KR102468315B1 - 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 - Google Patents

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 췌장 내배엽 세포의 췌장 내분비 풍부 클러스터로의 분화를 촉진하고 호르몬-발현 세포 내에서 인슐린 발현을 향상시키는 방법을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 {DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS INTO PANCREATIC ENDOCRINE CELLS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 2012년 6월 8일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/657,160호의 이익을 주장한다.
본 발명은 세포 분화 분야이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 만능 줄기 세포의 내분비 세포로의 분화의 조절자로서의 에프린 리간드 및 스핑고신-1-포스페이트의 용도를 개시한다.
제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착(engraftment)에 적절한 인슐린-생산 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터의 작용성 β 세포의 생성이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능성 세포는 낭배형성(gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 시기를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽(definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 HNF3베타, GATA4, MIXL1, CXCR4 및 SOX17과 같은 많은 마커를 발현한다.
낭배형성 마지막까지, 내배엽은 내배엽의 전방, 중간 및 후방 영역을 독특하게 표시하는 인자들의 패널의 발현에 의해 인식될 수 있는 전방-후방 도메인(anterior-posterior domain)으로 나누어진다. 예를 들어, Hhex, 및 Sox2는 전방 영역을 확인해 주는 반면, Cdx1, 2, 및 4는 후방의 절반의 내배엽을 확인해 준다.
내배엽 조직의 이주는, 내배엽이 상이한 중배엽 조직들과 아주 근접해지게 하며 이는 장관의 국지화를 돕는다. 이는 많은 분비형 인자들, 예를 들어 FGF, Wnt, TGF-B, 레틴산(RA), 및 BMP 리간드(ligand) 및 그 길항제에 의해 달성된다. 예를 들어, FGF4 및 BMP는 추정 후장 내배엽에서의 Cdx2 발현을 촉진하며 전방 유전자 Hhex 및 SOX2의 발현을 억제한다(문헌[2000 Development, 127:1563―1567]). 또한 WNT 신호전달(signaling)은 후장 발생을 촉진하고 전장 운명을 저해하도록 FGF 신호전달과 병행하여 작동하는 것으로 밝혀졌다(문헌[2007 Development, 134:2207―2217]). 마지막으로, 중간엽에 의해 분비된 레틴산은 전장-후장 경계부를 조절한다(문헌[2002 Curr Biol, 12:1215―1220]).
특정 전사 인자들의 발현 수준을 이용하여 조직의 아이덴티티(identity)를 표기할 수 있다. 완성 내배엽의 원시 장관으로의 형질전환 동안, 장관은 제한된 유전자 발현 패턴에 의해 분자 수준에서 관찰될 수 있는 넓은 도메인들 내로 국지화되게 된다. 예를 들어, 장관 내의 국지화된 췌장 도메인은 PDX-1의 매우 높은 발현 및 CDX2 및 SOX2의 매우 낮은 발현을 나타낸다. 이와 유사하게, 높은 수준의 Foxe1의 존재는 식도 조직을 나타내며; NKX2.1은 폐 조직에서 고도로 발현되며; SOX2/Odd1(OSR1)은 위 조직에서 고도로 발현되며; PROX1/Hhex/AFP의 발현은 간 조직에서 높으며; SOX17은 담도 구조 조직에서 고도로 발현되며; PDX1, NKX6.1/PTf1a, 및 NKX2.2는 췌장 조직에서 고도로 발현되며; CDX2의 발현은 장 조직에서 높다. 상기 요약은 문헌[Dev Dyn 2009, 238:29―42] 및 문헌[Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221-251]으로부터 수정된다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화에서 일어난다(문헌[2009 Annu Rev Cell Dev Biol, 25:221-251]; 문헌[2009 Dev Dyn, 238:29-42]). 배측(dorsal) 및 복측(ventra) 췌장 도메인은 전장 상피에서 생긴다. 또한 전장은 식도, 기관, 폐, 갑상선, 위, 간, 췌장 및 담관계가 생기게 한다.
췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자 PDX1을 발현한다. Pdx1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기(ES: embryonic stem) 세포-유래 완성 내배엽의 강화된 배양물의 생성을 기재한다(문헌[Nature Biotechnol 2005, 23:1534-1541]; 미국 특허 제7,704,738호). 마우스의 신장 피막 하에 이들 세포를 이식하면 내배엽 조직의 특성을 갖는 더욱 성숙한 세포로 분화되었다(미국 특허 제7,704,738호). 인간 배아 줄기 세포-유래된 완성 내배엽 세포는 FGF-10 및 레틴산의 첨가 후에 PDX1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다(미국 특허 공개 제2005/0266554A1호). 면역 결핍 마우스의 지방 패드 내에 이들 췌장 전구 세포를 후속적으로 이식하면 3 내지 4개월의 성숙기 후에 작용성 췌장 내분비 세포의 형성이 유발되었다(미국 특허 제7,993,920호 및 미국 특허 제7,534,608호).
피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터의 췌도 세포의 생성 시스템을 보고한다(미국 특허 제7,033,831호). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 먼저 인간 배아 줄기 세포를 부티르산나트륨과 액티빈 A의 배합물을 이용하여 내배엽으로 분화시켰다(미국 특허 제7,326,572호). 이어서 당해 세포를 EGF 또는 베타셀룰린과 배합된 노긴(Noggin)과 같은 BMP 길항제를 이용하여 배양하여 PDX1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
또한 소분자형 저해제(inhibitor)는 췌장 내분비 전구 세포의 유도에 사용되었다. 예를 들어, TGF-B 수용체 및 BMP 수용체들의 소분자형 저해제(문헌[Development 2011, 138:861-871]; 문헌[Diabetes 2011, 60:239-247])가 췌장 내분비 세포의 수를 유의하게 향상시키기 위하여 사용되었다. 게다가, 소분자형 활성화제가 완성 내배엽 세포 또는 췌장 전구 세포의 생성에 또한 사용되었다(문헌[Curr Opin Cell Biol 2009, 21:727-732]; 문헌[Nature Chem Biol 2009, 5:258-265]).
인간 만능 줄기 세포로부터 췌장 세포를 생성시키기 위한 프로토콜의 개선에 있어서 장족의 발전이 이루어졌음에도 불구하고, 작용성 내분비 세포 및 특정 베타 세포를 유발하는 프로토콜을 생성시킬 필요성이 여전히 존재한다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 일 부류의 에프린 리간드 및 스핑고신-1-포스페이트 또는 스핑고신 수용체의 작용제가 내분비 세포의 생성을 향상시키고 내분비 호르몬 및 내분비 전구 세포의 클러스터링을 가속시킴을 입증한다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 에프린 A4 또는 에프린 A3을 포함하는 배지 내에서 췌장 내배엽 세포의 개체군을 배양함으로써 인슐린 및 NKX6.1의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포의 개체군은 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포의 개체군은 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 액티빈 A 또는 액티빈 C를 포함하는 배지 내에서 췌장 내배엽 세포를 배양함으로써 인슐린, 글루카곤, 및 그렐린의 발현을 억제하는 중에 소마토스타틴의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리된 췌장 내배엽 세포의 개체군은 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포의 개체군보다 더 많은 소마토스타틴을 발현시킨다. 일부 실시 형태에서는, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포의 개체군에서의 인슐린의 발현에 비교하여 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리된 췌장 내배엽 세포의 개체군에서 인슐린의 발현이 억제된다. 일부 실시 형태에서는, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포의 개체군에서의 글루카곤의 발현에 비교하여 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리된 췌장 내배엽 세포의 개체군에서 글루카곤의 발현이 억제된다. 일부 실시 형태에서는, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포의 개체군에서의 그렐린의 발현에 비교하여 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리된 췌장 내배엽 세포의 개체군에서 그렐린의 발현이 억제된다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리된 췌장 내배엽 세포는 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포가 유래되는 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 췌장 내배엽 세포를 처리함으로써 NKX6.1의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포에 비교하여, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지로 처리된 췌장 내배엽 세포의 개체군은 향상된 양의 NKX6.1을 발현시킨다. 일부 실시 형태에서, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포에 비교하여, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지로 처리된 췌장 내배엽 세포 내에서 인슐린, 글루카곤, 및 그렐린과 같은 호르몬의 발현 수준은 영향을 받지 않는다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지로 처리된 췌장 내배엽 세포는 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포가 유래되는 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일부 실시 형태에서 본 발명은, 에프린 A4, 에프린 A3, 액티빈 A, 액티빈 C, 세마포린 3a, 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 췌장 내배엽 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 만능 세포를 분화시키는 단계적 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 에프린 A4 또는 에프린 A3을 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 액티빈 A 또는 액티빈 C를 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 세마포린 3a, 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포가 유래되는 만능 줄기 세포는 인간 배아 만능 줄기 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 췌장 내분비 세포를 스핑고신-1 수용체 작용제로 처리함으로써 내분비 클러스터의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포를 처리하기 위해 사용되는 스핑고신-1 수용체 작용제는 스핑고신-1-포스페이트(S1P)이다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포, 및 본 발명의 세포를 사용하는 방법 또한 본 발명의 실시 형태로서 고찰된다.
도 1a 내지 도 1g는, 실시예 1에 기재된 바와 같이 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 내에서 하기 유전자의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 나타낸다: 인슐린(도 1a), 소마토스타틴(도 1b), 그렐린(도 1c), 글루카곤(도 1d), PDX-1(도 1e), NKX6.1(도 1f), 및 NGN3(도 1g).
도 2a 내지 도 2c는, 인슐린에 대해 면역 염색된 세포의 영상을 나타낸다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 도 2a, 대조군; 도 2B, 50 ng/mL 에프린-A3으로 처리된 세포; 및 도 2c, 100 ng/mL 에프린-A3으로 처리된 세포.
도 3a 내지 도 3c는, 인슐린에 대해 면역 염색된 세포의 영상을 나타낸다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 도 3a, 대조군; 도 3b, 50 ng/mL 에프린-A4로 처리된 세포; 및 도 3c, 100 ng/mL 에프린-A4로 처리된 세포.
도 4a 내지 도 4d는, 스핑고신-1-포스페이트(S1P)로 처리하고 제1일(도 4a), 제7일(도 4b), 및 2가지의 상이한 배율로 제10일(도 4c 및 도 4d)에 영상화한 세포의 S6 배양물의 위상차 영상을 도시한다. 상기 영상들은, 제7일에 내분비 세포의 클러스터링의 명확한 증거가 있었고, 제10일에 췌장 내배엽 상피의 박층에 의해 클러스터들이 서로 분리되었음을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는, S1P로 처리하고 Hb9(도 5a), NKX6.1(도 5b)에 대해 면역염색하거나, 인슐린(도 5c) 및 Hb9(도 5d)에 대해 면역염색한 세포의 영상을 도시한다.
도 6a 및 도 6b는, 10 μM의 S1P로 처리하고 제6기의 시작으로부터 3일 후에 수확한 세포의 상이한 배율에서의 위상차 영상을 도시한다. 도 6c 및 도 6d는, NKX2.2에 대해 면역염색한 세포의 영상을 도시한다. 도 6c, 대조군 세포; 도 6d, S1P로 처리된 세포.
개시내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정 특색, 실시 형태 또는 출원을 기술 또는 예시하는 하기 부문으로 구분된다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 수준에서 그의 자기-재생 및 분화 능력 둘 모두에 의해 규정되는 미분화된 세포이다. 줄기 세포는 자기-재생 선구체, 비-재생 선구체, 및 최종 분화된 세포를 포함하는 자손 세포를 생성할 수 있다. 또한 줄기 세포는 시험관 내에서 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 작용성 세포로 분화하는 그의 능력을 특징으로 한다. 또한 줄기 세포는 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며, 배반포 내로의 주입 이후, 비록 전부는 아니더라도, 사실상 대부분의 조직에 기여한다.
줄기 세포는 그들의 발생 능력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위집단이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위집단이 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 선구체 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능 줄기 세포보다 더 제한된 하위집단의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 세포 또는 분화-유도된 세포는 세포 계통 내에서 더욱 특화된(결정된(committed)) 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 정상 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속 분화할 것이며 정상 환경 하에서 다른 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. "탈분화"(de-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이러한 맥락에서, 차등 발현(differential expression)은 미분화 세포에 비교하여 양성 마커에 대한 증가된 수준 및 음성 마커에 대한 감소된 수준을 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포는 특정 마커가 그 세포에서 검출될 때 특정 마커에 "대하여 양성"이거나 또는 "양성"이다. 이와 유사하게, 세포는 특정 마커가 그 세포에서 검출되지 않을 때 특정 마커에 "대하여 음성"이거나 또는 "음성"이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "세포 밀도" 및 "접종 밀도"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며 고체 또는 반고체 평면 또는 곡면 기재의 단위 면적당 접종된 세포의 수를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "제1기" 및 "S1"은 완성 내배엽(DE)의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하도록 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배의 외피(epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들 중 하나 이상을 발현한다: HNF3 베타, GATA4, SOX17, CXCR4, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드(goosecoid), C-Kit, CD99, 및 MIXL1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "장관"은 하기 마커들 중 하나 이상을 발현하는, 완성 내배엽으로부터 유래된 세포를 말한다: HNF3-베타, HNF1-베타, 또는 HNF4-알파. 장관 세포는 모든 내배엽 기관, 예를 들어 폐, 간, 췌장, 위 및 장이 생기게 할 수 있다.
원시 장관의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인해 주는 "제2기" 및 "S2"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.
"전장 내배엽"은 식도, 폐, 위, 간, 췌장, 담낭, 및 일부분의 십이지장이 생기게 하는 내배엽 세포를 말한다.
"후방 전장"은 후방 위, 췌장, 간, 및 일부분의 십이지장이 생기게 할 수 있는 내배엽 세포를 말한다.
"중장 내배엽"은 장들, 십이지장, 맹장 및 상행 결장의 부분들이 생기게 할 수 있는 내배엽 세포를 말한다.
"후장 내배엽"은 원위 1/3의 횡행 결장, 하행 결장, S상 결장 및 직장이 생기게 할 수 있는 내배엽 세포를 말한다.
"제3기" 및 "S3" 둘 모두는 전장 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하도록 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전장 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, FOXA2, CDX2, SOX2, 및 HNF4 알파.
췌장 전장 전구체의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하기 위하여 "제4기" 및 "S4"가 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 "췌장 전장 전구체 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, NKX6.1, HNF6, FOXA2, PTF1a, Prox1 및 HNF4 알파.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "제5기" 및 "S5"는 췌장 내배엽 및 췌장 내분비 전구 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하도록 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 또는 PROX1. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 CDX2 또는 SOX2를 사실상 발현하지 않는다.
"췌장 내분비 세포", 또는 "췌장 호르몬 발현 세포", 또는 "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현시키는 세포", 또는 "제6기 세포", 또는 "S6 세포"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 하기 호르몬 중 하나 이상을 발현시킬 수 있는 세포를 지칭한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 그렐린, 및 췌장 폴리펩티드.
"췌장 인슐린 양성 세포"는 인슐린, HB9, NKX2.2, 및 NKX6.1을 발현시키는 내분비 개체군을 지칭한다.
"췌장 내분비 전구 세포" 또는 "췌장 내분비 선구 세포"는 췌장 호르몬 발현 세포가 될 수 있는 췌장 내배엽 세포를 말한다. 이러한 세포는 하기 마커들 중 하나 이상을 발현할 수 있다: NGN3, NKX2.2, 뉴로D, ISL-1, Pax4, Pax6, 또는 ARX.
"d1", "d 1", 및 "1일"; "d2", "d 2", 및 "2일"; "d3", "d 3", 및 "3일" 등은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 이들 수와 문자의 조합은 본 출원의 단계적 분화 프로토콜 중의 상이한 단계에서의 인큐베이션의 특정 일을 지칭한다.
"글루코스" 및 "D-글루코스"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 자연에서 일반적으로 발견되는 당인 덱스트로스를 말한다.
췌장 내분비 선구 세포에서 발현되는 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 확인하는 "뉴로D" 및 "뉴로D1"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.
미국 캘리포니아주 소재의 스템젠트(Stemgent)로부터 입수가능한 BMP 수용체 저해제를 나타내기 위하여 "LDN" 및 "LDN-193189"가 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.
만능 줄기 세포의 단리, 팽창 및 배양
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(SSEA: stage-specific embryonic antigen) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 사용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현시킬 수 있다(문헌[Thomson et al. 1998, Science 282:1145-1147]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현의 손실로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼리 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조업자(미국 캘리포니아주 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, OCT4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 SCID 마우스 내에 주사하고, 형성된 기형종을 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정시킨 다음에, 삼배엽층으로부터의 세포형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배양체(embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다. 다양한 지지 세포 층을 사용하는 배양 중에, 또는 기질 단백질 코팅된 용기를 사용함으로써, 만능 세포를 용이하게 증폭할 수 있다. 대안적으로, 세포의 일상적 증폭을 위해, mTeSR(등록상표)1 배지(캐나다 밴쿠버 소재의 스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies))와 같은 한정 배지와 조합하여 화학적으로 한정된 표면을 사용할 수 있다. EDTA(에틸렌다이아민테트라아세트산)와 같은 다양한 칼슘 킬레이터의 사용, 효소적 방법, 또는 기계적 방법을 사용하여 배양 평판으로부터 만능 세포를 용이하게 제거할 수 있다. 대안적으로, 임의의 기질 단백질 또는 지지 세포 층의 부재 하에 현탁액 중에서 만능 세포를 증폭할 수 있다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 임신 후 형성된 조직으로부터 유도되는 확립된 만능 세포주를 포함하고, 이러한 조직에는 전-배아 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 임의의 시점에, 전형적으로 대략 10 내지 12주의 임신 전에(그러나 반드시 그러한 것은 아님) 취해진 태아 조직이 포함된다. 비제한적인 예로는 예를 들어 인간 배아 줄기 세포주들 H1, H7, 및 H9(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 와이셀 리서치 인스티튜트(WiCell Research Institute))와 같은 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 인간 배아 생식 세포의 확립된 주가 있다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 다수의 만능성 관련 전사 인자들, 예를 들어 OCT4, NANOG, Sox2, KLF4, 및 ZFP42의 강제 발현을 사용하여 성체 체세포로부터 유래될 수 있는 유도성 만능 세포(IPS: inducible pluripotent cell) 또는 재프로그래밍된 만능 세포 또한 적합하다(문헌[Annu Rev Genomics Hum Genet 2011, 12:165-185]). 본 발명의 방법에서 사용되는 인간 배아 줄기 세포는 또한 톰슨(Thomson) 등에 의해 기재된 바와 같이 제조될 수 있다(미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science, 1998, 282:1145-1147]; 문헌[Curr Top Dev Biol 1998, 38:133-165]; 문헌[Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1995, 92:7844-7848]).
만능 줄기 세포로부터의 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어, ABCG2, 크립토(cripto), FOXD3, 커넥신(CONNEXIN)43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81 중 하나 이상의 발현을 포함한다.
본 발명에 사용하기에 적절한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9(NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1(NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7(NIH 코드: WA07) 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002(스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 또한, 만능 세포의 특징적인 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적절하다: ABCG2, 크립토, CD9, FOXD3, 커넥신43, 커넥신45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, 및 Tra 1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이며, 여기서 PDX-1 및 NKX6.1의 발현은 CDX2 및 SOX2의 발현보다 사실상 더 높다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, 뉴로D, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2, 및 PAX6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 하나 이상을 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 췌장 내분비 세포는 세포 계통의 특징적인 마커를 발현시키는 세포이다. 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1 및 하기 전사 인자 중 하나 이상을 발현시킨다: NKX2.2, NKX6.1, 뉴로D, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4, 및 PAX6. 본 발명의 일 태양에서, 세포 계통의 특징적인 마커를 발현시키는 세포는 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 에프린 A4 또는 에프린 A3을 포함하는 배지 내에서 제5기 세포의 개체군을 배양함으로써 인슐린 및 NKX6.1의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서는, 세포의 개체군에서 인슐린 및 NKX6.1의 발현이, 처리되지 않은 세포의 개체군에서의 인슐린 및 NKX6.1의 발현의 2배 이상으로 향상된다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포의 개체군은 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포의 개체군은 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 액티빈 A 또는 액티빈 C를 포함하는 배지 내에서 제5기 세포를 배양하는 단계에 의해 인슐린, 글루카곤, 및 그렐린의 발현을 억제하는 중에 소마토스타틴의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 처리된 세포의 개체군은 처리되지 않은 배양물의 2배 이상의 소마토스타틴을 발현시킨다. 일부 실시 형태에서, 인슐린의 발현은 처리되지 않은 배양물에서의 인슐린의 발현의 약 절반으로 억제된다. 일부 실시 형태에서, 글루카곤의 발현은 처리되지 않은 배양물에서의 글루카곤의 발현의 약 1/10로 억제된다. 일부 실시 형태에서, 그렐린의 발현은 처리되지 않은 배양물에서의 그렐린의 발현의 약 1/3로 억제된다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 제5기 세포를 처리함으로써 NKX6.1의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 처리된 세포의 개체군은 처리되지 않은 배양물의 2배 이상의 NKX6.1을 발현시킨다. 일부 실시 형태에서, 처리되지 않은 배양물에 비교하여, 처리된 배양물에서 호르몬의 발현 수준은 영향을 받지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일부 실시 형태에서 본 발명은, 에프린 A4, 에프린 A3, 액티빈 A, 액티빈 C, 세마포린 3a, 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 제5기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 만능 세포를 분화시키는 단계적 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 에프린 A4 또는 에프린 A3을 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 액티빈 A 또는 액티빈 C를 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 세마포린 3a, 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 인간 배아 만능 줄기 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 췌장 내배엽 세포를 에프린 리간드와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 인슐린 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 에프린 리간드는 에프린 A3 및 에프린 A4로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포를 에프린 리간드와 함께 배양하는 단계는 인슐린 및 NKX6.1의 발현을 향상시킨다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포를 에프린 리간드와 함께 배양하는 단계는 췌장 내배엽 세포에서의 인슐린 및 NKX6.1의 발현을 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포에서의 인슐린 및 NKX6.1의 발현의 2배 이상으로 향상시킨다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 만능 줄기 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 만능 줄기 세포는 인간 배아 만능 줄기 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 제조된 인슐린 및 NKX6.1-발현 세포에 관한 것이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 췌장 내배엽 세포를 스핑고신-1 수용체 작용제와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 내분비 클러스터 형성을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 만능 줄기 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 인간 배아 만능 줄기 세포이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.
실시예
실시예 1
인슐린 발현의 강력한 유도자로서의 에프린A4의 동정
인간 ES 세포의 분화로부터의 췌장 내배엽/내분비 배양물의 생성에 대한 다양한 단백질의 역할을 이해하기 위하여 본 실시예를 실행하였다.
인간 배아 줄기 세포주 H1(hESC H1, 계대 40)의 세포를 10 μM의 Y27632(록 저해제(Rock inhibitor), 카탈로그 번호 Y0503, 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마알드리치(SigmaAldrich))로 보충된 mTeSR(등록상표)1 배지(캐나다 밴쿠버 소재의 스템셀 테크놀로지스) 중에 단일 세포로서 1 × 105 세포/㎠로 마트리겔(MATRIGEL)(상표)(1:30 희석액; 뉴저지주 소재의 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))-코팅된 접시 상에 접종하였다. 접종 후 48시간에, 배양물을 불완전 PBS(Mg 또는 Ca가 없는 포스페이트 완충 식염수) 중에 세척하였다. 배양물을 하기와 같이 췌장 내배엽/내분비 계통으로 분화시켰다:
a) 제1기(완성 내배엽(DE) - 3일): 세포를 하기의 제1기용 배지에서 1일 동안 배양하였다: 0.1%의 무지방산 BSA(카탈로그 번호 68700, 아이오와주 엔케니 소재의 프롤리언트(Proliant)), 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨(카탈로그 번호 S3187, 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마알드리치), 1X 글루타맥스(GlutaMax)(상표)(인비트로젠(Invitrogen) 카탈로그 번호 35050-079), 4.5 mM의 D-글루코스(시그마알드리치 카탈로그 번호 G8769), 100 ng/mL의 GDF8(미네소타주 미니애폴리스 소재의 R&D 시스템즈(R&D Systems)), 및 1 μM의 MCX 화합물(GSK3B 저해제, 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로 [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온, 미국 특허 출원 공개 제2010-0015711호; 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨)로 보충된 MCDB-131 배지(카탈로그 번호 10372-019, 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로젠). 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 0.1 μM의 MCX 화합물로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다.
b) 제2기(원시 장관 - 2일): 0.1%의 무지방산 BSA; 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨; 1X 글루타맥스(상표); 4.5 mM의 D-글루코스; 0.25 mM의 아스코르브산(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma)), 및 25 ng/mL의 FGF7(미네소타주 미니애폴리스 소재의 R & D 시스템즈)로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
c) 제3기(전장 - 2일): ITS-X(인비트로젠)의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마); 10 ng/mL의 액티빈-A(R & D 시스템즈); 1 μM의 레틴산(RA; 시그마); 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산; 200 nM의 TPB(PKC 활성화제; 카탈로그 번호 565740; 뉴저지주 깁스타운 소재의 EMD 케미칼스(EMD Chemicals)); 10 μM의 포르스콜린(FSK, 시그마), 및 100 nM의 LDN(BMP 수용체 저해제; 카탈로그 번호 04-0019; 캘리포니아주 샌디에고 소재의 스템젠트)로 보충된 MCDB-131 배지로 제1일 동안 세포를 처리하였다. 제2일에, ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 10 ng/mL의 액티빈 A; 1 μM의 RA; 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산, 200 nM의 TPB, 10 μM의 포르스콜린, 및 10 nM의 LDN으로 보충된 MCDB-131 배지로 세포를 처리하였다.
d) 제4기(췌장 전장 전구체 - 2일); ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 50 nM의 LDN-193189; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산; 및 100 nM의 TPB로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
e) 제5기(췌장 내배엽/내분비 - 3일): ITS-X의 1:200 희석액; 20 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산으로 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제4기 세포를 처리하였으며, 제2일 내지 제3일에만 100 nM의 ALk5 저해제 SD-208(문헌[Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161]에 개시됨)을 첨가하였다.
제5기의 제1일에, 하기 표 I에 열거된 인자를 배지 내에 스파이킹(spiking)하고, S5의 완료시에(제5기의 제3일) 관련 췌장 내배엽/내분비 유전자의 PCR 분석을 위해 mRNA를 수집하였다. 대조군으로서, 상기 열거된 S5 배지로만 배양물을 처리하였다. RNeasy 미니 키트(RNeasy Mini Kit)(캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠(Qiagen))로 총 RNA를 추출하고; 제조자의 지침에 따라 고용량 cDNA 역전사 키트(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 역전사하였다. 커스텀 택맨 어레이(custom Taqman Array)(어플라이드 바이오시스템즈) 상에 사전-로딩된 택맨 유니버설 마스터 믹스(Taqman Universal Master Mix) 및 택맨 유전자 발현 어세이(Taqman Gene Expression Assay)를 사용하여 cDNA를 증폭하였다. 서열 검출 소프트웨어(Sequence Detection Software)(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 데이터를 분석하고 ΔΔCt 방법을 사용하여 미분화 인간 배아 줄기(hES) 세포에 대해 표준화하였다. 모든 프라이머는 어플라이드 바이오시스템즈로부터 구매하였다.
[표 I]
Figure 112021087068051-pat00001
Figure 112021087068051-pat00002
도 1a 내지 도 1g는, 실시예 1에 약술된 바와 같이, 그리고 표 I에 열거된 인자들의 존재 하에, 제5기로 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 내에서의 하기 유전자의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 도시한다: 인슐린(도 1a), 소마토스타틴(도 1b), 그렐린(도 1c), 글루카곤(도 1d), PDX-1(도 1e), NKX6.1(도 1f), 및 NGN3(도 1g).
도 1에 나타낸 바와 같이, 에프린-A4는 대조군 배양물에 비교하여 NKX6.1 및 인슐린의 mRNA 발현을 향상시킨 반면에(도 1f) PDX-1(도 1e) 및 NGN3 발현(도 1g)에 대해서는 최소의 영향을 나타냈다. 액티빈-A 및 액티빈―C와 같은 인자는 소마토스타틴(도 1b)의 발현을 유의하게 향상시킨 반면에 인슐린(도 1a), 글루카곤(도 1d), 및 그렐린(도 1c)의 발현은 억제했다. 더욱이, 처리되지 않은 배양물에 비교하여 세마포린 3a 및 에피겐과 같은 인자는 NKX6.1 발현을 향상시킨 반면에 호르몬의 발현에는 영향을 미치지 않았다. 도 1에서, 대조군 배양물 내의 상이한 마커의 평균 발현 수준은 그래프 상의 점선에 의해 나타낸다.
실시예 2
S5에서의 인슐린 발현에 대한 에프린의 효과의 확인
본 실시예는 실시예 1에서 동정된 성과(hit)의 확인을 기재한다. 특히, 하기 열거된 프로토콜에서 S5에서의 에프린-A3 또는 에프린-A4의 첨가의 효과이다.
인간 배아 줄기 세포주 H1(hESC H1, 계대 40)의 세포를 10 μM의 Y27632로 보충된 mTeSR(등록상표)1 배지 중에 단일 세포로서 1 × 105 세포/㎠로 마트리겔(상표)(1:30 희석액; 뉴저지주 소재의 BD 바이오사이언시즈)-코팅된 접시 상에 접종하였다. 접종 후 48시간에, 배양물을 불완전 PBS(Mg 또는 Ca가 없는 포스페이트 완충 식염수) 중에 세척하였다. 배양물을 하기와 같이 췌장 내배엽/내분비 계통으로 분화시켰다:
a) 제1기(완성 내배엽(DE) - 3일): 제1기 배지(상기 실시예 1 참조) 내에서 1 일 동안 세포를 배양하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 0.1 μM의 MCX 화합물로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다.
b) 제2기(원시 장관 - 2일): 0.1%의 무지방산 BSA; 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨; 1X 글루타맥스(상표); 4.5 mM의 D-글루코스; 0.25 mM의 아스코르브산(미주리주 소재의 시그마) 및 25 ng/mL의 FGF7(미네소타주 소재의 R & D 시스템즈)로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
c) 제3기(전장 - 2일): ITS-X(캘리포니아주 소재의 인비트로젠)의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1(미주리주 소재의 시그마); 10 ng/mL의 액티빈-A(미네소타주 소재의 R& D 시스템즈); 1 μM의 RA(미주리주 소재의 시그마); 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산; 200 nM의 TPB(PKC 활성화제; 카탈로그 번호 565740; 뉴저지주 깁스타운 소재의 EMD 케미칼스); 10 μM의 포르스콜린 및 100 nM의 LDN(BMP 수용체 저해제; 카탈로그 번호 04-0019; 스템젠트)으로 보충된 MCDB-131 배지로 제1일 동안 세포를 처리하였다. 제2일에, ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 10 ng/mL의 액티빈-A; 1 μM의 RA; 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산, 200 nM의 TPB, 10 μM의 포르스콜린, 및 10 nM의 LDN으로 보충된 MCDB-131 배지로 세포를 처리하였다.
d) 제4기(췌장 전장 전구체 - 2일): ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 50 nM의 LDN-193189; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산; 및 100 nM의 TPB로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
e) 제5기(췌장 내배엽/내분비 - 3일): ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산; 100 nM의 ALk5 저해제(제2일 내지 제3일에만)(문헌[Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161]에 개시된 SD-208) 및 +/- 0-100 ng/mL의 에프린-A3 또는 에프린-A4(미네소타주 소재의 R & D 시스템즈)로 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제4기 세포를 처리하였다.
제5기의 종료점에, 대조군 및 에프린-처리 배양물을 고정시키고 인슐린 단백질 발현에 대해 염색하였다(메사추세츠주 캠브리지 소재의 밀리포어(Millipore)로부터의 기니아 피그 항-인슐린 항체를 사용함). 도 2는 인슐린에 대해 면역염색한 세포의 영상을 도시한다. 도 2a, 대조군 세포; 도 2b, 50 ng/mL 에프린 A3으로 처리된 세포; 도 2c, 100 ng/mL 에프린 A3으로 처리된 세포. 도 3은 인슐린에 대해 면역염색한 세포의 영상을 도시한다. 도 3a, 대조군 세포; 도 3b, 50 ng/mL 에프린 A4로 처리된 세포; 도 3c, 100 ng/mL 에프린 A4로 처리된 세포. 이들 데이터는, 실시예 1로부터의 데이터와 일관되게, 제5기에서의 에프린-A3 및 에프린―A4 양자 모두의 첨가가 인슐린의 단백질 발현을 유의하게 향상시켰음을 나타낸다.
실시예 3
S6에서의 스핑고신-1-포스페이트의 첨가는 내분비 호르몬을 함유하는 세포 클러스터의 형성을 유의하게 가속시킨다.
본 실시예는, 제6기에서의 내분비 클러스터 형성의 진행, 및 내분비 풍부 클러스터(endocrine rich cluster)의 형성을 가속시킴에 있어서 스핑고신-1-포스페이트의 효과를 기재한다.
인간 배아 줄기 세포주 H1(hESC H1, 계대 40)의 세포를 10 μM의 Y27632로 보충된 mTeSR(등록상표)1 배지(캐나다 밴쿠버 소재의 스템셀 테크놀로지스) 중에 단일 세포로서 1 × 105 세포/㎠로 마트리겔(상표)(1:30 희석액; 뉴저지주 소재의 BD 바이오사이언시즈) 코팅된 접시 상에 접종하였다. 접종 후 48시간에, 배양물을 불완전 PBS(Mg 또는 Ca가 없는 포스페이트 완충 식염수) 중에 세척하였다. 배양물을 하기와 같이 췌장 내배엽/내분비 계통으로 분화시켰다:
a) 제1기(완성 내배엽(DE) - 3일): 제1기 배지(상기 실시예 1 참조) 내에서 1 일 동안 세포를 배양하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 0.1 μM의 MCX 화합물로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다.
b) 제2기(원시 장관 - 2일): 0.1%의 무지방산 BSA; 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨; 1X 글루타맥스(상표); 4.5 mM의 D-글루코스; 0.25 mM의 아스코르브산(미주리주 소재의 시그마) 및 25 ng/mL의 FGF7(미네소타주 소재의 R & D 시스템즈)로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
c) 제3기(전장 - 2일): ITS-X(캘리포니아주 소재의 인비트로젠)의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1(미주리주 소재의 시그마); 10 ng/mL의 액티빈-A(미네소타주 소재의 R& D 시스템즈); 1 μM의 RA(미주리주 소재의 시그마); 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산; 200 nM의 TPB(PKC 활성화제; 카탈로그 번호 565740; 뉴저지주 깁스타운 소재의 EMD 케미칼스); 10 μM 포르스콜린(FSK, 미주리주 소재의 시그마), 및 100 nM의 LDN(BMP 수용체 저해제; 카탈로그 번호 04-0019; 캘리포니아주 소재의 스템젠트)으로 보충된 MCDB-131 배지로 제1일 동안 세포를 처리하였다. 제2일에, ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 10 ng/mL의 액티빈-A; 1 μM의 RA; 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산, 200 nM의 TPB, 및 10 nM의 LDN으로 보충된 MCDB-131 배지로 세포를 처리하였다.
d) 제4기(췌장 전장 전구체 - 2일); ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 50 nM의 LDN-193189; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산; 2 ng/mL의 FGF7; 1 ng/mL의 AA; 및 100 nM의 TPB로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
e) 제5기(췌장 내배엽/내분비 - 3일): ITS-X의 1:200 희석액; 15 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산; 및 1 ng/mL의 FGF7로 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제4기 세포를 처리하였으며; 제2일 내지 제3일에만 100 nM의 ALK5 저해제 SD-208을 첨가하였다.
f) 제6기(췌장 내분비 - 3 내지 10일): ITS-X의 1:200 희석액; 15 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 0.25 mM의 아스코르브산으로 보충된 MCDB-131 배지로 3 내지 10일 동안 제5기 세포를 처리하였다. 일부 배양에서는 10 μM의 스핑고신-1-포스페이트(미주리주 소재의 시그마)를 3일 동안 첨가하였다.
도 4a 내지 도 4d는, 스핑고신-1-포스페이트(S1P)로 처리하고 제1일(도 4a), 제7일(도 4b), 및 2가지의 상이한 배율로 제10일(도 4c 및 도 4d)에 영상화한 세포의 S6 배양물의 위상차 영상을 도시한다. 상기 영상들은, 제7일에 내분비 세포의 클러스터링의 명확한 증거가 있었고, 제10일에 췌장 내배엽 상피의 박층에 의해 클러스터들이 서로 분리되었음을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는, Hb9(도 5a) 및 NKX6.1(도 5b)에 대해 면역염색하거나, 인슐린(도 5c) 및 Hb9(도 5d)에 대해 면역염색한 세포의 영상을 도시한다. 도 5a 및 도 5b는, 내분비 클러스터에는 Hb9가 강화된 반면에 클러스터를 둘러싸는 췌장 상피에는 NKX6.1이 강화되었음을 나타낸다. Hb9-강화 클러스터 내의 세포 중 일부는 또한 NKX6.1에 대해서 양성이었다. 도 5c 및 도 5d에 나타낸 바와 같이 클러스터는 인슐린 및 Hb9에 대해 강화되었다. 이러한 형태학적 변화는, NKX6.1+ PDX-1+ 풍부 상피가 내분비 클러스터를 생기게 하는 췌장 발생과 매우 유사하다. 각각의 경우에, 세포의 동일한 시야(field)로부터 상이한 필터를 사용하여 영상의 쌍을 얻었다.
도 6a 및 도 6b는, 10 μM의 스핑고신-1-포스페이트(S1P)로 처리하고 제6기의 시작으로부터 3일 후에 수확한 세포의 상이한 배율에서의 위상차 영상을 도시한다. 이들 영상은, 제6기의 시작으로부터 단 3일 후에 내분비 클러스터가 생겼음을 나타낸다. 이는 대조군 배양물 내의 클러스터의 형성보다 약 7일 더 이르다.
도 6c 및 도 6d는, NKX2.2에 대해 면역염색한 대조군 세포(도 6c) 및 S1P로 처리된 세포(도 6d)의 영상을 도시한다. NKX2.2+ 세포가 배양물 전체에 걸쳐 균일하게 분포된 대조군 배양물(도 6d)에 비교하여, S1P-처리 배양물에서 내분비 클러스터는 또한 NKX2.2+ 세포에 대해 강화되었다(도 6c).

Claims (9)

  1. 시험관내(in vitro) 세포 배양물(cell culture)로서,
    배양 배지 및 세포 집단을 포함하며,
    상기 배양 배지는 인슐린 및 NKX6.1의 발현을 향상시키기에 유효한 양의 에프린 리간드로 보충된 것이고,
    상기 세포 집단은 췌장 내배엽 세포 및 췌장 내분비 전구 세포를 포함하며,
    상기 세포 집단은 인슐린 및 NKX6.1을 발현시키고,
    상기 세포 집단은 상기 에프린 리간드로 보충된 배양 배지를 사용하여 상기 췌장 내배엽 세포를 배양함으로써 얻어지며,
    상기 에프린 리간드로 보충된 배양 배지 내에서의 상기 췌장 내배엽 세포의 배양은 그 췌장 내배엽 세포에서의 인슐린 및 NKX6.1의 발현을, 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포에서의 인슐린 및 NKX6.1의 발현 대비 적어도 2배로 향상시키고,
    상기 에프린 리간드가 에프린 A3 또는 에프린 A4이고,
    상기 췌장 내배엽 세포는 만능 줄기 세포의 단계적 시험관내 분화에 의해 얻어진 것인,
    시험관내 세포 배양물.
  2. 제1항에 있어서, 에프린 리간드가 에프린 A4인, 시험관내 세포 배양물.
  3. 제1항에 있어서, L-알라닐-L-글루타민을 더 포함하는, 시험관내 세포 배양물.
  4. 제3항에 있어서, 에프린 리간드가 에프린 A3인, 시험관내 세포 배양물.
  5. 제3항에 있어서, 에프린 리간드가 에프린 A4인, 시험관내 세포 배양물.
  6. 제1항에 있어서, SANT-1을 더 포함하는, 시험관내 세포 배양물.
  7. 제6항에 있어서, 에프린 리간드가 에프린 A3인, 시험관내 세포 배양물.
  8. 제6항에 있어서, 에프린 리간드가 에프린 A4인, 시험관내 세포 배양물.
  9. 제6항에 있어서, L-알라닐-L-글루타민을 더 포함하는, 시험관내 세포 배양물.
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