samalla tavalla kuin havaitaan Fyn:n yhteydessä [Abraham ja Veillette, Mol. Cell Biol. 10 (1990) 5197 - 5206; Davidson et ai., J. Exp. Med. 175 30 (1982) 1483 - 1492; Luo ja Sefton, Mol. Cell Biol. 12 (1992) 4724 - 4732]. CD4-riippuvainen hiiren T-soluhybri- dooma-mallissa antigeenispesifisen auttajatoiminnan palautuminen oli saavutettavissa vain sellaisilla CD4-molekyy-leillä, joilla oli kyky olla vuorovaikutuksessa Lck:n kans-35 sa [Glaichenhaus et ai., Cell 64 (1991) 511 - 520].

10

Vahvimmat todisteet Lck-kinaasin suorasta osallistumisesta antigeenireseptorivälitteiseen viestitykseen tulevat kuitenkin tutkimuksista, jotka koskevat mutanttisolu-linjoja, joista puuttuu Lck. On tutkittu kahta tällaista 5 linjaa, joista toinen on peräisin ihmisen T-soluleukemia-linjasta Jurkat [Goldsmith ja Weiss, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 6879 - 6883; Straus ja Weiss, Cell 70 (1992) 585 - 593] ja toinen hiiren sytotoksisesta T-solukloonista CTLL-2 [Karnitz et ai., Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 4521 - 10 4530]. Molemmista Lck-negatiivisista mutanttilinjoista puut tuu TCR-välitteinen viestitys, ja kumman tahansa mutantti-linjan täydentäminen transfektoimalla Lck-ilmentämisplasmi-dilla palauttaa reagoivuuden TCR-ristiliittymisärsykkeisiin [Karnitz et ai., Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 4521 - 4530; 15 Straus ja Weiss, Cell 70 (1992) 585 - 593].

Jokin aika sitten uuden tyrosiinikinaasiryhmän jäsenien, joita aluksi edustivat läheistä sukua olevat tai identtiset kinaasit Syk [Taniguchi et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 15790 - 15796] ja PTK 72 [Zioncheck et ai., 20 J. Biol. Chem. 261 (1986) 15637 - 15643; Zioncheck et ai., J. Biol. Chem. 263 (1988) 19195 - 19202], on osoitettu liittyvän solun pintareseptoreihin. Vaikka PTK 72:n ja Sykrn ei ole sitovasti osoitettu olevan identtisiä, niille on yhteistä jakautuminen kudoksiin (kateenkorva ja perna), mole-25 kyylimassa ja proteolyysiherkkyys. PTK 72:n on osoitettu liittyvän B-solun IgM-reseptoriin [Hutchcroft et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 9107 - 9111; Hutchcroft et ai., J. Biol. Chem. 267 (1992) 8613 - 8619] ja fosforyloi- tuvan reseptorin ristiliittyessä anti-IgM:ään [Hutchcroft 30 et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 14846 - 14849]. Entsyymin samanaikainen aktivoituminen, mitattuna sekä autofosfory-laatiolla että eksogeenisen proteiinifragmentin fosforylaa-tiolla, on osoitettu pinta-IgM:n ristiliittymisen jälkeen [Hutchcroft et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 35 9107 - 9111; Hutchcroft et ai., J. Biol. Chem. 267 (1992) 8613 - 8619]. PTK 72:n havaitaan myös liittyvän suuriaffi- 11 niteettiseen IgE-reseptoriin rotan basofiilisessa leukemia-solulinjassa [Hutchcroft et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 9107 - 9111; Hutchcroft et ai., J. Biol. Chem.

267 (1992) 8613 - 8619].

5 Syk-ryhmän yhden toisen jäsenen, ZAP-70:n, on osoi tettu olevan PTK, joka liittyy T-solureseptorin zeeta-ket-juun reseptorin ristiliittymisen jälkeen [Chan et al.r Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 9166 - 9170]. Vaikka ZAP-70:n, Fyn:n tai Lck:n ilmentyminen COS-soluissa johtaa 10 solun kokonaistyrosiinifosfaatin kohtalaiseen lisääntymiseen, ZAP-70:n ja joko Lck:n tai Fyn:n rinnakkaisilmentymi-nen johtaa tyrosiinin nettofosforylaation dramaattiseen lisääntymiseen [Chan et ai., Cell 71 (1992) 649 - 662]. Jos läsnä on myös CD8-zeeta-ketjukimeera, kimeera fosforyloituu 15 ja ZAP-70 esiintyy siihen liittyneenä [Chan et ai., Cell 71 (1992) 649 - 662]. Tällä hetkellä ei ole selvää, aktivoiko ZAP-70 Src-ryhmän kinaaseja ja/tai päinvastoin, eikä myöskään se, miksi kinaasien rinnakkaisilmentyminen COS-soluissa johtaa näennäiseen konstitutiiviseen aktivaatioon. Joka 20 tapauksessa ZAP-70:n aktiivinen liittyminen ristiliittynee-seen TCR:ään viittaa siihen, että tällä PTK:11a on rooli reseptorivasteen edistämisessä.

Toisin kuin SRC-ryhmän kinaaseissa, Syk:ssa ja ZAP-70:ssä on kaksi SH2-domeenia eikä N-terminaalista my-25 ristoylaatiokohtaa [Taniguchi et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 15790 - 15796; Chan et ai., Cell 71 (1992) 649 - 662]. Luonnollinen odotus kinaasi-reseptoriliittymisen mekanismin suhteen on, että kyseiset kaksi SH2~domeenia sitovat anti-geenireseptorin laukaisija-aiheiden kaksi tyrosiinia, kun 30 ne ovat fosforyloituneet. Tämä on tällä hetkellä kuitenkin edelleen vain hypoteesi.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö osoittaa, että on järkevää muodostaa kimeeroja proteiinityrosiinikinaasimolekyylin solunsisäisen 35 domeenin ja kohteentunnistustehtävään kykenevän solunulkoi-sen domeenin kesken. Tarkemmin määriteltynä Syk- tai 12 ZAP-70-kinaasisekvenssejä sisältävien kimeerojen kerääntyminen yhteen laukaisee kalsiumin mobilisaation. Pelkkien Syk-kimeerojen aggregoituminen tai Fyn- tai Le k- ja ZAP-70-kinaaseja sisältävien kimeerojen rinnakkaisaggregoituminen 5 riittää käynnistämään sytolyyttisen efektoritoiminnan. Mainitunlainen efektoritoiminta helpottaa epätoivottavien koh-desolujen, esimerkiksi patogeenien, patogeenien infektoimien solujen, kasvainsolujen tai autoimmuunisolujen, spesifistä tunnistamista ja tuhoamista.

10 Voidaan konstruoida mikä tahansa määrä keksinnön mukaisia käyttökelpoisia kimeerisiä molekyylejä. Esimerkiksi sellaisten kimeerojen muodostaminen, jotka koostuvat proteiinityrosiinikinaasin solunsisäisestä osasta liittyneenä sopivasti käsitellyn vasta-ainemolekyylin solunulkoi-15 seen osaan, mahdollistaa immuunijärjestelmän solun kohteen-tunnistuspotentiaalin suuntaamiseen uudelleen spesifisesti solunulkoisen vasta-aineosan tunnistamaan antigeeniin. Niinpä vasta-aineosan pystyessä tunnistamaan jonkin patogeenin pinnalla olevan determinantin kimeeralla varustetut 20 immuunijärjestelmän solut reagoisivat patogeenin läsnäoloon alkuperäänsä sopivalla efektoriohjelmalla; auttaja-T-lymfo-syytit reagoisivat esimerkiksi sytotoksisella aktiivisuudella kohdetta vastaan, ja B-lymfosyytit aktivoituisivat syntetisoimaan vasta-ainetta. Makrofagit ja granylosyytit 25 toteuttaisivat efektoriohjelmansa, mukaan luettuina syto-kiinin vapautus, fagosytoosi ja reaktiivisen hapen tuotanto. Vastaavasti vasta-aineosan pystyessä tunnistamaan kas-vainsoluja immuunijärjestelmän reaktio kasvaimeen voimistuisi suotuisalla tavalla. Vasta-aineen pystyessä tunnista-30 maan immuunisoluja, jolla on epäasiallinen reaktiivisuus omien determinanttien kanssa, voisivat autoreaktiiviset solut tulla selektiivisesti valituiksi tuhoamiskohteiksi.

Vaikka näissä esimerkeissä käytetään vasta-aineki-meeroja kätevänä välineenä keksinnön selittämiseksi, kek-35 sinnön suoja-ala ei rajoitu vasta-ainekimeeroihin, ja spesifisten solunulkoisten ei-vasta-ainedomeenien käytöstä voi 13 itse asiassa olla tärkeitä etuja. Solunulkoisen osan ollessa esimerkiksi virus-, bakteeri- tai loisreseptori, kimee-roilla varustetut solut ottaisivat spesifisesti kohteikseen soluja, joilla esiintyy virus-, bakteeri- tai loisdeter-5 minantteja. Tämän lähestymistavan etuna vasta-aineiden käyttöön nähden on, että luontaisella patogeenireseptorilla voi olla ainutlaatuisen suuri selektiivisyys tai affiniteetti patogeenin suhteen, mikä mahdollistaa suuremman tarkkuusas-teen tuloksena olevassa immuunivasteessa. Oman antigeenin 10 kanssa epäasiallisesti reagoivien immuunijärjestelmän solujen hävittämiseksi voi vastaavasti riittää, että antigeeni liitetään (joko intaktina proteiinina tai MHC-kompleksina T-solukatohoitojen ollessa kyseessä) solunsisäisiin prote-iinityrosiinikinaasiketjuihin ja vaikutetaan siten omiin de-15 termeninantteihin epäasiallisesti reagoivien solujen spesifiseen kohdentumiseen.

Kimeerojen yksi muu käyttötarkoitus on solupopulaatioiden kontrollointi in vivo muuta muotoa olevien geeniteknisten toimenpiteiden jälkeen. On ehdotettu esimerkiksi 20 kasvaimiin tunkeutuvien lymfosyyttien tai luonnollisten tappajasolujen käyttöä sytotoksisten aineosien viemiseen kasvainten esiintymiskohtaan. Tämä keksintö tarjoaa kätevän keinon mainitunlaisten lymfosyyttien ja solujen lukumäärän ja aktiivisuuden säätelemiseksi poistamatta niitä potilaan 25 elimistöstä monistettaviksi in vitro. Koska kimeeristen reseptorien solunsisäiset domeenit ovat solujen proliferaa-tiovasteiden välittäjiä, solunulkoisten domeenien koordinointi erilaisilla solunulkoisille domeeneille spesifisillä aggregoitumisärsykkeillä (esimerkiksi solunulkoiselle do-30 meenille spesifisellä vasta-aineella) johtaa kimeeroja sisältävien solujen proliferaatioon.

Vaikka tämän keksinnön erityissuoritusmuodot käsittävät Syk- tai Syk- ja Src-ryhmän proteiinityrosiini-kinaasien välisiä kimeeroja, voitaisiin tässä esitettyihin 35 tarkoituksiin käyttää mitä tahansa tyrosiinikinaasia, joka toimii samalla tavalla kuin nämä molekyylit. Toivottavien 14 immuunisolujen käynnistäjämolekyylien ominaispiirteitä ovat kyky ilmentyä itsenäisesti, kyky tulla fuusioiduiksi so-lunulkoiseen domeeniin (suoraan tai epäsuorasti kalvon läpäisevän domeenin kautta), niin että tuloksena oleva kimee-5 ra esiintyy terapeuttisen solun pinnalla, ja kyky käynnistää solun efektoriohjelmia aggregoitumisen jälkeen kohdeli-gandin kohtaamiseksi.

Tällä hetkellä kätevin menetelmä kimeerojen viemiseksi immuunijärjestelmän soluihin on jonkin muotoinen gee-10 nihoito. Immuunijärjestelmän solujen tekeminen kimeerisiä reseptoreja sisältäviksi sekoittamalla solut sopivalla tavalla liukoiseen muotoon saatetun puhdistetun kimeerisen proteiinin kanssa johtaisi kuitenkin myös sellaisen käsitellyn solupopulaation muodostumiseen, jolla on kyky rea-15 goida kimeerojen solunulkoisen domeenin tunnistamiin kohteisiin. Samankaltaisia lähestymistapoja on käytetty esimerkiksi intaktin HIV-reseptorin, CD4:n, viemiseen erytro-syytteihin terapiatarkoituksia varten. Tässä tapauksessa käsitelty solupopulaatio olisi kyvytön itseuusiutumiseen.

20 Tämä keksintö kuvaa toimivia yksinkertaistettuja proteiinityrosiinikinaasikimeeroja, joilla on kyky ohjata uudelleen immuunijärjestelmän toimintaa. Se kuvaa tarkemmin määriteltynä lymfosyyttien, makrofagien, luonnollisten tappajasolujen tai granulosyyttien säätelyä ilmentämällä mai-25 nituissa soluissa kimeeroja, joilla on kyky saada solu reagoimaan kimeerojen tunnistamiin kohteisiin. Keksintö koskee myös lääkeainetta, joka on tarkoitettu soluvasteiden suuntaamiseksi infektionaiheuttajaan, kasvain- tai syöpäsoluun tai autoimmuunimekanismilla syntyneeseen soluun. Soluvas-30 teen ohjaamiseksi nisäkkäässä käsittää sen, että annetaan mainitulle nisäkkäälle vaikuttava määrä terapeuttisia soluja, joilla mainituilla soluilla on kyky tunnistaa ja tuhota mainittu infektionaiheuttaja, kasvain- tai syöpäsolu tai autoimmuunimekanismilla syntynyt solu. Soluvasteen välittä-35 jänä voi olla yksi ainoa kimeera tai se voi olla tulos useiden kimeerojen (esimerkiksi kahden tai useamman kimee- 15 ran muodostama ryhmä, joista yksi sisältää solunsisäisen CD28-domeenin) välisestä yhteistyöstä.

HIV-infektion hoitamiseksi annetaan potilaalle vaikuttava määrä sytotoksisia T-lymfosyyttejä, joilla esiintyy 5 kimeerinen reseptori; näillä lymfosyyteillä on kyky tunnistaa ja lysoida spesifisesti HIV:n infektoimia soluja samoin kuin verenkierrossa oleva virus.

Yhdessä toisessa suoritusmuodossa tarjotaan käyttöön kimeerisiä reseptoriproteiineja, jotka ohjaavat syto-10 toksiset T-lymfosyytit tunnistamaan ja lysoimaan HIV:n infektoiman solun. Yksi toinen keksinnön suoritusmuoto käsittää isäntäsoluja, jotka on transformoitu vektorilla, joka käsittää kimeerisiä reseptoreja.

Joukkoa menetelmiä kimeeristen immuunireseptorien 15 konstruoimiseksi ja ilmentämiseksi samoin niiden erilaisia terapeuttisia käyttötarkoituksia selvitetään yksityiskohtaisesti US-patenttihakemuksissa sarjanumerot 07/847 566 ja 07/665 961, jotka mainitaan täten viitteinä.

Tämän keksinnön nämä ja muut, sitä rajoittamattomat 20 suoritusmuodot käynevät ilmi ammattimiehille seuraavasta keksinnön yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

Seuraavassa yksityiskohtaisessa kuvauksessa viitataan erilaisiin molelyylibiologian ja immunologian alan ammattimiesten tuntemiin menetelmiin. Julkaisut ja muu mate-25 riaali, joissa esitetään mainitunlaisia menetelmiä, joihin viitataan, mainitaan tässä kokonaisuudessaan viitteinä.

Perushakuteoksiin, joissa esitetään yhdistelmä-DNA-tekniikan yleisiä periaatteita, kuuluvat Watson et al., Molecular Biology of the Gene, voi. I ja II, the Benjamin/ 30 Gummings Publishing Company, Inc., Menlo Park CA 1977; Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., New York, N.Y. 1986; Lewin, Genes II, John Wileys & Sons, New York, N.Y. 1985; Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 35 2. p., University of California Press, Berkeley, CA 1981;

Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 16 2. p., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, N.Y. 1989.

Määritelmiä 5 Termillä "kloonaus" tarkoitetaan in vitro -rekombi- naatiomenetelmän käyttöä jonkin määrätyn geenin tai muun DNA-sekvenssin insertoimiseksi vektorimolekyyliin. Halutun geenin kloonaamiseksi menestyksellisesti on välttämätöntä käyttää menetelmiä DNA-fragmenttien aikaansaamiseksi, näi-10 den fragmenttien liittämiseksi vektorimolekyyleihin, yhdistelmä- DNA-molekyyl in viemiseksi isäntäsoluun, jossa se pystyy replikoimaan, ja kohdegeenin sisältävän kloonin valikoimiseksi vastaanottajaisäntäsolujen joukosta.

Termillä "cDNA" tarkoitetaan komplementaarista eli 15 kopio-DNA:ta, joka on syntynyt RNA-templaatista RNAista riippuvaisen DNA-polymeraasin (käänteistranskriptaasin) vaikutuksesta. Niinpä "cDNA-klooni" tarkoittaa kiinnostuksen kohteena olevalle RNA-molekyylille komplementaarista kak-sisäikeistä DNA-sekvenssiä, joka on kloonausvektorissa.

20 Termillä "cDNA-kirjasto" tarkoitetaan kokoelmaa cDNA-inserttejä sisältäviä yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka käsittävät DNA-kopioita mRNA:sta, jota solu ilmentää cDNA-kirjaston tekohetkellä. Mainitunlainen cDNA-kirjasto voidaan valmistaa ammattimiesten tuntemin menetelmin, joita 25 kuvataan esimerkiksi teoksessa Maniatis et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra. Yleisesti esitettynä ensin eristetään RNArta sellaisen organismin soluista, jonka genomista halutaan kloonata jokin määrätty geeni. Tämän keksinnön tarkoituksiin ovat edullisia nisäkkäiden ja eri-30 tyisesti ihmisen lymfosyyttisolulinjat. Yksi tähän tarkoitukseen tällä hetkellä edullinen vektori on lehmänrokkovi-ruskanta WR.

Termillä "vektori" tarkoitetaan esimerkiksi plasmi-dista, bakteriofagista tai nisäkkään tai hyönteisen viruk-35 sesta peräisin olevaa DNA-molekyyliä, johon voidaan inser-toida tai kloonata DNA-fragmentteja. Vektori sisältää yhden 17 tai useamman ainutkertaisen restriktiokohdan ja voi olla kykenevä autonomiseen replikaatioon jossakin määrätyssä isäntä- tai vehikkeliorganismissa, niin että kloonattu sekvenssi on saatettavissa lisääntymään. Niinpä termillä "DNA-5 ilmentämisvektori" tarkoitetaan mitä tahansa itsenäistä elementtiä, jolla on kyky ohjata rekombinanttipeptidin synteesiä. Mainitunlaisia DNA-ilmentymisvektoreita ovat mm. bakteeriplasmidit ja faagit ja nisäkäs- ja hyönteisplasmi-dit ja -virukset.

10 Termillä "olennaisen puhdas" tarkoitetaan yhdistet tä, esimerkiksi proteiinia, polypeptidiä tai vasta-ainetta, joka on siihen luonnollisesti liittyviä komponentteja olennaisesti sisältämätön. Yhdiste on yleisesti ottaen olennaisen puhdas, kun vähintään 60 %, edullisemmin vähintään 75 % 15 ja edullisimmin vähintään 90 % kaikesta näytteessä olevasta materiaalista on kiinnostuksen kohteena olevaa yhdistettä. Puhtaus voidaan mitata millä tahansa sopivalla menetelmällä, esimerkiksi pylväskromatografiällä, polyakryyliamidi-geelielektroforeesilla tai HPLC-analyysillä. Nukleiinihapon 20 yhteydessä "olennaisen puhdas" tarkoittaa nukleiinihappose-kvenssiä, -segmenttiä tai -fragmenttia, joka ei välittömästi rajoitu (ts. ole kytkeytynyt kovalenttisesti) kumpaankaan koodaussekvensseistä, joihin se rajoittuu (ts. toiseen 5'-päästään ja toiseen 3'-päästään) keksinnön mukaisen 25 DNA:n lähteenä olevan organismin luonnossa esiintyvässä ge-nomissa.

Termillä "funktionaalinen johdos" tarkoitetaan molekyylin "fragmentteja", "variantteja", "analogeja" tai "kemiallisia johdoksia". Molekyylin "fragmentti", kuten mi-30 kä tahansa tämän keksinnön mukaisista cDNA-sekvensseistä, tarkoittaa molekyylin mitä tahansa nukleotidialajoukkoa. Mainitunlaisen molekyylin "variantti" tarkoittaa luonnossa esiintyvää molekyyliä, joka on olennaisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen fragmentti. Molekyylin 35 "analogi" tarkoittaa ei-luonnollista molekyyliä, joka on olennaisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen 18 fragmentti. Molekyylin sanotaan olevan "olennaisesti samanlainen" kuin toinen molekyyli, jos aminohapposekvenssi on olennaisesti sama molemmissa molekyyleissä. "Olennaisesti samanlainen" aminohapposekvenssi on tarkemmin määriteltynä 5 sekvenssi, jonka identtisyysaste luonnollisen tai referens-sisekvenssin kanssa on vähintään 50 %, edullisesti 85 % ja edullisimmin 95 % ja/tai joka eroaa luonnollisesta tai re-ferenssisekvenssistä vain konservatiivisten aminohapposubs-tituutioiden suhteen. Olennaisesti samanlaisilla aminohap-10 pomolekyyleillä on samanlainen biologinen aktiivisuus. Niinpä kahta molekyyliä pidetään variantteina termin tässä käytetyssä merkityksessä sillä edellytyksellä, että niillä on samanlainen aktiivisuus, vaikka toinen molekyyleistä sisältää enemmän tai vähemmän aminohapporyhmiä kuin toinen 15 tai aminohapposekvenssit eivät ole identtiset. Tässä käy tettynä molekyylin sanotaan oleva toisen molekyylin "kemiallinen johdos", kun se sisältää kemiallisia lisäryhmitty-miä, jotka eivät normaalisti ole kyseisen molekyylin osia. Mainitunlaiset ryhmittymät voivat parantaa molekyylin liu-20 koisuutta, imeytymistä, biologista puoliintumisaikaa jne.

Nämä ryhmittymät voivat vaihtoehtoisesti vähentää molekyylin toksisuutta, eliminoida molekyylin mahdollisen epätoivottavan sivuvaikutuksen tai heikentää sitä jne. Mainitunlaisia vaikutuksia välittämään pystyviä ryhmittymiä esite-25 tään esimerkiksi teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. p., Mack Publishing Co., Easton, PA 1980.

Tämän keksinnön mukaisen reseptorikimeerageenin "funkionaalisen johdoksen" piiriin on vastaavasti tarkoitettu kuuluviksi geenin "fragmentit", "variantit" tai "ana-30 logit", jotka voivat olla nukleotidisekvenssiltään "olennaisesti samanlaisia" ja jotka koodaavat molekyyliä, jolla on samanlainen aktiivisuus kuin proteiinityrosiini-kinaasikimeeralla. "Olennaisesti samanlaiset" nukleiinihapot koodaavat olennaisesti samanlaisia aminohapposekvensse-35 jä (määritelty edellä), ja niiden piiriin voi kuulua myös mikä tahansa nukleiinihapposekvenssi, jolla on kyky hybri- 19 disoitua luonnollisen tai referenssinukleiinihapposekvens-sin kanssa sopivissa hybridisaatio-olosuhteissa (katso esimerkiksi Ausubel et ai., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, N.Y. 1989 ankaruudeltaan 5 sopivien hybridisaatio-olosuhteiden suhteen).

Niinpä termin proteiinityrosiinikinaasikimeerapro-teiini piiriin on tarkoitettu tässä käytettynä kuuluviksi mitkä tahansa funktionaaliset johdokset, fragmentit, variantit, analogit tai kemialliset johdokset, jotka voivat 10 olla olennaisesti samanlaisia kuin "villin tyypin" kimeera ja joilla on samanlainen aktiivisuus (ts. edullisimmin 90 %, edullisemmin 70 %, edullisesti 40 % tai vähintään 10 % villin tyypin reseptorikimeeran aktiivisuudesta). Ki-meerisen reseptorin funktionaalisen johdannaisen aktiivi-15 suuteen sisältyy spesifinen sitoutuminen (solunulkoisen osan kautta) kohteena olevaan taudinaiheuttajaan tai soluun ja tuloksena oleva kyseisen aiheuttajan tai solun tuhoaminen (solunsisäisen osan ohjaamana); mainitunlainen aktiivisuus voidaan testata esimerkiksi käyttämällä mitä tahansa 20 tässä kuvatuista määrityksistä.

Tämän keksinnön mukaista kimeeraa tai sen funktionaalisia johdoksia koodaava DNA-sekvenssi voidaan yhdistää vektori-DNA:hän tavanomaisin menetelmin, mukaan luettuina tylpät tai yksisäikeiset päät ligaatiota varten, restrik-25 tioentsyymipilkonta sopivien päiden aikaansaamiseksi, päi den täydentäminen tarvittaessa, käsittely alkalisella fos-fataasilla epätoivottavan liittymisen välttämiseksi ja li-gaatio sopivien ligaasien avulla. Menetelmiä mainitunlaisten käsittelyjen tekemiseksi esittävät Manitis et ai., sup-30 ra, ja ne ovat alalla hyvin tunnettuja.

Nukleiinihappomolekyylin, kuten DNA:n, sanotaan olevan "kykenevä ilmentämään" polypeptidi, jos se sisältää nukleotidisekvenssejä, jotka sisältävät transkription ja translaation säätelyinformaatiota ja mainitunlaiset sek-35 venssit "kytkeytyvät toiminnallisesti" polypeptidiä koodaa- viin nukleotidisekvensseihin. Toiminnallinen kytkentä on 20 kytkentä, jossa säätely-DNA-sekvenssit ja DNA-sekvenssi, joka on määrä ilmentää, liittyvät toisiinsa tavalla, joka mahdollistaa geenin ilmentymisen. Geenin ilmentämisen vaatimien säätelyalueiden tarkka luonne voi vaihdella organis-5 mistä toiseen, mutta mukana on yleensä promoottorialue, joka prokaryooteissa sisältää sekä promoottorin (joka ohjaa RNA:n transkription alkamista) että DNA-sekvenssit, jotka RNA:ksi kopioituina antavat proteiinisynteesin aloitussig-naalin. Mainitunlaisiin alueisiin kuuluvat normaalisti 5'-10 pään koodaamattomat sekvenssit, jotka ovat mukana transkription ja translaation aloituksessa, kuten TATA-laatik-ko, cap-rakenne, CAAT-sekvenssi yms.

Koodaamaton alue 3'-suuntaan proteiinia koodaavasta geenisekvenssistä voidaan haluttaessa saada aikaan edellä 15 kuvatuin menetelmin. Tämä alue voidaan säilyttää transkription lopetusta säätelevien sekvenssiensä, kuten terminaa-tio- ja polyadenylaatiosekvenssiensä, vuoksi. Säilyttämällä proteiinia koodaavaan DNA-sekvenssiin luonnostaan rajoittuva 3'-alue voidaan siten saada aikaan transkription lope-20 tussignaalit. Jos transkription lopetussignaalit eivät toimi tyydyttävällä tavalla ilmentämisisäntäsolussa, voidaan niiden tilalla käyttää isäntäsolussa toimivaa 3'-aluetta.

Kahden DNA-sekvenssin (kuten promoottorialueen sekvenssin ja proteiinityrosiinikinaasikimeeraa koodaavan sek-25 venssin) sanotaan oleva toiminnallisesti kytkeytyneitä, jos näiden kahden DNA-sekvenssin välisen kytkennän luonne ei (1) johda kehystä siirtävään mutaatioon, (2) häiritse promoottorialueen sekvenssin kykyä ohjata reseptorikimeeragee-nisekvenssin transkriptiota eikä (3) häiritse reseptoriki-30 meerageenisekvenssin kykyä tulla kopioiduksi promoottorialueen sekvenssin vaikutuksesta. Promoottorialue olisi kytkeytynyt toiminnallisesti DNA-sekvenssiin, jos promoottorilla olisi kyky saada aikaan kyseisen DNA-sekvenssin transkriptio. Niinpä asianomaisen isännän tunnistamat transkriptio-35 ja translaatiosignaalit ovat välttämättömät proteiinin ilmentämiseksi .

21 Tässä kuvataan proteiinityrosiinikinaasikimeerapro-teiinin (tai sen funktionaalisen johdoksen) ilmentämisen joko prokaryootti- tai aukaryottisoluissa, vaikkakin euka-ryoottinen (ja erityisesti ihmisen lymfosyyteissä tapahtu-5 va) ilmentäminen on edullista.

Tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan valmistaa millä tahansa monista erilaisista menetelmistä. Voidaan esimerkiksi antaa soluja, jotka ilmentävät reseptori-kimeeraproteiinia tai sen funktionaalista johdosta, eläi-10 melle kyseisen kimeeran sitomiseen kykeneviä polyklonaali-sia vasta-aineita sisältävän seerumin tuotannon käynnistämiseksi .

Yhdessä edullisessa menetelmässä tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet ovat monoklonaalisia vasta-aineita. 15 Mainitunlaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa käyttämällä hybridoomatekniikkaa [Kohler et ai., Nature 256 (1975) 495; Kohler et ai., Eur. J. Immunol. 6 (1976) 511; Kohler et ai., Eur. J. Immunol. 6 (1976) 292;

Hammerling et ai. teoksessa Monoclonal Antibodies and 20 T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. 1981, s. 563 - 684].

Yleisesti esitettynä mainitunlaisissa menettelyissä immunisoidaan eläin kimeera-antigeenilla. Mainitunlaisten eläinten splenosyytit eristetään ja fuusioidaan sopivan myeloo-masolulinjan kanssa. Tämän keksinnön mukaisesti voidaan 25 käyttää mitä tahansa sopivaa myeloomasolulinjaa. Fuusioinnin jälkeen tuloksena olevia hybridoomasoluja pidetään selektiivisesti yllä HAT-alustassa ja kloonataan sitten raja-laimennusmenetelmällä, jota kuvaavat Wands et ai. [Gastroenterology 80 (1981) 225 - 232]. Mainitunlaisella vali- 30 koinnilla saadut hybridoomasolut tutkitaan sitten kimeeroja sitomaan kykeneviä vasta-aineita erittävien kloonien identifioimiseksi. Tässä kuvatut vasta-aineet voivat olla myös polyklonaalisia tai, edullisesti, aluespesifisiä polyklo-naalisia vasta-aineita.

35 Tässä kuvattuja kimeerojen vastaisia vasta-aineita voidaan käyttää tarkkailtaessa kimeerisen reseptorin (tai 22 kimeerisen reseptorin sisältävien solujen) määrää potilaassa. Mainitunlaiset vasta-aineet soveltuvat hyvin käytettäviksi alalla tunnetuissa tavanomaisissa immuunidiagnostisissa määrityksissä, mukaan luettuina sellaiset immunomet-5 riset määritykset tai "kerrosmääritykset" kuin suorat, käänteiset ja samanaikaiset kerrosmääritykset. Vasta-aineita voidaan käyttää miten monina tahansa yhdistelminä, joita ammattimiehet voivat määritellä ilman tarpeettomia kokeiluja, spesifisyydeltään, herkkyydeltään ja tarkkuudeltaan hy-10 väksyttävien immuunimääritysten aikaansaamiseksi.

Perushakuteoksiin, joissa esitetään immunologian yleisiä periaatteita, kuuluvat Roitt, Essential Immunology, 6. p., Blackwell Scientific Publications, Oxford 1988; Kimball, Introduction to Immunology, 2. p., Macmillan Pub- 15 lishing Co., New York 1986; Roitt et al., Immunology, Gower Mwdical Publishing Ltd., Lontoo 1985; Campbell, Monoclonal Antibody Technology teoksessa Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 13, toim. Burdon et al., Elsevier, Amsterdam 1984; Klein, Immunology: The 20 Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York 1982; Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, toim. Kennett et al., Plenum Press, New York 1980.

"Detektointi" on tarkoitettu sisältämään aineen 25 läsnä- tai poissaolon tai aineen määrän määrittämisen. Tämä termi tarkoittaa siten keksinnön mukaisten materiaalien, koostumusten ja menetelmien käyttöä kvalitatiivisiin ja kvantitatiivisiin määrityksiin.

Muita hybridoomia, jotka erittävät monoklonaalisia 30 vasta-aineita, joilla on sama spesifisyys kuin tässä kuvatuilla, voidaan eristää anti-idiotyyppiseulontamenetelmällä [Potocmjak et al., Science 215 (1982) 1637]. Anti- idiotyyppivasta-aine on lyhyesti esitettynä vasta-aine, joka tunnistaa kiinnostuksen kohteena olevan kloonin tuotta-35 maila vasta-aineella esiintyviä ainutlaatuisia determinantteja. Anti-idiotyyppivasta-aine valmistetaan immunisoimalla 23 eläin, joka on samaa kantaa kuin monoklonaalisen vasta-aineen lähteenä käytettävä, kiinnostuksen kohteena olevalla monoklonaalisella vasta-aineella. Immunisoitu eläin tunnistaa immunisointivasta-aineen idiotyyppiset determinantit ja 5 reagoi niihin tuottamalla näiden idiotyyppisten determinanttien vastaista vasta-ainetta (anti-idiotyyppivasta-ainetta).

Hybridisoluja voidaan viljellä replikaatiota varten sekä in vitro että in vivo. Suuri tuotanto tekee in vivo 10 -viljelystä tällä hetkellä edullisen viljelymenetelmän. Ly hyesti esitettynä yksittäisistä hybridikannoista peräisin olevia soluja injektoidaan intraperitoneaalisesti pristaa-nilla esihoidettuihin BALB/c-hiiriin toivottuja monoklonaa-lisia vasta-aineita suurina pitoisuuksina sisältävän vesi-15 vatsanesteen tuottamiseksi. Isotyyppiä IgM tai IgG olevia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan puhdistaa viljel-mäsupernatanteista käyttämällä ammattimiesten hyvin tuntemia pylväskromatografiamenetelmiä.

Tässä kuvatut vasta-aineet soveltuvat erityisesti 20 käytettäviksi immuunimäärityksissä, joissa niitä voidaan käyttää nestefaasissa tai sidottuina kiinteään kantajaan. Näissä immuunimäärityksissä käytettävät vasta-aineet voidaan lisäksi leimata detektoitavissa oleviksi eri tavoin.

Alalla tunnetaan monia erilaisia merkkiaineita ja 25 leimausmenetelmiä. Esimerkkeihin merkkiainetyypeistä, joita voidaan käyttää tämän keksinnön yhteydessä, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, entsyymit, radioisotoopit, fluoresoivat yhdisteet, kemiluminesoivat yhdisteet, bioluminesoivat yhdisteet ja metallikelaatit. Ammattimiehet 30 tuntenevat muita vasta-aineisiin sidottaviksi soveltuvia merkkiaineita tai pystynevät löytämään niitä käyttämällä rutiinikokeita. Näiden merkkiaineiden sitominen vasta-aineisiin voidaan myös tehdä käyttämällä tavanomaisia, ammattimiesten yleisesti tuntemia menetelmiä.

35 Yksi tavoista, joilla tämän keksinnön mukaisia vas ta-aineita voidaan leimata detektoitavissa oleviksi, on vas- 24 ta-aineen kytkeminen entsyymiin. Joutuessaan myöhemmin alttiiksi substraatilleen tämä entsyymi reagoi puolestaan substraatin kanssa sillä tavalla, että syntyy kemiallinen ryhmittymä, joka voidaan detektoida esimerkiksi spektrofoto-5 metrisin tai fluorimetrisin keinoin. Esimerkkeihin entsyy meistä, joita voidaan käyttää vasta-aineiden leimaamiseen detektoitavissa oleviksi, kuuluvat malaattidehydrogenaasi, stafylokokkinukleaasi, delta-V-steroidi-isomeraasi, hiivan alkoholidehydrogenaasi, alfa-glyserofosfaattidehydrogenaasi, 10 trioosifosfaatti-isomeraasi, biotiiniavidiiniperoksidaasi, piparjuuriperoksidaasi, alkalinen fosfataasi, asparaginaa-si, glukoosioksidaasi, β-galaktosidaasi, ribonukleaasi, ure-aasi, katalaasi, glukoosi-VI-fosfaattidehydrogenaasi, glu-koamylaasi ja asetyylikoliiniesteraasi.

15 Detektoitavissa oleviksi leimattujen vasta-aineiden läsnäolo voidaan detektoida myös leimaamalla vasta-aineet radioaktiivisella isotoopilla, joka voidaan määrittää sitten sellaisin keinoin kuin käyttämällä gamma- tai tuikelas-kuria. Tämän keksinnön tarkoituksiin erityisen käyttökel-20 poisia isotooppeja ovat 3H, 125I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57Co, 59Fe ja 75Se.

On myös mahdollista todeta detektoitavissa oleviksi leimattujen vasta-aineiden sitoutuminen leimaamalla vasta-aineet fluoresoivalla yhdisteellä. Kun fluoresoivaksi lei-25 mattu vasta-aine saatetaan alttiiksi aallonpituudeltaan sopivalle valolle, sen läsnäolo voidaan detektoida väriaineen fluoresenssin ansiosta. Yleisimmin käytettyihin fluoresoiviin merkkiaineisiin kuuluvat fluoreseiini, isotiosyanaat-ti, rodamiini, fykloerytriini, fykosyaniini, allofykosya-30 niini, o-ftaalialdehydi ja fluoresamiini.

Tässä kuvatut vasta-aineet voidaan leimata detektoitavissa oleviksi myös käyttämällä fluoresoivia metalleja, kuten 152Eu:a tai muita lantanidisarjän metalleja. Näitä metalleja voidaan kiinnittää vasta-ainemolekyyliin käyttä-35 mällä sellaisia metalleja kelatoivia ryhmiä kuin diety- 25 leenitriamiinipentaetikkahappoa (DTPA) tai etyleenidiamiini-tetraetikkahappoa (EDTA).

Vasta-aineita voidaan leimata detektoitavissa oleviksi myös kytkemällä ne kemiluminesoivaan yhdisteeseen.

5 Kemiluminesoivalla aineella leimatun vasta-aineen läsnäolo määritetään sitten detektoimalla kemiallisen reaktion aikana syntyvän luminesenssin läsnäolo. Esimerkkejä erityisen käyttökelpoisista kemiluminesoivista merkkiyhdisteistä ovat luminaali, isoluminoli, aromaattinen akridiniumesteri, imi-10 datsoli, akridiniumsuolat, oksalaattiesteri ja dioksetaani.

Bioluminesoivaa yhdistettä voidaan samoin käyttää tämän keksinnön mukaisten vasta-aineiden leimaamiseen. Bio-luminesenssi on biologisissa järjestelmissä esiintyvä ke-miluminesenssityyppi, jossa katalyyttinen proteiini tehos-15 taa kemiluminesenssireaktiota. Bioluminesoivan vasta-aineen läsnäolo määritetään detektoimalla luminesenssin läsnäolo. Tärkeisiin bioluminesoiviin yhdisteisiin leimaustarkoitus-ten kannalta kuuluvat lusiferiini ja lusiferaasi ekvoriini.

Tässä kuvatut vasta-aineet sopivat ihanteellisesti 20 välineistön valmistamiseen. Mainitunlainen välineistö voi käsittää kantajavälineen, joka on jaettu osastoihin ottaakseen vastaan siten tiukasti rajattuihin tiloihin yhden tai useamman säiliövälineen, kuten pulloja, putkia yms., joista mainituista säiliövälineistä kukin käsittää käytettävän 25 määrityksen eri elementin.

Määritystyyppejä, joita voidaan sisällyttää välineistön muotoon, on monia, ja niihin kuuluvat esimerkiksi kompetitiiviset ja ei-kompetitiiviset määritykset. Tyypillisiä esimerkkejä määrityksistä, joissa voidaan käyttää kek-30 sinnön mukaisia vasta-aineita, ovat radioimmuunimääritykset (RIA), entsyymi-imuunimääritykset (EIA), entsyymiin kytketty immuunisorbentti -määritykset (ELISA) ja immunometriset eli kerrosimmuunimääritykset.

Termin "immunometrinen määritys" eli "kerrosim-35 muunimääritys" piiriin on tarkoitettu kuuluviksi samanai kaiset, suorat ja käänteiset kerrosimmuunimääritykset. Nämä 26 termit ovat ammattimiesten hyvin ymmärtämiä. Ammattimiehet ymmärtänevät myös, että tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet ovat käyttökelpoisia määritysten muissa variaatioista ja muodoissa, joita tunnetaan tällä hetkellä tai joi-5 ta voidaan kehittää tulevaisuudessa. Ne on tarkoitettu kuuluviksi tämän keksinnön suoja-alan puitteisiin.

Edullisessa tavassa määritysten tekemiseksi on tärkeää, että inkubointiväliaineessa on läsnä tiettyjä "salpaajia" (jotka lisätään tavallisesti yhdessä leimatun liu-10 koisen vasta-aineen kanssa). "Salpaajia" lisätään sen ta kaamiseksi, että tutkittavassa näytteessä läsnä olevat epäspesifiset proteiinit, proteaasi tai ihmisen vasta-aineet hiiren immunoglobuliineja vastaan eivät ristisido tai tuhoa kiinteällä kantajalla olevia vasta-aineita tai radioaktii-15 visesti laimettua indikaattorivasta-ainetta, niin että syntyy vääriä positiivisia tai vääriä negatiivisia tuloksia. Valikoima "salpaajia" parantaa siten olennaisesti tämän keksinnön yhteydessä kuvattavien määritysten spesifisyyttä.

On havaittu, että "salpaajina" voidaan käyttää 20 joukkoa merkityksettömiä (ts. epäspesifisiä) vasta-aineita, jotka kuuluvat samaan ryhmään tai alaryhmään (isotyyppiin) kuin määrityksissä käytettävät (esimerkiksi IgGi, IgG2a, IgM jne.). "Salpaajien" pitoisuus (normaalisti 1 - 100 pg/ml) on tärkeää, jotta pidetään yllä asianmukainen herkkyys ja 25 estetään samalla mahdollinen ihmisen seerumissa esiintyvien ristireagoivien proteiinien aiheuttama epätoivottu häirintä. Lisäksi "salpaajat" sisältävä puskurijärjestelmä täytyy optimoida. Edullisia puskureita ovat heikkoihin orgaanisiin happoihin perustuvat puskurit, kuten imidatsoli-, HEPPS-, 30 MOPS-, TES-, ADA-, ACES-, HEPES-, PIPES-, TRIS- yms. puskurit, joiden pH on fysiologisella alueella. Jonkin verran vähemmän edullisia puskureita ovat epäorgaaniset puskurit, kuten fosfaatti-, boraatti- ja karbonaattipuskurit. On myös edullista lisätä tunnettuja proteaasi-inhibiittoreita (nor-35 maaliksi 0,01 - 10 pg/ml) "salpaajat" sisältävään pusku riin .

27

On olemassa monia kiinteitä immuuniadsorbentteja, joita on käytetty ja joita voidaan käyttää tämän keksinnön yhteydessä. Hyvin tunnettuihin immuuniadsorbentteihin kuuluvat lasi, polystyreeni, polypropeeni, dekstraani, nailon 5 ja muut materiaalit mainitunlaisista materiaaleista muodostettujen tai niillä päällystettyjen putkien, helmien ja mikromaljojen muodossa, yms. Immobilisoitavat vasta-aineet voidaan sitoa joko kovalenttisesti tai fysikaalisesti kiinteään immuuniadsorbenttiin käyttämällä sellaisia menetelmiä 10 kuin kovalenttista sitomista amidi- tai esterisidoksen kautta tai absorboimalla. Ammattimiehet tuntevat tai pystyvät korkeintaan rutiinikokeita käyttämällä löytämään monia muita sopivia kiinteitä immuuniadsorbentteja ja menetelmiä vasta-aineiden immobilisoimiseksi niille.

15 Diagnoosin tekemiseksi in vivo, in vitro tai in si tu voidaan sitoa merkkiaineita, kuten radionuklideja, tämän keksinnön mukaisiin vasta-aineisiin joko suoraan tai käyttämällä funktionaalista väliryhmää. Yksi väliryhmä, jota käytetään usein metallikationien muodossa olevien radioiso-20 tooppien sitomiseen vasta-aineisiin, on dietyleenitriamii-nipentaetikkahappo (DTPA). Tyypillisiä esimerkkejä tällä tavalla sidottavista metallikationeista ovat 99Tc, 123I, luIn, 131I, 97Ru, 57Cu, 67Ga ja 68Ga. Tässä kuvattuja vasta- aineita voidaan leimata myös ei-radioaktiivisilla isotoo-25 peiliä diagnoositarkoituksiin. Tällä tavalla käytettyinä erityisen käyttökelpoisia alkuaineita ovat 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr ja 56Fe.

Tässä kuvattu antigeeni voidaan eristää olennaisen puhtaassa muodossa käyttämällä tämän keksinnön mukaisia 30 vasta-aineita. Niinpä yksi suoritusmuoto tarjoaa käyttöön olennaisen puhtaan proteiinityrosiinikinaasikimeeran, jolle mainitulle antigeenille on tunnusmerkillistä, että tässä kuvatut vasta-aineet tunnistavat ja sitovat sen. Yhdessä toisessa suoritusmuodossa tarjotaan käyttöön menetelmän ki-35 meerisen reseptoriantigeenin eristämiseksi tai puhdistami- 28 seksi muodostamalla mainitun antigeenin kompleksi yhden tai useamman reseptorikimeeran vastaisen vasta-aineen kanssa.

Tässä kuvattuja olennaisen puhtaita kimeera-anti-geeneja voidaan puolestaan käyttää kimeeran vastaisen vas-5 ta-aineen detektointiin tai mittaamiseen näytteestä, kuten seerumista tai virtsasta. Niinpä tässä tarjotaan käyttöön yksi suoritusmuoto käsittää menetelmän proteiinityrosiini-kinaasiantigeenin vastaisen vasta-aineen läsnäolon tai määrän detektoimiseksi näytteestä, joka menetelmä käsittää 10 vasta-ainetta sisältävän näytteen saattamisen kosketukseen detektoitavissa olevaksi leimatulla reseptorikimeeralla varustetun kimeerisen antigeenin kanssa ja mainitun merkkiaineen detektoinnin. Ymmärrettäneen, että voidaan käyttää myös kimeeran immuunireaktiivisia fraktioita ja immuunireaktii-15 visia analogeja. Termillä "immuunireaktiivinen fraktio" tarkoitetaan kimeerisen antigeenin mitä tahansa osaa, jolla se immuunireagoi vastaavalla tavalla reseptorikimeeran vastaiseen vasta-aineeseen. Termillä "immuunireaktiivinen analogi" tarkoitetaan proteiinia, joka eroaa reseptorikimeera-20 proteiinista yhden tai useamman aminohapon suhteen, mutta immuunireagoi vastaavalla tavalla keksinnön mukaiseen vasta-aineeseen .

Termillä "tunnistaa ja sitoa spesifisesti" tarkoitetaan sitä, että vasta-aine tunnistaa ja sitoo kimeerisen 25 reseptoripolypeptidin, muttei olennaisesti tunnista eikä sido muita näytteessä, esimerkiksi biologisessa näytteessä, olevia ei-sukulaismolekyylejä.

Termillä "autoimmuunimekanismilla syntynyt solu" tarkoitetaan soluja, jotka tuottavat isännän kudoksen kans-30 sa reagoivia vasta-aineita, tai autoreaktiivisia immuuni- efektori-T-soluja; mainitunlaiset solut sisältävät asetyy-likoliinireseptorien vastaisia vasta-aineita (jotka johtavat esimerkiksi myasthenia gravikseen) tai DNA:n, erytro-syyttien ja verihiutaleiden vastaisia autoantibodeja (jotka 35 johtavat esimerkiksi lupus erythematosukseen) .

29

Termillä "terapeuttinen solu" tarkoitetaan solua, joka on transformoitu keksinnön mukaisella kimeeralla, niin että sillä on kyky tunnistaa ja tuhota jokin määrätty in-fektionaiheuttaja, jonkin määrätyn taudinaiheuttajan infek-5 toima solu, kasvain- tai syöpäsolu tai autoimmuunimekanis-milla syntynyt solu; mainitunlaiset terapeuttiset solut ovat edullisesti hematopoieesijärjestelmän soluja.

Termillä "kohteena oleva infektionaiheuttaja" tarkoitetaan mitä tahansa infektionaiheuttajaa (esimerkiksi 10 virus, bakteeri, alkueläin tai sieni), jonka kimeerisen reseptorin sisältävä terapeuttinen solu pystyy tunnistamaan. Termillä "kohdesolu" tarkoitetaan mitä tahansa isäntäsolua, jonka kimeerisen reseptorin sisältävä terapeuttinen solu pystyy tunnistamaan; kohdesoluihin kuuluvat, mainittuihin 15 rajoittumatta, viruksen, bakteerin, alkueläimen tai sienen infektoimat isännän solut samoin kuin kasvain- tai syöpäsolut ja autoimmuunimekanismilla syntyneet solut.

Termillä "solunulkoinen" tarkoitetaan sitä, että ainakin osa molekyylistä on esillä solun pinnalla. Termillä 20 "solunsisäinen" tarkoitetaan sitä, että ainakin osa mole kyylistä on alttiina terapeuttisen solun sytoplasmalle. Termillä "kalvon läpäisevä" tarkoitetaan sitä, että ainakin osa molekyylistä kulkee plasmakalvon läpi. "Solunulkoinen osa", "solunsisäinen osa" ja "kalvon läpäisevä osa" voivat 25 tässä käytettyinä sisältää niitä reunustavia aminohapposekvenssejä, jotka ulottuvat viereisiin solun osiin.

Termillä "oligomeroida" tarkoitetaan kompleksointia muiden proteiinien kanssa, niin että muodostuu dimeerejä, trimeerejä, tetrameerejä tai muita, ylempiä oligomeereja. 30 Mainitunlaiset oligomeerit voivat olla homo-oligomeereja tai hetero-oligomeereja. "Oligomerointiosa" on molekyylin se alue, joka ohjaa kompleksin (ts. oligomeerin) muodostumista .

Termillä "sytolyyttinen" tarkoitetaan kykyä tuhota 35 solu (esimerkiksi patogeenin infektoima solu, kasvain- tai 30 syöpäsolu tai autoimmuunimekanismilla syntynyt solu) tai kykyä tuhota infektionaiheuttaja (esimerkiksi virus).

Termillä "immuunikatovirus" tarkoitetaan retrovi-rusta, joka villiä tyyppiä olevassa muodossa pystyy infek-5 toimaan kädellisisännän T4-soluja ja jolla on lentivi-rusalaryhmän morfogeneettiset ja morfologiset ominaisuudet. Tämän termin piiriin kuuluvat rajoituksitta kaikki HIV- ja SIV-variantit, mukaan luettuina HIV-1, HIV-2, SIVmac, SI-Vagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand ja SIVcpz.

10 Termillä "MHC:stä riippumaton" tarkoitetaan sitä, ettei solun sytolyyttinen vaste vaadi MHC-luokan II antigeenin läsnäoloa kohdesolun pinnalla.

Termillä "funktionaalinen sytolyysisignaalin välittävä johdos" tarkoitetaan funktionaalista johdosta (määri-15 telty edellä), jolla on kyky ohjata vähintään 10 %:a, edullisesti 40 %:a, edullisemmin 70 %:a tai edullisimmin vähintään 90 %:a villin tyypin molekyylin biologisesta aktiivisuudesta. Tässä käytettynä "funktionaalinen sytolyysisignaalin välittävä johdos" voi toimia antamalla terapeutti-20 selle solulle suoraan signaalin, joka johtaa reseptoriin sitoutuneen taudinaiheuttajan tai solun tuhoamiseen (esimerkiksi solusisäisen kimeerisen reseptorin osan ollessa kyseessä), tai se voi toimia epäsuorasti edistämällä oligo-meroitumista terapeuttisen solun sytolyysisignaalin välttä-25 vien proteiinien kanssa (esimerkiksi kalvon läpäisevän do-meenin ollessa kyseessä). Mainitunlaisten johdosten tehoa voidaan testata esimerkiksi käyttämällä tässä kuvattavia in vitro -määrityksiä.

Termillä "funktionaalinen HIV:n vaippaan sitoutuva 30 johdos" tarkoitetaan funktionaalista johdosta (määritelty edellä), jolla on kyky sitoa mikä tahansa HIV:n vaippapro-teiini. Funktionaalisia johdoksia voidaan identifioida esimerkiksi käyttämällä tässä kuvattavia in vitro -määrityksiä .

31

Terapeuttinen anto Tämän keksinnön mukaisia transformoituja soluja voidaan käyttää monien sairauksien hoidossa. Nykyisiä menetelmiä mainitunlaisten transformoitujen solujen antamiseksi 5 ovat adoptiivinen immuuniterapia tai solujensiirtoterapia. Nämä menetelmät mahdollistavat transformoitujen immuunijärjestelmän solujen palaamisen verenkiertoon. Katso Rosenberg, Sei. Am. 62 (toukokuu 1990); Rosenberg et ai., N. Engl. J. Med. 323 (1990) 570.

10 Keksinnön mukaisia farmaseuttisia koostumuksia voi daan antaa mille tahansa eläimelle, jossa keksinnön mukaisilla yhdisteillä voi olla suotuisia vaikutuksia. Etusijalla mainitunlaisten eläinten joukossa ovat ihmiset, vaikkakaan keksintöä ei ole tarkoitus rajoittaa sillä tavoin.

15 Yksityiskohtainen kuvaus

Ensin kuvataan piirustuksia.

Piirustusten kuvaus

Kuvio IA on kaavio, joka esittää keksinnön mukaisten reseptori-kinaasifuusioproteiinien järjestymistä. Kuvio 20 IB esittää virtaussytometriatuloksia lehmänrokkovirusrekom- binanttien Jurkat-soluissa ilmentämien CD16/7/zeetan, CD16/7/Lck:n, CD16/7/Fyn(T):n, CDl6/7/Syk:n ja CD16/7/ZAP-70:n ollessa kyseessä. Kuvio 1C esittää immuunisaostettujen CD16/7/zeetan (negatiivinen vertailunäyte), CD16/ 7/ Lck:n, 25 CD16/7/Fyn(T):n, CD16/7/Syk:n ja CD16/7/ZAP-70:n in vitro -kinaasiaktiivisuusmäärityksiä; molekyylimassaltaan pienempi lajike, joka näkyy Fyn-kimeeri-immuunisaostumassa, on toistaiseksi identifioimaton.

Kuvio 2 esittää sytosolin kalsiumvastetta, jonka 30 laukaisee kinaasikimeerojen ristiliittyminen TCR-negatiivi- sissa Jurkat-soluissa. Kuviossa esitetään positiivisen populaation suhteellinen solunsisäinen kalsiumpitoisuus (mitattuna Indo-l:n violetin fluoresenssin suhteella siniseen fluoresenssiin). Erilaisia fuusioproteiineja ilmentävillä 35 lehmänrokkovirusrekombinanteilla infektoidut Jurkat-solut saatettiin anti-CDl6-mAb:n 3G8 ja sen jälkeen vuohen fy- 32 koerytriinin konjugoitujen, hiiren IgG:n vastaisten F(ab')2“ vasta-aineiden vaikutuksen alaisiksi hetkellä 0. TCR:n zee-ta-ketjuun ja FcRIIB2:een perustuvat kimeerat toimivat positiivisina ja vastaavasti negatiivisina vertailunäytteinä.

5 Kuvio 3 esittää kalsiumvasteen ennenaikaista käyt töönottoa TCR-positiivisissa soluissa, jotka ilmentävät Syk-kinaasikimeeraa. Infektointi ja analyysi tehtiin edellä kuvion 2 yhteydessä kuvatulla tavalla. Olennaisessa osassa Syk-kimeeraa ilmentävistä soluista violetin fluoresenssin 10 suhde siniseen fluoresenssiin oli suuri ennen primaarisen vasta-aineen lisäämistä.

Kuviot 4A ja 4B esittävät anti-hybridoomatappamis-määritystä. Kuvio 4a esittää 5LCr-kromaatin prosentuaalista vapautumista hybridoomakohdesoluista efektorisolujen (kinaa-15 sikimeeraa ilmentävät CTL:t) ja kohdesolujen välisen suhteen funktiona; solut, jotka ilmentävät reseptorikimeeroja, joissa on TCR:n zeeta-ketjun ja FcRIIB2:n solunsisäisiä do-meeneja, toimivat positiivisina ja vastaavasti negatiivisina vertailunäytteinä. Kuvio 4B esittää tappamisspesifisyyt-20 tä (sivullisten tappamisen poissaoloa). BW5147-solut (joista puuttuu pinnan anti-CDl6-vasta-aine) leimattiin 51Cr-kro-maatilla ja saatettiin alttiiksi kinaasikimeeroja ilmentäville CTL-soluille samoissa olosuhteissa kuin kromaatilla merkityistä 3G8-soluista (ilmentävät anti-CD16-vasta-ainet-25 ta) koostuva rinnakkaisnäyte. Kromaatin vapautumista BW5147-soluista ei ollut havaittavissa.

Kuviot 5A, 5B ja 5C osoittavat, että ZAP-70:n ja Fyn:n tai Lck:n rinnakkaisilmentäminen mahdollistaa syto-lyysin induktion ja lyhentää kalsiumvasteen latenssia. CTL-30 solut koinfektoitiin kuvioon merkittyjä kimeeroja ilmentävillä lehmänrokkovirusrekombinateilla ja analysoitiin syto-lyysiteho tai kalsiumin mobilisaatio. Tämä analyysi aliarvioi kimeerojen tehoa, sillä sitä osaa soluista, joka ilmentää molempia kimeeroja, ei mitattu erikseen (sitä osaa 35 soluista, joka ilmentää vähintään yhtä kimeeraa, käytettiin aktiivisuuden normalisointiin). Kuvio 5A esittää sytolyy- 33 simääritystä, jossa käytettiin CD16/7/kinaasi-kimeerapareja ilmentäviä CTL-soluja. Kuvio 5B esittää CD16/ 7/kinaasi-kimeerapareja ilmentävien TCR-negatiivisten solujen kal-siumvastetta. Kuvio 5C esittää sytolyysimääritystä, jossa 5 käytettiin CD4/CD7/Fyn-kimeeraa ja CD16/CD7/ZAP-70-kimeeraa rinnakkain ilmentäviä CTL-soluja. CD16/7/-zeeta-kimeera toimii positiivisena vertailunäytteen, kun taas CD16/7/FcRIIB2-kimeera toimii negatiivisena vertailunäyt-teenä.

10 Kuviot 6A ja 6B osoittavat, että kimeerat, joissa esiintyy kinaasin deleetioita tai pistemutaatioita, ovat tehottomia kalsiumin mobilisaatiossa ja uudelleensuunnatus-sa sytolyysissä. Kinaasinegatiivisia fuusioproteiinivari-antteja konstruoitiin deletoimalla (Sykin ollessa kyseessä) 15 tai aiheuttamalla pistemutaatioita (ZAP-70:n ollessa ky seessä) ja niistä testattiin kalsiumvaste ja sytolyysi. Kuvio 6A esittää kalsiumvastetta TCR-negatiivisissa soluissa. Kuvio 6B esittää uudelleensuunnatun sytolyysin määrittämistä.

Kuvio 7A, 7B ja 7C osoittavat, että ihmisen Sykihon 20 perustuvat kimeerat ovat teholtaan suurin piirtein saman laisia kuin sian Sykihon perustuvat kimeerat. Kuvio 7A esittää ihmisen Sykin sekvenssiä (sekvenssi numero 5) verrattuna sian Sykihon (sekvenssi numero 6); ensimmäiset 11 ja viimeiset 7 ryhmää määritetään alukesekvensseillä. Kuvio 25 7B esittää ihmisen Syk-kimeeraa ilmentävien TCR-negatii- visten solujen kalsiumin mobilisaatiota koskevaa analyysiä. Kuvio 7C esittää ihmisen Syk-kimeeraa ilmentävien CTL-solujen uudelleensuunnatun sytolyysin määrittämistä.

Kuvio 8 esittää muutoksia tyrosiinin fosforylaatio-30 mallissa kimeeristen kinaasien ristiliittämisen jälkeen.

T-soluantigeenireseptorinegatiiviset Jurkat-solut, jotka ilmentävät kuvioon merkittyjä kimeeroja tai kimeerapareja, käsiteltiin anti-CDl6i11a ja sekundaarisella vasta-aineella, hiiren anti-hiiri-IgGillä, lysoitiin, fraktioitiin po-35 lyakryyliamidigeelillä, siirrettiin nitroselluloosalle ja tutkittiin anti-fosfotyrosiinivasta-aineella . Merkinnällä 34 "+" varustetut kaistat edustavat ristiliittämisen kohteena olleista soluista eristettyjä näytteitä, kun taas merkinnällä varustetut näytteet lysoitiin suoraan käsittele mättä ennalta sekundaarisella vasta-aineella. Vertailukais-5 tat saatiin käsittelemällä samalla tavalla TCR-negatiivisia soluja, jotka ilmentävät solunsisäistä domeenia sisältämätöntä CD16/7-fuusioproteiinia. Oikeassa reunassa esitetään vertailua varten TCR-positiivisten Jurkat-solujen (villin tyypin lehmänrokkoviruksella infektoitujen tai infektoimat-10 tornien) anti-CD3-käsittelyn vaikutukset. Voimakkaat vyöhykkeet lähellä molekyylimassaa 100 kD tämän kuvan vasemmassa osassa vastaavat kinaasikimeerojen odotettuja molekyylimas-so j a.

Kuvio 9 esittää fosfolipaasin C-γΙ tyrosiinin fos-15 foryloitumista kimeerojen aggregoitumisen jälkeen. PLC-yl immuunisaostettiin vasta-aineristiliittämisen kohteena olleista soluista ja immuunisaostumat fraktioitiin geeleillä, siirrettiin nitroselluloosalle ja tutkittiin anti-fosfoty-rosiinivasta-aineella. Olennainen fosforyloituneen PLC-yl:n 20 lisäys havaittiin Syk-kimeerojen aggregoitumisen jälkeen, kun taas Fyn- ja ZAP-70-kimeerojen rinnakkaisaggregoitumi-sen jälkeen havaitaan rajoitetumpi mutta helposti havaittavissa oleva lisääntyminen.

Kuviot 10Ά ja 10B esittävät in vitro -kinaasimää-25 rityksiä. Soluille, joilla esiintyy kimeerisiä kinaaseja, tehtiin vasta-ainevälitteinen kimeeraristiliittäminen, minkä jälkeen kinaasit immuunisaostettiin ja tutkittiin im-muunisaostumista endogeenisen substraatin fosforylaatio. Kuviossa 10A verrataan immuunisaostettujen kinaasikimeerojen 30 aktiivisuutta 10 min kestävän inkuboinnin aikana, kun käytetään ristiliittämisen kohteina olleista (+) tai olemattomista (-) soluista eristettyjä immuunisaostumia.

T-solujen aktivoituminen yhteenkerääntyneiden tyro-siinikinaasien vaikutuksesta 35 Seuraavaksi kuvataan keksinnön erityissuoritusmuo- toja. Tässä kuvauksessa osoitetaan, että yksinkertaiset yh- 35 teenkerääntymistapahtumat aktivoivat ei-reseptorikinaaseja. Muodostettiin keinotekoisia reseptorikinaaseja, joiden so-lunsisäiset domeenit koostuivat Src- tai Syk-ryhmän ki-naasien koko sekvensseistä, ja tarkasteltiin ulkoisten ris-5 tiliittymisärsykkeiden aikaansaaman aggregoitumisen seura uksia. Kävi ilmi, että Syk- ja Src-ryhmän kinaasien aktiivisuuksien välillä oli selvä ero: viimeksi mainittujen ris-tiliittyminen ei johtanut merkittävään solujen aktivaatioon, kun taas ensin mainitun ristiliittyminen johti vapai-10 den solunsisäisten kalsiumionien ja Sykin ollessa kyseessä sytolyysimahdollisuuksien ilmaantumiseen. ZAP-70-kimeerojen kyvyttömyys indusoida distaalisten reseptorien välittämiä ohjelmia oli voitettavissa saattamalla ZAP-70-kimeera kerääntymään yhteen joko Fyn- tai Lck-kinaasikimeerojen kans-15 sa. Seuraavassa kuvattavat esimerkit annetaan keksinnön valaisemiseksi, ei sen rajoittamiseksi.

Proteiinityrosiinikinaasikimeerojen konstruointi ja tehon osoittaminen

Konstruoitiin geenifuusioita, jotka koodaavat solun 20 pinnan reseptorikinaaseja muistuttavia proteiineja liittä mällä CD16-molekyylin solunulkoista domeenia koodaava DNA-fragmentti lyhyeen välisegmenttiin, joka koodaa CD7:n kalvonviereisiä ja kalvon läpäiseviä domeeneja ja on puolestaan liitetty täydellisiin sekvensseihin, jotka koodaa-25 vat ihmisen Lck:n [Koga et ai., Eur. J. Immunol. 16 (1986) 1643 - 1646], hiiren Fyn(T):n [Cooke ja Perlmutter, New Biol. 1 (1989) 66 - 74], sian Sykin [Taniguchi et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 15790 - 15796] ja ihmisen ZAP-70:n [Chan et ai., Cell 71 (1992) 649 - 662] tyrosiini-30 kinaaseja (kuvio IA). Tuloksena olevat kolmiosaiset geeni-fuusiot vietiin rekombinanttilehmänrokkoviruksiin homologisella rekombinaatiolla ja tekemällä valikointi E. colin gpt-geenituotteen rinnakkaisilmentymisen perusteella. Solujen infektointi rekombinanteilla johti kaikkien neljän ki-35 naasikimeeran tehokkaaseen ilmentymiseen solun pinnalla (kuvio IB). Tuloksena olevien proteiinikoostumusten im- 36 muunisaostus anti-CD16-vasta-aineilla paljasti massaltaan odotettujen molekyylilajikkeiden läsnäolon, jotka olivat aktiivisia in vitro -fosforylaatiomäärityksessä (kuvio 1C).

Seuraavaksi tutkimme, mahdollistaisiko fuusioprote-5 iinien ristiliittäminen vapaan solunsisäisen kalsiumin kerääntymisen samalla tavalla kuin havaitaan sellaisten fuu-sioproteiinien kohdalla, jotka perustuvat T-soluantigee-nireseptorien solunsisäisiin domeeneihin. Tämän tekemiseksi infektoimme erilaisia soluja lehmänrokkovirusrekombinateil-10 la ja mittasimme sytoplasman suhteellisen kalsiumpitoisuuden, kun solunulkoiset domeenit oli silloitettu vasta-aineilla. Tehtiin sekä spektrofluorimetrisiä (koko populaatio) että virtaussytometrisiä (yksittäinen solu) mittauksia solujen ollessa värjättyjä Indo-l:llä [Grynkiewicz et ai., 15 J. Biol. Chem. 260 (1985) 3440 - 3450; Rabinovitch et ai., J. Immunol. 137 (1986) 952 - 961]. Virtaussytometriset analyysit tehtiin niiden tulosten perusteella, joita saatiin soluista, joilla CD16:n esiintyminen solun pinnalla määritettynä fykoerytriinifluoresenssi-intensiteetin perusteella 20 osui ennalta määrätylle suhteellisen kapealle alueelle.

Vaikka pieniä vaihteluja keskimääräisessä fluoresenssi-intensiteetissä havaittiin vielä tällä alueella (mikä johtui eroista taustalla olevassa solujen ilmentämien kimeero-jen jakautumisessa), tämä lähestymistapa antoi mahdollisuu-25 den verrata sellaisten solujen vastetta, joilla oli suunnilleen sama lukumäärä reseptoreja. Kuviossa 2 analysoidaan sellaisen ihmisen Jurkat-T-soluleukemialinjamutantin soluista, josta puuttuu T-soluantigeenireseptori [Weiss ja Stobo, J. Exp. Med. 160 (1984) 1284 - 1299], saatuja tulok-30 siä. Näissä soluissa ei Lck- eikä Fyn-kimeeroilla ollut kapasiteettia mobilisoida kalsiumia ristiliittymisen jälkeen. Muutamissa kokeissa Lck-fuusioproteiin yhteenkerääntyminen johti lievään kalsiumpitoisuuden laskuun lepotilassa verrattuna negatiiviseen vertailunäytteeseen, pieniaffiniteet-35 tisen IgG-reseptorin FcRIIB2 solunsisäiseen domeeniin perustuvaan fuusioproteiiniin [Kolanus et ai., EMBO J. 11 37 (1992) 4861 - 4868]. Sekä ZAP-70:een että Syk:hon perustuvien fuusioproteiinien aggregoituminen edisti hyvin tehokkaasti vapaan kalsiumionin ilmaantumista sytoplasmaan, suunnilleen yhtä tehokkaasti kuin T-solureseptorin zeeta-5 ketjun solunsisäisen domeenin sisältävän samanlaisen kimee-ran aggregoituminen. Pieni viive kalsiumvasteen alkamisessa havaittiin sekä Zap-70- että Syk-kimeerojen kohdalla verrattuna zeeta-kimeerojen aikaansaaman kalsiumin mobilisaation alkamiseen kuluvaan aikaan. T-solureseptoripositiivi-10 sissa soluissa (kuvio 3) vuon arviointia Syk-kimeerojen yhteydessä häiritsi osittain vapaan kalsiumin suuri pitoisuus lepotilassa, mikä viittaa kalsiuminsäätelymekanismin konstitutiiviseen käyttöönottoon,

Kimeerojen vieminen sytolyyttiseen T-solulinjaan 15 antoi siten mahdollisuuden arvioida fuusioproteiinien mahdollisuuksia käynnistää efektoritoiminta. Tässä määrityksessä käytetään kohdesoluina anti-CD16-hybridoomasoluja, joiden pinnalla esiintyy CD16:n vastaista IgG-vasta-ainetta [Fleit et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982) 3275 -20 3279; Shen et ai., Mol. Immunol. 26 (1989) 959 - 969]. Hyb- ridoomasolut leimataan sisällyttämällä niihin 51Cr-kro-maattia ja sedimentoidaan yhdessä efektorisolujen kanssa, jotka on valmistettu infektoimalla ihmisen allospesifinen sytotoksinen T-lymfosyytti (CTL) -linja lehmänrokkovirusre-25 kombinateilla, jotka ilmentävät CD16/CD7/kinaasi-fuusiopro-teiineja. Kimeeristen reseptorikinaasien ilmentyminen antaa infektoiduille CTL-soluille mahdollisuuden sitoutua koh-desoluihin ja, ollessaan kompetentteja, lysoida ne, jota prosessia mitataan sisällytetyn 51Cr-kromaatin vapautumisel-30 la. Täten varustettujen CTL-solujen suhteellinen teho määritetään vertaamalla efektorisolujen suhdetta kohdesolui-hin, joka tarvitaan määrätyn 51Cr-vapautumisosuuden saavuttamiseen. Kuvio 4A osoittaa, että CTL-solut, joilla esiintyy kimeerisiä reseptoreja, jotka käsittävät Src-ryhmän ki-35 naaseja Lck tai Fyn(T) tai Syk-ryhmän kinaasia ZAP-70, ovat kyvyttömiä välittämään anti-CD16-hybridoomakohteiden vas- 38 täistä sytolyysiä. CTL-solut, joilla esiintyi Syk-prote-iinituotteeseen perustuva kinaasikimeera, olivat kuitenkin suurin piirtein yhtä tehokkaita kuin CTL-solut, joilla esiintyy kimeera, joka koostuu CD16:sta fuusioituna samalla 5 tavalla T-solureseptorin zeeta-ketjun solunsisäiseen domee-niin. CDl6/CD7/kinaasi-kimeerojen ohjaamaa sytolyyttistä aktiivisuutta ei voitu katsoa sytoluyttisten jyvästen epäspesifisen vapautumisen ansioksi, koska irrelevantin kromia sisältävän kohteen sedimentointi yhdessä kinaasilla varus-10 tettujen CTL-solujen kanssa ei johtanut leimatun kromin havaittavissa olevaan vapautumiseen (kuvio 4B).

Syk- ja ZAP-70-aktiivisuuksien erilaisuus sytolyy-simäärityksessä oli odottamaton, kun otetaan huomioon näiden kahden kimeeran samanlainen aktiivisuus kalsiumvaste-15 määrityksessä. Koska oli osoitettu, että ei-kimeerisen ZAP-70:n ja Src-ryhmän kinaasien rinnakkaisilmentäminen johti aktivaatioon COS-soluissa [Chan et ai., Cell 71 (1992) 649 - 662], tutkimme kinaasikimeeraparien suhteellisia mahdollisuuksia saada aikaan sytolyysi. CTL-efektorit koinfek-20 toitiin rekombinanttilehmänrokkoviruksilla, jotka koodaavat ZAP-70- ja Lck-kimeeroja, ZAP-70- ja Fyn(T)-kimeeroja tai Lck- ja Fyn(T)-kimeeroja. Kuvio 5A osoittaa, että Zap-70-ja Fyn(T)-kimeerojen tai ZAP-70- ja Lck-kimeerojen rinnak-kaisilmentyminen antoi CTL-soluille suurin piirtein yhtä 25 voimakkaan aktiivisuuden kuin on pelkkiä CD16/CD7/Syk-kinaasi-kimeeroja ilmentävillä CTL-soluilla, joiden aktiivisuus on puolestaan yhtä voimakas kuin CD16/CD7/Zeeta-kimeerojen aktiivisuus. Lck- ja Fyn(T)-kimeerojen rinnak-kaisilmentyminen ei antanut mahdollisuutta suunnata merkit-30 tävää sytolyysipotentiaalia anti-CD-16-kohdesoluja vastaan (kuvio 5A) . Kinaasifuusioproteiinipareilla koinfektoitujen solujen kalsiuminmobilisaatiopotentiaalin arviointi osoitti, että ZAP-70- ja Src-ryhmän kinaasikimeerojen rinnak-kaisilmentyminen suurensi nopeutta, jolla kalsium tuli mo-35 bilisoiduksi vasteena reseptorin ristiliittymiseen, ja että Lck- ja Fyn(T)-kimeerojen rinnakkaisilmentyminen ei johta- 39 nut vapaan solunsisäisen kalsiumin merkittävään kerääntymiseen (kuvio 5B) . Jotta saisimme tarkemmin tutkituksi Fyn-kimeeran roolia rinnakkaisaggregoitumisen indusoimassa ak-tivaatiovasteessa, valmistimme Fyn-kimeeran, joka koostui 5 CD4:n solunulkoisista ja kalvon läpäisevistä domeeneista fuusioituina Fyn:ään samalla tavalla kuin CD16-kimeerojen yhteydessä. Kuvio 5C osoittaa, että tämän kimeeran tehokkuus suunnatun sytolyysin määrityksessä on kymmenesosa -kahdeskymmenesosa vertailukelpoisen CD16-kimeeran tehokkuu-10 desta, mikä viittaa siihen, että kimeeristen kinaasien fysikaalinen yhteenliittyminen on tärkeää aktivaation kannalta. Näitä kahta kimeeraa ilmentävien solujen sytolyyttinen aktiivisuus on kuitenkin merkittävästi suurempi kuin mitä havaittaisiin pelkkää ZAP-70-kimeeraa ilmentävien solujen 15 kohdalla. Koska kinaasin ilmentymistaso on suhteellisen korkea tässä järjestelmässä, ei voida sulkea pois sitä, että jäännösaktiivisuus heijastaa CD4/Fyn-kimeerojen spontaania sattumanvaraista liittymistä yhteen CD16/ZAP-70:n kanssa .

20 Sen toteamiseksi, että sekä kalsiumvaste- että sy- tolyysimäärityksessä havaittu aktivaatio oli liitettävissä suoraan relevanttiin kinaasiaktiivisuuteen eikä kinaasien passiiviseen liittymiseen yhteen olemassa olevien signaa-linvälityslementtien kanssa, joiden epäsuora aggregaatio 25 käynnistää sitten aktivaatiovasteen, muodostimme kinaasi-negatiivisia variantteja sekä sian Syk että ihmisen ΖΆΡ-70 -reseptorikimeeroista. Kuvio 6 osoittaa, että reseptoriki-meeroilta, joista joko puuttui kinaasidomeeni lähes kokonaan (Sykin ollessa kyseessä) tai joissa oli fosfotransfe-30 raasiaktiivisuuden poistava pistemutaatio (ZAP-20:n ollessa kyseessä), puuttui kinaasiaktiivisuus in vitro, ja ne olivat kyvyttömiä välittämään kalsiumin mobilisaation risti-liittymisen jälkeen tai välittämään reseptorin uudelleen-suuntaaman sytolyysin.

35 Koska sian Sykin vuorovaikutus ihmisen solukoneis- ton kanssa ei ehkä ole identtinen ihmisen Sykin vuorovaiku- 40 tuksen kanssa, konstruoimme myös samanlaisia ihmisen Sykrhon perustuvia proteiinikimeeroja, kun ihmisen Syk-sekvenssejä oli eristetty PCR:llä käyttämällä sian proteiinisekvenssin amino- ja karboksyylipäitä vastaavia alukkeita. Kuvio 7A 5 osoittaa, että sian ja ihmisen Syk ovat silmiinpistävän samanlaisia proteiineja, mihin viittaa kinaasin osia ja toisia SH2-domeeneja vastaavien PCR-tuotteiden analysointi [Chan et ai., Cell 71 (1992) 649 - 662]. Tämän kanssa so pusoinnussa ihmisen Syk-kimeerareseptoriproteiinit käyttäy-10 tyivät suurin piirtein samalla tavalla kuin sian rakenteet kalsiuminvapautus- ja sytolyysimäärityksissä (kuviot 7B ja 7C) .

Sen toteamiseksi, johtaako kimeeristen tyrosiini-kinaasien aggregoituminen merkittävään muutokseen fosfoty-15 rosiiniproteiinien runsaudessa, infektoitiin T-soluresepto-rinegatiivisia soluja lehmänrokkovirusrekombinanteilla, jotka koodaavat kimeerisiä kinaaseja. Kimeerojen solunulkoiset domeenit ristiliitettiin käyttämällä vasta-aineita ja aktivoitujen solujen kokosolulysaatit fraktioitiin elektrofo-20 reettisesti, siirrettiin kalvoihin ja analysoitiin käyttämällä fosfotyrosiinin tunnistavaa vasta-ainetta. Lysaatit valmistettiin rikkomalla solut ionittomissa detergenteissä vanadaatin läsnä ollessa yhdessä EDTArn kanssa tai ilman sitä tai tekemällä lysointi natriumdodekyylisulfaatin läsnä 25 ollessa, mitä seurasi äänikäsittely vapautuneen DNA:n leikkaamiseksi. Fosfotyrosiiniproteiinimalli oli erilainen kussakin tapauksessa, ja lysaateissa, jotka oli valmistettu vanadaatin läsnä ollessa mutta ilman EDTAa, esiintyi lisä-lajike, jota ei ollut läsnä pelkässä SDS:ssa valmistetuissa 30 lysaateissa, mikä viittaa siihen, että EDTA voi estää tyro-siinikinaasien samoin kuin fosfataasien lyysiä seuraavan toiminnan. Havaittiin, että suora lysointi SDS:ssa johtaa paremmin toistettavissa oleviin proteiinityrosiinifosfory-laatiomalleihin kuin lyysi, jossa käytetään ionittomia de-35 tergenttejä EDTA:n ja vanadaatin läsnä ollessa. Kuvio 8 osoittaa, että SyK:n, ZAP-70:n tai Fyn:n ynnä ZAP-70:n si- 41 sältävien kimeerojen aggregoituminen johtaa muutamien sellaisten proteiinilajikkeiden fosforylaation ilmaantumiseen tai lisääntymiseen, jotka liikkuvat yhdessä sellaisten proteiinien kanssa, joilla fosforylaatio lisääntyy antigee-5 nireseptorien ristiliittymisen jälkeen. Erityisesti Syk-ki-meerojen yhteenkerääntymisen aiheuttama vyöhykekuvio on hyvin samanlainen kuin Y-solureseptoripositiivisissa soluissa olevan anti-CD3-vasta-aineen aiheuttama (kuvio 8). Joukossa on noin 150 kD:n proteiini, jonka aiheuttaa Syk-kimeerojen 10 aggregoituminen mutta myös Syn- ja ΖΆΡ-70-kimeerojen rin- nakkaisaggregoituminen. Alustavissa kokeissa tämän fosfo-proteiinin havaittiin liikkuvan yhdessä fosfolipaasi C-y:n kanssa (tuloksia ei esitetä).

Jotta voitaisiin todeta suoraan PLC-y:lla yhteenke-15 rääntyvän kinaasikimeeran vaikutukset, ristiliitimme kimee-roja, saostimme PLC-y:n käyttämällä monoklonaalisten vasta-aineiden seosta ja analysoimme tuloksena olevista immuu-nisaostumista fosfotyrosyyliproteiinien läsnäolon. Kuvio 9 osoittaa, että Syk:n yhteenkerääntyminen johtaa PLC-y:n ty-20 rosiinifosfaattipitoisuuden olennaiseen kasvuun, kun taas

Fyn- ynnä ZAP-70-kimeerojen ristiliittäminen yhdessä johtaa vähemmän dramaattiseen mutta helposti havaittavissa olevaan tyrosiinifosfaatin lisääntymiseen. Soluissa, jotka ilmensivät pelkkää Fyn-kimeeraa, esiintyi PLC-yin kohtalaista pe-25 rusfosforylaatiota, joka ei lisääntynyt reseptorin aggre- goitumisen jälkeen (kuvio 9). Tällä hetkellä ei ole tiedossa, fosforyloivatko Syk, Fyn ja ZAP-70 ynnä Fyn samoja ty-rosiiniryhmiä. Koska Fyn-kimeeroja ilmentävissä soluissa ei esiintynyt kalsiumin mobilisaatiota lepotilassa eikä indu-30 soituna, näissä soluissa havaittava fosfotyrosiinisignaali voi edustaa sellaisten PLC-γ:11a olevien kohtien hyödyntämistä, jotka ovat muita kuin fosfolipaasin aktivaation välittäviä kohtia.

Alustavassa yrityksessä ottaa huomioon muutokset 35 fosfotyrosiinimallissa arvioimme erilaisten kinaasien ak tiivisuutta yhteenkerääntymisen jälkeen in vitro -auto- 42 fosforylaatiomäärityksessä. Kimeerat aggregoitiin ja im-muunisaostettiin ja arvioitiin niiden kykyä sisällyttää fosfaattimerkkiaine immuunisaostumassa olevaan proteiinila-jikkeeseen. Kuvio 10A osoittaa, ettei näissä olosuhteissa 5 havaittu kinaasiaktiivisuuden kasvua ristiliittämisen jälkeen, kun kinaasimääritys kesti 10 min. Vaikka leimatun fosfaatin sisällytyksen kasvu jatkuu 30 minuuttiin asti tässä määrityksessä, on epäselvää, mitkä tekijät rajoittavat aktiivisuutta; havaittua kinetiikkaa saattaa erityises-10 ti hallita immuunikompleksien dissosioitumisnopeus, mikä mahdollistaa kinaasin diffuusion hyödyntämättömään substraattiin. Pyrkiessämme kontrolloimaan tätä vaikutusta samoin kuin maksimoimaan määrityksen herkkyyden, tutkimme myös Syk-kinaasiaktiivisuutta tehtäessä ennalta tai jätet-15 täessä pois ristisitominen hyvin lyhyellä aikavälillä, 5-30 s; tässäkään yhteydessä ei kuitenkaan tapahtunut kinaasiaktiivisuuden merkittävää kasvua (kuvio 10B). Vaikka emme tällä hetkellä pysty sulkemaan pois sitä mahdollisuutta, että aktiivisuuden kasvu olisi osoitettavissa sopivan 20 substraatin ollessa kyseessä, aggregoitumisen indusoimaa

Syk-kimeeran aktiivisuutta ei havaittu myöskään, kun käytettiin eksogeenistä peptidisubstraattia (cdc 2:n ryhmien 6 - 20 Y 19 K -substituutio) kinaasiaktiivisuuden mittaamiseen .

25 Mahdolliset mekanismit

Mekanismi, jolla yksinkertainen fysikaalinen ärsyke, reseptorien aggregoituminen, johtaa selvästi erottuvan kemiallisen signaalin välittymiseen immuunijärjestelmän soluihin, on edelleen tuntematon. Aiemmat tutkimukset ovat 30 osoittaneet, että Src-ryhmän kinaaseja voidaan havaita liittyneinä moniin immuunijärjestelmän tärkeisiin aggregaa-tion aktivoimiin reseptoreihin ja että mainitunlaisten reseptorien ristiliittyminen johtaa usein lisääntyneeseen ki-naasiaktiivisuuteen. Myöhemmin on havaittu, että Syk- ja 35 ZAP-70-sukulaiskinaasit liittyvät joko pysyvästi (Syk:n ollessa kyseessä) tai tilapäisesti (Zap-70:n ollessa kysees- 43 sä) B- ja vastaavasti T-soluantigeenireseptoreihin, ja ainakin Syk:n ollessa kyseessä reseptorien ristiliittymisen on raportoitu johtavan lisääntyneeseen kinaasiaktiivisuu-teen.

5 Tässä työssä olemme osoittaneet, että Syk-ryhmän kinaasien aggregoituminen johtaa, mutta Src-ryhmän kinaasi-en Pck ja Fyn aggregoituminen ei johda, kalsiumvasteeseen soluissa, joista puuttuu T-solureseptori. Tämä vaste näyttää johtuvan epäsuorasta liittymisestä muihin T-soluresep-10 tori- tai signaalinvälityskomponentteihin, koska kinaasine-gatiiviset mutantit eivät pysty indusoimaan kalsiumvastet-ta. Syk-kinaasia sisältävien kimeerojen aggregoituminen riittää mahdollistamaan spesifisen sytolyysin induktion, kun taas samanlaisen sytolyysin indusointi ZAP-70-kimee-15 ralla vaatii lisäksi Src-ryhmän kinaasin osallistumista.

Tällä hetkellä on epäselvää, mikä Syk-ryhmän kinaaseista on todennäköisesti tärkeämmässä osassa T-solujen aktivaatiossa; sekä ZAP-70:ä että Sykitä esiintyy T-soluissa, mukaan luettuina tässä tutkimuksessa käytetyt solulinjat, ja vä-20 hintään yksi reagoiva ihmisen T-solulinja sisältää Sykitä muttei ZAP-70iä spesifisten PCR-monistustuotteiden perusteella pääteltynä. Proteiinityrosiinin fosforylaation li-sääntymismalli Syk-kimeerojen yhteenkerääntymisen jälkeen on hyvin samanlainen kuin malli, joka havaitaan T-solu-25 antigeenireseptorien ristiliittämisen jälkeen.

Yhdessä yksinkertaisessa mallissa, joka liittyy ei-reseptorityrosiinikinaasien aiheuttamaan immuunijärjestelmän solujen aktivaatioon, turvaudutaan reseptoriin liittyvään kinaasin, jonka aggregoituminen johtaa aktivaatioon 30 joko fysikaalisen liittymisen (esimerkiksi aktiivisten ki- naasidimeerien muodostumisen) tai keskinäisen entsyymitoi-minnan (esimerkiksi .ristifosforylaatio) kautta; aktivoitunut entsyymi toimii sitten ratkaisevilla solunsisäisillä substraateilla, joita tarvitaan kalsiumin mobilisaatioon ja 35 inositolifosfaattisynteesiin. Tukea tälle tapahtumasarjalle on löydettävissä tutkimuksista, joiden yhteydessä on rapor- 44 toitu reseptoriin liittyvän kinaasiaktiivisuuden lisääntyvän reseptorien ristiliittymisen jälkeen [esimerkiksi Bolen et ai., Adv. Cancer Res. 57 (1991) 103 - 149; Burkhardt et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 7410 - 7414; Ei-5 seman ja Bolen, Nature 355 (1992) 78 - 80; Hutchcroft et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 9107 - 9111;

Hutchcroft et ai., J. Biol. Chem. 267 (1992) 8613 - 8619;

Tsygankov et ai., J. Biol. Chem. 267 (1992) 18259 - 18262; Wong et ai., Oncogene 7 (1992) 2407 - 2415]. Raportoidut 10 muutokset kinaasiaktiivisuudessa ovat kuitenkin olleet useimmiten vaatimattomia ja eroavat jyrkästi dramaattisista muutoksista, joita havaitaan in vivo fosfotyrosyyliprote-iinimallissa. Koska on vaikea sulkea yksiselitteisesti pois heikkojen allosteeristen vuorovaikutusten aiheuttamaa akti-15 vaatiota käytettäessä välineenä in vitro -kinaasimäärityk-siä, emme voi tässä vaiheessa antaa ehdotonta lausuntoa ki-naasin aktivaation suhteellisesta merkityksestä signaalin-välityksen käynnistymisessä. Tässä esitetyt tulokset viit-taavat kuitenkin siihen, että aggregoitumisen indusoima 20 entsyymin ja substraatin uudelleenjakautuminen voi olla tärkeä tekijä olemassa olevan aktiivisuuden suuntaamisessa kohden sopivaa fysiologista kohdetta.

Syk-ryhmän kinaaseihin perustuvien kimeerojen agg-regoituminen johti kalsiumvasteeseen, joka oli hieman vii-25 västynyt mutta amplitudiltaan vastaava kuin vaste, joka havaitaan zeeta-reseptorikimeerojen aggregoitumisen jälkeen soluissa, joista puuttuu endogeeninen T-solureseptori. Voimakkaampi viive vapaiden kalsiumionien ilmaantumisessa havaittiin ZAP-70-kimeerojen ristiliittymisen jälkeen, ja tä-30 mä viive voitiin poistaa olennaisilta osiltaan ristiliittä-mällä yhdessä ZAP-70- ja Syn-kimeeroja. Havaittua latenssia ei tällä hetkellä pystytä selittämään. Koska rinnakkainen ristiliittäminen nopeutti kalsiumin mobilisaatiota, on hou-kuttelevaa selittää viive ZAP-70:n suhteellisella tehotto-35 muudella aggregoitumisen välittämän autoaktivaation ollessa kyseessä. Muut tekijät voivat kuitenkin olla yhtä tärkeitä, 45 ja ZAP- ja Syk-kinaasien sitominen solun pinnalla voi itse asiassa estää aktivaatiota normaaliin prosessiin verrattuna; jos esimerkiksi normaalissa tapahtumasarjassa Syk-ryhmän kinaasit tulevat tilapäisesti siirretyiksi yhteenke-5 rääntyneisiin reseptoreihin, aktivoiduiksi ja sitten vapautetuiksi diffusoitumaan substraatteihinsa, kinaasidomee-nin pysyvä kytkeytyminen plasmakalvoon olisi rajoittava tekijä estämällä pääsyn substraattiin ja/tai rajoittamalla signaalin vahvistusta, koska kimeeriset reseptorit ovat ky-10 vyttömiä toimimaan eräänlaisena katalyysikeskuksena kinaa-sin aktivaatiolle.

Kalsiumvasteen toinen erityispiirre oli havainto, että T-solureseptoripositiivisissa soluissa, joilla esiintyy ihmisen tai sian Sykthon perustuvia kimeeroja, vapaan 15 kalsiumin peruspitoisuus oli suuri, mikä viittaa siihen, että kalsiumin vapautuminen oli käynnistynyt spontaanisti. Vastaavaa havaintoa ei tehty reseptorinegatiivisissa soluissa. Tämä tulos on vastakkainen kuin havaitsemamme yleinen suuntaus, jonka mukaan ihmisen T-solukasvainlinjojen 20 T-solureseptorinegatiiviset mutantit ovat tyypillisesti ulkopuolisiin laukaisijamolekyyleihin hyvin voimakkaasti reagoivia. Ehdotamme kahta mahdollista ja toisiinsa liittyvää selitystä T-solureseptorin ilmeiselle tarpeelle spontaanissa aktivaatioprosessissa. Toinen on se, että kimeerinen 25 Syk-kinaasi saattaa toimia konstitutiivisesti T-solureseptorin solunsisäisillä domeeneilla ja synnyttää fosfotyro-siinikohteita reseptorikimeerojen SH2-domeeneille, mikä johtaa solunsisäiseen aggregoitumiseen multivalenttisen T-solureseptorisillan kautta, mikä puolestaan edistää ki-30 naasin aktivaatiota. Toinen mahdollisuus on se, että Syk:n aktivaatioon tarvittavaan kalvoon liittyvän kinaasin pitoisuus voi olla pienempi T-solureseptorinegatiivisessa solu-linjassa joko siitä syystä, että yleinen säätelypiiri johtaa hypoteettisen kinaasin vähentyneeseen de novo -syn-35 teesiin, tai siitä syystä, että antigeenireseptorin poissaolo johtaa säätelemättömiin solunsisäisiin tapahtumiin.

46 B-soluissa Syk-kinaasin on raportoitu liittyvän konstitutiivisesti IgM-antigeenireseptorin solunsisäisiin elementteihin [Hutchcroft et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 9107 - 9111; Hutchcroft et ai., J. Biol.

5 Chem. 267 (1992) 8613 - 8619]. Tämän yhteyden tarkka meka nismi on epäselvä, mutta yksi mahdollisuus on, ettei fosfo-tyrosiinia tarvita Syk:n SH2-domeenien vuorovaikutukseen tyrosiinilaukaisija-aiheen kanssa, joka on läsnä mb-1- ja B29-reseptoriketjujen sytoplasmadomeenissa. Tätä ehdotusta 10 puoltaa raportti, jonka mukaan Philadelphia-kromosomin kat-keamispisterykelmäalueen geenituote BCR sitoutuu erilaisiin SH2-domeeneihin fosfotyrosiinista riippumattomalla tavalla [Pendergast et ai., Cell 66 (1991) 161 - 171; Muller et ai., Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 5087 - 5093]. Tässä tapauk-15 sessa näyttää kuitenkin todennäköiseltä, että fosfoseriini-ja/tai fosfotreosiiniryhmillä on ratkaiseva rooli vuorovaikutuksessa. Syk voi vaihtoehtoisesti liittyä IgM-reseptorin solunsisäisiin aiheisiin Syk:n SH2-elementtien ja katalyyttisen domeenin välissä sijaitsevan ainutlaatuisen alueen 20 kautta. Kolmas mahdollisuus on, että tarvitaan vain hyvin pieni määrä tyrosiinifosforyloitunutta peptidiä toiminnallisesti merkittävien Syk-pitoisuuksien saamiseen plasmakal-von sisäpinnalle ja tämä pieni tyrosiinifosfaattipitoisuus on jäänyt tähän asti detektoimatta.

25 Vaikka aktivaation Src-ryhmän kinaasin tarvetta B-soluissa ei ole määritetty varmuudella, somaattisin eli organismigeneettisin keinoin on osoitettu, että T-soluissa kahdella kinaasilla, Lck:lla ja Fyn(T):llä, on tärkeä rooli [Appleby et ai., Cell 70 (1992) 751 - 763; Karnitz et ai., 30 Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 4521 - 4530; Stein et ai., Cell 70 (1992) 741 - 750; Straus ja Weiss, Cell 70 (1992) 585 - 593]. Tällä hetkellä emme pysty varmuudella sanomaan, edeltääkö vai seuraako näiden kinaasien toiminta normaalisti Syk-ryhmän kinaasien toimintaa. Yhdessä hypoteesissä, joka 35 koskee ZAP-70:n toimintaa T-solujen aktivaatiossa, turvaudutaan reseptoriin liittyvän Src-ryhmän kinaasiin, jonka 47 aggregoituminen mahdollistaa reseptoriketjujen tilapäisen fosforylaation, joka puolestaan johtaa ZAP-70:n yhteenliittymiseen ja sitä seuraavaan solujen aktivaatioon. Tässä mallissa ehdotettu alussa tapahtuva reseptoriketjujen fos-5 forylaatio täytyy erottaa zeetan pysyvästä fosforylaatios-ta, joka havaitaan myöhemmin reseptorien ristiliittymisen j älkeen.

Hiiren T-soluissa pieni osa Y-solureeptorikomp-lekseista sisältää zeetan sukulaismolekyylin, josta käyte-10 tään nimitystä eeta [Baniyash et ai., J. Biol. Chem. 263 (1988) 9874 - 9878] ja joka edustaa vaihtoehtoisesti silmu-koitunutta muotoa [Clayton et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 5202 - 5206]. Eeta eroaa zeetasta karboksyy- lipäässä, ja siitä puuttuu kauimmainen hiiren zeetassa 15 esiintyvistä kuudesta tyrosiiniryhmästä [Jin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 3319 - 3323]. Vaikka hiiren TCR:n zeeta-zeeta-isomuotojen zeeta-ketjun fosforylaatio on detektoitavissa helposti vasta-ainevälitteisen reseptorien ristiliittämisen jälkeen, TCR:n eeta-ketju ei samanlaisissa 20 olosuhteissa fosforyloidu havaittavasti [Bauer et ai.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 3842 - 3846]. Zeeta-

ketjun pysyvä fosforylaatio näyttää vaativan kaksi lähekkäistä zeeta-ketjua, sillä TCR-isomuodot, joissa on zeeta-eeta-heterodimeerejä, eivätkä fosforyloidu reseptorien ris-25 tiliittämisen jälkeen [Bauer et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 3842 - 3846]. Huolimatta fosforylaatioeroista solulinjoja, jotka käsittävät yksinomaan eeta-homodimeereistä koostuvia TCR-isomuotoja, ei pystytä toiminnallisesti erottamaan solulinjöistä, joissa on vain zee-30 ta-homodimeerejä [Bauer et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA

88 (1991) 3842 - 3846]. Niinpä zeetan fosforylaatio, joka havaitaan 30 minuutin kuluttua vasta-ainevälitteisestä reseptorien aggregoitumisesta, ei korreloi aktivaation kanssa. Yhdessä erillisessä tutkimuksessa on tarkastelemalla 35 TCR:n aggregoitumista seuraavan fosfotyrosiinifosfoproteii-nien kerääntymisen ajallista kulkua osoitettu, että varhai- 48 sin havaittavissa oleva lajike on kaksi proteiinia, joiden massa on 135 ja 100 kD ja fosforylaatio ensimmäisen kerran havaittavissa 5 ja vastaavasti 15 sekunnin kuluttua risti-liittämisestä ja joilla puolet maksimifosforylaatiosta, 5 kummassakin tapauksessa noin 30 sekunnin kuluttua, saavutetaan aiemmin kuin puolet kalsiumin maksimimobilisaatiosta ja puolet inositolifosfaatin maksimimuodostuksesta [June et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 7722 - 7726; June et ai., J.Immunol. 144 (1990) 1591 - 1599]. Zeetan fosfory-10 laationopeus on sen sijaan olennaisesti pienempi ja johtaa puoleen maksimisubstituutiosta noin 3-5 minuutin kuluttua stimulaatiosta, selvästi kalsiumin kerääntymisen ja inosi-tolifosfaattien vapautumisen havaitsemisen jälkeen [June et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 7722 - 7726; June 15 et ai., J.Immunol. 144 (1990) 1591 - 1599].

Jos kaksivaiheinen malli on oikea, tyrosiinin fos-forylaation, joka on välttämätön ZAP-70:n viemiseen plasma-kalvon sisäpinnalle, täytyy siten olla edellä mainituissa tutkimuksissa havaittua nopeampi, otaksuttavasti tilapäi-20 sempi, tapahtuma. Jokin aika sitten on ehdotettu, että asianmukaisen nopeasti (noin 15 sekunnissa) alkava tyrosiinin fosforylaatio on detektoitavissa sekä zeetaketjussa että CD3:n epsilon-ketjussa reseptorien ristiliittymisen jälkeen [Wange et ai., J. Biol. Chem. 267 (1992) 11685 - 11688] ja 25 tyrosiinifosfaattia sisältävää 70 kD:n proteiinia on löydettävissä liittyneenä sekä zeeta- että epsilonketjuun. Tällä hetkellä ei ole selvää, onko pysyvä liittyminen fos-foryloituneisiin reseptoriketjuihin edellytys T-solujen onnistuneelle aktivaatiolle.

30 Tässä esitetyt tulokset viittaavat kuitenkin ylei sesti ottaen siihen, että Syk-ryhmän kinaasit vaikuttavat suorempaan T-solujen efektorikoneistoon kuin Src-ryhmän kinaasit. Kasvava todistusaineisto viittaa siihen, että Src-ryhmän kinaasit voivat liittyä joukkoon solupinnan mo-35 lekyylejä, jotka eivät ole antigeeni/Fc-reseptoriryhmän jäseniä, mukaan luettuina CD2 [Belief ai., Mol. Cell. Biol.

49 12 (1992) 5548 - 5554], CD23 [Sugie et ai., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 88 (1991) 9132 - 9135], CD36 [Huang et ai., J. Biol. Chem. 267 (1992) 5467 - 5473], IL-2-reseptorin beeta-ketju [Hatakeyama et ai., Science 252 (1991) 1523 - 5 1528] ja erilaiset fosfatidyyli-inositoliin ankkuroituneet proteiinit [Stefanova et ai., Science 254 (1991) 1016 -1919; Thomas ja Samelson, J. Biol. Chem. 267 (1992) 12317 -12322], joista joidenkin tiedetään vaativan lisäksi anti-geenireseptorin läsnäoloa aktivaation edistämiseksi T-so-10 luissa. Viimeksi mainitun vaatimuksen yhtenä yksinkertaisena selityksenä voi olla, että antigeenireseptorin laukaisija-aiheet toimivat Src-ryhmän kinaasien substraatteina ja mahdollistavat Syk-ryhmän kinaasien myöhemmän telakoitumisen, jota ehkä seuraa jokin niiden aktivaatiota edistävä 15 muuntumistapahtuma. Fosforylaatioon ja aktivaatioon johtavan tapahtumaketjun toteaminen on vaikeaa; voi olla myös niin, että laukaisija-aiheilla on vain tilapäinen rooli ja ne toimivat eräänlaisena katalyysikeskuksena efektorikinaa-sien käyttöönotolle, aktivaatiolle ja vapautukselle.

20 Src-kinaaseja on jakautuneena laajalti kaikkialle ei-hematopoieettisiin linjoihin, ja viimeaikaiset tutkimukset, joissa on käytetty Fyn-negatiivisia hiiriä, ovat osoittaneet, että Fyn osallistuu pitkäaikaisen tehostuksen ylläpitoon, joka on synapsivälitystä helpottava ilmiö, jon-25 ka ajatellaan olevan assosiaatiomuistin varhaisen vakaantumisen taustalla [Grant et ai., Science 258 (1992) 1903 - 1910]. Jos Src-ryhmän kinaasit toimivat välittäjinä samankaltaisilla aktivaatioteillä muissa solutyypeissä, voi osoittautua, että myös Syk-ryhmän kinaaseja on jakautuneena laa-30 jemmin kaikkialle ekstrahematopoieettisiin tiloihin.

Kokeelliset menetelmät

Kimeerojen konstruointi

Ihmisen Lck-kinaasin [Koga et ai., Eur. J. Immunol. 16 (1986) 1643 - 1646], hiiren Fyn(T)-kinaasin [Cooke ja 35 Perlmutter, New Biol. 1 (1989) 66 - 74], sian Syk-kinaasin [Taniguchi et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 15790 - 15796] 50 ja ihmisen ZAP-70-kinaasin [Chan et ai., Cell 71 (1992) 649 - 662] kokonaiset koodausalueet liitettiin sellaisen kimeerisen, kalvon läpäisevän proteiinin solunsisäiseen do-meeniin, joka koostui solunulkoisesta CD16-domeenista liit-5 tyneenä lyhyeen "varsisegmenttiin" ja kalvon läpäisevään CD7-domeeniin. Solunsisäinen CD7-domeeni typistettiin siir-ronpysäytyssekevenssin kohdalta lisäämällä Mlu-kohta. Eri kinaasit tehtiin sopiviksi asianmukaisessa lukukehyksessä olevan Mlu-kohdan avulla, niin että mahdollistettiin kolmi-10 osaisen fuusioproteiinin ilmentäminen. Sian Syk-sekvenssi saatiin toteuttamalla sian koko lymf osyytti-RNA:lie kään-teiskopiointi ja PCR, jossa käytettiin sopivia restrik-tiokohtia sisältäviä alukkeita. ZAP-70-sekvenssit valmistettiin vastaavasti PCR:llä ihmisen T-solu-cDNA-kirjastos-15 ta. Sekventoitiin rinnakkain muutamia isolaatteja ja johdettiin kullekin kinaasille mutaatioton koodaussekvenssi vaihtamalla keskenään restriktiofragmentteja. Tuloksena olevat koodaussekvenssit insertoitiin lehmänrokkovirusil-mentämisvektoriin CD16/CD17-sekvenssien perään. Ihmisen Syk 20 eristettiin luonnollisten tappajasolujen cDNA-kirjastosta ja Daudi-solukirjastosta käyttämällä sian sekvenssin päitä vastaavia alukkeita. Eteenpäin johtavan alukkeen sekvenssi oli atg gca gac agt gcc aac cac ttg ccc ttc ttc t (sekvenssi numero 7) ja taaksepäin johtavan alukkeen sekvenssi oli 25 cgc ggg gcg gcc get tta att cac cac gtc gta gta gta (sekvenssi numero 8). Kun alkumonistus oli osoittanut odotettua kokoa vastaavien vyöhykkeiden läsnäolon, tehtiin uudelleen-monistus (10 sykliä) käyttämällä 5'-päässä laajennusaluket-ta, jonka sekvenssi oli cgc ggg acg cgt acc atg gca gac agt 30 gcc aac (sekvenssi numero 9) , jolloin tuli mahdolliseksi ligatoida fragmentti Mlul:llä katkaistuun vektoriin.

Kalsiumin mobilisaation analysointi

Tehtiin virtaussytometrisiä ja koko näytettä koskevia spetrofotometrisiä analyysejä rekombinanttikinaaseja 35 ilmentävistä soluista käyttämällä kalsiumherkkää fluorofo-ria Indo-1 aiemmin kuvatulla tavalla [Romeo ja Seed, Cell 51 64 (1991) 1037 - 1046; Romeo et ai., Cell 68 (1992) 889 - 897]. Lyhyesti esitettynä Jurkat-mutanttialalinjan JRT 3.T. 3.5 solut [Weiss ja Stobo, J. Exp. Med. 160 (1984) 1284 - 1299] infektoitiin käsittelemällä rekombinanttilehmänrokko-5 viruksilla tunnin ajan seerumittomassa IMDM:ssä infektoin-tikertoimen (moi; multiplicity of infection) ollessa 10 ja inkuboitiin 3-9 tuntia 10 % FBS:ää sisältävässä IMDM:ssä. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla, suspendoitiin uudelleen tiheydeksi 3·106 solua/ml täysalustaa, joka sisälsi 10 1 mmol/1 Indo-l-asetometoksiesteriä [Grynkiewicz et ai., J. Biol. Chem. 260 (1985) 3440 - 3450] (Molecular Probes,

Eugene, OR), ja inkuboitiin lämpötilassa 37 °C 45 min. In-do-l:tä sisältävät solut pelletoitiin, suspensoitiin uudelleen tiheydeksi 1·106 solua/ml seerumittomaan IMDMrään ja 15 säilytettiin huoneenlämpötilassa pimeässä. Soluista analysoitiin vapaat kalsiumionit mittaamalla samanaikaisesti violetti ja sininen fluoresenssiemissio virtaussytometri-sesti [Rabinovitch et ai., J. Immunol. 137 (1986) 952 - 961]. Kalsiumvuon käynnistämiseksi solususpensioon lisättiin joko 20 konjugoimatonta monoklonaalista vasta-ainetta 3G8 (anti-CD16) (1 pg/ml) ja sen jälkeen 10 pg/ml fykoerytriiniin (PE) konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG-F(ab')2: a ajahetkel-lä 0 tai PE:hen konjugoitua anti-CD4-vasta-ainetta (Leu-3a, Becton Dickinson) ja sen jälkeen konjugoimatonta toista 25 vasta-ainetta. Violetin ja sinisen emission suhdetta kuvaavia histogrammeja kerättiin PE-positiivisesta (infektoituneesta) solupopulaatiosta, joka edusti tyypillisesti 40 -80 %:a soluista. Emissiosuhdetta violetti:sininen ennen vasta-aineen lisäystä käytettiin normalisoidun lähtösuhteen 30 määrittämiseen, jonka arvoksi annettiin yksi.

Lymfosyytti sytolyys imääri tys

Rajoitettua sytolyyttistä CD8+ CD4” HLA B44 -linjaa (WH3) pidettiin yllä IMDM:ssä, joka sisälsi 10 % ihmisen seerumia ja 100 yksikköä/ml IL-2:a, ja stimuloitiin ajoit-35 tain säteilytetyillä (3 000 rad) yksitumaisilla soluilla, joiden haplotyyppi oli HLA B44. Soluja viljeltiin vähintään 52 10 vuorokautta stimuloinnin jälkeen ennen niiden käyttöä sytotoksisuusmäärityksissä. Solut infektoitiin käsittelemällä 1 tunti rekombinanttilehmänrokkoviruksella (moi vähintään 10) seerumittomassa alustassa, mitä seurasi inku-5 bointi täysalustassa tunnin ajan. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen tiheydeksi 1·107 solua/ml. Lisättiin 100 μΐ näytettä U-pohjaisen mik-romaljan kuhunkin syvennykseen, joka sisälsi 100 μΐ/syvennys täysalustaa. Soluista tehtiin laimennussarja laimentamalla 10 aina kaksinkertaiseen tilavuuteen. Kaksi syvennystä kutakin näytettä kohden ei sisältänyt lymfosyyttejä, jotta mahdollistettiin kromin spontaanin vapautumisen ja kromin koko-naisvastaanoton mittaaminen. Sentrifugoitiin 106 kohdesolua 3G8 10-2 [Shen et ai., Mol. Immunol. 26 (1989) 959 - 969], 15 suspendoitiin ne uudelleen 50 pl:aan steriiliä 51Cr- natriumkromaattia (1 mCi/ml, DuPont), pidettiin näytettä 1 tunti lämpötilassa 37 °C välillä sekoittaen ja pestiin solut sitten kolmesti PBSrllä. Kuhunkin syvennykseen lisättiin 100 μΐ leimattuja soluja suspendoituina uudelleen 20 alustaan tiheydeksi 105 solua/ml. Mikromaljaa sentrifugoitiin 1 min kiihtyvyydellä 750-g ja inkuboitiin 4 tuntia lämpötilassa 37 °C. Inkubointijakson lopussa kussakin syvennyksessä olevat solut suspendoitiin uudelleen pipetoi-malla varovasti, otettiin näyte sisällytetyn kokonaispuls-25 simäärän määrittämiseksi ja sentrifugoitiin mikromaljaa 1 min kiihtyvyydellä 750-g. Poistettiin 100 μ1:η annoksia supernatanttia ja tehtiin laskenta gammasädetuikelaskuris-sa. Suhteelle efektori:kohde tehtiin korjaus infektoituneiden efektorisolujen prosentuaalisen osuuden suhteen (taval-30 lisesti > 70 %).

Mutanttikinaasikimeerojen muodostaminen Sian Sykkinaasinegatiivinen fuusioproteiinivariant-ti muodostettiin pilkkomalla kimeera Stil:llä ja NotI:llä (viimeksi mainittu välittömästi 31-suuntaan karboksyyli-35 päästä) täydentämällä Notl-kohta ja ligatoimalla päät yh teen. Tuloksena olevassa sekvenssissä liittyi sian Syk:n 53 298 ensimmäistä ryhmää 4 ulkopuoliseen ryhmään (GPRL) ennen päätepistettä. ZAP-70:n ATP-sitoutumiskohtaan muodostettiin pistemutaatio (K369G9 insertoimalla kaksisäikeinen oligo-nukleotidifragmentti Ball- ja Earl-kohtien väliin, jotka 5 sijaitsevat Chanin et ai. kuvaaman [Cell 71 (1992) 649 - 662] sekvenssin ylemmän säikeen nukleotidiryhmien 1 319 ja 1 345 välissä. Tuloksena oleva sekvenssi koodasi glysiiniä ryhmän 369 kohdalla lysiinin sijasta.

Immuunisaostus ja kinaasimääritys 10 Infektoitiin noin 2*106 HeLa S3 -solua käsittele mällä 1 tunti seerumittomassa DME-alustassa rekombinantti-lehmänrokkoviruksella (moi vähintään 10) . Solut otettiin talteen 5 tunnin kuluttua infektoinnista, pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella ja 15 lysoitiin liuoksessa, joka sisälsi 1 %:n Triton X-100:aa, 0,15 mol/1 NaClta, 0,02 mol/1 Hepesiä (pH 7,3), 5 mmol/1 EDTAa, 5 mmol/1 NaF:a, 0,2 mmol/1 Na3V04:a, 10 pg/ml leupep-tiiniä, 10 pg/ml aprotiniinia ja 1 mmol/1 PMSFrää. Kun oli inkuboitu 10 min jäähauteella, tumat poistettiin sentrifu-20 goimalla ja CD16-fuusioproteiinit immuunisaostettiin vasta-aineella BMA209/2 ja proteeini-A-sefaroosilla. Fuusioprote-iinilla kuormitettu hartsi pestiin kolmesti lyysipuskurilla ja lopuksi Hepes-puskurilla (20 mmol/1, pH 7,3). Kuhunkin näytteeseen lisättiin 10 μΐ kinaasipuskuria (20 mmol/1 He-25 pesiä, pH 7,3, 10 mmol/1 MgCl2:a, 10 mmol/1 MnCl2:a), joka sisälsi 10 pCi [γ-32Ρ] ATP: tä (> 3 000 Ci/ mmol) . Reak- tioseosten annettiin inkuboitua 10 min huoneenlämpötilassa ja reaktiot keskeytettiin lisäämällä 20 μΐ pitoisuudeltaan kaksinkertaista (2X) näytteensyöttöpuskuria (4 % SDS:a, 30 100 mmol/1 Trisiä, pH 6,8, 20 % glyserolia ja 10 % β- merkaptoetanolia). Kun näytteitä oli keitetty 3 min, ne käsiteltiin annoksittain gradienttigeelillä (4 - 15 %) . Ki-naasimääritykset, joissa käytettiin liukoista peptidisubst-raattia, joka vastasi cdc 2:n asemia 6 - 20 ja jossa tyr 20 35 oli korvattu lys:llä, tehtiin valmistajan (UBI) ohjeiden mukaisesti.

54

Proteiinityrosiinin fosforylaation immuunitäpläana- lyysi TCR-negatiivisia 3.5-soluja infektoitiin 1 tunti rekombinanttivirusvarastoviljelmillä (moi vähintään 10) .

5 Sitten soluja inkuboitiin 8-12 tuntia lämpötilassa 37 °C ja ne sentrifugoitiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen seerumittomaan Iscoven alustaan tiheydeksi 107 solua/ml. Soluannoksia inkuboitiin yhdessä anti-CD16-mAb:n kanssa (3G8, Medarex tai BMA209/2, Behringwerke) käyttämällä 1 pg 10 vasta-ainetta solumäärää 2·106 - 3·106 kohden. Stimuloituja näytteitä inkuboitiin edelleen 5 min 3 - 5-kertaisen ylimäärän kanssa affiniteettipuhdistettua anti-hiiri-IgGl-vasta-ainetta (Southern Biotechnology). Solut jatkokäsitel-tiin Scristin et ai. mukaisesti [J. Biol. Chem. 268 (1993) 15 5886 - 5893] pienin muutoksin. Inkuboinnit keskeytettiin lisäämällä SDS:a loppupitoisuudeksi 1 % ja näytteitä keitettiin 3 min. DNA leikattiin äänikäsittelemällä 1 min käyttämällä Heat Systems Ultrasonics, Inc.:n laitetta, lisättiin 2X näytepuskuria, tehtiin annoksille, jotka vasta-20 sivat solumäärää 105 - 2,5·105, erotus polyakryyliamidigee-leillä ja siirrettiin proteiinit puolikuivalla sähköimey-tyksellä (Hoefer) nitroselluloosalle (Schleicher ja Schuell BA45) . Suodattimet suojattiin käsittelemällä 1 tunti Tris-puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa, joka sisälsi 25 0,05 % Tween-20:tä (TBST), joka sisälsi 1,5 % kanan ovalbu- miinia (Sigma), pestiin TBST:llä, siirrettiin liuokseen, joka sisälsi antifosfotyrosiinivasta-ainetta 4G10 (UBI) laimennettuna suhteessa 1:10 000, ja inkuboitiin 1-2 tuntia lämpötilassa 22 °C. Kun suodattimet oli pesty TBST:llä, 30 niitä inkuboitiin 1 tunti TBST:ssä, joka sisälsi suhteessa 1:5 000 laimennettua antihiiri-piparjuuriperoksidaasikonju-gaattia. Fosforyloitunutta proteiinia vastaavat vyöhykkeet detektoitiin kemiluminenssilla (ECL, Amersham) . Valotusajat olivat alueella 2 s - 5 min.

55

Ihmis-IgGl:proteiinityrosiinikinaasikimeerojen konstruointi

Voidaan valmistaa kimeerisiä molekyylejä, jotka sisältävät kohdesoluspesifisen vasta-ainemolekyylin solunul-5 koisen domeenin ja proteiinityrosiinikinaasin (esimerkiksi tässä kuvattujen kinaasien) solunsisäisen domeenin. Mainitunlaisen molekyylin tuottamiseksi valmistetaan ihmisen IgGl:n raskaan ketjun sekvenssejä liittämällä CH3-domeenin sekvenssejä cDNÄ-fragmenttiin, joka on johdettu vasta-ai-10 neen kalvon läpäisevää muotoa vastaavan mRNA:n 3'-päästä. 3'-pään fragmentti saadaan poilymeraasiketjureaktiolla käyttämällä nielurisa-cDNA-kirjastoa substraattina ja oligonuk-leotideja, joiden sekvenssit ovat CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (sek-15 venssi numero 1) ja CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (sekvenssi numero 2) ja jotka vastaavat toivottujen DNA-fragmenttien 5'- ja vastaavasti 3'-päätä. 5'-pään oligonukleotidi on 20 komplementaarinen ihmisen IgGl:n CH3-domeenin yhdelle koh dalle, ja 3'-pään oligonukleotidi on komplementaarinen kohdalle, joka on välittömästi 5'-suuntaan kalvon läpäisevää domeenia koodaavista sekvensseistä. PCR-tuote pilkotaan BstXI:llä ja BamHI:llä ja ligatoidaan BstXI- ja BamHI-25 kohtien väliin puolisynteettiseen IgGl-vasta-ainegeeniin, jossa on vaihtelevia ja vakioalueita. BstXI-BanHI-fragmen-tin insertoinnin jälkeen konstruktion monistetut osat korvataan CH3:ssa olevaan Smal-kohtaan asti restriktiofragmenttien vaihdolla, niin että vain Smal-kohdan ja 3'-30 oligonukleotidin välinen osa on peräisin PCR-reaktiosta.

Ihmis-IgGl-kimeerareseptorin muodostamiseksi raskasta ketjua vastaava geeni, joka päättyy BamHI-kohtaan, liitetään kiinnostuksen kohteena olevaan kinaasin solun-sisäiseen domeeniin tavanomaisin menetelmin. Kimeerisen re-35 septorin ilmentymistaso voidaan määrittää virtaussytometri- 56 alla. Ilmentymistä voidaan tehostaa rinnakkaisilmentämällä vasta-aineen kevyen ketjun cDNArta koodaava plasmidi.

Jotta saadaan muodostetuksi yksi transkriptioyksik-kö, joka mahdollistaisi sekä raskaan että kevyen ketjun il-5 mentämisen yhdestä promoottorista käsin, muodostetaan bi-sistronista mRNArta koodaava plasmidi raskaan ja kevyen ketjun koodausekvensseistä ja 78 kD:n glukoosisäädeltyä proteiinia (tunnetaan nimillä grp78 tai BiP) koodaavan mRNA:n 5-pään transloitumattomasta osasta. grp78-sekvenssejä saa-10 daan PCR:llä ihmisen genomi-DNA:sta käyttämällä alukkeita, joiden sekvenssit ovat CGC GGG CGG CCGCGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (sekvenssi numero 3) ja CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (sek-15 venssi numero 4) 5'- ja vastaavasti 3'-päässä. Polymeraasiketjureaktiot, joissa käytetään näitä oligonukleotideja, tehdään di-metyylisulfoksidin (10 %) läsnä ollessa. PCR:llä saatu fragmentti pilkotaan NotI:llä ja Hindi :11a ja insertoidaan 20 ihmisen IgGl:ä koodaavia sekvenssejä myöhemmin esiintyvien NotI- ja Hpal-kohtien väliin. Ihmisen IgG:n kevyttä kappa-ketjua koodaavat sekvenssit insertoidaan sitten grp78-esisekvenssin jälkeen käyttämällä Hindi-kohtaa ja toista vektorissa olevaa kohtaa. Näillä käsittelyillä saatava il-25 mentämisplasmidi koostuu puolisynteettisestä raskaan ketjun geenistä, jota seuraavat grp78:n esisekvenssit, sitten kevyen kappa-ketjun cDNA-sekvenssit ja sitten yhdestä SV40-DNA-fragmentista peräisin olevat polyadenylaatiosignaalit. Olemme aiemmin osoittaneet, että COS-solujen transfektointi 30 tällä ilmentymisplasmidilla antoi tulokseksi raskaan ketjun determinanttien merkittävästi parantuneen ilmentymisen verrattuna transfektointiin pelkkiä raskaan ketjun determinantteja koodaavalla plasmidilla.

Sellaisen bisistronisen geenin muodostamiseksi, jo-35 ka käsittää raskas ketju/reseptori -kimeeran ja kevyen ketjun, voidaan edellä olevat raskaan ketjun sekvenssit korva- 57 ta millä tahansa tässä kuvatulla kimeerisellä raskas ket-ju/reseptori -geenillä.

Kun IgG-tyrosiinikinaasikimeerat on konstruoitu, ne voidaan kloonata ilmentämisvektoriin, viedä isäntäsoluun ja 5 testata millä tahansa tässä kuvatuista määrityksistä (esimerkiksi kalsiumin mobilisaatio -määrityksellä tai syto-lyysimäärityksellä).

CD4-tyrosiinikinaasikimeerojen konstruointi

Voidaan valmistaa kimeerisiä molekyylejä, jotka si-10 sältävät CD4-molekyylin solunulkoisen domeenin ja prote-iinityrosiinikinaasin (esimerkiksi tässä kuvattujen ki-naasien) solunsisäisen domeenin. Mainitunlaisen molekyylin tuottamiseksi eristetään (esimerkiksi edellä kuvatulla tavalla) tyrosiinikinaasia koodittava sekvenssi (esimerkiksi 15 cDNA). Tämä sekvenssi liitetään sitten CD4:n käsitellyn muodon solunulkoiseen domeeniin, jossa on BamHI-kohta välittömästi kalvon läpäisevän domeenin edellä [Aruffo et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 8573 - 8577;

Zettlmeissl et ai., DNA Cell Biol. 9 (1990) 347 - 353], ta-20 vanomaisin menetelmin. Tämän fuusioproteiinin muodostami seksi voidaan järjestää BamHI-kohta sekvenssin sopivaan kohtaan (samoin tavanomaisin menetelmin). Geenifuusiotuot-teet viedään lehmänrokkovirusilmentämisplasmidiin (tässä kuvatulla tavalla) ja insertoidaan lehmänrokkoviruksen WR-25 kannan genomiin homologisella rekombinaatiolla ja tekemällä valikointi mykofenolihapossa tapahtuvan kasvun perusteella [Falkner et ai., J. Virol. 62 (1988) 1849 - 1854; Boyle et ai., Gene 65 (1988) 123 - 128]. Tutkitaan virtaussytometri-sellä analyysillä, ilmentävätkö lehmänrokkovirusrekombinan-30 tit CD4-tyrosiinikinaasifuusioproteiineja solun pinnalla.

Tulokset varmistetaan immuunisaostamalla lehmänrokkovirus-rekombinanteilla infektoidut solut (edellä kuvatulla tavalla) .

CD4-kimeerojen teho voidaan testata millä tahansa 35 tässä kuvatuista kalsiumin mobilisaatio -määrityksistä tai sytolyysimäärityksistä. Yhdessä erityisesimerkissä muodos- 58 tetaan kohde:efektori-mallijärjestelmä, joka perustuu HIV:n vaipan gpl20/gp41-kompleksin CD4-tunnistukseen. HeLa-solut infektoidaan rekombinanttilehmänrokkoviruksilla, jotka ilmentävät gpl20/gp41:ä [Chakrabarti et ai., Nature 320 5 (1986) 535 - 537; Earl et ai., J. Virol. 64 (1990) 2448 - 2451], ja leimataan ne 51Cr:llä. Leimattuja soluja inkuboi-daan ihmisen allospesifisen (cd8+, CD4") sytotoksisen T- lymfosyyttilinjan solujen kanssa, jotka on infektoitu leh-mänrokkovirusrekombinanteilla, jotka ilmentävät CD4-tyro-10 siinikinaasikimeeraa, ja tutkitaan spesifisen lyysin suhteen.

Sen mahdollisuuden kontrolloimiseksi, että lehmän-rokkovirusinfektointi saattaisi edistää CTL-solujen tekemää "keinotekoista" tunnistusta, tehdään samanlaisia sytolyy-15 sikokeita käyttämällä kohdesoluja, jotka on infektoitu leh-mänrokkovirusrekombinanteilla, jotka ilmentävät CD16:n fos-fatidyyli-inositoliin kytkeytynyttä muotoa (CD16PI) , ja leimattu 51Cr:llä, ja CTL-soluja, jotka on infektoitu CD16-ki-meeroja ilmentävillä vertailurekombinanteilla.

20 Yhdessä toisessa esimerkissä neutrofiiliset granu- losyytit, joilla on hyvin lyhyt elinikä verenkierrossa (noin 4 tuntia) ja jotka ovat voimakkaasti sytolyyttisiä, ovat houkuttelevia soluja CD4-tyrosiinikinaasikimeerojen ilmentämiseksi. Neutrofiilien infektointi HIV:llä ei johda to-25 dennäköisesti viruksen vapautumiseen, ja näiden solujen runsauden (runsaslukuisin leukosyyteistä) pitäisi helpottaa isännän puolustusta. Yhtenä toisena houkuttelevana mahdollisuutena isäntäsoluiksi ovat kypsät T-solut, yksi retrovi-ruskäsittelyyn tällä hetkellä käytettävissä oleva populaa-30 tio [Rosenberg, Sei. Am. 262 (1990) 62 - 69]. T-solu- populaatioita voidaan lisätä viljelmässä suhteellisen helposti yhdistelmä-IL-2:n avulla, ja lisätyillä populaatioilla on tyypillisesti rajoitettu elinikä uudelleeninfusoitui-na [Rosenberg et ai., N. Engl. J. Med. 323 (1990) 570 - 578]. 35 CD4-kimeeroja ilmentävien solujen tekemän HIV:n tunnistuksen pitäisi sopivissa olosuhteissa tarjota myös 59 mitogeenisia ärsykkeitä, mikä mahdollistaa sen, että varustettu solupopulaatio voisi reagoida dynaamisesti viruskuor-mitukseen. Vaikka olemme tässä keskittyneet fuusioproteii-nien käyttäytymiseen sytolyyttisissä T-lymfosyyteissä, saat-5 taisi kimeerojen ilmentäminen auttajalymfosyyteissä tarjota HIV:n mobilisoiman sytokiinilähteen, joka voisi vaikuttaa auttajasolualaryhmän romahtamista vastaan AIDSin ollessa kyseessä. Viimeaikaiset kuvaukset, jotka koskevat muutamia suunnitelmia infektion vastustuksen aikaansaamiseksi muissa 10 vaiheissa kuin viruksen tunkeutumisen yhteydessä [Friedman et ai., Nature 335 (1988) 452 - 454; Green et ai., Cell 58 (1989) 215 - 223; Malim et ai., Cell 58 (1989) 205 - 214;

Trono et ai., Cell 59 (1989) 113 - 120; Buonocore et ai.,

Nature 345 (1990) 625 - 628], viittaavat siihen, että voi- 15 täisiin suunnitella CD4-kimeeroja sisältäviä soluja, jotka estävät virustuotannon ilmentämällä sopivia aineita, jotka toimivat solunsisäisesti.

Kyky välittää signaaleja T-lymfosyytteihin autonomisten kimeerojen avulla antaa myös kyvyn säädellä retrovi-20 ruskäsiteltyjä lymfosyyttejä in vivo. Ristiliittymisärsyk- keet, joita välittävät esimerkiksi spesifiset IgM-vasta-aineet, jotka on käsitelty komplementtiin sitoutuvien do-meenien poistamiseksi, voivat mahdollistaa mainitunlaisten lymfosyyttien lukumäärän kasvun in situ, kun taas käsittely 25 vastaavilla spesifisillä IgG-vasta-aineilla (jotka tunnis tavat esimerkiksi kimeeriseen ketjuun aikaansaadun amino-happovariaation) voisi selektiivisesti poistaa käsitellyn populaation. Olemme aiemmin määrittäneet, etteivät anti-CD-IgM-vasta-aineet vaadi lisäristiliittämistä kalsiumin mobi-30 lisoimiseksi Jurkat-soluissa, jotka ilmentävät CD4:zeeta- kimeeroja. Kyky säädellä solupopulaatioita turvautumatta toistuvaan elimistön ulkopuolella tapahtuvaan monistukseen voi olennaisesti laajentaa aluetta ja tehoa geneettisesti käsitellyille T-soluille nykyisin ehdotettujen käyttötar-35 koitusten yhteydessä.

60

Kinaasikimeerojen ja CD28-kimeerareseptorien yhdis-telmäohjaus

Sen osoittaminen, että jotkut kinaasikimeerat (kuten ZAP-70:n ja Src-ryhmän kinaasien kimeerat) voivat toi-5 mia vain yhdessä sytolyyttisen tappamisen ohjaamiseksi, tarjoaa mahdollisuuden kontrolloida sytolyyttistä vastetta käyttämällä sopivia kimeeristen kinaasien muodostamia pareja. Tämä lähestymistapa on erityisen edullinen kasvainten-vastaisen hoidon alueella, koska kimeeraparien solunulkoi-10 set domeenit voidaan suunnitella tunnistamaan ja sitomaan useita kasvainsolupinnoilla olevia determinantteja. Voimakas sytolyyttinen vaste saadaan aikaan vasta kunkin monista determinateista tultua sidotuksi (ja siten esimerkiksi ZAP-70:n ja Src-ryhmän kinaasien osallistuttua sitomiseen). Tä-15 mä lähestymistapa parantaa terapeuttista spesifisyyttä vähentämällä muiden kuin syöpäsolujen tuhoutumisen todennäköisyyttä ja esiintymistiheyttä.

Yhdessä erityisesimerkissä kimeerapari voi sisältää kaksi erilaista solunulkoista domeenia, joista kumpikin 20 tunnistaa kohteena olevan kasvaimen eri antigeenipiirteen. Mainitunlainen kimeerapari voi tunnistaa kaksi toisiinsa liittymätöntä molekyyliä kasvaimen pinnalla (esimerkiksi solupinnan kaksi erilaista proteiinimarkkeria), tai pari voi tunnistaa saman molekyylin kaksi erilaista tuntomerkkiä 25 (esimerkiksi solunpinnan samaan proteiiniin liittyvän antigeenisen proteiinin ja antigeenisen hiilihydraatin). Esimerkkeihin kasvainantigeeneista kuuluvat, mainittuihin rajoittumatta, mikä tahansa lukuisista hiilihydraateista (esimerkiksi Ley, sialyyli-LeY, Lex ja sialyyli-Lex) , karsi-30 noembryoninen antigeeni, CD40, muuntunut CD44, a-fetopro-teiini, T- ja Tn-antigeenit, tensakiini ja kasvutekijä-reseptorit (esimerkiksi HER2/neu).

Koska on osoitettu, että CD28:n mukanaolo edistää T-solujen aktivaatiota, keksinnön piiriin kuuluvat lisäksi 35 myös terapeuttiset solut, jotka ilmentävät useita kimeeri-siä reseptoreja, joista yksi sisältää CD28:n solunsisäisen 61 domeenin ja toinen (tai useampi) minkä tahansa tässä kuvatun proteiinityrosiinikinaasin solunsisäisen domeenin. Ki-meeristen reseptorien muodostamassa ryhmässä voivat so-lunulkoiset domeenit olla identtisiä (kaikki voivat esimer-5 kiksi olla peräisin CD4-proteiinista ja tunnistaa siten HIV:n tai HIV:n infektoiman solun), tai kukin niistä voi, kuten edellä käsiteltiin, olla suunniteltu tunnistamaan solun tai patogeenin pinnalla oleva eri kohdemolekyyli.

Tämä yhdistelmäohjausmenetelmä voidaan ulottaa mi-10 hin määrään tahansa yhteistyössä toimivia kimeerisiä reseptoreja (sitä voidaan käyttää esimerkiksi ZAP-70:n ja Src-ryhmän kinaasien kimeerojen yhdistelmien tai vaihtoehtoisesti CD28-kimeeran, ZAP-70-kimeeran ja Src-ryhmän kinaasin kimeeran yhdistelmän ollessa kyseessä yhdistelmäohjauksen 15 helpottamiseksi edelleen). Sitä voidaan lisäksi käyttää minkä tahansa tämän keksinnön mukaisen hoitomenetelmän säätelyyn .

CD28-kimeeroja konstruoidaan ja ilmennetään noudattamalla tässä kuvattuja menetelmiä. Aruffo ja Seed [Proc. 20 Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 8573 - 8577] esittävät CD28:n sekvenssin. Mainitussa viitteessä kuvataan myös CD28:n solunsisäisiä ja kalvon läpäiseviä domeeneja. Romeo et ai. (Cold Spring Harbor symp. on Quant. Biol. LVI I, 1992, s. 117 - 125) esittävät yhden esimerkin kimeerasta, 25 jossa on solunsisäinen CD28-domeeni.

Muita suoritusmuotoja

Muiden, proteiinikinaasin solunsisäisistä sekvensseistä koostuvien kimeerojen muodostamiseksi reseptorin so-lunulkoista domeenia koodaavia cDNA- tai genomisekvenssejä 30 voidaan varustaa restriktiokohdalla, joka tuodaan välittömästi valitun solunulkoisen domeenin edellä olevaan kohtaan. Solunulkoista domeenia vastaava fragmentti, joka päättyy restriktiokohtaan, voidaan sitten liittää prote-iinikinaasisekvensseihin. Tyypillisiä solunulkoisia do-35 meeneja voidaan saada reseptoreista, jotka tunnistavat komplementin, hiilihydraatteja, virusproteiineja, bakteere- 62 ja, alkueläimiä tai monisoluisia loisia tai niiden indusoi-mia proteiineja. Vastaavasti voidaan patogeenien tai kas-vainsolujen ilmentämiä ligandeja tai reseptoreja liittää proteiinikinaasisekvensseihin immuunireaktioiden ohjaami-5 seksi mainittuja ligandeja tunnistavia reseptoreja sisältäviä soluja vastaan.

Pienimpien mahdollisten sytolyysin vaatimien prote-iinikinaasisekvenssien identifioimiseksi voidaan valmistaa tavanomaisin menetelmin sarja deleetiomutantteja, joista on 10 poistettu aina suurempi osa kinaasin solunsisäisestä do-meenista. Mainittujen deleetiomutanttien tehokkuus testataan millä tahansa tässä kuvatuista määrityksistä. Käyttökelpoisiin solunsisäisiin domeeneihin kuuluvat Syk-pro-teiinikinaasin ollessa kyseessä esimerkiksi sian Syk-sek-15 venssin aminohapot 336 - 628 ja ihmisen Syk-sekvenssin aminohapot 338 - 630. Käyttökelpoisiin solunsisäisiin domeeneihin kuuluvat Src-ryhmän kinaasien ollessa kyseessä esimerkiksi SH2- ja SH3-domeenit.

Vaikka keksintöä on kuvattu sen erityissuoritusmuo-20 tojen yhteydessä, ymmärrettäneen, että siihen voidaan tehdä muita muutoksia ja tämä hakemus on tarkoitettu kattamaan keksinnön variaatiot, käyttötarkoitukset tai sovellukset mukaan luettuina sellaiset poikkeamiset tästä esityksestä, jotka kuuluvat keksinnön alan ammattitaidon piiriin ja joi-25 ta voidaan soveltaa edellä esitettyihin, oheisten patenttivaatimusten suoja-alan puitteissa oleviin olennaisiin piirteisiin.

63

Sekvenssilistaus (1) YLEISET TIEDOT: 5 (i) HAKIJA: Brian Seed

Charles Romeo Waldemar Kolanus (ii)KEKSINNÖN NIMITYS: Soluimmuniteetin suuntaaminen 10 uudelleen proteiinityrosiinikinaasikimeerojen avulla (lii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 9 15 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Fish & Richardson P.C.

(B) KATU: 225 Franklin Street (C) KAUPUNKI: Boston (D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: Massachusetts

20 (E) MAA: USA

(F) POSTINUMERO: 02110-2804 (v) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke, 3,5" 1,44 Mb

25 (B) TIETOKONE: IBM PS/2 malli 50Z tai 55SX

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: MC-DOS (versio 5.0) (D) OHJELMISTO: Wordperfect (versio 5.1) (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: 30 (A) HAKEMUSNUMERO: PCT/US96/--- (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: 08/394 177 35 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 24.2.1995 (viii) ASIAMIESTÄ KOSKEVAT TIEDOT: (A) NIMI: Karen F. Lech, Ph.D.

(B) REKISTERINUMERO: 35 238 40 (C) VIITE/LUETTELONUMERO: 00786/271001 (ix) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: (617) 542-5070 (B) TELEFAX: (617) 542-8906 45 (C) TELEX: 200154 (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: 64 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1:

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC

33 10 (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 50 15 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2:

20 CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC

CTGGGCCTCA 50 (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: 25 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 30 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC

33 35 (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 (B) TYYPPI: nukleiinihappo 40 (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4:

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG

45 33 (2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: 65 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 630 (B) TYYPPI: aminohappo

(C) JUOSTEISUUS: N/A

5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 5:

Met Ala Asp Ser Ala Asn His Leu Pro Phe Phe Phe Gly His Ile

Thr 10 1 5 10 15

Arg Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Leu Vai Gin Gly Gly Met Ser Asp

Gly 20 25 30

Leu Tyr Leu Leu Arg Gin Ser Arg Asn Tyr Leu Gly Gly Phe Ala 15 Leu 35 40 45

Ser Vai Ala His Gly Arg Lys Ala His Asn Tyr Thr Ile Glu Arg

Glu 50 55 60 20 Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Arg Thr His Ala Ser

Pro 65 70 75 80

Ala Asp Leu Cys Asn Tyr His Ser Gin Glu Ser Asp Gly Leu Vai 2 5 Cys 85 90 95

Leu Leu Lys Lys Pro Phe Asn Arg Pro Gin Gly Vai Gin Pro Lys

Thr 100 105 110 30 Gly Pro Phe Glu Asp Leu Lys Glu Asn Leu Ile Arg Glu Tyr Vai

Lys 115 120 125

Gin Thr Met Asn Leu Gin Gly Gin Ala Leu Glu Gin Ala Ile Ile

Ser 35 130 135 140

Gin Lys Pro Gin Leu Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu

Lys 145 150 155 160 4 0 Met Pro Trp Phe His Gly Lys Ile Ser Arg Glu Ile Ser Thr Gin

Ile 165 170 175

Vai Leu Ile Gly Ser Lys Thr Asn Gly Lys Phe Leu Ile Arg Ala

Arg 45 180 185 190

Asp Asn Asn Gly Ser Tyr Ala Leu Cys Leu Leu His Ile Gly Lys

Vai 195 200 205

Leu His Tyr Arg Ile Asp Lys Asp Lys Thr Gly Lys Leu Ser Ile 50 Pro 210 215 220

Glu Gly Lys Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gin Leu Vai Glu His Tyr

Ser 240 66 225 230 235

Tyr Lys Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Leu Thr Val Pro Cys Gin

Lys 5 245 250 255 lie Gly Thr Gin Gly Asn Val Asn Phe Gly Gly Arg Pro Gin Leu

Phe 260 265 270

Gly Ser His Pro Ala Thr His Ser Ala Gly Gly lie lie Ser Arg 10 He 275 280 285

Lys Ser Tyr Ser Phe Pro Lys Pro Gly His Arg Lys Ser Ser Pro

Ala 290 295 300 15 Gin Gly Asn Arg Gin Glu Ser Thr Val Ser Phe Asn Phe Tyr Glu

Pro 305 310 315 320

Glu Leu Ala Pro His Ala Ala Asp Lys Gly Pro Gin Arg He Ala 2 0 Leu 325 330 335

Pro Met Asp Thr Glu Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ala Asp Pro Glu

Glu 340 345 350 25 He Arg Pro Lys Glu Val Tyr Leu Asp Arg Lys Leu Leu Thr Leu

Glu 355 360 365

Asp Lys Glu Leu Gly Ser Gly Asn Phe Gly Thr Val Lys Lys Gly

Tyr 30 370 375 380

Tyr Gin Met Lys Lys Vai Vai Lys Thr Vai Ala Val Lys He Leu

Lys 385 390 395 400 35 Asn Glu Ala Asn Asp Pro Ala Leu Lys Asp Glu Leu Leu Ala Glu

Ala 405 410 415

Asn Val Met Gin Gin Leu Asp Asn Pro Tyr He Val Arg Met He

Gly 40 420 425 430

He Cys Glu Ala Glu Ser Trp Met Leu Val Met Glu Met Ala Glu

Leu 435 440 445

Gly Pro Leu Asn Lys Tyr Leu Gin Gin Asn Arg His Val Lys Leu 45 Lys 450 455 460

Asn He He Glu Leu Val His Gin Val Ser Met Gly Met Lys Tyr

Leu 465 470 475 50 480

Glu Glu Ser Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val

Leu 485 490 495

Leu Val Thr Gin His Tyr Ala Lys He Ser Asp Phe Gly Leu Ser 55 Lys 67 500 505 510

Ala Leu Arg Ala Asp Glu Asn Tyr Tyr Lys Ala Gin Thr His Gly

Lys 515 520 525 5 Trp Pro Vai Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn Tyr Tyr Lys

Phe 530 535 540

Ser Ser Lys Ser Asp Vai His Ser Phe Gly Vai Leu Met Asn Glu

Ala 10 545 550 555 560

Phe Ser Tyr Gly Gin Lys Phe Tyr Arg Gly Met Lys Gly Ser Glu

Vai 565 570 575 15 Ile Ala Met Leu Glu Lys Gly Glu Arg Met Gly Cys Pro Ala Gin

Cys 580 585 590

Pro Arg Glu Met Tyr Asp Leu Met Asn Leu Cys Trp Thr Tyr Asp

Vai 20 595 600 605

Glu Asn Arg Pro Gly Phe Ala Ala Vai Glu Leu Arg Leu Arg Asn

Tyr 610 615 620

Tyr Tyr Asp Vai Vai Asn 25 625 630 (2) SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 30 (A) PITUUS: 628 (B) TYYPPI: aminohappo

(C) JUOSTEISUUS: N/A

(D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 6: 35

Met Ala Asp Ser Ala Asn His Leu Pro Phe Phe Phe Gly Gin Ile

Thr 15 10 15

Arg Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Leu Vai Gin Gly Gly Met Ser Asp 4 0 Gly 20 25 30

Leu Tyr Leu Leu Arg Gin Ser Arg Asn Tyr Leu Gly Gly Phe Ala

Leu 35 40 45 45 Ser Vai Ala Tyr Asp Arg Lys Ala His His Tyr Thr Ile Glu Arg

Glu 50 55 60

Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ser Gly Gly Arg Thr His Gly Ser

Pro 50 65 70 75 80

Ala Glu Leu Cys His Tyr His Ser Gin Glu Leu Asp Gly Leu Vai

Cys 85 90 95 68

Leu Leu Lys Asn Pro Phe Asn Arg Pro Pro Gly Val Gin Pro Lys

Thr 100 105 110

Gly Pro Phe Glu Asp Leu Lys Glu Asn Leu lie Arg Glu Tyr Val 5 Lys 115 120 125

Gin Thr His Asn Leu Gin Gly Gin Ala Leu Glu Gin Ala lie lie

Ser 130 135 140 10 Gin Lys Pro Gin Leu Glu Lys Leu lie Ala Thr Thr Ala His Glu

Lys 145 150 155 160

Met Pro Trp Phe His Gly Lys lie Ser Arg Asp Glu Ser Glu Gin 15 He 165 170 175

Val Leu Ile Gly Ser Lys He Asn Gly Lys Phe Leu He Arg Ala

Arg 180 185 190 20 Asp Met Gly Ser Tyr Ala Leu Gly Leu Leu His He Gly Lys Val

Leu 195 200 205

Met Tyr Arg He Asp Lys Asp Lys Thr Gly Lys Leu Ser He Pro

Gly 25 210 215 220

Gly Lys Asn Phe Asp Thr Leu Trp Gin Leu Val Glu Lys Tyr Ser

Tyr 225 230 235 240 30 Lys Ser Asp Gly Leu Leu Arg Val Leu Thr Val Pro Cys Gin Lys

He 245 250 255

Gly Gly Gin Thr Gly Asn Asp Ser Phe Arg Pro Gin Leu Phe Ser

Ala 35 260 265 270

His Ser Ala Thr Trp Ser Ala Gly Gly Ile Ile Ser Arg He Lys

Ser 275 280 285

Tyr Ser Phe Pro Lys Pro Gly His Arg Lys Ala Ser Ser Pro Gin 4 0 Gly 290 295 300

Asn Arg Pro Glu Ser Leu Val Ser Tyr Asn Phe Tyr Glu Ser Asp

Arg 305 310 315 45 320

Gly Phe Trp Ala Asn Glu Arg Glu Ala Gin Arg Glu Ala Leu Pro

Met 325 330 335

Asp Thr Glu Val Val Glu Ser Pro Tyr Ala Asp Pro Glu Glu He 50 Arg 340 345 350

Pro Lys Glu Val Tyr Leu Asp Arg Lys Leu Leu Thr Leu Glu Asp

Lys 355 360 365 69

Glu Leu Gly Ser Gly Asn Phe Gly Thr Val Lys Lys Gly Tyr Tyr

Gin 370 375 380

Met Lys Lys Val Val Lys Thr Val Ala Val Lys lie Leu Lys Asn 5 Glu 385 390 395 400

Ala Asn Asp Pro Ala Leu Lys Asp Glu Leu Leu Ala Glu Ala Asn

Val 10 405 410 415

Met Gin Gin Leu Asp Asn Pro Tyr lie Val Arg Met lie Gly lie

Cys 420 425 430

Glu Ala Ser Ser Trp Met Leu Val Met Glu Met Ala Glu Leu Gly 15 Pro 435 440 445

Leu Asn Lys Tyr Leu Gin Gin Asn Arg His Val Lys Asp Lys Asn

He 450 455 460 20 He Glu Leu Val His Gin Val Ser Met Gly Met Lys Tyr Leu Glu

Glu 465 470 475 480

Cys Asn Pro Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu 25 Val 485 490 495

Thr Gin His Tyr Ala Lys He Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys Ala

Leu 500 505 510 30 Arg Ala Asp Glu Asn Tyr Tyr Lys Ala Gin Thr His Gly Lys Trp

Pro 515 520 525

Val Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys He Asn Tyr Tyr Lys Phe Ser

Ser 35 530 535 540

Lys Ser Asp Val Asn Ser Phe Gly Val Leu Met Trp Glu Ala Phe

Ser 545 550 555 560 4 0 Tyr Gly Gin Lys Phe Tyr Arg Gly Met Lys Gly Ser Glu Val Ser

Ala 565 570 575

Met Leu Glu Lys Gly Glu Arg Met Gly Cys Phe Phe Gly Cys Phe

Arg 45 580 585 590

Glu Met Tyr Glu Leu Asn Thr Leu Cys Asn Thr Tyr Asp Val Glu

Asn 595 600 605

Arg Pro Gly Phe Val Ala Val Glu Leu Arg Leu Arg Asn Tyr Tyr 50 Tyr 610 615 620

Asp Val Val Asn 625 55 (2) SEKVENSSIN NRO 7 TIEDOT: 70 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 (B) TYYPPI: nukleiinihappo 5 (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 7:

ATGGCAGACA GTGCCAACCA CTTGCCCTTC TTCT

10 34 (2) SEKVENSSIN NRO 8 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 15 (A) PITUUS: 39 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 8: 20 CGCGGGGCGG CCGCTTTAAT TCACCACGTC GTAGTAGTA 39 (2) SEKVENSSIN NRO 9 TIEDOT: 25 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen 30 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 9:

CGCGGGACGC GTACCATGGC AGACAGTGCC AAC

33

Claims (32)

1. T-lymfosyyttien käyttö, joista T-lymfosyyteistä kukin ilmentää ainakin kahta kalvoon sitoutunutta, kimee- 5 ristä proteiinireseptoria, joista mainituista reseptoreista ensimmäinen käsittää (a) ensimmäisen proteiinityrosiini-kinaasin solunsisäisen osan, jolla on kyky antaa mainitulle T-lymfosyytille signaali reseptoriin sitoutuneen kohteena olevan solun tai reseptoriin sitoutuneen kohteena olevan 10 infektionaiheuttajan tuhoamiseksi, ja (b) solunulkoisen osan, jolla on kyky tunnistaa ja sitoa spesifisesti mainittu kohteena oleva solu tai mainittu kohteena oleva infek-tionaiheuttaja; ja joista mainituista reseptoreista toinen käsittää (a) solunulkoisen osan, jolla on kyky tunnistaa ja 15 sitoa spesifisesti mainittu kohteena oleva solu tai mainittu kohteena oleva infektionaiheuttaja, ja (b) CD28:sta johdetun solunsisäisen osan, jolloin mainitut T-lymfosyytit kykenevät tunnistamaan ja tuhoamaan spesifisesti mainitun kohteena olevan solun tai kohteena olevan infektionaiheut-20 tajan, valmistettaessa lääkevalmistetta soluimmuunivasteen ohjaamiseksi nisäkkäässä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että mainittu kohteena oleva solu on infektionaiheuttajan infektoima isäntäsolu, kasvain- tai syö- 25 päsolu tai autoimmuunimekanismin muodostama solu.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että mainittu proteiinityrosiinikinaasi on Syk-kinaasiryhmän jäsen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen käyttö, tun- 30 nettu siitä, että mainittu proteiinityrosiinikinaasi on Syk.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että mainittu solunsisäinen osa sisältää sian Syk:n aminohapot 336 - 628 tai ihmisen Syk:n aminoha- 35 pot 338 - 630.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu T-lymfosyytti ilmentää kolmatta kalvoon sitoutunutta kimeeristä proteiinireseptoria, joka mainittu kolmas kimeerinen reseptori käsittää (a) toisen 5 proteiinityrosiinikinaasin solunsisäisen osan, jolla on kyky antaa mainitulle T-lymfosyytille signaali reseptoriin sitoutuneen kohteena olevan solun tai reseptoriin sitoutuneen kohteena olevan infektionaiheuttajan tuhoamiseksi, ja (b) solunulkoisen osan, jolla on kyky tunnistaa ja sitoa 10 spesifisesti mainittu kohteena oleva solu tai mainittu kohteena oleva infektionaiheuttaja.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että toinen mainituista proteiinityrosiini-kinaaseista on Syk-kinaasiryhmän jäsen ja toinen mainituis- 15 ta proteiinityrosiinikinaaseista on Src-kinaasiryhmän jä sen .

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että toinen mainituista proteiinityrosiinikinaaseista on ZAP-70 ja toinen mainituista proteiinityro- 20 siinikinaaseista on Fyn.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että toinen mainituista proteiinityrosiinikinaaseista on ZAP-70 ja toinen mainituista proteiinityrosiinikinaaseista on Lck.

10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu ZAP-70: n osa sisältää ihmisen ZAP-70:n Tyr 369:n.

11. Patenttivaatimuksen 1 tai 6 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu soluvaste on MHC:stä 30 riippumaton.

12. Patenttivaatimuksen 1 tai 6 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainitut T-lymfosyytit ovat syto-toksisia T-lymfosyyttejä.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tun- 35 nettu siitä, että mainittu kohteena oleva infektionai heutta ja on immuunikatovirus.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu solunulkoinen osa käsittää CD4:n HIV-vaippaan sitoutuvan osan.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tun-5 nettu siitä, että mainitut T-lymfosyytit tuhoavat mainitun kohteena olevan solun tai kohteena olevan infektionai-heuttajan sytolyysin kautta.

16. T-lymfosyytti, tunnettu siitä, että se ilmentää ainakin kahta kalvoon sitoutunutta, kimeeristä pro- 10 teiinireseptoria, joista mainituista reseptoreista ensim mäinen käsittää (a) ensimmäisen proteiinityrosiinikinaasin solunsisäisen osan, jolla on kyky antaa mainitulle T-lymfosyytille signaali reseptoriin sitoutuneen kohteena olevan solun tai reseptoriin sitoutuneen kohteena olevan 15 infektionaiheuttajan tuhoamiseksi, ja (b) solunulkoisen osan, jolla on kyky tunnistaa ja sitoa spesifisesti mainittu kohteena oleva solu tai mainittu kohteena oleva infektionaiheuttaj a ; ja joista mainituista reseptoreista toinen käsittää (a) solunulkoisen osan, jolla on kyky tunnistaa ja 20 sitoa spesifisesti mainittu kohteena oleva solu tai mainittu kohteena oleva infektionaiheuttaja, ja (b) CD28:sta johdetun solunsisäisen osan, jolloin mainittu T-lymfosyytti kykenee tunnistamaan ja tuhoamaan spesifisesti mainitun kohteena olevan solun tai kohteena olevan infektionaiheut-25 tajan.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen solu, tun nettu siitä, että mainittu proteiinityrosiinikinaasi on Syk-kinaasiryhmän jäsen.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen T-lymfosyytti, 30 tunnettu siitä, että mainittu proteiinityrosiinikinaasi on Syk.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen T-lymfosyytti, tunnettu siitä, että mainittu solunsisäinen osa sisältää sian Syk:n aminohapot 336 - 628 tai ihmisen Sykin ami- 35 nohapot 338 - 630.

20. Patenttivaatimuksen 16 mukainen T-lymfosyytti, tunnettu siitä, että mainittu T-lymfosyytti ilmentää kolmatta kalvoon sitoutunutta kimeeristä proteiiniresepto-ria, joka mainittu kolmas kimeerinen reseptori käsittää (a) 5 toisen proteiinityrosiinikinaasin solunsisäisen osan, jolla on kyky antaa mainitulle T-lymfosyytille signaali reseptoriin sitoutuneen kohteena olevan solun tai reseptoriin sitoutuneen kohteena olevan infektionaiheuttajan tuhoamiseksi, ja (b) solunulkoisen osan, jolla on kyky tunnistaa ja 10 sitoa spesifisesti mainittu kohteena oleva solu tai mainittu kohteena oleva infektionaiheuttaja.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen T-lymfosyytti, tunnettu siitä, että toinen mainituista proteiinityro-siinikinaaseista on Syk-kinaasiryhmän jäsen ja toinen mai- 15 nituista proteiinityrosiinikinaaseista on Src-kinaasiryhmän j äsen.

22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen T-lymfosyytti, tunnettu siitä, että toinen mainituista proteiinityrosiinikinaaseista on ZAP-70 ja toinen mainituista prote- 20 iinityrosiinikinaaseista on Fyn.

23. Patenttivaatimuksen 20 mukainen T-lymfosyytti, tunnettu siitä, että toinen mainituista proteiinityrosiinikinaaseista on ZAP-70 ja toinen mainituista proteiinityrosiinikinaaseista on Lck.

24. Patenttivaatimuksen 22 tai 23 mukainen T- lymfosyytti, tunnettu siitä, että mainittu ZAP-70: n osa sisältää ihmisen ZAP-70:n Tyr 369:n.

25. Patenttivaatimuksen 16 tai 20 mukainen T-lymfosyytti, tunnettu siitä, että mainitut T- 30 lymfosyytit ovat sytotoksisia T-lymfosyyttejä.

26. Patenttivaatimuksen 16 mukainen T-lymfosyytti, tunnettu siitä, että mainittu kohteena oleva infektionaiheutta ja on immuunikatovirus.

27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen T-lymfosyytti, 35 tunnettu siitä, että mainittu solunulkoinen osa käsittää CD4:n HIV-vaippaan sitoutuvan osan.

28. Patenttivaatimuksen 16 mukainen T-lymfosyytti, tunnettu siitä, että mainitut T-lymfosyytit tuhoavat mainitun kohteena olevan solun tai kohteena olevan infek-tionaiheuttajan sytolyysin kautta.

29. Patenttivaatimuksen 16 tai 20 mukainen T- lymfosyytti, tunnettu siitä, että mainittu sitoutuminen on MHC:stä riippumatonta.

30. Patenttivaatimuksen 16 tai 20 mukainen T-lymfosyytti, tunnettu siitä, että mainittu solunulkoi- 10 nen osa käsittää reseptorin ligandiin sitoutuvan osan, li-gandin reseptoriin sitoutuvan osan, vasta-aineen antigeeniin sitoutuvan osan tai niiden funktionaalisen johdoksen.

31. DNA, tunnettu siitä, että se koodaa kalvoon sitoutunutta kimeeristä proteiinireseptoriparia, jolloin 15 ensimmäinen mainituista reseptoreista käsittää (a) prote-iinityrosiinikinaasin solunsisäisen osan, jolla on kyky antaa T-lymfosyytille signaali reseptoriin sitoutuneen kohteena olevan solun tai reseptoriin sitoutuneen kohteena olevan infektionaiheuttajan tuhoamiseksi, ja (b) solunul- 20 koisen osan, jolla on kyky tunnistaa ja sitoa spesifisesti mainittu kohteena oleva solu tai mainittu kohteena oleva infektionaiheuttaja, ja jolloin toinen mainituista reseptoreista käsittää (a) solunulkoisen osan, jolla on kyky tunnistaa ja sitoa spesifisesti mainittu kohteena oleva solu 25 tai mainittu kohteena oleva infektionaiheuttaja, ja (b) CD28:sta johdetun solunsisäisen osan jolloin mainittu T-lymfosyytti kykenee tunnistamaan ja tuhoamaan spesifisesti mainitun kohteena olevan solun tai kohteena olevan infektionaiheutta j an .

32. Vektori, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 31 mukaista kalvoon sitoutunutta kimeeristä proteiinireseptoriparia koodaavan DNA:n.