KR102450208B1 - 항-tigit 항체, 항-pvrig 항체 및 이들의 조합 - Google Patents

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Abstract

항-PVRIG 및 항-TIGIT 항체가 제공된다.

Description

항-TIGIT 항체, 항-PVRIG 항체 및 이들의 조합
항-PVRIG 및 항-TIGIT 항체가 제공된다.
순수 T-세포는 생산적으로 활성화되기 위해 항원-제시 세포 (APC)로부터 두 개의 독립적인 신호를 수신해야 한다. 먼저 신호 1은 항원-특이적이며 T 세포 항원 수용체가 APC에서 적절한 항원-MHC 복합체를 만날 때 발생한다. 면역 반응의 운명은 APC-발현된 리간드가 관여하는 T 세포 보조자극 분자를 통해 전달되는 두 번째 항원-비의존성 신호 (신호 2)에 의해 결정된다. 이 두 번째 신호는 자극성 (양성 보조자극) 또는 억제성 (음성 보조자극 또는 보조억제) 중 하나일 수 있다. 보조자극 신호가 없거나 보조억제 신호가 있는 상태에서, T-세포 활성화가 손상되거나 중단되어 항원- 특이적 미반응의 상태를 유도하거나 (T-세포 무반응성이라고 알려짐), T-세포 세포사멸성 죽음을 유도할 수 있다.
보조자극 분자 쌍은 보통 APC 상에서 발현되는 리간드 및 T 세포 상에서 발현되는 이들의 동족 수용체로 구성된다. 보조자극 분자의 프로토타입 리간드/수용체 쌍은 B7/CD28 및 CD40/CD40L이다. B7 패밀리는 구조적으로 관련된 세포-표면 단백질 리간드로 구성되어, 면역 반응에 자극성 또는 억제성 정보를 제공할 수 있다 B7 패밀리의 구성원은 적어도 하나의 가변 또는 불변 면역글로불린 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 구조적으로 관련된다.
양성 및 음성 보조자극 신호는 모두 세포-매개성 면역 반응의 조절에 결정적인 역할을 하며, 이들 신호를 매개하는 분자는 면역조절에 효과적인 표적인 것으로 입증되어 왔다. 이 지식에 기초하여, 보조자극 분자의 표적화를 수반하는 여러 치료법이 개발되어 왔고, 암 환자에서 면역 반응을 켜거나 끄는 것을 차단하여 암의 예방 및 치료에 유용하고, 자가면역 질환 및 염증성 질환, 뿐만 아니라 동종 이식의 거부에서도 통제되지 않은 면역 반응을 끄거나 이들 병리학적 상태를 갖는 대상에서 음성 보조자극 (또는 보조억제)에 의한 "신호 차단"의 유도에 의해 예방 및 치료에 유용한 것으로 확인되었다.
B7 리간드에 의해 전달된 신호의 조작은 자가면역, 염증성 질환 및 이식 거부의 치료에서 잠재력을 보였다. 치료 전략은 리간드 또는 보조자극 쌍의 수용체에 대한 단일클론 항체를 사용하거나, 적절한 리간드에 결합하고 이를 차단할 수 있는 보조자극 수용체로 구성된 용해성 융합 단백질을 사용한 보조자극의 차단을 포함한다. 또 다른 접근법은 저해성 리간드의 용해성 융합 단백질을 사용하는 보조억제의 유도이다. 이들 접근법은 적어도 부분적으로 자가- 또는 동종-반응성 T-세포 (자가면역 질환 또는 이식에서 발병 과정을 각각 책임짐)의 최종 결실에 의존하며, 이는 아마도 보조자극이 없는 경우 (세포 생존 유전자를 유도함) T-세포는 세포사멸의 유도에 매우 민감해지기 때문이다. 따라서, 면역계의 병원체 방어 능력을 손상시키지 않으면서 보조자극 신호를 조절할 수 있는 신규 제제는 이러한 병리학적 상태의 치료 및 예방에 매우 유리하다.
보조자극 경로는 종양 발달에 중요한 역할을 한다. 흥미롭게도, 종양은 항-종양 T-세포 반응을 억제하는 조절 T-세포를 당길뿐만 아니라 B7-CD28 및 TNF 패밀리에서의 보조자극 인자의 억제를 통해 T-세포 활성화를 방해함으로써 면역 파괴를 회피하는 것으로 나타났다 (Wang (2006), "Immune Suppression by Tumor Specific CD4+ Regulatory T cells in Cancer", Semin. Cancer. Biol. 16: 73-79; Greenwald, et al. (2005), "The B7 Family Revisited", Ann. Rev. Immunol. 23: 515-48; Watts (2005), "TNF/TNFR Family Members in Co-stimulation of T Cell Responses", Ann. Rev. Immunol. 23: 23-68; Sadum, et al., (2007) "Immune Signatures of Murine and Human Cancers Reveal Unique Mechanisms of Tumor Escape and New Targets for Cancer Immunotherapy", Clin. Canc. Res. 13(13): 4016-4025). 이러한 종양 발현된 보조자극 분자는 매력적인 암 바이오마커가 되어 왔고, 종양-관련 항원 (TAA)으로서 작용할 수 있다. 또한, 보조자극 경로는 T-세포 의존성 면역 반응을 종양 전이 내의 개시 및 효과기 기능 모두에서 약화시키는 면역학적 체크포인트로서 확인되었다. 조작된 암 백신이 계속적으로 개선되면서, 이러한 면역학적 체크포인트가 치료적 항-종양 반응을 유도하는 백신의 능력에 대한 주요 장애물이라는 것이 명백해지고 있다. 이러한 점에서, 보조자극 분자는 활성 (백신 접종) 및 수동 (항체-매개) 암 면역요법을 위한 아쥬반트로서 작용하여 면역 내성을 훼손시키고 면역계를 자극하는 전략을 제공할 수 있다
지난 10년 동안, 다양한 보조자극 단백질에 대한 작동제 및/또는 길항제가 자가면역 질환, 이식 거부, 알레르기 및 암을 치료하기 위해 개발되어 왔다. 예를 들어, CTLA4-Ig (Abatacept, Orencia®)는 RA의 치료를 위해, 돌연변이된 CTLA4-Ig (Belatacept, Nulojix®)는 급성 신장 이식 거부의 예방을 위해 승인되었고, 최근에는 항-CTLA4 항체 (Ipilimumab, Yervoy®)에 의한 흑색종의 치료를 위해 승인되었다. 머크 (Keytruda®) 및 BMS (Opdivo®)의 항-PD-1 항체와 같은 다른 보조자극 조절제가 승인되어 암 치료를 위해 승인되었으며, 바이러스성 감염 여부에도 마찬가지로 테스트 중이다.
그러나, 항-체크포인트 억제제 항체를 이용한 단일요법이 유망한 것으로 관찰되었던 한편, 많은 연구 (Ahmadzadeh et al., Blood 114: 1537 (2009), Matsuzaki et al., PNAS 107 (17): 7875-7880 (2010), Fourcade et al., Cancer Res. 72 (4): 887-896 (2012) 및 Gros et al., J. Clinical Invest. 124 (5): 2246 (2014))는 종양 침윤성 림프구 (TIL)를 조사하여 TIL이 공통적으로 다중 체크포인트 수용체를 발현하는 것을 보여 주었다. 또한, 다중 체크포인트를 발현하는 TIL이 실제로 종양 반응성이 가장 높은 것 같다. 대조적으로, 말초의 비-종양 반응성 T 세포는 단일 체크포인트를 발현할 가능성이 더 크다. 단일특이적 전장 항체를 이용한 체크포인트 차단은 자가면역 독성에 기여하는 것으로 가정되는 자가 항원-반응성 단일 발현 T-세포 대 종양-반응성 TIL의 탈-억제와 관련하여 구별되지 않는 같다.
관심있는 표적 중 하나는 PVRIG이다. 폴리오바이러스 수용체 관련 면역글로불린 도메인 포함 단백질 Q6DKI7 또는 C7orf15라고도 역시 불리는 PVRIG는 길이가 326개 아미노산의 막통과 도메인 단백질이고, 신호 펩타이드 (아미노산 1번 내지 40번 범위), 세포외 도메인 (아미노산 41번 내지 171번), 막통과 도메인 (아미노산 172번 내지190번) 및 세포질 도메인 (아미노산 191번 내지 326번)을 갖는다. PVRIG는 PVRIG의 결합 파트너인 폴리오바이러스 수용체-관련 2 단백질 (PVLR2, 넥틴-2, CD112 또는 헤르페스 진입 매개인자 B (HVEB)라고도 역시 알려진 인간 혈장 막 당단백질)과 결합한다.
또 다른 관심 표적은 TIGIT이다. TIGIT는 효과기 및 조절 (Treg) CD4+ T-세포, 효과기 CD8+ T-세포 및 NK 세포에서 높게 발현되는 보조억제 수용체이다. TIGIT는 (1) 직접적인 신호전달, (2) 리간드 신호전달의 유도, (3) 보조자극 수용체 CD226 (DNAM-1이라고도 알려짐)에 의한 신호전달과 경쟁 및 이의 교란에 의해 면역 반응을 약화시키는 것으로 관찰되었다. TIGIT 신호전달은 NK 세포에서 가장 잘 연구되어 왔는데, 동종 리간드인 폴리오바이러스 수용체 (PVR, CD155라고도 알려짐)와의 결합은 세포질 ITIM 도메인을 통해 직접적으로 NK 세포 세포독성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. TIGIT 유전자의 녹아웃 (knockout) 또는 TIGIT/PVR 상호작용의 항체 차단은 생체내에서 자가면역 질환을 악화시킬뿐만 아니라 시험관내에서 NK 세포 살상을 증진시키는 것으로 나타났다. T-세포 및 NK 세포에 미치는 직접적인 효과 외에도, TIGIT는 수지상 세포 또는 종양 세포에서 PVR-매개성 신호전달을 유도하여 IL10과 같은 항-염증성 사이토카인의 생산을 증가시킨다. T-세포에서 TIGIT는 또한 보조자극 수용체 CD226의 동종이중합을 교란시키고 PVR에 결합하기 위해 이와 경쟁함으로써 림프구 반응을 억제할 수 있다
TIGIT는 상이한 유형의 종양에 침투하는 종양 침윤성 림프구 (TIL) 및 Treg을 포함하는 림프구에서 높게 발현된다. PVR은 또한 종양에서 광범위하게 발현되며, TIGIT-PVR 신호전달 축이 암에 대한 우세한 면역 탈출 기작일 수 있음을 시사한다. 특히, TIGIT 발현은 또 다른 중요한 보조억제 수용체인 PD1의 발현과 밀접하게 상관되어 있다. TIGIT 및 PD1은 수많은 인간 및 마우스 종양의 TIL 상에서 공동-발현된다. TIGIT 및 CTLA4와는 달리, T-세포 반응의 PD1 억제는 보조자극 수용체와의 리간드 결합에 대한 경쟁을 수반하지 않는다.
따라서, TIGIT는 단일클론 항체 요법을 위한 매력적인 표적이며, 항-PVRIG 항체를 포함한 추가적인 항체와 조합된다.
관련 출원
본 출원은 2016년 8월 17일 출원된 미국 특허 일련번호 62/376,334, 2017년 6월 1일자로 출원된 미국 특허 일련번호 62/513,771, 2016년 8월 17일자로 출원된 미국 특허 일련번호 62/376,335, 2016년 11월 3일 출원된 미국 특허 일련번호 62/417,217 호, 2017년 6월 1일자로 출원된 미국 특허 일련번호 62/513,775, 2017년 3월 28일자로 출원된 미국 특허 일련번호 62/477,974 호, 2017년 6월 1일자로 출원된 미국 특허 일련번호 62/513,916 및 2017년 7월 28일자로 출원된 미국 특허 일련번호 62/538,561에 대한 우선권을 주장하고, 이들 모두는 본 명세서에서 그들의 전문이 참고문헌으로 통합된다.
서열 목록
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따라서, 일 관점에서, 본 발명은 서열번호 160을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 165를 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 인간 TIGIT (서열번호 97)에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 항원-결합 도메인은 서열번호 150을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 155를 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 또한, 항원-결합 도메인은 서열번호 560을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 565를 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.
추가의 관점에서, 본 발명은 VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 중쇄로서, 상기 VH가 서열번호 160을 포함하는 중쇄 및 VL-VC를 포함하는 경쇄로서 상기 VL이 서열번호 165을 포함하고 VC가 카파 또는 람다인 경쇄를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 중쇄로서, 상기 VH가 서열번호 150을 포함하는 중쇄 및 VL-VC를 포함하는 경쇄로서 상기 VL이 서열번호 159를 포함하고 VC가 카파 또는 람다인 경쇄를 포함할 수 있다. 추가적으로, 본 발명은 VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 중쇄로서, 상기 VH가 서열번호 560을 포함하는 중쇄 및 VL-VC를 포함하는 경쇄로서 상기 VL이 서열번호 565를 포함하고 VC가 카파 또는 람다인 경쇄를 포함할 수 있다.
일부 관점에서, CH1-힌지-CH2-CH3의 서열은 인간 IgG1, IgG2, IgG4 및 이의 변이체로부터 선택된다. 일부 관점에서, 중쇄는 서열번호 164를 가지고, 경쇄는 서열번호 169를 갖는다.
추가적인 관점에서, 상기 조성물은 인간 PD-1 또는 인간 PVRIG일 수 있는 인간 체크포인트 수용체 단백질에 결합하는 제 2 항체를 추가로 포함할 수 있다. 제 2 항체는 서열번호 5를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 10을 포함하는 가변 경쇄 도메인 또는 서열번호 9를 갖는 중쇄 및 서열번호 14를 갖는 경쇄을 포함하는 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다.
추가의 관점에서, 본 발명은 서열번호 160을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 인코딩하는 제 1 핵산 및 서열번호 165를 포함하는 가변 경쇄 도메인을 인코딩하는 제 2 핵산을 포함하는 핵산 조성물을 제공한다. 대안적으로, 상기 핵산 조성물은 서열번호 150을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 인코딩하는 제 1 핵산 및 서열번호 155를 포함하는 가변 경쇄 도메인을 인코딩하는 제 2 핵산을 포함한다. 대안적으로, 상기 핵산 조성물은 서열번호 560을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 인코딩하는 제 1 핵산 및 서열번호 565를 포함하는 가변 경쇄 도메인을 인코딩하는 제 2 핵산을 포함한다.
추가의 관점에서, 본 발명은 제 1 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터 및 제 2 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터 또는 대안적으로 제 1 및 제 2 핵산 모두를 포함하는 발현 벡터와 같은 이들 핵산 조성물을 포함하는 발현 벡터 조성물을 또한 제공한다.
추가적인 관점에서, 본 발명은 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포 및 숙주 세포를 항체가 생산되는 조건 하에서 배양하여 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
추가의 관점에서, 본 발명은 서열번호 9를 갖는 중쇄 및 서열번호 14를 갖는 경쇄를 포함하는 항-PVRIG 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 서열번호 19를 갖는 중쇄 및 서열번호 24를 갖는 경쇄를 가지는 항체를 제공한다.
추가적인 관점에서, 항-VRPG 항체 (CHA.7.518.1.H4 (S241P) 또는 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 중 어느 하나는 인간 체크포인트 수용체 단백질에 결합하는 제 2 항체와 함께 투여되며, PD-1에 결합하는 항체와 같은
추가의 관점에서, 항-PVRIG 항체 (CHA.7.518.1.H4 (S241P) 또는 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P))는 CPA.9.086 또는 CPA.9.083 또는 CHA.9.547.13와 같은 인간 TIGIT와 결합하는 항체와 같은 인간 체크포인트 수용체 단백질에 결합하는 제 2 항체와 함께 공동-투여된다.
추가의 관점에서, 본 발명은 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 또는 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 둘 중 하나의 중쇄를 인코딩하는 제 1 핵산 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 또는 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 둘 중 하나의 경쇄를 인코딩하는 제 2 핵산을 포함하는 핵산 조성물을 제공한다.
추가의 관점에서, 본 발명은 제 1 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터 및 제 2 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터 또는 대안적으로 제 1 및 제 2 핵산 모두를 포함하는 발현 벡터와 같은 이들 핵산 조성물을 포함하는 발현 벡터 조성물을 또한 제공한다.
추가적인 관점에서, 본 발명은 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포 및 숙주 세포를 항체가 생산되는 조건 하에서 배양하여 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 a) 환자로부터의 종양 시료로부터 세포 집단을 제공하는 단계; b) 상기 집단을 i) TIGIT 단백질; ii) PVR 단백질; iii) PD-1 단백질; iv) PD-L1 단백질; 및 v) 이소형 대조군과 결합하는 표지된 항체로 염색하는 단계; c) 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 전개하는 단계; d) 상기 TIGIT, PVR, PD-1 및 PD-L1 각각에 대해, 상기 이소형 대조군 항체에 대비한 상기 단백질을 발현하는 집단 내의 세포의 백분율을 결정하는 단계; 양성 세포의 백분율이 4가지 수용체 모두에 대해 > 1%인 경우, e) 상기 환자에게 TIGIT 및 PD-1에 대한 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 a) 환자로부터의 종양 시료로부터 세포 집단을 제공하는 단계; b) 상기 집단을 i) PVRIG 단백질; ii) PVRL2 단백질; iii) PD-1 단백질; iv) PD-L1 단백질; 및 v) 이소형 대조군과 결합하는 표지된 항체로 염색하는 단계; c) 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 전개하는 단계; d) 상기 PVRIG, PVRL2, PD-1 및 PD-L1 각각에 대해, 상기 이소형 대조군 항체에 대비한 상기 단백질을 발현하는 집단 내의 세포의 백분율을 결정하는 단계; 양성 세포의 백분율이 4가지 수용체 모두에 대해 > 1%인 경우, e) 상기 환자에게 PVRIG 및 PD-1에 대한 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
추가의 관점에서, 본 발명은 a) 환자로부터의 종양 시료로부터 세포 집단을 제공하는 단계; b) 상기 집단을 i) PVRIG 단백질; ii) PVRL2 단백질; iii) TIGIT 단백질; iv) PVR 단백질; 및 v) 이소형 대조군과 결합하는 표지된 항체로 염색하는 단계; c) 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 전개하는 단계; d) 상기 PVRIG, PVRL2, TIGIT 및 PVR 각각에 대해, 상기 이소형 대조군 항체에 대비한 상기 단백질을 발현하는 집단 내의 세포의 백분율을 결정하는 단계; 양성 세포의 백분율이 4가지 수용체 모두에 대해 > 1%인 경우, e) 상기 환자에게 PVRIG 및 TIGIT에 대한 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
A. 개요
본 발명은 암 치료를 위해 단독으로 또는 조합하여 사용하기 위한 다수의 유용한 항체를 제공한다. 암은 환자가 암성 세포를 인식하고 제거할 수 없는 것으로 간주될 수 있다 많은 경우, 이들 형질전환된 (예로, 암성) 세포는 면역 감시를 방해한다. 미억제된 T-세포 활성을 예방하기 위해 신체의 T-세포 활성화를 제한하는 자연적인 제어 기작이 있고, 이는 암성 세포가 면역 반응을 회피하거나 억제하는 데 사용될 수 있다. 면역 효과기 세포 - 특히 T 세포의 암을 인식하고 제거하는 능력을 회복시키는 것이 면역요법의 목표이다. 때로 "면역요법"이라고도 지칭되는 면역종양학 분야는 Yervoy, Keytruda 및 Opdivo와 같은 T-세포 체크포인트 억제성 항체의 최근 승인으로 신속하게 진화하고 있다 이들 항체는 T-세포 면역의 정상적인 음성 조절인자를 차단하기 때문에 일반적으로 "체크포인트 억제제"라고 지칭한다. 최적의 항원-특이적 면역 반응을 조율하기 위해 보조자극 및 공동억제의 다양한 면역조절 신호가 사용될 수 있는 것으로 일반적으로 이해된다. 일반적으로, 이들 항체는 CTLA-4 또는 PD-1과 같은 체크포인트 억제제 단백질에 결합하는데, 이는 정상적인 환경 하에서 세포독성 T-세포 (CTL)의 활성화를 예방하거나 억제한다. 예를 들어, 이들 단백질에 결합하는 항체의 사용을 통해 체크포인트 단백질을 억제함으로써, 종양에 대한 증가된 T-세포 반응을 달성할 수 있다. 즉, 이러한 암 체크포인트 단백질은 면역 반응을 억제하고; 예를 들어 체크포인트 단백질에 대한 항체를 사용하여 단백질이 차단될 때 면역계가 활성화되어 면역 자극을 유발하여 암 및 전염병과 같은 병태를 치료한다.
본 발명은 추가적인 체크포인트 단백질인 PVRIG 및 TIGIT에 대한 항체의 용도에 관한 것이다. PVRIG는 NK 및 T-세포의 세포 표면 상에 발현되고, 다른 기지의 면역 체크포인트과 여러 유사점을 공유한다. PVRIG가 체크포인트 수용체임을 나타내는 데 사용된 식별 및 방법은 본원에 참고문헌으로 명시적으로 통합되는 국제특허출원 WO2016/134333에서 논의된다. PVLR2의 상호작용 및/또는 결합을 차단하는 인간 PVRIG에 대한 항체가 본 명세서에서 제공된다. PVRIG가 그의 리간드 (PVRL2)에 결합될 때, 표적 세포에 대한 NK 및 T-세포의 면역 반응을 약화시키도록 작용하는 억제 신호가 유도된다 (예로, PD-1/PDL1과 유사함). PVRIG에 대한 PVRL2의 결합을 차단함으로써 PVRIG의 억제 신호를 차단하고 결과적으로 NK 및 T-세포의 면역 반응을 조절한다. PVRL2에 대한 결합을 차단하는 PVRIG에 대한 항체를 이용하는 것은 NK 및 T-세포에 의한 암 세포의 살상을 증진시키는 치료적 접근법이다. PVRIG와 결합하고 그의 리간드인 PVRL2의 결합을 차단하는 차단 항체가 생성되었다. PD-1과 같은 다른 체크포인트 억제제 항체와 조합으로 항-PVRIG 항체가 제공된다.
유사하게, TIGIT는 또한 체크포인트 수용체의 특성을 갖는 것으로 나타났으며, 본 발명은 TIGIT와 PVR의 상호작용 및/또는 결합을 차단하는 항-TIGIT 항체를 제공한다. TIGIT가 그의 리간드 (PVR)에 결합될 때, 표적 세포에 대한 NK 및 T-세포의 면역 반응을 약화시키도록 작용하는 억제 신호가 유도된다 (즉, PD-1/PDL1과 유사함). TIGIT에 대한 PVR의 결합을 차단함으로써 TIGIT의 억제 신호를 차단하고 결과적으로 NK 및 T-세포의 면역 반응을 조절한다. PVR에 대한 결합을 차단하는 TIGIT에 대한 항체를 이용하는 것은 NK 및 T-세포에 의한 암 세포의 살상을 증진시키는 치료적 접근법이다. TIGIT와 결합하고 그의 리간드인 PVR의 결합을 차단하는 차단 항체가 생성되었다. PD-1과 같은 다른 체크포인트 억제제 항체와 조합으로 항-TIGIT 항체가 제공된다.
또한, 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 항-PVRIG 및 항-TIGIT 항체의 조합을 제공한다.
B. 정의
본 출원을 더 완벽하게 이해할 수 있도록 몇 가지 정의가 하기에 설명되어 있다 이러한 정의는 문법적 등가물을 포함하는 의미이다.
본원에서 "절제"는 활성의 감소 또는 제거를 의미한다. 일부 구현예에서, 항체의 불변 도메인으로부터 활성을 제거하는 것이 유용하다. 따라서, 예를 들어, "FcγR 결합을 제거하는"은 특정 변이체를 포함하지 않는 Fc 영역과 비교하여 Fc 영역 아미노산 변이체가 50% 이하의 시작 결합을 가지며, 70-80-90-95-98 % 이하의 활성 손실이 바람직하고, 일반적으로 활성은 비아코아 검정에서 검출가능한 결합 수준 미만이다. 도 50에 도시된 바와 같이, IgG1 불변 영역의 하나의 절제 변이체는 N297A 변이체인데, 이는 미가공 글리코실화 부위를 제거하고 FcγRIIIa 결합을 유의하게 감소시켜 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 감소시킨다.
"항원-결합 도메인" 또는 "ABD"은 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 폴리펩타이드 서열의 일부로서 존재할 때, 특이적으로 표적 항원에 결합하는 여섯 개의 CDR (Complementary Determining Regions)의 집합을 의미한다. 따라서, "TIGIT 항원-결합 도메인"은 본 명세서에서 개략된 바와 같이 TIGIT 항원 (도 51에 나타낸 서열)에 결합한다. 유사하게, "PVRIG 항체 결합 도메인"은 본 명세서에서 개략된 바와 같이 PVRIG 항원 (도 1에 나타낸 서열)에 결합한다. 공지된 바와 같이, 이들의 CDR은 일반적으로 각각이 세 개의 CDR: 중쇄의 경우 vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3 및 경쇄의 경우 vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3을 포함하는 중쇄 CDR (vhCDR 또는 VHCDR)의 제 1 집합 및 경쇄 CDR (vlCDR 또는 VLCDR)의 제 2 집합으로서 존재한다. CDR은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인에 각각 존재하며 다함께 Fv 영역을 형성한다. 따라서, 일부 경우에 항원-결합 도메인의 여섯 개의 CDR은 가변 중쇄 및 가변 경쇄에 기여한다. "Fab" 형식에서, 6개 CDR의 집합은 두 개의 상이한 폴리펩타이드 서열, 가변 중쇄 도메인 (vh 또는 VH; vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3 포함) 및 가변 경쇄 도메인 (vl 또는 VL; vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3 포함)에 기여하고, vh 도메인의 C-말단은 중쇄의 CH1 도메인의 N-말단에 부착되고, vl 도메인의 C-말단은 불변 경쇄 도메인의 N-말단에 부착된다 (따라서 경쇄를 형성함).
본원에서 "변형"은 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실 또는 단백질에 화학적으로 연결된 분체로의 변경을 의미한다. 예를 들어, 변형은 단백질에 부착된 변경된 탄수화물 또는 PEG 구조일 수 있다. 본원에서 "아미노산 변형"은 폴리 펩타이드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 의미한다. 명확하게 하기 위해, 달리 언급하지 않는 한, 아미노산 변형은 항상 DNA에 의해 코딩된 아미노산, 예를 들어 DNA 및 RNA에서 코돈을 갖는 20개의 아미노산으로 이루어진다.
본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모체 폴리펩타이드 서열 내의 특정 위치의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 특히, 일부 구현예에서, 치환은 유기체 내 또는 임의의 유기체에서 자연적으로 발생하지 않는 특정 위치에서 자연적으로 발생하지 않은 아미노산에 대한 것이다. 예를 들어, 치환 N297A는 변이체 폴리펩타이드, 이 경우에는 297번 위치의 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 Fc 변이체를 말한다. 명확하게 하기 위해, 핵산 코딩 서열을 변화시키지만 출발 아미노산을 변화시키지 않도록 조작되었던 단백질 (예를 들어, CGG (아르기닌을 인코딩함)을 CGA (여전히 아르기닌을 인코딩함)와 교환하여 숙주 유기체 발현 수준을 증가시킴)은 "아미노산 치환"이 아니고; 즉, 동일한 단백질을 인코딩하는 새로운 유전자의 생성에도 불구하고, 단백질이 시작하는 특정 위치에서 동일한 아미노산을 갖으면, 이는 아미노산 치환이 아니다.
본원에서 사용된 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모체 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에서 아미노산 서열을 첨가하는 것을 의미한다. 예를 들어, -233E 또는 233E는 233번 위치 이후와 234번 위치 이전의 글루탐산의 삽입을 지정한다. 또한, -233ADE 또는 A233ADE는 위치 233번 이후 및 위치 234번 이전의 AlaAspGlu의 삽입을 지정한다.
본원에서 사용된 "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모체 폴리펩타이드 서열 내의 특정 위치에서 아미노산 서열의 제거를 의미한다. 예를 들어, E233- 또는 E233 #, E233 () 또는 E233del은 233번 위치의 글루탐산의 결실을 지정한다. 또한, EDA233 또는 EDA233#은 233번 위치에서 시작하는 GluAspAla 서열의 결실을 지정한다.
본원에서 사용된 "변이 단백질" 또는 "단백질 변이체" 또는 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모체 단백질과 다른 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 단백질 자체, 단백질을 포함하는 조성물, 또는 이를 인코딩하는 아미노산 서열을 말할 수 있다. 바람직하게, 단백질 변이체는 모체 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형, 예로 모체와 비교하여 약 1 내지 약 70개 아미노산 변형, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개 아미노산 변형을 갖는다. 하기 기술하는 바와 같이, 일부 구현예에서, 모체 폴리펩타이드, 예를 들어 Fc 모체 폴리펩타이드는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 Fc 영역과 같은 인간 야생형 서열이지만, 변이체를 갖는 인간 서열도 "모체 폴리펩타이드"로서 작용할 수 있다. 본원의 단백질 변이체 서열은 바람직하게 모체 단백질 서열과 약 80% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 약 95-98-99 % 동일성을 보유할 것이다. 변이체 단백질은 변이체 단백질 자체, 단백질 변이체를 포함하는 조성물 또는 이를 인코딩하는 DNA 서열을 말할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 "항체 변이체" 또는 "변이체 항체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모체 항체와 상이한 항체를 의미하며, 본원에서 사용되는 "IgG 변이체"또는 "변이체 IgG"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모체 IgG (다시 말하면 많은 경우에 인간 IgG 서열)와 다른 항체를 의미하고, 본원에 사용된 "면역글로불린 변이체" 또는 "변이체 면역글로불린"은 적어도 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모체 면역글로불린과 다른 면역글로불린 서열을 의미한다. 본원에서 사용되는 "Fc 변이체"또는 "변이체 Fc"는 Fc 도메인에서 아미노산 변형을 포함하는 단백질을 의미한다. 본 발명의 Fc 변이체는 이를 구성하는 아미노산 변형에 따라 정의된다. 따라서, 예를 들어 S241P 또는 S228P는 모체 IgG4 힌지 폴리펩타이드과 비교하여 위치 228번에서 치환 프롤린을 갖는 힌지 변이체이고, 번호매김 S228P는 EU 인덱스에 따르고 S241P는 카밧 번호매김이다. EU 인덱스 또는 카밧 또는 EU 번호매김 설계에서와 같은 EU 인덱스는 EU 항체의 번호매김을 말한다 (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85). 변형은 첨가, 결실 또는 치환일 수 있다 치환은 자연 발생 아미노산 및 경우에 따라 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 예로는 모두 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 6,586,207; 국제특허출원 WO 98/48032; WO 03/073238; 미국 특허 US2004-0214988A1; 국제특허출원 WO 05/35727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11: 1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99: 11020-11024; 및 L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "단백질"은 단백질, 폴리펩타이드, 올리고 펩타이드 및 펩타이드를 포함하는 적어도 두 개의 공유 결합된 아미노산을 의미한다. 펩티딜기는 자연 발생 아미노산 및 펩타이드 결합, 또는 합성 펩타이드 모방체 구조, 예로 펩토이드와 같은 "유사체"를 포함한다 (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 Simon et al., PNAS USA 89(20): 9367 (1992) 참조) 아미노산은 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 자연 발생 또는 합성일 수 있다 (예로, DNA에 의해 코딩된 아미노산이 아님). 예를 들어, 호모-페닐알라닌, 시트룰린, 오르니 틴 및 노르에류신은 본 발명의 목적을 위한 합성 아미노산으로 간주되며, D- 및 L- (R 또는 S) 입체구조의 아미노산 모두 사용될 수 있다. 본 발명의 변이체는, 예를 들어 본원에서 모두 전문이 참고문헌으로 통합되는 Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12): 625-30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2): 7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656): 371-3, and Chin et al., 2003, Science 301(5635): 964-7에 의해 기술된 방법을 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 슐츠 연구진에 의해 개발된 기술학을 사용하여 도입된 합성 아미노산의 사용을 포함하는 변형을 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드는 하나 이상의 측쇄 또는 말단의 합성 유도체화, 글리코실화, PEG화, 원형 치환, 고리화, 다른 분자에 대한 링커, 단백질 또는 단백질 도메인에 대한 융합 및 펩타이드 태그 또는 표지의 첨가를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "잔기"는 단백질 내의 위치 및 그의 관련 아미노산 동일성을 의미한다. 예를 들어, 아스파라긴 297 (Asn297 또는 N297이라고도 지칭함)은 인간 항체 IgG1의 297번 위치의 잔기이다.
본원에서 사용되는 "Fab"또는 "Fab 영역"은 VH, CH1, VL 및 CL 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. Fab는 단리된 이 영역 또는 이 영역을 전장 항체 또는 항체 단편의 맥락에서 말할 수 있다.
본원에서 사용되는 바 "Fv" 또는 "Fv 단편" 또는 "FV 영역"은 단일 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 당업자라면 이해할 바와 같이, 이들은 일반적으로 두 개의 사슬로 구성된다.
본원에서의 "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 일반적으로 scFv 또는 scFv 도메인을 형성하기 위해 본원에서 논의된 scFv 링커를 사용하는 가변 경쇄 도메인에 공유 결합된 가변 중쇄 도메인을 의미한다. scFv 도메인은 N-말단부터 C-말단까지 (vh-링커-vl 또는 vl-링커-vh)의 방향일 수 있다 일반적으로, 링커는 당해 기술분야에 일반적으로 공지된 바와 같은 scFv 링커이고, 링커 펩타이드는 우세하게 다음의 아미노산 잔기를 포함한다: Gly, Ser, Ala 또는 Thr. 링커 펩타이드는 원하는 활성을 보유하도록 서로에 대해 정확한 입체구조를 취하는 방식으로 두 분자를 연결하는데 적절한 길이를 가져야 한다. 일 구현예에서, 링커는 약 1 내지 50개의 아미노산 길이이고, 바람직하게는 약 1 내지 30개의 아미노산 길이이다. 일 구현예에서, 1 내지 20개 아미노산 길이의 링커가 사용될 수 있으며, 약 5 내지 약 10개 아미노산이 일부 구현예에서 용도를 찾는다. 유용한 링커는 예를 들어 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n을 포함하는 글리신-세린 중합체를 포함하며, 식 중 n은 적어도 하나 (일반적으로 3 내지 4개) 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 기타 가요성 링커를 포함한다. 대안적으로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 비단백질성 중합체가 링커로서 사용되어 링커로서의 용도를 찾을 수 있다.
본원에서 사용되는 "IgG 서브클래스 변형"또는 "이소형 변형"은 하나의 IgG 이소형의 하나의 아미노산을 상이한 정렬된 IgG 이소형에서 상응하는 아미노산으로 전환시키는 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, IgG1은 EU 위치 296번에서 티로신 및 IgG2은 페닐알라닌을 포함하기 때문에, IgG2에서의 F296Y 치환은 IgG 서브클래스 변형으로 간주된다. 유사하게, IgG1은 241번 위치에 프롤린을 갖고 IgG4는 해당 위치에 세린을 갖기 때문에, S241P를 갖는 IgG4 분자는 IgG 서브클래스 변형으로 간주된다. 서브클래스 변형은 본원에서 아미노산 치환으로 간주되는 점을 주목하라.
본원에서 사용되는 "비-자연 발생 변형"은 이소형이 아닌 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, IgG 중 어느 것도 297번 위치에서 AN 아스파라긴을 포함하지 않기 때문에, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 (또는 이들의 하이브리드)에서의 치환 N297A는 비-자연 발생 변형으로 간주된다.
본원에서 사용된 "아미노산" 및 "아미노산 동일성"은 DNA 및 RNA에 의해 코딩되는 20개의 자연 발생 아미노산 중 하나를 의미한다.
본원에 사용된 "효과기 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용으로부터 유도되는 생화학적 사건을 의미한다. 효과기 기능에는 ADCC, ADCP 및 CDC가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용되는 바 "IgG Fc 리간드"는 IgG 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩타이드를 의미한다. Fc 리간드는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII, FcRn, C1q, C3, 만난 결합 렉틴, 만노스 수용체, 스태필로코커스 단백질 A, 스트렙토코커스 단백질 G 및 바이러스 FcγR을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. Fc 리간드는 또한 FcγR과 상동적인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 상동체 (FcRH)를 포함한다 (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190: 123-136). Fc 리간드는 Fc와 결합하는 발견되지 않은 분자를 포함할 수 있다. 상세한 IgG Fc 리간드는 FcRn 및 Fc 감마 수용체이다. 본원에서 사용된 "Fc 리간드"는 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩타이드를 의미한다.
본원에서 사용된 "모체 폴리펩타이드"는 변이체를 생성하기 위해 후속적으로 변형되는 출발 폴리펩타이드를 의미한다. 모체 폴리펩타이드는 자연 발생 폴리펩타이드, 또는 자연 발생 폴리펩타이드의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다. 모체 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 자체, 모체 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 또는 이를 인코딩하는 아미노산 서열을 말할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 "모체 면역글로불린"은 변이체를 생성하도록 변형된 미변형 면역글로불린 폴리펩타이드를 의미하고, 본원에서 사용되는 "모체 항체"는 변이체 항체를 생성하도록 변형된 미변형된 항체를 의미한다. "모체 항체"는 하기에 개략된 바와 같이 기지의 시판되는 재조합으로 생성된 항체를 포함하는 것을 주목해야 한다.
본원에서 사용되는 "Fc" 또는 "Fc 영역"또는 "Fc 도메인"은 제 1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역, 일부 경우에서 힌지의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서 Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 두 개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 세 개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대한 N-말단의 가요성 힌지를 말한다. IgA 및 IgM의 경우, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc 도메인은 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 (Cγ2 및 Cγ3) 및 Cγ1 (Cγ1) 및 Cγ2 (Cγ2) 사이의 하부 힌지 영역을 포함한다. Fc 영역의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 카복실-말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하도록 정의되며, 번호매김은 카밧에서와 같이 EU 인데스에 따른다. 하기에 보다 완벽하게 설명되는 바와 같이 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 Fc 영역에 대해, 예를 들어 하나 이상의 FcγR 수용체 또는 FcRn 수용체에 대한 결합을 변경시키도록 이루어진다.
본원에서 "중쇄 불변 영역"은 항체의 CH1-힌지-CH2-CH3 부분을 의미한다.
본원에 사용된 "위치"는 단백질 서열 내의 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로 또는 확립된 형식 예를 들어 항체 번호매김을 위한 EU 인덱스에 따라 번호를 매길 수 있다.
본원에서 사용되는 "표적 항원"은 주어진 항체의 가변 영역에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 본 발명에서, 본원에서의 관심있는 하나의 표적 항원은 TIGIT, 보통 인간 TIGIT 및 선택적으로 하기에 정의된 바와 같이 시노 TIGIT이다. 또 다른 관심있는 표적 항원은 PVRIG이며, 보통 인간 PVRIG 및 선택적으로 하기에 정의된 바와 같이 시노 PVRIG이다.
본원에 사용된 "표적 세포"는 표적 항원을 발현하는 세포를 의미한다.
본원에서 사용된 "가변 영역"은 카파, 람다 및 중쇄 면역글로불린 유전자 좌위를 각각 만드는 Vκ (V카파), Vλ (V람다) 및/또는 VH 유전자 중 임의의 것에 의해 실질적으로 인코딩되는 하나 이상의 Ig 도메인을 포함하는 면역글로불린의 영역을 의미한다.
본원에서 "야생형 또는 WT"는 대립유전자 변이를 포함하여 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. WT 단백질은 의도적으로 변형되지 않았던 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명의 항체는 일반적으로 단리되거나 재조합된다. 본원에 개시된 다양한 폴리펩타이드를 기술하는데 사용될 때, "단리된"은 발현된 세포 또는 세포 배양 물로부터 동정되고 분리 및/또는 회수되었던 폴리펩타이드를 의미한다. 통상적으로, 단리된 폴리펩타이드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 말한다. "재조합"은 이종 숙주 세포에서 재조합 핵산 기술을 이용하여 항체가 생성되는 것을 의미한다.
"특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 특정 항원 또는 에피토프에 "특이적인"은 비-특이적인 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합에 대비해 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다.
특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들어, 항원 또는 에피토프에 대해 적어도 약 10-9 M, 적어도 약 10-10 M, 적어도 약 10-11 M 이상, 약 10-12 M 이상, 약 10-13 M 이상, 약 10-14 M 이상, 약 10-15 M의 KD를 갖는 항체에 의해 나타날 수 있고, KD는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 말한다. 전형적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 또는 에피토프의 대조군 분자에 대해 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000-, 10,000배 이상인 KD를 가질 것이다.
또한, 특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은, 예를 들어 항원 또는 에피토프에 대해 대조군과 비교하여 적어도 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000- 또는 10,000배 이상의 KA 또는 Ka를 갖는 항체에 의해 나타날 수 있고, KA 또는 Ka는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 말한다. 결합 친화성는 일반적으로 표면 플라스몬 공명 (예로, 비아코아 분석) 및 항원-발현 세포로의 유동 세포계측법을 사용하여 측정된다.
C. 서열
서열 목록은 도 53의 형식에 기초하여 다수의 서열을 제공하고, 서열의 표지에 대한 지침으로서 미국 특허 USSN 62/513,916 (본원에 참조문헌으로 명시적으로 포함됨)의 도 4가 참조된다. 가변 중쇄 도메인은 식별자 (예로, "CPA.0.86")로 본 명세서의 도 53의 형식 (상기 참조된 도 4의 형식과 동일함)을 따르는 다음 서열과 함께 표지되며, 다음 서열 식별자는 vhCDR1, 다음의 vhCDR2 , vhCDR3, 전장의 중쇄, 가변 경쇄, vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3 및 전장의 경쇄로 이어진다. 따라서 개별 항체에는 10개의 연관된 서열 식별자를 가진다. BM26 마우스의 IgG1 (BM26-M1)(국제특허출원 WO2016/028656A1, 클론 31C6)와 BM29 마우스의 IgG1 (BM29-M1) (미국 특허 US2016/0176963A1, 클론 22G2)의 서열을 서열 목록에 포함한다. 주목하지 않는 한, TIGIT 항체의 전장의 HC 서열은 H4(S241P) 형식이다.
D. PVRIG 단백질
본 발명은 PVRIG 단백질에 특이적으로 결합하고 이의 리간드 단백질, PVRL2, 인간 세포질막 당단백질에 의한 활성화를 방지하는 항체를 제공한다. 단백질 Q6DKI7 또는 C7orf15를 포함하는 폴리오바이러스 수용체 관련 면역글로불린 도메인이라고도 불리는 PVRIG는 도 1에 나타낸 RefSeq 기탁번호 NP_076975에 표시된 아미노산 및 핵산 서열과 관련된다. PVRIG의 결합 파트너 (미국 특허공개 2016/0244521의 실시예 5에 나타난 바와 같음), 인간 폴리오바이러스 수용체-관련 2 단백질 (PVRR2, 넥틴-2, CD112 또는 헤르페스 바이러스 진입 매개인자 B, (HVEB)라고도 알려짐)의 서열을 도 2에 나타낸다. 본 발명의 항체는 PVRIG 및 PVLR2의 결합이 차단되도록 PVRIG 세포외 도메인에 특이적이다.
PVRIG는 길이가 326개 아미노산의 막통과 도메인 단백질이고, 신호 펩타이드 (아미노산 1번 내지 40번 범위), 세포외 도메인 (아미노산 41번 내지 171번), 막통과 도메인 (아미노산 172번 내지190번) 및 세포질 도메인 (아미노산 191번 내지 326번)을 갖는다. 개시 코돈일 수 있는 두 개의 메티오닌이 있지만, 성숙한 단백질은 동일한다.
따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PVRIG" 또는 "PVRIG 단백질" 또는 "PVRIG 폴리펩타이드"는 선택적으로 본원에 기술된 바와 같은 공지된 또는 야생형 PVRIG를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 이러한 단백질 또는 이의 변이체, 컨쥬게이트 또는 단편뿐만 아니라 임의의 자연 발생 스프라이싱 변이체, 아미노산 변이체 또는 이소형태, 특히 PVRIG의 ECD 단편을 포함할 수 있다.
본원에 기재되고 하기에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, PVRIG에 결합하고 PVRL2에 의한 활성화를 방지하는 (예로, 가장 공통적으로 PVRIG 및 PVRLR2의 상호작용을 차단함으로써) 항-PVRIG 항체 (항원-결합 단편 포함)는 T 세포 및/또는 NK 세포 활성화를 증진시키고, 암 및 병원균 감염과 같은 질환을 치료하는데 사용된다.
E. TIGIT 단백질
본 발명은 TIGIT 단백질에 특이적으로 결합하고 이의 리간드 단백질, PVR, 폴리오바이러스 수용체 (aka CD155) 인간 세포질막 당단백질에 의한 활성화를 방지하는 항체를 제공한다. TIGIT 또는 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체는 WUCAM, Vstm3 또는 Vsig9로도 공지된 보조-억제 수용체 단백질이다. TIGIT는 면역글로불린 가변 도메인, 막통과 도메인 및 면역수용체 티로신-기반 억제성 모티프 (ITIM)를 가지며 PVR 단백질 패밀리의 서명 서열 요소를 포함한다. TIGIT 및 PVR의 세포외 도메인 (ECD) 서열을 도 51에 나타낸다. 본 발명의 항체는 TIGIT 및 PVR의 결합이 차단되도록 TIGIT ECD에 특이적이다.
따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "TIGIT" 또는 "TIGIT 단백질" 또는 "TIGIT 폴리펩타이드"는 선택적으로 본원에 기술된 바와 같은 공지된 또는 야생형 TIGIT를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 이러한 단백질 또는 이의 변이체, 컨쥬게이트 또는 단편뿐만 아니라 임의의 자연 발생 스프라이싱 변이체, 아미노산 변이체 또는 이소형태, 특히 TIGIT의 ECD 단편을 포함할 수 있다.
본원에 기재되고 하기에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, TIGIT에 결합하고 PVR에 의한 활성화를 방지하는 (예로, 가장 공통적으로 TIGIT 및 PVR의 상호작용을 차단함으로써) 항-TIGIT 항체 (항원-결합 단편 포함)는 T 세포 및/또는 NK 세포 활성화를 증진시키고, 암 및 병원균 감염과 같은 질환을 치료하는데 사용된다.
VI. 항체
하기에 논의되는 바와 같이, 용어 "항체"는 일반적으로 사용된다. 전통적인 항체 구조 단위는 전형적으로 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 일반적으로 폴리펩타이드 사슬의 두 개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄" (전형적으로 약 25 kDa의 분자량을 가짐) 및 하나의 "중쇄" (전형적으로 약 50 내지 70 kDa의 분자량을 가짐)를 가진다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 본 발명은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나, 이에 한정되지 않는 여러 서브클래스를 갖는 일반적으로 IgG 클래스에 기초하는 단일클론 항체에 관한 것이다. 일반적으로 IgG1, IgG2 및 IgG4는 IgG3보다 자주 사용된다. IgG1은 356 (D 또는 E) 및 358 (L 또는 M)에서 다형성을 갖는 상이한 동종형을 가지는 점을 주목해야 한다. 본원에 기술된 서열은 356D/358M 동종형을 사용하지만, 다른 동종형도 본원에 포함된다. 즉, 본원에 포함된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 임의의 서열은 356D/358M 동종형을 대체하는 356E/358L을 가질 수 있다.
각 사슬의 아미노-말단 부분은 항원 인식에 주로 관여하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하며, 일반적으로 당해 기술분야 및 본원에서 "Fv 도메인"또는 "Fv 영역"이라고 지칭된다. 가변 영역에서, 세 개의 루프가 중쇄 및 경쇄의 V 도메인 각각을 위해 모여서 항원-결합 부위를 형성한다. 각각의 루프는 아미노산 서열의 변화가 가장 유의한 상보성 결정 영역 (이하, "CDR"이라고 약칭됨)이라고 지칭된다. "가변"은 가변 영역의 특정 분절이 항체 중의 서열이 집중적으로 상이한 사실을 말한다. 가변 영역 내의 가변성은 고르게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은 각기 9 내지 15개 이상의 아미노산 길이인 "과다가변 영역"으로 불리는 극단적 가변성의 더 짧은 영역으로 구분된 15 내지 30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 상대적으로 변하지 않는 스트레치로 구성된다.
각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 배열된 세 개의 과가변 영역 ("상보성 결정 영역", "CDR") 및 네 개의 FR로 구성된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
과다가변 영역은 일반적으로 경쇄 가변 영역에서 약 아미노산 잔기 24 내지 34 (LCDR1; "L"은 경쇄를 표시함), 50 내지 56 (LCDR2) 및 89 내지 97 (LCDR3)로부터 중쇄 가변 영역에서 약 31 내지 35B (HCDR1; "H"는 중쇄를 표시함), 50 내지 65 (HCDR2) 및 95 내지 102 (HCDR3) 주변의 아미노산 잔기 (Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)) 및/또는 과가변 루프를 형성하는 이들 잔기 (예로, 경쇄 가변 영역에서 잔기들 26 내지32 (LCDR1), 50 내지52 (LCDR2) 및 91 내지 96 (LCDR3) 및 중쇄 가변 영역에서 26 내지 32 (HCDR1), 53 내지 55 (HCDR2) 및 96 내지 101 (HCDR3))를 포괄한다 (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). 본 발명의 특이적 CDR은 하기에 기술된다.
당업자라면 이해할 바와 같이, CDR의 정확한 번호매김 및 배치는 상이한 번호매김 시스템 간에 상이할 수 있다. 그러나, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 개시는 연관된 (본질적인) CDR의 개시를 포함하는 것을 이해해야 한다. 따라서, 각 가변 중쇄 영역의 개시는 vhCDR (예로, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3)의 개시이며 각 가변 경쇄 영역의 개시는 vlCDR (예로, vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3)의 개시이다. CDR 번호매김의 유용한 비교는 하기와 같고, Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1): 55-77 (2003) 참조:
Figure 112019022434593-pct00001
본 발명은 매우 많은 상이한 CDR 집합을 제공한다. 이 경우에, "완전 CDR 집합"은 세 개의 가변 경쇄 및 세 개의 가변 중쇄 CDR, 예로 vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3을 포함한다. 이들은 각각 더 큰 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 도메인의 일부일 수 있다 . 또한, 본 명세서에서 보다 완전하게 설명된 바와 같이, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인은 중쇄 및 경쇄가 사용될 때 별도의 폴리펩타이드 사슬 또는 scFv 서열의 경우 단일 폴리펩타이드 사슬 상에 존재할 수 있다.
CDR은 항원-결합, 보다 구체적으로는 항체의 에피토프 결합 부위의 형성에 기여한다. "에피토프"는 파라토프 (paratope)라고 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원-결합 부위와 상호작용하는 결정기를 말한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 그룹이며 보통 특이적 전하 특징뿐만 아니라 특이 구조적 특징을 갖는다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
에피토프는 특이적 항원-결합 펩타이드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기와 같은, 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기 (에피토프의 면역우세 성분이라고도 불림) 및 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있고; 달리 말하면, 아미노산 잔기는 특이적 항원-결합 펩타이드의 자국 내에 있다.
에피토프는 입체구조 또는 선형일 수 있다 입체구조적 에피토프는 선형 폴리펩타이드 사슬의 상이한 분절로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형의 에피토프는 폴리펩타이드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 생산된 것이다. 입체구조적 및 비-입체구조적 에피토프는 변성 용매 존재 시 전자에 대한 결합은 아니지만 후자에 대한 결합이 손실되는 점에서 구별될 수 있다.
에피토프는 전형적으로 독특한 공간 입체구조에서 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 하나의 항체가 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합을 차단하는 능력, 예를 들어 "비닝"을 보여주는 간단한 면역검정법으로 입증될 수 있다. 하기에 개략된 바와 같이, 본 발명은 본 명세서에서 열거된 항원 결합 도메인 및 항체를 포함할뿐만 아니라 열거된 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프와의 결합을 경쟁하는 것들을 포함한다.
각 사슬의 카복시-말단 부분은 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 카밧 등은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 수많은 일차 서열을 수집하였다. 서열의 보존 정도에 기초하여, 그들은 개별 일차 염기 서열을 CDR과 프레임워크로 분류하고 이의 목록을 만들었다 (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al. 참조).
면역글로불린의 IgG 서브클래스에는 중쇄의 여러 면역글로불린 도메인이 있다. 본원에서 "면역글로불린 (Ig) 도메인"은 구별된 삼차 구조를 갖는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 본 발명에서 흥미로운 것은 불변 중쇄 (CH) 도메인 및 힌지 도메인을 포함하는 중쇄 도메인이다. IgG 항체의 맥락에서, IgG 이소형은 각각 세 개의 CH 영역을 갖는다. 따라서 IgG의 맥락에서 "CH" 도메인은 다음과 같다: "CH1"은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따라 118 내지 220번 위치를 나타낸다. "CH2"는 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따라 237 내지 340번 위치를 말하며, "CH3"은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따라 341 내지 447번 위치를 나타낸다.
중쇄의 또 다른 유형의 Ig 도메인은 힌지 영역이다. 본원에서 "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역" 또는 "면역글로불린 힌지 영역"은 항체의 제 1 및 제 2 불변 도메인 사이의 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩타이드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 위치 220번에서 끝나고, IgG CH2 도메인은 잔기 EU 위치 237번에서 시작된다. 따라서 IgG의 경우, 항체 힌지는 본원에서 221번 위치 (IgG1에서 D221) 내지 236번 (IgG1에서 G236)을 포함하도록 정의되며, 번호매김은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따른다.
경쇄는 일반적으로 가변 경쇄 도메인 (경쇄 CDR를 Fv 영역을 형성하는 가변 중쇄 도메인과 함께 포함 함) 및 불변 경쇄 영역 (종종 CL 또는 Cκ로 지칭됨)의 두 개 도메인을 포함한다. 일반적으로, 불변 람다 또는 불변 카파 도메인 둘 중 하나가 사용될 수 있으며, 람다가 일반적으로 본 발명에서 용도를 찾는다.
하기에 개략된 추가적인 치환을 위한 관심있는 또 다른 영역은 Fc 영역이다.
A. 키메라 및 인간화 항체
일부 구현예에서, 본원에서의 항체는 상이한 종으로부터의 혼합물, 예로 키메라 항체 및/또는 인간화 항체로부터 유해될 수 있다. 일반적으로, "키메라 항체" 및 "인간화 항체"는 하나 이상의 종으로부터의 영역을 조합하는 항체를 말한다. 예를 들어, "키메라 항체"는 전통적으로 마우스 (또는 일부 경우에 래트)로부터의 가변 영역(들) 및 인간으로부터의 불변 영역(들)을 포함한다. "인간화 항체"는 일반적으로 가변-도메인 프레임워크 영역을 인간 항체에서 발견되는 서열로 교체한 비인간 항체를 말한다. 일반적으로, 인간화 항체에서, CDR을 제외한 전체 항체는 인간 기원의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되거나 CDR 내를 제외하고 이러한 항체와 동일하다. 비-인간 유기체에서 기원한 핵산에 의해 인코딩되는 CDR의 일부 또는 전부는 항체를 만들기 위해 인간 항체 가변 영역의 베타-시트 프레임워크에 이식되며, 항체의 특이성은 이식된 CDR에 의해 결정된다. 이러한 항체의 생성은 예를 들어, 국제특허출원 WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321: 522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536에 기술되어 있고, 이들 모두는 전문이 참고문헌으로 통합된다. 선택된 수용체 프레임워크 잔기의 상응하는 공여체 잔기로의 "역돌연변이 (back mutation)"는 초기 이식된 구조물에서 손실된 친화성을 회복하기 위해 종종 요구된다 (미국 특허 US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, 이들 모두는 전문이 참고문헌으로 통합됨). 또한, 인간화 항체는 최적으로, 면역글로불린 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부, 보통은 전부를 포함할 것이고, 따라서 전형적으로 인간 Fc 영역을 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한 유전자 조작된 면역계를 가진 마우스를 사용하여 생성될 수 있다 본원에 전문이 참고문헌으로 통합되는 Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654. 비-인간 항체를 인간화하여 재형성하기 위한 다양한 기술 및 방법이 당해 기술분야에 잘 알려져있다 (본 명세서에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA) 및 인용된 참고문헌 참조). 인간화 방법은 본원에 전문이 참고문헌으로 통합되는 Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332: 323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86: 10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20): 4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11: 321-8에 기술된 방법을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 인간화 또는 비인간 항체 가변 영역의 면역원성을 감소시키는 다른 방법은, 예를 들어 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-973에 기술된 바와 같이 재표면화 방법을 포함할 수 있다.
따라서, 본원에서 열거된 임의의 항체로부터의 vhCDR 및 vDCDR은 인간화 (또는 이미 인간화된 것들에 대해 "재인간화")될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 특정 생식계열 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 생식계열 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 이러한 항체는 특정 생식계열 서열의 "산물"인 또는 "이로부터 유래한" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항체를 포함할 수 있다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"인 또는 "이로부터 유래한" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고 인간 항체의 서열과 가장 가까운 서열 (예로, 가장 높은 동일성%)의 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선별함으로써 확인될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"인 또는 "이로부터 유래한" 인간 항체는 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위-특이적 돌연변이의 의도적인 도입으로 인해 생식계열 서열과 비교하여 아미노산 차이를 포함할 수 있다.. 그러나, 인간화 항체는 전형적으로 아미노산 서열에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열 (예로, 마우스 생식계열 서열)과 비교할 때 항체를 인간 서열로부터 유래된 것으로 식별하는 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 경우에, 인간화 항체는 CDR을 제외한 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 즉, CDR은 마우스의 것일 수 있지만, 가변 영역 (중쇄 또는 경쇄)의 프레임워크 영역은 하나의 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 프레임워크 아미노산과 아미노산 서열이 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래된 인간화 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 10 내지 20개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 소정의 경우, 인간화 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 5개 이하 또는 심지어 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다 (다시 말하면, 임의의 변이체의 도입 전에; 즉, 변이체의 수가 일반적으로 작음).
일 구현예에서, 모체 항체는 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 친화성이 성숙되어 있다. 구조-기반의 방법이 예를 들어 미국 특허 USSN 11/004,590에 기술된 바와 같이 인간화 및 친화성 성숙을 위해 채용될 수 있다. 선택 기반의 방법은 인간화 및/또는 친화성 성숙 항체 가변 영역에 채용될 수 있고, 본원에서 모두 전문이 참고문헌으로 통합되는 Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294: 151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16): 10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10): 753-759에 기술된 방법을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 다른 인간화 방법은 CDR의 일부만의 이식을 수반할 수 있고, 본원에서 모두 전문이 참고문헌으로 인용되는 미국 특허 USSN 09/810,510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169: 1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169: 3076-3084에 기술된 방법을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
B. 조건부 항체 공학
본 발명의 항체는 아미노산 치환에 의해 아미노산 서열을 변경시키도록 변형되거나 조작될 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이, 아미노산 치환은 항체의 추가적인 기능적 성질을 변경시키는 것뿐만 아니라 단백질 (예로, TIGIT 또는 PVRIG, 결합의 증가 및 감소 모두 포함)에 대한 CDR의 친화성을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 항체는 전형적으로 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포 세포독성과 같은 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 변경하기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 적어도 일부 구현예에 따른 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나 (예로, 하나 이상의 화학적 분체가 항체에 부착될 수 있음), 그의 글리코실화를 변경하도록, 다시 말하면 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 변경하도록 변형될 수 있다. 이러한 구현예는 하기에서 추가로 기술된다. Fc 영역에서 잔기의 번호매김은 카밧의 EU 인덱스의 번호매김이다.
일 구현예에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예로 증가되거나 감소되도록 변형된다. 이 접근법은 보드머 (Bodmer) 등의 미국 특허 5,677,425에 추가로 설명된다. CH1의 힌지 부위의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
보다 또 다른 구현예에서, 특히 IgG4 불변 도메인이 사용될 때, 항체는 생체내 Fab 팔 교환을 배제하기 위해 변형될 수 있다. 상세하게, 이 과정은 기능적 단가인 이중특이적 항체를 효과적으로 생성하는 다른 IgG4 항체 간에 IgG4 분자-절반 (하나의 중쇄와 하나의 경쇄)의 교환을 수반한다. 중쇄의 힌지 부위 및 불변 도메인의 돌연변이는 이 교환을 막을 수 있다 (Aalberse, RC, Schuurman J., 2002, Immunology 105: 9-19 참조). 본 명세서에 개략된 바와 같이, 본 발명에서 특정 용도를 찾은 돌연변이는 IgG4 불변 도메인의 맥락에서 S241P이다. IgG4는 유의한 효과기 기능이 없기 때문에 본 발명에서 용도를 찾고, 따라서 세포 고갈 없이 리간드에 수용체 결합을 차단하는데 사용된다 (PVRIG에서 PVRL2 또는 TIGIT에서 PVR로).
일부 구현예에서, FcγR 수용체에 대한 결합을 변경하기 위해, 일반적으로 Fc 영역에서 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 "Fc 감마 수용체", "FcγR" 또는 "Fc감마R"은 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고 FcγR 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 패밀리의 임의의 구성원을 의미한다. 인간에서 이 패밀리는 이소형태 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI (CD64); 이소형태 FcγRIIa (동종형 H131 및 R131 포함), FcγRIIb (FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2 포함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII (CD32); 및 이소형태 FcγRIIIa (동종형 V158 및 F158 포함) 및 FcγRIIIb (동종형 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2 포함)을 포함하는 FcγRIII (CD16) (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82: 57-65), 뿐만 아니라 임의의 발견되지 않은 인간 FcγR 또는 FcγR 이소형태 또는 동종형을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. FcγR은 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 마우스 FcγR은 임의의 발견되지 않은 마우스 FcγR 또는 FcγR 이소형태 또는 동종형뿐만 아니라 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII-1 (CD16) 및 FcγRIII-2 (CD16-2)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 결합을 변경하기 위해 만들어질 수 있는 다수의 유용한 Fc 치환이 존재한다. 증가된 결합뿐만 아니라 감소된 결합을 유도하는 치환이 유용할 수 있다. 예를 들어, FcγRIIIa에 대한 증가된 결합은 일반적으로 증가된 ADCC (항체 의존성 세포-매개 세포독성, FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개성 반응 세포)를 유도하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, FcγRIIb (억제성 수용체)에 대한 감소된 결합은 일부 상황에서 마찬가지로 유익할 수 있다. 본 발명에서 용도를 찾은 아미노산 치환은 이들 모두가 본원에서 전문이 참고문헌으로 명시적으로 통합되는 미국 특허 11/124,620 (상세하게 도 41) 및 미국 특허 6,737,056에 나열된 것들 및 특히 본 명세서에 개시된 변형을 포함한다.
또한 또 다른 예에서, Fc 영역은 Fcγ 수용체에 대한 항체 의존성 세포독성 (ADCC) 매개하고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화성을 증가시키고/거나 FcRn 결합을 증가시키는 항체의 능력을 증가 시키도록 다음의 위치에서 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 변형된다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근법은 프레스타의 국제특허출원 PCT WO 00/42072에 추가로 기술되어 있다. 또한, FcRI, FcRII, FcRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 매핑되었고 개선된 결합을 갖는 변이체가 기술되어 있다 (Shields, R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339번에서의 특이적 돌연변이는 FcγRIII에의 결합을 개선하는 것으로 확인된다. 추가적으로, 다음의 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 개선시키는 것으로 확인된다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A. 또한, M252Y/S254T/T256E 또는 M428L/N434S와 같은 돌연변이는 FcRn과의 결합을 개선시키고 항체 순환 반감기를 증가시킨다 (Chan CA and Carter PJ (2010) Nature Rev Immunol 10: 301-316 참조).
또한, 본 발명의 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능한다. 예를 들어, 워드의 미국 특허 6,277,375에 기술된 바와 같이 다음의 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경되어 프레스타 등의 미국 특허 5,869,046 및 6,121,022에서 기술된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 영역의 두 개의 루프로부터 가져온 구제 수용체 결합 에피토프를 포함할 수 있다. 혈청 반감기를 증가시키기 위한 추가적인 돌연변이가 미국 특허 8,883,973, 6,737,056 및 7,371,826에 개시되고, 428L, 434A, 434S 및 428L/434S를 포함한다.
보다 또 다른 구현예에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 미글리코실화된 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키거나 ADCC와 같은 효과기 기능을 감소시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위, 예를 들어 N297을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하고 이로써 해당 부위에서 글리코실화를 제거하여 알라닌 대체가 일부 구현예에서 용도를 찾는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 감소된 양의 퓨코실 잔기를 갖는 과소퓨코실화된 항체 또는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 갖는 항체와 같은 변형된 유형의 글리코실화를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 양상은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기작을 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변형된 글리코실화 기작을 갖는 세포는 당해 기술 분야에 기술되어 왔으며, 본 발명의 적어도 일부 구현예에 따라 재조합 항체를 발현하여 이로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 20040110704 및 국제특허출원 WO 2003/035835 참조.
본 발명에 의해 고려되는 본원에서의 항체의 또 다른 변형은, 예로 반감기를 증진시키기 위해 PEG화 또는 다른 수용성 분체, 전형적으로 중합체의 첨가이다. 항체는 예를 들어 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 항체의 생물학적 (예로, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다.
FcγR 및/또는 FcRn에 대한 결합 친화력을 변경시키고/거나 생체내 혈청 반감기를 증가시키기 위해 수행된 치환에 추가하여, 하기에서 더 자세히 기술되는 바와 같이 추가적인 항체 변형이 이루어질 수 있다.
일부 경우에는 친화성 성숙이 수행된다. CDR의 아미노산 변형은 때로 "친화성 성숙"이라고 지칭된다. "친화성 성숙한" 항체는 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 변경(들)을 가지고, 이들 변경(들)을 소유하지 않는 모체 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화성의 개선을 유도하는 항체이다. 일부의 경우, 항원에 대한 항체의 친화성을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본 발명의 항체 (PVRIG 또는 TIGIT 항체)의 하나 이상의 CDR에서 이루어진다. 일반적으로, 임의의 단일한 CDR에서 단지 1 또는 2 또는 3개 아미노산이 치환되고 일반적으로 1, 2, 3개 이하이다. 6개 CDR 집합 (예로, vhCDR1-3 및 vlCDR1-3) 내에서 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 변경이 이루어진다. 그러나, 임의의 CDR에서 치환 없음, 1, 2 또는 3개 치환의 임의의 조합은 독립적으로 및 선택적으로 임의의 다른 치환과 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
친화성 성숙은 항원에 대한 항체의 결합 친화성을 "모체" 항체와 비교하여 적어도 약 10% 내지 50-100-150% 이상, 또는 1 내지 5배로 증가시키도록 수행될 수 있다. 바람직한 친화성 성숙된 항체는 항원에 대해 나노몰 또는 피코몰 수준의 친화성을 가질 것이다. 친화성 성숙된 항체는 공지된 절차에 의해 생산된다. 친화성과 효능의 상관 관계는 하기에서 논의된다.
대안적으로, 아미노산 변형은 "침묵"하는, 예로 항원에 대한 항체의 친화성을 유의하게 변경시키지 않는 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다. 이들은 (본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산에 대해 시행해질 수 있는 바와 같이) 발현의 최적화를 포함하는 다수의 이유로 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명의 CDR 및 항체의 정의 내에 변이체 CDR 및 항체가 포함되고; 즉, 본 발명의 항체는 본 발명의 열거된 항체의 하나 이상의 CDR에서 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 또한, 하기에 개략된 바와 같이, 아미노산 변형은 프레임워크 및 불변 영역을 포함하여 CDR 외부의 임의의 영역에서 독립적으로 및 선택적으로도 역시 만들어질 수 있다.
a. 추가적인 항체의 생성
인간 PVRIG에 대한 추가적인 항체는 실시예에 개략된 방법과 같은 공지된 방법을 사용하여 당해 기술분야에 잘 공지된 바와 같이 제조될 수 있다. 따라서, 추가적인 항-PVRIG 항체는 마우스 면역화와 같은 전통적인 방법에 의해 (때로 예를 들어 아데브론에 의해 사용되는 바와 같은 DNA 면역화를 사용하여) 생성될 수 있고, 이후 인간 PVRIG 단백질에 대한 스크리닝 및 항체 정제 및 회수와 함께 하이브리도마 생성이 이어진다.
VII. 본 발명의 TIGIT 항체
본 발명은 항-TIGIT 항체를 제공한다. (편의상, "항-TIGIT 항체" 및 "TIGIT 항체"는 상호교환적으로 사용된다). 본 발명의 항-TIGIT 항체는 인간 TIGIT, 바람직하게는 인간 TIGIT의 ECD에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 또한 TIGIT에 결합하는 6개 CDR의 다수의 특이적인 열거된 집합를 포함하는 전장 항체를 포함하는 항원-결합 도메인을 제공한다.
TIGIT 또는 TIGIT 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들어 적어도 약 10-4 M, 적어도 약 10-5 M, 적어도 약 10-6 M, 적어도 약 10-7 M, 적어도 약 10-8 M, 적어도 약 10-9 M, 대안적으로 적어도 약 10-10 M, 적어도 약 10-11 M 이상, 약 10-12 M 이상, 약 10-13 M 이상, 약 10-14 M 이상, 약 10-15 M 이상의 KD를 갖는 항체에 의해 나타날 수 있고, KD는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 말한다. 전형적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 TIGIT 항원 또는 에피토프의 대조군 분자에 대해 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000-, 10,000배 이상인 KD를 가질 것이다.
그러나, NK 및 T-세포의 표면 상에 발현된 TIGIT에 대한 최적의 결합의 경우, 항체는 바람직하게는 50 nM 미만, 가장 바람직하게는 1 nM 미만의 KD를 가지고, 0.1 nM 미만 및 1 pM 미만이 본 발명에서 용도를 찾는다.
또한, 특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은, 예를 들어 TIGIT 항원 또는 에피토프에 대해 대조군과 비교하여 적어도 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000- 또는 10,000배 이상의 ka (결합 속도 상수라고 지칭됨)를 갖는 항체에 의해 나타날 수 있고, ka는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도 상수를 말한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-TIGIT 항체는 인간 TIGIT에 100 nm 이하, 50 nm 이하, 10 nm 이하, 또는 1 nm 이하 (즉, 높은 결합 친화성), 또는 1 pM 이하의 KD로 결합하고, KD는 공지된 방법 예로 표면 플라즈몬 공명 (SPR, 예로 비아코어 검정), ELISA, KINEXA, 가장 전형적으로는 25
Figure 112019022434593-pct00002
C 또는 37
Figure 112019022434593-pct00003
C에서의 SPR에 의해 결정된다.
본원에 기술된 TIGIT 항체는 다음과 같이 표지된다. 항체는 참조 번호, 예를 들어 "CPA.9.086"를 갖는다. 이것은 예를 들어,도 53에 도시된 바와 같이 가변성 중쇄 및 가변 경쇄의 조합을 나타내며, 이들 항체는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함하는 것으로 이해한다. "CPA.9.086.VH"는 CPA. 9. 086의 가변 중쇄 부분을 말하는 한편,"CPA. 9. 086.VL"는 가변 경쇄이다. "CPA. 9. 086.vhCDR1", "CPA. 9. 086.vhCDR2", "CPA. 9. 086.vhCDR3", "CPA. 9. 086.vlCDR1", "CPA. 9. 086.vlCDR2" 및 "CPA. 9. 086.vlCDR3"는 표시된 CDR을 말한다. "CPA. 9. 086.HC"는 이 분자의 전체 중쇄 (예로, 가변 및 불변 도메인)을 말하고, "CPA. 9. 086.LC"는 동일한 분자의 전체 경쇄 (예로, 가변 및 불변 도메인)을 말한다. 일반적으로, 인간 카파 경쇄는 본원에서의 각 파지 (또는 인간화 하이브리도마) 항체의 불변 도메인으로 사용되지만, 일부 구현예에서는 람다 경쇄 불변 도메인이 사용된다. "CPA. 9. 086.H1"은 인간 IgG1 (Human IgG1)의 불변 도메인을 포함하는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 전장의 항체를 말한다 (따라서, H1; IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서열은 도 50에 나타냄). 따라서 "CPA. 9. 086.H2"는 인간 IgG2에 연결된 CPA. 9. 086 가변 도메인일 것이다. "CPA. 9. 086.H3"은 인간 IgG3에 연결된 CPA. 9. 086 가변 도메인일 것이고, "CPA. 9. 086.H4"는 인간 IgG4에 연결된 CPA. 9. 086 가변 도메인일 것이다. 일부 경우에, 인간 IgG는 하기에 설명하는 것과 같은 추가적인 돌연변이를 가질 수 있으며 주석이 달릴 수 있는 점을 주목하라. 예를 들어, 많은 구현예에서, 인간 IgG4에서 S241P 돌연변이가 있을 수 있으며, 이는 예를 들어 "CPA.9.086.H4 (S241P)"로서 주석을 달 수 있다. 이러한 S241P 힌지 변이체를 갖는 인간 IgG4 서열은 도 50에 나타낸다. 다른 잠재적인 변이체는 IgG1 (N297A) (또는 이 부위에서 글리코실화 및 이로써 FcγRIIIa 결합과 관련된 많은 효과기 기능을 제거한 다른 변이체) 및 IgG1(D265A)이고, 이는 FcγR 수용체에 대한 결합을 감소시킨다.
본 발명은 또한 전장의 중쇄 및 경쇄뿐만 아니라 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 상기 개략된 바와 같이 scFv 링커에 의해 연결된 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하는 TIGIT에 결합하는 scFv를 제공한다. VL 및 VH 도메인은 예로 N-말단부터 C-말단까지 "VH-링커-VL" 또는 "VL-링커-VH" 어느 방향으로든 될 수 있다. 이들은 성분 요소에 의해 명명되고, 예를 들어 "scFv-CPA. 9.086.VH-링커-VL " 또는 "scFv-CPA.9.086.VL-링커-VH"이다. 따라서 "scFv-CPA.9.086"은 어느 방향으로든 될 수 있다.
많은 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 (파지로부터 유래함)이고 TIGIT 및 PVR의 결합을 차단한다. 도 58 및도 75에 도시된 바와 같이, 수용체-리간드 상호작용에 결합하고 이를 차단하는 CPA 항체는 하기와 같으며, 이들의 성분도 마찬가지로 개략된다 ("서열" 섹션에서 논의된 바와 같이, scFv 구조물을 제외한 모든 서열은 서열 목록에 있음):
CPA.9.018, CPA.9.018.VH, CPA.9.018.VL, CPA.9.018.HC, CPA.9.018.LC, CPA.9.018.H1, CPA.9.018.H2, CPA.9.018.H3, CPA.9.018.H4; CPA.9.018.H4(S241P); CPA.9.018.vhCDR1, CPA.9.018.vhCDR2, CPA.9.018.vhCDR3, CPA.9.018.vlCDR1, CPA.9.018.vlCDR2, CPA.9.018.vlCDR3 및 scFv-CPA.9.018;
CPA.9.027, CPA.9.027.VH, CPA.9.027.VL, CPA.9.027.HC, CPA.9.027.LC, CPA.9.027.H1, CPA.9.027.H2, CPA.9.027.H3, CPA.9.027.H4; CPA.9.018.H4(S241P); CPA.9.027.vhCDR1, CPA.9.027.vhCDR2, CPA.9.027.vhCDR3, CPA.9.027.vlCDR1, CPA.9.027.vlCDR2, CPA.9.027.vlCDR3 및 scFv-CPA.9.027;
CPA.9.049, CPA.9.049.VH, CPA.9.049.VL, CPA.9.049.HC, CPA.9.049.LC, CPA.9.049.H1, CPA.9.049.H2, CPA.9.049.H3; CPA.9.049.H4; CPA.9.049.H4(S241P); CPA.9.049.vhCDR1, CPA.9.049.vhCDR2, CPA.9.049.vhCDR3, CPA.9.049.vlCDR1, CPA.9.049.vlCDR2, CPA.9.049.vlCDR3 및 scFv-CPA.9.049;
CPA.9.057, CPA.9.057.VH, CPA.9.057.VL, CPA.9.057.HC, CPA.9.057.LC, CPA.9.057.H1, CPA.9.057.H2, CPA.9.057.H3; CPA.9.057.H4; CPA.9.057.H4(S241P); CPA.9.057.vhCDR1, CPA.9.057.vhCDR2, CPA.9.057.vhCDR3, CPA.9.057.vlCDR1, CPA.9.057.vlCDR2, CPA.9.057.vlCDR3 및 scFv-CPA.9.057;
CPA.9.059, CPA.9.059.VH, CPA.9.059.VL, CPA.9.059.HC, CPA.9.059.LC, CPA.9.059.H1, CPA.9.059.H2, CPA.9.059.H3; CPA.9.059.H4; CPA.9.059.H4(S241P); CPA.9.059.vhCDR1, CPA.9.059.vhCDR2, CPA.9.059.vhCDR3, CPA.9.059.vlCDR1, CPA.9.059.vlCDR2, CPA.9.059.vlCDR3 및 scFv-CPA.9.059;
CPA.9.083, CPA.9.083.VH, CPA.9.083.VL, CPA.9.083.HC, CPA.9.083.LC, CPA.9.083.H1, CPA.9.083.H2, CPA.9.083.H3; CPA.9.083.H4; CPA.9.083.H4(S241P); CPA.9.083.vhCDR1, CPA.9.083.vhCDR2, CPA.9.083.vhCDR3, CPA.9.083.vlCDR1, CPA.9.083.vlCDR2, CPA.9.083.vlCDR3 및 scFv-CPA.9.083;
CPA.9.086, CPA.9.086.VH, CPA.9.086.VL, CPA.9.086.HC, CPA.9.086.LC, CPA.9.086.H1, CPA.9.086.H2, CPA.9.086.H3; CPA.9.086.H4; CPA.9.086.H4(S241P); CPA.9.086.vhCDR1, CPA.9.086.vhCDR2, CPA.9.086.vhCDR3, CPA.9.086.vlCDR1, CPA.9.086.vlCDR2, CPA.9.086.vlCDR3 및 scFv-CPA.9.086;
CPA.9.089, CPA.9.089.VH, CPA.9.089.VL, CPA.9.089.HC, CPA.9.089.LC, CPA.9.089.H1, CPA.9.089.H2, CPA.9.089.H3; CPA.9.089.H4; CPA.9.089.H4(S241P); CPA.9.089.vhCDR1, CPA.9.089.vhCDR2, CPA.9.089.vhCDR3, CPA.9.089.vlCDR1, CPA.9.089.vlCDR2, CPA.9.089.vlCDR3 및 scFv-CPA.9.089;
CPA.9.093, CPA.9.093.VH, CPA.9.093.VL, CPA.9.093.HC, CPA.9.093.LC, CPA.9.093.H1, CPA.9.093.H2, CPA.9.093.H3; CPA.9.093.H4; CPA.9.093.H4(S241P); CPA.9.093.vhCDR1, CPA.9.093.vhCDR2, CPA.9.093.vhCDR3, CPA.9.093.vlCDR1, CPA.9.093.vlCDR2, CPA.9.093.vlCDR3 및 scFv-CPA.9.093;
CPA.9.101, CPA.9.101.VH, CPA.9.101.VL, CPA.9.101.HC, CPA.9.101.LC, CPA.9.101.H1, CPA.9.101.H2, CPA.9.101.H3; CPA.9.101.H4; CPA.9.101.H4(S241P); CPA.9.101.vhCDR1, CPA.9.101.vhCDR2, CPA.9.101.vhCDR3, CPA.9.101.vlCDR1, CPA.9.101.vlCDR2, CPA.9.101.vlCDR3 및 scFv-CPA.9.101; 및
CPA.9.103, CPA.9.103.VH, CPA.9.103.VL, CPA.9.103.HC, CPA.9.103.LC, CPA.9.103.H1, CPA.9.103.H2, CPA.9.103.H3; CPA.9.103.H4; CPA.9.103.H4(S241P); CPA.9.103.vhCDR1, CPA.9.103.vhCDR2, CPA.9.103.vhCDR3, CPA.9.103.vlCDR1, CPA.9.103.vlCDR2, CPA.9.103.vlCDR3 및 scFv-CPA.9.103.
또한, 본 발명은 하이브리도마로부터 생성된 마우스 항체인 다수의 CHA 항체를 제공한다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 여섯 개의 CDR은 인간 프레임워크 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역에 삽입될 때 또는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인이 인간화될 때 유용하다.
따라서, 본 발명은 다음의 CDR 집합을 포함하는 항체, 보통 전장 또는 scFv 도메인을 제공하며, 이의 서열은 도 53 및/또는 서열 목록에 나타나 있다:
CHA.9.536.1, CHA.9.536.1.VH, CHA.9.536.1.VL, CHA.9.536.1.HC, CHA.9.536.1.LC, CHA.9.536.1.H1, CHA.9.536.1.H2, CHA.9.536.1.H3; CHA.9.536.1.H4, CHA.9.536.1.H4(S241P), CHA.9.536.1.vhCDR1, CHA.9.536.1.vhCDR2, CHA.9.536.1.vhCDR3, CHA.9.536.1.vlCDR1, CHA.9.536.1.vlCDR2 및 CHA.9.536.1.vhCDR3;
CHA.9.536.3, CHA.9.536.3.VH, CHA.9.536.3.VL, CHA.9.536.3.HC, CHA.9.536.3.LC, CHA.9.536.3.H1, CHA.9.536.3.H2, CHA.9.536.3.H3; CHA.9.536.3.H4, CHA.9.536.3.H4(S241P); CHA.9.536.3.vhCDR1, CHA.9.536.3.vhCDR2, CHA.9.536.3.vhCDR3, CHA.9.536.3.vlCDR1, CHA.9.536.3.vlCDR2 및 CHA.9.536.3.vhCDR3;
CHA.9.536.4, CHA.9.536.4.VH, CHA.9.536.4.VL, CHA.9.536.4.HC, CHA.9.536.4.LC, CHA.9.536.4.H1, CHA.9.536.4.H2, CHA.9.536.4.H3; CHA.9.536.4.H4, CHA.9.536.4.H4(S241P), CHA.9.536.4.vhCDR1, CHA.9.536.4.vhCDR2, CHA.9.536.4.vhCDR3, CHA.9.536.4.vlCDR1, CHA.9.536.4.vlCDR2 및 CHA.9.536.4.vhCDR3;
CHA.9.536.5, CHA.9.536.5.VH, CHA.9.536.5.VL, CHA.9.536.5.HC, CHA.9.536.5.LC, CHA.9.536.5.H1, CHA.9.536.5.H2, CHA.9.536.5.H3; CHA.9.536.5.H4, CHA.9.536.5.H4(S241P), CHA.9.536.5.vhCDR1, CHA.9.536.5.vhCDR2, CHA.9.536.5.vhCDR3, CHA.9.536.5.vlCDR1, CHA.9.536.5.vlCDR2 및 CHA.9.536.5.vhCDR3;
CHA.9.536.6, CHA.9.536.6.VH, CHA.9.536.6.VL, CHA.9.536.6.HC, CHA.9.536.6.LC, CHA.9.536.6.H1, CHA.9.536.6.H2, CHA.9.536.6.H3; CHA.9.536.6.H4, CHA.9.536.6.vhCDR1, CHA.9.536.6.vhCDR2, CHA.9.536.6.vhCDR3, CHA.9.536.6.vlCDR1, CHA.9.536.6.vlCDR2 및 CHA.9.536.6.vhCDR3;
CHA.9.536.7, CHA.9.536.7.VH, CHA.9.536.7.VL, CHA.9.536.7.HC, CHA.9.536.7.LC, CHA.9.536.7.H1, CHA.9.536.7.H2, CHA.9.536.7.H3; CHA.9.536.7.H4, CHA.9.536.5.H4(S241P); CHA.9.536.7.vhCDR1, CHA.9.536.7.vhCDR2, CHA.9.536.7.vhCDR3, CHA.9.536.7.vlCDR1, CHA.9.536.7.vlCDR2 및 CHA.9.536.7.vhCDR3;
CHA.9.536.8, CHA.9.536.8.VH, CHA.9.536.8.VL, CHA.9.536.8.HC, CHA.9.536.8.LC, CHA.9.536.8.H1, CHA.9.536.8.H2, CHA.9.536.8.H3; CHA.9.536.8.H4, CHA.9.536.8.H4(S241P), CHA.9.536.8.vhCDR1, CHA.9.536.8.vhCDR2, CHA.9.536.8.vhCDR3, CHA.9.536.8.vlCDR1, CHA.9.536.8.vlCDR2 및 CHA.9.536.8.vhCDR3;
CHA.9.560.1, CHA. 9.560.1VH, CHA. 9.560.1.VL, CHA. 9.560.1.HC, CHA. 9.560.1.LC, CHA. 9.560.1.H1, CHA. 9.560.1.H2, CHA. 9.560.1.H3; CHA. 9.560.1.H4, CHA. 9.560.1.H4(S241P), CHA. 9.560.1.vhCDR1, CHA. 9.560.1.vhCDR2, CHA. 9.560.1.vhCDR3, CHA. 9.560.1.vlCDR1, CHA. 9.560.1.vlCDR2 및 CHA. 9.560.1.vhCDR3;
CHA.9.560.3, CHA. 9.560. 3VH, CHA. 9.560. 3.VL, CHA. 9.560. 3.HC, CHA. 9.560. 3.LC, CHA. 9.560. 3.H1, CHA. 9.560. 3.H2, CHA. 9.560. 3.H3; CHA.9.560.3.H4, CHA.9.560.3.H4(S241P); CHA. 9.560. 3.vhCDR1, CHA. 9.560. 3.vhCDR2, CHA. 9.560. 3.vhCDR3, CHA. 9.560. 3.vlCDR1, CHA. 9.560. 3.vlCDR2 및 CHA. 9.560. 3.vhCDR3;
CHA.9.560.4, CHA. 9.560. 4VH, CHA. 9.560. 4.VL, CHA. 9.560. 4.HC, CHA. 9.560. 4.LC, CHA. 9.560. 4.H1, CHA. 9.560. 4.H2, CHA. 9.560. 4.H3; CHA.9.560.4.H4, CHA.9.560.4.H4(S241P), CHA. 9.560. 4.vhCDR1, CHA. 9.560. 4.vhCDR2, CHA. 9.560. 4.vhCDR3, CHA. 9.560. 4.vlCDR1, CHA. 9.560. 4.vlCDR2 및 CHA. 9.560. 4.vhCDR3;
CHA.9.560.5, CHA. 9.560. 5VH, CHA. 9.560. 5.VL, CHA. 9.560. 5.HC, CHA. 9.560. 5.LC, CHA. 9.560. 5.H1, CHA. 9.560. 5.H2, CHA. 9.560. 5.H3; CHA. 9.560. 5.H4, CHA. 9.560. 5.vhCDR1, CHA. 9.560. 5.vhCDR2, CHA. 9.560. 5.vhCDR3, CHA. 9.560. 5.vlCDR1, CHA. 9.560. 5.vlCDR2 및 CHA. 9.560. 5.vhCDR3;
CHA.9.560.6, CHA. 9.560. 6VH, CHA. 9.560. 6.VL, CHA. 9.560. 6.HC, CHA. 9.560. 6.LC, CHA. 9.560. 6.H1, CHA. 9.560. 6.H2, CHA. 9.560. 6.H3; CHA.9.560.6.H4, CHA.9.560.6.H4(S241P), CHA. 9.560. 6.vhCDR1, CHA. 9.560. 6.vhCDR2, CHA. 9.560. 6.vhCDR3, CHA. 9.560. 6.vlCDR1, CHA. 9.560. 6.vlCDR2 및 CHA. 9.560. 6.vhCDR3;
CHA.9.560.7, CHA. 9.560. 7VH, CHA. 9.560. 7.VL, CHA. 9.560. 7.HC, CHA. 9.560. 7.LC, CHA. 9.560. 7.H1, CHA. 9.560. 7.H2, CHA. 9.560. 7.H3; CHA.9.560.7.H4; CHA.9.560.7.H4(S241P); CHA. 9.560. 7.vhCDR1, CHA. 9.560. 7.vhCDR2, CHA. 9.560. 7.vhCDR3, CHA. 9.560. 7.vlCDR1, CHA. 9.560. 7.vlCDR2 및 CHA. 9.560. 7.vhCDR3;
CHA.9.560.8, CHA. 9.560. 8VH, CHA. 9.560. 8.VL, CHA. 9.560. 8.HC, CHA. 9.560. 8.LC, CHA. 9.560. 8.H1, CHA. 9.560. 8.H2, CHA. 9.560. 8.H3; CHA.9.560.8.H4, CHA.9.560.8.H4(S241P); CHA. 9.560. 8.vhCDR1, CHA. 9.560. 8.vhCDR2, CHA. 9.560. 8.vhCDR3, CHA. 9.560. 8.vlCDR1, CHA. 9.560. 8.vlCDR2 및 CHA. 9.560. 8.vhCDR3;
CHA.9.546.1, CHA. 9. 546.1VH, CHA. 9. 546.1.VL, CHA. 9. 546.1.HC, CHA. 9. 546.1.LC, CHA. 9. 546.1.H1, CHA. 9. 546.1.H2, CHA. 9. 546.1.H3; CHA.9.546.1.H4, CHA.9.546.1.H4(S241P), CHA. 9. 546.1.vhCDR1, CHA. 9. 546.1.vhCDR2, CHA. 9. 546.1.vhCDR3, CHA. 9. 546.1.vlCDR1, CHA. 9. 546.1.vlCDR2 및 CHA. 9. 546.1.vhCDR3;
CHA.9.547.1, CHA. 9. 547.1VH, CHA. 9. 547.1.VL, CHA. 9. 547.1.HC, CHA. 9. 547.1.LC, CHA. 9. 547.1.H1, CHA. 9. 547.1.H2, CHA. 9. 547.1.H3; CHA.9.547.1.H4, CHA.9.547.1.H4(S241P), CHA. 9. 547.1.vhCDR1, CHA. 9. 547.1.vhCDR2, CHA. 9. 547.1.vhCDR3, CHA. 9. 547.1.vlCDR1, CHA. 9. 547.1.vlCDR2 및 CHA. 9. 547.1.vhCDR3;
CHA.9.547.2, CHA. 9. 547. 2VH, CHA. 9. 547. 2.VL, CHA. 9. 547. 2.HC, CHA. 9. 547. 2.LC, CHA. 9. 547. 2.H1, CHA. 9. 547. 2.H2, CHA. 9. 547. 2.H3; CHA.9.547.2.H4, CHA.9.547.2.H4(S241P), CHA. 9. 547. 2.vhCDR1, CHA. 9. 547. 2.vhCDR2, CHA. 9. 547. 2.vhCDR3, CHA. 9. 547. 2.vlCDR1, CHA. 9. 547. 2.vlCDR2 및 CHA. 9. 547. 2.vhCDR3;
CHA.9.547.3, CHA. 9. 547. 3VH, CHA. 9. 547. 3.VL, CHA. 9. 547. 3.HC, CHA. 9. 547. 3.LC, CHA. 9. 547. 3.H1, CHA. 9. 547. 3.H2, CHA. 9. 547. 3.H3; CHA.9.547.3.H4, CHA.9.547.3.H4(S241P), CHA. 9. 547. 3.vhCDR1, CHA. 9.547. 3.vhCDR2, CHA. 9. 547. 3.vhCDR3, CHA. 9. 547. 3.vlCDR1, CHA. 9. 547. 3.vlCDR2 및 CHA. 9. 547. 3.vhCDR3;
CHA.9.547.4, CHA. 9. 547. 4VH, CHA. 9. 547. 4.VL, CHA. 9. 547. 4.HC, CHA. 9.547. 4.LC, CHA. 9. 547. 4.H1, CHA. 9. 547. 4.H2, CHA. 9. 547. 4.H3; CHA.9.547.4.H4, CHA.9.547.4.H4(S241P), CHA. 9. 547. 4.vhCDR1, CHA. 9. 547. 4.vhCDR2, CHA. 9. 547. 4.vhCDR3, CHA. 9. 547. 4.vlCDR1, CHA. 9. 547. 4.vlCDR2 및 CHA. 9. 547. 4.vhCDR3;
CHA.9.547.6, CHA. 9. 547. 6 VH, CHA. 9. 547. 6.VL, CHA. 9. 547. 6.HC, CHA. 9. 547. 6.LC, CHA. 9. 547. 6.H1, CHA. 9. 547. 6.H2, CHA. 9. 547. 6.H3; CHA.9.547.6.H4, CHA.9.547.6.H4(S241P), CHA. 9. 547. 6.vhCDR1, CHA. 9. 547. 6.vhCDR2, CHA. 9. 547. 6.vhCDR3, CHA. 9. 547. 6.vlCDR1, CHA. 9. 547. 6.vlCDR2 및 CHA. 9. 547. 6.vhCDR3;
CHA.9.547.7, CHA. 9. 547. 7VH, CHA. 9. 547. 7.VL, CHA. 9. 547. 7.HC, CHA. 9. 547. 7.LC, CHA. 9. 547. 7.H1, CHA. 9. 547. 7.H2, CHA. 9. 547. 7.H3; CHA.9.547.7.H4, CHA.9.547.7.H4(S241P), CHA. 9. 547. 7.vhCDR1, CHA. 9. 547. 7.vhCDR2, CHA. 9. 547. 7.vhCDR3, CHA. 9. 547. 7.vlCDR1, CHA. 9. 547. 7.vlCDR2 및 CHA. 9. 547. 7.vhCDR3;
CHA.9.547.8, CHA. 9. 547. 8VH, CHA. 9. 547. 8.VL, CHA. 9. 547. 8.HC, CHA.9.547.8.LC, CHA. 9. 547. 8.H1, CHA. 9. 547. 8.H2, CHA. 9. 547. 8.H3; CHA.9.547.8.H4, CHA.9.547.8.H4(S241P), CHA. 9. 547. 8.vhCDR1, CHA. 9. 547. 8.vhCDR2, CHA. 9. 547. 8.vhCDR3, CHA. 9. 547. 8.vlCDR1, CHA. 9. 547. 8.vlCDR2 및 CHA. 9. 547. 8.vhCDR3;
CHA.9.547.9, CHA.9.547.9, CHA.9.547.9VH, CHA.9.547.9.VL, CHA.9. 547.9.HC, CHA.9.547.9.LC, CHA.9.547.9.H1, CHA.9.547.9.H2, CHA.9.547.9.H3; CHA.9.547.9.H4, CHA.9.547.9.H4, CHA.9.547.9.H4(S241P), CHA.9.547.9.H4(S241P), CHA.9.547.9.vhCDR1, CHA.9.547.9.vhCDR2, CHA.9.547.9.vhCDR3, CHA.9.547.9.vlCDR1, CHA.9.547.9.vlCDR2 및 CHA.9.547.9.vhCDR3;
CHA.9.547.13, CHA.9.547.13, CHA.9.547. 13VH, CHA.9. 547.13.VL, CHA.9. 547.13.HC, CHA. 9.547.13.LC, CHA. 9.547.13.H1, CHA.9.547.13.H2, CHA.9. 547.13.H3; CHA.9.547.13.H4, CHA.9.547.13.H4, CHA.9.547.13.H4(S241P), CHA.9.547.13.H4(S241P), CHA. 9. 547.13.vhCDR1, CHA.9.547.13.vhCDR2, CHA.9.547. 13.vhCDR3, CHA. 9. 547.13.vlCDR1, CHA. 9. 547.13.vlCDR2 및 CHA. 9. 547. 13.vhCDR3;
CHA.9.541.1, CHA. 9. 541.1.VH, CHA. 9. 541.1.VL, CHA. 9. 541.1.HC, CHA. 9. 541.1.LC, CHA. 9. 541.1.H1, CHA. 9. 541.1.H2, CHA. 9. 541.1.H3; CHA.9.541.1.H4, CHA.9.541.1.H4(S241P), CHA. 9. 541.1.vhCDR1, CHA. 9. 541.1.vhCDR2, CHA. 9. 541.1.vhCDR3, CHA. 9. 541.1.vlCDR1, CHA. 9. 541.1.vlCDR2 및 CHA. 9.541.1.vhCDR3;
CHA.9.541.3, CHA. 9. 541. 3.VH, CHA. 9. 541. 3.VL, CHA. 9. 541. 3.HC, CHA. 9. 541. 3.LC, CHA. 9. 541. 3.H1, CHA. 9. 541. 3.H2, CHA. 9. 541. 3.H3; CHA.9.541.3.H4, CHA.9.541.3.H4(S241P), CHA. 9. 541. 3.vhCDR1, CHA. 9. 541. 3.vhCDR2, CHA. 9. 541. 3.vhCDR3, CHA. 9. 541. 3.vlCDR1, CHA. 9. 541. 3.vlCDR2 및 CHA. 9.541. 3.vhCDR3;
CHA.9.541.4, CHA. 9. 541.4.VH, CHA. 9. 541. 4.VL, CHA. 9. 541. 4.HC, CHA. 9. 541. 4.LC, CHA. 9. 541. 4.H1, CHA. 9. 541. 4.H2, CHA. 9. 541. 4.H3; CHA.9.541.4.H4, CHA.9.541.4.H4(S241P), CHA. 9. 541. 4.vhCDR1, CHA. 9. 541. 4.vhCDR2, CHA. 9. 541. 4.vhCDR3, CHA. 9. 541. 4.vlCDR1, CHA. 9. 541. 4.vlCDR2 및 CHA. 9.541. 4.vhCDR3;
CHA.9.541.5, CHA. 9. 541. 5.VH, CHA. 9. 541. 5.VL, CHA. 9. 541. 5.HC, CHA. 9. 541. 5.LC, CHA. 9. 541. 5.H1, CHA. 9. 541. 5.H2, CHA. 9. 541. 5.H3; CHA.9.541.5.H4, CHA.9.541.5.H4(S241P), CHA. 9. 541. 5.vhCDR1, CHA. 9. 541. 5.vhCDR2, CHA. 9. 541. 5.vhCDR3, CHA. 9. 541. 5.vlCDR1, CHA. 9. 541. 5.vlCDR2 및 CHA. 9.541. 5.vhCDR3;
CHA.9.541.6, CHA. 9. 541. 6.VH, CHA. 9. 541. 6.VL, CHA. 9. 541. 6.HC, CHA. 9. 541. 6.LC, CHA. 9. 541. 6.H1, CHA. 9. 541. 6.H2, CHA. 9. 541.6.H3; CHA.9.541.6.H4, CHA.9.541.6.H4(S241P), CHA. 9. 541. 6.vhCDR1, CHA. 9. 541. 6.vhCDR2, CHA. 9. 541. 6.vhCDR3, CHA. 9. 541. 6.vlCDR1, CHA. 9. 541. 6.vlCDR2 및 CHA. 9.541. 6.vhCDR3;
CHA.9.541.7, CHA. 9. 541. 7.VH, CHA. 9. 541. 7.VL, CHA. 9. 541. 7.HC, CHA. 9. 541. 7.LC, CHA. 9. 541. 7.H1, CHA. 9. 541. 7.H2, CHA. 9. 541. 7.H3; CHA.9.541.7.H4, CHA.9.541.7.H4(S241P), CHA. 9. 541. 7.vhCDR1, CHA. 9. 541. 7.vhCDR2, CHA. 9. 541. 7.vhCDR3, CHA. 9. 541. 7.vlCDR1, CHA. 9. 541. 7.vlCDR2 및 CHA. 9.541. 7.vhCDR3; 및
CHA.9.541.8, CHA. 9. 541. 8.VH, CHA. 9. 541. 8.VL, CHA. 9. 541. 8.HC, CHA. 9. 541. 8.LC, CHA. 9. 541. 8.H1, CHA. 9. 541. 8.H2, CHA. 9. 541. 8.H3; CHA.9.541.8.H4, CHA.9.541.8.H4(S241P); CHA. 9. 541. 8vhCDR1, CHA. 9. 541. 8.vhCDR2, CHA. 9. 541. 8.vhCDR3, CHA. 9. 541. 8.vlCDR1, CHA. 9. 541. 8.vlCDR2 및 CHA. 9.541. 8.vhCDR3.
상기 항체의 CDR을 포함하는 scFv의 경우, 이들은 vhCDR을 갖는 가변 중질 도메인, 링커 및 vlCDR을 갖는 가변 경쇄 도메인을, 다시 말하면 상기와 같이 어느 방향으로든 포함하는 scFv를 포함하는 scFv로서 표지된다. 따라서 본 발명은 scFv-CHA.9.536.3.1, scFv-CHA.9.536.3, scFv-CHA.9.536.4, scFv-CHA.9.536.5, scFv-CHA.9.536.7, scFv-CHA.9.536.8, scFv-CHA.9.560.1, scFv-CHA.9.560.3, scFv-CHA.9.560.4, scFv-CHA.9.560.5, scFv-CHA.9.560.6, scFv-CHA.9.560.7, scFv-CHA.9.560.8, scFv-CHA.9.546.1, scFv-CHA.9.547.1, scFv-CHA.9.547.2, scFv-CHA.9.547.3, scFv-CHA.9.547.4, scFv-CHA.9.547.6, scFv-CHA.9.547.7, scFv-CHA.9.547.8, scFv-CHA.9.547.9, scFv-CHA.9.547.13, scFv-CHA.9.541.1, scFv-CHA.9.541.3, scFv-CHA.9.541.4, scFv-CHA.9.541.5, scFv-CHA.9.541.6, scFv-CHA.9.541.7 및 scFv-CHA.9.541.8를 포함한다.
또한, CHA.9.543은 TIGIT와 결합하지만 TIGIT-PVR 상호작용을 차단하지 않는다.
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 상기 개략된 바와 같이 CDR의 변이체를 포함하여 상기 성분 (CPA 및 CHA)의 변이체를 추가로 제공한다. 따라서, 본 발명은 항체가 여전히 TIGIT에 결합하는 한, CDR 집합에서 1, 2 또는 3개의 아미노산 차이를 포함할 수 있는, 본원에 개략된 바와 같이 6개 CDR의 집합를 포함하는 항체를 제공한다. 본 명세서에 개략된 CDR 서열과 비교하여 돌연변이를 포함하는 항-TIGIT 항체인지 여부를 테스트 하는 적합한 검정법이 비아코아 검정과 같이 당해 기술분야에 공지되어 있다.
또한, 본 발명은 상기 가변 중쇄 및 경쇄의 변이체를 추가로 제공한다. 이 경우, 가변 중쇄는 본 명세서의 "VH" 서열과 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하고/거나, Fc 변이체가 사용될 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "VL" 서열 (특히 CPA.9.086)과 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하고/거나, Fc 변이체가 사용될 때, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 변화를 포함할 수 있는 가변 경쇄가 제공된다. 이들 구현예에서, 본 발명은 항체가 여전히 TIGIT에 결합하는 한, 이들 변이체를 포함한다. 본 명세서에 개략된 CDR 서열과 비교하여 돌연변이를 포함하는 항-TIGIT 항체인지 여부를 테스트 하는 적합한 검정법이 비아코아 검정과 같이 당해 기술분야에 공지되어 있다.
유사하게, 본원에서의 전장 "HC" 및 "LC"서열 (특히 CPA.9.086)과 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하고/거나, Fc 변이체가 사용될 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 중쇄 및 경쇄가 제공된다. 이들 구현예에서, 본 발명은 항체가 여전히 TIGIT에 결합하는 한, 이들 변이체를 포함한다. 본 명세서에 개략된 CDR 서열과 비교하여 돌연변이를 포함하는 항-TIGIT 항체인지 여부를 테스트 하는 적합한 검정법이 비아코아 검정과 같이 당해 기술분야에 공지되어 있다.
또한, 본원에서 CPA 또는 CHA 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 프레임워크 영역은 당해 기술분야에 알려진 바와 같이 (필요에 따라 CDR에서 생성된 우연한 변이체) 인간화될 수 있고 (또는 CHA 항체의 경우, 대안의 인간화 방법이 시행될 수 있는 정도까지 "재인간화"될 수 있음), 따라서 도 53의 VH 및 VL 사슬의 인간화 변이체가 생성될 수 있다 (특히 CPA.9.086). 또한, 인간화 가변 중쇄 및 경쇄 도메인은 다음으로 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 (IgG4 (S241P) 포함)로부터의 불변 영역과 같은 인간 불변 영역과 융합될 수 있다.
상세하게, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 마우스 VH 및 VL 사슬은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어 NCBI 웹사이트의 IgBLAST 프로그램을 사용하여 인간화될 수 있고, 인간화 방법에 대해 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 Ye et al., Nucleic Acids Res. 41: W34-W40 (2013)에 개략된다. IgBLAST는 마우스 VH 및/또는 VL 서열을 가져와서 이를 공지된 인간 생식계열 서열의 라이브러리와 비교한다. 본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 본 명세서에서 생성된 인간화 서열에 대해, 사용된 데이타베이스는 IMGT 인간 VH 유전자 (F+ORF, 273개의 생식계열 서열) 및 IMGT 인간 VL 카파 유전자 (F+ORF, 74개의 생식계열 서열)이었다. 예시적인 다섯 개의 CHA 서열을 선택하였다: CHA.9.536, CHA9.560, CHA.9.546, CHA.9.547 및 CHA.9.541 (도 53 참조). 인간화의 이러한 구현예에서, 인간 생식계열 IGHV1-46 (대립유전자 1)은 5개 모두의 경우에 수용체 서열 및 인간 중쇄 IGHJ4 (대립유전자 1) 연결 영역 (J 유전자)으로서 선택되었다. 네 개 (CHA.7.518, CHA.7.530, CHA.7.538_1 및 CHA.7.538_2) 중 세 개의 경우, 사람 생식계열 IGKV1-39 (대립유전자 1)가 수용체 서열로서 선택되었고, 인간 경쇄 IGKJ2 (대립유전자 1) (J 유전자)가 선택되었다. J 유전자는 IMGT® the international ImMunoGeneTics information system에서 www.imgt.org로서 파일화된 인간 연결 영역 서열로부터 선택된다. CDR은 AbM 정의에 따라 정의되었다 (www.bioinfo.org.uk/abs/ 참조).
일부 구현예에서, 본 발명의 항-TIGIT 항체는 다른 항-TIGIT 항체의 VH 및 VL 서열이 "혼합되어 매칭"되어 다른 항-TIGIT 항체를 생성할 수 있는 항-TIGIT 항체를 포함한다. 이러한 "혼합되어 매칭된" 항체의 TIGIT 결합은 상기에 기술된 결합 분석법, 예로 ELISA 또는 비아코아 검정을 사용하여 테스트될 수 있다. 일부 구현예에서, VH 및 VL 사슬이 혼합되고 매칭될 때, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체된다. 마찬가지로, 일부 구현예에서, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체된다. 예를 들어, 상동성 항체의 VH 및 VL 서열은 특히 혼합 및 매칭에 적합하다.
따라서, 본 발명의 TIGIT 항체는 (a) 본원에 열거된 서열; (b) (a)에서 특정된 CDR 아미노산 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 치환으로 달라지는 서열; (c) (a) 또는 (b)에 특정된 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; (d) 본원에 열거된 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 상세하게, CPA.9.086 항체는 (a), (b), (c) 또는 (d)로부터 선택된 서열을 가질 수 있다.
추가적으로, 본원에서 열거된 TIGIT 항체와 동일성을 공유하는 항체는 TIGIT 항체의 정의에 포함된다. 즉, 소정의 구현예에서, 본 발명에 따른 항-IGIT 항체는 바람직한 항-TIGIT 항체의 항-TIGIT 아미노산 서열의 전부 또는 일부와 동일한 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이는 모체 항-TIGIT 항체의 바람직한 기능적 성질을 보유한다. 두 개 서열 간의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이고 (예로, 상동성% = 동일한 위치의 수/위치의 총수 X 100), 두 개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려한다. 두 개 서열 간의 서열 비교 및 동일성 백분율의 결정은 하기의 비-제한적인 실시예에서 기술된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
두 개의 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 메이어 및 밀러의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있고 (E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)), 이는 PAM120 무게 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하여 ALING 프로그램 (버전 2.0) 내에 통합되었다. 또한, 두 개의 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 니들만 및 운쉬의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있고 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)), 이는 블러섬 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 갭 중량 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 길이 무게 1, 2, 3, 4, 5 또는 6를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 (시판됨)의 GAP 프로그램 내에 통합되었다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공개 데이타베이스에 대한 검색을 수행하는 "질문 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 알트슐 등의 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행 할 수 있다 (Altschule, et al., (1990) J Mol. Biol. 215: 403-10). BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행되어 본 발명의 적어도 일부 구현예에 따라 항체 분자와 상동적인 아미노산 서열을 획득할 수 있다. 비교 목적으로 갭 정렬을 얻기 위해, 갭 BLAST는 Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 사용할 때 각 프로그램 (예로, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개 변수를 사용할 수 있다.
일반적으로, TIGIT 항체 간을 비교하기 위한 동일성 백분율은 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90% 이며, 적어도 약 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성이 바람직하다. 동일성 백분율은 전체 아미노산 서열, 예를 들어 전체 중쇄 또는 경쇄 또는 사슬의 부분을 따라 일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-TIGIT 항체의 정의 내에는 전체 가변 영역 (예를 들어, 동일성이 가변 영역을 따라 95 또는 98% 동일함) 또는 전체 불변 영역을 따라 또는 단지 Fc 도메인을 따라 동일성을 공유하는 것들이 포함된다. 상세하게, 본 발명은 CPA.9.086 항체와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 약 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성 백분율을 갖는 TIGIT 항체를 제공한다.
또한, 동일한 CDR을 가지지만 가변 도메인 (또는 전체 중쇄 또는 경쇄)의 프레임워크 부분에서의 변화를 가질 수 있는 서열도 역시 포함된다. 예를 들어, TIGIT 항체는 도 53에 도시된 CDR과 동일한 CDR을 갖지만, 가변 영역을 따라 동일성이 더 낮을 수 있는, 예를 들어 95 또는 98% 동일성 백분율을 갖는 항체를 포함한다. 상세하게, 본 발명은 CPA.9.086과 동일한 CDR을 가지지만 CPA.9.086과 95 또는 98% 동일한 프레임워크 영역을 갖는 TIGIT 항체를 제공한다.
A. 결합을 경쟁하는 TIGIT 항체
본 발명은 열거된 항체뿐만 아니라 TIGIT 분자에 특이적으로 결합하기 위해 열거된 항체와 경쟁하는 추가적인 항체 (본원에서 열거된 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 CPA 번호)를 제공한다. 실시예 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 TIGIT 항체는 상이한 에피토프 빈 내에 "비닝"할 수 있다. 에피토프 비닝 연구에서 44개의 TIGIT 항체 중에서 4개의 집단이 있으며, 각각은 관련된 쌍을 이루는 차단 양상을 가지고, 본 명세서에서 개략되고 도 67 및도 68에 도시된 12개의 구별된 빈으로 분리된다. 본원에 개략된 12개의 구별된 빈이 있다: 1) BM9-H4, CHA.9.525, CPA.9.081-H4, CHA.9.538, CHA.9.553, CPA.9.069-H4, CHA.9.543, CHA.9.556, CPA.9.077-H4 및 CHA.9.561; 2) CHA.9.560 및 CHA.9.528; 3) CHA.9.552, CHA.9.521, CHA.9.541, CHA.9.529, CHA.9.519, CHA.9.527 및 CHA.9.549; 4) CPA.9.057-H4 및 CHA.9.554; 5) CHA.9.546, CPA.9.012-H4, CHA.9.547, CPA.9.013-H4, CPA.9.018-H4, MBSA43-M1, 시노 PVR-Fc(리간드), CHA.9.555, PVR-Fc M2A(리간드), BM29-H4, CPA.9.027-H4, CPA.9.049-H4 및 CPA.9.053-H4; 6) CPA.9.064-H4; 7) BM26-H4; 8) CPA.9.059-H4; 9) CHA.9.535 및 CPA.9.009-H4; 10) CHA.9.536, CHA.9.522 및 CPA.9.015-H4; 11) CPA.9.011-H4 및 BM8-H4 및 12) CPA.9.071-H4.
따라서, 본 발명은 구별된 에피토프 빈 1 내지 12에 존재하는 항체와의 결합을 경쟁하는 항-TIGIT 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CPA.9.086과의 결합을 경쟁하며 CPA.9.086과 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 항-TIGIT 항체를 제공한다.
열거된 항체와 경쟁하는 추가적인 항체가 당해 기술분야에 공지되고 일반적으로 하기에 개략된 바와 같이 생성된다. 경쟁적인 결합 연구는 일반적으로 SPR/비아코아® 결합 검정법뿐만 아니라 ELISA 및 세포-기반의 검정법을 사용하여 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 시행될 수 있다.
VIII. PVRIG 항체
본 발명은 항-PVRIG 항체를 제공한다. (편의상, "항-PVRIG 항체" 및 "PVRIG 항체"는 상호교환적으로 사용된다). 본 발명의 항-PVRIG 항체는 인간 PVRIG, 바람직하게는 인간 PVRIG의 ECD에 특이적으로 결합한다.
PVRIG 또는 PVRIG 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들어 적어도 약 10-4 M, 적어도 약 10-5 M, 적어도 약 10-6 M, 적어도 약 10-7 M, 적어도 약 10-8 M, 적어도 약 10-9 M, 대안적으로 적어도 약 10-10 M, 적어도 약 10-11 M 이상, 약 10-12 M 이상의 KD를 갖는 항체에 의해 나타날 수 있고, KD는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 말한다. 전형적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 PVRIG 항원 또는 에피토프의 대조군 분자에 대해 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000-, 10,000배 이상인 KD를 가질 것이다.
그러나, 국제특허출원 WO2016/134333의 실시예에 나타낸 바와 같이, NK 및 T-세포의 표면 상에 발현된 PVRIG에 대한 최적의 결합의 경우, 항체는 바람직하게는 50 nM 미만, 가장 바람직하게는 1 nM 미만의 KD를 가지고, 1 pM 미만 및 0.1 pM 미만이 본 발명에서 용도를 찾는다.
또한, 특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은, 예를 들어 PVRIG 항원 또는 에피토프에 대해 대조군과 비교하여 적어도 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000- 또는 10,000배 이상의 KA 또는 Ka를 갖는 항체에 의해 나타날 수 있고, KA 또는 Ka는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 말한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-PVRIG 항체는 인간 PVRIG에 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 또는 1 nM 이하 (즉, 높은 결합 친화성), 또는 1 pM 이하의 KD로 결합하고, KD는 공지된 방법 예로 표면 플라즈몬 공명 (SPR, 예로 비아코어 검정), ELISA, KINEXA, 가장 전형적으로는 25
Figure 112019022434593-pct00004
C 또는 37
Figure 112019022434593-pct00005
C에서의 SPR에 의해 결정된다.
항-PVRIG 항체에 대한 결합 친화성은 놀랍게도 활성과 상관되는 점을 주목하는 것이 중요하다. 스크리닝 데이타의 누적 분석은 본 발명의 항-PVRIG 항체의 친화성이 일차 인간 T 세포에 결합하는 그들의 능력과 높게 상관되는 점을 보여준다. 보다 구체적으로, T 세포에서 가장 높은 최대 신호를 주는 항체는 피코몰 범위의 친화성을 갖는 항체이었다. 낮은 나노몰 범위 초과의 친화성을 갖는 항체는 T 세포에 비교적 약한 최대 신호를 주었다. 따라서, 데이타는 T 세포-기반의 면역요법에 대한 항-PVRIG 항체의 유용성이 부분적으로 친화성에 기초하여 정의될 수 있음을 지시한다. 본원에서 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO 2016/134333으로부터의 항체 서열, 상세하게 도 38 (PVRIG와 결합하고 PVRIG와 PVRL2의 상호작용을 차단하는 서열을 도시함)에 개략된 항-PVRIG 항원-결합 도메인, 도 39 (PVRIG와 결합하고 PVRIG 및 PVRL2의 상호작용을 차단하지 않는 서열을 도시함), 도 40 (이들 항체로부터의 CDR 및 데이타를 도시함) 및 도 41 (결합하고 차단하는 하이브리도마로부터의 CDR을 도시함)에 개략된 항-PVRIG 항원 결합 도메인을 위한 서열이 언급된다. 즉, 도면 및 도면 설명뿐만 아니라 국제특허출원 WO2016/134333의 모든 CPA.7 및 CHA.7 항체 (CDR, VH 및 VL 및 전장의 서열 포함)로부터의 특정 서열 및 서열번호가 본원에 명시적으로 통합된다.
도 45 일차 CD8 T 세포에 결합하는 친화성 상이한 두 개의 항-PVRIG 항체의 능력을 도시한다. 도 45에 나타낸 바와 같이, CHA.7.518은 PVRIG를 과다-발현하도록 조작된 HEK 세포 (HEK hPVRIG)에 결합에 의해 측정되는 바 CPA.7.021 (국제특허출원 WO2016/13433의 서열)보다 대략 8배 더 높은 친화성을 갖는다. 이것과 부합하여, CHA.7.518은 Jurkat 세포에 결합에 의해 측정된 바 CPA.7.021보다 약 13배 더 높은 친화성을 갖는다. CHA.7.518의 더 높은 친화성은 HEK hPVRIG 세포로부터의 최대 결합 신호에 상응하지만 Jurkat 세포에서는 그렇지 않았다.
대조적으로, CHA.7.518은 일관되게 CPA.7.021과 비교하여 일차 CD8 T 세포로부터 더 높은 최대 결합 신호를 주었다. 이것은 서로 다른 농도의 이소형 또는 항-PVRIG 항체를 일차 CD8 T 세포에 첨가하고 결과로 생성된 최대 결합 신호를 측정하는 결합 적정 실험에서 설명된다. 두 명의 설명된 공여자 (도 45)에서, CHA.7.518는 일관되게 적정 의존적 방식으로 CPA.7.021보다 더 높은 최대 신호 (기하학적 평균 형광 강도, gMFI)을 주었다. gMFIr = 관심있는 항체의 기하학적 형광 강도/대조군 항체의 기하학적 형광 강도. gMFIr은 관심있는 항체가 이소형 항체와 비교하여 둘 다의 고정된 농도에서 주는 신호를 측정한다.
따라서, 본 발명의 항-PVRIG 항체는 피코몰 범위, 예로 0.1 내지 9 pM, 바람직한 약 0.2 내지 약 2, 특히 사용되는 약 0.2 내지 약 0.5의 결합 친화성 (본원에 개략된 기술을 사용하여 측정됨)를 갖는다.
TIGIT 항체와 마찬가지로, PVRIG 항체는 다음과 같이 유사하게 표지된다. 항체는 참조 번호, 예를 들어 "CHA.7.518.1"를 갖는다. 도3도 3에 도시된 바와 같이, 이것은 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 조합을 나타내고, 예를 들어 이들 항체가 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함하는 것으로 이해된다. "CPA. 7.518.1.VH"는 CPA. 7.518.1의 가변 중쇄를 말하는 한편, "CPA.7.518.1.VL"는 가변 경쇄이다. "CPA. 7.518.1.vhCDR1", "CPA.7.518.1.vhCDR2", "CPA. 7.518.1.vhCDR3", "CPA. 7.518.1.vlCDR1", "CPA. 7.518.1.vlCDR2" 및 "CPA. 7.518.1.vlCDR3"은 지시된 CDR을 말한다. "CPA. 7.518.1.HC"는 이 분자의 전체 중쇄 (예로, 가변 및 불변 도메인)을 말하고, "CPA. 7.518.1.LC"는 동일한 분자의 전체 경쇄 (예로, 가변 및 불변 도메인)을 말한다. 일반적으로, 인간 카파 경쇄는 본원에서의 각 파지 (또는 인간화 하이브리도마) 항체의 불변 도메인으로 사용되지만, 일부 구현예에서는 람다 경쇄 불변 도메인이 사용된다. "CPA. 7.518.1.H1"은 인간 IgG1 (Human IgG1)의 불변 도메인을 포함하는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 전장의 항체를 말한다 (따라서, H1; IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서열은 도 50도 50에 나타냄). 따라서 "CPA. 7.518.1.H2"는 인간 IgG2에 연결된 CPA. 7.518.1 가변 도메인일 것이다. "CPA. 7.518.1.H3"은 인간 IgG3에 연결된 CPA. 7.518.1 가변 도메인일 것이고, "CPA. 7.518.1.H4"는 인간 IgG4에 연결된 CPA. 7.518.1 가변 도메인일 것이다. 일부 경우에, 인간 IgG는 하기에 설명하는 것과 같은 추가적인 돌연변이를 가질 수 있으며 주석이 달릴 수 있는 점을 주목하라. 예를 들어, 많은 구현예에서, 인간 IgG4에서 S241P 돌연변이가 있을 수 있으며, 이는 예를 들어 "CPA. 7.518.1.H4 (S241P)"로서 주석을 달 수 있다. 이러한 S241P 힌지 변이체를 갖는 인간 IgG4 서열은 도 50에 나타낸다. 다른 잠재적인 변이체는 IgG1 (N297A) (또는 이 부위에서 글리코실화 및 이로써 FcγRIIIa 결합과 관련된 많은 효과기 기능을 제거한 다른 변이체) 및 IgG1(D265A)이고, 이는 FcγR 수용체에 대한 결합을 감소시킨다.
본 발명은 또한 가변 중쇄 및 경쇄 도메인뿐만 아니라 전장의 중쇄 및 경쇄를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 상기 개략된 바와 같이 scFv 링커에 의해 연결된 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하는 PVRIG에 결합하는 scFv를 제공한다. VL 및 VH 도메인은 예로 N-말단부터 C-말단까지 "VH-링커-VL" 또는 "VL-링커-VH" 어느 방향으로든 될 수 있다. 이들은 성분 요소에 의해 명명되고, 예를 들어 "scFv-CHA.7.518.1VH-링커-VL " 또는 "scFv-CHA.7.518.1.VL-링커-VH"이다. 따라서 "scFv-CPA. 7.518.1"은 어느 방향으로든 될 수 있다.
IX. 항체를 인코딩하는 핵산
본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 조성물뿐만 아니라 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 핵산 및/또는 발현 벡터 조성물로 형질전환된 숙주 세포도 역시 제공된다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 본원에 도시된 단백질 서열은 유전 코드의 축퇴성으로 인해 임의의 수의 가능한 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
항체를 인코딩하는 핵산 조성물은 항체의 형식에 의존할 것이다. 전통적으로, 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함하는 사량체 항체는 두 개의 상이한 핵산에 의해 인코딩되며, 하나는 중쇄를 인코딩하고 다른 하나는 경쇄를 인코딩한다. 이들은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 단일 발현 벡터 또는두 개의 발현 벡터 내에 삽입되어 본 발명의 항체를 형성하도록 발현되는 숙주 세포 내에 형질전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 scFv 구조물이 사용될 때, 가변 중쇄-링커-가변 경쇄를 인코딩하는 단일 핵산이 일반적으로 사용되며, 이는 숙주 세포 내로의 형질전환을 위한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 핵산은 신호 및 분비 서열, 조절 서열, 프로모터, 복제 원점, 선별 유전자 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 적절한 전사 및 번역 조절 서열을 포함하는 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다.
본 발명의 적어도 일부 구현예에 따라 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 중국 햄스터 난소 (CHO 세포), PER.C6, HEK293 및 기타를 포함한다.
핵산은 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당해 기술분야에 잘 공지된 기타를 포함하는 표준 기술에 의해 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예로 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리된" 또는 "실질적으로 순수하게 된다".
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-인코딩 DNA 단편은 가요성 링커를 인코딩하는, 예로 본원에서 논의된 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3 및 기타를 인코딩하는 또 다른 단편과 작동가능하게 연결되어 VH 및 VL 서열이 가요성 링커에 의해 연결된 VL 및 VH 영역을 갖는 인접한 단일-사슬 단백질로 발현될 수 있다.
X. 제형물
전술한 방법의 실행에 사용되는 치료적 조성물 (상세하게 CHA.7.518.1.H4(S241P) 및 CPA.9.086)은 원하는 전달 방법에 적합한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 치료적 조성물과 조합될 때 치료적 조성물의 항-종양 기능을 보유하고 일반적으로 환자의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예로는 멸균 인산염 완충 식염수, 정균수 등과 같은 다수의 표준 약제학적 담체 중 임의의 것을 포함하나 이에 한정되지는 않는다 (일반적으로, Remington 's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980 참조). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 채용되는 용량과 농도에서 수여자에게 독성이 없으며 완충액을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 염으로서 존재하는 것과 같은 수용성 형태일 수 있으며, 산 및 염기 부가염 모두를 포함하도록 의미한다. "약제학적으로 허용가능한 산 부가염"은 유리 염기의 생물학적 유효성을 보유하고 생물학적으로 또는 달리 해롭지 않으며, 무기산 등으로 형성된 염을 말한다. "약제학적으로 허용가능한 염기 부가염"은 무기 염기 등으로부터 유래한 염을 포함한다.
바람직하게는 멸균 수용액 형태의 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는 피하 및 정맥 내를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 방식으로 시행될 수 있다.
투여량 및 투여 빈도는 바람직한 구현예에서 치료적으로 또는 예방적으로 효과적이 되도록 선택된다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 단백질 분해, 전신 대 국소 전달, 및 새로운 프로테아제 합성 속도뿐만 아니라 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용 및 병태의 중증도를 위한 조정이 필요할 수 있고, 당업자에 의한 통상적인 실험법으로 확인가능할 것이다.
환자를 치료하기 위해, 치료적 유효량의 본 발명의 Fc 변이체를 투여할 수 있다. 본원에서 "치료적 유효량"은 투여되는 효과를 생성하는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료 목적에 따라 달라질 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 것이다.
XI. 항체의 사용 방법
PVRIG 및 TIGIT 항체를 포함하는 본 발명의 항체는 다수의 진단적 및 치료적 적용에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 환자에게 투여할 항체의 결정은 시료 종양 생검의 발현 수준 (유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준 둘 중 하나, 후자가 바람직함)의 평가를 사용하여 시행되어 시료가 TIGIT 또는 PVRIG 또는 둘 다를 과다발현하는 여부를 결정하여 투여할 치료 항체를 결정한다.
A. 진단적 용도
따라서, 본 발명의 항체는 또한 PVRIG 또는 TIGIT를 각각 과다-발현하는 종양의 영상화를 포함하는 시험관내 또는 생체내 진단에서 용도를 찾는다. 그러나 본 명세서에서 논의된 바와 같이, TIGIT 및 PVRIG 둘 다는 면역-종양학 표적 단백질로서 암 세포에서 반드시 과다발현되는 것이 아니라 암에서의 면역 침윤 내인 것을 주목해야 한다. 따라서 이것은 암 진단을 유도하는 작용 기작, 예로 T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포의 활성화이다. 따라서, 이들 항체는 암을 진단하는데 사용될 수 있다. PVRIG 항체를 이용한 진단은 또한 본원에서 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO 2016/134333, [0434 내지 0459]에 개략되어 있다.
일반적으로, 진단은 여러 방식으로 시행될 수 있다 일 구현예에서, 생검 시료와 같은 환자로부터의 조직을 항체가 내인성 TIGIT에 결합하도록 일반적으로 표지된 TIGIT 항체와 접촉시킨다. 신호 수준은 암의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 동일한 환자 또는 기준 시료로부터의 정상적인 비-암성 조직의 신호 수준과 비교된다. 생검 시료는 고형 종양, 혈액 시료 (ALL, T-세포 림프종 등과 같은 림프종 및 백혈병의 경우)로부터 나올 수 있다.
일반적으로, 본 구현예에서, 항-TIGIT는 예를 들어 당해 기술분야에 잘 공지된 바와 같이 형광 측정기 또는 다른 광학적 검출 시스템을 사용하여 검출되는 형광단 또는 다른 광학적 표지로 표지된다. 대안적인 구현예에서, 이차 표지된 항체를 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어 다른 포유동물 (마우스, 래트, 토끼, 염소 등)로부터의 항-인간 IgG 항체를 사용하여 샌드위치 검정을 형성하는 시료과 접촉시킨다.. 대안적으로, 항-IGIG 단일클론 항체는 직접적으로 표지 (예로, 바이오틴) 될 수 있으며, 검출은 당해 기술분야의 표지화 제제에게 유도되는 이차 Ab에 의해 시행될 수 있다.
일단 TIGIT의 과다-발현이 관찰되면, 치료는 본 명세서에 개략된 바와 같은 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체의 투여로 진행될 수 있다.
다른 구현예에서, 생체내 진단이 시행된다. 일반적으로, 본 구현예에서, 항-IGIG 항체 (항체 단편 포함)를 환자에게 주입하고 영상화가 시행된다. 본 구현예에서, 예를 들어 항체는 일반적으로 가돌리늄 킬레이트, 단일클론 항체 (단편 포함)의 방사성 표지화와 같은 광학적 표지 또는 MRI 표지로 표지된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 진단 및 치료 둘 다 또는 진단 단독을 위해 사용된다. 항-TIGIT 항체가 진단 및 치료 둘 다에 사용될 때, 일부 구현예는 진단 항체가 치료 항체와의 결합에 대해 경쟁하지 않도록 두 개의 상이한 에피토프에 대한 두 개 상이한 항-TIGIT 항체에 의존하지만, 일부 경우에는 동일한 항체를 둘 다에 사용할 수 있다 예를 들어, 이것은 상이한 빈 (bin)에 있는 항체, 예로 본 명세서에 개략된 바와 같은 TIGIT 상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 진단 항체 및 치료 항체를 포함하는 조성물이 본 발명에 포함되며, 일부 구현예에서는 진단 항체가 본원에 기술된 바와 같이 표지된다. 또한, 치료 및 진단 항체의 조성물은 본 명세서에 개략된 바와 같이 다른 약물과 함께 공동-투여될 수 있다.
진단에 사용하는 데 특히 유용한 항체는 이들 열거된 항체 또는 변이체 서열을 갖는 CDR을 활용하는 항체 또는 도 53의 임의의 항체와의 결합을 경쟁하는 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
많은 구현예에서, 진단 항체는 표지된다. 본원에서 "표지된"은, 본원에 개시된 항체가 스크리닝 또는 진단적 절차에서 검출을 가능하게 하도록 부착된 하나 이상의 원소, 동위원소 또는 화학적 화합물을 갖는 것을 의미한다. 일반적으로 표지는 다음의 여러 부류로 나뉜다: a) 항체에 의해 인식되는 융합 파트너로 도입된 에피토프일 수 있는 면역 표지, b) 방사성 또는 무거운 동위원소일 수 있는 동위원소 표지, c) 형광 및 비색측정 염료, 또는 다른 표지화 방법을 가능하게 하는 바이오틴과 같은 분자를 포함할 수 있는 소분자 표지, 및 d) 입자 (초음파 표지화를 위한 거품 포함) 또는 신체 영상화를 허용하는 상자성 표지과 같은 표지. 표지는 임의의 위치에서 항체로 도입될 수 있으며, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 단백질 발현 동안 시험관내 또는 생체내에 도입될 수 있다.
진단은 하기 기술된 바와 같이 신체 영상화를 가능하게 하는 진단 항체의 투여에 의해 생체내에서 또는 환자로부터 제거된 시료 상에서 시험관내로 수행될 수 있다. 이 맥락에서의 "시료"는 체액 (혈액, 소변, 혈청, 림프, 타액, 항문과 질 분비물, 땀과 정액을 포함하나 이에 한정되지 않음), 뿐만 아니라 적절한 조직의 생검 결과와 같은 조직 시료를 포함하나 이에 한정되지는 않는 임의의 시료를 포함한다.
또한, 하기에 및 실시예 및 도면에 개략된 바와 같이, PVRIG 또는 TIGIT, 또는 둘 다 또는 PVRIG 및 PD-1, 또는 TIGIT 및 PD-1의 단백질 발현 수준에 관한 정보는 환자에게 투여되어야 할 항체를 결정하는 데 사용될 수 있다.
B. 암 치료
본 발명의 항체는 특히 암 치료에서 용도를 찾는다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 암세포를 직접 공격하는 것이 아니라, 일반적으로 체크포인트 수용체 (예로, PVRIG 또는 TIGIT)의 작용을 억제함으로써 면역계를 자극하는 면역조절성이다. 따라서 종양 성장 및 발달에 중요한 분자 경로를 억제하고/거나 종양 세포를 고갈시키는 것을 목표로 하는 종양-표적화 요법과는 달리, 암 면역요법은 환자 자신의 면역계를 자극하여 암세포를 제거하고, 오래된 종양 파괴를 목표로 한다. 암 면역요법에는 다양한 접근법이 사용될 수 있고, 이들 중 종양-특이적 T 세포 반응을 유도하는 치료용 암 백신 및 면역억제 경로를 제거하는 면역자극성 항체 (예로, 억제 수용체의 길항제 = 면역 체크포인트)가 있다.
표적화된 치료 또는 통상적인 항암 요법으로의 임상 반응은 암세포가 저항성을 나타내고 종양 재발이 일어나기 때문에 일시적인 경향이 있다 그러나, 지난 수년 동안 암 면역요법의 임상적 사용은 이러한 유형의 치료가 장기적인 생존에 극적인 영향을 미치는 지속적인 임상 반응을 나타낼 수 있음을 보여주었다. 그러나, 반응이 장기적이더라도 단지 소수의 환자만이 반응한다 (매우 많은 수의 환자가 반응하지만 반응이 일시적인 통상적이거나 표적화된 치료와는 반대임).
종양이 임상적으로 검출될 때는 이미 면역저항성 및 면역억제성 성질을 획득하고 다양한 기전 및 다양한 면역 세포를 통해 면역억제성 종양 미세환경을 생성함으로써 면역-방어 시스템을 회피하였다.
따라서, 본 발명의 항체는 암을 치료하는 데 유용하다. 면역-종양학 작용 기작의 특성으로 인해, 체크포인트 수용체 (TIGIT 또는 PVRIG)는 반드시 특정 암 유형에서 과다발현되거나 상관될 필요는 없고; 즉, 목표는 항체가 T 세포 및 NK 세포 활성화를 탈억제하게 하여 면역계가 암을 따르게 하는 것이다.
본원에서 사용되는 "암"은 악성 성장 또는 종양 (예로, 조절되지 않은 세포 성장)을 유발하는 비정상적이고 제어되지 않은 세포 분열을 특징으로 하는 임의의 신생물 질환 (침윤성 또는 전이성)을 광범위하게 말한다. 본원에 사용된 용어 "암" 또는 "암성"은 악성 성장 또는 종양, 본원에 기술된 비-제한적인 예를 유발하는 비정상적이고 조절되지 않는 세포 분열을 특징으로 하는 임의의 신생물 질환 (침윤성, 비-침윤성 또는 전이성)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이것은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 임의의 생리학적 병태를 포함한다. 암의 예는 실시예에 예시되고, 또한 본 명세서 내에 역시 기술되어 있다.
본 발명의 항체를 사용하여 치료될 수 있는 암의 비-제한적인 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는 편평세포암, 폐암 (소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 샘암종 및 폐의 편평상피 암종 포함), 복막 암, 간세포암, 위암 또는 위장암 (위창자암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 흑색종, 비-흑색종 피부암 (편평 및 기저 세포 암종), 간암, 방광암, 간 암종, 유방암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액샘 암종, 신장 또는 신장암, 간암, 전립선 암, 외음부 암, 갑상샘 암, 간 임종 및 다양한 유형의 두경부암, 뿐만 아니라 B-세포 림프종 (저 등급/여포 비-호지킨 림프종 (NHL); 소림프성 (SL) NHL; 중등급/여포 NHL; 중등급 확산 NHL; 고등급 면역모세포 NHL; 고등급 림프모구 NHL; 고등급 비-절단성 소세포 NHL; 대용량 질환 NHL; 피질세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 왈덴스트롬 거대글로불린혈증 포함), 만성 림프세포 백혈병 (CLL), 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 털세포 백혈병, 만성 골수모세포 백혈병, 다발성 골수종 및 이식후 림프증식 성 장애 (PTLD)를 포함한다.
국제특허출원 WO2016/134333의 실시예에 나타난 바와 같이, PVRIG는 다양한 기원의 다수의 상이한 종양에서 종양 림프구 침윤 (CD3, CD4, CD8 및 PD-1 발현과의 상관 관계에 의해 입증됨)에서 과다발현되고/거나 이와 상관되며, 따라서 전립선암, 간암 (HCC), 결장직장암, 난소암, 자궁내막암, 유방암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 두경부암, 갑상샘암, 고환암, 요로상피암, 폐암, 흑색종, 비흑색종 피부암 (편평 및 기저세포 암종), 교모세포종, 신장암 (RCC), 림프종 (비-호지킨 림프종 (NHL) 및 호지킨 림프종 (HD)), 급성 골수성 백혈병 (AML), T 세포 급성 림프모구 백혈병 (T-ALL), 확산성 B 대세포 림프종, 고환 생식세포 종양, 중피종 및 식도암를 포함하나 이에 한정되지는 않는 임의의 암을 치료하는 데 유용하다.
상세하게, CHA.7.518.1H4 (S241P)는 전립선암, 간암 (HCC), 결장직장암, 난소암, 자궁내막암, 유방암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 두경부암, 갑상샘암, 고환암, 요로상피암, 폐암, 흑색종, 비흑색종 피부암 (편평 및 기저세포 암종), 교모세포종, 신장암 (RCC), 림프종 (NHL 또는 HL), 급성 골수성 백혈병 (AML), T 세포 림프모구 백혈병 (T-ALL), 확산성 B 대세포 림프종, 고환 생식세포 종양, 중피종, 방광암 및 식도암을 치료하는 데 용도를 찾는다.
상세하게, CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 전립선암, 간암 (HCC), 결장직장암, 난소암, 자궁내막암, 유방암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 두경부암, 갑상샘암, 고환암, 요로상피암, 폐암, 흑색종, 비흑색종 피부암 (편평 및 기저세포 암종), 교모세포종, 신장암 (RCC), 림프종 (NHL 또는 HL), 급성 골수성 백혈병 (AML), T 세포 림프모구 백혈병 (T-ALL), 확산성 B 대세포 림프종, 고환 생식세포 종양, 중피종, 방광암 및 식도암을 치료하는 데 용도를 찾는다.
상세하게, CPA.9.086H4 (S241P)는 전립선암, 간암 (HCC), 결장직장암, 난소암, 자궁내막암, 유방암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 두경부암, 갑상샘암, 고환암, 요로상피암, 폐암, 흑색종, 비흑색종 피부암 (편평 및 기저세포 암종), 교모세포종, 신장암 (RCC), 림프종 (NHL 또는 HL), 급성 골수성 백혈병 (AML), T 세포 림프모구 백혈병 (T-ALL), 확산성 B 대세포 림프종, 고환 생식세포 종양, 중피종, 방광암 및 식도암을 치료하는 데 용도를 찾는다.
상세하게, CPA.9.083H4 (S241P)는 전립선암, 간암 (HCC), 결장직장암, 난소암, 자궁내막암, 유방암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 두경부암, 갑상샘암, 고환암, 요로상피암, 폐암, 흑색종, 비흑색종 피부암 (편평 및 기저세포 암종), 교모세포종, 신장암 (RCC), 림프종 (NHL 또는 HL), 급성 골수성 백혈병 (AML), T 세포 림프모구 백혈병 (T-ALL), 확산성 B 대세포 림프종, 고환 생식세포 종양, 중피종, 방광암 및 식도암을 치료하는 데 용도를 찾는다.
상세하게, CHA.9.547.7.H4 (S241P)는 전립선암, 간암 (HCC), 결장직장암, 난소암, 자궁내막암, 유방암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 두경부암, 갑상샘암, 고환암, 요로상피암, 폐암, 흑색종, 비흑색종 피부암 (편평 및 기저세포 암종), 교모세포종, 신장암 (RCC), 림프종 (NHL 또는 HL), 급성 골수성 백혈병 (AML), T 세포 림프모구 백혈병 (T-ALL), 확산성 B 대세포 림프종, 고환 생식세포 종양, 중피종, 방광암 및 식도암을 치료하는 데 용도를 찾는다.
상세하게, CHA.9.547.13.H4 (S241P)는 전립선암, 간암 (HCC), 결장직장암, 난소암, 자궁내막암, 유방암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 두경부암, 갑상샘암, 고환암, 요로상피암, 폐암, 흑색종, 비흑색종 피부암 (편평 및 기저세포 암종), 교모세포종, 신장암 (RCC), 림프종 (NHL 또는 HL), 급성 골수성 백혈병 (AML), T 세포 림프모구 백혈병 (T-ALL), 확산성 B 대세포 림프종, 고환 생식세포 종양, 중피종, 방광암 및 식도암을 치료하는 데 용도를 찾는다.
C. TIGIT 항체 단일요법
본 발명의 TIGIT 항체는 특히 단일요법으로서 암의 치료에서 용도를 찾는다. 면역-종양학 작용 기작의 특성으로 인해, TIGIT는 반드시 특정 암 유형에서 과다발현되거나 상관될 필요는 없고; 즉, 목표는 항-TIGIT 항체가 T 세포 및 NK 세포 활성화를 탈억제하게 하여 면역계가 암을 따르게 하는 것이다.
도 53의 임의의 항-TIGIT 항체가 암 (하기에 설명된 바와 같이 T 세포의 활성화 포함)의 치료에 용도를 찾은 한편, CPA.9.086.H4(S241P), CPA.9.083.H4(S241P), CHA.9.547.7.H4(S241P), 및 CHA.9.547.13.H4(S241P)은 특히 일부 구현예에서 용도를 찾는다.
D. PVRIG 항체 단일요법
본 발명의 PVRIG 항체는 특히 단일요법으로서 암의 치료에서 용도를 찾는다. 면역-종양학 작용 기작의 특성으로 인해, TIGIT는 반드시 특정 암 유형에서 과다발현되거나 상관될 필요는 없고; 즉, 목표는 항-TIGIT 항체가 T 세포 및 NK 세포 활성화를 탈억제하게 하여 면역계가 암을 따르게 하는 것이다.
특히, CHA.7.518.1H4 (S241P)는 단일 요법으로 사용된다.
유사하게, CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 단일요법으로서 전립선암, 간암 (HCC), 결장직장암, 난소암, 자궁내막암, 유방암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 두경부암, 갑상샘암, 고환암, 요로상피암, 폐암, 흑색종, 비흑색종 피부암 (편평 및 기저세포 암종), 교모세포종, 신장암 (RCC), 림프종 (NHL 또는 HL), 급성 골수성 백혈병 (AML), T 세포 림프모구 백혈병 (T-ALL), 확산성 B 대세포 림프종, 고환 생식세포 종양, 중피종, 방광암 및 식도암을 치료하는 데 용도를 찾는다.
E. 조합 요법
당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 면역요법 표적을 표적하는 치료 항체 및 질환 병태에 특이적인 추가적 치료제를 포함하는 조합 요법이 크게 유망하다. 예를 들어, 면역요법 분야에는 화학치료제 (소분자 약물 또는 항-종양 항체) 또는 면역-종양학 항체를 사용한 다수의 유망한 조합 요법이 있다.
용어 "조합으로 투여" 및 "공동-투여"는 정확히 동시에 상기 예방제 또는 치료제의 투여에 한정되지 않는다. 대신에, 항체 및 다른 제제 또는 제제들은 단지 본 발명의 항체 또는 다른 제제 또는 제제들로의 치료 대비 증가되는 유익을 제공하기 위해 다함께 작용할 수 있도록 순차적으로 및 시간 간격 내에서 투여되는 것을 의미한다. 항체 및 다른 제제는 추가적으로 작용하는 것이 바람직하며, 상승적으로 작용하는 것은 특히 바람직하다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 적절하게 조합하여 존재한다. 숙련된 의사는 경험적으로 또는 제제의 약동학 및 작용 방식, 적절한 각 치료제의 용량 또는 용량들, 뿐만 아니라 적절한 투여 시기 및 방법을 고려하여 결정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 치료 요법 또는 제제와 동시에 투여될 수 있다. 추가적인 치료 요법 또는 제제는 항체의 효능 또는 안전성을 개선시키는데 사용될 수 있다. 또한, 추가적인 치료 요법 또는 제제는 항체의 작용을 변경하기보다는 동일한 질환 또는 동반 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 화학요법, 방사선요법, 또는 화학요법 및 방사선요법 둘 다와 함께 환자에게 투여될 수 있다.
1. 소분자 화학치료제를 가진 TIGIT 항체
본 발명의 TIGIT 항체는 세포독성제, 화학치료제, 사이토카인, 성장 저해제, 항-호르몬제, 키나제 저해제, 항-혈관형성 제제, 심장보호제, 면역자극성 제제, 면역억제제, 혈액학적 세포의 증식을 촉진시키는 제제, 혈관형성 저해제, 단백질 티로신 키나제 (PTK) 저해제 또는 다른 치료제를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제와 조합하여 투여될 수 있다.
이러한 맥락에서 "화학치료제"는 암의 치료에 유용한 화합물이다. 화학치료제의 예로는 티오테파 및 사이클로스포스포아미드와 같은 알킬화제, 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬설포네이트; 벤조도파, 카보퀴온, 메튜레도파 및 우레도파와 같은 아지리 딘; 알트레타민, 트레에틸렌 멜라민, 트리에틸렌 포스포라미드, 트리에틸렌 티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토제닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라 하이드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베 툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프로테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도제레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스펀지스타틴; 클로로암부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무?응?, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파 미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님무스틴과 같은 니트로소우레아; 에네디인 항생제 (예로, 칼레케아미신, 특히 칼레케아미신 감마II 및 칼리케아미신 오메가II (예로, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994) 참조); 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 에스페라미신와 같은 항생제; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 액티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마신, 캑티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 딕티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조 -5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (몰포리노-독소루비신, 시아노몰포리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 마이코 페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페프로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, ?quot;라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트 및 5- 플루오로우라실 (5-FU)과 같은 항-대사물질; 데노프 테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르 캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모 푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시퓨리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항-아드레날; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세그락톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트라세이트; 디포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미토잔트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK.RTM. 폴리사카라이드 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라조잔; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아조퀴논; 2,2', 2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카바 진; 만노무스틴; 미토브론니톨; 미토락톨; 피포브로만; 개사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오 테파; 택소이드, 예로 파크리탁셀 (TAXOL®; Bristol-Myers Squibb Oncology, NJ), ABRAXANE® 파크리탁셀의 무-크레모포어, 알부민-조작된 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) 및 도세탁셀 (TAXOTERE®; Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; 젬시타빈 (GEMZARM®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴 (VELBAN®); 옥살리플라틴; 류코보린; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포 이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 카페시타빈 (XELODA®); 상기 임의의 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니졸론의 조합 요법의 약자인 CHOP; 사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니졸론의 조합 요법의 약자인 CVP; 및 5-FU 및 류코보린과 조합한 옥살리플라틴 (ELOXATIN®)으로의 치료 요법의 약자인 FOLFOX와 같은 상기 둘 또는 그 이상의 조합을 포함한다.
적어도 일부 구현예에 따르면, 항-TIGIT 면역 분자는 당해 기술분야의 공지된 표준 간호의 암 치료와 함께 사용될 수 있다 (예를 들어, http://www.cancer.gov/cancertopics에서 찾을 수 있음).
따라서, 일부 경우에 본원에서 개략된 항-PVRIG 항체 (상세하게 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 또는 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 포함)는 화학치료제와 조합될 수 있다. 유사하게, 본원에서 개략된 항-TIGIT 항체 (상세하게 CPA.9.086H4 (S241P) CPA.9.083H4 (S241P) 및 CHA.9.547.13.H4 (S241P) 포함)는 화학치료제와 조합될 수 있다.
또한, 본 발명의 항-PVRIG 항체 및 항-TIGIT 항체는 다른 체크포인트 억제제 또는 활성제와 함께 투여 될 수 있다.
2. TIGIT 및 체크포인트 항체 조합 요법
본원에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 TIGIT 항체는 다수의 체크포인트 수용체 항체 중 하나와 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자의 종양은 수용체의 발현에 대해 평가될 수 있으며, 다음으로 결과가 의사에게 투여될 항체에 관한 정보를 주는데 사용된다: PVRIG 및 PD-1, TIGIT 및 PD-1 또는 TIGIT 및 PVRIG. 이들 검정법은 하기에 설명되어 있다
a. 항-TIGIT 항체와 항-PD-1 항체의 조합
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-TIGIT 항체와 항-PD-1 항체의 조합을 제공한다.
일 구현예에서, 암을 가진 환자로부터의 종양으로부터 생검을 가져와서 FACS 분석을 위해 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 해리시킨다. 세포를 (1) TIGIT (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 것 또는 MBSA43과 같은 당해 기술분야의 다른 것을 사용함); (2) PD-1 (예를 들어, EH12.2H7, Keytruda®, Opdivo® 등을 포함하여 당해 기술분야에 공지된 것을 사용함); (3) PD-L1 (예를 들어, 본원에 개략된 BM-1과 같은 당해 기술분야에 공지된 것을 사용함); 및 (4) PVR (예를 들어, SKII.4와 같은 당해 기술분야에 공지된 것을 사용함); 및 (5) 이소형 대조군 항체에 대한 표지된 항체로 염색한다. FACS가 시행되고, 각 수용체에 대해, 대조군 항체와 비교하여 수용체를 발현하는 세포의 백분율이 계산된다. TIGIT, PD-1, PD-1 및 PVR에 대한 양성 세포의 백분율이 모든 4가지 수용체에 대해 > 1%이면, 환자는 본원에 개략된 바와 같이 TIGIT 및 PD-1에 대한 항체로 치료된다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 항-TIGIT 항체와 항-PD-1 항체의 조합을 제공한다. 두 개의 승인된 항-PD-1 항체, 펨브로리주마브 (Keytruda®)와 니볼루마브 (Opdivo®)가 있으며, 본 발명의 항-TIGIT 항체와 함께 사용할 수 있는 더 많은 항체가 개발 중이다.
따라서, 본 발명은 다음의 특이적 조합을 제공한다: 펨브로리마주마브와 함께 CPA.9.083.H4(S241P) (도 53b에 나타냄); 니볼루마브와 함께 도 53b에 나타낸 CPA.9.083.H4(S241P); 펨브로리주마브와 함께 도 53a에 나타낸 CPA.9.086.H4(S241P); 니볼루마브와 함께 도 53a에 나타낸 CPA.9.086.H4(S241P); 펨브로리주마브와 함께 CHA.9.547.7H4(S241P); 니볼루마브와 함께CHA.9.547.7H4(S241P); 펨브로리주마브와 함께 CHA.9.547.13.H4(S241P); 및 니볼루마브와 함께 CHA.9.547.13.H4(S241P). (서열 목록이 언급됨).
b. 항-TIGIT 항체와 항-CTLA-4 항체의 조합
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-TIGIT 항체와 항-CTLA-4 항체의 조합을 제공한다. 본 발명의 항-TIGIT 항체와 조합하여 사용될 수 있는, 두 개의 승인된 항-CTLA-4 항체, 이피리무마브 (Yervoy®) 및 트레멜리무마브, 뿐만 아니라 개발 중인 다른 것이 있다.
따라서, 본 발명은 다음의 특정 조합을 제공한다: 이피리무마브와 함께 CPA.9.083.H4 (S241P); 이피리무마브와 함께 CPA.9.083.H4 (S241P); 이피리무마브와 함께 CPA.9.086.H4 (S241P); 트레멜리무마브와 함께 CPA.9.086.H4 (S241P); 이피리마무마브와 함께 CHA.9.547.7H4 (S241P); 트레멜리무마브와 함께 CHA.9.547.7H4 (S241P); 이피리무마브와 함께 CHA.9.547.13.H4 (S241P); 및 트레멜리무마브와 함께 CHA.9.547.13.H4 (S241P).
c. 항-TIGIT 항체와 항-PD-L1 항체의 조합
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-IGIT 항체와 항-PD-L1 항체의 조합을 제공한다. 본 발명의 항-TIGIT 항체와 조합하여 사용될 수 있는, 세 개의 승인된 항-PD-L1 항체, 아테조리주마브 (TECENTRIQ®), 아베루마브 (BAVENCIO®) 및 듀르발루마브 (IMFINZITM), 뿐만 아니라 개발 중인 다른 항-PD-1 항체가 있다.
따라서, 본 발명은 다음의 특정 조합을 제공한다: 아테조리주마브와 함께 CPA.9.083.H4(S241P); 아베루마브와 함께 CPA.9.083.H4(S241P); 듀르발루마브와 함께 CPA.9.083.H4(S241P); 아테조리주마브와 함께 CPA.9.086.H4(S241P); 아베루마브와 함께 CPA.9.086.H4(S241P); 듀르발루마브와 함께 CPA.9.086.H4(S241P); 아테조리주마브와 함께 CHA.9.547.7H4(S241P); 아베루마브와 함께 CHA.9.547.7H4(S241P); 듀르발루마브와 함께 CHA.9.547.7H4(S241P); 아테조리주마브와 함께 CHA.9.547.13.H4(S241P); 아베루마브와 함께 CHA.9.547.13.H4(S241P); 및 듀르발루마브와 함께 CHA.9.547.13.H4(S241P).
d. 항-TIGIT 항체와 항-LAG-3 항체의 조합
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-IGIT 항체와 항-LAG-3 항체의 조합을 제공한다. 개발 중인 여러 항-LAG-3 항체가 있고, BMS-986016 (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO2010/019570A2 참조), GSK2831781 (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허출원 2016/0017037A 참조), 머크사 클론 22D2, 11C9, 4A10 및/또는 19E8 (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO2016/028672A1 참조), 및 GSK2831781 뿐만 아니라 개발 중인 항체들을 포함하고, 이는 본 발명의 항-TIGIT 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다음의 특정 조합을 제공한다: CPA.9.083.H4(S241P)와 함께 BMS-986016; CPA.9.083.H4(S241P)와 함께 GSK2831781; CPA.9.086.H4(S241P)와 함께 BMS-986016; CPA.9.086.H4(S241P)와 함께 GSK2831781; CHA.9.547.7H4(S241P)와 함께 BMS-986016; CHA.9.547.7H4(S241P)와 함께 GSK2831781; CHA.9.547.13.H4(S241P)와 함께 BMS-986016; 및 CHA.9.547.13.H4(S241P)와 함께 GSK2831781.
따라서, 본 발명은 다음의 특정 조합도 역시 제공한다: CPA.9.083.H4(S241P)와 함께 머크사 클론 22D2, 11C9 및/또는 4A10; CPA.9.086.H4(S241P)와 함께 머크사 클론 22D2, 11C9 및/또는 4A10; CHA.9.547.7H4(S241P)와 함께 머크사 클론 22D2, 11C9 및/또는 4A10; CHA.9.547.13.H4(S241P)와 함께 머크사 클론 22D2, 11C9 및/또는 4A10.
e. 항-TIGIT 항체와 항-TIM-3 항체의 조합
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-IGIT 항체와 항-TIM-3 항체의 조합을 제공한다. 본 발명의 항-TIGIT 항체와 조합하여 사용될 수 있는, 개발 중인 적어도 하나의 항-TIM-3 항체, TSR-022 뿐만 아니라 개발 중인 다른 항체가 있다.
따라서, 본 발명은 다음의 특정 조합을 제공한다: CPA.9.083.H4(S241P)와 함께 TSR-022; CPA.9.086.H4(S241P)와 함께 TSR-0226; CHA.9.547.7H4(S241P)와 함께 TSR-022; 및 CHA.9.547.13.H4(S241P)와 함께 TSR-022.
f. 항-TIGIT 항체와 항-BTLA 항체의 조합
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-TIGIT 항체와 항-BTLA 항체의 조합을 제공하며, 상세하게 본원에 개시된 항-BTLA 항체의 CDR 및 전장의 서열에 대하여, 본원에 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO2011/014438 참조. 따라서, 본 발명은 다음의 특정 조합을 제공한다: 항-BTLA 항체와 함께 CPA.9.083.H4(S241P); 항-BTLA 항체와 함께 CPA.9.086.H4(S241P); 항-BTLA 항체와 함께 CHA.9.547.7H4(S241P); 및 항-BTLA 항체와 함께 CHA.9.547.13.H4(S241P).
g. 항-종양 항체와 함께 TIGIT 항체
일부 구현예에서, 본 발명의 항-TIGIT 항체는 환자의 선천적 면역 반응을 증가시키기 위해 일반적으로 면역계에 작용하는 면역-종양학/체크포인트 억제제와 달리, 대신에 특정 종양 표적 항원 (TTA)에게로 유도되는 항체와 공동-투여된다. 본 TIGIT 항체와 조합될 수 있는 승인되거나 개발 중인 많은 항-TTA 항체가 있다 현재까지 승인된 항체는 세투시마브, 파니투무마브, 니모투주마브 (모두 EGFR에 대한 항체), 리투지마브 (CD20), 트라스트주마브 및 퍼투주마브 (HER2), 알레투주마브 (CD52), 베박시주마브 (VEGF), 오파투무마브 (CD20) (RANK 리간드), 브렌투지마브 (CD30), 다라투무마브 (CD38), 이브리투모마브 (CD20) 및 이피리무마브(CTLA-4)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본원에서의 항-TIGIT 항체와 조합될 수 있는 임상 시험 중인 특이적 표적 종양학 항체는 이피리무마브, 트레멜리무마브와 같은 항-CTLA4 mAb; 니볼루마브 BMS-936558/ MDX-1106/ONO-4538, AMP224, CT-011, MK-3475와 같은 항-PD-1; BMS-936559/ MDX-1105, MEDI4736, RG-7446/MPDL3280A와 같은 항-PDL-1; IMP-321과 같은 항-LAG-3; 항-TIM-3, 항-BTLA, 항-B7-H4, 항-B7-H3, 항-VISTA; CP-870,893, 루카투무마브, 다세투주마브와 같은 항-CD40 mAb를 포함하는 면역자극성 단백질을 표적하는 길항제 항체; BMS-663513 우레루마브와 같은 항-CD137 mAb (항-4-1BB; 예를 들어 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 7,288,638 및 8,962,804 참조); PF-05082566 유도미루마브 (예를 들어, 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 8,821,867; 8,337,850; 및 9,468,678, 뿐만 아니라 국제특허출원 WO 2012/032433 참조); 항-OX40와 같은 항-OX40 mAb (예를 들어, 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO2006/029879 또는 WO2010096418 참조); TRX518와 같은 항-GITR mAb (예를 들어, 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 7,812,135 참조); 바르리루마브, DX-1127와 같은 항-CD27 mAb (예를 들어, 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO 2016/145085 및 미국 특허 공개 US 2011/0274685 및 US 2012/0213771 참조), 항-ICOS mAb (예를 들어, MEDI-570, JTX-2011), 및 항-TIM3 항체 (예를 들어, 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO 2013/006490 또는 미국 특허 공개 US 2016/0257758), 뿐만 아니라 전립선암, 난소암, 유방암, 자궁내막암, 다발성 골수종, 흑색종, 림프종, 소세포 폐암을 포함한 폐암, 신장암, 결장직장암, 췌장암, 위암, 뇌암에 대한 단일클론 항체 (일반적으로 www.clinicaltrials.gov 참조)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
3. PVRIG 및 PD-1 조합 요법
본원에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 PVRIG 항체는 다수의 체크포인트 수용체 항체 중 하나와 조합될 수 있다.
a. 항-PVRIG 항체와 항-PD-1 항체의 조합
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-PVRIG 항체와 항-PD-1 항체의 조합을 제공한다.
일 구현예에서, 암을 가진 환자로부터의 종양으로부터 생검을 가져와서 FACS 분석을 위해 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 해리시킨다. 세포를 (1) PVRIG (예를 들어, 국제특허출원 WO2016/134333 (상세하게는 차단하지는 않더라도 임의의 결합하는 것을 포함함) 또는 임의의 WO2017/041004에 개략된 것을 사용하더라도, 일반적으로 CHA.7.518.1H4(S241P)을 사용함); (2) PD-1 (예를 들어, EH12.2H7, Keytruda®, Opdivo® 등을 포함하여 당해 기술분야에 공지된 것을 사용함); (3) PD-L1 (예를 들어, 본원에 개략된 BM-1과 같은 당해 기술분야에 공지된 것을 사용함); 및 (4) PVRL2 (예를 들어, TX11과 같은 당해 기술분야에 공지된 것을 사용함); 및 (5) 이소형 대조군 항체에 대한 표지된 항체로 염색한다. FACS가 시행되고, 각 수용체에 대해, 대조군 항체와 비교하여 수용체를 발현하는 세포의 백분율이 계산된다. PVRIG, PD-1, PD-1 및 PVRL2에 대한 양성 세포의 백분율이 모든 4가지 수용체에 대해 > 1%이면, 환자는 본원에 개략된 바와 같이 PVRIG 및 PD-1에 대한 항체로 치료된다.
두 개의 승인된 항-PD-1 항체, 펨브로리주마브 (Keytruda®)와 니볼루마브 (Opdivo®)가 있으며, 본 발명의 항-PVRIG 항체와 함께 사용할 수 있는 더 많은 항체가 개발 중이다.
따라서, 본 발명은 다음의 특이적 조합을 제공한다: 펨브로리주마브와 함께 CHA.7.518.1.H4(S241P) (도 3에 나타냄); 니볼루마브와 함께 도 3에 나타낸 바와 같이 CHA.7.518.1.H4(S241P); 펨브로리주마브와 함께 도 3에 나타낸 바와 같이 CHA.7.538.1.2.H4(S241P) 및 니볼루마브와 함께 도 3에 나타낸 바와 같이 CHA.7.538.1.2.H4(S241P).
b. 항-PVRIG 항체와 항-CTLA-4 항체의 조합
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-PVRIG 항체와 항-CTRL-4 항체의 조합을 제공한다. 본 발명의 항-TIGIT 항체와 조합하여 사용될 수 있는, 두 개의 승인된 항-CTLA-4 항체, 이피리무마브 (Yervoy®) 및 트레멜리무마브, 뿐만 아니라 개발 중인 다른 것이 있다.
따라서, 본 발명은 다음의 특이적 조합을 제공한다: 이피리무마브와 함께 CHA.7.518.1.H4 (S241P); 트레멜리무마브와 함께 CHA.7.518.1.H4 (S241P); 이피리무마브와 함께 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P); 및 트레멜리무마브와 함께 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).
c. 항-PVRIG 항체와 항-PD-L1 항체의 조합
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-PVRIG 항체와 항-PD-L1 항체의 조합을 제공한다. 본 발명의 항-TIGIT 항체와 조합하여 사용될 수 있는, 세 개의 승인된 항-PD-L1 항체, 아테조리주마브 (TECENTRIQ®), 아베루마브 (BAVENCIO®) 및 듀르발루마브, 뿐만 아니라 개발 중인 다른 항-PD-1 항체가 있다.
따라서, 본 발명은 다음의 특정 조합을 제공한다: 아테조리주마브와 함께 CPA.9.083.H4(S241P); 아베루마브와 함께 CPA.9.083.H4(S241P); 듀르발루마브와 함께 CPA.9.083.H4(S241P); 아테조리주마브와 함께 CPA.9.086.H4(S241P); 아베루마브와 함께 CPA.9.086.H4(S241P); 듀르발루마브와 함께 CPA.9.086.H4(S241P); 아테조리주마브와 함께 CHA.9.547.7H4(S241P); 아베루마브와 함께 CHA.9.547.7H4(S241P); 듀르발루마브와 함께 CHA.9.547.7H4(S241P); 아테조리주마브와 함께 CHA.9.547.13.H4(S241P); 아베루마브와 함께 CHA.9.547.13.H4(S241P); 및 듀르발루마브와 함께 CHA.9.547.13.H4(S241P).
d. 항-PVRIG 항체와 항-LAG-3 항체의 조합
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-PVRIG 항체와 항-LAG-3 항체의 조합을 제공한다. 개발 중인 여러 항-LAG-3 항체가 있고, BMS-986016 (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO2010/019570A2 참조), GSK2831781 (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허출원 2016/0017037A 참조), 머크사 클론 22D2, 11C9, 4A10 및/또는 19E8 (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO2016/028672A1 참조), 및 GSK2831781 뿐만 아니라 개발 중인 항체들을 포함하고, 이는 본 발명의 항-PVRIG 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다음의 특이적 조합을 제공한다: BMS-986016와 함께 CHA.7.518.1.H4 (S241P); GSK2831781와 함께 CHA.7.518.1.H4 (S241P); BMS-986016와 함께 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P); 및 GSK2831781와 함께 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).
따라서, 본 발명은 다음의 특정 조합도 역시 제공한다: 머크사 클론 22D2, 11C9 및/또는 4A10과 함께 CHA.7.518.1.H4(S241P); 및 머크사 클론 22D2, 11C9 및/또는 4A10과 함께 CHA.7.538.1.2.H4(S241P).
e. 항-PVRIG 항체와 항-TIM-3 항체의 조합
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-PVRIG 항체와 항-TIM-3 항체의 조합을 제공한다. 본 발명의 항-PVRIG 항체와 조합하여 사용될 수 있는, 개발 중인 적어도 하나의 항-TIM-3 항체, TSR-022 뿐만 아니라 개발 중인 다른 항체가 있다.
따라서, 본 발명은 다음의 특이적 조합을 제공한다: TSR-022와 함께 CHA.7.518.1.H4 (S241P); 및 TSR-0226과 함께 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).
f. 항-PVRIG 항체와 항-BTLA 항체의 조합
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-PVRIG 항체와 항-BTLA 항체의 조합을 제공하며, 상세하게 본원에 개시된 항-BTLA 항체의 CDR 및 전장의 서열에 대하여, 본원에 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO2011/014438 참조. 따라서, 본 발명은 다음의 특이적 조합을 제공한다: 항-BTLA 항체와 함께 CHA.7.518.1.H4 (S241P); 및 항-BTLA 항체와 함께 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).
g. 항-종양 항체와 함께 PVRIG 항체
일부 구현예에서, 본 발명의 항-PVRIG 항체는 환자의 선천적 면역 반응을 증가시키기 위해 일반적으로 면역계에 작용하는 면역-종양학/체크포인트 억제제와 달리, 대신에 특정 종양 표적 항원 (TTA)에게로 유도되는 항체와 공동-투여된다. CHA.7.518.1.H4(S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4(S241P)을 포함하여, 본 PVRIG 항체와 조합될 수 있는 승인되거나 개발 중인 많은 항-TTA 항체가 있다 현재까지 승인된 항체는 세투시마브, 파니투무마브, 니모투주마브 (모두 EGFR에 대한 항체), 리투지마브 (CD20), 트라스트주마브 및 퍼투주마브 (HER2), 알레투주마브 (CD52), 베박시주마브 (VEGF), 오파투무마브 (CD20) (RANK 리간드), 브렌투지마브 (CD30), 다라투무마브 (CD38), 이브리투모마브 (CD20) 및 이피리무마브(CTLA-4)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본원에서의 항-PVRIG 항체와 조합될 수 있는 임상 시험 중인 특이적 표적 종양학 항체는 이피리무마브, 트레멜리무마브와 같은 항-CTLA4 mAb; 니볼루마브 BMS-936558/ MDX-1106/ONO-4538, AMP224, CT-011, MK-3475와 같은 항-PD-1; BMS-936559/ MDX-1105, MEDI4736, RG-7446/MPDL3280A와 같은 항-PDL-1; IMP-321과 같은 항-LAG-3; 항-TIM-3, 항-BTLA, 항-B7-H4, 항-B7-H3, 항-VISTA; CP-870,893, 루카투무마브, 다세투주마브와 같은 항-CD40 mAb를 포함하는 면역자극성 단백질을 표적하는 길항제 항체; BMS-663513 우레루마브와 같은 항-CD137 mAb (항-4-1BB; 예를 들어 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 7,288,638 및 8,962,804 참조); PF-05082566 유도미루마브 (예를 들어, 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 8,821,867; 8,337,850; 및 9,468,678, 뿐만 아니라 국제특허출원 WO 2012/032433 참조); 항-OX40와 같은 항-OX40 mAb (예를 들어, 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO2006/029879 또는 WO2010096418 참조); TRX518와 같은 항-GITR mAb (예를 들어, 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 7,812,135 참조); 바르리루마브, DX-1127와 같은 항-CD27 mAb (예를 들어, 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO 2016/145085 및 미국 특허 공개 US 2011/0274685 및 US 2012/0213771 참조), 항-ICOS mAb (예를 들어, MEDI-570, JTX-2011), 및 항-TIM3 항체 (예를 들어, 본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO 2013/006490 또는 미국 특허 공개 US 2016/0257758), 뿐만 아니라 전립선암, 난소암, 유방암, 자궁내막암, 다발성 골수종, 흑색종, 림프종, 소세포 폐암을 포함한 폐암, 신장암, 결장직장암, 췌장암, 위암, 뇌암에 대한 단일클론 항체 (일반적으로 www.clinicaltrials.gov 참조)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
4. PVRIG 및 TIGIT 조합 요법
상세한 구현예에서 용도를 찾은 항-TIGIT 및 항-PVRPG 항체의 특정 조합이 있다.
일 구현예에서, 암을 가진 환자로부터의 종양으로부터 생검을 가져와서 FACS 분석을 위해 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 해리시킨다. 세포를 (1) PVRIG (예를 들어, 국제특허출원 WO2016/134333 (상세하게는 차단하지는 않더라도 임의의 결합하는 것을 포함함) 또는 임의의 WO2017/041004에 개략된 것을 사용하더라도, 일반적으로 CHA.7.518.1H4(S241P)를 사용함); (2) TIGIT (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 것 또는 MBSA43와 같은 당해 기술분야의 다른 것을 사용함); (3) PVR (예를 들어, SKII.4와 같은 당해 기술분야에 공지된 것을 사용함); 및 (4) PVRL2 (예를 들어, TX11과 같은 당해 기술분야에 공지된 것을 사용함); 및 (5) 이소형 대조군 항체에 대한 표지된 항체로 염색한다. FACS가 시행되고, 각 수용체에 대해, 대조군 항체와 비교하여 수용체를 발현하는 세포의 백분율이 계산된다. PVRIG, TIGIT, PVR 및 PVRL2에 대한 양성 세포의 백분율이 모든 4가지 수용체에 대해 > 1%이면, 환자는 PVRIG 및 TIGIT에 대한 항체로 치료된다. 이와 관련하여 바람직한 조합은 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CPA.9.086이다.
일 구현예에서, 항-TIGIT 항체 CPA.9.086으로부터의 CDR 집합을 포함하는 항체는 항-PVRIG 항체 CHA.7.518.1로부터의 CDR 집합을 포함하는 항체와 조합된다. 상세한 구현예에서, 항-TIGIT 항체 CPA.9.086로부터의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체는 항-PVRIG 항체 CHA.7.518.1로부터의 VL 및 VL을 포함하는 항체와 조합된다. 일 구현예에서, 도 53에 나타낸 바와 같이CPA.9.086.H4(S241P)은 도3에 나타낸 바와 같이 CHA.7.518.1H4 (S241P)와 조합된다.
일 구현예에서, 항-TIGIT 항체 CPA.9.083으로부터의 CDR 집합을 포함하는 항체는 항-PVRIG 항체 CHA.7.518.1로부터의 CDR 집합을 포함하는 항체와 조합된다. 상세한 구현예에서, 항-TIGIT 항체 CPA.9.083으로부터의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체는 항-PVRIG 항체 CHA.7.518.1으로부터의 VL 및 VL을 포함하는 항체와 조합된다. 일 구현예에서, CPA.9.086.H4 (S241P)는 CHA.7.518.1H4 (S241P)와 조합된다.
일 구현예에서, 항-TIGIT 항체 CPA.9.086으로부터의 CDR 집합을 포함하는 항체는 항-PVRIG 항체 CHA.7.538.1.2.H4(S241P)로부터의 CDR 집합을 포함하는 항체와 조합된다. 상세한 구현예에서, 항-TIGIT 항체 CPA.9.086으로부터의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체는 항-PVRIG 항체 CHA.7.538.1.2.H4(S241P)으로부터의 VL 및 VL을 포함하는 항체와 조합된다. 일 구현예에서, CPA.9.086.H4 (S241P)는 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)와 조합된다.
일 구현예에서, CHA.518.1.H4 (S241P)는 서열 목록 (미국 특허 USSN 62/513,916의 도 4에 열거된 모든 항체 참고함)에 재인용된 바와 같이 항-TIGIT 항체, 구체적으로 CPA.9.018, CPA.9.027, CPA.9.049, CPA.9.057, CPA.9.059, CPA.9.083, CPA.9.086, CPA.9.089, CPA.9.093, CPA.9.101, CPA.9.103, CHA.9.536.1, CHA.9.536.3, CHA.9.536.4, CHA.9.536.5, CHA.9.536.6, CHA.9.536.7, CHA.9.536.8, CHA.9.560.1, CHA.9.560.3, CHA.9.560.4, CHA.9.560.5, CHA.9.560.6, CHA.9.560.7, CHA.9.560.8, CHA.9.546.1, CHA.9.546.1, CHA.9.547.2, CHA.9.547.3, CHA.9.547.4, CHA.9.547.6, CHA.9.547.7, CHA.9.547.8, CHA.9.547.9, CHA.9.547.13, CHA.9.541.1, CHA.9.541.3, CHA.9.541.4. CHA.9.541.5, CHA.9.541.6. CHA.9.541.7 및 CHA.9.541.8와 조합된다.
일 구현예에서, CPA.9.086은 a) 서열번호 5의 HC 서열 및 서열번호 3의 LC 서열 (또는 이에 포함된 CDR 집합); b) HC 서열 서열번호 32 및 LC 서열 서열번호 33 (또는 거기에 포함된 CDR 집합); 및 c) 서열번호 32의 HC 서열 및 서열번호 40의 LC 서열 (또는 이에 포함된 CDR 집합)을 포함하나 이에 한정되지는, 않는 국제특허출원 WO2017/041004에 개략된 바와 같은 항-PVRIG 항체와 조합된다.
일부 구현예에서, 상기 조합은 CPA.9.086, CPA.9.083, CHA.9.547.7 및 CHA.9.547.13으로 이루어진 군으로부터 선택된 항-TIGIT 항체를 포함하고, PVRIG 항체는 CHA.7.518.1 및 CHA.7.538.1.2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CPA.9.086, CPA.9.083, CHA.9.547.7 및 CHA.9.547.13으로 이루어진 군으로부터 선택된 항-TIGIT 항체를 포함하고, PVRIG 항체는 CHA.7.518.1이다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CPA.9.086, CPA.9.083, CHA.9.547.7 및 CHA.9.547.13으로 이루어진 군으로부터 선택된 항-TIGIT 항체를 포함하고, PVRIG 항체는 CHA.7.538.1.2이다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 항-TIGIT 항체 CPA.9.086 및 PVRIG 항체 CHA7.518.1을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 항-TIGIT 항체 CPA.9.083 및 PVRIG 항체 CHA7.518.1을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 항-TIGIT 항체 CHA.9.547.7 및 PVRIG 항체 CHA7.518을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 항-TIGIT 항체 CHA.9.547.13 및 PVRIG 항체 CHA7.518.1을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 항-TIGIT 항체 CPA.9.086 및 PVRIG 항체 CHA7.538.1.2를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 항-TIGIT 항체 CPA.9.083 및 PVRIG 항체 CHA7.538.1.2를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 항-TIGIT 항체 CHA.9.547.7 및 PVRIG 항체 CHA7.538.1.2를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 항-TIGIT 항체 CHA.9.547.13 및 PVRIG 항체 CHA7.538.1.2를 포함한다.
도 20 내지 도 24는 2016년 9월 27일자로 출원된 미국 특허출원 15/277,978에 개시된 바와 같은 PVRIG 항체를 제공한다. 본 발명의 TIGIT 항체는 본원 전반에 걸쳐 개시된 것뿐만 아니라 이들 도면에 개시된 PVRIG 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
5. 치료 평가
일반적으로, 본 발명의 항체는 단독으로 또는 조합하여 (PDR-1을 갖는 PVRIG, PD-1을 갖는 TIGIT 또는 PVRIG를 갖는 TIGIT) 암을 가진 환자에게 투여되고, 효능은 본원에 기술된 바와 같은 다수의 방식으로 평가된다. 따라서, 암 부하, 종양의 크기, 전이의 존재 또는 정도의 평가 등과 같은 효능의 표준 검정이 전개될 수 있는 한편, 면역-종양학 치료가 마찬가지로 면역 상태 평가에 기초하여 평가될 수 있다. 이것은 시험관내 및 생체내 검정을 포함하여 다수의 방식으로 시행될 수 있다 예를 들어, 종양 부하, 크기, 침윤성, LN 수반, 전이 등과 같은 "구식" 측정과 함께 면역 상태의 변화 (예로, ipi 치료 후 ICOS+ CD4+ T 세포의 존재)를 평가할 수 있다 따라서, 다음의 일부 또는 전부가 평가될 수 있다: CD4+ T 세포 활성화 또는 증식, CD8+ T (CTL) 세포 활성화 또는 증식, CD8+ T 세포-매개 세포독성 활성 및/또는 CTL 매개성 세포 고갈, NK 세포 활성 및 NK 매개성 세포 고갈의 억제성 효과, Treg 세포 분화 및 증식 및 Treg- 또는 골수 유래 억제인자 세포 (MDSC)-매개성 면역 억제 또는 면역 내성에 미치는 PVRIG 또는 TIGIT의 강화 효과 및/또는 면역 세포에 의한 전염증성 사이토카인 생산 예로 T 또는 다른 면역 세포에 의한 IL-2, IFN- 또는 TNF-α 생산에 미치는 PVRIG 또는 TIGIT의 효과.
일부 구현예에서, 치료 평가는 예를 들어 CFSE 희석 방법, 면역 효과기 세포의 Ki67 세포내 염색 및 3H-티미딘 도입 방법을 사용하여 면역 세포 증식을 평가함으로써 시행된다.
일부 구현예에서, 치료의 평가는 다음의 하나 이상 포함하는 활성화-관련 마커의 유전자 발현의 증가 또는 이의 단백질 수준 증가 및 CD107A의 표면 발현에 의해 측정된 세포 탈과립을 평가하여 시행된다: CD25, CD69, CD137, ICOS, PD1, GITR, OX40.
일부 구현예에서, 치료의 평가는 예를 들어 본 발명의 항체의 투여 전에 치료의 부재 시 T 세포 증식의 양을 평가함으로써 시행된다. 투여 후, 환자가 T 세포 증식을 증가시키고, 예로 환자의 T 세포의 하위집합이 증식하면, 이것은 T-세포가 활성화되었음을 지시하는 것이다.
유사하게, 본 발명의 항체로의 치료의 평가는 치료의 유효성을 평가하기 위해 투여 전 및 투여 후 환자의 IFNγ 수준을 측정함으로써 시행될 수 있다. 이것은 수 시간 또는 수 일 내에 시행될 수 있다.
일반적으로, 유전자 발현 검정은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 시행된다. 예를 들어 Goodkind et al., Computers and Chem. Eng. 29(3): 589 (2005), Han et al., Bioinform. Biol. Insights 11/15/15 9(Suppl. 1): 29-46, Campo et al., Nod. Pathol. 2013 Jan; 26 suppl. 1: S97-S110 참조, 이의 유전자 발현 측정 기술은 명시적으로 본원에 참고문헌으로 통합된다.
일반적으로, 단백질 발현 측정은 또한 당해 기술분야에 공지된 바와 유사하게 시행되고, 예를 들어 Wang et al., Recent Advances in Capillary Electrophoresis-Based Proteomic Techniques for Biomarker Discovery, Methods. Mol. Biol. 2013: 984: 1-12; Taylor et al, BioMed Res. Volume 2014, Article ID 361590, 8 pages, Becerk et al., Mutat. Res 2011 June 17: 722(2): 171-182 참조, 이의 측정 기술은 본원에 명시적으로 참고문헌으로 통합된다.
일부 구현예에서, 치료 평가는 효소 활성 (프로테아제 활성 포함), 세포막 투과성, 세포 부착성, ATP 생산, 보조효소 생산 및 뉴클레오티드 흡수 활성과 같은 수많은 세포 매개변수를 평가함으로써 표적 세포 생존능 검출에 의해 측정된 세포독성 활성을 평가함으로써 시행된다. 이러한 검정법의 특정 예로는 트립판 블루 또는 PI 염색법, 51Cr 또는 35S 방출 방법, LDH 활성, MTT 및/또는 WST 검정법, 칼세인-AM 검정법, 발광성 기반의 검정법 등이 있다.
일부 구현예에서, 치료의 평가는 IFNg, TNFα, GM-CSF, IL2, IL6, IL4, IL5, IL10, IL13를 포함하나 이에 한정되지 않는 사이토카인을 사용하는 잘 알려진 기술을 사용하여 배양 상청액에서 세포내 측정으로, 사이토카인 생성에 의해 측정된 T 세포의 활성을 평가함으로써 시행된다.
따라서, 치료의 평가는 다음 중 하나 이상을 평가하는 검정법을 사용하여 시행될 수 있다: (i) 면역 반응의 증가, (ii) α
Figure 112019022434593-pct00006
및/또는 γδ T 세포의 활성화 증가, (iii) 세포독성 T 세포 활성의 증가, (iv) NK 및/또는 NKT 세포 활성의 증가, (v) α
Figure 112019022434593-pct00007
및/또는 γδ T-세포 억제의 완화, (vi) 전염증성 사이토카인 분비의 증가, (vii) IL-2 분비의 증가, (viii) 인터페론- 생산의 증가, (ix) Th1 반응의 증가, (x) Th2 반응의 감소, (xi) 적어도 하나의 조절 T 세포 (Tregs)의 세포수 및/또는 활성의 감소 또는 제거.
효능을 측정하기 위한 검정법
일부 구현예에서, T 세포 활성화는 실시예에서 설명하는 바와 같이 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정을 사용하여 평가된다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 상이한 인자의 인산화 또는 탈인산화에 의해 또는 다른 번역후 변형을 측정함으로써 측정되는 면역 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 증식에 의해 또는 예시적인 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 αβ 및/또는 γδ T세포의 활성화의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 예로 암 세포와 같은 표적 세포의 직접적인 살상에 의해 또는 사이토카인 분비에 의해 또는 증식에 의해 또는 활성화 마커 예를 들어 CD137, CD107a, PD1 등의 발현 변화에 의해 측정된 세포독성 T 세포 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접적인 살상에 의해 또는 사이토카인 분비에 의해 또는 활성화 마커 예를 들어 CD107a 등의 발현의 변화에 의해 측정되는 NK 및/또는 NKT 세포 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 증식에 의해 또는 예시적인 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 αβ 및/또는 γδ T-세포 억제의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 ELISA 또는 루미넥스에 의해 또는 다중복합체 비드 기반의 방법에 의해 또는 세포내 염색 및 FACS 분석에 의해 또는 알리스폿 등에 의해 측정되는 전염증성 사이토카인 분비의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 ELISA 또는 루미넥스에 의해 또는 다중복합체 비드 기반의 방법에 의해 또는 세포내 염색 및 FACS 분석에 의해 또는 알리스폿 등에 의해 측정되는 IL-2 분비의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 ELISA 또는 루미넥스에 의해 또는 다중복합체 비드 기반의 방법에 의해 또는 세포내 염색 및 FACS 분석에 의해 또는 알리스폿 등에 의해 측정되는 인터페론-감마 생산의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 Th1 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 Th2 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 유동세포계측법 또는 IHC에 의해 측정되는 적어도 하나의 조절 T-세포 (Tregs)의 세포 수 및/또는 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적절한 감소는 하기에 개략된 증가의 경우와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 유동세포계측법 또는 IHC에 의해 측정되는 M2 대식구 세포 수의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적절한 감소는 하기에 개략된 증가의 경우와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 M2 대식구 전-종양생성 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적절한 감소는 하기에 개략된 증가의 경우와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 유동세포계측법 또는 IHC에 의해 측정되는 N2 호중구 증가의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적절한 감소는 하기에 개략된 증가의 경우와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 N2 호중구 전-종양생성 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적절한 감소는 하기에 개략된 증가의 경우와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 증식에 의해 또는 예시적인 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 T 세포 활성화의 억제의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 예로 암 세포와 같은 표적 세포의 직접적인 살상에 의해 또는 사이토카인 분비에 의해 또는 증식에 의해 또는 활성화 마커 예를 들어 CD137, CD107a, PD1 등의 발현 변화에 의해 측정된 CTL 활성화의 억제의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 αβ 및/또는 γδ T 세포 소모의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적절한 감소는 하기에 개략된 증가의 경우와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 증식에 의해 또는 예시적인 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 αβ 및/또는 γδ T세포 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 증식에 의해 또는 예시적인 CD45RA, CCR7 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 항원-특이적 기억 반응의 자극의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼슘 AM과 같은 세포독성 검정에 의해 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 요오드 염색 등과 같은 유동세포계측법 기반의 검정법에 의해 측정되는 암 세포의 세포사멸 또는 용해의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼슘 AM과 같은 세포독성 검정에 의해 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 요오드 염색 등과 같은 유동세포계측법 기반의 검정법에 의해 측정되는 암 세포에 미치는 세포독성 또는 세포증식억제 효과의 자극의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼슘 AM과 같은 세포독성 검정에 의해 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 요오드 염색 등과 같은 유동세포계측법 기반의 검정법에 의해 측정되는 암 세포의 직접적인 살상의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 증식에 의해 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 Th17 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼슘 AM과 같은 세포독성 검정에 의해 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 요오드 염색 등과 같은 유동세포계측법 기반의 검정법에 의해 측정되는, 보체 의존성 세포독성 및/또는 항체 의존성 세포-매개 세포독성의 유도의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적절한 증가는 하기에 개략되어 있다.
일 구현예에서, T 세포 활성화는 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접적인 살상에 의해 또는 사이토카인 분비에 의해 또는 증식에 의해 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된다. T-세포의 경우, 증식, 세포 표면 마커 (예로, CD25, CD69, CD137, PD1)의 활성화, 세포독성 (표적 세포를 살상하는 능력) 및 사이토카인 생산 (예로, IL-2, IL-4, IL-6, IFNg, TNF-a, IL-10, IL-17A)에서 증가는 암 세포의 증진된 살상과 부합될 수 있는 면역 조절을 나타내는 것이다.
일 구현예에서, NK 세포 활성화는 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접적인 살상에 의해 또는 사이토카인 분비에 의해 또는 예를 들어 CD107a 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된다. NK 세포의 경우, 증식, 세포독성 (표적 세포를 살상하고, CD107a, 그랜자임 및 퍼포린 발현을 증가시키는 능력), 사이토카인 생산 (예로, IFNg, TNF) 및 세포 표면 수용체 발현 (예로, CD25)에서 증가는 암 세포의 증진된 살상과 부합될 수 있는 면역 조절을 나타내는 것이다.
일 구현예에서, γδ T 세포 활성화는 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 증식에 의해 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된다.
일 구현예에서, Th1 세포 활성화는 예를 들어 사이토카인 분비에 의해 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된다.
적절한 활성 또는 반응의 증가 (또는 상기 개략된 바와 같이 적절한 감소)는 기준 시료 또는 대조군 시료, 예를 들어 본 발명의 항-PVRIG 항체를 포함하지 않는 테스트 시료에서의 신호에 대해 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98 내지 99% 백분율의 증가이다. 특이적 활성 증가는 도 27 내지 도 34에 도시되어 있다 예를 들어, T 세포 증식의 증가와 관련하여, CHA.7.518.1.H4 (S241P)는 약 60%의 증가를 보이고, CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 47%의 증가를 보이며; 약 10 내지 70%의 T 세포 증식 또는 IFN-γ의 관련 증가를 보이고, 약 20 내지 60% 범위가 역시 용도를 찾는다.
유사하게, 기준 또는 대조군 시료과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5배의 증가가 효능을 나타낸다.
VII. 구현예의 목록
1. 다음을 포함하는 인간 TIGIT (서열번호 97)에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 조성물:
a) 서열번호 160을 포함하는 가변 중쇄 도메인; 및
b) 서열번호 165를 포함하는 가변 경쇄 도메인.
2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 다음을 포함하는 항체인, 조성물:
a) VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 중쇄로서, 상기 VH는 서열번호 160을 포함하는, 중쇄; 및
b) VL-VC를 포함하는 경쇄로서, 상기 VL은 서열번호 165를 포함하고, VC는 카파 또는 람다 둘 중 하나인, 경쇄.
3. 제 2항에 있어서, 상기 CH1-힌지-CH2-CH3 서열은 인간 IgG1, IgG2, IgG4 및 이의 변이체로부터 선택되는, 조성물.
4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 164를 가지며, 상기 경쇄는 서열번호 169를 가진, 조성물.
5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 체크포인트 수용체 단백질에 결합하는 제 2 항체를 추가로 포함하는, 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 제 2 항체는 인간 PD-1와 결합하는, 조성물.
7. 제 5항에 있어서, 상기 제 2 항체는 인간 PVRIG (서열번호 2)와 결합하는, 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 제 2 항체는 서열번호 5를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 10을 함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 조성물.
9. 제 7항에 있어서, 상기 제 2 항체의 중쇄는 서열번호 9를 가지고, 상기 제 2 항체의 경쇄는 서열번호 14를 가진, 조성물.
10. 다음을 포함하는 핵산 조성물:
a) 서열번호 160을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 인코딩하는 제 1 핵산; 및
b) 서열번호 165를 포함하는, 가변 경쇄 도메인을 인코딩하는 제 2 핵산.
11. 제 10항에 있어서, 상기 제 1 핵산은 VH-CH1-힌지-CH2-CH3를 포함하는 중쇄를 인코딩하고, 상기 VH는 서열번호 160을 포함하고; 상기 제 2 핵산은 VL-VC를 포함하는 경쇄를 인코딩하고, 상기 VL은 서열번호 165를 포함하고, VC는 람다 도메인인, 핵산 조성물.
12. 제 10항 또는 제 11항에 따른 상기 제 1 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터 및 제 10항 또는 제 11항에 따른 상기 제 2 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터를 각각 포함하는 발현 벡터 조성물.
13. 제 10항 또는 제 11항에 따른 상기 제 1 핵산 및 제 10항 또는 제 11항에 따른 상기 제 2 핵산을 각각 포함하는 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물.
14. 제 12항 또는 제 13항에 따른 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
15. 다음을 포함하는 항-TIGIT 항체을 제조하는 방법:
a) 상기 항체가 발현되는 조건 하에 제 14항의 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 항체를 회수하는 단계.
16. T 세포를 활성화시킴으로써 암을 치료하는 방법으로서, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
17. 다음을 포함하는 인간 TIGIT (서열번호 97)에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 조성물:
a) 서열번호 150을 포함하는 가변 중쇄 도메인; 및
b) 서열번호 155를 포함하는 가변 경쇄 도메인.
18. 제 17항에 있어서, 상기 조성물은 다음을 포함하는 항체인, 조성물:
a) VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 중쇄로서, 상기 VH는 서열번호 150을 포함하는, 중쇄; 및
b) VL-VC를 포함하는 경쇄로서, 상기 VL은 서열번호 159를 포함하고, VC는 카파 또는 람다인, 경쇄.
19. 제 18항에 있어서, 상기 CH1-힌지-CH2-CH3 서열은 인간 IgG1, IgG2, IgG4 및 이의 변이체로부터 선택되는, 조성물.
20. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 154를 가지며, 상기 경쇄는 서열번호 159를 가진, 조성물.
21. 제 17항 내지 제 20항-중 어느 한 항에 있어서, 인간 체크포인트 수용체 단백질에 결합하는 제 2 항체를 추가로 포함하는, 조성물.
22. 제 21항에 있어서, 상기 제 2 항체는 인간 PD-1와 결합하는, 조성물.
23. 제 21항에 있어서, 상기 제 2 항체는 인간 PVRIG (서열번호 2)와 결합하는, 조성물.
24. 제 23항에 있어서, 상기 제 2 항체는 서열번호 5를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 10을 함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 조성물.
25. 제 23항에 있어서, 상기 제 2 항체의 중쇄는 서열번호 9를 가지고, 상기 제 2 항체의 경쇄는 서열번호 14를 가진, 조성물.
26. 다음을 포함하는 핵산 조성물:
a) 서열번호 150을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 인코딩하는 제 1 핵산; 및
b) 서열번호 155를 포함하는, 가변 경쇄 도메인을 인코딩하는 제 2 핵산.
27. 제 26항에 있어서, 상기 제 1 핵산은 VH-CH1-힌지-CH2-CH3를 포함하는 중쇄를 인코딩하고, 상기 VH는 서열번호 150을 포함하고; 상기 제 2 핵산은 VL-VC를 포함하는 경쇄를 인코딩하고, 상기 VL은 서열번호 155를 포함하고, VC는 람다 도메인인, 핵산 조성물.
28. 제 26항 또는 제 27항에 따른 상기 제 1 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터 및 제 26항 또는 제 27항에 따른 상기 제 2 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터를 각각 포함하는 발현 벡터 조성물.
29. 제 26항 또는 제 27항에 따른 상기 제 1 핵산 및 제 26항 또는 제 27항에 따른 상기 제 2 핵산을 각각 포함하는 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물.
30. 제 27항 또는 제 28항에 따른 상기 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포.
31. 다음을 포함하는 항-TIGIT 항체를 제조하는 방법:
a) 상기 항체가 발현되는 조건 하에 제 30항의 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 항체를 회수하는 단계.
32. T 세포를 활성화시킴으로써 암을 치료하는 방법으로서, 제 17항 내지 제 25항-중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
33. 다음을 포함하는 항체:
a) 서열번호 9를 갖는 중쇄; 및
b) 서열번호 14를 갖는 경쇄.
34. 제 33항에 있어서, 인간 체크포인트 수용체 단백질에 결합하는 제 2 항체를 추가로 포함하는, 항체.
35. 제 34항에 있어서, 상기 제 2 항체는 인간 PD-1와 결합하는, 항체.
36. 제 34항에 있어서, 상기 제 2 항체는 인간 TIGIT (서열번호 97)와 결합하는, 항체.
37. 제 36항에 있어서, 상기 제 2 항체는 서열번호 160를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 165를 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 항체.
38. 제 36항에 있어서, 상기 제 2 항체의 중쇄는 서열번호 164를 가지고, 상기 제 2 항체의 경쇄는 서열번호 169를 가진, 항체.
39. 다음을 포함하는 핵산 조성물:
a)서열번호 9를 인코딩하는 제 1 핵산; 및
b)서열번호 14를 인코딩하는 제 2 핵산; 및
40. 제 39항에 따른 상기 제 1 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터 및 제 39항에 따른 상기 제 2 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물.
41. 제 39항에 따른 상기 제 1 핵산 및 제 39항에 따른 상기 제 2 핵산을 각각 포함하는 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물.
42. 제 41항에 따른 상기 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포.
43. 다음을 포함하는 항-PVRIG 항체를 제조하는 방법:
a) 상기 항체가 발현되는 조건 하에 제 42항의 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 항체를 회수하는 단계.
44. T 세포를 활성화시킴으로써 암을 치료하는 방법으로서, 제 33항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
45. 다음을 포함하는 항체:
a) 서열번호 19를 갖는 중쇄; 및
b) 서열번호 24를 갖는 경쇄.
46. 제 45항에 있어서, 인간 체크포인트 수용체 단백질에 결합하는 제 2 항체를 추가로 포함하는, 항체.
47. 제 46항에 있어서, 상기 제 2 항체는 인간 PD-1와 결합하는, 항체.
48. 제 46항에 있어서, 상기 제 2 항체는 인간 TIGIT (서열번호 97)와 결합하는, 항체.
49. 제 48항에 있어서, 상기 제 2 항체는 서열번호 160를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 165를 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 항체.
50. 제 49항에 있어서, 상기 제 2 항체의 중쇄는 서열번호 164를 가지고, 상기 제 2 항체의 경쇄는 서열번호 169를 가진, 항체.
51. 다음을 포함하는 핵산 조성물:
a)서열번호 19를 인코딩하는 제 1 핵산; 및
b)서열번호 24를 인코딩하는 제 2 핵산; 및
52. 제 51항에 따른 상기 제 1 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터 및 제 51항에 따른 상기 제 2 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물.
53. 제 51항에 따른 상기 제 1 핵산 및 제 51항에 따른 상기 제 2 핵산을 각각 포함하는 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물.
54. 제 53항에 따른 상기 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포.
55. 다음을 포함하는 항-TIGIT 항체를 제조하는 방법:
a) 상기 항체가 발현되는 조건 하에 제 54항의 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 항체를 회수하는 단계.
56. T 세포를 활성화시킴으로써 암을 치료하는 방법으로서, 제 45항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
57. 다음을 포함하는 방법:
a) 환자의 종양 시료로부터 세포 집단을 제공하는 단계;
b) 상기 집단을 다음과 결합하는 표지된 항체로 염색하는 단계:
i) TIGIT 단백질;
ii) PVR 단백질;
iii) PD-1 단백질;
iv) PD-L1 단백질; 및
v) i) 내지 iv)에서의 항체에 대한 적절한 이소형 대조군;
c) 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 전개하는 단계;
d) TIGIT, PVR, PD-1 및 PD-L1 각각에 대해, 상기 이소형 대조군 항체에 대비하여 단백질을 발현하는 상기 집단에서의 세포의 백분율을 결정하는 단계;
양성 세포의 백분율이 모든 4개 수용체에 대해 > 1%인 경우,
e) TIGIT 및 PD-1에 대한 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계.
58. 제 57항에 있어서, 상기 TIGIT 항체는 CPA.9.086인, 방법.
59. 제 57항 또는 제 58항에 있어서, 상기 PD-1 항체는 펨브로리주마브 및 니볼루마브로부터 선택되는, 방법.
60. 다음을 포함하는 방법:
a) 환자의 종양 시료로부터 세포 집단을 제공하는 단계;
b) 상기 집단을 다음과 결합하는 표지된 항체로 염색하는 단계:
i) PVRIG 단백질;
ii) PVRL2 단백질;
iii) PD-1 단백질;
iv) PD-L1 단백질; 및
v) i) 내지 iv)에서의 항체에 대한 적절한 이소형 대조군;
c) 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 전개하는 단계;
d) PVRIG, PVRL2, PD-1 및 PD-L1 각각에 대해, 상기 이소형 대조군 항체에 대비하여 단백질을 발현하는 상기 집단에서의 세포의 백분율을 결정하는 단계;
양성 세포의 백분율이 모든 4개 수용체에 대해 > 1%인 경우,
e) PVRIG 및 PD-1에 대한 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계.
61. 제 60항에 있어서, 상기 PVRIG 항체는 CHA.7.518.1.H4(S241P)인, 방법.
62. 제 60항 또는 제 61항에 있어서, 상기 PD-1 항체는 펨브로리주마브 및 니볼루마브로부터 선택되는, 방법.
63. 다음을 포함하는 방법:
a) 환자의 종양 시료로부터 세포 집단을 제공하는 단계;
b) 상기 집단을 다음과 결합하는 표지된 항체로 염색하는 단계:
i) PVRIG 단백질;
ii) PVRL2 단백질;
iii) TIGIT 단백질;
iv) PVR 단백질; 및
v) 이소형 대조군;
c) 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 전개하는 단계;
d) PVRIG, PVRL2, TIGIT 및 PVR 각각에 대해, 상기 이소형 대조군 항체에 대비하여 단백질을 발현하는 상기 집단에서의 세포의 백분율을 결정하는 단계;
양성 세포의 백분율이 모든 4개 수용체에 대해 > 1%인 경우,
e) PVRIG 및 TIGIT에 대한 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계.
64. 제 63항에 있어서, 상기 PVRIG 항체는 CHA.7.518.1.H4(S241P)인, 방법.
65. 제 63항 또는 제 64항에 있어서, 상기 TIGIT 항체는 CPA.9.086인, 방법.
66. 다음을 포함하는 인간 TIGIT (서열번호 97)에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 조성물:
a) 서열번호 560을 포함하는 가변 중쇄 도메인; 및
b) 서열번호 565를 포함하는 가변 경쇄 도메인.
67. 제 66항에 있어서, 상기 조성물은 다음을 포함하는 항체인, 조성물:
a) VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 중쇄로서, 상기 VH는 서열번호 560을 포함하는, 중쇄; 및
b) VL-VC를 포함하는 경쇄로서, 상기 VL은 서열번호 565를 포함하고, VC는 카파 또는 람다 둘 중 하나인, 경쇄.
68. 제 67항에 있어서, 상기 CH1-힌지-CH2-CH3 서열은 인간 IgG1, IgG2, IgG4 및 이의 변이체로부터 선택되는, 조성물.
69. 제 67항 또는 제 68항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 564를 가지며, 상기 경쇄는 서열번호 569를 가진, 조성물.
70. 제 67항 내지 제 69항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 체크포인트 수용체 단백질에 결합하는 제 67 항체를 추가로 포함하는, 조성물.
71. 제 70항에 있어서, 상기 제 2 항체는 인간 PD-1와 결합하는, 항체.
72. 제 70항에 있어서, 상기 제 2 항체는 인간 PVRIG (서열번호 2)와 결합하는, 조성물.
73. 제 72항에 있어서, 상기 제 2 항체는 서열번호 5를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 10을 함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 조성물.
74. 제 72항에 있어서, 상기 제 2 항체의 중쇄는 서열번호 9를 가지고, 상기 제 2 항체의 경쇄는 서열번호 14를 가진, 조성물.
75. 다음을 포함하는 핵산 조성물:
a) 서열번호 560을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 인코딩하는 제 1 핵산; 및
b) 서열번호 565를 포함하는, 가변 경쇄 도메인을 인코딩하는 제 2 핵산.
76. 제 75항에 있어서, 상기 제 1 핵산은 VH-CH1-힌지-CH2-CH3를 포함하는 중쇄를 인코딩하고, 상기 VH는 서열번호 560을 포함하고; 상기 제 2 핵산은 VL-VC를 포함하는 경쇄를 인코딩하고, 상기 VL은 서열번호 565를 포함하고, VC는 람다 도메인인, 핵산 조성물.
77. 제 75항 또는 제 76항에 따른 상기 제 1 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터 및 제 75항 또는 제 76항에 따른 상기 제 2 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터를 각각 포함하는 발현 벡터 조성물.
78. 제 75항 또는 제 76항에 따른 상기 제 1 핵산 및 제 75항 또는 제 76항에 따른 상기 제 2 핵산을 각각 포함하는 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물.
79. 제 77항 또는 제 78항에 따른 상기 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포.
80. 다음을 포함하는 항-TIGIT 항체를 제조하는 방법:
a) 상기 항체가 발현되는 조건 하에 제 79항의 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 항체를 회수하는 단계.
81. T 세포를 활성화시킴으로써 암을 치료하는 방법으로서, 제 66항 내지 제 74항-중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
도 1은 인간 PVRIG의 전장의 서열 (두 개의 상이한 메티오닌 개시점을 보여줌)를 나타낸다. 신호 펩타이드는 밑줄이 표시되고, ECD는 이중 밑줄로 표시된다.
도 2는 인간 폴리오바이러스 수용체-관련 2 단백질 (PVLR2, 넥틴-2, CD112 또는 헤르페스바이러스 진입 매개인자 B (HVEB)라고도 알려짐), PVRIG의 결합 파트너의 서열 나타낸다. PVLR2는 인간 세포질막 당단백질이다.
도3a 및 3b는 가변 중쇄 및 경쇄뿐만 아니라 본 발명의 열거된 CHA 항체 CHA.7.518.1.H4(S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4(S241P) 각각의 vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3 서열을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 PVRIG 항체가 MLR에서 T-세포 증식을 증가시키는 것을 나타낸다. 낮은 CFSE 세포의 백분율은 표시된 PVRIG 항체로 처리된 MLR 검정으로부터 관찰된다. 각 그래프는 하나의 CD3 T-세포 공여자를 나타낸다. 실험은 미국 특허 USSN 15/048,967의 실시예 23에 기술되어 있으며, 본원에 참조문헌으로 통합된다.
도 5a 및 5b는 HEK hPVRIG 조작된 세포주, HEK 모체 세포 및 Jurka 세포에 대한 PVRIG 하이브리도마 항체의 결합 특징을 나타낸다. HEK OE는 HEK hPVRIG 세포를 표시하고, HEK par는 HEK 모체 세포를 표시한다. Jurkat 데이타의 경우, gMFIr은 이의 대조군에 대비한 PVRIG 항체 염색의 기하학적 MFI의 배수 차이를 표시한다. 농도는 gMFIr이 계산된 지점을 지시한다. 결합 없음은 항체가 테스트된 세포주에 결합하지 않는 것을 지시한다. 강조된 항체는 관심있는 '상위 네 개'의 항체이다.
도 6a 및 6b는 일차 인간 PBMC, 시노 과발현 세포 및 시노 일차 PBMC에 대한 PVRIG 하이브리도마 항체의 결합 특징을 나타낸다. Expi 시노 OE는 cPVRIG로 일시적 형질감염된 expi 세포를 표시하고, expi par는 expi 모체 세포를 표시한다. gMFIr은 이의 대조군에 대비한 PVRIG 항체 염색의 기하학적 MFI의 배수 차이를 표시한다. 농도는 gMFIr이 계산된 지점을 지시한다. 테스트 없음은 인간 HEK hPVRIG, expi cPVRIG 세포에 결합이 없거나 PBMC 하위집합에 대한 결합 요구조건을 충족시키지 않아 시험되지 않은 항체를 지시한다. 강조된 항체는 관심있는 '상위 네 개'의 항체이다. 실험은 미국 특허 USSN 15/048,967의 실시예 21에 기술되어 있으며, 본원에 참조문헌으로 통합된다.
도 7a 및 7b는 FACS-기반 경쟁 검정에서 PVRIG 항체의 차단 능력의 개요를 나타낸다. 억제의 IC50이 표시된다. IC50 없음은 이들 항체가 비-차단제임을 지시한다. 강조된 항체는 관심있는 '상위 네 개'의 항체이다. 실험은 미국 특허 USSN 15/048,967의 실시예 21에 기술되어 있으며, 본원에 참조문헌으로 통합된다.
도 8a 및 8b는 TIL이 흑색종 세포 624와 1 : 1 E : T로 항-PVRIG Ab (CPA.7.021, 10 μg/ml), 항-TIGIT (10A7 클론, 10 μg/ml)의 존재 시 또는 조합으로 18시간 동안 공동-배양된 결과를 나타낸다. 상청액을 수집하여 분비된 사이토카인을 검출하기 위한 Th1 Th2 Th17 세포계측 비드 어레이 검정으로 시험하였다. IFNγ (A) 및 TNF (B) 수준이 검출되었다. 치료는 세 벌의 시료의 스튜던트 t-테스트 (* P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01)로 비교되었다.
도 9a 내지 9f는 MART-1 또는 209 TIL이 흑색종 세포 624와 1 : 1 E : T로 항-PVRIG Ab (CPA.7.021, 10 μg/ml), 항-DNAM1 (DX11 클론, BD Biosciences 카탈로그 번호 559787; 10 μg/ml)의 존재 시 또는 조합으로 18시간 동안 공동-배양하였다. 상청액을 수집하여 분비된 사이토카인을 검출하기 위한 Th1 Th2 Th17 세포계측 비드 어레이 검정으로 시험하였다. IFNγ (A, D) 및 TNF (B, E) 수준이 검출되었다. TIL은 CD137 (C, F)의 표면 발현을 위해 염색되었다.
도 10a 및 10b는 TIL (F4)이 흑색종 세포 624와 1 : 3 E : T로 항-PVRIG Ab (CPA.7.021, 10 μg/ml), 항-TIGIT (10A7 클론, 10 μg/ml) 또는 항-PD1 (mAb 1B8, Merck; 10 μg/ml)의 존재 시 또는 조합으로 18시간 동안 공동-배양된 결과를 나타낸다. 상청액을 수집하여 분비된 사이토카인을 검출하기 위한 Th1 Th2 Th17 세포계측 비드 어레이 검정으로 시험하였다. IFNγ (A) 및 TNF (B) 수준이 검출되었다.
도 11a 내지 11e는 CHA.7.518, CHA.7.524, CHA.7.530, CHA.7.538_1 및 CHA.7.538_2 각각에 대한 네 개의 인간화 서열을 나타낸다. 모든 인간화 항체는 H4 (S241P) 치환을 포함한다. CHA.7.538_2의 경쇄는 CHA.7.538_1의 경우와 동일한다. 각각의 "H1"은 "CDR 교체"이며 인간 프레임워크에는 변경이 없다. 후속 서열은 더 굵은 글꼴로 표시된 프레임워크 변화를 변경시킨다. CDR 서열은 굵은 글씨로 표시된다. CDR 정의는 웹 사이트 www.bioinf.org.uk/abs/로부터의 AbM이다. IMGT® 국제 ImMunoGeneTics® 정보 시스템 www.imgt.org (설립자겸 이사: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France)으로부터의 인간 생식계열 및 연결 서열. 잔기 번호매김은 순차적으로 (seq) 또는 웹 사이트 www.bioinf.org.uk/abs/ (AbM)로부터의 초티아에 따라 나타낸다. "b"는 묻힌 측쇄를 표시하고; "p"는 부분적으로 묻힌 것을 표시하고; "i"는 VH 및 VL 도메인 사이의 경계면에서 측쇄를 표시한다. 인간 및 마우스 생식계열 사이의 서열 차이는 별표 (*)로 표시된다. 프레임워크에서 잠재적인 추가적 돌연변이는 하기 서열에 표시된다. 도면 상에 표시된 바와 같이 (# 탈아미노화 치환: Q/S/A; 이들은 아스파라긴 (N) 탈아미노화를 방지할 수 있음) CDR 서열의 잠재적인 변화는 각 CDR 서열 아래에 표시된다. @트립토판 산화 치환: Y/F/H; 이들은 트립토판 산화를 방지할 수 있다; @ 메티오닌 산화 치환: L/F/A).
도 12a 및 12e는 세 개의 CHA 항체인 CHA.7.518, CHA.7.538.1 및 CHA.7.538.2의 인간화 서열의 조사를 나타낸다.
도 13은 인간화 VH 및 VL CHA 항체를 결합하기 위한 설계를 나타낸다. "chimVH" 및 "chimVL"은 인간 IgG 불변 도메인에 부착된 마우스 가변 중쇄 및 경쇄 서열이다.
도 14는 일차 인간 PBMC, 시노 과발현 세포 및 시노 일차 PBMC에 대한 PVRIG 하이브리도마 항체의 결합 특징을 나타낸다. Expi 시노 OE는 cPVRIG로 일시적 형질감염된 expi 세포를 표시하고, expi par는 expi 모체 세포를 표시한다. gMFIr은 이의 대조군에 대비한 PVRIG 항체 염색의 기하학적 MFI의 배수 차이를 표시한다. 농도는 gMFIr이 계산된 지점을 지시한다. 테스트 없음은 인간 HEK hPVRIG, expi cPVRIG 세포에 결합이 없거나 PBMC 하위집합에 대한 결합 요구조건을 충족시키지 않아 시험되지 않은 항체를 지시한다. 강조된 항체는 인간화가 시행된 네 개의 항체이다 (도 24 참조). 실험은 미국 특허 USSN 15/048,967의 실시예 21에 기술되어 있으며, 본원에 참조문헌으로 통합된다.
도 15는 FACS-기반 경쟁 검정에서 PVRIG 항체의 차단 능력의 요약을 나타낸다. 억제의 IC50이 표시된다. IC50 없음은 이들 항체가 비-차단제임을 지시한다. 강조된 항체는 인간화가 시행된 네 개의 항체이다 (도 24 참조).
도 16. NK 세포 세포독성 검정에서 Reh 및 MOLM-13 세포에 대한 선택된 PVRIG 항체의 활성의 개요. 대조군에 대비한 세포독성의 배수 변화는 PVRIG 항체가 있는 상태에서의 살상의 절대 수준 (%)을 대조군 항체의 절대 살상 수준 (%)으로 나누어 계산하였다. 배수 변화는 5 : 1 효과기 대비 표적 비율로부터 계산된다.
도 17. PV PVRIG 오르토체의 서열 정렬. 인간, 시노몰거스, 마모셋 및 레서스 PVRIG 세포외 도메인의 정렬된 서열. 인간과 시노몰거스의 차이는 노란색으로 강조된다.
도 18. 시노, 인간, 시노/인간 하이브리드 PVRIG 변이체에 대한 항-인간 PVRIG 항체의 결합. 야생형 시노 PVRIG (●), H61R 시노 PVRIG (■), P67S 시노 PVRIG (▲), L95R/T97I 시노 PVRIG (▼) 및 야생형 인간 PVRIG (◆)에 대한 항체 결합을 나타낸다. ELISA 신호는 항체 농도의 함수로서 좌표화된다.
도 19. 항-인간 PVRIG 항체의 에피토프기 및 시노 교차-반응성의 상관 관계.
도 20 (A) PVRIG 및 HEK 모체 세포를 과발현하도록 조작된 HEK 세포에 대한 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 특이성. 데이타는 증가하는 항체 농도의 함수로서 절대 기하학적 MFI (gMFI) 측정을 보여준다. (B) PVRIG를 과발현하도록 조작된 HEK 세포 및 HEK 모체 세포에 대한 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 특이성. 데이타는 증가하는 항체 농도의 함수로서 절대 기하학적 MFI (gMFI) 측정을 보여준다.
도 21a 및 21b는 RNA 발현에 의해 검증된 PVRIG를 내인성으로 발현하는Jurkat 세포와 결합하는 CHA.7.518.1.H4 (S241P) (A) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) (B)의 능력을 나타낸다. (A) Jurkat 세포에 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 결합. 데이타는 증가하는 항체 농도의 함수로서 절대 기하학적 MFI (gMFI) 측정을 보여준다. 이소형 염색은 음성 대조군으로서 나타낸다. (B) Jurkat 세포에 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 결합. 데이타는 증가하는 항체 농도의 함수로서 절대 기하학적 MFI (gMFI) 측정을 보여준다. 이소형 염색은 음성 대조군으로서 나타낸다. 두 개 항체 모두 HEK hPVRIG 세포와 비슷한 친화성을 갖는 Jurkat 세포와 결합할 수 있다.
도 22는 CMV 펩타이드(494-503, NLVPMVATV)에 노출에 의해 증식되었고, RNA 발현에 의해 검증된 PVRIG를 내인성으로 발현하는 CD8 T 세포에 결합하는 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 능력을 나타낸다. CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)를 CMV 펩타이드-증식된 CD8 T-세포에 결합시킨다. 데이타는 증가하는 항체 농도의 함수로서 절대 기하학적 MFI (gMFI) 측정을 보여준다. 이소형 염색은 음성 대조군으로서 나타낸다.
도 23a 내지 23b. (A) 시노몰거스 PVRIG 및 expi 모체 세포를 과발현하도록 조작된 expi 세포에 대한 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 특이성. 데이타는 증가하는 항체 농도의 함수로서 절대 기하학적 MFI (gMFI) 측정을 보여준다. 시노몰거스 PVRIG 및 expi 모체 세포를 과발현하도록 조작된 expi 세포에 대한 CHA.7.538.1.2.H4(S241P)의 특이성. 데이타는 증가하는 항체 농도의 함수로서 절대 기하학적 MFI (gMFI) 측정을 보여준다.
도 24a 내지 24b. (A) CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)에 의한 HEK 세포에 대한 PVRIG Fc의 차단. 데이타는 최대 PVRIG Fc-유도된 신호 및 이차적인 배경에 대비하여 증가하는 항체 농도의 함수로서 HEK 세포에 결합하는 PVRIG Fc의 백분율을 나타낸다. (B) CHR.7.544가 HEK 세포에 대한 PVRIG Fc의 결합에 미치는 효과. 데이타는 증가하는 CHA.7.544 농도의 존재 하에 HEK 세포에 결합하는 PVRIG Fc로부터 유해한 절대 gMFI를 나타낸다. PVRIG Fc 결합의 양은 Alexa 647에 컨쥬게이션된 항-마우스 Fc 이차 항체에 의해 검출되었다.
도 25a 내지 25b. (A) CHA.7.518.1.H4 (S241P), CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 및 CHA.7.530.3에 의한 HEK hPVRIG 세포에 대한 PVRL2 Fc의 차단. 데이타는 최대 PVRL2 Fc-유도된 신호 및 이차적인 배경에 대비하여 증가하는 항체 농도의 함수로서 HEK hPVRIG 세포에 결합하는 PVRL2 Fc의 백분율을 나타낸다. (B) HEK hPVRIG 세포에 결합하는 PVRL2 Fc에 미치는 CHA.7.544의 효과. 데이타는 최대 PVRL2 Fc-유도된 신호 및 이차적인 배경에 대비하여 증가하는 항체 농도의 함수로서 HEK hPVRIG 세포에 결합하는 PVRL2 Fc의 백분율을 나타낸다.
도 26는 Jurkat 세포와 미컨쥬게이션된 CHA.7.518.1.H4 (S241P), CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 및 이소형 대조군의 사전-배양 시 그들의 최대 신호 대비 Alexa 647 컨쥬게이션된 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 결합의 백분율을 나타낸다.
도 27a 및 27b. (A) 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)가 CD4+ T 세포 증식을 증가시킨다. 대표적인 데이타 (n=2)는 항-DNAM-1 항체 또는 상이한 항-PVRIG 항체 또는 IgG 이소형 대조군의 존재 시 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양할 때 단일한 인간 CD4+ T 세포 공여자로부터의 CFSE가 낮고 증식하는 CD4+ T 세포 (평균+ 표준 편차)의 백분율을 나타낸다. 점선은 인간 IgG4 이소형 대조군 항체로 처리한 후 증식하는 저CFSE CD4+ T 세포의 기저선 백분율을 나타낸다. 수치는 적절한 이소형 대조군 항체와 비교하여 항-PVRIG 또는 항-DNAM-1 항체 처리의 증식에서 백분율의 증가 또는 감소를 말한다. (B) 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 hPVRL2-의존적 방식으로 CD4+ T 세포 증식을 증가시킨다. 대표적인 데이타 (n=2)는 항-DNAM-1 항체 또는 상이한 항-PVRIG 항체 또는 IgG 이소형 대조군의 존재 시 CHO-S OKT3 모체 또는 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양에 반응하여 단일한 인간 CD4+ T 세포 공여자로부터의 저CFSE 증식하는 CD4+ T 세포 (평균+ 표준 편차)의 백분율을 나타낸다. 점선은 인간 IgG4 또는 마우스 IgG1 이소형 항체로 처리한 후 증식하는 저CFSE CD4+ T 세포의 기저선 백분율을 나타낸다. 수치는 적절한 이소형 대조군 항체와 비교하여 항-PVRIG 또는 항-DNAM-1 항체 처리의 증식에서 백분율 증가 또는 감소를 말한다.
도 28a 내지 28c. (A) 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 CD8+ T 세포를 증식을 증가시킨다. 대표적인 데이타 (n=2)는 항-DNAM-1 항체 또는 상이한 항-PVRIG 항체 또는 IgG 이소형 대조군의 존재 시 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양할 때 단일한 인간 CD8+ T 세포 공여자 (공여자 232)로부터의 증식하는 저CFSE CD8+ T 세포 (평균 + 표준 편차)의 백분율을 나타낸다. 점선은 마우스 IgG1 또는 인간 IgG4 이소형 대조군 항체로 처리한 후 증식하는 저CFSE CD8+ T 세포의 기저선 백분율을 나타낸다. 수치는 적절한 이소형 대조군 항체와 비교하여 항-PVRIG 또는 항-DNAM-1 항체 처리의 증식에서 백분율 증가 또는 감소를 말한다. (B) 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 CD8+ T 세포 증식을 증가시킨다. 대표적인 데이타 (n=2)는 항-DNAM-1 항체 또는 상이한 항-PVRIG 항체 또는 IgG 이소형 대조군의 존재 시 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양할 때 단일한 인간 CD8+ T 세포 공여자 (공여자 234)로부터의 증식하는 저CFSE CD8+ T 세포 (평균+ 표준 편차)의 백분율을 나타낸다. 점선은 마우스 IgG1 또는 인간 IgG4 이소형 대조군 항체로 처리한 후 증식하는 저CFSE CD8+ T 세포의 기저선 백분율을 나타낸다. 수치는 적절한 이소형 대조군 항체와 비교하여 항-PVRIG 또는 항-DNAM-1 항체 처리의 증식에서 백분율 증가 또는 감소를 말한다. (C) 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 CD8+ T-세포로부터 IFNγ 분비를 증가시킨다. 대표적인 데이타 (n=2)는 항-DNAM-1 항체 또는 상이한 항-PVRIG 항체 또는 IgG 이소형 대조군의 존재 시 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양할 때 세 명의 상이한 인간 CD8+ T 세포 공여자 (공여자 231, 232 및 234)에 의해 생산된 INFg의 pg/mL을 나타낸다. 점선은 인간 IgG4 이소형 항체로 처리한 후의 기저선 IFNγ 생산을 나타낸다. 수치는 IgG4 이소형 대조군과 비교하여 항-PVRIG 항체 처리의 IFNγ 분비에서 증가 백분율을 말한다.
도 29. 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 다수의 공여자에서 CD4+ T 세포의 증식을 지속적으로 증가시키지만, CHA.7.530.3과 CHA.7.544는 그렇지 않다. 이소형 대조군과 비교한 증식 백분율은 각 공여자의 경우에 PVRIG 항체 처리 후 저CFSE CD4+ T 세포의 백분율을 이소형 항체 처리로 나누어서 계산하였다. 이소형 항체 처리의 증식 백분율은 0으로 설정되었다. 그래프의 각 기호는 다른 공여자를 나타낸다.
도 30a 내지 30d. (A) CD4+ T 세포 증식에 미치는 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 용량-의존성 효과. 2명의 상이한 인간 공여자로의 대표적인 데이타 (n=2)는 인간 IgG4 이소형, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 또는 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 항체로의 66 nM 내지 0.726 nM의 용량 적정 후 증식하는 CD4+ T세포의 평균 백분율을 나타낸다. 추정된 EC50은 단일 자리수 nM 범위 내에 있다 (B) CD8+ T 세포 증식에 미치는 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 용량-의존성 효과. 2명의 상이한 인간 공여자로의 대표적인 데이타 (n=2)는 인간 IgG4 이소형, CHA.7.518.1.H4(S241P), CHA.7.38.1.2 또는 CHA.7.544 항체로의 66 nM 내지 0.264 nM의 용량 적정 후 증식하는 CD8+ T세포의 평균 백분율을 나타낸다. 추정된 EC50은 단일 자리수 nM 범위 내에 있다
도 31a 내지 31c. (A) 624 흑색종 세포주에서 TIL 및 PVR, PVRL2 발현에 대한 TIGIT 및 PVRIG 발현의 유동 세포계측법 분석. 수치는 평균 형광 강도 (MFI) 비율 대 이소형 대조군을 나타낸다. (B-C) 대표적인 실험은 단일 처리로서 이소형 대조군, 항-TIGIT (30 μg/ml) 또는 항-PVRIG Ab (10 μg/ml)의 존재 시 (청색 히스토그램) 또는 항-TIGIT와 조합으로 (녹색 히스토그램) 흑색종 세포 624와 함께 1 : 3 E : T에서 18시간 동안 공동-배양될 때 TIL에 의한 IFNγ (B) 및 TNF (C) 분비를 나타낸다. Ab 단일 처리 효과의 백분율을 이소형 대조군 처리 mIgG1과 비교하고 Ab 조합 처리 효과의 백분율을 항-TIGIT 단일 처리와 비교하였다.
도 32a 내지 32h. 항-PVRIG Ab CHA.7.518.1.H4 (S241P) 또는 CHA.7.538의 존재 시, 항-TIGIT (aTIGIT) 조합이 있거나 없이 TIL (209-gp100/463-F4-gp100)를 흑색종 세포 624와 함께 18시간 동안 1 : 3 E : T에서 공동-배양하였고, 사이토카인 분비 여부를 테스트하였다. Ab 처리 효과의 백분율을 이소형 대조군 처리와 비교하였고 5회의 실험 (F4) 또는 6 회의 실험 (209)의 평균을 좌표화하였다. 쌍 이룬 이단 T 테스트는 이소형 또는 조합과 비교하여 각 처리에 대해 계산되었으며, 항-TIGIT 단독과 비교하여 p값이 표시된다.
도 33a 내지 33b. (A) 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 항-TIGIT 항체는 단일 항체 처리와 비교하여 CD4+ T 세포 증식을 증가시킨다. 대표적인 데이타 (n=2)는 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양할 때 단일한 인간 CD4+ T 세포 공여자 (공여자 143)로부터의 증식하는 저CFSE CD4+ T 세포 (평균+ 표준 편차)의 백분율을 나타낸다. 점선은 인간 IgG4 이소형 대조군 항체로 처리한 후 증식하는 저CFSE CD4+ T 세포의 기저선 백분율을 나타낸다. (B) 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 항-TIGIT 항체는 단일 항체 처리와 비교하여 CD4+ T 세포 증식을 증가시킨다. 대표적인 데이타 (n=2)는 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양할 때 단일한 인간 CD4+ T 세포 공여자 (공여자 201)로부터의 증식하는 저CFSE CD4+ T 세포 (평균+ 표준 편차)의 백분율을 나타낸다. 점선은 인간 IgG4 이소형 대조군 항체로 처리한 후 증식하는 저CFSE CD4+ T 세포의 기저선 백분율을 나타낸다. 수치는 적절한 이소형 대조군 항체와 비교하여 항-PVRIG 또는 항-DNAM-1 항체 처리의 증식에서 백분율 증가 또는 감소를 말한다.
도 34a 내지 34b. (A) 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 항-TIGIT 항체의 조합은 CD8+ T 세포 증식을 증가시킨다. 대표적인 데이타 (n=2)는 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양할 때 대표적인 인간 CD8+ T 세포 공여자 (공여자 232)로부터의 증식하는 저CFSE CD8+ T 세포 (평균+ 표준 편차)의 백분율을 나타낸다. 점선은 인간 IgG4 이소형 대조군 항체로 처리한 후 증식하는 저CFSE CD8+ T 세포의 기저선 백분율을 나타낸다. 수치는 적절한 이소형 대조군 항체와 비교하여 항-PVRIG 또는 항-DNAM-1 항체 처리의 증식에서 백분율 증가 또는 감소를 말한다. (B) 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 항-TIGIT 항체의 조합은 CD8+ T 세포로부터의 IFNg 분비를 증가시킨다. 대표적인 데이타 (n=2)는 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양할 때 대표적인 인간 CD8+ T 세포 공여자 (공여자 232)로부터 INFg의 pg/ml (평균+ 표준 편차)을 나타낸다. 점선은 인간 IgG4 이소형 항체로 처리한 후의 기저선 IFNγ 생산을 나타낸다. 수치는 적절한 이소형 대조군 항체와 비교하여 항-PVRIG 또는 항-DNAM-1 항체 처리의 INFg 분비에서 백분율 증가 또는 감소를 말한다.
도 35는 실시예 2(3)의 실험 시스템의 설계를 나타낸다.
도 36a 내지 36c는 TIL에서 PVRIG (항-인간 PVRIG CHA.7.538.AF647 사용), TIGIT (항-인간 TIGIT Cat. 17-9500-41 eBioscience 사용) 및 DNAM-1 (항-인간 CD226-APC　Cat. 338312 biolegend 사용) 발현의 수준을 도시하는 히스토그램을 나타낸다. 발현의 배수는 이소형 (Iso) 대조군과 비교된다.
도 37. TIL로부터의 IFNγ 분비에 미치는 항-PVRIG 항체의 효과의 요약된 좌표. TIL은 항 PVRIG 항체 (c518, c538 및 544) 또는 항 TIGIT 항체의 존재 시 PVRL2를 과발현하는 CHO-S HLA-A2/B2M 세포와 함께 18시간 동안 1 : 3의 E : T 비율로 공동-배양하였다. 각 점은 상이한 실험으로부터 동일한 TIL로부터의 IFNγ 분비 데이타의 평균을 나타낸다. 표시된 백분율은 이소형 대조군과 비교하여 각 항체 처리마다 상이하다. 쌍 이룬 이단 T-테스트는 544 또는 조합과 비교하여 각 처리에 대해 계산되었고, 항-TIGIT 단독과 비교하여 p 값이 표시된다. 각 TIL마다 수행된 실험 수; 209 (N = 3), F4 (N = 2), F5 (N = 3) 및 MART1 (N = 2).
도 38. TIL로부터의 TNFa 분비에 미치는 c518 및 c538 용량 반응의 효과의 요약된 좌표. TIL은 실시예 2(3)에 기술된 바와 같이 항 PVRIG 항체 (c518, c538 및 이소형 대조군)의 존재 시 PVRL2를 과발현하는 CHO-S HLA-A2/B2M 세포와 함께 18시간 동안 1 : 3의 효과기-대-표적 비율로 공동-배양하였다.
도 39a 내지 39c. TIL은 항 PVRIG 항체 (c518, c538 및 544) 또는 항 TIGIT 항체의 존재 시 PVRL2를 과발현하는 CHO-S HLA-A2/B2M 표적 세포와 함께 18시간 동안 1 : 3의 E : T 비율로 공동-배양하였다. 상기 표에 표시된 백분율은 그의 이소형 대조군과 비교하여 각 항체 처리의 TIL로부터의 사이토카인 분비 효과의 차이이다. 첫 번째 실험은 도면 A와 B에 나타내고, 두 번째 실험은 도면 C에 나타낸다.
도 40. CHO-S OKT3 공동-배양 검정의 설계. CFSE 표지된 CD3+ T 세포를 CHO-S-OKT3-PVRL2 또는 5d에 대한 모의 형질전환된 세포와 공동-배양하였다. T-세포 증식 및 사이토카인 분비에 미치는 항-PVRIG 항체 효과를 분석하였다.
도 41. 반응 대 미반응 공여자에서 CHO-OKT3 PVRL2 세포 상의 IFNγ 분비에 미치는 항-PVRIG 항체의 효과. 2 명의 다른 공여자로부터의 CD3+ 세포를 항 PVRIG 항체의 존재 시 CHO-S-PVRL2 세포와 5 : 1 E : T에서 5일 동안 공동-배양하였고, 사이토카인 분비 및 T 세포 증식을 테스트하였다. (A) 본 발명자가 PVRIG 항체에 대한 효과를 관찰한 '반응 공여자'. (B) 본 발명자가 Ab 처리의 효과를 관찰하지 못한 '미반응 공여자'.
도 42. 반응 공여자로부터의 CD4 및 CD8 증식에 미치는 항-PVRIG 항체의 효과. CFSE 표지된 CD3+ T 세포를 항-PVRIG Ab 또는 항-TIGIT Ab의 존재 시 CHO-S-PVRL2 세포와 5일 동안 5 : 1 E : T에서 공동-배양하였다. CD4 또는 CD8에서 T 세포 증식 게이팅에 미치는 효과를 유동 세포계측법으로 평가하였다. CD4+ 저CFSE 또는 CD8+ 저CFSE의 증식하는 세포 (낮은 CFSE) (A) 또는 전체 세포 수 (B)의 백분율이 제시된다.
도 43는 반응 공여자로부터의 IFNγ 분비 또는 CD8 증식에 미치는 항-PVRIG 항체의 효과를 나타낸다. CD3+ 세포를 항-PVRIG Ab의 존재 시 CHO-S-PVRL2 세포와 5일 동안 5 : 1 E : T에서 공동-배양하고 (A) 사이토카인 분비 및 (B) T-세포 증식을 테스트하였다. Ab 처리 효과의 백분율을 이소형 대조군 처리와 비교하고, 5명의 '반응' 공여자 (응답자)의 평균을 제시하였다. (C) 이소형 대 항-PVRIG Ab로의 치료 시 섹션 A 및 B에 기술된 바와 같이 CHOS-OKT3 PVRL2와의 공동-배양 시 동일한 5명의 공여자로부터의 IFNγ 분비 수준으로 p값은 쌍 이룬 T 테스트의 비율을 나타낸다.
도 44는 테스트된 공여자 (n=10)의 항체 처리 효과의 표 요약이다. 표시된 백분율은 적절한 이소형 대조군과 비교하여 특정 판독 값 (컬럼 제목으로 표시됨)에 미치는 Ab 처리의 효과를 나타낸다. 일부 항-PVRIG 항체 (주로 CHA.7.518)가 이소형 대조군 대비 IFNγ 또는 증식을 증진시킨 '반응 공여자' (공여자 # 3, 72,226,345 및 ES_001)는 '응답자'로서 간주되었다.
도 45a 및 45b는 여러 항체로의 실험 결과를 나타낸다. HEK hPVRIG 세포는 본원에서 논의된 바와 같이 hPVRIG로 형질전환된 HEK 세포 및 내인성 hPVRIG를 발현하는 Jurkat 세포이며, 친화성 (nM)은 A에 나타낸다. (B)는 공여자 1의 일차 CD8 T 세포에 대한 4가지 상이한 항체를 사용하는 gMFI를 나타내고, (C)는 공여자 2의 일차 CD8 T 세포이다.
도 46a 내지 46b는 CHO 세포와 TIGIT의 상호작용을 나타낸다. (A) 인간 TIGIT Fc 단백질이 CHO 세포에 결합한다. 인간 TIGIT Fc 및 Synagis IgG1 대조군의 등급화된 농도를 FACS-기반 결합 검정에서 CHO 세포에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. (B) 인간 PVR은 활성화된 CD4 T 세포에서 발현된다. CD4 T 세포를 OKT3 항체의 scFv를 발현하는 CHO 세포와 함께 공동-배양하고 5일 동안 활성화시켰다. 5일째에, CD4 T 세포를 PVR의 발현 및 CFSE의 희석에 대해 분석하였다.
도 47a 내지 47c는 CT26 종양 모델에서 항-mPVRIg 및 항-PDL-1 항체의 항종양 반응을 나타낸다. A-B. 10마리 BALB/c 마우스의 실험군은 5 Х 105개 CT26 세포로 피하 주사되었다. 4일째에 종양을 측정한 후 마우스를 무작위 추출 (실험군 당 평균 40 mm3의 종양 부피)한 다음 지정된 단일클론 항체 (100 또는 200 μg/용량 IP)로 처리한 후 7, 11, 14, 18 및 21일에 추가 용량을 투여하였다. A. 실험군을 6회 용량의 단일 제제로 처리하였다. 항-PDL-1 대 대조군 *** p <0.0001. 종양 부피는 평균 부피+ SEM으로 나타낸다. B. 종양 부피는 주 2회 측정되었다. 실험군 당 무-종양 (TF) 마우스의 수를 표시한다. C. 지정된 실험군의 생존율; 항-PDL-1 대 대조군 ** p = 0.005.
도 48a 내지 48c는 CT26 종양 모델에서 항-PVRIG 및 항-PDL-1 항체 조합의 항종양 반응을 나타낸다. A-B. 10마리 BALB/c 마우스의 실험군은 5 Х 105개 CT26 세포로 피하 주사되었다. 7일째에 종양을 측정한 후 마우스를 무작위 추출 (실험군 당 평균 75 mm3의 종양 부피)한 다음 지정된 단일클론 항체 (300 μg/용량 IP)로 처리한 후 11, 14, 18, 21 및 25일에 추가 용량을 투여하였다. A. 실험군을 6회 용량의 조합된 제제로 처리하였다. 항-PDL-1 + 단일클론 항체 407 대 대조군 p = 0.0005; 항-PDL-1 및 단일클론 항체 406 대 대조군 p = 0.056. B. 종양 부피는 주 3회 측정되었다. 실험군 당 무-종양 (TF) 마우스의 수를 표시한다. C. 지정된 실험군의 생존율; 항-PDL-1+ mAb 407 대 대조군 * p = 0.0088.
도 49a 내지 49d는 AB-407 (BOJ-5G4-F4)의 경우 가변 중쇄 (각각 A 및 B)의 아미노산 서열 및 핵산 서열, 및 가변 경쇄 (각각 C 및 D)의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 나타낸다.
도 50은 본 발명에서 특정 용도를 찾은 힌지 변이체를 갖는 인간 IgG1 (일부 유용한 아미노산 치환을 갖음), IgG2, IgG3, IgG4, IgG4의 불변 도메인 및 카파 및 람다 경쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 51은 인간 및 시노몰거스 머카크 (시노라고도 지칭됨) TIGIT ECD 및 인간 PVR ECD 단백질의 서열을 나타낸다.
도 52는 항-TIGIT fab에 대한 유동세포계측법 결합 개요를 나타낸다. 모든 고유한 ELISA 양성 fab를 유동세포계측법으로 분석하였다. 모체 Expi293 세포뿐만 아니라 인간 또는 시노 TIGIT를 과발현하는 Expi293 세포의 평균 형광 강도 (MFI)를 측정하였다. 표적-특이적 대 오프-표적 결합의 MFI 비율을 계산하였다. 선택한 클론에 대한 데이타를 나타낸다.
도 53a 및 53b는 항-TIGIT 항체의 서열을 나타낸다. 달리 언급하지 않는 한, 이 CDR은 서열 목록의 항체를 포함하는 IMGT 번호매김을 사용한다.
도 54는 실시예 12에 기술된 바와 같이 Expi293 인간 TIGIT를 과발현하는 세포에 대한 항-TIGIT mAb 결합의 FACS KD 결과를 나타낸다.
도 55는 Exp Expi293 시노 TIGIT를 과발현하는 세포에 대한 mAb 결합의 FACS KD 결과를 나타낸다.
도 56는 결과로 얻은 운동 속도 상수와 데이타가 결합 상수를 추정하기에 충분히 신뢰할 수 있는 평형 해리 상수를 보여주는 실시예 14로부터의 결과를 나타낸다.
도 57a 및 57b는 실시예 4에서 Expi293 인간 TIGIT를 과발현하는 세포에 결합하는 인간 PVR-Fc 변이체의 결과를 나타낸다. A (왼쪽): Expi293 인간 TIGT를 과발현하는 세포로 적정된 인간 PVR-m2aFc 구조물에 대해 생성된 결합 곡선. KD 및 95% 신뢰 구간을 나타낸다. B (오른쪽) : Expi293 인간 TIGT를 과발현하는 세포로 적정된 인간 PVR-h1Fc 구조물에 대해 생성된 결합 곡선. KD 및 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 58은 Expi293 세포에서 과발현된 인간 TIGIT에 인간 PVR-m2aFc 결합을 억제하는 파아지 항체의 표를 나타낸다. 기지의 차단 (BM26) 벤치마크 항체 및 인간 IgG4 이소형 대조군 (Synagis) 항체에 대한 mAb를 테스트하였다. "예"는 단일클론 항체가 BM26과 유사한 hPVR을 억제하였던 점을 나타낸다.
도 59는 Exp Expi293 세포에서 과발현된 사람 TIGIT에 대한 인간 PVR-h1Fc의 결합을 억제하는 항-TIGIT 하이브리도마 항체의 IC50 값의 표를 나타낸다. 수치는 두 개의 독립적인 실험 중 하나를 예시한다. 독립적으로 수행된 두 실험에 대한 IC50 결과는 단지 1.2 내지 2배 차이의 범위를 나타냈다.
도 60는 파지-유래 및 BM TIGIT 항-인간 TIGIT 항체, CPA.9.027, CPA.9.049, CPA.9.059, BM26 및 BM29은 IL-2 신호전달을 증가시키는 실시예 6의 결과를 나타낸다. BM26 및 BM29는 둘 다 인간 IgG4 (S241P 변이체의 hIgG4) 이소형이다. 대표적인 데이타 (n=2)는 Jurkat IL-2-RE 루시퍼라제 인간 TIGIT-세포 및 aAPC CHO-K1 인간 PVR 세포의 6시간 공동-배양으로부터의 루시퍼라제 신호의 RLU (평균 +/- 표준 편차)를 나타낸다. 각 항체의 농도는 10 μg/ml이었다.
도 61는 파지-유래 및 BM IgG4 항-인간 TIGIT 항체, CPA.9.027, CPA.9.049, CPA.9.059, BM26 및 BM29가 IL-2 신호전달을 용량-의존적 방식으로 증가시키는 실시예 6의 추가적인 결과를 나타낸다. BM26 및 BM29는 둘 다 hIgG4 이소형이다. 대표적인 데이타 (n=2)는 Jurkat IL-2-RE 루시퍼라제 인간 TIGIT-세포 및 aAPC CHO-K1 인간 PVR 세포의 6시간 공동-배양으로부터의 루시퍼라제 신호의 RLU (평균 +/- 표준 편차)를 나타낸다. 20 μg/ml에서 시작하는 2배 일련 희석의 10개 지점이 각 항체에 사용되었다.
도 62는 하이브리도마-유래 및 BM 항-인간 TIGIT 항체, CHA.9.536, CHA.9.541, CHA.9.546, CHA.9.547, CHA.9.560, BM26 및 BM29가 IL-2 신호전달을 증가시키는 실시예 6의 결과를 나타낸다. BM26 및 BM29는 둘 다 mIgG1 이소형이다. 비-차단 항-인간 TIGIT 항체인 CHA.9.543은 IL-2 신호전달을 증진시키지 않는다. 대표적인 데이타 (n=2)는 Jurkat IL-2-RE 루시퍼라제 인간 TIGIT-세포 및 aAPC CHO-K1 인간 PVR 세포의 6시간 공동-배양으로부터의 루시퍼라제 신호의 RLU (평균 +/- 표준 편차)를 나타낸다. 각 항체의 농도는 10 μg/ml이었다.
도 63은 하이브리도마-유래 및 벤치마크 mIgG1 항-인간 TIGIT 항체인 CHA.9.536, CHA.9.541, CHA.9.546, CHA.9.547, CHA.9.560 및 BM26이 IL-2 신호전달을 용량-의존적 방식으로 증가시키는 실시예 6의 결과를 나타낸다 . BM26은 mIgG1 이소형이다. 대표적인 데이타 (n=2)는 Jurkat IL-2-RE 루시퍼라제 인간 TIGIT-세포 및 aAPC CHO-K1 인간 PVR 세포의 6시간 공동-배양으로부터의 루시퍼라제 신호의 RLU (평균 +/- 표준 편차)를 나타낸다. 20 μg/ml에서 시작하는 2배 일련 희석의 10개 지점이 각 항체에 사용되었다.
도 64는 파지, 하이브리도마 및 BM 항-인간 TIGIT 항체, CPA.9.027, CPA.9.049, CPA.9.059, CHA.9.536, CHA.9.541, CHA.9.546, CHA.9.547, CHA.9.560, BM26 및 BM29가 항원-특이적 INFg 신호전달을 증가시키는 것을 나타낸다. BM29는 단지 hIgG4 이소형으로서 테스트되는 반면, BM26은 hIgG4 및 mIgG1 이소형 모두로서 테스트된다. 대표적인 데이타 (n=2)는 CMV-특이적 CD8+ T 세포를 Mel624 인간 PVR 세포와 24시간 공동-배양한 후 배양 상청액에서 IFNγ (평균 +/- 표준 편차)의 양을 나타낸다. 각 항체의 농도는 10 g/ml이었다. 검정에 사용된 Mel624 인간 PVR은 0.0033 μg/ml 또는 0.001 μg/ml 펩타이드로 펄스처리되었다.
도 65는 파지, 하이브리도마 및 BM 항-인간 TIGIT 항체, CPA.9.027, CPA.9.049, CPA.9.059, CHA.9.536, CHA.9.541, CHA.9.546, CHA.9.547 및 CHA.9.560뿐만 아니라 BM26은 항원-특이적 IFNγ 신호전달을 단독으로 (열린 막대) 또는 항-PVRIG 항체 CHA.7.518.1.H4 (S241P) (빗금 막대)와 함께 증가시키는 것을 나타낸다. BM26은 mIgG1 이소형이다. 이소형 항체 대조군 처리의 경우, 열린 막대는 이소형 항체 단독을 말하고, 빗금 막대는 CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 조합한 이소형 항체를 말한다. 대표적인 데이타 (n=2)는 CMV-특이적 CD8+ T 세포를 인간 PVR 및 인간 PVRL2를 과발현하는 Mel624 세포와 24시간 공동-배양한 후 배양 상청액에서 IFNγ (평균 +/- 표준 편차)의 양을 나타낸다. 각 항체의 농도는 10 μg/ml이었다. 검정에 사용된 Mel624 인간 PVR/인간 PVRL2 세포는 0.0033 μg/ml 또는 0.001 μg/ml 펩타이드로 펄스처리되었다.
도 66는 항-인간 항체 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 항-인간 TIGIT 항체와 CHA.7.518.1.H4(S241P)의 조합으로 각각의 이소형 대조군 항체를 넘는 IFNg 분비의 증가 백분율을 나타낸다.
도 67는 실시예 7의 에피토프 비닝 실험의 덴드로그램을 나타낸다.
도 66은 실시예 7의 에피토프 비닝 실험으로부터의 항체의 그룹화를 나타낸다.
도 69는 실시예 3의 실험에서 기술된 바와 같이 인간 TIGIT를 과발현하는 Expi293 세포 상에 친화성 성숙 파지 항체 (CPA.9.083, CPA.9.086), 인간화 하이브리도마 항체 (CHA.9.547.7, CHA.9.547.13), 벤치마크 항체 (BM26, BM29) 및 hIgG4 이소형 대조군 (항-Synagis)의 용량 적정에서 인간 TIGIT를 과발현하는 세포와 높은 친화성 결합을 나타낸다. 모든 항체를 10 μg/ml (133.33 nM [결합 부위])에서 시작하여 11개 지점에 걸쳐 일련 2배 희석을 사용하여 적정하였다. AF647-표지된 염소 항-인간 F(ab') (Jackson Immunoresearch)를 세포에 첨가하여 항-TIGIT 항체의 결합을 검출하였다. 인간 TIGIT를 과발현하는 Expi293 세포 (검정색 선) 및 모체 Expi293 세포 (회색 선)에 결합된 항-TIGIT 항체의 gMFI를 나타낸다. KD값은 +/- 95% CI이고, 곡선 적합은 각 그래프 아래에 표시된다.
도 70은 실시예 3의 실험에서 기술된 바와 같이 시노 TIGIT를 과발현하는 Expi293 세포 상에 친화성 성숙 파지 항체 (CPA.9.083, CPA.9.086), 인간화 하이브리도마 항체 (CHA.9.547.7, CHA.9.547.13), 벤치마크 항체 (BM26, BM29) 및 hIgG4 이소형 대조군 (항-Synagis)의 용량 적정에서 항-TIGIT 항체가 시노 TIGIT에 교차 반응하는 것을 나타낸다. 모든 항체를 10 μg/ml (133.33 nM [결합 부위])에서 시작하여 11개 지점에 걸쳐 일련 2배 희석을 사용하여 적정하였다. AF647-표지된 염소 항-인간 F(ab') (Jackson Immunoresearch)를 세포에 첨가하여 항-TIGIT 항체의 결합을 검출하였다. 시노 TIGIT를 과발현하는 Expi293 세포 (검정색 선) 및 모체 Expi293 세포 (회색 선)에 결합된 항-TIGIT 항체의 gMFI를 나타낸다. KD값은 +/- 95% CI이고, 곡선 적합은 각 그래프 아래에 표시된다.
도 71는 실시예 3의 실험에서 기술된 바와 같이 마우스 IgG1 (mIgG1) (CPA.9.083, CPA.9.086), 벤치마크 항-마우스 TIGIT 항체 (BM27 mIgG1, BM30 mIgG1) 및 mIgG1 이소형 대조군 (항-Synagis)로 재구성된 친화성 성숙 파지 항체의 용량 적정에서 친화성 성숙 파지 항체가 마우스 TIGIT에 교차 반응하는 것을 나타낸다. A) 마우스 TIGIT를 과발현하는 HEK 세포 (검정색 선) 및 모체 HEK 세포 (회색 선)에 결합된 항-TIGIT 항체의 gMFI. B) Balb/c 마우스의 s.c. 이식된 Renca 종양으로부터의 조절성 CD4+ CD25+ Foxp3+ T-세포에 결합된 항-TIGIT 항체 (검정색 선) 또는 Synagis mIgG1 (회색 선)의 gMFI. 항-TIGIT 항체를 각각 15 μg/ml (200 nM [결합 부위]) 또는 10 μg/ml (132 nM [결합 부위])에서 시작하는 일련의 2- 또는 3배 희석을 사용하여 적정하였다. AF647-표지된 염소 항-마우스 IgG-Fc (Southern Biotech)를 세포에 첨가하여 마우스 TIGIT를 과발현하는 세포에서 항-TIGIT 항체의 결합을 검출하였다. 항-TIGIT 항체를 마우스 Treg 결합을 위해 AF647에 직접 컨쥬게이션시켰다. 각 항-TIGIT 항체에 대한 KD 값이 표시되어 있다.
도 72는 실시예 3의 실험에서 기술된 바와 같이, 3명의 건강한 공여자 PBMC (공여자 321, 322 및 334)로부터의 인간 효과기 기억 CD95+ CD28- CD8+ CD3+ T 세포 상에 친화성 성숙 파지 항체 (CPA.9.083, CPA.9.086), 인간화 하이브리도마 항체 (CHA.9.547.7, CHA.9.547.13) 및 벤치마크 항체 (BM26, BM29)의 용량 적정을 나타낸다. PBMC는 계열 마커 CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD28, CD56 및 CD95 (BD Biosciences, BioLegend)뿐만 아니라 생/사 고정가능한 아쿠아 염료 (Life Technologies)에 대한 항체로 표면 염색되었다. AF647-표지된 항-TIGIT 항체 및 hIgG4 이소형 대조군 항체 (항-Synagis)는 다음으로 30 μg/ML (396 nM [결합 부위])에서 시작하여 12개 지점에 걸쳐 일련 3배 희석을 사용하여 적정되었다. 효과기 기억 T 세포에 결합된 항-TIGIT 항체의 gMFI를 나타낸다. 3명의 상이한 공여자에 대한 각 항체의 KD 값이 표에 보고되어 있다. 친화성 성숙 파지 항체 (CPA.9.083 및 CPA.9.086)는 인간 효과기 기억 T-세포에 대해 가장 높은 결합 친화성을 가졌다.
도 73은 실시예 3의 실험에서 기술된 바와 같이, 3마리의 순수 시노 원숭이로부터 분리된 PBMC (BioreclamationIVT)로부터의 시노 효과기 기억 CD95+CD28-CD8+ CD3+ T 세포 상에 친화성 성숙 파지 항체 (CPA.9.083, CPA.9.086, CPA.9.103), 인간화 하이브리도마 항체 (CHA.9.547.1) 및 벤치마크 항체 (BM26)의 용량 적정을 나타낸다. PBMC는 계열 마커 CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD28, CD56 및 CD95 (BD Biosciences, BioLegend)뿐만 아니라 생/사 고정가능한 아쿠아 염료 (Life Technologies)에 대한 항체로 표면 염색되었다. AF647-표지된 항-TIGIT 항체 및 hIgG4 이소형 대조군 항체 (항-Synagis)는 다음으로 30 μg/ML (396 nM [결합 부위])에서 시작하여 12개 지점에 걸쳐 일련 3배 희석을 사용하여 적정되었다. 효과기 기억 T 세포에 결합된 항-TIGIT 항체의 gMFI는 항-Synagis hIgG4 이소형 대조군 항체의 차감된 gMFI로 표시된다. 2명의 공여자에 대한 각 항체의 KD 값이 표에 보고되어 있다. 친화성 성숙 파지 항체 (CPA.9.083 및 CPA.9.086)는 시노 효과기 기억 T-세포에 대해 가장 높은 결합 친화성을 가졌다.
도 74는 실시예 5의 실험에서 기술된 바와 같이, 인간, 시노 및 마우스 TIGIT에 결합하는 항-TIGIT 항체의 SPR 동력학을 나타낸다. 친화성 성숙 파지 항체 (CPA.9.083, CPA.9.086, CPA.9.103), 인간화 하이브리도마 항체 (CHA.9.547.1 및 CHA.9.547.7) 및 벤치마크 항체 (BM26, BM29)의 운동 속도 및 평형 해리 상수는 ProteOn 기기 상의 SPR에 의해 결정되었다.
도 75는 실시예 4의 실험에서 기술된 바와 같이, 항-TIGIT 항체가 PVR/TIGIT 상호작용을 차단하는 것을 나타낸다. 인간 TIGIT를 과발현하는 Expi293 세포를 친화성 성숙 파지 항체 (CPA.9.083, CPA.9.086), 인간화 하이브리도마 항체 (CHA.9.547.7, CHA.9.547.13), 벤치마크 항체 (BM26, BM29) 또는 hIgG4 이소형 대조군 (항-Synagis)과 미리 배양하였다. 모든 항체를 10 μg/ml (133.33 nM [결합 부위])에서 시작하여 11개 지점에 걸쳐 일련 2.5배 희석을 사용하여 적정하였다. 항체 사전배양 후, 인간 PVR-m2aFc를 158 nM [결합 부위] 또는 EC90으로 세포에 첨가하였다. 이어서 AF647-표지된 염소 항-마우스 IgG-Fc (Southern Biotech)를 세포에 첨가하여 항-TIGIT 항체의 결합을 검출하였다. 인간 TIGIT를 과발현하는 Expi293 세포에 대한 PVR-m2aFc 결합의 억제 백분율을 각각의 항체에서 관찰하였다. 각각의 항-인간 TIGIT 항체에 대한 IC50 값이 표 (n = 2 실험)에 보고되어 있다.
도 76는 친화성 성숙 파지 항체 (CPA.9.083, CPA.9.086), 인간화 하이브리도마 항체 (CHA.9.547.7, CHA.9.547.13) 및 벤치 마크 항체 (BM26)가 용량-의존적 방식으로 IL-2 신호전달을 증가시키는 실시예 6의 결과를 나타낸다. Synagis hIgG4는 이소형 대조군 항체이다. 대표적인 데이타 (n=2)는 Jurkat IL-2-RE 루시퍼라제 인간 TIGIT-세포 및 CHO-K1 인간 PVR 세포의 6시간 공동-배양으로부터의 루시퍼라제 신호의 RLU (평균 +/- 표준 편차)를 나타낸다. 20 μg/ml에서 시작하는 1.5배 일련 희석의 19개 지점이 각 항체에 사용되었다.
도 77는 항-TIGIT 항체가 CMV 특이적 CD8+ T 세포에서 IFNγ를 유도하는 것을 나타낸다. 실시예 6의 실험에서 기술된 바와 같이, 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포와의 시험관내 공동-배양 검정을 이용하여 항원-특이적 사이토카인 분비에 미치는 친화성 성숙 파지 항체 (CPA.9.083, CPA.9.086), 인간화 하이브리도마 항체 (CHA.9.547.7, CHA.9.547.13) 및 벤치마크 항체 (BM26, BM29)의 효과를 평가하였다. 검정에 사용된 표적 세포주는 인간 PVR 및 PVRL2를 내인성으로 발현하는 HLA-A2+ 췌장 샘암종 세포 Panc.05.04이었다. Panc.05.04 세포를 0.03 μg/ml 또는 0.01 μg/ml의 CMV pp65 펩타이드로 37℃에서 1시간 동안 펄스 처리하였다. 이어서 세포를 세척하고 96-웰 둥근-바닥 조직 배양 처리된 플레이트에 50,000개 세포/웰로 도말 하였다. 항-인간 TIGIT 항체 또는 이소형 대조군 hIgG4 항체 (항-Synagis)를 0.1 μg/ml의 농도로 첨가하였다. 단일 공여자로부터의 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포를 상기 프로토콜에 따라 증식시켰다. 50,000개의 인간 CD8+ T 세포를 각 웰에 첨가하였다. 공동-배양물을 37℃에서 5% CO2로 24시간 동안 배양하였다. 공동-배양 상청액에서 인간 인터페론 감마 (IFNγ)의 양은 세포계측 비드 검정 (BD Biosciences)을 사용한 유동 세포계측법으로 측정하였다. hIgG4 이소형 대비 각 항체의 IFNγ 분비의 증가 백분율은 표 (n = 2 실험)에 요약되어 있다.
도 78는 PVRIG 항체인 CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 조합될 때 항-TIGIT 항체가 IFNγ를 증강시키는 것을 나타낸다. 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포와의 시험관내 공동-배양 검정을 이용하여 항-PVRIG 항체인 CHA.7.518.1와 조합으로 항원-특이적 사이토카인 분비에 미치는 친화성 성숙 파지 항체 (CPA.9.083, CPA.9.086), 인간화 하이브리도마 항체 (CHA.9.547.7, CHA.9.547.13) 및 벤치마크 항체 (BM26, BM29)의 효과를 평가하였다. 검정에 사용된 표적 세포주는 인간 PVR 및 PVRL2를 내인성으로 발현하는 HLA-A2+ 췌장 샘암종 세포 Panc.05.04이었다. Panc.05.04 세포를 0.03 μg/ml 또는 0.01 μg/ml의 CMV pp65 펩타이드로 37℃에서 1시간 동안 펄스 처리하였다. 이어서 세포를 세척하고 96-웰 둥근-바닥 조직 배양 처리된 플레이트에 50,000개 세포/웰로 도말 하였다. 항-인간 TIGIT 항체 또는 이소형 대조군 hIgG4 항체 (항-Synagis)를 0.1 μg/ml의 농도로 CHA.7.518.1 (빗금 막대) 또는 대조군 hIgG4 이소형 항체 (진한 막대)와 10 μg/ml로 조합하여 첨가하였다. 단일 공여자로부터의 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포를 상기 프로토콜에 따라 증식시켰다. 50,000개의 인간 CD8+ T 세포를 각 웰에 첨가하였다. 공동-배양물을 37℃에서 5% CO2로 24시간 동안 배양하였다. 공동-배양 상청액에서 인간 IFNγ의 양은 세포계측 비드 검정 (BD Biosciences)을 사용한 유동 세포계측법으로 측정하였다. hIgG4 이소형 대비 각 항체의 IFNγ 분비의 증가 백분율은 표 (n = 2 실험)에 요약되어 있다.
도 79는 해리된 종양으로부터의 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 PVRIG 및 TIGIT 발현의 상관 분석을 나타낸다. 각 종양 시료에 대해 평균 형광 강도 비율 (MFIr)을 계산하고, 스페어만의 상관 분석을 수행하여 r2 및 p 값을 보고하였다.
도 80는 항-마우스 PVRIG 항체로 처리된 TIGIT KO 마우스에서 종양 성장 억제 및 생존의 결과를 나타낸다. 7 내지10마리의 TIGIT KO와 C57BL/6 마우스 WT 실험군은 1 Х 105개 B16/DB-hmgp100 세포로 피하 주사되었다. 마우스를 지정된 항체로 접종한 날 (0일째)에 시작하여 3주 동안 매주 2회 처리하였다. A) 평균 종양 부피 +/- 평균 표준 편차 (SEM)가 상부 그래프에 나타나 있으며, ***은 mIgG1 이소형 대조군 항체로 처리된 C57BL/6 WT과 비교하여 항-마우스 PVRIG 항체 (클론 407)로 처리한 TIGIT KO의 p값 <0.001을 표시한다. 각 항체 처리 실험군 내의 개별 마우스에 대한 종양 부피는 하부 그래프에서 스파이더 플롯로 나타낸다. B) mIgG1 이소형 대조군으로 처리한 대조군 C57BL/6 WT 마우스와 비교하여 표시된 날에 측정된 TGI를 표에 요약한다. C) B16/Db-hmgp100 세포의 주사 후 마우스 생존.
도 81a 내지 81c는 Mel-624, Colo205 및 Panc.05.04 세포에서 대조군과 비교하여 표시된 항체와 조합 처리를 나타낸다. gp100 또는 CMVpp65 특이적 T 세포를 Mel-624, Colo205 및 Panc.05.04 세포, gp100 또는 CMVpp65 펩타이드 및 10 mg/ml에서 표시된 항체와 함께 공동-배양하였다. 조건부 배지에서의 IFN-γ 농도는 24시간에 측정되었다. 세 벌의 평균+ 표준 편차를 나타낸다. hIgG4과 비교하여 각 조건에 대한 IFN-γ의 변화%를 나타낸다.
도 82a 내지 82c는 CD8 T 세포 상의 PD-1/TIGIT/PVRIG 발현 및 Colo205, Panc.05.04 세포 상의 PD-L1, PVR, PVRL2의 발현을 나타낸다. A) pp65 펩타이드로 IL-2 및 IL-7과 함께 10일 동안 증식시킨 CMVpp65 반응성 T-세포에 대한 PVRIG, TIGIT 및 PD-1의 발현. CMVpp65 반응성 T-세포 상의 PVRIG, TIGIT 및 PD-1의 발현을 나타낸다. B) Colo205 및 Panc.05.04 세포 상의 PD-L1, PVR 및 PVRL2의 발현을 나타낸다. C) CMVpp65 특이적 T-세포를 Colo205 및 Panc.05.04 세포, CMVpp65 펩타이드 및 10 mg/ml에서 표시된 항체와 함께 공동-배양하였다. 조건부 배지에서의 IFN-γ 농도는 24시간에 측정되었다. 세 벌의 평균+ 표준 편차를 나타낸다. hIgG4과 비교하여 각 조건에 대한 IFN-γ의 변화%를 나타낸다.
도 83. PVRIG는 인간 암으로부터의 세포독성 림프구 하위집합에 가장 높게 발현된다. A) 5 내지 8명의 건강한 공여자 PBMC로부터의 백혈구 세포 하위집합에 대한 PVRIG의 발현을 나타낸다. PVRIG 발현은 이소형 대조군 MFI와 비교하여 PVRIG MFI의 비율로서 정의된다. B) 5명의 건강한 공여자 PBMC로부터의 CD8 T 세포 하위집합과 비교하여 말초혈액 Tregs에 대한 PVRIG, TIGIT, CD96 및 PD-1의 발현을 나타낸다. C) 3명의 건강한 공여자로부터의 CMV pp65 특이적 T 세포를 pp65 (495-503) 펩타이드, IL-2 및 IL-7로 시험관내에서 7일 동안 증식시켰다. HLA-A2/pp65 (495-503) 사량체 양성 세포 상의 TIGIT (청색) 및 PVRIG (검정색)의 발현을 나타낸다. D) 인간 T 세포를 활성화 후 0, 1, 2 및 7일째 CD4+ T 세포 상에 나타난 동종이형성 DC 및 TIGIT 및 PVRIG의 발현과 함께 배양하였다. E) 대표적인 폐암 및 신장암으로부터의 TIL (CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 NK 세포)에서 이소형 대조군 (적색)과 비교하여 PVRIG (청색)의 발현을 나타내는 대표적인 FACS 플롯. F) 폐암 시료로부터의 CD4 및 CD8 TIL에서 PVRIG, TIGIT 및 PD-1의 공동-발현을 나타낸다. G) 다양한 암 유형의 해리된 인간 종양으로부터의 CD8+ 및 CD4+ TIL에서 PVRIG의 발현을 나타낸다. 각 점은 개별 환자로부터의 구별된 종양을 나타낸다. H) 자궁내막, 신장 및 폐 종양으로부터의 PVRIG, TIGIT 및 PD-1에 대한 CD8 TIL 대 Treg TIL의 상대 발현을 평가하였다. 각 종양의 경우, CD8 TIL 상의 발현 배수를 Treg TIL 상의 발현 배수로 정상화하고 좌표화하였다. A, B, C, G 및 H의 경우 평균+ SEM은 오차 막대로 나타낸다.
도 84. PVRL2 발현은 종양 미세환경에서 증진된다. A) PVRL2 발현은 폐암, 난소/자궁내막, 유방, 결장, 신장 및 흑색종 종양에서 IHC에 의해 평가 하였다. 막대는 평균+ SEM을 나타낸다. 각각의 종양에 대해 병리학자에 의해 2개의 코어를 평가하고, 보충적인 방법에서 기술된 바와 같이 유병율 및 종양 세포 상의 막성 염색의 강도에 기초하여 점수를 매겼다. 각 종양에 대해 2개 코어의 평균 점수를 나타낸다. B) 간질에서 종양 세포 (화살표) 및 면역 세포 (*) 상의 PVRL2 발현을 나타내는 대표적인 흑색종 종양을 나타낸다. C) CD45-, CD14+ TAM 및 Lin-CD14-CD33hi mDC 세포 하위집합에 대한 FACS에 의해 결정된 해리된 종양으로부터의 로그2 규모의 PVRL2 발현을 나타낸다. 평균+ SEM은 각 암 유형별로 나타낸다. 점선은 염색이 관찰되지 않음을 나타낸다. 각 세포 유형에 대해 적어도 100개의 사건을 분석하도록 요구되었다. D) IgG (적색)와 비교하여 PVRL2 발현 (청색)에 대한 대표적인 FACS 플롯이 폐암에 대해 표시된다. E) 본 발명자가 PVRIG 및 PVRL2 발현 둘 다를 평가할 수 있는 종양 시료의 경우, CD8+ T 세포 상의 PVRIG 발현을 각 종양 시료의 CD14+ TAMS 및 CD45- 세포 상의 PVRL2 발현 대비 좌표화하였다. 각 점은 개별 종양 시료를 나타낸다. 적색 선은 IgG와 비교하여 PVRIG 또는 PVRL2의 2배 발현을 나타낸다. 도 84F의 표는 다양한 종양 시료에서 PVRL2의 유병율을 나타낸다.
도 85. 종양 세포에서 PVRL2 및 PD-L1의 구별된 조절. A) PD-L1 및 PVRL2의 발현을 일련의 섹션 상의 IHC에 의해 평가하였다. 도 84a의 종양 시료을 조직 유형에 기초하여 그룹화하고, PD-L1 음성 및 PD-L1 양성에서 PVRL2의 발현을 나타낸다. PD-L1 음성 종양은 주어진 종양의 두 개 코아 중 하나로부터의 종양 또는 면역 세포 상의 막 염색 없음으로서 정의되었다. PD-L1 양성 염색은 종양의 적어도 1개 코어 상의 막 염색으로서 정의되었다. 막대는 각 실험군의 평균 + SEM을 나타낸다. B, C) PVRL2+ PD-L1- 자궁내막 (B) 종양 및 PVRL2+ PD-L1- 폐 (C) 종양의 대표적인 발현. D) 배양 2일째에 미성숙 BM-DC를 지시된 자극 및 FACS에 의해 평가된 PVR, PVRL2 및 PD-L1 발현과 함께 배양하였다. 각각의 조건에 대해, 발현은 배지 단독 대조군 조건으로 정상화하였다. E) IFN- 또는 배지 단독으로 처리된 HT-29 세포 상의 PVR, PVRL2 및 PD-L1의 발현을 나타낸다. PD-L1 또는 PVRL2는 청색으로 나타내고, IgG 이소형 대조군 염색은 적색으로 나타낸다.
도 86. CHA.7.518.1.H4 (S241P)는 T 세포 활성화를 증진시키는 고친화성 항체이다. A) HEK293 PVRIG 또는 HEK293 모체 세포에 대한 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 또는 IgG 이소형 대조군의 결합을 FACS에 의해 나타낸다. FACS KD 값은 HEK293 hPVRIG, HEK293 cPVRIG 및 Jurkat 세포에 대한 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 결합에 대해 나타낸다. B) CHA.7.518.1.H4 (S241P)는 PVRIG를 이소적으로 발현하는 HEK293 세포에 대한 PVRL2 Fc의 결합을 교란시킨다. 평균+ 표준 편차의 세 벌의 수치를 나타낸다. C) CHA.7.518.1.H4 (S241P)는 내인성으로 PVRL2를 발현하는 HEK293 세포에 대한 PVRIG Fc의 결합을 차단한다. D) 인간 CD4 T 세포를 10 μg/ml 항-PVRIG 항체 및 인간 IgG 이소형 대조군 항체의 존재 시 세포 표면 결합된 항-CD3 항체 및 hPVRL2를 발현하는 aAPC CHO 세포와 함께 공동-배양하였다. 11명의 상이한 공여자로부터 분리된 CD4 T 세포의 증식에 미치는 PVRIG Ab의 효과를 나타낸다. 막대는 평균+ SEM을 나타낸다. E) gp100 특이적 T 세포주 (TIL-209, TIL-463)를 HLA-A2 및 PVRL2를 발현하도록 조작된 CHO 세포 및 10 μg/ml 항-PVRIG 또는 IgG 이소형 대조군 항체와 함께 공동-배양하였다. IFN-γ 및 TNF-α 생산은 공동-배양 24시간 후 테스트되었다. 평균+ 표준 편차의 세 벌의 수치를 나타낸다. 이소형 조절과 비교하여 각 조건에 대한 IFN-γ 및 TNF-α의 변화 백분율은 각 막대 위의 숫자로 표시된다. F) MEL624, Colo205 및 Panc.05.04 세포에서 IgG (청색)괴 비교하여 PVR, PVRL2 및 PD-L1 (적색)의 발현을 나타낸다. T 세포의 경우, TIL-209 및 TIL-463 gp100 특이적 T-세포 및 CMVpp65 특이적 T 세포에서 IgG (청색)과 비교하여 PVRIG, TIGIT 및 PD-1 (적색)의 발현을 나타낸다. CMVpp65 반응성 T-세포를 증식시키기 위하여, PBMC를 pp65 (495-503) 펩타이드, IL-2 및 IL-7과 함께 10일 동안 배양하였다. PVRIG, TIGIT, PD-1의 발현은 HLA-A2/pp65 사량체 양성 세포 상에 나타난다. G) 흑색종 종양으로부터 유래한 TIL로부터 증식된 gp100 특이적 T 세포 (TIL-209, TIL-463)를 10 μg/ml의 지시된 항체의 존재 시 MEL624 세포와 공동-배양하였다. 조건부 배지에서의 IFN-γ 농도는 24시간에 결정되었다. H, I) 증식된 CMVpp65 특이적 T 세포를 Colo205 및 Panc.05.04 세포, CMVpp65 펩타이드 및 10 μg/ml에서 지시된 항체와 함께 공동-배양하였다. 조건부 배지에서의 IFN-γ 농도는 24시간에 결정되었다. E, G, H, I의 경우 세 벌의 평균+ 표준 편차를 나타낸다. 이소형 조절과 비교하여 각 조건에 대한 IFN-γ의 변화 백분율은 각 막대 위의 숫자로 표시된다.
도 87. PVRIG 결핍 마우스는 T-세포 기능을 증가시켰다. A) 정제된 마우스 면역 세포 하위집합으로부터 qRT-PCR에 의해 측정된 PVRIG의 RNA 발현이 평가되었다. 하우스키핑에 대한 상대적 발현은 Ct 방법으로 결정되었다. B) pmel CD8+ TCR 유전자전환 T-세포를 gp100 (25-33)으로 활성화시키고, PVRIG 및 TIGIT RNA 전 사체 수준을 qRT-PCR에 의해 지시된 시간대에서 평가하였다. 그래프는 5가지 상이한 실험의 결과로부터의 평균 + SEM을 나타낸다. C) 비장은 PVRIG-/- 및 WT 한배동물로부터 수확하였고, NK, CD4+ 및 CD8+ T-세포 ("휴지 세포") 상의 PVRIG의 발현을 유동 세포계측법으로 분석하였다. 또한, CD3+ T-세포를 비장 세포로부터 분리하고 항-CD3/항-CD28 비드로 11일 동안 활성화시켰다. 활성화 후 CD4+ 및 CD8+ T-세포 ("활성화된" 세포) 상의 PVRIG 발현을 유동 세포계측법으로 분석하였다. 각 점은 개별 마우스로부터 유래한 세포를 나타낸다. D) WT 및 PVRIG-/- 유래 비장 세포를 세포 증식 염료 eFluor450로 표지하고 대조군-Fc (마우스 IgG2a) 또는 마우스 PVRL2 Fc의 존재 시 배양하였다. 배양 4일 후, 세포 분열을 유동 세포계측법으로 분석하였다. 실험 (왼쪽) 및 PVRL2 Fc 3가지 독립적인 실험 (오른쪽)에 의한 억제 백분율의 개요 (PVRL2 Fc 증식%로부터 차감된 대조군-Fc 증식%로서 정의됨)로부터 대표적인 FACS 플롯이 제시된다. *는 WT 대 PVRIG-/- T-세포에서 단백질 대조군의 존재 시 증식과 비교하여 PVRL2-FC의 존재 시 증식의 변화에 대한 p값 < 0.05, 쌍 이룬 스튜던트 t-테스트를 표시한다. E) PVRIG-/- 또는 pmel PVRIG WT 마우스로부터 유래한 pmel CD8+ T-세포를 그들의 동족 펩타이드 및 IL2로 11일 동안 활성화시켰다. 이어서 활성화된 pmel CD8+ 세포를 B16-Db/gp100 세포와 함께 18시간 동안 공동-배양하고, 공동-배양 후 CD107 발현 및 사이토카인 생산을 평가하였다. 네 개의 독립적인 실험이 각각의 쌍을 이룬 점으로 표시된 바와 같이 제시된다. *는 PVRIG-/- 대 WT를 비교한 p-값 < 0.05, 스튜던트 t-테스트를 나타낸다.
도 88. PVRIG 결핍은 종양 성장을 감소시키고 CD8+ 효과기 T 세포 기작을 증가시킨다. A) C57BL/6 또는 WT PVRIG-/- 마우스는 피하로 5 × 105개 MC38 세포를 주입하였다. 종양 부피가 주 2회 측정되었다. 실험군 당 n = 10 마우스, Ave+ SEM을 나타내고, *는 WT 마우스 대 PVRIG-/- 마우스에 대한 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-테스트로 p값 <0.05를 표시한다 (ANOVA). B) 개별 종양 성장 곡선이 표시된다. 실험군 당 n = 10 마우스, 하나의 대표적인 실험을 나타낸다 (n = 2). C) C57BL/6 WT 또는 PVRIG-/- 마우스는 5 × 105개 MC38 세포를 피하 주사하였다. 접종 후 14일째에, 마우스를 항-PD-L1로 2주 동안 주 2회 처리하였다. 종양 부피가 주 2회 측정되었다. 실험군 당 n = 10 마우스, 평균 + SEM을 나타낸다. 항-PD-L1으로 둘 다 처리된 WT 마우스 대 PVRIG-/- 마우스에 대한 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-테스트로 p-값 = 0.052. D) 개별 종양 성장 곡선을 나타낸다. 하나의 대표적인 실험을 나타낸다 (n = 2). E-H) 별도의 중복 실험에서, 마우스가 항-PD-L1 또는 적절한 이소형 대조군의 2회 용량을 투여 받은 후 18일째 종양을 수확하였다. 해리된 종양은 프레펠딘 A의 존재 시 PMA 및 이오노마이신으로 4시간 동안 자극하기 전에 CD45+ 세포에 대해 농축되었다. 그래프는 이소형 처리된 야생형 및 PVRIG-/- 마우스 (E) 및 항-PD-L1 처리된 야생형 및 PVRIG-/- 마우스 (F)로부터의 CD45+ 면역 세포, CD8+ T 세포 및 인터페론g-생성 CD+ 8T 세포의 종양 조직 mg 당 총 수를 도시한다. G-H) 이소형- 및 항-PD-L1 처리된 PVRIG-/- 마우스로부터의 종양-유출 림프절에서 CD8+ IFN- + TNF- + 효과기 세포의 빈도를 그들의 상응하는 야생형 집단과 비교하여 나타낸다. EH의 경우, 평균 + SEM이 표시되고 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-테스트로부터의 p 값을 나타낸다.
도 89. 길항적 항-PVRIG 항체는 PD-1 억제제 또는 TIGIT 유전자 결핍과 조합으로 성장한 종양을 상승적으로 억제한다. A) 항-mPVRIG 단일클론 항체 또는 IgG 이소형 대조군 Ab의 일련 희석액으로 미리 배양된 mPVRIG HEK293 조작된 세포에 mPVRL2 Fc 융합 단백질의 결합을 나타낸다. B) BALB/c 마우스가 5 × 105개 CT26 세포로 피하 주사되었다. 접종 후 14일째에, 마우스를 희생시키고 비장, 유출 림프절 및 종양을 수확하였다. 세포를 CD3+CD4+ T 세포, CD3+CD8+ T 세포, CD3-CD49b+ NK 세포, CD11b+ Gr-1+ 골수유래-억제인자 세포 (MDSC) 및 CD11b+F4/80+ 대식세포 상의 PVRIG의 발현에 대해 유동 세포계측법에 의해 분석되었다. C, D) BALB/c 마우스가 5 Х 105개 CT26 세포로 피하 주사되었다. 접종 후 7일째에, 마우스를 항-PD-L1 및/또는 항-PVRIG Ab로 3주 동안 주 2회 처리하였다 (화살표는 Ab 처리를 나타냄). C) 종양 부피를 나타낸다. ***은 PD-L1+ aPVRIG 처리된 군과 비교하여 aPD -L1+ 래트 IgG2b에 대한 p-값 <0.001 (ANOVA)을 표시한다. 화살표는 항체가 투여된 시기를 표시한다. D. 완전 반응자 마우스의 생존 분석. *는 PD-L1+ PVRIG 처리된 그룹과 비교하여 PD-L1+ 래트 IgG2b에 대한 p 값 <0.05 (로그-순위 테스트)를 표시한다. 3가지 연구에 대한 하나의 대표적인 연구를 나타낸다 E. C57BL/6 또는 TIGIT-/- 마우스는 1 × 105개 B16/DB-hmgp100 세포를 피하 주입하였다. 마우스를 접종 당일 (0일째)부터 시작하여 지정된 단일클론 항체로 3주 동안 주 2회 처리하였다. E. 종양 부피를 주 2회 측정하였고 평균+ SEM을 나타낸다. 대조군 WT + mIgG1 이소형 대조군과 비교하여 표시된 날에 측정한 종양 성장 억제. ***은 TIGIT-/- + aPVRIG의 p 값 <0.001을 WT + mIgG1 이소형 대조군과 비교하여 나타낸다. 화살표는 항체가 투여된 시기를 표시한다. F. 각 마우스의 개별 종양 성장 곡선을 나타낸다. 수행된 2개의 대표적인 실험 중 하나가 표시된다.
도 90. PVRIG는 인간 암에서 TIL의 T 및 NK 세포에서 발현된다. A) 건강한 공여자 PBMC로부터의 CD4 T 세포 하위집합에서 PVRIG, TIGIT, CD96 및 PD-1의 발현을 나타낸다. 평균+ SEM을 나타낸다. B) 인간 T-세포를 동종이형성 PBMC와 함께 공동-배양하였고 CD4 및 CD8 T 세포 상의 PVRIG 단백질의 발현을 나타낸다 (최상부). C) 종양을 해리시키고 단일 세포를 항-CD3 및 항-CD28로 활성화시켰다. IgG 이소형 대조군 (적색)과 비교하여 PVRIG (청색)의 발현을 0일 (직접적으로 생체외) 및 활성화 후 5일째에 평가하였다. D) 해리된 인간 종양으로부터의 NK 세포 상의 PVRIG의 발현을 나타낸다. 각 점은 개별 환자로부터의 구별된 종양을 나타낸다. 평균± 95% 신뢰 구간이 표시된다. D) 해리된 종양 세포를 5일 동안 항-CD3 및 항-CD28 비드로 활성화시켰다. IgG 이소형 대조군 (적색)과 비교하여 CD4 및 CD8 T 세포 상의 PVRIG (청색)의 발현을 0일 (직접적으로 생체외) 및 활성화 후 5일째에 2개 해리된 종양 시료에 대해 나타낸다. E) PVRIG의 발현은 해리된 종양 및 해리된 공여자-매칭된 정상 인접 조직으로부터의 CD4 및 CD8 T 세포에서 평가하였다. 각 라인은 개별 환자로부터 획득한 매칭된 조직을 나타낸다. 쌍을 이룬 스튜던트 t-테스트가 수행되었다. F) 종양으로부터의 CD4 및 CD8 T 세포에서 IgG 이소형 대조군과 비교하여 PVRIG, TIGIT 및 PD-1 발현 배수의 크기 상관 분석을 나타낸다. 각 점은 개별 종양 시료를 나타낸다. 스페어만 상관 계수와 p 값이 표시된다.
도 91. PVRL2의 발현은 결장암, 피부암 및 유방암에서 증진된다. A) 양성 세포, CHO-S 인간 PVRL2 (오른쪽)의 FFPE 섹션에 대한 시그마 항-인간 PVRL2 항체의 결합을 pH 9에서 항원 복구 후 음성 세포, CHO-S (왼쪽)와 비교하여 보여주는 현미경사진. B) 항-PVRL2 항체는 PVRL2+ (HT29, MCF7, PC3, PANC1, RT4, NCI-H1573) 및 PVRL2- (Jurkat, OPM2, Daudi, CA46) 세포주의 패널 상에서 테스트되었다. C-F) 폐 정상 및 암 조직에서 PVRL2의 발현 예. C) 염색을 보이지 않는 정상 조직. D) 부분적 양성 염색을 보이는 폐 샘암종. E) 양성 염색을 보이는 폐 샘암종. F) 강한 양성 염색을 보이는 폐 샘암종.
도 92. 인접 정상 조직과 비교하여 종양에서 TAM 및 CD45- 세포 상의 PVRL2은 상향 조절된다. 공여자 매칭된 종양 및 정상 인접한 조직으로부터의 CD45- 세포 및 TAM 상의 PVRL2 발현을 나타낸다. 쌍을 이룬 스튜던트 t-테스트 p 값이 표시된다.
도 93. PVRIG와 PVRL2는 동일한 종양 시료에서 공동-발현된다. 개별 종양의 경우 CD4 T 세포 (A) 및 NK 세포 (B) 상의 PVRIG 발현이 TAMS 상의 PVRL2 발현에 대해 좌표화된다.
도 94. 인간 T-세포 상의 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 활성. A) 세포 표면 결합된 항-CD3 및 PVRL2를 발현하는 CHO 세포로 활성화된 CD4 T-세포 상의 PVRIG의 발현. B) HLA-A2, B-2m 및 PVRL2의 발현은 CHO-S 모체 및 조작된 CHO-S 세포주 상에 나타난다. 이소형에 대비한 발현 배수는 숫자로 도시된다. C) 세포 표면 결합된 항-CD3 및 PVRL2를 이소적으로 발현하는 CHO 세포를 다양한 농도의 항-PVRIG Ab 또는 적절한 IgG 대조군의 존재 시 정제된 CD8 T 세포와 공동-배양하였다. 증식%를 나타낸다. 각 점은 세 벌의 평균값을 나타낸다. D) CHO 세포의 이소적 발현 HLA-A2/B2m 및 PVRL2를 1 μg/ml gp100 및 다양한 농도의 항-PVRIG 항체 또는 적절한 IgG 대조군의 존재 시 2개 gp100 특이적 T 세포주 (TIL F4, TIL 209)와 공동-배양하였다. 공동-배양 3일째의 TNF-α 농도는 낮아진다. 각 값은 세 벌의 평균을 나타낸다.
도 95. mPVRIG 결합 상호작용 및 대리 항-mPVRIG 항체의 특성화. A, B) mPVRL2에 대한 mPVRIG의 결합을 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다. C) 용해성 수용체 Fc 또는 대조군 단백질을 고정화된 mPVRL2 HIS와의 용량 반응으로 ELISA 형식으로 배양하였다. 결합 수용체 Fc를 나타낸다. D) 용해성 PVRL2 HIS 단백질을 PVRIG Fc 또는 DNAM Fc 코팅 플레이트와의 용량 반응으로 배양하였다. E) mPVRL2 siRNA, mPVRsRNA 또는 혼합된 siRNA 트랜스펙션으로 형질전환된 B16-F10 세포주에 mPVRIG Fc 또는 대조군 Fc 융합 단백질의 결합을 나타낸다. F) mPVRIG를 과발현하는 HEK293 세포에 항-mPVRIG의 결합을 조사하여 래트 항-마우스 PVRIG 단일클론 항체의 친화성 특성화를 수행하였다. G) 내인성으로 mPVRIG를 발현하는 D10.G4.1 세포주에 대한 항-mPVRIG 대 이소형 대조군 마우스 IgG를 검사하여 래트 항-마우스 PVRIG 단일클론 항체의 친화성 특성화를 수행하였다. H) 마우스 PVRIG-siRNA (녹색 히스토그램) 대 혼합 siRNA (주황색 히스토그램)로 형질전환된 D10.G4.1 세포에 항-mPVRIG의 결합. I) 내인성으로 PVRL2를 발현하는 B16-F10 세포에 항-mPVRIG Ab와 함께 미리 배양한 mPVRIG Fc의 결합.
도 96. 유전자전환 PVRIG 및 TIGIT 녹아웃 마우스의 생성. PVRIG 조건부 녹아웃 및 TIGIT 녹아웃 마우스주는 오즈젠사 (Ozgene Pty Ltd, Bentley WA, Australia)에 의해 생성되었다. A) PVRIG 엑손 1 내지 4가 플록싱된 표적화 구조물을 C57BL/6 ES 세포주 Bruce4 (Koentgen et al., Int Immunol 5: 957-964, 1993)에 전기천공하였다. B) TIGIT 엑손 1 (ATG 포함) 및 엑손 2 및 3의 코딩 영역이 FRT-인접 네오 카세트로 대체된 표적화 구조물을 C57BL/6 ES 세포주 Bruce4에 전기천공하였다. 상동 재조합 ES 세포 클론을 서던 하이브리드화에 의해 동정하고 goGermline 포배세포에 주입하였다 (Koentgen et al., genesis 54: 326-333, 2016). 수컷 키메라 마우스를 획득하고 C57BL/6J 암컷과 교배시켜 C57BL/6 배경에 이형접합 생식계열 자손을 확립하였다. 　생식계열 마우스를 FRP 인접한 선별가능한 마커 카세트를 제거하고 조건부 또는 녹아웃 대립유전자 (PVRIG 및 Tigit 각각)를 생성하기 위해 보편적인 FLP C57BL/6 마우스주와 교차시켰다. 　PVRIG 녹아웃의 경우, 마우스를 loxP 인접한 엑손을 제거하고 녹아웃 대립유전자를 생성하기 위해 보편적인 Cre C57BL/6 마우스주와 추가로 교차시켰다.
도 97. PVRIG 녹아웃 마우스는 면역-표현형으로 야생형 마우스와 유사한다. 항-응고제-코팅 튜브에 정맥혈을 채취하고 기관을 수확하기 전에 마우스 (야생형 및 PVRIG 녹아웃 집단 당 5마리)를 안락사시켰다. 채취한 신선한 골수, 흉선, 비장, 피부 및 장간막 림프절로부터 단일 세포를 회수하였다. 세포를 형광크롬-컨쥬게이션된 표면 마커 항체로 염색하고 BD LSR Fortessa 유동 세포계측기로 획득하였다. 패널은 림프성 조직 유형을 교차하는 골수 세포 (A), 수지상 세포 (B), B 세포 (C), T 세포 (D), CD4 T 세포 (E), CD8 T 세포 (F) 및 NK 세포의 비슷한 빈도를 도시한다. (H-I) Hemavet 950 수의혈액학 시스템 상에서 정맥 전혈이 전개되어 야생형 및 PVRIG 결핍 마우스로부터의 혈액 세포 하위집합의 계수 및 빈도를 비교하였다.
도 98. 항-PD-L1으로 처리한 PVRIG-/- 마우스에서는 항-PD-L1으로의 야생형과 비교하여 T 세포 효과기 기능이 증가되었다. MC38 종양을 WT 또는 PVRIG-/- 마우스에 접종한 다음 항-PD-L1 또는 래트 IgG2b 이소형 대조군으로 처리하였다. 18일째, CD45+ 종양 침윤 림프구를 종양으로부터 정제하고, RNA를 추출하고, 전사체 프로파일을 수행하였다. 여러 개의 T 세포 관련 유전자가 관찰되고, 각 점은 개별 마우스를 나타낸다. 스튜던트 t 테스트가 표시된다.
도 99. 항-TIGIT 및 항-VRPG 항체는 종양 세포 살상을 유도한다. 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포로의 시험관내 공동-배양 검정을 사용하여 항원-특이적 종양 세포 살상에 미치는 벤치마크 항-TIGIT 항체 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 효과를 평가하였다. 검정에 사용된 HLA-A2+ 표적 세포주는 Mel624 (A) 및 Panc05.04 (B)이었다. Synagis hIgG4는 이소형 대조군 항체이다. 표적 세포의 루시페라제 활성을 바이오-글로 루시퍼라제 기질로 측정하였다. 대표적인 데이타 (n=2)는 3명의 다른 공여자로부터의 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포와 16시간의 공동-배양 후 Mel624 또는 Panc05.04 세포의 특이적 살상 백분율 (평균 +/- 표준 편차)을 나타낸다.
도 100은 CHA.7.518.1.H4 (S241P)로 항-TIGIT 항체의 용량-의존성 종양 세포 살상을 나타낸다. 인간 CMV-특이적 CD8+ T-세포로의 시험관내 공동-배양 검정은 CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 조합될 때 항원-특이적 Mel624 세포 살상에 미치는 두 개의 상이한 항-TIGIT 항체, BM26 및 CPA.9.086의 효과를 평가하기 위해 사용하였다. 표적 세포의 루시페라제 활성을 바이오-글로 루시퍼라제 기질로 측정하였다. 대표적인 데이타 (n=2)는 1명의 공여자로부터의 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포와 16시간의 공동-배양 후 Mel624 세포의 특이적 살상 백분율 (평균 +/- 표준 편차)을 나타낸다.
도 101. CPA.9.086 CDR 서열, IMGT 및 카밧 번호매김.
도 102. 항-TIGIT hIgG4+ CHA.7.518.1.H4 (S241P) 조합은 종양 세포 살상을 유도한다. CMV-반응성 CD8+ T 세포의 Mel624 PVR, PVRL2 및 루시퍼라제 OE의 공동 배양. CMV-반응성 공여자 156는 0.5 μg/ml aTIGIT Ab 및 10 μg/ml CHA.7.518.1.H4 (S241P)에서 시작하는 용량 적정과 동시에 CMV-반응성 공여자 4로는 10 μg/ml aTIGIT Ab 및 10 μg/ml CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 단일 투여.
XIII. 실시예
"PVRIG 항체 및 처리 방법"이라는 명칭의 국제특허출원 PCT/US2016/18809 (2016년 2월 19일 출원)는 본원에 명시적으로 그의 전문이, 상세하게는 실시예 1 내지 5, 7 내지 8 , 11 내지 13, 16 내지 20 및 26 내지 28 및 첨부 도면의 경우 참고문헌으로 통합된다.
A. 실시예 1: PVRIG, DNAM 및 TIGITF에 대한 PVR, PVRL2 및 PVRL3 결합의 표면 플라스몬 공명 연구
재료 및 방법
모든 실험은 22℃에서 ProteOn XPR 36 기구를 사용하여 수행하였다.
1 단계: ProteOn XPR 36 바이오센서를 사용하여 GLC 칩의 여섯 개 레인 모두 위에 고밀도 염소 항-인간 fc 다중클론 항체 표면 (Invitrogen H10500)이 준비하였다. 항-인간 fc 표면에 대한 활성화 단계는 수평 유동 방향에서 발생하였고 고밀도 pAb에 대한 고정화 단계는 수직 유동 방향에서 발생하였다. 차단 단계는 수직 및 수평 위치 모두에서 발생하여 수평 "간극"이 기준면으로 사용될 수 있다 염소 항-인간 pAb의 평균 약 4400 RU가 각 레인에 고정화되었다.
2 단계: 각 주기마다 인간 PVRIG 융합 단백질 (인간 fc, GenScript lots 451, 448, 125), 인간 DNAM-1 융합 단백질 (인간 fc, R & D Systems), 인간 TIGIT 융합 단백질 (인간 fc, R & D Systems) 및 대조군 인간 IgG (Synagis)를 각각 2 μg/mL의 농도로 2분 동안 상이한 수직 레인 위에 포획하였다. PVR, 두 개 로트의 PVRL2 및 PVRL3을 상이한 리간드 포획 주기에서 여섯 개의 모든 포획 리간드 위에 여섯 개의 상이한 농도로 수평 유동 방향으로 각각 주입하였다. 주입은 2분이었고, 이후 50 μL/분의 유속에서 10분의 해리가 이어졌다. PVR 농도 범위는 3배 일련 희석에서 1.4 nM 내지 332 nM이었고, PVRL2의 두 개 로트는 3배 일련 희석으로 1.3 nM 내지 322 nM의 농도 범위에서 주입되었고, PVRL3는 3배 일련 희석으로 1.4 nM 내지 334 nM의 농도 범위에서 주입되었다. 모든 단백질 시약은 0.05% 트윈 20 및 0.01% BSA가 첨가된 탈기된 PBS 완충액인 전개 완충액으로 제조되었다. 항-인간 fc 포획 표면은 각 주기 후에 146 mM 인산의 두 번의 30초 펄스로 재생되었다.
3 단계: 포획된 각 리간드에 결합하는 분석물의 센서그램 데이타를 프로세싱하였고, 간극 기준화 및 분석물 주입과 동일한 사전-공시료 주입을 사용한 ProteOn 매니저 버전 3.1.0.6을 사용하여 이중 기준화하였다.
결과
a) PVR: 포획된 DNAM-1 및 TIGIT에 약하게 결합하고 PVRIG의 세 개 로트 및 대조군 IgG에 대한 결합을 나타내지 않는다. DNAM-1 및 TIGIT와의 PVR 상호작용의 KD를 평가하기에 충분한 정보가 생성되지 않았다 (데이타는 미도시).
b) PVRL2: PVRL2의 두 개 로트는 PVRIG와 DNAM-1의 세 개 롯트에 모두 결합하지만 TIGIT에는 거의 또는 전혀 결합하지 않으며 대조군 IgG에도 결합하지 않았다. 센서그램은 복합적인 동력학을 나타내어서 결합 상수를 추정할 수 없었다 (데이타 미도시).
c) PVRL3: TIGIT에 대한 최소 결합을 나타내었고 다른 단백질에는 결합하지 않았다 (데이타 미도시).
B. 실시예 2: 인간 흑색종 특이적 TIL 기능에 미치는 PVRIG 녹다운 (KD) 및 항-PVRIG 항체의 효과
이들 검정법의 목적은 흑색종 표적 세포와 공동-배양 시 활성화 마커 및 사이토카인 분비에 의해 측정되는, 인간 유래 TIL에서의 PVRIG의 기능적 능력을 평가하는 것이다.
1. 실시예 2(1):
PVRIG와 PVRL2의 상호작용을 단독으로 또는 다른 항체 (예로, 항-TIGIT, 항-DNAM1)와 조합하여 차단하는 것으로 밝혀진 항-PVRIG 항체 (CPA.7.021)의 효과를 평가하였다. PD1은 녹다운 (siRNA) 연구를 위한 벤치마크 면역 체크포인트로서 사용되었다.
재료 및 방법: TIL: 세 명의 흑색종 환자로부터의 종양-침윤성 림프구 (TIL) (1) TIL-412- HLA-A2-Mart1 특이적, (2) TIL-F4- HLA-A2-gp100 특이적, (3) TIL-209- HLA-A2-gp100 특이적이 사용되었다. TIL은 10% 인간 혈청 (Sigma, H3667) + 1% 글루타맥스 (Life technologies, 35050-038) + 1% Na-피루베이트 (Biological Industries, 03-042-1B) + 1% 비-필수 아미노산 (Biological Industries, 01-340-1B) + 1% Pen-Strep (Biological Industries, 03-031-1B) + 300 U/ml rhIL2 (Biolegend, 509129)가 보충된 IMDM (BI, 01-058-1A) 완전 배지에서 해동되었다.
종양 세포주: 인간 흑색종 세포 Mel-624는 MHC-1 일배체형 HLA-A2와 관련하여 MART-1 및 gp-100 항원을 발현한다. 세포를 10%, 25 mM HEPES 완충액, 1% Pen-Strep가 보충된 완전한 DMEM 배지에서 배양하였다.
TIL에서 녹다운: 100 pmol의 Dharmacon ON-TARGET + 인간 PVRIG siRNA-SMART 풀 (L-032703-02) 또는 인간 PD1 siRNA-SMART 풀 (L-004435) 또는 비-표적화 siRNA (D-001810-01-05)를 사용하여 TIL에서 인간 PVRIG 및 인간 PD1의 녹다운 (KD)을 시행하였다. siRNA를 TIL (AMAXA, program X-005)에 전기천공시켰다. 전기천공법은 해동 24시간 후 IL-2이 보충된 완전 IMDM에서 배양된 휴지 TIL에서 시행하였다. 전기천공 이후에, TIL을 96 웰 TC 플레이트에 접종하여 24시간 동안 회복시켰다. 24시간 후, 세포를 수확하고 생존 염료 (BD Horizon; Cat # 562247, BD biosciences)로 염색하고, PBS로 세척하여 항-인간 PVRIG-CPA.7.021 (CPA.7.021 IgG2 A647, 7.5 μg/ml) 또는 항-인간 PD-1 (Biolegend, # 329910 AF647, 5 μg/ml)으로 실온에서 30분 동안 염색하였다. 사용된 이소형 대조군은 synagis (IgG2 A647, 7.5μg/ml) 및 마우스 IgG1 (Biolegend # 400130 A647, 5μg/ml)이다. 모든 시료는 MACSQuant 분석기 (Miltenyi)에서 전개되었으며 데이타는 FlowJo 소프트웨어 (v10.0.8)를 사용하여 분석되었다.
TIL과 624 흑색종 세포의 공동-배양: siRNA 전기천공된 TIL을 수확하고 96 TC 플레이트에 5 × 104개/웰로 접종하였다. Mel-624 세포를 또한 수확하고 공동-배양에서 1 : 1 / 1 : 3 E : T 비율로 접종시켰다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤샘 동안 (18시간) 배양하였다.
흑색종 특이적 TIL 활성에 미치는 항-PVRIG 항체 (CPA.7.021), 항-TIGIT (클론 10A7, Genentech 미국 특허 출원 US 2009/0258013) 및 항-DNAM1 (클론 DX11, Shibuya et al Immunity　Volume 4, Issue 6, 1 June 1996, Pages 573-581; BD Biosciences에 처음 기술됨; 마우스 항-인간 DNAM-1 클론 DX11, Cat No. 559787)의 효과를 평가하기 위해, TIL (1 × 105개 세포/웰)을 단일-처리 (10 μg/mL) 또는 조합-처리 (각각 최종 10 μg/mL)에서 1 : 1 효과기 : 표적 비율로 624 흑색종 표적 세포를 첨가하기 전에 테스트 항체 또는 관련 이소형 대조군과 미리 배양하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤샘 동안 (18시간) 배양하였다.
TIL 활성화의 평가: 공동-배양 16시간 후, 세포를 생존 염료 (BD Horizon, Cat # 562247, BD biosciences)로 염색하고, PBS로 세척하여 Fc 차단 용액 (cat # 309804, Biolegend)에 노출시킨 후 항-CD8a (Cat # 301048, Biolegend) 및 항-CD137 (Cat # 309804, Biolegend)로 4℃에서 30분 동안 표면 염색하였다. 모든 시료는 MACSQuant 분석기 (Miltenyi)에서 전개되었으며 데이타는 FlowJo 소프트웨어 (v10.0.8)를 사용하여 분석되었다. 배양 상청액을 수집하고 CBA 키트 (Cat # 560484, BD)에 의해 사이토카인 분비를 분석하였다.
결과
TIL에서 PVRIG 녹다운: TIL MART-1 및 TIL F4를 IL-2와 함께 24시간 동안 배양하였다. 100 pmol의 ON-TARGET + 인간 PVRIG siRNA - SMART 풀 (L-032703-02) 또는 인간 PD1 siRNA - SMART 풀 (L-004435) 또는 비-표적화 siRNA (D-001810-01-05)를 사용하여 TIL에 전기천공시켰다 (AMAXA, program X-005). PVRIG 또는 PD-1의 검출은 전기천공 24시간 후 (및 공동-배양 전) 수행하였다. 생존 염료에 대해 세포를 염색하고 항-PVRIG 또는 항-PD-1을 사용하여 30분 RT 배양하였다. KD 모집단의 백분율은 미국 특허 USSN 15/048,967의도 82에 나타내며, 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다.
녹다운된 TIL을 사용한 기능 검정: IL2로 24시간 동안 배양된 인간 TIL을 인간 PVRIG 또는 PD-1 또는 대조군으로서 혼합된 서열을 인코딩하는 siRNA로 전기천공하였다. TIL은 전기 천공 24시간 후 PVRIG 및 PD-1 발현에 대해 테스트되었다. 혼합-전기천공된 TIL과 비교하여 PVRIG의 약 80% 녹다운 및 PD-1의 약 50% 녹다운이 본원에서 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 USSN 15/048,967의도 82에 입증된 바와 같이 관찰되었다.
KD TIL을 Mel-624 세포와 1 : 1 또는 1 : 3 E : T에서 18시간 동안 배양하고 CD137의 발현을 위해 염색하였다. 활성화 마커 CD137의 상승된 수준은 대조군 혼합된 siRNA와 비교하여 PD-1 siRNA로 전기천공된 TIL과 유사하게 PVRIG siRNA로 전기천공된 TIL MART-1에서 관찰되었다 (본원에서 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 USSN 15/048,967의도 83A에서 입증된 바와 같음). 공동-배양 상청액을 수집하고 분비된 사이토카인의 존재를 테스트하였다. PVRIG siRNA로 전기천공된 TIL은 대조군 SCR siRNA와 비교하여 IFNγ 및 TNF 수준의 유의한 증가를 보여준다. 유사한 효과가 PD-1 siRNA로 전기천공된 TIL에서 나타났다 (본원에서 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 USSN 15/048,967의 도 83B-C에서 입증된 바와 같음).
TIL F4에서 활성화 수준의 동일한 증가 경향이 관찰되었다. 1 : 3 E : T에서 Mel-624와 PVRIG siRNA 전기천공된 TIL F4의 공동-배양은 본원에서 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 USSN 15/048,967의 도 84A 및 도 84B에 나타난 바와 같이, CD137 표면 발현 수준의 증가뿐만 아니라 공동-배양 상청액에서의 IFNγ 분비 증가를 가져왔다. PD-1 siRNA로 전기천공된 TIL에서도 유사한 경향이 관찰되었다.
차단 Ab를 이용한 기능적 검정:
시험관내 단일요법 및 항-PVRIG 및 항-TIGIT의 조합요법: 209 TIL을 18시간 동안 1 : 1 E : T에서 Mel-624 세포와 배양하였다. 공동-배양 상청액을 수집하고 분비된 사이토카인의 존재를 테스트하였다. 항-TIGIT 처리는 IFNγ 또는 TNF 분비 수준에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 항-TIGIT 및 항-PVRIG가 함께 공동-배양에 첨가된 경우 IFNγ 및 TNF 수준의 증가가 관찰되었다 (도 8a 내지 8b).
시험관내 단일요법 및 항-PVRIG 및 항-TIGIT의 조합요법: 209 TIL을 18시간 동안 1 : 1 E : T에서 Mel-624 세포와 배양하였다. TIL은 활성화 마커 CD137의 표면 발현을 위해 염색되었으며, 항-DNAM-1 처리 시 감소된 발현 수준을 보였다. 공동-배양 상청액을 수집하고 분비된 사이토카인의 존재를 테스트하였다. 항-DNAM-1의 처리는 분비된 사이토카인 IFNγ 및 TNF를 증가시키는 경향을 매개하였다. 항-DNAM-1 및 항-PVRIG를 조합한 처리는 CD137 발현에 미치는 효과를 부분적으로 역전시켰으며 (도 9c), 사이토카인 분비 IFNγ 및 TNF에 미치는 효과를 증진시켰다 (도 9a 내지 도 9b). MART-1 TIL은 18시간 동안 1 : 1 E : T에서 Mel-624 세포와 함께 배양되었다. 공동-배양 상청액을 수집하고 분비된 사이토카인의 존재를 테스트하였다. 항-DNAM-1로의 처리는 TIL에서의 CD137 표면 발현을 감소시켰으며 분비된 사이토카인 IFNγ 및 TNF도 역시 감소시켰다. 항-DNAM-1 및 항-PVRIG를 조합한 처리는 이들 효과를 부분적으로 역전시켰다 (도 9d 내지 도 9f).
요약 및 결론: PD1 KD는 IFNγ 및 F4 및 MART-1에서의 분비에 의해 측정된 바와 같이 TIL 활성을 개선하였다. 대조군 siRNA와 비교하여 MART-1 TIL의 PVRIG KD에서 IFNγ와 TNF 분비의 증가 (약 20%)가 관찰되었다. 동일한 경향은 F4 TIL 상의 624 흑색종 세포와 공동-배양 시 CD137 발현에서 관찰되었다.
항-TIGIT의 처리는 624 Mel와 함께 공동-배양된 TIL로부터의 IFNγ 또는 TNF 분비 수준에는 영향을 미치지 않았지만, 항-TIGIT 및 항-PVRIG (CPA.7.021)를 조합하여 공동-배양에 첨가할 때 IFNγ 및 TNF 수준의 증가가 관찰되었다.
항-DNAM-1 처리는 CD137 및 사이토카인 분비 감소에 의한 나타난 TIL-MART-1 활성화를 감소시켰고 항-PVRIG (CPA.7.021)는 DNAM-1 Ab와 조합 처리에서 이 효과를 부분적으로 역전시킬 수 있었다. TIL 209에서 IFNγ와 TNF 분비 수준은 항-DNAM-1을 사용하여 약간 증가하였고 (약 10%), IFNγ와 TNF 수준의 증가 (각각 약 40%와 30%)는 항-DNAM1과 항-PVRIG (CPA.7.021)가 공동- 배양에 조합하여 첨가될 때 관찰되었다. 종합적으로, 본 발명자의 결과는 PVRIG가 PVRL2를 위한 새로운 보조억제 수용체라는 것을 보여주었다.
2. 실시예 2(2):
PVRIG와 PVRL2의 상호작용을 차단하는 것으로 나타난 추가적인 항-PVRIG 항체 (CHA.7.518.1.H4 (S241P); CHA.7.524; CHA.7.530; CHA.7.538)의 TIL-209, TIL-412 및 TIL-463-F4 활성에 미치는 효과를 단독으로 또는 다른 항체 (예로, 항-TIGIT, PD1)와 조합하여 624 흑색종 세포주와의 공동-배양 시 평가하였다.
이 검정에 사용된 기능적 항체는 항-hPVRIG 하이브리도마 Ab (mIgG1 골격) - CHA.7.518.1.H4 (S241P); CHA.7.524; CHA.7.530; CHA.7.538 (M1 로트 # 30816); 항-TIGIT (mIgG1 골격) - 클론 10A7 (Genescript), 항-TIGIT 클론 MBSA43 (e-biosciences) 및 mIgG1 (cat # 400166, MOPC-21 클론, Biolegend)이었다.
TIL과 624 Mel의 공동-배양: TIL은 공동-배양 2.1 24시간 전에 기술된 바와 같이 해동되고 배양되었다. 테스트된 Ab를 단일-처리 (10 μg/mL)로 또는 항-TIGIT (20 μg/mL)와 조합하여 접종된 TIL에 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 항온 배양하였다 (총 100 μL). Mel-624 세포를 수확하고 TIL과의 공동-배양에서 1 : 3 효과기 : 표적 비율로 접종하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤샘 동안 (18시간) 배양하였다.
TIL 기능적 능력의 평가: T 세포 활성은 공동-배양 상청액에서 IFNγ의 검출에 기초하여 평가되었다. 배양 상청액을 수집하고 CBA 키트 (Cat # 560484, BD) 또는 MAGPIX 인간 IFNγ/TNFα 키트에 의해 사이토카인에 대해 테스트하였다. 두 개 미단의 쌍을 이루지 않은 T-테스트가 계산되었다. P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 언급되었다.
결과
항-PVRIG 하이브리도마 Ab의 존재 시 TIL 및 흑색종 세포를 이용한 기능적 검정: IL2로 24시간 동안 배양된 인간 TIL를 18시간 동안 1 : 3 E : T에서 Mel-624 세포와 함께 공동-배양하고 사이토카인 분비를 테스트하였다. 도 31은 수행된 5 내지 6개 중 대표적인 실험을 기술하였다. 항-TIGIT 또는 항-PVRIG Ab (청색)의 존재 시 또는 항-TIGIT 및 항-PVRIG의 조합 (녹색)으로 TIL을 흑색종 세포 624와 공동-배양하고 IFNγ/TNF 분비를 테스트하였다. 이 실험에서, 항-TIGIT과 조합하여 모든 항-PVRIG Ab CHA.7.518.1.H4 (S241P), CHA.7.530, CHA.7.538은 항-TIGIT 처리 단독과 비교하여 IFNγ 분비를 증가시켰던 한편, 모든 4개의 PVRIG Ab 단일-처리는 테스트된 (TIL-209 및 TIL463-F4) 3개의 TIL 중 2개에서 종 (20 내지 30%) IFNγ 분비를 증가시켰다.
Ab CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 효과는 TIL 463-F4-gp100에서 실험을 통해, 단일 및 항-TIGIT와 조합으로서 5회의 실험을 통해 통계적으로 유의하게 나타났다 (도 9e, 9g). 항-PVRIG Ab CHA.7.518.1.H4 (S241P) 조합 처리의 효과는 TIL 209에서도 통계적으로 유의하였다 (도 9c). 항-PVRIG Ab CHA.7.538의 조합 치료의 효과는 TIL 463-F4-gp100에서 통계적으로 유의하였다 (도 9f).
요약 및 결론: 본원에 기술된 실험 시스템에서, IFNγ 분비의 변화에 의해 보는 바와 같이 표적 흑색종 세포에 반응하여 항-PVRIG가 TIL에 미치는 효과를 관찰하였다. 테스트된 항-PVRIG 하이브리도마 Ab는 관련 이소형 대조군에 비해 IFNγ 분비의 증가를 매개하였다. Ab CHA.7.518.1.H4 (S241P)는 단일-처리로서 IFNγ 분비의 증가를 매개하는데 장점이 있는 것으로 보이지만, 테스트된 다른 aPVRIG Ab와 비교하여 이 효과의 크기는 상이한 TIL 간에 다양하다. 이 효과는 항-TIGIT 치료와 조합하여 증진된다.
3. 실시예 2(3):
목표는 HLA-A2, b2 미세글로불린 (B2M) 및 PVRL2를 안정적으로 공동-발현하는, 펩타이드-펄스 처리된 CHO-S 세포와의 공동-배양 시 인간 TIL 활성에 미치는 항-인간 PVRIG 항체 (CHA.7.518.1.H4 (S241P); CHA.7.544; 또는 CHA.7.538)의 기능적 활성을 평가하는 것이다.
세 명의 흑색종 환자의 절제된 전이암으로부터의 TIL이 다음과 같이 사용되었다: TIL-412- HLA-A2-Mart1(26-35) 특이적, TIL-463-F4- HLA-A2-gp100(209-217) 특이적, TIL-463-F5- HLA-A2-gp100(209-217) 특이적 및 TIL-209- HLA-A2-gp100(209-217) 특이적.
TIL은 10% 인간 혈청 + 1% 글루타맥스 + 1% Na-피루베이트 + 1% 비-필수 아미노산 + 1% Pen-Strep + 300 U/ml의 rhIL2가 보충된 IMDM 완전 배지 (Biolegend, 589106)에서 해동되었다.
HLA-A2/B2M (렌티바이러스 벡터 cat # CD515B-1-SBI, system biosciences)을 발현하는 렌티 바이러스로 CHO-S 세포 (표적 세포)를 안정하게 형질전환시키고, 8 mM 글루타맥스 1% 및 1% Pen/Strep가 보충된 CD CHO 배지 (Cat#10743-011)에서 600 μg/ml의 하이그로마이신 B 선별 하에 배양하였다. 이어서, 제한 희석에 의해 HLA-A2/B2M 발현 세포를 클로닝하였다. 이어서, 높은 HLA-A2 및 B2M 발현을 갖는 3E8 클론을 인간 PVRL2 (렌티바이러스 벡터 cat # CD510B-1-SBI, system biosciences)를 발현하는 렌티바이러스로 형질전환시키고, 6 μg/ml 퓨로마이신 선별 하에 배양하였다.
본원에 기술된 (도 35에 도시됨) 실험 시스템에서, TIGIT, DNAM-1 및 PVRIG를 내인성으로 발현하는 gp100 또는 MART-1 반응성 TIL (도 37)을 펩타이드-펄스 처리된 CHO-S HLA-A2/B2M/PVRL2 세포와 공동-배양하였다.
이 검정에 사용된 기능적 항체는 다음과 같은 항-인간 PVRIG이었다; Ab 461 (Aldeveron) - 본 실시예에서 544로 지칭됨, 항-인간 PVRIG 키메라 Ab (hIgG4 골격) - CHA.7.538; CHA.7.518 (본 실시 예에서 c538 및 c518로 지칭됨, 이는 7.538 및 7.518으로부터의 가변 중쇄 및 경쇄 영역이 인간 IgG4 불변 영역 항-인간 TIGIT (mIgG1 골격) 클론 MBSA43 (e-biosciences), mIgG1 (biolegend) 및 hIgG4 (biolegend)에 융합된 것을 의미함).
TIL은 표적 세포와 공동-배양 전에 24시간 동안 본원에서 기술된 바와 같이 해동되고 배양되었다. 테스트된 항체를 단일-처리 (10 μg/mL)로 또는 항-TIGIT (총 20 μg/mL)와 조합하여 접종된 TIL에 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 항온 배양하였다 (총 100 μL). CHO-S 세포를 수확하고, 0.1 또는 0.5 μg/ml의 gp-100 (gp100209-217) 또는 20 μg/ml의 MART-126-35 펩타이드로 37℃에서 1시간 동안 Opti-MEMTM 환원된 혈청 배지에서 펄스 처리하였다. Opti-MEM?? 환원된 혈청 배지로 세 번 세척한 후, 효과기 : 표적 비율 1 : 3 (33k : 100k)에서 TIL과 함께 펩타이드-펄스 처리된 표적 세포를 밤샘 동안 (18시간) 공동-배양하였다.
TIL 기능적 능력의 평가: 단일-처리 또는 항-TIGIT와의 조합 처리로서 항-PVRIG 항체 (10 μg/ml)의 TIL 활성에 미치는 효과를 조합된 비드 어레이 (CBA) 키트 (Cat # 560484, BD)를 사용하여 밤샘 공동-배양 상청액으로부터 사이토카인 분비의 측정을 사용하여 평가하였다. 모든 시료는 MACSQuant 분석기 (Miltenyi)에서 획득되며 데이타는 FlowJo 소프트웨어 (v10.0.8)를 사용하여 분석되었다.
항-PVRIG 항체의 용량 반응: 항-PVRIG 항체 c518, c538 (또는 hIgG4 이소형 대조군) 용량 반응의 효과를 항체 농도 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 및 0.03 μg/ml에서 기술된 검정법 상에서 테스트하였다. 두 개 미단의 쌍을 이루지 않은 T-테스트가 계산되었다. P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 언급되었다.
결과
PVRL2를 발현하는 CHO-S HLA-A2/B2M 세포와의 공동-배양 시 TIL 활성에 미치는 항-PVRIG 항체의 효과: 네 개의 상이한 TIL (412, 463, 462 및 209)의 활성에 미치는 세 개의 항-PVRIG 항체 (544, c538 및 c518)의 두 번의 다른 실험로부터의 효과를 도 37에 요약하였다. Ab는 비-차단제 Ab 대조군으로서 사용되었다. 실험의 자세한 결과는 도 39에 제시되어 있다. 544, c538 및 c518 항체로의 처리는 이소형 항체로의 치료와 비교하여 TIL로부터의 IFN 분비 수준을 증가시켰다 (각각 평균 6%, 28% 및 23%). 증가된 IFN 분비는 비-차단제 대조군인 544와 비교하여 c538 또는 c518로 처리된 TIL에서 검출되었다. c538 내지 c518 Ab로의 처리 간에 유의한 차이는 발견되지 않았다. 항-TIGIT로의 처리는 이소형과 비교하여 TIL로부터의 IFN 분비가 증가시켰다 (평균 49%). c518 및 c538의 항-TIGIT와의 조합 처리는 TIL로부터의 IFN 분비에서 추가적인 효과를 유도 하였지만, 조합 효과가 TIGIT의 단일-치료와 비교하여 통계적으로 유의하지 않았다.
TIL 기능적 능력에 미치는 항-PVRIG 항체 용량 반응의 효과: TIL F4 및 209의 활성에 미치는 용량 반응에서 항-PVRIG 항체 (c538 및 c518)의 첨가 효과를 평가하였다 (도 80). c518 및 c538 항체의 EC50은 TIL로부터의 TNFα 분비의 효과에 의해 측정된 이소형 대조군과 비교하여 단일 자리수 nM이다.
요약 및 결론: 본원에 기술된 실험 시스템에서 PVRL2를 과다-발현하는 펩타이드-펄스 처리된 CHO-S HLA-A2/B2M 표적 세포와의 공동-배양에 반응하여 TIL 활성에 미치는 항-PVRIG 항체의 효과를 관찰 하였다. 테스트한 항-PVRIG 항체는 관련 이소형 대조군과 비교하여 TIL로부터 IFN 및 TNF의 증가된 분비를 매개하였다. 항체 c518 및 c538은 IFN 분비에 의해 나타난 바와 같이, PVRIG의 비-차단제 항체인 544와 비교하여 TIL 활성에 미치는 통계적으로 유의한 이점 (각각 p-0.0063 및 p-0.0034)을 갖는다 (PVRIG 발현 세포에서 시행된 경쟁 실험에 기초함). c518 및 c538 항체 모두 항-TIGIT 항체에 대한 추가적인 효과가 있었다 (통계적으로 유의하지 않음).
4. 실시예 2(4):
본 실시예의 목적은 흑색종 표적 세포와 공동-배양 시 사이토카인 분비에 의해 측정되는, 인간 유래 TIL에서의 PVRIG의 기능적 능력을 평가하는 것이다. PVRIG와 PVRL2의 상호작용을 차단하는 것으로 나타난 항-PVRIG 항체 (CHA.7.518.1.H4 (S241P); CHA.7.524; CHA.7.530; CHA.7.538)의 효과를 단독으로 또는 다른 항체 (예로, 항-TIGIT, PD1)와 조합하여 평가하였다.
정제된 CD3+ T 세포를 Rossetesep 인간 T 세포 농축 칵테일 키트 (줄기 세포 기술)를 사용하여 연층 혈액 시료 상에서 획득하였다. 세포를 해동시키고 공동-배양에서 증식을 추적할 수 있도록 CFSE (분자 프로브)로 표지하였다.
CHO-S-OKT3 세포: CD710B-1 (SBI, cat# CS965A-1, lot# 151014-005, 1.40× 108 ifus/ml)에서 CD5L-OKT3-scFv-CD14로 CHO-S 세포를 형질전환하였다. 세포를 CD CHO (Gibco, Life technologies Cat # 10743-011)의 존재 시 8 mM 글루타맥스 및 6 μg/ml 퓨로마이신을 첨가하여 배양하였다. 표면 OKT3 수준은 1 : 200 희석에서 PE-염소 항-마우스 IgG F(ab)'2 (Jackson Immunoresearch, cat # 115-116-146)를 사용하여 유동 세포계측법으로 평가하였다. CHO-S-OKT3 세포를 제조사의 지침에 따라 Amaxa 전기천공 시스템 (Lonza, Walkersville, MD, USA)을 사용하여 인간 PVRL2 (델타 이소형태) 또는 빈 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. Ingenio?? 전기천공 용액 (Mirus, Cat # MC-MIR-50115) 및 펄스-프로그램 U-024에서 2 × 106개 세포 당 5 μg의 pcDNA3.1 플라스미드 (빈 벡터 또는 hPVRL2)를 사용하였다. 형질전환된 CHOS-S-OKT3 세포 상의 PVRL2의 발현을 항-PVRL2 Ab (cat # 337412, Biolegend)를 사용하여 유동세포계측법기로 평가하였다.
이 분석에 사용된 기능적 항체는 항-hPVRIG 하이브리도마 Ab (mIgG1 골격)-CHA.7.518.1.H4 (S241P); CHA.7.524; CHA.7.530; CHA.7.538, 항-TIGIT 클론 MBSA43 (e-biosciences) 및 mIgG1 (cat # 400166, MOPC-21 클론, Biolegend)이었다.
CD3 T-세포와 CHO-OKT3 세포의 공동-배양: CD3+ T 세포를 해동시키고 즉시 CFSE로 표지하였다. 동시에 CHO-S-OKT3-PVRL2 세포를 수확하고 37℃에서 1시간 동안 미토마이신-C로 처리하고, 세척하여 T 세포와 1 : 5 E : T (1 × 105개 T 세포 및 2 × 104개 CHO-OKT3-PVRL2 또는 모의). Ab를 단일-처리 (10 μg/ml) 또는 항-TIGIT (10 μg/mL)와 조합하여 첨가하고 공동-배양 플레이트를 5일 동안 37℃, 5% CO2 배양하였다. 5일 후 세포를 수확하고 T 세포 증식을 CD4 및 CD8 하위집단에서 FACS 게이팅에 의해 분석하였다.
CHOS-OKT3 공동-배양 검정에서 항-PVRIG 항체의 효과: CFSE-표지된 T 세포를 자극 세포 (막-결합된 항-CD3 mAb 단편을 발현하는 CHO 세포)로 자극하였다. 인간 PVRL2를 발현하는 CHOS 자극 세포 및 대조 자극 세포 (빈 벡터)를 CFSE-표지된 인간 T 세포와 1 : 5의 비율로 공동-배양하기 전에 미토마이신 C (50 μg/ml 1 시간)로 처리하였다. 37℃ 및 5.0% CO2에서 5일 후 T 세포 증식 (CFSE 희석) 및 사이토카인 분비 (ELISA 또는 TH1/2/17 CBA 키트)에 미치는 항-PVRIG 항체 (10 μg/ml)의 효과는 배양 상청액에서 평가하였다. 모든 시료는 MACSQuant 분석기 (Miltenyi)에서 획득되며 데이타는 FlowJo 소프트웨어 (v10.0.8)를 사용하여 분석되었다. 배양 상청액을 수집하고 CBA 키트 (Cat # 560484, BD)에 의해 사이토카인 분비를 분석하였다.
결과
CHOS-OKT3 검정에서 PVRL2 과다발현에 미치는 항-PVRIG 항체의 효과: PVRL2를 과다발현하는CHOS-OKT3 또는 모의 (빈 벡터) 세포를 CD3+ 세포와 공동-배양하고 항-PVRIG 항체의 단일 처리 또는 항-TIGIT와 조합으로 T 세포 증식 및 사이토카인 분비에 미치는 효과를 테스트하였다 (도 40). 5일 후 세포를 수확하고 CFSE 희석을 분석하였다. 동시에 공동-배양 상청액을 수집하고 사이토카인 분비를 테스트하였다. 도 41은 반응자 대 비반응 공여자에서 PVRIG 항체의 효과를 나타낸다. 항-TIGIT와 조합한 단일 치료로서 T 세포 증식에 미치는 다양한 항-PVRIG Ab의 효과를 평가하였다. 일부 항-PVRIG Ab가 T 세포 증식을 증진시키는 반면, 항-TIGIT 항체와의 추가적인 효과는 이 시스템에서 관찰되지 않았다 (도 42). 이들 효과는 Ab가 CD3+ 세포와 모의 (공 벡터 형질전환) CHO-S 세포 (데이타 미도시)와의 공동-배양에서 테스트된 때 보이지 않았다.
총 10명의 공여자가 테스트되었으며 10명의 공여자 중 5명이 항-PVRIG Ab에 반응하였다. Ab CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 처리는 테스트된 5명의 반응 공여자에 대해 20 내지 50% 범위의 IFNγ 분비를 지속적으로 증가시키는 결과를 가져왔던 반면, 다른 Ab로 치료한 경우 명백한 경향을 나타내지 못했다 (도 43). 유사한 효과가 CD8+ 세포 증식에서 관찰되었다. Ab 치료의 효과는 도 44에 요약되어 있다.
C. 실시예 3: 인간 흑색종 특이적 TIL 기능에 미치는 항-TIGIT 및 항-PD-1 항체와 조합한 항-PVRIG 항체의 효과
1. 실시예 3(1):
재료 및 방법
TIL: 세 명의 흑색종 환자로부터의 종양-침윤성 림프구 (TIL)가 다음과 같이 사용되었다: (1) TIL-412- HLA-A2-Mart1 특이적, (2) TIL-F4- HLA-A2-gp100 특이적 및 (3) TIL-209- HLA-A2-gp100 특이적.
TIL은 10% 인간 혈청 (Sigma, H3667) + 1% 글루타맥스 (Life technologies, 35050-038) + 1% Na-피루베이트 (Biological Industries, 03-042-1B) + 1% 비-필수 아미노산 (Biological Industries, 01-340-1B) + 1% Pen-Strep (Biological Industries, 03-031-1B) + 300 U/ml rhIL2 (Biolegend, 509129)가 보충된 IMDM (BI, 01-058-1A) 완전 배지에서 해동되었다.
종양 세포주: 인간 흑색종 세포 Mel-624는 MHC-1 일배체형 HLA-A2와 관련하여 MART-1 및 gp-100 항원을 발현한다. 세포를 10% FBS (BI, 04-127-1A), 25 mM HEPES 완충액 (BI, 03-025-1B), 1% 글루타맥스 (Life technologies, 35050-038) 및 1% Pen-Strep (Biological Industries, 03-031-1B)이 보충된 완전 DMEM 배지 (Biological Industries, 01-055-1A)에 배양하였다.
항-PVRIG, 항-TIGIT 및 PD1 차단 항체의 존재 시 TIL과 624 흑색종 세포의 공동-배양: 흑색종 특이적 TIL 활성에 미치는 항-PVRIG 항체 (CPA.7.021), 항-TIGIT (클론 10A7) 및 항-PD-1 (mAb 1B8, Merck)의 효과를 평가하기 위해, TIL (3 × 104개 세포/웰)을 단일-처리 (10 μg/mL) 또는 조합-처리 (각각 최종 10 μg/mL)에서 1 : 3 효과기 : 표적 비율로 624 흑색종 표적 세포를 첨가하기 전에 테스트 항체 또는 관련 이소형 대조군과 미리 배양하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤샘 동안 (18시간) 배양하였다.
TIL 활성화의 평가: 배양 상청액을 수집하고 CBA 키트 (Cat # 560484, BD)에 의해 사이토카인 분비를 분석하였다.
항-PVRIG의 시험관내 단일요법 및 항-TIGIT와 PD1 차단 항체와의 조합요법: F4 TIL (gp100 특이적)을 18시간 동안 1 : 3 E : T에서 Mel-624 세포와 배양하였다. 공동-배양 상청액을 수집하고 분비된 사이토카인의 존재를 테스트하였다. 항-TIGIT 또는 항-PD1의 처리는 IFNγ 또는 TNF 분비 수준에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 항-TIGIT 및 항-PD1이 항-PVRIG와 조합하여 공동-배양에 첨가된 경우 IFNγ 및 TNF 수준의 증가가 관찰되었다 (도 10a 내지 10b).
항-PVRIG, 항-TIGIT, 항-PD1의 단독 처리는 624 Mel와 TIL 공동-배양로부터의 IFNγ 또는 TNF 분비 수준에는 영향을 미치지 않았지만, 항-TIGIT 및 항-PD-1 항체가 항-PVRIG (CPA.7.021)과 조합하여 첨가될 때 IFNγ 및 TNF 수준의 증가가 관찰되었다. 제시된 데이타는 항-TIGIT 또는 항-PD1 항체와의 조합 요법의 상승 작용 효과가 있음을 제시한다.
2. 실시예 3(2):
또한, 시험관내 세포-기반의 일차 검정에서 항-TIGIT 항체와 조합하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포 기능을 증진시키는 항-PVRIG 항체의 능력을 평가하였다.
CHO-S OKT3 검정: CHO-S OKT3 검정을 이용하여 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 시판되는 항-TIGIT 항체의 조합이 T 세포 증식 및 사이토카인 분비를 단일한 항-PVRIG 또는 항-TIGIT 항체 치료보다 증가시킬 수 있는지 여부를 결정하였다. 공동-배양 검정에 사용된 표적 세포는 항-인간 CD3 항체 클론 OKT3 (OKT3라고 약칭됨)의 단일 사슬 가변 단편 및 인간 PVRL2 (hPVRL2라고 약칭됨)을 안정적으로 과다발현하는 중국 햄스터 난소 세포주 CHO-S (ATCC)이었다. CHO-S OKT3 모체 세포는 40 mM 글루타맥스, 페니실린/스트렙토마이신 및 6 μg/ml 퓨로마이신이 보충된 무-혈청 CD-CHO 배지에서 성장시켰다. CHO-S OKT3 hPVRL2 세포는 40 mM 글루타맥스, 페니실린/스트렙토마이신, 6 μg/ml 퓨로마이신 및 600 μg/ml 하이그로마신 B가 보충된 무-혈청 CD-CHO 배지에서 성장시켰다.
RosetteSepTM 인간 CD3+ T 세포 농축 칵테일 (Stemcell Technologies) 및 인간 CD8+ 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)를 각각 사용하여 건강한 인간 공여자로부터 일차 CD3+ 및 CD8+ T 세포를 분리하고 액체 질소에서 동결시켰다. 공동-배양 검정 당일에, CD3+ 또는 CD8+ T 세포를 해동시키고, 계수하고, 1 μM CFSE (Life Technologies)로 37℃에서 10분 동안 표지하였다. 이 배양 후, T 세포를 세척하고 10% 열-불활성화된 FBS, 글루타맥 스, 페니실린/스트렙토마이신, 비 필수 아미노산, 소듐 피루베이트 및 50 μM -메르캅토 에탄올이 보충된 RPMI를 포함하는 완전 배지에 T 세포를 재현탁시켰다. CHO-S OKT3 hPVRL2 세포를 배양물로부터 수확하고, 주기적으로 혼합하면서 37℃에서 1시간 동안 미토마이신 C로 처리하였다. 배양 후, 표적 세포를 철저히 세척하고, 계수하고, 완전한 RPMI 배지에 재현탁시켰다. 검정은 표적 세포 (20,000)와 T 세포 (100,000)의 5 : 1 비율로 설정되었다. 96-웰 U-바닥 플레이트 (Costar)에 표적 세포, T 세포 및 10 μg/ml의 각 항체 처리를 첨가하고 3일 (CD8+ T-세포) 또는 5일 (CD4+ T-세포) 동안 37℃에서 배양하였다. 항체 처리는 인간 CHA.7.518.1.H4 (S241P) IgG4 단독, 마우스 항-인간 TIGIT (클론 MBSA43, eBioscience)과 조합된 인간 IgG4 이소형 대조군 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 항-TIGIT (클론 MBSA43)의 조합을 포함하였다. 또한, 마우스 항-인간 DNAM-1 IgG1 (클론 DX11, BioLegend), 마우스 IgG1 이소형 대조군 (클론 MOPC21, BioLegend) 및 인간 IgG4 이소형 대조군의 활성도 평가되었다.
3일 또는 5일 배양 기간 후, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, TNFα 및 IFNγ을 포함하는 분비된 사이토카인에 대해 공동-배양 상청액을 세포계측 비드 어레이 (CBA) 인간 Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트 (BD Biosciences) 또는 LEGENDplexTM 인간 Th 사이토카인 키트 (BioLegend)로 분석하였다. T 세포 증식은 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 생/사 고정가능한 아쿠아 죽은 세포 염색 키트 (ThermoFisher Scientific), 항-CD4 항체 (클론 RPA-T4, BioLegend) 및 항-CD8 항체 (클론 HIT8a, BioLegend)으로 염색하고, 생존한 저CFSE 증식하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 백분율 상의 게이팅을 함으로써 측정되었다.. 데이타는 FACS Canto II (BD Biosciences)를 사용하여 얻었고 FlowJo (Treestar) 및 프리즘 (Graphpad) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
결과: CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 항-TIGIT 항체의 조합은 단일 항체 처리와 비교하여 CD4+ T 세포 증식을 증강시킨다: CHA.7.518.1.H4 (S241P) 인간화 하이브리도마-유래 PVRIG 항체가 항-TIGIT 항체와 결합할 때 시험관내에서 일차 CD4+ T 세포 증식을 증진시키는 것을 CHO-S OKT3 검정으로 평가하였다.
도 33a 및 33b는 CHO-S OKT3 hPVRL2 표적 세포와의 공동-배양에 반응하고 단독 또는 조합으로 항-PVRIG 및 항-TIGIT 항체로 처리된 두 개 상이한 공여자로부터의 증식하는 CD4+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 이들 두 개의 대표적인 인간 CD3+ T 세포 공여자에서, CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 항-TIGIT 항체의 조합은 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 단독 또는 IgG4 이소형과 항-TIGIT 항체의 조합과 비교하여 CD4+ T-세포 증식을 증가시킨다. 항-DNAM-1 항체는 두 공여자 모두에서 IgG1 이소형 대조군과 비교하여 CD4+ T 세포 증식을 감소시킨다.
CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 항-TIGIT 항체는 CD8+ T 세포 증식 및 IFN-g 분비를 증진시킨다. 도 34a는 CHO-S OKT3 검정에서 항-TIGIT 항체와 조합으로 CD8+ T 세포 증식을 증가시키는 인간화 PVRIG 항체인 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 능력을 도시하고 있다. 대표적인 인간 CD8+ T 세포 공여자에서, CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 항-TIGIT 항체의 조합은 T세포가 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양될 때 CD8+ T 세포 증식을 증가시킨다. 항-PVRIG 항체와 항-TIGIT 항체의 조합은 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 단독 또는 hIgG4 이소형+ 항-TIGIT 항체 처리보다 증식을 더 증가시킨다. 도 34b는 상기 기술된 바와 동일한 대표적인 인간 CD8+ T-세포 공여자에서, 항-TIGIT 항체와 조합한 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P)가 또한 CHO-S OKT3 검정에서 IFNγ 분비를 증진 시키는 보여준다. 항-PVRIG 항체와 항-TIGIT 항체의 조합은 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 단독 또는 hIgG4 이소형+ 항-TIGIT 항체 처리보다 INFg 분비를 더 증가시킨다. 항-DNAM-1 항체는 IgG1 이소형 대조군 항체와 비교하여 CD8+ T 세포 증식 및 IFNγ 생산 둘 다를 감소시킨다.
요약 및 결론
종합적으로, 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 항-TIGIT 항체는 일차 세포-기반의 CHO-S OKT3 검정에서 시험관내 기능적 활성을 가졌다. CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 항-TIGIT 항체의 조합은 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 또는 항-TIGIT 항체 단독을 사용한 처리와 비교하여 CD8+ T 세포로부터의 IFNγ 분비뿐만 아니라 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 증가시켰다. 종합하여, 이들 데이타는 두 개의 체크포인트 수용체인 PVRIG와 TIGIT의 공동-차단이 단일 수용체 차단과 비교하여 T 세포 기능을 증가시키는 것을 입증한다.
TIGIT는 CD112 (PVRL2; Zhu et. al., J. Exp. Med. (2016): 1-10의 도 4E 및 4F 참조)와 상호작용하지 않고 오히려 상이한 리간드인 PVR와 상호작용하는 것을 주목해야 한다. PVR은 주 등의 CHO/CD112 시스템에서 발현된다. 따라서, aCD112R (항-PVRIG 항체) 및 항-TIGIT의 조합 효과에 대한 우리의 해석은 aCD112R/aPVRIG가 인간 CD112R과 인간 CD112의 상호작용을 차단하지만, 항-TIGIT 항체는 인간 TIGIT와 인간 또는 햄스터 PVR (T 세포 또는 CHO 세포에서)의 상호작용을 차단하는 것이고, 주 등이 실제로 항-CD112R/항-TIGIT 조합 효과가 CHO CD112 검정에서 발생하는 이유에 관한 가설을 제시하지는 못한다. 즉, 조합 효과는 PVRL2/CD112 리간드 단독을 통한 것이 아니다.
D. 실시예 4: 시노몰거스 교차-반응성을 기초로 한 항-인간 PVRIG 항체의 에피토프 매핑
이론적 근거 및 목적
이 연구의 목적은 시노몰거스 원숭이 (cyno) 오르토체에 대한 항-인간 PVRIG 항체의 교차-반응성을 결정하는 PVRIG 단백질의 에피토프를 확인하는 것이다. 인간 PVRIG 표적에 대한 많은 항체는 많은 이들 항체가 동일한 에피토프 빈에 속함에도 불구하고 다양한 정도의 시노 교차-반응성을 나타낸다. 인간/시노 교차-반응성 (또는 이의 결여)의 분자적 기반을 밝히기 위해, PVRIG 재조합 단백질의 여러 시노-대-인간 돌연변이를 설계, 발현 및 정제하고, 항-인간 PVRIG 항체의 패널과 결합을 ELISA에서 테스트하였다.
방법
시노-대-인간 PVRIG 변이체의 설계: 인간 및 PVRIG ECD의 서열 정렬은 인간과 시노 오르토체 사이에 90%의 서열 동일성과 93%의 서열 상동성을 보여준다. 돌연변이의 특성 (보존 대 비보존) 및 돌연변이 영역의 이차구조 예측 (코일 대 연장)에 기초하여, 시노 PVRIG의 세 개의 부위-유도된 돌연변이체가 시노-교차 반응성에 중점을 둔 에피토프 맵핑을 탐지하도록 설계되었다. 이들 돌연변이체는 H61R, P67S 및 L95R/T97I 시노 PVRIG를 포함한다. 야생형 시노 및 인간 PVRIG도 역시 생성되었다.
시노, 인간 및 하이브리드 PVRIG 변이체의 발현 및 정제: 모든 PVRIG 변이체는 포유류 세포에서 C-말단 6XHis 태그를 갖는 ECD 융합으로서 발현되었다. 단백질을 친화 정제, 이온-교환 크로마토그래피 및 크기-배제 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 단백질을 PBS 완충액 (pH 7.4)으로 완충액-교환하고 4℃에서 보관하였다.
PVRIG-항체 상호작용을 결정하는 ELISA: 기능적 ELISA는 다음과 같이 수행하였다: 시노, 인간 및 시노/인간 하이브리드 PVRIG (His-태그화) 재조합 단백질을 IA 플레이트에 밤샘 동안 4℃에서 흡착시켰다. 코팅된 플레이트 웰을 PBS로 두 번 헹구고 실온 (RT)에서 1시간 동안 300 μL 차단 완충액 (PBS pH 7.4에서 5% 탈지분유)과 함께 배양하였다. 차단 완충액을 제거하고 플레이트를 PBS로 두 번 헹구었다. 플레이트-결합된 PVRIG 변이체를 1시간 동안 RT에서 용액 (50 μL/웰 부피에서 0.1 μg/mL 내지 8 μg/mL의 선형 범위)에서의 항-인간 PVRIG mAb (인간 IgG1 이소형)와 함께 배양하였다. 플레이트를 PBS-T (PBS 7.4, 0.05 % 트윈 20)로 세 번 세척한 다음, PBS로 세 번 세척하고 50 μL/웰의 HRP-컨쥬게이션된 이차 항체를 첨가하였다 (인간 IgG Fc 도메인 특이, Jackson ImmunoResearch). 이것을 1시간 동안 실온에서 배양하고 플레이트를 다시 세척하였다. ELISA 신호는 슈어블루 TMB 기질 (KPL Inc) 50 μL를 첨가하여 5 내지 20분 동안 배양함으로써 모든 웰에서 현상되었다. HRP 반응은 2 N H2SO4 (VWR) 50 μL를 첨가함으로써 정지되었으며, 450 nm에서의 흡광도 신호는 스펙트라맥스 (Molecular Devices) 또는 엔비전 (PerkinElmer) 분광광도계에서 판독되었다. 데이타는 엑셀 (Microsoft)로 전송되 그래프패드 프리즘 (GraphPad Software, Inc.)에 좌표화되었다.
결과
시노 교차-반응성의 결정인자로서의 S67, R95 및 I97 잔기: 도 18에 나타낸 결합 데이타는 S67, R95 및 I97 잔기가 다양한 항체의 시노 교차-반응성에 영향을 주는 것을 명백하게 보여준다. P67S의 시노-대-인간 돌연변이가 CPA.7.002와 CPA.7.041의 결합에 부정적인 영향을 미치는 반면, L95R/T97I의 시노-대-인간 돌연변이는 CPA.7.002, CPA.7.021, CPA.7.028 및 CPA.7.041의 결합을 유의하게 개선시킨다. 한편, H61R 시노-대-인간 돌연변이는 테스트된 임의의 항체의 결합에 영향을 미치지 않는다.
시노-대-인간 변이체와의 상대적 결합은 세 개의 에피토프 군을 제시한다: 시노, 인간 및 하이브리드 PVRIG 변이체에 대한 항체의 상대적 결합은 3개의 구별된 에피토프 군을 제시한다: 1군은 R95/I97 잔기에 결합한다 (CPA.7.021 및 CPA.7.028). 2군은 S67 및 R95/I97 잔기 (CPA.7.002 및 CPA.7.041)에 결합한다. 3군은 S67 또는 R95/I97 잔기 (CPA.7.024 및 CPA.7.050)에 결합하지 않는다. 에피토프 군은 이들 항체의 시노 교차-반응성 정도와 강한 상관 관계를 나타낸다 (도 19).
요약 및 결론: PVRIG ECD에서의 시노-인간 변화에 기초한 제한된 에피토프 매핑은 항-인간 PVRIG 항체의 시노 교차-반응성의 결정인자로서 S67, R95 및 I97 잔기를 확인하였다. CPA.7.021 및 CPA.7.028 항체의 L95R/T97I 시노 PVRIG에 대한 결합의 완전한 복원 및 CPA.7.002의 이 돌연변이체에 대한 결합 개선은 R95 및 I97 잔기가 이들 항체의 결정적인 인간 PVRIG 에피토프임을 강력히 시사한다. 이들 발견은 또한 일차 아미노산 서열에 기초한 비-인간 영장류 PVRIG 오르토체에 대한 교차-반응성을 예측하는 가능한 방법을 제시한다.
E. 실시예 5: 인간화 항체: 인간화 항-PVRIG 하이브리도마-유래된 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 결합 및 수용체-리간드 차단 분석
이 실험은 서로와 비교하여 Jurkat 세포에서 발현된 PVRIG 항원과의 결합의 경쟁을 평가함으로써 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 세포주 및 원발성 백혈구 상의 인간 및 시노몰거스 PVRIG 단백질에 대한 결합을 특성화하고, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)가 PVRIG와 PVRL2 사이의 상호작용을 차단하는 능력을 특성화하고, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 에피토프 공간을 특성화하기 위해 전개되었다.
hPVRIG 과다발현 세포의 FACS 분석: 다음의 세포주를 사용하여 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 특이성을 평가하였다: HEK 모체 및 HEK hPVRIG 과다발현 세포. 이들 세포를 DMEM (Gibco) + 10% 우태아 혈청 (Gibco) + 글루타맥스 (Gibco)에서 배양하였다. hPVRIG를 과다발현하는 HEK 세포의 경우, 0.5 μg/ml 퓨로마이신 (Gibco)도 또한 양성 선별을 위해 배지에 첨가하였다. FACS 분석을 위해, 모든 세포주를 로그 성장기에서 수확하고, 웰 당 50,000 내지 100,000개의 세포를 96 웰 플레이트에 접종하였다. 미컨쥬게이션된 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) (hIgG4) 및 이들 각각의 대조군의 결합을 얼음 상에서 10 μg/ml로 시작하는 8개-지점 일련 적정에서 30분 내지 1시간 동안 평가하였다. 일련 적정은 3배 일련 희석으로 수행하였다. 미컨쥬게이션된 일차 항체는 항-인간 Fc Alexa 647 컨쥬게이션된 항체 (Jackson Laboratories)로 검출하였다. 데이타는 FACS Canto II (BD Biosciences), FACS LSR 포르테사 X-20 (BD Biosciences) 또는 IntelliCyt (IntelliCyt Corporation)를 사용하여 획득하고 FlowJo (Treestar) 및 프리즘 (Graphpad) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
hPVRIG에 대한 인간 세포주의 FACS 분석: 다음의 세포주를 사용하여 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 발현 및 특이성을 평가하였다: Jurkat 및 HepG2. Jurkat 세포는 RPMI 배지+ 10% 우태아 혈청, 글루타맥스, 비-필수 아미노산 (Gibco), 나트륨 피루 베이트 (Gibco), 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco)에서 배양하였다. HepG2 세포를 DMEM + 10% 우태아 혈청+ 글루타맥스에서 배양하였다. FACS 분석을 위해, 모든 세포주를 로그 성장기에서 수확하고, 웰 당 50,000 내지 100,000개의 세포를 96 웰 플레이트에 접종하였다. 미컨쥬게이션된 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) (hIgG4) 및 이들 각각의 대조군의 결합을 얼음 상에서 10 μg/ml로 시작하는 8개-지점 일련 적정에서 30분 내지 1시간 동안 평가하였다. 미컨쥬게이션된 일차 항체는 항-인간 Fc Alexa 647 컨쥬게이션된 항체로 검출되었다. 일련 적정은 3배 일련 희석으로 수행하였다. FACS Canto II 또는 IntelliCyte를 사용하여 데이타를 수집하고 FlowJo 및 프리즘 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
CMV-증식 CD8 T 세포 상의 PVRIG의 FACS 분석: CMV 반응성 공여자는 CTL (Cellular Technology Limited)로부터 구입하였다. 공급된 PBMC를 10 μM CMV 펩타이드 494-503 (NLVPMVATV, Anaspec)으로 2시간 동안 펄스 처리시켰다. 이어서 PBMC를 세 번 세척한 후 RPMI + 10% 인간 AB 혈청 (Sigma), 글루타맥스, 페니실린/스트렙토마이신 및 2 ng/ml IL-2 (R & D Systems) 및 10 ng/ml IL-7 (R & D Systems)로 구성된 사이토카인 성장 칵테일에서 9일 동안 24 웰 플레이트에 도말하였다. 9일 후, 비-부착성 세포를 수확하고, CD8 T 세포 농축을 위해 표현형을 정하고, 액체 질소에 저장하였다.
CMV-증식된 CD8 T 세포 상의 발현을 평가하기 위해, 미컨쥬게이션된 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) (hIgG4) 및 이들 각각의 대조군의 결합을 얼음 상에서 666 nM로 시작하는 8개-지점 일련 적정에서 30분 내지 1시간 동안 평가하였다. 일련 적정은 4배 일련 희석으로 수행하였다. 미컨쥬게이션된 일차 항체는 항-인간 Fc Alexa 647 컨쥬게이션된 항체로 검출하였다. FlowJo 및 프리즘 소프트웨어를 사용하여 데이타를 분석하고 BD LSR 포르테사 X-20에서 수집하였다.
시노몰거스 hPVRIG 조작된 과다발현 세포의 FACS 분석: 다음의 세포주를 사용하여 시노몰거스 PVRIG (cPVRIG)와 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 교차-반응성을 평가하였다: expi 모체 및 expi cPVRIG 과다발현 세포. 이들 세포를 DMEM + 10% 우태아 혈청+ 글루타맥스에서 배양하였다. expi cPVRIG 일시적 과다발현 세포는 네온 형질전환 시스템을 이용하여 cPVRIG DNA를 모체 expi 세포 내에 전기천공시킴으로써 생성되었다. FACS 분석을 위해, expi cPVRIG 세포를 형질감염 후 1 내지 3일 사이에 사용하였다. 모체 expi 세포는 로그 성장기에서 수확하였다. 각 유형의 웰 당 50,000 내지 100,000개 세포를 96 웰 플레이트에 접종하였다. 미컨쥬게이션된 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) (hIgG4) 및 이들 각각의 대조군의 결합을 얼음 상에서 10 μg/ml로 시작하는 8개-지점 일련 적정에서 30분 내지 1시간 동안 평가하였다. 일련 적정은 3배 일련 희석으로 시행하였다. 미컨쥬게이션된 일차 항체는 항-인간 Fc Alexa 647 컨쥬게이션된 항체로 검출하였다. FACS Canto II 또는 IntelliCyte를 사용하여 데이타를 수집하고 FlowJo 및 프리즘 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
세포-기반의 수용체-리간드 차단 검정: PVRIG와 이의 리간드 PVRL2의 상호작용을 억제하는 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 능력을 두 가지 배향으로 시행된 세포 경쟁 검정법에서 평가하였다.
제 1 배향에서, PVRL2는 조작되지 않은 HEK 세포에서 내인성으로 발현되고, HEK 세포에 용해성 바이오틴화된 PVRIG Fc 결합을 차단하는 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 능력을 측정하였다. 보다 구체적으로, 바이오틴화된 PVRIG Fc 단백질 (33nM) 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) (1.03 내지 198 nM, hIgG4)를 100,000개의 HEK 세포에 동시 첨가하고 얼음 위에 1시간 동안 배양하였다. 바이오틴화된 PVRIG Fc 결합의 정도는 스트렙타비딘 알렉사647 (Jackson Laboratories)을 얼음 위에서 20 내지 30분 동안 첨가함으로써 연속적으로 검출되었다. 세포를 FACS Canto II를 사용하여 획득하기 위해 PBS로 두 번 세척하였다. FlowJo, 엑셀 (Microsoft) 및 프리즘을 사용하여 데이타를 분석하였다.
제 2 배향에서, HEK 세포는 인간 PVRIG (HEK hPVRIG)를 발현하도록 조작되었고, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) (hIgG4)의 용해성 인간 PVRL2 Fc를 억제하는 능력을 평가하였다. 보다 구체적으로, HEK hPVRIG 세포를 얼음 위에서 30분 동안 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) (0.66 내지 66 nM)로 미리 배양한 후, PVRL2 mFc (마우스 Fc를 갖는 인간 PVRL2)를 첨가하고 (얼음 위에서 1시간 동안) HEK hPVRIG에 결합하는 그의 능력을 측정하였다. 얼음 위에서 20 내지 30분 동안 염소 항-마우스 Fc A647 (Jackson Laboratories)을 후속 첨가하여 PVRL2 mFc 결합의 정도를 검출하였다. 세포를 FACS Canto II를 사용하여 획득하기 위해 PBS로 두 번 세척하였다. FlowJo, 엑셀 및 프리즘을 사용하여 데이타를 분석하였다.
세포 기반의 에피토프 공간 분석: CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 에피토프 공간은 Jurkat 세포와의 결합을 다른 것과 경쟁하는 이들 능력에 대해 평가되었다. 간략하게, Jurkat 세포를 로그 성장기에서 수확하여 얼음 위에서 30분 동안 g/ml의 미표지된 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)로 염색하였다. 이어서 Jurkat 세포는 회전 침전시키고, 세척하여 얼음 위에서 30분 동안 g/ml Alexa647-표지된 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)로 반대염색하였다. Jurkat 세포에서 PVRIG 결합에 대해 미표지된 항체와 표지된 항체의 경쟁은 유동 세포계측법에 의한 Alexa 647 신호의 크기에 의해 평가되었다. FACS Canto II를 사용하여 데이타를 수집하고 FlowJo, 엑셀 및 프리즘을 사용하여 분석하였다.
결과
CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 과다발현 세포, Jurkat 세포 및 인간 T 세포 상에서 PVRIG를 인식한다: CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 인간화 하이브리도마-유래 PVRIG 항체의 인간 PVRIG에 결합하는 능력을 인간 PVRIG, Jurkat 세포 및 일차 T 세포를 과다발현하는 HEK 세포를 사용하여 평가하였다. 도 20은 CHA.7.518.1.H4 (S241P) (A) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) (B) 둘 다의 특이성을 나타낸다. 둘 다의 항체는 HEK hPVRIG 세포에 매우 특이적으로 결합하고, HEK 모체 세포에는 결합하지 않는다.
결합 친화성: CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 둘 다는 관련된 Kd 값과 함께 높은 친화성으로의 HEK hPVRIG 세포에 대한 결합도 역시 나타낸다: HEK hPVRIG 세포에 결합하기 위한 0.29 nM의 CHA.7.518.1.H4(S241P) 및 0.86 nM의 CHA7.538.1.2.
도 21은 내인성으로 PVRIG를 발현하는 Jurkat 세포에 결합하는 CHA.7.518.1.H4 (S241P) (A) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) (B)의 능력을 도시한다. 둘 다는 HEK hPVRIG 세포에 대한 비슷한 친화성으로 Jurkat 세포에 결합할 수 있다.
Jurkat 세포에 대한 이들 항체의 친화성은 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 경우 0.15nM이고 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 경우 0.59nM이다.
도 22는 CMV 펩타이드 (494-503, NLVPMVATV)에 노출에 의해 증식되고 내인성으로 PVRIG를 발현하는 CD8 T 세포에 결합하는 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 능력을 도시한다.
CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 expi 세포 상에 발현된 시노몰거스 PVRIG (cPVRIG)를 검출한다: cPVRIG에 결합하는 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 능력은 cPVRIG를 과다발현하는 expi 세포를 사용하여 평가하였다. 도 23은 CHA.7.518.1.H4 (S241P) (A) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) (B) 둘 다의 특이성을 나타낸다. 둘 다의 항체는 expi hPVRIG 세포에 매우 특이적으로 결합하고, expi 모체 세포에는 결합하지 않는다. CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 둘 다는 관련된 Kd 값과 함께 높은 친화성으로의 expi hPVRIG 세포에 대한 결합도 역시 나타낸다: CHA.7.518.1.H4(S241P)의 경우 0.24 nM 및 CHA7.538.1.2의 경우 0.58 nM.
세포-기반의 수용체-리간드 차단 검정: PVRIG와 PVRL2의 상호작용을 억제하는 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 능력을 프로토콜 섹션에서 개략된 바와 같이 두 가지 배향으로 평가하였다. 제 1 순열에서, CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 PVRIG Fc의 HEK 세포에 대한 결합을 완전히 억제할 수 있었다 (도 24a). 이 차단 능력과 관련된 IC50 값은 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 경우 15 nM이고 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 경우 16.1 nM이다. 중요하게, PVRIG에 결합하는 것으로 확인된 하이브리도마로부터 유래한 모든 항체가 PVRIG Fc의 HEK 세포와의 결합을 차단할 수는 없다. 도 24B에 나타낸 바와 같이, CHA.7.544로 명명된 항체 클론은 PVRIG Fc와 HEK 세포의 결합을 차단할 수 없다.
제 2 순열에서, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 모두 PVRL2 Fc와 HEK hPVRIG 세포의 결합을 완전히 억제할 수 있었다 (도 25a). 이 억제와 관련된 IC50 값은 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 경우 1.8 nM이고 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 경우 2.53 nM이다. CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 능력은 이 순열에서 PVRL2 Fc 결합을 완전히 억제할 수 있었고, 제 1 순열에서 PVRIG Fc 결합을 억제하는 능력과 부합함에도 불구하고 다른 항체는 이와 동일한 경향을 보이지 않았다. 보다 구체적으로, PVRIG Fc와 HEK 세포의 결합을 완전히 억제할 수 있는 또 다른 인간화 하이브리도마-유래 항체, CHA.7.530.3 (제 1 순열, 데이타 미도시)은 HEK hPVRIG 세포에 결합하는PVRL2 Fc의 결합을 완전히 억제할 수 없었다 (도 25a). 종합적으로, 이 데이타는 세포-기반의 수용체 리간드 차단 검정의 제 2 순열이 수용체-리간드 차단 항체의 효능을 제 1 순열과 비교하여 더 민감하게 구별할 수 있음을 가리킨다. 중요하게도, CHA.7.544는 HEK 세포에 대한 PVRIG Fc 결합을 차단할 수 없는 것과 부합하여, HEK hPVRIG 세포에 대한 PVRL2 Fc의 결합을 차단할 수 없는 것으로 나타났다 (도 25b).
세포 기반의 에피토프 공간 분석: 프로토콜 섹션에서 개략된 바와 같이, CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 에피토프 공간 분석은 PVRIG 결합을 경쟁할 수 있는 능력을 평가함으로써 시행되었다. 도 26은 동일한 항체의 Alexa 647 (A647) 컨쥬게이션된 버전의 결합을 억제하는 항체의 미 컨쥬게이션된 버전의 능력을 나타낸다. 도 26의 데이타는 경쟁없이 수득한 최대 신호와 비교하여 A647 컨쥬게이션된 항체의 결합 백분율 나타낸다. CHA.7.518.1.H4 (S241P) A647 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) A647로부터 수득된 신호는 이소형 대조군과 Jurkat 세포의 사전-배양에 영향을 받지 않았다 (데이타 미도시). 예상된 바와 같이, CHA.7.518.1.H4 (S241P) A647 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) A647로부터 생성된 신호는 그들의 미컨쥬게이션된 버전과의 경쟁할 때 유의하게 감소되었다 (데이타 미도시). 흥미롭게도, 반대 항체의 미컨쥬게이션된 버전과의 사전-배양과 관련하여 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)로부터의 A647 신호를 분석한 결과, 유의한 감소가 역시 있었다. 이는 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)가 내인성으로 발현된 PVRIG 상에 유사한 에피토프 공간을 공유할 수 있음을 가리킨다.
요약 및 결론: CHA.7.518 및 CHA.7.538로 명명된 항-PVRIG 항체의 마우스 버전은 인간 IgG4 이소형 (CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)) 내로 성공적으로 인간화되었고, 인간 PVRIG 항원에 대한 결합 성질을 보유하였다. 조작된 과다발현 세포, Jurkat 및 CMV 증식된 일차 CD8 T 세포를 사용하여, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 내인성 인간 PVRIG에 매우 특이적이고 높은 친화성으로 결합하는 것으로 나타났다. 또한, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 시노 PVRIG 항원에 대한 반응성도 나타내었고, 높은 친화성으로 과다발현 세포에 결합하였다. 기능적으로, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 FACS-기반의 검정법에서 PVRIG와 PVRL2의 상호작용을 억제할 수 있었다. 마지막으로, CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 Jurkat 세포에 대한 결합을 서로 경쟁하는 능력으로 인해 내인성 인간 PVRIG 상에 에피토프 공간을 잠재적으로 공유하는 것으로 나타났다.
F. 실시예 6: 인간 항체: 인간화 항체의 기능적 분석
본 발명의 여러 인간화 항체의 기능적 활성을 확인하였다.
CHO-S OKT3 검정: CHO-S OKT3 검정을 이용하여 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4(S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4(S241P)이 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식 및 사이토카인 분비를 증진시킬 수 있는지 여부를 결정하였다. 공동-배양 검정에 사용된 표적 세포는 항-인간 CD3 항체 클론 OKT3 (OKT3라고 약칭됨)의 단일 사슬 가변 단편를 안정적으로 과다발현하거나 OKT3 및 인간 PVRL2 (hPVRL2라고 약칭됨) 둘 다를 안정적으로 과다발현하는 중국 햄스터 난소 세포주 CHO-S (ATCC)이었다. CHO-S OKT3 모체 세포를 40 mM 글루타맥스 (Gibco), 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco) 및 6 μg/ml 퓨로마이신 (Gibco)이 보충된 무-혈청 CD-CHO 배지 (Gibco)에서 성장시켰다. CHO-S OKT3 hPVRL2 세포를 모체 세포와 동일한 CD-CHO 배지에서 성장시켰지만 600 μg/ml 하이 그로마이신 B (Gibco)도 역시 보충하였다.
RosetteSepTM 인간 CD4+ T 세포 농축 칵테일 (Stemcell Technologies) 및 인간 CD8+ 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)를 각각 사용하여 건강한 인간 공여자로부터 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 분리하고 액체 질소에서 동결시켰다. 공동-배양 검정 당일에, CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 해동시키고, 계수하고, 1 μM CFSE (Life Technologies)로 37℃에서 10분 동안 표지하였다. 이 배양 후, T 세포를 세척하고 10% 열-불활성화된 FBS, 글루타맥 스, 페니실린/스트렙토마이신, 비 필수 아미노산 (Gibco), 소듐 피루베이트 (Gibco) 및 50 μM β-메르캅토 에탄올 (Gibco)이 보충된 RPMI (Gibco)를 포함하는 완전 배지에 T 세포를 재현탁시켰다. CHO-S OKT3 및 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포를 배양물로부터 수확하고, 주기적으로 혼합하면서 37℃에서 1시간 동안 미토마이신 C (Sigma-Aldrich)로 처리하였다. 배양 후, 표적 세포를 철저히 세척하고, 계수하고, 완전한 RPMI 배지에 재현탁시켰다. 검정은 표적 세포 (20,000)와 T 세포 (100,000)의 5 : 1 비율로 설정되었다. 96-웰 U-바닥 플레이트 (Costar)에 표적 세포, T 세포 및 10 μg/ml의 각 항체 처리를 첨가하고 3일 (CD8+ T-세포) 또는 5일 (CD4+ T-세포) 동안 37℃에서 배양하였다. PVRIG 항체 처리는 인간 CHA.7.518.1.H4 (S241P) IgG4, 인간 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) IgG4, 인간 CHA.7.530.3 IgG4 (부분적 수용체/리간드 차단 항체) 및 마우스 CHA .7.544 IgG1 (비-수용체/리간드 차단 항체)를 포함하였다. PVRIG 항체에 추가하여, 마우스 항-인간 DNAM-1 IgG1 (클론 DX11, BioLegend), 마우스 IgG1 이소형 대조군 (클론 MOPC21, BioLegend) 및 인간 IgG4 이소형 대조군의 활성도 평가되었다. 항체 용량-적정을 위해, PVRIG 항체의 66 nM 내지 0.264 nM 범위의 3배 희석 및 각각의 이소형 대조군 항체를 사용하였다.
3일 또는 5일 배양 기간 후, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, TNFα 및 IFNγ을 포함하는 분비된 사이토카인에 대해 공동-배양 상청액을 세포계측 비드 어레이 (CBA) 인간 Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트 (BD Biosciences) 또는 LEGENDplexTM 인간 Th 사이토카인 키트 (BioLegend)로 분석하였다. T 세포 증식은 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 생/사 고정가능한 아쿠아 죽은 세포 염색 키트 (ThermoFisher Scientific), 항-CD4 항체 (클론 RPA-T4, BioLegend) 및 항-CD8 항체 (클론 HIT8a, BioLegend)으로 염색하고, 생존한 저CFSE 증식하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 백분율 상의 게이팅을 함으로써 측정되었다.. 데이타는 FACS Canto II (BD Biosciences)를 사용하여 얻었고 FlowJo (Treestar) 및 프리즘 (Graphpad) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
결과
CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 hPVRL2-의존적 방식으로 CD4 + T 세포 증식을 증진시킨다: CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 인간화 하이브리도마 유래 PVRIG 항체의 시험관내에서 일차 CD4+ T 세포 증식을 증진시키는 능력을 CHO-S OKT3 검정으로 평가하였다. 도 27a는 CHO-S OKT3 hPVRL2 표적 세포 및 상이한 PVRIG 항체와의 공동-배양에 반응하여 대표적인 공여자로부터의 증식하는 CD4+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 이 공여자에서, 인간화 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 항체는 인간 IgG4 이소형 대조군 (점선)과 비교하여 CD4+ T 세포 증식을 증가시킨다. 부분적 수용체/리간드 차단 항체인 인간 CHA.7.530.3 IgG4는 T 세포 증식을 단지 약하게 증진시키는 한편, 비-수용체/리간드 차단 항체인 마우스 CHA.7.544 IgG1은 이소형 대조군 항체와 비교하여 효과가 없다. 항-DNAM-1 항체는 CD4+ T 세포 증식을 감소시킨다. 도 27b는 인간화 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) PVRIG 항체 및 항-DNAM-1 항체의 표적 세포에 미치는 효과가 hPVRL2 과다발현에 의존적임을 입증한다. CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.1 항체 처리 후, CD4+ T 세포가 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 함께 공동-배양될 때 CHO-S OKT3 모체 세포와 공동-배양과 비교하여 CD4+ T 세포 증식의 더 큰 증가가 관찰된다. 유사하게, 항-DNAM-1 항체는 T 세포가 hPVRL2-발현 CHO-S OKT3 세포와 공동-배양될 때 단지 CD4+ T 세포 증식을 감소시킨다.
CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 CD8+ T 세포 증식 및 IFN-g 분비를 증진시킨다: 도 28a 내지 28b는 CHO-S OKT3 검정에서 CD8+ T 세포 증식을 증가시키는 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 능력을 설명한다. 두 명의 상이한 인간 CD8+ T 세포 공여자에서, CHA.7.518.1.H4(S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4(S241P) 항체는 T세포가 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양될 때 인간 IgG4 이소형 대조군과 비교하여 CD8+ T 세포 증식을 증가시킨다. 그러나, 마우스 CHA.7.544 IgG1은 효과가 거의 또는 전혀 없다. CD4+ T 세포에서 관찰된 바와 같이, 항-DNAM-1 항체는 CD8+ T 세포 증식을 감소시킨다. 도 28c는 인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)가 또한 CHO-S OKT3 검정에서 IFNγ 분비를 증진시키는 것을 보여준다. 세 명의 상이한 인간 CD8+ T-세포 공여자에서, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 항체는 인간 IgG4 이소형 대조군 (점선)과 비교하여 IFNγ 생산을 증가시킨다. CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 항체 처리 후에도 IL-10, IL22 및 TNFα의 증가가 역시 관찰되었다 (데이타 미도시).
CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 복수의 인간 공여자를 통해 지속적으로 CD4+ T 세포 증식을 증진시킨다: 다음으로, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA .7.538.1.2.H4 (S241P) 항체는 재현가능하게 T 세포 기능을 증진시킬 수 있었고, CD4+ T 세포 증식에 미치는 인간화 PVRIG 항체의 효과가 CHO-S OKT3 검정에서 11명의 상이한 공여자를 통해 조사되었다. 도 29는 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 둘 다가 T 세포가 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 공동-배양될 때 인간 IgG4 이소형 대조군 항체와 비교하여 대다수의 테스트된 공여자에서 CD4+ T 세포 증식을 지속적으로 증가시키는 것을 입증한다. 또한, 부분적 수용체/리간드 차단 항체, CHA.7.530.3 및 비-수용체/리간드 차단 항체 CHA.7.544는 동일한 공여자를 통해 CD4+ T 세포 증식을 지속적으로 증진시키지 못한다.
CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식에 미치는 용량-의존적 효과를 갖는다: 마지막으로, 인간화 PVRIG 항체 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)의 용량-의존적 효과를 CHO-S OKT3 검정법으로 측정하였다. CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 항체의 용량을 감소시키면 CD4+ T 세포 (도 30a) 및 CD8+ T 세포 (도 30b)의 증식 백분율은 T 세포를 CHO-S OKT3 hPVRL2 세포와 함께 공동-배양할 때 감소한다. T 세포 증식에 미치는 이 용량-의존적 효과는 CHA.7.544 항체 또는 IgG4 이소형 대조군 모두에서 관찰되지 않는다. 또한, 용량 적정에 의한 이중상 효과는 관찰되지 않았으며, 이는 인간화 PVRIG 항체의 작동제 활성의 결여를 시사한다.
요약 및 결론
인간화 PVRIG 항체, CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 일차 세포-기반의 CHO-S OKT3 검정에서 시험관내 기능적 활성을 가졌다. CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 모두 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 용량- 의존적 방식으로 증가시켰다. CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 또한 CHO-S OKT3 검정에서 IFNγ 분비를 증강시킬 수 있었다. CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) 항체의 활성은 표적 세포 상의 hPVRL2의 과다발현에 의존적인 것으로 밝혀졌다. CHA.7.518.1.H4 (S241P) 및 CHA.7.538.1.2.H4 (S241P)는 복수의 인간 공여자를 통해 일관되게 T 세포 활성을 증진시켰던 반면, 비-차단 CHA.7.544 항체는 거의 또는 전혀 효과가 없었다.
G. 실시예 7: 마우스 PVRIG를 위한 마우스 단일클론 항체의 개발
마우스 단일클론 항체 (mAb)의 개발은 Aldevron Freiburg (Germany)에서 수행되었다. DNA 면역화 기술을 이용하여 마우스 PVRIG 단백질에 대한 항체를 생성하였다. 마우스 PVRIG를 발현하는 면역화 벡터가 숙주 유기체 (래트) 내에 도입되었다. 마우스 PVRIG가 발현되었고, 면역화 반응이 생성되었다. 양성 항혈청 확인 및 하이브리도마 스크리닝을 마우스 PVRIG를 일시적으로 발현하는 세포 상에서 분석하였다.
래트 항-마우스 PVRIG pAb 생성
마우스 PVRIG 단백질에 대한 래트 다중클론 항체의 개발은 마우스 PVRIG 세포외 도메인의 Aldevron 독점 면역화 벡터로의 클로닝 및 전장 및 세포외 도메인의 Aldevron 독점 스크리닝 벡터 내로의 클로닝을 포함하였다. 면역화 및 스크리닝에 사용된 다양한 발현 벡터를 마우스 PVRIG를 일시적으로 발현하는 세포 상의 FACS에 의해 검증하였다. 세 마리의 래트를 이어서 면역화 벡터로 면역화시켰다. 면역 혈청을 채취하고 희석된 혈청을 스크리닝 벡터로 일시적으로 형질감염된 세포를 사용하여 FACS에 의해 테스트하였다. 각 래트로부터의 생산 혈액을 수집하고, 단백질-A를 사용하여 정제를 수행하였다.
래트 항-마우스 PVRIG mAb 생성
래트 림프구의 융합 및 Aldevron의 테스트 시스템을 이용한 선별을 수행하였다. 이것은 20 x 96-웰 플레이트의 융합 이후에 마우스 PVRIG ECD (세포외 도메인) 또는 FL (전장)으로 일시적으로 형질감염된 세포에 세포 기반의 ELISA (cELISA)에 의한 초기 스크리닝을 포함한다. 108개의 양성 클론 (마우스 PVRIG ECD \\ FL을 발현하는 세포에 결합)을 추가로 증식시키고, 재테스트하였다. 30개의 양성 클론을 T-25 플라스크 내에 증식시키고, 상청액을 세포 기반의 ELISA에서 테스트하였다. 23개의 하이브리도마 클론을 추가 서브클로닝을 위해 선택하였다. 무-혈청 상청액은 cELISA 및 FACS에 의해 테스트하였다. 총 21개의 클론이 생성되었고 마우스 PVRIG 단백질을 과다발현하는 세포에서 결합이 확인되었다.
Ab 특성화
래트 항-마우스 PVRIG 테스트 혈액, 정제된 pAb, 전-클론 및 클론성 상청액 및 정제된 단일클론 항체의 결합을 마우스 PVRIG를 과다발현하는 안정한 HEK293 세포를 사용한 유동 세포계측법으로 분석하였다. 마우스 PVRIG를 내인성으로 발현하는 D10.G4.1 세포에 대한 항체의 결합도 역시 테스트하였다. 마우스 PVRIG의 특이적 세포 표면 발현이 검증되었다. 세포 (1 내지 2 × 105개)는 PBS에서 1 : 1000로 희석된 고정가능한 생존능 염색으로 10분 동안 RT에서 세포를 염색한 이후 PBS로 세척하였다. 이어서 Ab를 세포 (FACS 완충액으로 희석됨)에 첨가한 후 염소 항-래트-PE (FACS 완충액에서 1 : 100로 희석됨)로 염색하였다.
mAb 특이성은 마우스 PVRIG를 내인성으로 발현하는 D10.G4.1 세포주의 PVRIG 형질감염을 위한 siRNA로 테스트하였다. 마우스 PVRIG 녹다운이 관찰된 후 세포 표면의 감소가 관찰되었다.
NK 세포에 결합하는 mAb는 FACS에 의해 역시 테스트되었다.
mAb 다양성을 입증하기 위해 비닝 검정을 수행하였다.
정제된 단일클론 항체 (Kd)의 친화성은 마우스 PVRIG를 과다발현하는 안정한 세포 대비 빈 벡터 형질전환 세포 및 D10.G4.1 세포주에서 FACS 적정에 의해 결정되었다. 세포 (1 × 105개)는 PBS에서 1 : 1000로 희석된 고정가능한 생존능 염색으로 10분 동안 RT에서 세포를 염색한 이후 PBS로 세척하였다. 이어서 Ab를 세포 (8개 농도 - 1 : 3 일련 희석, FACS 완충액으로 희석된 10 내지 0.01 μg/ml )에 첨가한 후 염소 항-래트-PE (FACS 완충액에서 1 : 100로 희석됨)로 염색하였다.
단일클론 항체 특성화 - 요약 표
표 7 (1 내지 10열)은 항-마우스 PVRIG 항체의 특성화를 위해 생성된 데이타를 요약한다.
● 1열은 Ab 코드 ID를 나타낸다.
● 2열은 Aldevron이 제공한 Ab 명칭을 나타낸다.
● 3열은 10 μl/ml 단일클론 항체 농도에서 빈 벡터 형질전환 세포 대비 안정한 과다발현 세포 상의 MFI 비율로서 FACS 데이타를 나타낸다.
● 4열은 과다발현 HEK 세포 상의 친화성 (nM)를 나타낸다.
● 5열은 10 μg/ml 단일클론 항체 농도에서 NK 세포에 대한 결합을 나타낸다.
● 6열은 이소형 대조군 대비 D10.G4.1 세포주의 결합의 MFI 비율을 나타낸다.
● 7열은 D10.G4.1 세포주에 대한 친화성 (nM)을 나타낸다.
● 8열은 에피토프 비닝 검정에서 다양한 빈을 나타낸다.
● 9열은 수용체-리간드 차단 검정% (마우스 PVRL2 과다발현 세포에 결합하는 마우스 PVRIG-Fc 융합 단백질) 및 IC50 (nM)을 나타낸다.
● 10열은 수용체-리간드 차단 검정% (마우스 PVRIG 과다발현 세포에 결합하는 마우스 PVRL2-Fc 융합 단백질) 및 IC50 (nM)을 나타낸다.
AB-406 및 AB-407은 수용체-리간드 결합 검정에서 차단 활성이 상대적으로 높은 친화성을 가지고, NK 및 D10.G4.1 세포에 결합하는 점을 입증하였다.
이들 Ab는 TME 발현 및 생체내 연구를 위해 선택되었다.
Figure 112019022434593-pct00008
H. 실시예 8: 추가적인 면역 체크포인트 억제제로의 조합 테스트
배경
CTLA4와 PD1 경로의 항체 차단이 암에 대한 효과적인 치료 양식으로 등장했던 반면, 대다수의 환자는 장기적인 이점을 얻지 못하여 추가적인 면역 체크포인트의 표적화의 필요성을 시사한다. 본 발명자의 독특한 계산 알고리즘을 채용하여 B7/CD28 패밀리의 새로운 구성원을 정의했으며, T 및 NK 세포의 복수의 하위집합으로 표현되는 PVRIG를 확인하였다. 본 발명자는 본원에서 이 분자를 표적하는 차단 항체의 발현 양상, 기능적 특성화 및 항-종양 활성을 보고한다.
방법
예측 발견 플랫폼을 활용하여 PVRIG는 잠재적인 새로운 면역 체크포인트으로서 확인되었으며, 이후 레트로바이러스 세포 스크리닝 라이브러리를 사용하여 이의 동족체 결합 대상을 확인하였다. T-세포 조절에 미치는 표적 효과는 표적 과다발현, 녹다운 및 길항제 항체 접근법을 이용하여 일차 및 종양-유래 T-세포 검정으로 평가하였다. 인간 단백질에 대한 항체를 시험관내에서 T- 세포 활성화를 증진시키는 능력에 대해 스크리닝하는 한편, 마우스 오르토체를 표적하는 항체를 동종 모델에서 종양 성장 억제에 미치는 효과에 대해 생체내 평가하였다
결과
PVRIG-Fc- 융합 단백질은 PVRL2에 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 결합 특이성은 ELISA 및 유동 세포 측법 분석에 의해 검증되었다. PVRIG는 NK 세포 및 γδ T-세포뿐만 아니라 기억 T-세포 상의 표적 검출로 T-세포 활성화 시 독특한 발현 동력학을 입증하였다. PVRL2와 PVRIG의 상호작용을 차단하는 능력을 가진 고친화성 인간 항체 패널을 생성하였으며, 시험관내에서 테스트된 때 PVRL2-의존적 기작을 통해 일차 CD4+ 및 종양-유래 CD8+ T- 세포 둘 다의 활성화를 증진시키는 것으로 나타났다.
CHA.7.518.1.H4 (S241P)는 마우스 교차-반응성이 아니기 때문에, 생체내 연구를 대리 차단화 항-마우스 PVRIG 항체로 수행하였다.　 항-PDL-1 차단과 조합될 때, 항-마우스 PVRIG는 CT26 및 MC38 결장직장암 모델 모두에서 확립된 종양의 성장을 억제한다.　 추가적인 면역 체크포인트 억제제뿐만 아니라 PVRIG 녹아웃 마우스와의 조합 테스트가 진행 중이다.
결론
고친화성 길항제 항체는 인간 T- 세포 활성화를 증진시킬 수 있고, 유사한 특징을 갖는 대리 항체는 복수의 동족 모델에서 생체내 PD-L1과의 상승 작용을 나타낸다. 전반적으로, 본 발명자의 데이타는 암 치료를 위한 다른 B7 패밀리 체크포인트에 추가하여 PVRIG를 표적하는 유용성을 보여준다
I. 실시예 9: 생체내 POC 연구: CT26 종양 모델에서 항 MPVRIG MAB의 효능
본 실시예는 단일-요법 또는 항-PDL-1 치료와 조합하여 CT26 마우스 결장 암종 모델에서의 항-mPVRIg 단일클론 항체 치료의 효능을 기술한다.
재료 및 방법
종양 접종 실험:
CT26 결장 암종은 ATCC (CRL-2638)로부터 구입하였다. 세포를 10% FBS (Biological Industries, 04-127-1A) 및 100 μg/mL 페니실린/스트렙토마이신 (Biological Industries, 03-031-1B)을 갖는 RPMI 1640 (Biological Industries, 01-100-1A)에서 배양하였다. 종양 이식을 위해, 세포를 수확하고, 세척하고, 계수하고, 차가운 RPMI 1640에서 107개 세포/ml로 현탁시키고, 얼음에 두었다. BALB/c 마우스 ((암컷, 8주) Envigo)를 10% 케타민 (Clorketam; SAGARPA Q-7090-053) 및 10% 자일라진 (Sedaxylan; BE-V254834) 혼합물을 복강내에 주사하여 마취시켰다. 다음으로, 마우스의 등을 면도하고 70% 에탄올 용액으로 소독하였다. 종양 세포는 피하로 마우스의 후면 오른쪽 옆구리에 5 Х 105개 세포의 CT26 50 μL로 주사하였다. 종양이 30 내지 50 mm3 (단일 처리) 또는 60 내지 90 mm3 (조합 처리)의 부피에 도달할 때 종양 접종 후 4일 (단일 처리) 또는 7일 (조합 처리)에 단일클론 항체 투여를 시작하였고; 총 6회 투여를 위해 3주 동안 200 μL의 최종 부피/주사로 복강내 (ip) 주사되었다. 종양 성장은 2 내지 3 일마다 전자캘리퍼로 측정하였고 0.5 × W2 × L mm3로 보고되었다. 연구 종결 또는 임의의 다음 임상 종결점에서 마우스를 CO2로 희생시켰다: 종양 부피 = 2250 mm3, 종양 궤양, 체중 손실 = 20%, 또는 빈약한 외모.
항체:
래트 IgG2b 이소형 단일클론 항체 (mAb)로 조작된 본 연구에서 사용된 키메라 항-마우스 PVRIg 항체 (mAb 406 및 mAb 407)는 mPVRIg를 발현하는 293HEK 형질전환체에 결합하고 이들 세포에 mPVRL2의 결합을 차단하는 것으로 나타났다. 본 연구에서 사용된 mIgG1 항-마우스 PDL-1 억제제는 단일클론 항체 YW243.55.S70이었다. YW243.55.S70 항체는 국제특허출원 WO 2010/077634 (WO 2010/077634의 서열번호 20 및 21에 각각 나타낸 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)에 기술되고, 여기에 기술된 서열을 가진 항-PD-L1이다.
모든 단일클론 항체는 멸균된 PBS로 제형화되었으며 내독소 (<0.05 EU/mg)가 낮았다.
Figure 112019022434593-pct00009
Figure 112019022434593-pct00010
연구 설계
단일 처리
8주령의 BALB/c 암컷 마우스를 Envigo로부터 구입하여 SPF 동물 시설에서 실험을 시작하기 전 1주 동안 유지하였다. 마우스는 마취시키고, 면도하여 50 μL의 5 × 105개 CT26 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양 접종 후 4일째에, 마우스를 무작위로 n = 10의 처리군으로 배정하였다 (하기에 기술됨). 접종 후 4일, 7일, 11일, 14일, 18일 및 21일째에 마우스를 주입된 mAb (하기에 기술됨)로 처리하였다. 종양 성장은 2 내지 3일마다 캘리퍼로 측정하였다.
Figure 112019022434593-pct00011
조합 처리
항-mPVRIg 및 항-mPDL-1 mAb 처리의 조합. 마우스는 단일 치료에 기술된 바와 같이 치료받았다. 종양 접종 후 7일째에 마우스를 하기 기술된 바와 같이 무작위로 n = 10의 치료군으로 배당하였다. 종양 접종 후 7일, 11일, 14일, 18일, 21일 및 25일째에 마우스를 주입된 mAb (하기에 기술됨)로 처리하였다.
Figure 112019022434593-pct00012
통계적 분석:
반복 측정을 사용한 양방향 ANOVA 이후, JUMP (Statistical Discoveries TM) 소프트웨어를 사용하여 처리군의 선택된 쌍의 반복 측정으로 양방향 분산 분석. 종양 성장 측정의 분석은 모든 연구 동물이 살아있는 마지막 날에 측정된 종양 부피를 비교함으로써 수행되었다. 무-종양 마우스의 백분율의 통계적 차이를 로그 순위 맨텔-Cox 테스트로 측정하였다. P <0.05의 값은 유의한 것으로 간주되었다.
* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001. 각 실험의 경우, 수행된 반복 횟수와 군 당 동물 수는 해당 도면 설명 (도 47 내지 48)에 설명되어 있다.
결과
동종 CT26 종양 모델에서 항-MPVRIg 및 항-MPDL-1의 단독요법 활성
본 발명자는 마우스 동종 CT26 종양 모델에서 항-MPVRIg 및 항-mPDL-1 단일요법의 전임상 평가를 시작하였다. 본 발명자는 mIgG1 이소형 항-PDL-1 항체 (YW243.55.S70) 또는 rIgG2b 이소형 항-MPVRIg (항체 406 및 407)로 마우스를 처리하였다.
CT26 결장 암종의 반-치료적 치료 모델에서 대조군 mIgG1 이소형과 비교하여 TGI의 70%를 유도하는 항-PDL-1로의 단독요법이 유의하게 효과적이었고 (P <0.000), 신속한 종양 거부 반응으로의 더 높은 종양 거부율 및 지속가능한 항-종양 면역이 대부분의 마우스에서 관찰되었다 (도 63a 및 도 63b).
항-mPVRIg mAb 406 및 항-mPVRIg mAb 407 둘 중 하나로의 처리군은 TGI rIgG2b 이소형 대비 TGI가 없는 유사한 종양 성장 속도를 보였다 (도 63a 및 63b). 따라서, 항-종양 PDL-1 mIgG1 처리는 마우스의 생존을 연장시켰고 (P <0.01, 도 63c), 10마리 중 5마리가 완전 종양 제거를 나타냈다 (도 63b). 생존율에 미치는 항-mPVRIg mAb의 효과는 관찰되지 않았다.
동종 마우스 종양 모델에서 항-PVRIg 및 항-PDL-1 조합의 활성
다음으로, 본 발명자는 마우스 동종 종양 모델에서 항-PVRIg 및 항-PDL-1 조합 요법의 활성을 평가하였다.
CT26 결장 암종의 치료 모델에서, 접종 7일째에 개시된 대조군 rIgG2b 이소형 처리와 함께 항-PDL-1을 투여하는 것은 효과적이지 않았던 반면, 항-PVRIg mAb 407과 항-PDL-1의 조합은 유의한 TGI (56%, P = 0.0005), 10마리 중 4마리 개체가 완전한 종양 청소를 보여주는 종양 거부의 높은 비율 (도 64a 및 64b) 및 지속가능한 항종양 면역이 검출되는 촉진된 더 나은 항종양 활성 (P <0.01, 도 64c)을 유도하였다. 항-PVRIg 단일클론 항체 406과 항-PDL-1의 조합은 부분적으로 효과적이었고, 33%의 TGI를 유도하였지만, 기록된 항-종양 반응은 일시적이었고 생존율에 미치는 효과는 관찰되지 않았다.
결론
mPVRIg는 새로운 B7-유사 분자로서, 따라서 항체 기반의 암 면역요법의 잠재적인 표적으로서의 역할을 할 것으로 예측되었다. 여러 인간 시험관내 실험 시스템이 mPVRIg의 면역-조절 효과를 입증하였다. 이 보고서에 제시된 연구에서, 본 발명자는 mPVRIg에게 유도된 mAb의 생체내 항암 효과를 평가하였다. 본 발명자의 연구에서, 최소한의 질환 설정, 예로 4일째 치료 시작 (종양 평균 40 mm3)에서 단독요법으로서 10 mg/kg (200 μg/마우스)의 항-mPVRIg 치료가 TGI 또는 생존 이점을 얻지 못하였던 반면, 양성 대조군 항-PDL-1 단일클론 항체는 유의한 TGI를 나타내었고 생존 기간이 연장되었다.
항-mPVRIg 단일클론 항체를 항-PDL-1 치료와 함께 또한 테스트하였다. 10 mg/kg (200 μg/마우스)로의 치료는 종양이 평균 크기 75 mm3에 도달한 때, 7일째에 시작되었다. 치료 CT26 모델에서 항-MPVRIg 단일클론 항체 407과 항-PDL-1의 조합 요법은 치료된 마우스의 종양 성장 억제 및 연장된 생존을 나타냈다. 종양 성장에 미치는 효과는 부분적인 반응 (일시적인 TGI)을 나타내는 다른 개체와 일부 대상은 반응이 없었던 반면, 완전한 종양 제거를 나타내는 일부 대상에서는 개별 마우스 간에 다양하였다. MC38 및 B16-Db/gp100 종양 모델에서 항-mPVRIg 및 항-mPDL-1 조합 치료의 생체내 효과를 또한 보여주었다 (데이타 미도시).
추가적인 생체내 연구는 추가적인 동종 모델에서 또는 추가적인 치료 화합물 또는 요법과의 조합으로 용량 의존성 및 효능을 평가하도록 계획된다.
J. 실시예 10: 파지 디스플레이에 의한 TIGIT 치료 항체 발견
1. 소개
파지 디스플레이 항체 발견 연구는 표적 항원으로서 재조합 인간 TIGIT 세포외 도메인을 사용하여 순수한 인간 fab 라이브러리로부터 인간 TIGIT 결합제를 분리하기 위해 시행되었다. 45개의 새로운 인간 TIGIT 특이적 항체가 분리되어 본 명세서에서 논의된 바와 같이 힌지 영역에 조건부 S241P를 포함하는 인간 IgG4로서 생성되었다. 결과로 생성된 항체를 TIGIT-PVR 상호작용을 차단하는 능력 및 유동 세포계측법에 의해 시노몰거스 TIGIT를 발현하는 세포와의 교차-반응성에 대해 스크리닝하였다. 이들 항체들 중 두 개가 더 높은 인간 및 시노몰거스 TIGIT 결합 친화성을 위해 추가로 최적화되었다.
2. 프로토콜
파지 디스플레이에 의한 항체 발견을 위한 항원: 인간 TIGIT 단백질의 두 가지 형식을 파지 디스플레이에서 항원으로서 사용하였다. 첫 번째 형식은 C-말단 폴리히스티딘 태그 (hTIGIT-HIS)에 융합된 인간 TIGIT ECD (Met22-Pro141)로 구성되고, 내부에서 생성되거나 Sino Biological사로부터 구입하였다. 두 번째 항원 형식은 C-말단 (hTIGIT-hFc)에서 인간 IgG1 Fc 도메인에 융합된 인간 TIGIT ECD로 구성되고, 내부에서 생성되거나 R & D Systems로부터 구입하였다.
항원의 기능적 QC: 바이오패닝에 사용된 재조합 TIGIT 항원은 인간 TIGIT의 리간드인 인간 PVR에 결합하는 능력에 의해 기능적으로 검증되었다. 바이오닌화된 항원을 ELISA 또는 유동 세포계측법에 의해 PVR 결합에 대해 테스트하였다. 바이오틴화된 hTIGIT-HIS는 ELISA에 의한 hPVR-hFc (Sino Biological Inc.)에 결합하는 능력에 의해 검증되었다. 바이오틴화된 hTIGIT-hFc는 Expi293 세포에서 표면 발현된 PVR을 내인성으로 결합시키는 능력에 대해 유동 세포계측법에 의해 입증되었다.
인간 항체 라이브러리의 파지 패닝: 항원으로서 인간 TIGIT-HIS (연구 1) 또는 인간 TIGIT-hFc (연구 2)를 이용하는 두 가지의 파지 연구가 실행되었다. 패닝 반응은 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드를 사용하여 바이오틴화된 TIGIT 항원을 표시하는 용액에서 수행되었다. 두 연구 모두는 초기 발견을 위해 인간 fab 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하였다. 각각의 인간 TIGIT 항원을 사용하여 3회의 패닝을 수행하고, 각 연속적인 패닝에서 더 높은 세척 엄격도 및 더 낮은 항원 농도를 사용하였다. 연구 1에서 생성된 항체 CPA.9.002는 L-CDR3의 포화 돌연변이 유발에 의한 파지 라이브러리 생성 및 인간 TIGIT-HIS (연구 3)에 대한 결과적인 라이브러리 패닝에 의해 개선된 인간 TIGIT 결합에 최적화되었다. 연구 2 및 연구 3에서 각각 생성된 두 개의 항체 CPA.9.059와 CPA.9.027도 개선된 인간 TIGIT 친 화성 및 시노 TIGIT 교차-반응성 (연구 4)을 위해 최적화되었다. 각각의 항체에 대해, 두 개의 CDR (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 또는 L-CDR3의 임의의 조합)의 포화 돌연변이 유발에 의해 파지 라이브러리가 생성되었다. 결과로 생성된 파지 라이브러리를 인간 TIGIT-HIS 및 C-말단 HIS-태그된 시노 TIGIT ECD 재조합 단백질에 대해 4회 반복하여 패닝을 교대로 수행 하였다. 사용된 패닝 항원은 다음과 같다: 1회에서 1 nM 인간 TIGIT-HIS, 2회에서 1 nM 시노 TIGIT-HIS, 3회에서 0.1 nM 인간 TIGIT-HIS 및 4회에서 0.1 nM 시노 TIGIT-HIS.
fab 단편으로 발현된 항체를 사용한 결합 스크리닝: 파지미드 구조물은 fab 발현 벡터로서 기능할 수 있도록 앰버 종결 코돈을 포함한다. 이들 벡터를 대장균 내에 형질전환시키고 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)로 유도하면 용해성 fab 분자가 세포질주변으로 발현된다. 대장균 세포질 주변으로 분비된 Fab 단백질을 결합 스크리닝을 위해 삼투 충격에 의해 추출하였다.
ELISA에 의한 일차 스크리닝: fab PPE 추출물을 ELISA에 의해 패닝 항원 hTIGIT-HIS 또는 hTIGIT-hFc에 대한 결합을 테스트하였다. ELISA 스크리닝으로부터의 양성 결과는 중쇄 및 경쇄-특이적 프라이머를 사용하여 서열 분석하였다. 서열을 조립하고 분석하였다. 중쇄 CDR3에 하나 이상의 비-보존적 차이가 있으면 클론은 서열-독특한 것으로 간주되었다.
유동 세포계측법에 의한 이차 스크리닝: 서열 독특한 ELISA-양성 fab 클론을 선택하여, 유동 세포 계측법에 의해 인간 TIGIT 과다-발현하는 Expi293 세포와 결합하는 능력을 분석하였다. 모체 Expi293 세포는 각 fab 시료의 음성 대조군으로 사용되었다.
Fab 결과의 재구성 및 인간 IgG4 분자로서의 생산: 잠재적인 인간 TIGIT 결합 fab을 전장 인간 IgG4 (S242P 힌지 돌연변이체 포함, 본원에 전문이 참고문헌으로 통합되는 Aalberse et al., Immunology 202 105: 9-19, 특히 S241P의 논의 및 여기에 인용된 참고문헌 1, 2 및 3 참조)로 추가의 특성화를 위해 전환시켰다. 단백질 발현 구조물은 pUNO3 벡터 (Invivogen) 내에 서브-클로닝된 가변 중쇄 및 경쇄 서열의 PCR- 증폭에 의해 유도되었다.
3. 결과
인간 TIGIT 재조합 단백질의 기능적 QC: 시판되어 구입하거나 내부에서 생성된 hTIGIT-HIS 및 hTIGIT-hFc 재조합 단백질은 인간 PVR에 결합하는 능력에 의해 기능적으로 검증되었다. 인간 PVR (Fc-컨쥬게이션됨)은 ELISA에서 바이오틴화된 hTIGIT-HIS에 용량-의존적 결합을 보여주었다 (데이타 미도시). 유사한 결합이 PVR이 ELISA 플레이트에 고정화되고 hTIGIT-HIS가 용액 상태인 역배향에서 관찰되었다 (데이타 미도시).
hTIGIT-hFc 단백질은 유동세포계측 검정법에서 PVR에 결합함으로써 기능적으로 입증되었다. 이 분석에서, hTIGIT-hFc 단백질은 내인성으로 인간 PVR을 발현하는 Expi293 세포에 대하여 적정되었다. 상호작용은 AF647 형광 표지에 컨쥬게이션된 항-hFc 이차 항체를 사용하여 검출되었다. 무관한 Fc 단백질을 대조군으로 사용하였다 (데이타 미도시).
기능적 검정법은 하기 실시예에 기술된 바와 같이 다수의 후보 물질 상에서 시행되었다.
Fab 단편으로 발현된 항체를 사용한 친화성 성숙 결합 스크리닝: 세포질주변 추출된 fab 클론의 96-웰 플레이트 8개를 새로운 연구 (1 및 2)를 위해 분석하였다. 표적 항원으로서 hTIGIT-HIS 단백질을 사용하여 연구 1에서 73개의 독특한 클론이 확인되었다. 유동 세포계측법에 의한 73개 ELISA 양성 클론의 이차 스크리닝은 인간 TIGIT를 과다발현하는 Expi293 세포에 대한 결합 양성 21개를 확인하였다. 연구 2 (hTIGIT-hFc를 표적 항원)의 유사한 스크리닝은 유동 세포계측법에 의해 인간 TIGIT를 과다발현하는 Expi293 세포에 대한 결합에도 양성인 24개를 포함하여 37개 ELISA 양성 클론을 얻었다 (도 52).
fab 클론의 두 개의 96-웰 플레이트 (PPE)를 최적화/친화성 성숙 연구 (3 및 4)을 위해 스크리닝 하였다. ELISA-양성 특이적 변이체는 유동세포계측법에서 인간 및/또는 사이노몰거스 TIGIT를 과다발현하는 Expi293 세포와 결합에 대해 스크리닝되었다. hTIGIT-HIS 단백질에 대한 상위 클론들의 결합 친화성는 또한 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 평가되었다. CPA.9.002 항체의 친화성 성숙의 첫 번째 주기는 L-CDR3에서의 돌연변이 및 재조합 인간 TIGIT에 대한 결합 친화력의 적어도 3배 개선이 있는 5개의 새로운 항체, CPA.9.021, CPA.9.027, CPA.9.044, CPA.9.048 및 CPA.9.049를 수득하였다. CPA.9.027 항체의 최적화의 두 번째 주기는 재조합 인간 TIGIT에 대한 결합에서 적어도 25배 개선된 4개의 새로운 항체를 수득하였다. 새로운 변이체는 H-CDR2 및 L-CDR3 (CPA.9.083 및 CPA.9.086)에서 추가적으로 CPA.9.089 및 CPA.9.093에 대한 L-FR4에서 돌연변이를 나타내었다. CPA.9.059의 최적화로 두 개의 새로운 항체 CPA.9.101과 CPA.9.103가, CPA.9.103의 경우 인간 TIGIT 결합의 유의한 개선뿐만 아니라 시노몰거스 TIGIT에 대한 유의하게 개선된 결합을 가지고 생성되었다. 돌연변이는 H-CDR3와 L-CDR1에서 두 변이체 모두의 경우 관찰되었다. 또한 CPA.9.101에서 L-FR1의 사소한 변화가 관찰되었다.
hIgG4 내의 ELISA 및 FACS 양성 fab의 재구성: ELISA 및 유동 세포계측법에서 인간 TIGIT 결합 양성인 45개의 독특한 fab이 본원에서 논의된 바와 같은 조건부 S241P 힌지 변이체를 포함하여 인간 IgG4 분자로서 발현되도록 재구성되었다. 또한, 11개의 친화성 최적화된 변이체도 역시 IgG4로서 재구성되었다. 선택된 파지-유래 항체의 서열을 도 53에 나타낸다. 두 개의 벤치마크 항체 BM26 (국제특허출원 WO2016/028656, 클론 31C6) 및 BM29 (미국 특허 US2016/0176963, 클론 22G2)의 서열도 역시 비교를 위해 도 53에 나타낸다. 재구성된 항체를 인간 TIGIT를 과다발현하는 Expi293 세포와 결합에 대해 평가하고 결합 곡선을 생성하여 평형 결합 상수 (KD)를 계산하였다. 이들 항체는 또한 시노 TIGIT를 과다발현하는 Expi293 세포와 결합뿐만 아니라 세포 기반의 검정에서 인간 TIGIT와 인간 PVR 사이의 상호작용을 차단하는 능력에 대해 평가되었다. 이들 특성에 기초하여, 이들 항체의 하위집합을 하기에 더 완벽하게 기술된 바와 같이 시험관내 기능적 검정을 위해 선택하였다.
K. 실시예 11: 하이브리도마에 의한 TIGIT 치료 항체 발견
1. 이론적 근거 및 목적
해당 기술분야에서 알려진 표준 방법을 사용하는 하이브리도마 기술은 높은 친화력으로 인간 TIGIT에 결합하고, 비-인간 영장류 (시노몰거스 머카크, Macaca fascicularis, 시노라고 약칭됨) TIGIT와 교차 반응하며, TIGIT와 이의 리간드인 PVR (CD155)의 상호작용을 차단하는 마우스 항체를 생성하는 데 사용되었다.
2. 요약
Balb/c 마우스를 인간 및 시노 TIGIT 세포외 도메인 단백질의 재조합 형태로 면역화시켰다. 면역화된 마우스의 비장 및 림프절로부터 분리된 세포를 Sp2/0 골수종 세포주와 융합시켜 마우스 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성시켰다. 다중클론성 및 서브-클로닝된 단일클론성 하이브리도마로부터의 상청액을 표준 SPR 방법을 사용하여 인간 및 시노 TIGIT 과다발현 Expi293 세포와 결합 및 인간 및 시노 TIGIT 재조합 단백질에 대한 결합 친화성에 대해 스크리닝하였다. 선별된 하이브리도마로부터의 마우스 항체를 정제하고 결합 및 기능적 검정에서 철저하게 특성화 하였다. 다섯 개의 기능적 및 시노 교차-반응 마우스 항체는 hIgG4 프레임워크 (본원에 개략된 바와 같은 조건부 힌지 변이체 포함) 및 이소형을 포함하도록 인간화되었다. 서열은 도 53에 나타낸다.
L. 실시예 12: 인간 및 시노 TIGIT를 과다발현하는 세포와 결합하는, 파지 및 하이브리도마-유래 항체의 FACS KD 측정
1. 프로토콜
다음의 인간 파지 및 마우스 항-TIGIT 항체의 결합 친화성을 평가하기 위해 준비되었다: Expi293 모체, Expi293 인간 TIGIT 과다발현 및 Expi293 시노 TIGIT 과다발현. 다음의 하이브리도마 및 파지 항체를 195 pM 내지 200 nM의 결합 부위 농도 범위에서 11개-지점 2배 연속적 일련 희석으로 각각 제조하였다.
파지는 항체를 생성하였다: CPA.9.027, CPA.9.049, CPA.9.059.
하이브리도마는 항체를 생성하였다 (전-인간화): CHA.9.536, CHA.9.541, CHA.9.543, CHA.9.546, CHA.9.547 및 CHA.9.560. BM26 (국제특허출원 WO2016/028656A1, 마우스 IgG1로서 클론 31C6) 및 BM29 (미국 특허 US2016/0176963A1, 마우스 IgG1로서 클론 22G2)의 두 개의 벤치마크 항체가 포함되었다.
각 적정의 12번째 웰은 배경으로만 작용하는 완충액을 포함하였다 각 세포 유형은 항-인간 TIGIT 단일클론 항체와 함께 4℃에서 60분 동안 배양되었다. 세척 후, AF647-태그화 염소 항-인간 F(ab') (Jackson Immunoresearch) 및 AF647-태그화 염소 항-마우스 IgG-Fc (Southern Biotech # 1030-30)를 각각 인간 및 마우스 mAb와 배양된 세포에 첨가하였다 . 다음으로 FACS Canto II HTS 기기는 각 웰에 대해 5,000-10,000개의 기하학적 평균 형광 강도 (gMFI)를 기록하였다. 인간 PVR 분자적 농도의 함수로서 gMFI의 좌표는 그래프패드 프리즘의 "하나의 부위, 특이적 결합"모델을 사용하여 각 비선형 적합의 KD 및 95% 신뢰 구간을 추정하기에 적합하였다.
2. 결과
각 단일클론 항체에 대해 측정된 두 개의 독립적인 FACS KD는 평균 2배 이상은 차이가 나지 않았다. 결합 등온선 적합의 95% 신뢰 구간과 함께 KD에 대한 단일 대표적인 측정은 각각 도 54 및 도 55의 인간과 시노 과다발현 세포의 각 단일클론 항체에 대해 나열되어 있다. CPA.9.059는 시노 과다-발현 세포와 결합을 나타내지 않았다. 모든 mAb에 대한 결합 부위 농도 (2X 분자적 농도)는 비선형 곡선-피팅에 사용되는 점을 주목해야 하고, 이는 FACS KD 방법이분자적 또는 화학양론적 결합 상수보다는 결합 부위 상수 (kD)를 측정하는 것을 가정하고 있음을 의미한다.
M. 실시예 13: TIGIT에 대한 PVR-FC 결합을 억제하는 파지 및 하이브리도마-유래 항-인간 TIGIT MAB의 FACS 차단 검정
1. 소개
이 분석의 목적은 파지 및 하이브리도마 유래 항-인간 TIGIT 항체의 세포 표면에 과다-발현된 인간 TIGIT에 대한 인간 PVR의 결합을 억제하는 능력을 특성화하는 것이다 첫째, 인간 TIGIT-인간 PVR 결합 친화성은 FACS에 의해 결정될 것이다. 결합 등온선은 차단 분석에 사용된 인간 PVR의 포화 농도를 보여주었다. 다음으로, 인간 TIGIT을 과다발현하는 세포를 파지 및 하이브리도마-생산 항-TIGIT mAb로 적정하고,이어서 포화 농도의 인간 PVR을 첨가하였다. 이어서, 과다발현 세포에 대한 항-인간 TIGIT 항체 결합을 FACS를 사용하여 측정하였다.
2. 프로토콜
FACS KD 검정: 최적의 결합을 위해 다양한 인간 PVR-Fc 이소형을 FACS를 통해 테스트하였고, 인간 PVR-h1Fc (Sino Biological # 10109-H20H) 및 인간 PVR-m2aFc (Compugen)가 인간 TIGIT 과다발현 세포에 대해 가장 높은 결합 수준을 보여주는 것으로 결정되었다. 두 개의 PVR 이소형은 각각 98 pM 내지 100 nM의 최종 분자 농도 범위에서 11개-지점 일련 적정을 통해 2배 일련 희석되었다. 각 적정의 12번째 웰은 배경으로만 작용하는 완충액을 포함하였다 각 세포 유형은 mAb와 함께 4℃에서 60분 동안 배양되었다. 세척 후, AF647-태그화 F(ab')2 단편 염소-항 인간 Fc (Jackson Immunoresearch #109-606-098) 및 AF647-태그화 염소 항-마우스 IgG-Fc (Southern Biotech # 1033-31)를 각각 인간 및 마우스 항-TIGIT mAb로 적정된 웰에 첨가하였다. 다음으로 FACS Canto II HTS 기기는 각 웰에 대해 5,000-10,000개의 기하학적 평균 형광 강도 (gMFI)를 기록하였다. 인간 PVR 분자적 농도의 함수로서 gMFI의 좌표는 그래프패드 프리즘의 "하나의 부위, 특이적 결합"모델을 사용하여 각 비선형 적합의 KD 및 95% 신뢰 구간을 추정하기에 적합하였다. 인간 PVR-m2aFc 및 인간 PVR-h1Fc의 결과를 각각 도 57a 및 57b에 나타내었다.
파지 MAb 차단 검정: 다음의 파지-유래 hIgG4 항체 및 벤치마크 mAb 각각을 267 pM 내지 6.7 nM의 결합 부위 농도 범위에서 3개-지점 5배 연속적 일련 희석으로 제조하였다: CPA.9.027, CPA.9.049 및 CPA .9.059, 뿐만 아니라 BM26 (국제특허출원 WO2016/028656A1, hIgG4로서 클론 31C6) 및 Synagis hIgG4 (음성 이소형 대조군).
각 적정의 4번째 웰은 배경으로만 작용하는 완충액을 포함하였다 세포를 mAb와 함께 4℃에서 15분 동안 배양하였다. 이어서, 인간 PVR-m2aFc (Compugen)를 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, AF647-태그화 염소 항-마우스 IgG (SouthernBiotech # 1033-31)를 첨가하였다. 다음으로 FACS Canto II HTS 기기는 각 웰에 대해 5,000-10,000개의 기하학적 평균 형광 강도 (gMFI)를 기록하였다. 단일클론 항체로 미리 배양된 세포에 대한 결합된 인간 PVR의 gMFI 값을 차단 벤치마크 mAb 및 비-차단 대조군 단일클론 항체로 미리 배양한 세포의 gMFI 값과 비교하였다. 파지 항체가 공지된 비-차단 단일클론 항체로의 적정으로부터의 신호와 비교하여 인간 PVR-m2aFc 결합 신호를 감소시키면, 항체는 파지 단일클론 항체의 해당 농도에서 PVR 결합을 차단하는 것으로서 특성화되었다. 파지 mAb의 차단 경향은 BM26 벤치마크로의 PVR 차단과 유사하였다 (도 58).
하이브리도마 MAb 차단 분석: 다음의 하이브리도마 항체를 각각 14 pM 내지 133 nM의 결합 부위 농도 범위에서 11-지점 2.5배 일련 희석으로 제조하였다: CHA.9.536, CHA.9.541, CHA.9.546, CHA.9.547, CHA.9.560.BM26 (국제특허출원 WO2016/028656A1, 마우스 IgG1로서 클론 31C6) 및 BM29 (미국 특허 US2016/0176963A1, 마우스 IgG1로서 클론 22G2).
각 적정의 12번째 웰은 배경으로만 작용하는 완충액을 포함하였다 세포를 mAb와 함께 4℃에서 15분 동안 배양하였다. 이어서, 인간 PVR-h1Fc (Sino Biological # 10109-H20H)를 첨가하고, 세포를 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, AF647-태그화 F(ab')2 단편 염소-항-인간 Fc (Jackson Immunoresearch)를 첨가하였다. 다음으로 FACS Canto II HTS 기기는 각 웰에 대해 5,000-10,000개의 기하학적 평균 형광 강도 (gMFI)를 기록하였다. mAb 결합 부위 농도의 함수로서 gMFI의 좌표은 그래프패드 프리즘의 "로그 (억제제) 대 반응-가변 기울기 (네 개 매개변수)" 모델을 사용하여 각 비선형 적합의 IC50을 추정하기에 적합하였다. 이 실험은 2일에 걸쳐 두 번 반복되었다.
3. 결과
도 58 및 59는 파지 및 하이브리도마 항체 모두가 Expi293 세포의 세포 표면에서 과다발현된 인간 TIGIT과 인간 PVR-Fc의 결합을 강력하게 차단하는 것을 입증한다. 파지 및 하이브리도마 항체의 차단 활성은 테스트된 두 개의 벤치마크 항체인 BM26 및 BM29와 비슷하다.
N. 실시예 14: 인간, 시노 및 마우스 TIGIT에 대한 9개 파지- 및 하이브리도마-유래 MAB의 표면 플라스몬 공명 (SPR) 동력학 연구
1. 프로토콜
모든 실험은 22℃에서 ProteOn XPR 36 기구를 사용하여 수행하였다. 첫째, 표준 아민 커플링을 사용하여 별도의 GLC 칩 상의 모든 수직적 포획 레인 및 수평 간극에 고정화된 염소 항-인간 Fc 다중클론 항체 (Thermo # H10500) 및 토끼 항-마우스 항체 (GE Healthcare # BR100838)로 고밀도 포획 표면을 제조하였다. 각 GLC 칩의 경우 항-인간 포획 pAb 및 항-마우스 포획 항체에 대한 전형적인 고정화 수준은 약 5000 RU이었다. 인간 TIGIT는 Sino Biologicals로부터 구입하였고, 마우스 TIGIT 단량체와 개 TIGIT 단량체는 내부에서 제조되었다. 인간, 마우스 및 시노 TIGIT에 대한 결합을 위해 연구된 정제된 단일클론 항체는 하기에 열거된다:
파지 항체: CPA.9.027, CPA.9.049 및 CPA.9.059
하이브리도마 항체: CHA.9.536, CHA.9.541, CHA.9.543, CHA.9.546, CHA.9.547 및 CHA.9.560
벤치마크 비교: BM26 (국제특허출원 WO2016/028656A1, hIgG4로서 클론 31C6) 및 BM29 (미국 특허 US2016/0176963A1, hIgG4로서 클론 22G2).
각 단일클론 항체를 여과된 BSA를 최종 농도 100 μg/mL로 첨가한 1x PBST인 전개 완충액으로 약 0.5 μg/mL로 희석하였다. ProteOn 기기 상의 각 "단일-샷 동력학" 주기의 경우, 대략 1.5 내지 2.5분 동안 여섯 개의 독특한 수직적 포획 레인 중 하나에서 상이한 mAb가 포획되었다. ProteOn의 완충액 유동을 수평 방향으로 전환한 후 포획 표면이 대략 15 내지 20분 동안 안정화되었다. 인간 TIGIT (346 pM 내지 84.1 nM), 시노 TIGIT (371 pM 내지 90.2 nM) 또는 마우스 TIGIT (382 pM -92.9 nM)의 3배 일련 희석의 여섯 개 농도를 2분 동안 주입한 후, 20분 동안 유속 50 μL/분으로 해리시켰다. 동일한 완충액 주입이 이중-기준화를 위해 각 일련의 주입된 항원을 선행하였다. 항-인간 항체 표면을 146 mM 인산의 두 번의 30초 펄스로 재생시키고 항-마우스 항체 포획 표면을 10 mM 글리신 pH 1.7의 두 번의 30초 펄스로 재생시켰다. 포획된 단일클론 항체에 주입된 TIGIT 항원의 센서그램은 ProteOn 버전의 스크루버를 사용하여 처리되었으며 대량 수송 조건을 포함한 1 : 1 동력학 결합 모델에 적합하였다.
도 56는 결과로 얻은 운동 속도 상수와 데이타가 결합 상수를 추정하기에 충분히 신뢰할 수 있는 평형 해리 상수를 보여준다 (센서그램 데이타 미도시). 별표는 1.00 × 10-5/초로 일정하게 유지되어야 하는 kd 값을 나타낸다. 인간 TIGIT에 결합하는 CHA.9.560 클론과 같은 경우에, 동력학 모델은 Kd를 추정할 수 있지만 계기 감도의 20분의 해리 데이타만이 제공된 후 1 × 10-6/초의 단위로 정확하게 Kd를 추정하는 것은 사실상 불가능하다.
O. 실시예 15: 항-TIGIT 항체의 기능적 분석
1. 이론적 근거 및 목적
항-인간 TIGIT 항체가 TIGIT와 이의 리간드 PVR의 상호작용을 억제하고, 결과적으로 단독 요법으로 또는 항-인간 PVRIG 항체 CHA.7.518. 1.H4 (S241P)와 조합으로 인간 T 세포 활성화를 증진시키는 능력을 기능적으로 특성화하기 위함.
2. 프로토콜
인간 TIGIT/CD155 Jurkat IL-2 루시퍼라제 리포터 검정: 인간 TIGIT/PVR Jurkat IL-2 루시퍼라제 리포터 생체검정 키트 (Promega)를 사용하여 항-인간 TIGIT 항체 치료가 T 세포 활성화에 미치는 효과를 평가하였다. Jurkat T 세포는 재조합 인간 TIGIT 및 IL-2 반응 요소 (IL-2-RE)에 의해 유도된 루시퍼라제 리포터 유전자로 안정적으로 형질감염시켰다. 자극인자 세포는 재조합 인간 PVR 및 항원 비-의존적 방식으로 TCR-매개성 신호전달을 활성화하도록 설계된 조작된 세포 표면 단백질을 발현하는 인공적인 APC (aAPC) CHO-K1 세포이었다. 이들 세포의 공동-배양 후, 인간 TIGIT/인간 PVR 상호작용은 TCR 신호 및 IL-2-RE-매개성 발광을 억제한다. 인간 TIGIT/인간 PVR 상호작용을 차단하는 항-인간 TIGIT 항체를 첨가하면 억제 신호가 방출되어 T 세포 활성화와 IL-2-RE 매개성 발광을 일으킨다. 분석은 제조사의 지침에 따라 수행되었다. 간략하게, aAPC CHO-K1 인간 PVR 세포를 37℃ 수조에서 해동시키고 10% FBS (Promega)가 보충된 F-12 배지에서 희석시켰다. 25,000개 세포/웰을 백색 편평-바닥 조직 배양 처리된 96 웰 플레이트 (Costar) 상에 도말하였다. 다음으로 플레이트를 37℃에서 밤샘 동안 배양하였다. 다음날, 하이브리도마 및 파지-유래 항-인간 TIGIT 항체, 마우스 IgG1 (mIgG1) 및 hIgG4 이소형 대조군 항체 또는 벤치마크 (BM) 항-인간 TIGIT 항체를 10 μg/ml의 단일 용량으로 또는 20 μg/ml에서 시작하는 10개 지점, 2배 일련 희석으로 첨가하였다. Jurkat IL-2-RE 루시퍼라제 인간 TIGIT 세포를 37℃ 수조에서 해동시키고 10% FBS (Promega)가 보충된 RPMI 배지에서 희석시켰다. 125,000개 Jurkat 세포를 각 웰에 첨가하였다. 다음으로 플레이트를 37℃에서 5% CO2로 6시간 동안 배양하였다. 배양 후 플레이트를 배양기로부터 꺼내어 30분 동안 실온으로 평형화를 유지시켰다. 80 μL의 바이오-글로 루시퍼라제 기질 (Promega)을 각 웰에 첨가하고 혼합물을 실온에서 10분 동안 광으로부터 보호하여 평형화를 유지시켰다. 엔비전 다중-표지 판독기 (Perkin Elmer)에서 초-민감한 발광 검출기로 발광을 정량화하였다. 발광 신호는 상대적인 광 단위 (RLU)로 보고되었다.
인간 CMV-특이적 CD8 + T 세포의 증식: 인간 CMV-반응성 말초혈액 단핵 세포 (PBMC) (CTL)를 해동시키고, 2 × 106개 세포/ml로 재현탁시키며, 2 ng/ml 재조합 인간 IL-2 (R & D systems) 및 10 ng/ml 재조합 인간 IL-7 (R & D systems)가 보충된 완전 RPMI 배지에서 1 μg/ml의 CMV pp65 펩타이드 (Anaspec)로 37℃에서 자극시켰다. 9일 후, 세포를 1 : 2로 분할하고 저용량 인간 IL-2 (100 IU/ml)로 휴지시켰다. CMV-특이적 CD8+ T 세포의 빈도는 CMV pp65/HLA-A2 사량체 (MBL)로 결정하였다. 65 내지 98%의 사량체 양성인 CMV-특이적 CD8+ T 세포를 CMV 펩타이드 자극 후 12일에서 16일 사이의 검정에 사용하였다.
인간 PVR 발현 흑색종 세포주와 인간 CMV-특이적 CD8 + T 세포의 공동-배양 검정법: 인간 CMV 특이적 CD8+ T 세포와 시험관내 공동-배양 검정은 항원-특이적 사이토카인 분비에 미치는 항-인간 TIGIT 항체의 효과를 평가하는 데 사용하였다 . 검정에 사용된 표적 세포주는 인간 PVR DNA (System Biosciences)를 포함한 렌티바이러스로 안정적으로 형질도입된 HLA-A2+ 흑색종 세포주, Mel624이었다. Mel624 인간 PVR 과다발현 세포의 안정한 풀을 0.0033 μg/ml 또는 0.001 μg/ml의 CMV pp65 펩타이드로 37℃에서 1시간 동안 펄스 처리하였다. 이어서, 세포를 세척하고 50,000개 세포/웰로 도말하였다. 하이브리도마 및 파지로부터 유래된 항-인간 TIGIT 항체, 대조군 mIgG1 또는 hIgG4 이소형 항체, 또는 BM 항-인간 TIGIT 항체를 10 μg/ml의 농도로 첨가하였다. 공여자 2, 공여자 4 및 공여자 210으로서 특정된 3명의 상이한 공여자로부터의 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포를 상기 프로토콜에 따라 증식시켰다. 50,000개의 인간 CD8+ T 세포를 각 웰에 첨가하였다. 공동-배양물을 37℃에서 5% CO2로 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 1200 rpm에서 1분 동안 원심 분리하고 상청액을 수집하였다. 공동 배양 상청액에서 인간 인터페론 감마 (IFNγ)의 양은 세포계측 비드 검정법 (BD)을 사용하여 유동 세포계측법으로 측정하였다.
인간 PVR- 및 인간 PVRL2 (CD112)-발현 흑색종 세포주와 인간 CMV-특이적 CD8 + T 세포의 공동-배양 검정법: 항-인간 TIGIT 항체 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P), 항-인간 PVRIG 항체의 항원-특이적 사이토카인 분비에 미치는 조합 효과를 상기 기술한 검정법과 유사한 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포와의 시험관내 공동-배양 검정법에 의해 평가하였다. 검정에 사용된 표적 세포주는 렌티바이러스 형질도입 (System Biosciences)을 통해 인간 PVR 및 TIGIT와 PVRIG의 리간드인 인간 PVRL2를 각각 안정적으로 발현하는 HLA-A2+ 흑색종 세포주 Mel624이었다. 인간 PVR 및 인간 PVRL2를 과다발현하는 Mel624 세포를 0.0033 μg/ml 또는 0.001 μg/ml의 CMV pp65 펩타이드로 37℃에서 1시간 동안 펄스 처리하였다. 이어서, 세포를 세척하고 50,000개 세포/웰로 도말하였다. 하이브리도마 및 파지 유래의 항-인간 TIGIT 항체 또는 항-인간 BM TIGIT 항체를 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 또는 대조군 hIgG4 이소형 항체와 조합하여 10 μg/ml로 첨가하였다.있었다 . 공여자 4, 공여자 25 및 공여자 210으로서 특정된 3명의 상이한 공여자로부터의 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포를 상기 프로토콜에 따라 증식시켰다. 50,000개의 인간 CD8+ T 세포를 각 웰에 첨가하였다. 공동-배양물을 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 1200 rpm에서 1분 동안 원심 분리하고 상청액을 수집하였다. 공동 배양 상청액에서 인간 인터페론 감마 (IFNγ)의 양은 세포계측 비드 검정법 (BD)을 사용하여 유동 세포계측법으로 측정하였다.
3. 결과
항-인간 TIGIT 항체는 IL-2 신호전달을 증진시킨다: 인간 TIGIT/인간 PVR Jurkat 루시퍼라제 리포터 검정으로 IL-2 신호전달을 증진시키는 하이브리도마 및 파지-유도 항-인간 TIGIT 항체의 능력을 평가 하였다. 도 60 및 도 62는 IL-2 신호전달에 미치는 10 μg/ml 파지 또는 하이브리도마-유래 항-인간 TIGIT 항체의 효과를 각각 나타낸다. 세 개의 파지-유래 항체, CPA.9.027, CPA.9.049 및 CPA.9.059는 hIgG4 이소형 대조군과 비교하여 IL-2 신호를 강하게 증진시켰다. 또한, 세 개의 파지 항체 모두는 BM 항-인간 TIGIT 항체인 BM26 및 BM29와 비교하여 IL-2 신호전달을 더 많이 유도하였다. 다섯 개의 하이브리도마-유래 항체인 CHA.9.536, CHA.9.541, CHA.9.546, CHA.9.547 및 CHA.9.560도 mIgG1 이소형 대조군과 비교하여 IL-2 신호전달을 유도하였다. 주목할만하게, 다섯 개의 하이브리도마 항체는 BM26 및 BM29와 비교하여 유사한 IL-2 신호전달을 유도하였다. 항-인간 TIGIT 비-차단 항체인 CHA.9.543은 IL-2 신호전달을 유의하게 증가시키지 않았다. 항-TIGIT 항체의 효과가 용량-의존적인지 여부를 결정하기 위해, 20 μg/ml에서 시작하는 각 항체의 10개 지점, 2배 일련 희석으로 검정을 수행하였다 (도 61 및 도 63). IL-2 신호는 모두 여덟 개의 항-인간 TIGIT 항체, 뿐만 아니라 BM26 및 BM29로 용량-의존적 방식으로 감소하였다.
항-인간 TIGIT 항체는 인간 CMV-특이적 CD8 + T 세포로부터의 IFNγ 분비를 증가시킨다: IFNγ 분비를 조절하는 하이브리도마 및 파지-유래 항-인간 TIGIT 항체의 능력을 CMV-특이적 T 세포/Mel624 공동-배양 검정으로 평가하였다. 도 64는 항-인간 TIGIT 항체가 IFNγ 분비에 미치는 효과를 보여준다. 세 개의 파지-유래 항체인 CPA.9.027, CPA.9.049 및 CPA.9.059는 배지 단독 및 hIgG4 이소형 대조군 항체와 비교하여 IFNγ 분비를 증진시켰다. 또한, 다섯 개의 하이브리도마-유래 항체인 CHA.9.536, CHA.9.541, CHA.9.546, CHA.9.547 및 CHA.9.560도 mIgG1 이소형 대조군 항체와 비교하여 IFNγ 생산을 증가시켰다. 파지 및 하이브리도마-유래 TIGIT 항체는 BM26 및 BM29와 유사한 방식으로 IFNγ를 유도하였다. 예상된 바와 같이, 항-인간 TIGIT 비-차단 항체인 CHA.9.543은 IFNγ 분비에 유의한 영향을 미치지 않았다.
도 65는 항-인간 TIGIT 항체 및 CHA.7.518.1.H4(S241P)가 IFNγ 분비에 미치는 조합된 효과를 보여준다. 세 개의 파지-유래 항체인 CPA.9.027, CPA.9.049 및 CPA.9.059 및 다섯 개의 하이브리도마-유래 항체인 CHA.9.536, CHA.9.541, CHA.9.546, CHA.9.547 및 CHA.9.560는 BM26를 포함하여 모두 단독으로 또는 CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 조합으로 처리될 때 이들 각각의 이소형 대조군 항체와 비교하여 IFNγ 분비를 증진시켰다. 항-인간 TIGIT 비-차단 항체인 CHA.9.543은 다른 항-인간 TIGIT 항체와 비교하여 IFNγ 분비를 감소시켰다. 각 이소형 대조군 항체 대비 각 항체의 IFNγ 분비의 증가 백분율은 도 66에 요약되어 있다. 상승 작용 효과는 항-인간 TIGIT 항체와 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 조합 치료에서 관찰된다.
4. 요약 및 결론
인간 TIGIT/인간 PVR Jurkat 리포터 검정에 항-인간 TIGIT 항체를 첨가하면 IL-2 신호전달에서 강한 용량-의존적인 증가를 유도하였다. 추가적으로, 항-인간 TIGIT 항체는 Mel624 인간 PVR 세포와 공동-배양될 때 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포로부터 IFNγ 분비를 증가시켰다. IFNγ의 분비는 항-인간 PVRIG 항체와 조합하여 항-인간 TIGIT 항체에 의해 추가로 증가되었다. 종합적으로, 이들 데이타는 항-인간 TIGIT 항체가 인간 T 세포 활성화의 TIGIT-매개성 억제를 차단할 수 있고, T 세포 활성화가 TIGIT 및 PVRIG 둘 다의 공동-차단에 의해 증진되는 것을 입증한다.
P. 실시예 16: 항-TIGIT 항체의 비닝 분석
1. 프로토콜
실험은 연속 유동 마이크로스폿터 (CFM) 및 IBIS MX96 SPR 영상화기 (MX96 SPRi)를 사용하여 회사 (Wasatch Microfluidics Inc., Salt Lake City, UT)에서 수행되었다. 다음의 항-인간 TIGIT mAb 및 인간 PVR-Fc 변이체를 각각 10 mM 소듐아세티이트, pH 5.0에서 약 10 μg/mL로 희석하고 Xantec 200M 바이오센서 프리즘 칩의 독립적인 스폿 상에서 표준 아민 커플링을 사용하여 7분 주기 동안 CFM 사용하여 공유적으로 고정시켰다:
1 CPA.9.009-H4 17 CPA.9.081-H4 32 CHA.9.555
2 CPA.9.011-H4 18 CHA.9.519 33 CHA.9.560
3 CPA.9.012-H4 19 CHA.9.521 34 CHA.9.525
4 CPA.9.013-H4 20 CHA.9.522 35 CHA.9.538
5 CPA.9.014-H4 21 CHA.9.527 36 CHA.9.543
6 CPA.9.015-H4 22 CHA.9.528 37 CHA.9.553
7 CPA.9.018-H4 23 CHA.9.529 38 CHA.9.556
8 CPA.9.027-H4 24 CHA.9.535 39 CHA.9.561
9 CPA.9.049-H4 25 CHA.9.536 40 BM8-H4
10 CPA.9.053-H4 26 CHA.9.541 41 BM9-H4
11 CPA.9.057-H4 27 CHA.9.546 42 BM26-H4
12 CPA.9.059-H4 28 CHA.9.547 43 BM29-H4
13 CPA.9.064-H4 29 CHA.9.549 44 MBSA43-M1
14 CPA.9.069-H4 30 CHA.9.552 45 PVR-Fc M2A
15 CPA.9.071-H4 31 CHA.9.554 46 Sino PVR-Fc
16 CPA.9.077-H4
BM8-H4 및 BM9-H4는 각각 미국 특허 US2015/0216970A1의 hIgG4로 재구성된 클론 10A7 및 1F4를 말한다. MBSA43-M1은 eBioscience로부터의 마우스 항-인간 TIGIT IgG1이다. 이어서 프리즘 칩을 1X PBST로 3분 동안 헹구어낸 다음, 1 M 에탄올아민을 5분 동안 주입하여 과량의 NHS 에스테르를 켄칭시킨 MX96 SPRi 영상화기에 직접 로딩하였다. 예비 실험은 결합 활성을 테스트하고, TIGIT 결합의 재현성 평가하여 최상의 재생 조건을 결정하도록 모든 고정된 단일클론 항체에 4분 동안 100 nM 단량체 인간 TIGIT (Sino Biologicals, Cat # 10917-H08H)를 주입을 수차례 반복하여 항체의 재생시키는 것을 포함한다. 이들 예비 실험은 대부분의 고정화된 단일클론 항체를 재현가능하게 재생시키는 최상의 시약이 1/500 인산의 30초 펄스인 것을 보여주었다. 그러나 고정된 PVR은 활성을 유지하지 못해서 이들의 차단 패턴이 생성되어 용액에서만 분석물로서 "비닝"된다. 하기에 설명된 이들 예비 실험 및 비닝 실험에서, 모든 단백질 시료는 가스가 제거된 HBST인 전개 완충액에서 제조되었다. "샌드위치" 에피토프 비닝 프로토콜을 수행하여 각 단일클론 항체와 PVR을 각 고정화 단일클론 항체에 미리 복합된 TIGIT에 주입하여 고정화된 단일클론 항체가 단일클론 항체 용액에서 TIGIT에 결합하는 것을 차단하는지 여부를 결정하였다. 각 주기마다 100 nM의 TIGIT를 모든 고정된 단일클론 항체에 4분 동안 먼저 주입한 후 274 nM (결합 부위 농도)에서 경쟁 단일클론 항체 또는 리간드를 4분 동안 주입하였다. 이것은 각 단일클론 항체 및 경쟁 분석물로서 작용하는 PVR로 반복하였다. 경쟁자 단백질 대신에 전개 완충액을 사용하는 대조군 주기를 이중-기준화를 위해 12번 주기 이후에 수행하였다. 모든 표면은 1/500 인산의 30초 펄스로의 각 주기 이후에 재생되었다. 와사치의 독점 소프트웨어를 사용하여 센서그램 데이타를 처리하고 기준화하였다. 항체 쌍은 고정된 단일클론 항체에 미리 복합된 TIGIT 상에서 경쟁자의 주입으로부터 결합이 관찰되지 않으면 공유된 TIGIT-결합 에피토프를 갖는 것으로서 분류되었다. 항체 쌍은 TIGIT 상의 상이한 에피토프에 대한 결합 또는 경쟁자 단일클론 항체의 주입이 미리 복합된 TIGIT에 결합을 나타내는 경우 "샌드위칭"으로 분류되었다. 경쟁자의 낮은 또는 최소 결합은 "중간" 차단제로서 분류되었다. 각 단일클론 항체와 리간드에 대한 쌍을 이룬 TIGIT 차단 양상의 계층적 군집화는 와사치의 독점 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
2. 결과
PVR-Fc 단백질과 13개의 단일클론 항체는 모두 활성을 상실하거나 리간드로서 재생될 수 없어서 이들의 차단 양상이 단지 용액에서 분석물로서 결정되었다. MAb CPA.9.014-H4는 TIGIT에 결합되지 않았기 때문에 분류되지 않았다. 도 67은 각각의 단일클론 항체와 두 개의 PVR 단백질에 대한 쌍을 이룬 차단 양상에 기초한 덴드로그램 군집화를 보여준다. 수직 축은 차단 양상의 통계적 유사성 인자를 나타낸다. 와사치 마이크로플루이딕스는 도 67에 선으로 지시되는 단일클론 항체를 군집화하도록 컷오프인자 5를 적용하였다. 에피토프 "빈"의 가장 엄격한 정의를 위해 동일한 차단 양상을 나타내는 이들 mAb (및 PVRs)만을 비닝하여 총 12개의 구별된 빈이 있다. 최소한의 차이만 보여주는 차단 양상이 함께 군집하면, mAb 및 PVR의 네 개 밀접하게 관련된 "군집"이 존재한다 이러한 "군집"은 도 67의 하단에 상이한 음영 블록으로 표시된다. 도 68은 블랙박스로 표시된 각 빈과 함께 각 구별된 독특한 빈을 구성하는 mAb 및 PVR을 함께 군집화한다. 회색 상자는 관련된 차단 양상의 각 "군집"을 구성하는 모든 독특한 빈을 둘러싼다. 도 68의 단일클론 항체 및 PVR들은 도 67의 덴드로그램에서 각 단백질을 나타내는 숫자 키와 함께 열거된다.
Q. 실시예 17: TIGIT 녹아웃 마우스에게 항-PVRIG 항체의 투여
이론적 근거 및 목적
마우스 PVRIG 차단과 조합하여 TIGIT 결실이 동종 마우스 종양 모델에서 종양 성장 억제 및 생존을 증진시킬 수 있는지 여부를 조사.
프로토콜
동물
TIGIT 녹아웃 (KO) 마우스는 Ozgene Pty LTD (호주)에서 생성되었다. C57BL/6 야생형 (WT) 마우스 (Ozgene)를 대조군으로 사용하였다. 8 내지 11주령의 암컷 TIGIT KO 및 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 모든 연구는 텔아비브 대학교 (텔아비브, 이스라엘)에서 기관 동물관리 및 사용위원회의 승인을 받았다.
생체내 종양 모델
1 Х 105개 B16/Db-hmgp100 흑색종 세포를 C57BL/6 WT 또는 TIGIT KO 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 항체 처리는 종양 접종과 동일한 날 (0일)에 시작되었고, 처리군 당 7 내지 10마리의 마우스가 사용되었다. 사용된 항체는 마우스 IgG1 이소형 대조군 (Clone MOPC-21 BioXcell) 및 마우스 IgG1 항-마우스 PVRIG (Clone 407, Compugen LTD)였다. 항체를 복강내 주사에 의해 10 mg/kg을 주 2회 3주 동안 투여하였다. 종양 성장은 2 내지 3 일마다 전자캘리퍼로 측정하였고 0.5 × W2 × L mm3로서 보고되었다 (L은 종양의 길이이고, W는 종양의 너비임). 종양 크기가 2250 mm3에 도달한 동물을 마취시켰다.
통계적 분석
반복 측정을 사용한 양방향 ANOVA 이후, JUMP 소프트웨어 (Statistical Discoveries TM)를 사용하여 처리군의 선택된 쌍의 반복 측정으로 양방향 분산 분석을 수행하였다. 종양 성장 측정의 분석은 모든 연구 동물이 살아있는 마지막 날에 측정된 종양 부피를 비교함으로써 수행되었다. 무-종양 마우스의 백분율의 통계적 차이를 로그 순위 맨텔-Cox 테스트로 측정하였다. P <0.05의 값은 유의한 것으로 간주되었다. * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001.
결과
TIGIT KO 마우스에서 항-마우스 PVRIG 차단 항체로 처리한 이후 생체내 종양 성장 억제
본 발명자는 동종 마우스 B16/Db-hmgp100 피하 흑색종 종양 모델에서 마우스 PVRIG 차단과 함께 TIGIT 결실의 생체 내 효능을 테스트하였다. 종양 보유 C57BL/6 WT 마우스를 항-마우스 PVRIG 차단 항체로 처리하는 것은 이소형 치료 (11일째 TGI 17%, 종결점 18일째 TGI 8%)와 비교하여 종양 성장 억제 (TGI)에 약간의 효과를 미쳤다. 종양 성장에 미치는 TIGIT 결실의 효과는 C57BL/6 WT 대조군 (11일째 TGI 17% 및 종결점에서 13% TGI)과 비교하여 사소한 것이었다. 그러나, TIGIT 결실을 항-마우스 PVRIG 항체 (클론 407) 처리와 조합할 때 유의한 TGI가 명백하였다 (11일째 63%, 종결점에서 49% TGI) (도 80a 및 80b). TGI에 따르면, 항-마우스 PVRIG 항체 (클론 407)로 처리한 TIGIT KO 마우스는 C57BL/6 WT 대조군과 비교하여 생존율이 증가하였지만, 통계적 유의성은 달성되지 않았다 (도 80c).
요약 및 결론
TIGIT 결실과 PVRIG 차단의 조합은 생체내에서 종양 성장을 현저히 감소시켰으며, TIGIT와 PVRIG가 이 흑색종 종양 모델에서 억제 작용을 하는 것을 가리킨다. 이들 데이타는 TIGIT와 PVRIG를 공동-표적하는 것이 항-종양 반응을 유의하게 증진시키는 또 다른 조합요법일 수 있음을 시사한다.
R. 실시예 18: PVRIG 길항작용은 T 세포 효과기 기능을 증진시키고 종양 성장을 감소시킨다
요약
최근의 진보에도 불구하고, 대다수의 환자는 체크포인트 억제제로부터 장기적인 이익을 얻지 못한다.　 PVRIG는 DNAM/TIGIT 패밀리의 새로운 면역억제 수용체이고, 본 발명자는 본원에서 항-종양 반응을 조절하는 데 PVRIG의 역할을 보여준다. PVRIG는 PVRL2에 결합하고 정상 조직의 림프구와 비교하여 종양 침윤성 림프구에서 현저하게 증진된 발현을 나타낸다.　 PVRIG 길항기작은 인간 T 세포 활성화를 증진하였고, PVRIG와 PD-1 또는 TIGIT 억제제의 조합은 상승적으로 림프구 기능을 더 증가시켰다. 다음으로 본 발명자는 전임상 종양 모델에서 PVRIG의 역할을 겨냥하였다. PVRIG-/- 마우스는 시험관내에서 유의하게 증가된 T 세포 활성화를 나타내었고 증가된 CD8 효과기 기능에 의해 매개된 MC38 종양 성장을 감소시켰다. 길항적 항-PVRIG 항체는 항-PD-L1와 조합하여 또는 TIGIT-/- 마우스에서 테스트하였을 때 종양 성장을 현저하게 감소시켰다. 요약하면, 본 발명자는 PVRIG-PVRL2 경로가 인간 암에서 유도되었고, PVRIG-PVRL2 상호작용에 길항-작용하는 것이 T 세포 기능을 증가시키고 종양 성장을 감소시키는 것을 입증하고 있다.
유의성 상태
이 데이타는 PVRIG가 암 치료의 유망한 표적이 될 수 있고, PVRIG 억제제 CHA.7.518.1.H4 (S241P)를 단일요법으로 또는 TIGIT 또는 PD1 차단과 조합하여 새로운 암 면역요법 제제로 테스트할 근거를 제공한다.
소개
증거가 증가하면서 내인성 면역 반응이 암의 개시, 진행 및 억제를 만드는 것이 결정적인 점을 입증한다 (1) (2). 환자의 면역 상태뿐만 아니라 종양 미세 환경 (TME) 내의 종양-침윤성 백혈구 (TIL)의 내용물도 암 생존율 및 환자가 치료법에 반응하는 방식의 핵심 예후 지표가 된다 (3) (4). T 세포는 항-종양 반응을 일으킬 수 있는 TIL의 핵심 구성요소이며 대부분의 항-종양 면역 반응은 궁극적으로 효과기 림프구 세포의 기능성에 의존한다. 돌연변이 부하 및 Th1 극성화 TME와 같은 효과적인 CD8 T 세포 반응에 대한 면역 반응을 편향시키는 다른 요인뿐만 아니라 환자 종양의 TME에서 CD8 T 세포의 농축은 유리한 항-종양 면역 반응의 핵심 예후 지표이다 (5) (6).
많은 고형 종양에서 중요한 관찰은 효과기 T 세포가 TME 내에서 활성화되거나 '소모되는' 표현형을 가지는 것이다 (7). 이것은 TME 내의 T 세포가 처음에는 동족 항원을 보았지만 활성화되고 종양으로 전환되더라도 효과적인 항-종양 반응을 후속적으로 일으킬 수 없는 것을 가리킨다. 사전-활성화되거나 소모된 T 세포는 PD-1 및 CTLA-4와 같은 공동-억제성 수용체의 증가된 표면 발현에 의해 정의된다 (8). 동족 리간드와 상호작용을 억제하는 항체로 이들 공동-억제성 수용체를 치료적 표적화하는 것은 다수의 진행된 암 환자에서 탁월한 임상 효과를 보여 주었다 (9). 기작적으로, 이들 공동-억제성 수용체를 표적화하면 TME에 미리 존재하는 이미 종양-반응성인 T 세포의 증식 및 확장된 T 세포 수용체 다양성을 가진 T 세포 풀의 생산을 유도하는 것이 밝혀졌다 (10) (11) (12). 현재 병원에 사용되는 체크포인트 억제제가 암 치료에 혁명을 일으키고 암 퇴치에서 면역계의 힘을 입증했지만, 많은 환자들이 여전히 재발하고/거나는 치료에 반응하지 않는다. 결과적으로, 암에서의 면역 반응에 대한 이해의 증가와 추가적인 면역-기반 경로의 표적화는 추가적인 치료법을 유도할 것이다.
이러한 새로운 경로들 중에서, 잠재적인 새로운 암 면역요법으로서, 현재 넥틴-유사 패밀리 내의 수용체 및 리간드 군이 조사 중에 있다. 이 패밀리의 수용체는 DNAM-1 (CD226), CD96 (TACTILE), TIGIT, 더 최근에는 PVRIG (CD112R)를 포함한다 (13) (14) (15). 이들 분자 중에서, DNAM 2 리간드, PVR (CD155) 및 PVRL2 (CD112)에 대한 결합이 이 서브패밀리 내에 활성화 수용체이고, 림프구로 활성화 신호를 전달한다 (16). 이 패밀리의 두 개 수용체는 인간 림프구 기능, TIGIT 및 더 최근에는 PVRIG를 억제하는 것으로 나타 났다 (17) (18). TIGIT가 PVR와 높은 친화성으로, PVRL2에는 훨씬 더 약한 친화성으로 상호작용을 하는 것으로 보고되어 있고, 이의 ITSM 모티브를 통해 림프구에 억제성 신호를 전달함으로써 T 세포 및 NK 세포 반응 모두를 억제하는 것으로 나타났다 (19) (20). 더 최근에, PVRIG는 PVRL2에 높은 친화성으로 결합하고 ITIM 모티프를 통해 억제성 신호를 전달하는 것으로 나타났다 (15). 두 경우 모두에서, TIGIT와 PVR의 친화성 및 PVRIG와 PVRL2의 친화성은 DNAM와 PVR 또는 PVRL2의 친화성보다 높으며, TIGIT 및 PVRIG는 DNAM으로부터의 PVR 및 PVRL2와 경쟁할 수 있음을 시사하고, TIGIT 및 PVRIG가 T 세포 기능을 감소시키는 간접적인 기작을 제공한다. 이 패밀리 내에서 PVR은 또한 CD96의 리간드이다. CD96의 기능은 마우스 림프구 (21)에서 억제성이지만 인간 림프구에서는 (22)활성화되는 것으로 보고되었다. 이들 데이타에 기초하여, 본 발명자는 T 세포 기능을 약화시키는 억제성 신호를 전달하기 위해 두 개의 수용체, TIGIT 및 PVRIG가 각각 PVR 및 PVRL2에 높은 친화성으로 결합하는 인간 림프구를 가정한다.
인간 PVRIG가 최근의 한 보고서에서 T 세포 반응을 억제하는 것으로 밝혀졌지만, 암 면역 감시에서의 PVRIG 및 PVRL2의 역할은 잘 알려져 있지 않다. 상세하게, 암에서 이 경로의 발현 프로파일 및 CD8 T 세포 항-종양 반응을 조절하는 데 PVRIG의 역할은 보고되지 않았다. 또한, 마우스 PVRIG 유전자의 기능적 특성화 및 전임상 종양 모델에서 생체내 PVRIG-PVRL2 상호작용을 교란하는 효과는 보고되지 않았다. 본원에서, 본 발명자는 종양 세포 공동-배양 검정 및 전임상 종양 모델에서 암의 PVRIG 및 PVRL2 발현 프로파일 및 PVRIG 길항기작의 효과를 보고함으로써 암 세포 설정에서 PVRIG의 역할을 밝혀냈다. 본 발명자는 PVRIG가 TIGIT 또는 CD96과 비교하여 T 세포 하위집합에 차별화된 발현 프로파일을 가지고 있으며, PVRIG 및 PVRL2 발현이 정상 인접 조직과 비교하여 암에서 유도된 것을 입증한다. 다수의 인간 시험관내 검정 시스템에서 고친화성 PVRIG 길항적 단일클론 항체 (CHA.7.518.1.H4 (S241P))는 특히 항-TIGIT 또는 항-PD1 항체와 조합될 때 T 세포 기능을 증진시켰다. 또한, 본 발명자는 길항적 항체 또는 PVRIG 결핍 마우스를 사용하여 마우스 PVRIG의 새로운 특성화를 보고하고 PVRIG-PVRL2 상호작용의 억제가 PD-1 억제 또는 TIGIT 유전자 결핍과 조합으로 가장 강력한 효과와 함께 종양 성장을 감소시켰던 것을 보여준다. 종합적으로, 이 데이타는 PVRIG가 T 세포 항-종양 반응을 조절하는 데 결정적인 억제성 수용체임을 보여주고, 암 환자의 임상 시험을 위해 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 개발을 지원한다.
재료 및 방법
인간 말초혈액 및 종양 발현 연구
건강한 공여자 인간 PBMC는 헬싱키 선언에 따라 스탠포드 대학 (Stanford University)으로부터 획득하였다. 인간의 조직은 인간 조직 협력 네트워크, 국립 암 연구소 지원 자원에 의해 제공되었다. 인간 암 조직 및 매칭된 정상 인접 조직은 제조사의 프로토콜 (Miltenyi Biotec)에 따라 단일 세포로 해리되었다. 해리된 세포는 상이한 세포 하위집합 상의 다양한 표적의 발현을 위해 유동세포계측법에 의해 분석되었다. 개별 세포 하위집합의 각 표적 발현의 경우, 표적의 MFI 값을 이소형 대조군의 MFI 값으로 나누어 발현 배수 값을 계산하였다. 다른 연구자가 이들 동일한 조직 표본으로부터 시료를 받았을 수 있다 종양 유형은 각 시료에 대한 병리학 보고서를 검토하여 결정되었다. IHC 연구의 경우, 보조 PVRL2 항체 (HPA-012759, Sigma) 및 PD-L1 (Sp142, SpringBio)을 사용하여 보완 방법에 설명된 바와 같은 조건을 사용하여 종양 마이크로어레이 (Biochain 연구소)를 염색하였다. 동일한 종양으로부터 두 벌의 코어에 대한 두 명의 독립적인 검토자가 점수를 매겼다.
PVRIG 항체 생성 및 특성화
항-인간 PVRIG 및 항-마우스 PVRIG 항체는 보완 방법에 상술된 바와 같이 생성하였다. 간략하게, 항체 결합 특이성 및 친화성은 유전자를 발현하지 않는 세포에 대한 검출가능한 결합없이 PVRIG 조작된 세포에 대한 선택적 결합에 의해 평가되었다. 이들 항-PVRIG 항체의 길항적 활성은 PVRIG와 PVRL2의 상호작용이 교란된 ELISA 및 FACS 기반의 검정법을 사용하여 결정하였다. 세포 기반의 검정의 특성화를 위해, 항체를 PBMC 또는 종양-유래 T 세포 배양에서 PVRL2를 발현하는 표적 세포로 구성된 여러 T 세포-표적 세포 공동- 배양 검정 시스템에서 테스트하였다. 이전에 기술된 바와 같이 gp100 특이적 T 세포주는 흑색종 종양으로부터 증식되었 (23). CMVpp65 반응성 T 세포는 CMVpp65 (495-503), IL-2 및 IL-7을 갖는 건강한 공여자 PBMC (CTL 면역 스폿)로부터 10일 동안 증식되었다. 조합 연구를 위해, PD-1, TIGIT 및 PVRIG에 대한 항체를 10 μg/ml에서 사용하였다. 세포측정 비드 어레이 (Cytometric Bead Array, CBA)를 사용하여 조건부 배지의 사이토카인 농도를 결정하고 보완 방법에 기술된 바와 같이 FACS 염색을 수행하였다.
마우스 PVRIG 발현 및 기능의 특성화
mPVRL2 및 mPVR와 마우스 PVRIG의 결합 상호작용은 재조합 PVRIG, PVRL2 및 PVR 단백질을 사용하는 SPR 및 ELISA에 의해 및 이소적으로 조작된 PVRIG 및 PVRL2 과다발현 세포주 또는 PVR 또는 PVRL2 siRNA를 형질감염된 세포주를 사용한 FACS에 의해 평가하였다. PVRIG 및 TIGIT 결핍 마우스는 보완 방법에 기술된 바와 같이 생성되었다. 발현 분석을 수행하여 비장, 림프절 및 다양한 세포 하위집합의 종양에서 PVRIG의 발현을 조사하였다. 마우스 PVRIG에 대한 T 세포 조절 활성을 입증하는 세포 기능적 검정은 보완된 재료 및 방법에서 상술된 바와 같이 WT 및 PVRIG-/- T 세포 및 PVRL2 Fc 또는 PVRL2가 이소적으로 발현된 표적 세포를 사용하여 확립되었다. CT26, MC38 및 B16/Db-hmgp100 종양 모델을 보완된 방법에 기술된 바와 같이 수행하였다. 모든 연구는 텔아비브 대학교 (이스라엘 텔아비브) 또는 존스홉킨스 대학교 (볼티모어, 미국)에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았다.
결과
PVRIG 발현은 말초 혈액 및 종양의 효과기 T 세포에서 가장 높다
Ig 슈퍼패밀리 (IgSF)는 수백 개의 단백질로 구성되지만 이들 중 소수만이 T 세포 억제성 수용체이다. IgSF의 단백질은 빠르게 진화하는 경향이 있고 (24), 따라서 이들 단백질 간의 서열 유사성은 일반적으로 낮으며 새로운 면역 수용체를 확인하는 데 최적이지 않다. 새로운 면역 체크포인트를 확인하기 위해, 본 발명자는 유전자 구조, 단백질 도메인, 예측된 세포 위치 파악 및 발현 양상과 같은 알려진 면역 체크포인트 중에서 공유된 게놈 및 프로테옴 특성화에 기초하여 생물정보학 알고리즘을 개발하였다. 이들 알고리즘을 사용하여 PVRIG는 새로운 면역 수용체로서 확인되었다. 보고서는 최근에 인간 PVRIG (CD112R)는 PVRL2에 결합하고 T 세포의 기능을 억제하는 것도 역시 입증하였다 (15). 그러나, 종양 면역 감시를 조절하는데 이 경로의 관련성은 보고된 바 없었다. 본원에서, 본 발명자는 인간 암 및 전임상 종양 모델에서 PVRIG 및 PVRL2의 발현 및 기능을 밝혀냈다. 건강한 공여자의 말초혈액에서 PVRIG는 CD8 T 세포와 NK 세포에서 가장 높은 발현을 보이는 림프구에만 배타적으로 발현되었다 (도 83a). 또한 T 세포의 하위집합 분석은 Treg 하위집합와 비교하여 CD8 또는 CD4 기억/효과기 T 세포 하위집합에서 가장 높은 PVRIG 발현을 나타냈다 (도 83b, 도 90a). 우세한 기억 T 세포 발현 양상은 PVRIG를 패밀리 내의 다른 수용체 (TIGIT, CD96)와 구별하며, 기억/효과기 T 세포와 비교하여 Treg 상에 동등하거나 더 높은 발현을 보이는 경향이 있다. 본 발명자는 두 개의 검정 시스템 (CMV 회상 반응의 도 83c, DC-MLR의 도 83d, 도 90b)에서 T 세포 활성화 후 PVRIG 및 TIGIT의 발현 역학을 추가로 비교하였고, TIGIT와 비교하여 PVRIG가 유도의 지연된 동력학 및 후기 시간대에 더 지속적인 발현을 가진 것을 보여준다. TIGIT와 비교하여 기억/효과기 세포에서 PVRIG의 선호적 발현은 T 세포 반응을 조절하는데 PVRIG의 독특한 역할을 제시한다.
활성화 후 T 세포에서의 PVRIG 발현의 지연되고 지속되는 유도는 이것이 종양 미세환경에서 발현될 수 있음을 시사하였다. 다음으로, 본 발명자는 FACS에 의해 생체외에서 직접 해리된 인간 종양으로부터의 백혈구 상에서 PVRIG의 발현을 분석하였다. PVRIG의 발현은 다수의 종양 유형으로부터의 CD8 T 세포, CD4 T 세포 및 NK 세포에서 검출되었다 (도 83e 내지 83g, 도 90c). PVRIG는 CD4 및 CD8 T 세포 상에서 PD-1 및 TIGIT와 함께 발현되었다 (도 83f). 평균적으로, 방광, 결장직장 및 전립선과 비교하여 유방, 자궁내막, 두경부, 폐, 신장 및 난소 종양으로부터의 CD4+ 및 CD8+ TIL에서 더 높은 발현이 검출되었다. 생체외에서 PVRIG 발현이 낮거나 존재하지 않는 종양 시료에서 항-CD3 및 항-CD28로 활성화하면 PVRIG의 발현이 증진되었고, PVRIG의 TIL 발현이 재활성화 시 추가로 유도될 수 있음을 제시한다 (도 90d). 결장, 폐, 신장, 자궁내막 및 난소 종양의 경우, 본 발명자는 동일한 환자로부터의 정상 인접 조직을 얻었고 종양 대비 정상 조직으로부터 분리된 림프구에서 PVRIG 발현을 비교할 수 있었다. TIL는 매칭되는 정상 인접 조직 (NAT)으로부터 분리된 세포와 비교하여 CD4 및 CD8 T 세포에서 PVRIG의 유의한 유도를 보였다 (도 90e). PBMC와 마찬가지로, 본 발명자는 폐암, 자궁내막암 및 신장 종양으로부터의 Tregs 대비 CD8 T 세포에서 PVRIG, TIGIT 및 PD1 발현을 추가로 비교하였다. TIL에서, TIGIT 발현은 CD8 T 세포에서 유사하거나 더 높은 발현이 관찰되었다 (도 83h). 다음으로, 본 발명자는 생체외 TIL에서의 발현 크기 또는 종양과 NAT 간의 발현의 배수 변화 크기에 대한 상관 관계 분석을 통해 T 세포 집단에 대한 PVRIG, TIGIT 및 PD-1의 공동-조절을 조사하였다. 둘 다의 분석에서 CD4와 CD8 T 세포는 PVRIG와 PD1 또는 TIGIT 간에 양성의 유의한 상관 관계를 보였다 (도 90f). 종합적으로, 이들 데이타는 PVRIG가 종양의 T 세포 기능을 조절하는데 결정적일 수 있는 새로운 억제성 수용체 표적으로서 PVRIG를 배치하면서, 다수의 인간 암으로부터의 T 세포 및 NK 세포에서 PVRIG가 발현되는 것을 입증한다.
정상 인접 조직과 비교하여 종양 조직에서 PVRL2 발현이 증진된다.
PD-L1 발현이 PD-1 억제제에 대한 반응을 예측하도록 돕는 것으로 입증되면서, 본 발명자는 PVRL2의 발현이 인간 암 조직에서, 이의 동족 수용체 PVRIG의 발현과 동시적인지 여부를 조사하였다. 본 발명자는 FFPE 시료 (도 91a)의 염색을 항-PVRL2 항체를 사용하여 확인하여, 폐, 결장, 피부, 유방, 난소/자궁내막, 신장 암 조직으로 구성되는 종양 마이크로어레이 (TMA)를 염색하였고, 각각의 코어를 유병율 및 PVRL2 발현의 강도에 기초하여 점수를 매겼다. PVRL2 발현은 이들 장기의 정상 조직 시료의 대부분에서 존재하지 않거나 최소한으로 발현되었다. 종양 조직에서, 종양 세포 상의 PVRL2 발현은 폐, 결장, 유방 및 난소/자궁내막 암의 50 내지70%에서 검출되었다 (도 84a, 84f). 신장암 시료에서의 발현은 20 내지 40% 범위이었던 한편 흑색종에서의 발현은 가장 낮았다 (약 10%) (도 84a, 84f). PVRL2 발현은 종양 세포 및 면역 세포 상의 침윤성 부위에서 검출되었다 (도 84b). PVRL2를 발현하는 특이적 면역 세포 하위집합을 결정하기 위해, 본 발명자는 신선한 해리된 종양에 대해 유동 세포계측법을 수행하였다. PVRL2의 발현은 다수의 종양 유형으로부터의 CD45+ 면역 세포, 특히 골수 세포 (예로, CD14+ 종양 연관된 대식구 (TAM) 및 골수 DC) 및 CD45- 비-면역 세포 상에서 검출되었다 (도 84c, 84d). PVRL2의 발현은 림프구에서 검출되지 않았다 (데이타 미도시). 결장, 폐, 신장, 자궁내막 및 난소 종양으로부터 분리된 CD45- 세포 및 TAM 상의 PVRL2 발현의 비교는 동일한 공여자의 매칭된 NAT로부터 분리된 세포와 비교하여 종양으로부터 분리된 세포 상에서 PVRL2의 유의한 유도를 보여주었다 (도 92). 본 발명자가 PVRIG 및 PVRL2 발현을 얻은 시료의 경우, 본 발명자는 골수에서 및 다수의 종양 유형으로부터의 CD45- 세포에서 PVRL2와 비교하여 림프구 상의 PVRIG의 발현을 조사하였다. 조사된 암 유형 중에서도, 자궁내막, 폐, 신장 암이 PVRIG고 림프구 및 PVRL2고 TAM 또는 CD45- 비-면역 세포의 가장 높은 유병률을 가졌다 (도 82e, 도 93). TMA와 해리된 종양 연구의 데이타를 통합하여, 본 발명자는 유방, 자궁내막, 폐, 두경부, 신장 및 난소 종양이 PVRIG 길항기작의 예시적인 반응성 종양 유형일 수 있음을 입증한다.
PD-L1과 비교하여 PVRL2 발현은 차별적으로 조절되고 PD-L1의 종양에서 존재한다
PVRIG 및 PD-1이 종양-침윤성 림프구 (TIL)에서 공동- 발현될 수 있으므로, 본 발명자는 동일한 종양에서 PVRL2 및 PD-L1의 공동-발현을 동일한 TMA의 일련의 절편을 염색함으로써 역시 조사하였다. 종양 세포 상의 PVRL2 발현은 PD-L1- 종양 시료에서 PD-L1+ 시료와 비교하여 유사한 빈도 및 평균 점수로 명백하게 검출되었다 (종양 세포 또는 면역 세포에 막 PD-L1 염색이 없음에 의해 정의됨). (도 85a, 도 84f). 면역 세포에서 PVRL2 발현이 검출된 5개 종양 중 3개가 PD-L1을 역시 발현하였지만 (데이타 미도시), 소수의 시료가 면역 세포 상에 PD-L1 및 PVRL2의 공동-발현에 관하여 결론을 내리기가 어렵게 한다. 종양-PD-L1 음성 종양에서 종양 세포 상의 PVRL2의 발현은 PVRL2 발현이 일부 종양 유형에서 PD-L1보다 우세하고, 이 경로의 표적화가 PD-L1- 종양에서 특히 효과적일 수 있는 것을 제안하였다. PD-L1은 적응적 저항성의 기작으로서 IFN-에 의해 주로 유도되는 반면 (28), PVRL2는 게놈 스트레스, DNA 손상, 종양 억제인자 유전자에 의해 조절된다 (29,30). PD-L1 및 PVR/PVRL2의 구별된 조절을 더 이해하기 위해, 다음으로 본 발명자는 종양 세포주 및 단핵구-유래 DC에서 PVR, PVRL2 및 PD-L1 발현의 조절을 다양한 염증성 자극에 노출시킴으로써 평가 하였다 (도 85d). 전염증성 신호로 DC를 치료하면 일반적으로 PVR, PVRL2 및 PD-L1 발현이 증가하여 DC 성숙 시 PVR, PVRL2 및 PD-L1 발현이 증가하는 것을 보여준다. 대조적으로, IFN-γ로 상피 세포의 처리는 PD-L1의 발현을 증가시켰지만, PVRL2의 높은 기저선 발현에 미치는 효과는 없었고 (도 85e), IFN-γ에 의한 PD-L1과 비교하여 PVRL2 발현의 차별적 조절을 지지한다. 요약하면, 이들 발견은 PD-L1 및 PVRL2가 DC와 같은 항원 제시 세포 (APC) 상에서 공동-조절될 수 있지만, 상피 세포상에서 차별적으로 조절될 수 있음을 가리킨다. PD-L1 음성 종양에서 PVRL2의 존재는 이 경로의 표적화가 PD-L1 억제제에 대한 비-반응성 또는 진행중인 환자의 잠재적인 이득이 될 수 있음을 시사한다.
CHA.7.518.1.H4 (S241P)는 PVRL2에 대한 PVRIG의 상호작용을 교란시키는 PVRIG에 대한 고친화성 인간화 단일클론 항체이다
인간 PVRIG-PVRL2 상호작용을 길항하는 기능적 결과를 조사하기 위해 본 발명자는 PVRIG 및 PVRL2의 상호작용을 차단하는 높은 친화성, 길항적인 항-PVRIG 항체 CHA.7.518.1.H4 (S241P)를 생성하였다. 이 항체는 인간 PVRIG 또는 시노몰거스 머카크 PVRIG를 이소적으로 발현하는 HEK293 세포에 선택적으로 결합하고 나노몰 이하의 친화성를 갖는 내인성으로 PVRIG를 발현하는 Jurkat 세포도 역시 결합시켰다 (도 86a). 생화학적 검정에서, CHA.7.518.1.H4 (S241P)는 PVRL2+ HEK293 세포 (도 86b)와 PVRIG Fc의 상호작용을 차단하고 또한 PVRIG+ HEK293 세포 (도 86C)에 대한 PVRL2 Fc 결합도 차단한다. 이 항체를 사용하여 본 발명자는 여러 T 세포 검정에서 길항적인 항-PVRIG의 기능적 효과를 관찰하였다. 세포 표면 항-CD3 항체 및 인간 PVRL2를 이소적으로 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 생성하였고, 항-인간 PVRIG (CHA.7.518.1.H4 S241P)) 또는 이소형 대조군의 존재 시 일차 인간 CD4 T 세포와 공동-배양하였다. PVRIG 발현은 CHO 항-CD3 aAPC와의 공 배양 시에 증식하는 CD4 T 세포에서 유도되었다 (도 94a). CHA.7.518.1.H4 (S241P)로의 PVRIG의 길항기작은 다수의 공여자로부터의 CD4 T 세포의 증식을 증진시켰다 (도 86d). 본 발명자는 또한 흑색종 종양으로부터 유래된 두 개의 인간 gp100 반응성 CD8 T 세포주에 미치는 항-PVRIG의 효과를 테스트하였다. 이들 T 세포주는 이소형 대조군 IgG 또는 항-PVRIG 항체의 존재 시 HLA-A2 및 PVRL2를 발현하는 aAPC와 개별적으로 공동-배양하였다 (도 94b). 두 개의 세포주 모두에서 관찰된 바와 같이, 항-PVRIG는 IFN-γ 및 TNF-α 생산을 약 20 내지 50% 증가시켰다. 용량 반응 평가에서, CHA.7.518.1.H4 (S241P)는 다중 검정에서 단일 자리수 나노몰 EC50 값을 나타내었다 (도 94c, 94d). 이들 데이타는 종합적으로 CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 PVRIG-PVRL2 상호작용을 길항하면 T 세포 활성화가 증가하는 것을 입증한다.
TIGIT 또는 PD-1 억제제와 조합한 CHA.7.518.1.H4 (S241P)는 T 세포 기능의 상승적 증진을 유도한다.
PVRIG 및 TIGIT 차단의 조합은 T 세포-수지상 세포 공동-배양 검정에서 (15), CD4 T 세포의 기능을 상승적으로 증가시켰고, T 세포-APC 상호작용을 조절하는 데 이 경로의 역할을 제시한다. 종양 세포 공동-배양 설정에서 CD8 T 세포에 미치는 PVRIG 및 TIGIT 차단의 효과는 보고되지 않았다. 본 발명자의 종양 발현 프로파일링은 CD45- 면역 세포 상의 PVRL2의 발현을 보여주면서, 본 발명자는 2개의 T 세포 검정 시스템을 사용하여 T 세포-종양 세포의 공동-배양에서 이 경로의 표적화의 효과를 추가로 탐구하였다. 본 발명자는 먼저 항-PVRIG, 항-TIGIT 또는이소형 대조군 항체의 존재 시, 흑색종 세포주인 MEL624와 함께 2개의 gp100 종양 항원 특이적 CD8 T 세포주를 개별적으로 또는 조합하여 공동-배양을 수행하였다. MEL624 세포는 PVR과 PVLR2 둘 다를 발현하며, TIL-209와 TIL-463 둘 다는 PVRIG, TIGIT 및 PD-1을 발현한다 (도 86f). TIL-209에서, 본 발명자는 항-PVRIG 또는 항-TIGIT 단독이 IFN-γ를 증가시키지 않았으며 항-PVRIG와 항-TIGIT의 조합이 IFN-γ 생산을 상승적으로 증가시키는 것을 관찰하였다 (도 86g). TIL-463에서, 본 발명자는 항-PVRIG 또는 항-TIGIT가 IFN-γ 생산을 약간 증가시키고, 항-PVRIG와 항-TIGIT의 조합이 IFN-γ를 추가적으로 증가시키는 것을 관찰하였다 (도 86g). 추가적인 검정 시스템에서, 본 발명자는 인간 T 세포 반응을 연구하기 위한 모델 시스템으로서 CMVpp65 반응성 CD8 T 세포를 활용하였다. HLA-A2+ CMVpp65 CD8 T 세포는 CMVpp65 (495-503)의 존재 시 증식되었고, PVRIG, TIGIT 및 PD-1의 발현은 10일째에 관찰되었다 (도 86f). PVRIG는 CMVpp65 특이적 CD8 T 세포에서 인간 암 시료에서 관찰된 것과 유사한 정도로 발현되었다 (도 83). 표적 세포로서, 본 발명자는 유사한 양의 PVR과 PVRL2를 둘 다 발현한 PD-L1고 (Panc05.04)와 PD-L1저 (Colo205) HLA-A2+ 암 세포주를 확인하였다 (도 86f). 본 발명자는 다음으로 PVRIG, TIGIT 및/또는 PD-1에 대한 항체를 차단하는 상태에서 pp65 (495-503) 펩타이드로 펄스 처리된 HLA-A2+ 종양 세포주와 CMVpp65 반응성 T 세포의 공동-배양을 수행하였다. 본 발명자는 항-PVRIG Ab가 Panc05.04 세포와의 공동-배양에서 약 50%까지 및 Colo205와의 공동-배양에서 최소한으로 IFN-γ를 증가시키는 것을 관찰하였다 (도 86i). 항-TIGIT와 항-PVRIG Ab의 조합은 둘 다의 표적 세포주에서 FN-γ 생산을 상승적으로 증가시켜서, PD-1 항체 단독과 비교하여 IFN-γ의 더 큰 증가를 유도하였다 (도 86h). 항-PVRIG와 항-PD-1의 조합은 또한 개별 항체와 비교하여 IFN-γ 생산의 상승 작용 증가를 가져왔다 (도 86i). 종합적으로, 이 데이타는 종양 세포와 상호작용 시 인간 CD8 T 세포의 활성화 증가에 PVRIG와 TIGIT 또는 PVRIG 및 PD1 차단을 조합하는 것의 강력한 상승 작용 효과를 제시한다.
PVRIG 결핍은 T 세포 증식을 증가시키고 종양 성장을 감소시켰다
마우스 PVRIG 및 마우스 PVRL2과 이의 상호작용을 위한 서열이 보고되었지만, 발현 프로파일 및 마우스 PVRIG의 면역 조절 활성은 잘 알려져 있지 않다. 본 발명자는 먼저 NK, NKT 및 T 세포에서 mPVRIG RNA 발현 및 전사를 분석하였다 (도 87a). 활성화된 마우스 CD8 T 세포는 TIGIT와 비교하여 지연된 유도 동력학으로 PVRIG 전사물을 증가시켰다 (도 87b). 본 발명자는 재조합 mPVRIG가 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 여러 검정 배향으로 수행된 ELISA에 의해 mPVRL2 단백질에 결합하는 것을 검증하였다 (도 95a 내지 95d). 또한 본 발명자는 mPVRIG와 mPVR 간의 상호작용을 관찰하였지만, 친화성은 mPVRL2와의 상호작용보다 대략 10배 적었다 (도 95e). PVR 또는 PVRL2가 mPVRIG의 우세한 리간드인지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자는 PVR과 PVRL2를 발현하는 B16F10 세포에 마우스 PVRIG Fc의 결합을 테스트하였다 (데이타 미도시). PVRIG Fc는 B16F10 세포에서 PVRL2 siRNA 녹다운 시 완전히 차단되는 B16F10 세포에 대한 용량-의존성 결합을 나타내었다 (도 95f). 대조적으로, PVRIG Fc 융합 단백질의 결합은 PVR 녹다운 (도 95f) 이후 약간 감소되었지만 지속적으로 감소하여 mPVRIG와 mPVR 간에 매우 약한 상호작용이 발생함을 시사한다. 종합적으로, 이들 결과는 인간의 경우와 같이 마우스에서 PVRL2가 PVRIG의 주요 리간드임을 보여준다.
면역 반응에서 PVRIG의 역할을 설명하기 위해 본 발명자는 PVRIG 결핍 (-/-) 마우스를 생성하였다 (도 96). PVRIG-/- 마우스는 예상되는 멘델의 비율로 태어났고 10개월령까지 명백한 표현형을 나타내지 않았으며, 8주령에는 야생형 마우스와 비교할 때 유사한 백혈구 세포질 (말초 및 림프 조직)을 가졌다 (도 97) . 야생형 (WT) CD8 T 세포 및 NK 세포는 PVRIG를 발현하고 PVRIG의 발현은 PVRIG-/- 세포에서 검출되지 않았다 (도 87c). 마우스 T 세포 반응을 조절하는 데 PVRIG의 역할을 조사하기 위해, 본 발명자는 두 개 분석 시스템에서 WT 및 PVRIG-/- T 세포의 증식을 조사하였다. WT 또는 PVRIG-/- T 세포를 용해성 PVRL2 Fc 또는 대조군 Fc 단백질의 존재 시 고정화된 항-CD3으로 활성화시켰다. 용해성 PVRL2는 Fc WT CD4+ T 세포 증식을 유의하게 억제하지만 PVRIG-/- CD4+ T 세포 증식은 아니었고 (도 87d), PVRIG-/- 세포가 억제성 신호가 결여된 것을 시사한다. 종양 세포와 CD8+ T 세포의 상호작용에 마우스 PVRIG의 역할을 평가하기 위해 PVRIG-/- 마우스는 gp10025-33에 특이적인 유전자전환 TCR을 발현하는 pmel TCR 유전자전환 마우스로 사육되었다 (28). 활성화된 PVRIG-/- 또는 WT Pmel CD8+ T 세포는 PVRL2를 내인성으로 발현하는 B16-DB/gp100 흑색종 종양 세포와 공동-배양하였고 (데이타 미도시), 활성화 및 효과기 기능이 평가되었다. PVRIG-/- pmel CD8+ T 세포는 WT 세포와 비교하여 증진된 탈과립화 및 효과기 사이토카인 (IFN-γ 및 TNF-α)의 생산을 보였다 (도 87e). 이들 데이타는 마우스 PVRIG가 PVRL2+ 종양 표적 세포와의 공동-배양시 종양-특이적 T 세포의 활성화 및 효과기 기능을 억제함을 가리킨다.
다음으로 본 발명자는 MC38 동족 모델에서 PVRIG 결핍이 종양 성장에 미치는 효과를 연구하였다. PVRIG-/- 마우스는 WT 마우스와 비교하여 종양 성장을 유의하게 감소시켰다 (p <0.05; 도 88a 내지 88b). 또한, 14일째에 시작하여 PD-L1 차단은 상기 항-종양 반응을 더 증폭시켰고, 항-PD-L1 처리된 WT 마우스와 비교하여 PVRIG-/- 마우스의 종양 성장을 감소시켰다 (p = 0.052) (도 88c 내지 88d). PVRIG-/- 및 WT 종양 미세환경에 미치는 PD-L1 차단의 기능적 효과를 평가하기 위해, 본 발명자는 처리군이 이소형 또는 항-PD-L1의 2회 용량을 수여받을 때 18일째 네 개의 실험 집단 중 하나로부터의 종양과 종양-유출 림프절을 수확하였지만, 종양 부피의 차이는 관찰되지 않았고, 면역 하위집합 조성물 및 세포내 사이토카인에 대한 유동 세포계측법을 수행하였다. CD8+ T 세포 (WT 종양에 비해 92%) 및 IFN-γ 생산 CD8+ T 세포 (WT 종양 대비 110%)와 같이 PVRIG-/- 종양으로의 면역 세포 (CD45+) 트래피킹은 약간 증진되었다 (WT 종양에 비해 88%; 도 88e). PD-L1 차단과 조합하여, CD45+ 세포의 침윤은 PVRIG-/- 종양 (항-PD-L1- 처리된 WT 마우스로부터의 종양에 비해 160%, p = 0.032; 도 88f)에서 유의하게 증가하였다. 항-PD-L1 처리된 PVRIG-/- 종양은 또한 항-PD-L1 처리된 WT 종양과 비교하여 종양 중량 당 총 CD8+ T 세포 (252% 증가) 및 IFN-γ-생산 CD8+ T 세포 (297% 증가)의 수가 더 많았다 (도 88f). 본 발명자는 또한 PVRIG-/- 마우스가 PD-L1 차단 (데이타 미도시)에 관계없이 변경되지 않은 효과기 종양-침윤성 CD4+ T 세포 및 Foxp3+ Treg 세포 수를 가진 것을 관찰하였다. PVRIG-/- 종양의 면역 부전의 복구는, 특히 PD-L1 차단 후에, 항-PD-L1-처리된 WT 마우스와 비교하여 IFN- + TNF- + 효과기 CD8+ T 세포의 빈도가 증가했던 종양-유출 림프절에서 관찰되었다 (도 88g 내지 88h). 종합적으로, 이들 데이타는 특히 PVRIG 제거가 항-PD-L1 항체 치료와 조합될 때 증가된 항-종양 면역 반응과 관련된 종양 성장을 감소시키는 것을 입증한다.
항-mPVRIG 항체는 PD-1 항체 또는 TIGIT 결핍과 조합하여 종양 성장을 억제하였다
PVRIG의 유전적 결핍이 종양 성장을 감소시키는 것을 입증한 후, 본 발명자는 PVRIG-PVRL2 상호작용의 항체-매개성 억제가 본 발명자의 인간 시험관내 데이타가 밝힌 바와 같이 특히 PD1 또는 TIGIT 억제제와 조합하여 항-종양 면역을 개선시킬 수 있는 것을 입증하고자 하였다. 이것을 평가하기 위해 본 발명자는 고친화성, 길항적 항-mPVRIG 항체를 생성하였다. FACS에 의해 결정된 항-mPVRIG 단일클론 항체의 친화성 평가는 CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 유사하게 나노몰 이하의 Kd (HEK293 mPVRIG 상에 0.33 nM, D10.G4.1 세포 상에 0.39 nM)를 나타냈다 (도 95g 내지 95h). 이 항체의 특이성은 mPVRIG 녹다운 시에 D10.G4.1 세포에 대한 결합의 대부분이 폐기됨에 따라 추가로 검증되었다 (도 95i). 항-MPVRIG는 mPVRIG Fc와 B16F10의 결합 및 mPVRIG-과다발현 HEK293 세포에 대한 mPVRL2 Fc의 결합을 억제함으로써 mPVRIG-mPVRL2 상호작용을 교란시키는 것을 테스트하였다 (도 89a). 항-mPVRIG 항체에 의한 PVRIG-PVRL2 상호작용의 완전한 차단이 둘 다의 항체 형식 (도 89a, 도 95j)에서 관찰되었으며, 길항적 항-mPVRIG 항체를 입증하였다. 다음으로, 본 발명자는 동종 CT26 피하 결장 종양 모델에서 mPVRIG 차단의 생체내 효능을 테스트하였다. PVRIG 발현은 비장 또는 유출 림프절 하위집합과 비교하여 종양 미세환경에서 NK 및 T 세포 상에서 상승되었다 (도 89b). 단독 요법으로 종양 보유 마우스를 항-mPVRIG 차단 단일클론 항체로 치료하는 것은 종양 성장을 감소시키지 못하였다 (데이타 미도시). 그러나, 항-PVRIG 및 항-PD-L1 단일클론 항체의 조합은 효과적으로 CT26 종양 성장을 지연시켰고 (도 89c), 완전 반응자의 40%의 비율로 처리된 마우스의 생존율을 유의하게 증가시켰다 (도 89d). 인간 T 세포 검정 데이타와 부합하여, 이들 데이타는 PD-1과 PVRIG 억제제의 조합이 종양 성장을 감소시킬 수 있음을 보여준다.
본 발명자는 또한 항-종양 반응의 조절에서 PVRIG와 TIGIT 신호전달을 모두 제거하는 효과를 테스트하였다. 이들 연구에서 B16F10/Db-hmgp100 흑색종 세포를 접종한 WT 또는 TIGIT-/- 마우스에서 항-mPVRIG 항체의 효능을 테스트하였다. 항-mPVRIG 차단 단일클론 항체로 종양 보유 WT 마우스의 치료는 이소형 치료 (11일째 TGI 17%, 종결점 18일째 TGI 8%)와 비교하여 미미한 효과가 있었다. TIGIT 결실이 종양 성장에 미치는 효과는 WT 대조군 (11일째 TGI 17%, 종결점에서 TGI 13%)과 비교하여 미미하였다. 그러나, TIGIT 결실이 항-PVRIG mAb 처리와 조합될 때, 유의한 종양 성장 억제가 관찰되었다 (11일째 TGI 63% 및 종결점에서 49%) (도 89e, 89f). 종양 성장 억제에 따라, 항-PVRIG 단일클론 항체 407로 치료한 TIGIT-/- 마우스는 WT 대조군과 비교하여 생존율이 증가하였으나, 이 공격적인 신속히 성장하는 종양 모델에서 통계적 유의성은 달성하지 못하였다 (데이타 미도시). 종합적으로, 이들 데이타는 PD1 또는 TIGIT 억제제와 함께 PVRIG 억제제의 상승적 활성을 입증하고, PD1 또는 TIGIT 억제제를 사용한 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 임상 시험의 이론적 근거를 제공하는 본 발명자의 인간 기능적 데이타와 일치한다.
논의
CTLA4 및 PD-1과 같은 면역 T 세포 체크포인트를 표적하는 항체가 암 환자 생존을 증가시켰지만, 대다수의 암 환자는 여전히 임상적 이익을 나타내지 않다. 이에 대한 가능한 이유 하나는 T 세포 항-종양 면역을 억제하는 추가적인 T 세포 조절제의 존재이다. 본원에서 본 발명자는 효과기 T 세포 기능을 조절하는 PVRIG의 역할을 밝히고 PVRIG 길항기작이 T 세포 항-종양 반응을 증가시키고 종양 성장을 감소시키는 것을 입증한다.
PVRIG는 넥틴 및 넥틴-유사 패밀리의 새로운 구성원이고, 패밀리 내의 여러 알려진 면역조절 수용체 중에 배치된다. 이 패밀리 내 수용체의 상호작용을 이해하는 것은 PVRIG 작용의 관련성과 작용기작을 이해하는 데 중요하다. 이들 수용체 중에서 DNAM, TIGIT 및 CD96은 동일한 리간드인 PVR 및 PVRL2를 공유하는 견지에서 PVRIG와 가장 밀접하게 관련된다. DNAM은 PVR과 PVRL2 모두에 결합하여 림프구에 보조자극 신호를 전달한다. TIGIT는 PVR에 결합하고 PVRL2에는 약하게 결합하는 것으로 보고되어 있다. ELISA 또는 SPR을 사용하여 TIGIT와 PVRL2 사이의 상호작용을 검출할 수 없었으며 (데이타 미도시), PVR이 TIGIT의 우세한 리간드임을 시사한다. 유사한 방법을 사용하여, 본 발명자 및 최근의 보고서는 PVRL2와 PVRIG 사이의 높은 친화성 상호작용을 검출하였고, PVRIG가 PVRL2에 대한 우세한 억제성 수용체임을 시사한다. 이들 데이타는 TIGIT와 PVRIG가 이 축에서 이중 신호전달 노드를 구성하고 이 패밀리 내에서 T 세포 활성화를 최대로 높이는 데 둘 다를 차단해야 하는 점을 제시한다. 다른 리간드와의 상호작용에 추가하여, 본 발명자는 PDRIG가 PD-1과 유사한 효과기 또는 기억 T 세포에서 가장 높은 발현을 보인 반면 TIGIT는 조절 T 세포에서 가장 높은 발현을 보였다. 또한 본 발명자는 PVRIG가 TIGIT와 비교하여 T 세포 활성화 후 후기 유도를 나타내는 것으로 관찰하였다. 이들 데이타는 PVRIG가 PVRL2에 높은 친화성으로 상호작용하고 기억 세포 상의 차별화된 발현 및 TIGIT에 대한 후기 유도 프로파일을 가지면서, 이 패밀리 내에서 독특한 역할을 하는 것을 시사한다.
본원에 보고된 것은 PVRIG가 결핍된 마우스 및 길항적 항-PVRIG 항체를 사용하여 항-종양 T 세포 반응을 조절하는 PVRIG의 새로운 역할이다. 본원에서 마우스 PVRIG는 T 세포 및 NK 세포에서 발현되어 림프구 활성화 시 유도되고 TMR에서 주변부와 비교하여 가장 높았다. 또한, 본 발명자는 PVRIG 결핍이 시험관내에서 T 세포 기능을 증가시키고 생체내에서 종양 성장을 감소시키는 것을 보여준다. PVRIG에 대한 길항적 항체는 항-PD-L1 또는 TIGIT의 유전적 결핍과 조합될 때 종양 성장을 감소시켰고, T 세포 반응을 조절하는데 PVRIG의 필수적인 역할을 입증한다. 이들 새로운 데이타는 전임상 종양 모델을 사용하여 PD1 또는 TIGIT 길항기작과 조합으로 PVRIG 표적화가 암 치료를 위한 잠재적인 신규 치료법이라는 생체내 개념 증거를 제공한다.
본원에서는 본 발명자가 임상 시험에서 테스트하려고 추구하는 PVRIG와 PVRL2의 상호작용을 교란시키는 고친화성 항-인간 PVRIG 항체에 대해 보고하고 있다. 임상 시험에서 환자 선택에 관한 정보를 줄 수 있는 잠재적인 암 적응증을 결정하기 위해 본 발명자는 FACS 및 IHC에 의한 인간 암에서 이 축의 발현 프로파일을 조사하였다. PVRIG의 경우 본 발명자는 FACS에 의해 자궁내막, 폐, 신장 및 난소 암에서 가장 높은 CD4 및 CD8 T 세포의 평균 PVRIG 발현이 현재의 시료 수로는 터키 다중 비교 테스트로의 ANOVA에 의해 결정된 바와 같이 다른 암 유형과의 통계적 차이를 달성하지 못하는 점을 관찰하였다. PVRIG가 T 세포 활성화 시 유도되고 종양 침윤성 T 세포의 대부분이 항원을 경험한 점을 감안하면, PVRIG 중간값 발현이 종양 시료 및 암 유형에서 유사한 것은 놀랍지 않다. 본 발명자는 PVRIG 발현이 PD-1 및 TIGIT 발현과 상관되는 것을 관찰하였으며, 이들 3개의 억제성 수용체의 상호작용이 항-종양 반응을 조절하는데 중요할 것을 시사한다. 이 보고서에서, 본 발명자는 PDRIG 항체가 CD8 T 세포 종양 세포 공동-배양에서 TIGIT 항체와 조합될 때 PVRIG 또는 TIGIT 억제제와 조합한 PD-1보다, T 세포 기능의 상승적 증가를 관찰하였다. 이들 데이타는 DC-T 세포 상호작용을 조절하는 데 PVRIG 및 TIGIT의 역할을 입증한 이전 연구와 함께 이 경로가 T 세포-APC 및 T 세포-종양 세포 상호작용을 조절하는 데 관여할 수 있음을 보여주며, PVRIG 표적화가 항-종양 면역 반응을 증가시킬 수 있는 다중 기작을 제공한다.
PD-L1의 발현이 PD-1 억제제에 대한 임상적 반응과 상관되면서, 본 발명자는 또한 특정 암 유형이 더 높은 발현을 갖는지 여부를 평가하기 위해 FACS 및 IHC에 의한 종양에서의 PVRL2 발현을 분석하였다. 해리된 종양 세포를 평가하면서, 본 발명자는 자궁내막, 두경부, 신장, 폐 및 난소 시료로부터 대 식구 상의 평균 PVRL2 발현이 다른 종양 유형과 비교할 때 더 높은 것을 관찰하였다. CD45- 비-면역 세포에서 평균 PVRL2 발현은 다른 암에 비해 유방, 대장, 자궁내막, 폐, 난소, 전립선 암에서 더 높았다. PVRIG와 PVRL2 발현에 기초하여, 본 발명자는 자궁내막, 두경부, 폐, 신장, 난소 암이 PVRIG와 PVRL2 의 고발현을 갖는 종양의 더 높은 발병률을 가지고, 이들이 이 경로의 억제제에 반응할 수 있는 잠재적인 암이라고 졀정하였다.
PVRL2 발현이 염증 매개인자에 의해 시험관내에서 항원 생산 세포 상에 조절될 수 있는 반면, 암 세포 상의 PVRL2 발현은 변하지 않았다. 이들 데이타는 항원 제시 세포 상의 PVRL2 발현이 염증에 의해 조절될 수 있고 염증성 종양의 지표일 수 있음을 시사한다. 따라서, 본 발명자는 모든 PD-L1+ 종양이 종양 세포 및 면역 구획 모두에서 PVRL2도 역시 발현하는 것을 관찰하였다. 골수 세포에서 PVRL2의 발현은 PD-1 또는 TIGIT와 조합된 설정에서 PVRIG 억제제에 대한 반응을 예측하여 항-종양 효과를 추가로 증진시키도록 도울 수 있다 흥미롭게도, PD-L1 음성 종양의 일부는 PVRL2를 주로 종양 세포에서 발현하고 면역 세포에는 발현하지 않는다. 상피 세포에서의 PVR 및 PVRL2 발현은 종양생성 및 스트레스 및 DNA 손상에 대한 반응으로 유도되는 것으로 보고되었다. 이들 데이타는 종양 세포에서 PVRL2 발현의 조절이 IFN-g에 의존적이지 않은 시험관내 결과와 부합한다. PD-L1은 IFN-g에 반응하는 적응적 저항성 설정에서 유도되고 염증 반응과 관련되므로, PD-L1이 없는 경우 PVRL2의 발현은 PVRL2 발현이 PD-L1보다 더 우세하며 PVRL2 비-염증 종양에서 발현되는 것을 제시한다. 상기 내용에 기초하여, PVR과 PVRL2의 존재가 PD-L1과 독립적으로 면역 반응을 억제하는 데 기여하고, PVRIG 및 TIGIT의 억제제는 PD-L1 음성 또는 PD-1 억제제에 대한 미반응자/진행인자인 환자에서 특히 중요할 수 있는 것이 가능하다.
요약하면, 이 보고서는 CD8-종양 세포 상호작용을 조절하는 데 PVRIG/TIGIT의 유망한 역할을 입증하고, PD-1 억제 또는 TIGIT 결핍과 조합한 PVRIG 길항기작이 종양 성장의 상승적 감소을 유ㅂ도하는 것을 보여주는, 인간 암에서 이 축의 발현을 특성화하는 것을 포함하여, PVRIG 생물학에 대한 몇 가지 새로운 통찰력을 제공한다. 이들 데이타는 PVRIG 생물학에 대한 현재의 이해를 확장하고 암 환자에서 고친화성 항-PVRIG 항체인 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 임상 시험에 대한 이론적 근거를 제공한다.
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S. 실시예 19: 종양 세포 살상 검정
종양 세포의 살상에 미치는 항-인간 TIGIT 항체 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 단독으로 또는 조합으로 효과는 인간 CMV-특이적 CD8 T 세포와의 시험관내 공동-배양 검정에 의해 평가하였다. 검정에 사용된 HLA-A2+ 표적 세포주는 인간 PVR 및 PVRL2를 안정적으로 발현하는 흑색종 세포주 Mel624 및 인간 PVR 및 PVRL2의 내인성 수준을 발현하는 췌장 샘암종 세포주 Panc05.04이었다. 두 종양 세포주는 렌티바이러스 형질도입을 통해 l루시퍼라제 리포터 유전자로 안정적으로 형질 감염되었다 (System Biosciences). Mel 624 및 Panc.05.04 세포를 각각 0.0033 μg/ml 또는 0.01 μg/ml의 CMV pp65 펩타이드로 37℃에서 1시간 동안 펄스 처리하였다. 이어서, 세포를 세척하고 20,000개 세포/웰로 도말하였다. 벤치마크 항-인간 BM TIGIT 항체 및 CHA.7.518.1.H4(S241P)를 조합하여 또는 대조군 hIgG4 이소형 항체와 함께 10 μg/ml로 첨가하였다. 공여자 4, 공여자 72 및 공여자 234로서 특정된 3명의 상이한 공여자로부터의 인간 CMV-특이적 CD8+ T 세포를 100,000개 세포/웰로 첨가하였다. 공동-배양물을 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 플레이트를 배양기로부터 꺼내어 30분 동안 실온으로 평형화를 유지시켰다. 바이오-글로 루시퍼라제 기질 (Promega)을 각 웰에 첨가하고 혼합물을 실온에서 10분 동안 광으로부터 보호하여 평형화를 유지시켰다. 엔비전 다중-표지 판독기 (Perkin Elmer)에서 초-민감한 발광 검출기로 발광 또는 상대적 광 단위 (RLU)를 정량화하였다. 특이적 살상 백분율은 [(치료 항체의 RLU - 배지 단독의 RLU)/배지 단독의 RLU] × 100에 의해 계산되었다.
결과
도 99a 및 99b는 각각 Mel624 및 Panc05.04 세포의 살상에 미치는 항-TIGIT 항체 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 효과를 보여준다. 공동-배양에만 첨가하였을 때, 항-TIGIT 항체와 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 둘 다는 이소형 대조군 항체와 비교하여 종양 세포주의 유의한 T 세포 살상을 유도하였다. 항-TIGIT 항체의 경우, 특이적 살상 백분율은 테스트된 3명의 CMV-반응성 공여자를 통해 Mel624 세포의 경우 19 내지 41%, Panc05.04 세포의 경우 3 내지 44%의 범위이었다. CHA.7.518.1.H4(S241P) 항체의 경우, 특이적 살상 백분율은 Mel624 세포의 경우 16 내지 20%, Panc05.04 세포의 경우 0.21 내지 29%의 범위이었다. 일부 경우에, 항-TIGIT 항체 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 조합된 치료에서 종양 세포 살상에 미치는 추가적인 효과가 관찰되었다.
종양 세포 살상에 미치는 항-TIGIT 항체 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 효과가 용량-의존적인지 여부를 결정하기 위해, 항-TIGIT 항체의 경우 0.5 μg/ml 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 경우 10 μg/ml에서 시작하여 각 항체의 10개 지점 2배 일련 희석으로 검정이 수행되었다 (도 100). 항-TIGIT 항체, BM26 또는 CPA.9.086 어느 하나가 CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 조합되었을 때 Mel624 살상을 농도-의존적 방식으로 감소시켰다. 2.6 ± 1.7 nM의 EC50을 갖는 BM26 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 조합과 비교하여 0.40 ± 0.49 nM의 EC50을 갖는 CPA.9.086 및 CHA.7.518.1.H4 (S241P) 조합에 대해 더 강력한 살상이 관찰되었다.
T. 실시예 20: KD의 생물리학적 측정
KinExA 평형 실험은 KinExA 3200 기기 (Sapidyne Instruments, Boise, ID, USA)를 사용하여 22℃에서 수행하였다. 재조합 His-태그화 인간 TIGIT는 시노 바이오로지칼사 (Sino Biologicals, Beijing, China)로부터 얻은 후 1 X PBS로 재구성하였다. KinExA 분석을 위한 모든 항원 및 항체 시료는 100 μg/mL 여과된 BSA 및 0.02 % 소듐 아자이드를 포함하는 탈기된 PBST 완충액 (0.05% 트윈 20을 포함한 PBS)에서 제조되었다. 사용된 이차 검출 항체는 1X PBS (pH 7.4)에서의 0.5 mg/mL 스톡으로부터 상기기술된 PBST 완충액 (BSA 및 아자이드)으로 400 내지 700배 희석된 Alexa Flour 647-표지된 염소 항-인간 IgG (H+ L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories)이었다. 각각의 KinExA 실험을 위해 약 20 μg의 인간 TIGIT를 1 mL의 50 mg 탄산나트륨 pH 9.2에 희석시켰고, 이는 50 mg의 아즈락톤 비드 (Ultralink Support, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에 직접 첨가하여 밤샘 동안 4℃에 진탕하였다. 진탕한 후, 비드를 10 mg/mL BSA를 포함하는 1M 트리스 완충액 (pH 8.5)으로 한 번 헹구고 동일한 완충액으로 실온에서 1시간 동안 진탕시켰다. 결합된 비드를 KinExA 기기의 비드 저장소에 첨가하고, KinExA 기기의 전개 완충액이기도 한 0.02% 소듐아자이드를 포함한 1X HBS-N (0.01M 헤페스, 0.15M NaCl, GE Healthcare)을 사용하여 약 30 mL로 희석시켰다. 모든 항원-결합 비드는 제조 직후에 사용하였다.
CPA.9.086의 두 벌의 KD 측정 (표 1)을 위해, 957 aM 내지 212 pM 범위의 14개 농도의 TIGIT를 2.5 pM CPA.9.086 결합 부위 및 1.8 pM CPA.9.086 결합 부위와 함께 약 72시간 동안 실온에서 평형화하였다. CPA.9.083의 경우 478 aM 내지 196 pM 범위의 14개 농도의 TIGIT를 1.8pM CPA.9.083 결합 부위와 함께 약 72시간 동안 평형화하였다. 벤치마크 항체, BM26 hIgG4의 중복 측정을 위해 9.6 fM 내지 3.53 nM 범위의 14개 농도의 TIGIT를 20 μM BM26 결합 부위와 8.0 μM BM26 결합 부위와 함께 약 72시간 동안 평형화하였다. CHA.9.547.13의 경우 10.5 fM 내지 2.2 nM 범위의 14개 농도의 TIGIT를 8 pM mAb CHA.9.547.13 결합 부위와 함께 약 72시간 동안 평형화하였다. 모든 실험을 위해 각 평형화된 시료의 비드 팩을 통해 흐르는 부피는 0.25 mL/분의 유속에서 4 mL내지 11 mL의 범위였다. 데이타는 KinExA Pro 소프트웨어 (버전 4.2.10; Sapidyne Instruments)를 사용하여 KD를 추정하고 곡선 적합성의 95% 신뢰 구간 (CI)을 생성하기 위해 1 : 1 "표준 평형" 결합 모델로 적합하였다.
결과
CPA.9.083 및 CPA.9.086은 펨토몰 결합 친화성으로 인간 TIGIT와 결합하는 한편, CHA.9.547.13 및 BM26은 피크몰 친화성으로 결합하였다. 따라서, CPA.9.083 및 CPA.9.086은 테스트된 네 개 상이한 항체의 가장 높은 친화성을 갖는 인간 TIGIT에 결합하였다.
Figure 112019022434593-pct00013
Figure 112019022434593-pct00014
U. 실시예 21: 면역 체크포인트 TIGIT을 표적하는 새로운 치료 항체 CPA.9.086의 개발 및 기능적 특성화
배경: TIGIT는 상이한 유형의 종양을 침윤하는 효과기 및 조절 CD4+ T 세포 (Treg), 효과기 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 포함하는 림프구 상에서 높게 발현되는 보조억제 수용체이다. TIGIT의 이의 보고된 리간드, 폴리오바이러스 수용체 (PVR) 및 PVR-유사 단백질 (PVRL2 및 PVRL3)의 결합은 림프구 활성화를 직접적으로 억제한다. PVR은 또한 종양에서 광범위하게 발현되며, TIGIT-PVR 신호전달 축이 암에 대한 우세한 면역 탈출 기작일 수 있음을 시사한다. 본 발명자는 본원에서 TIGIT를 표적하는 치료 항체 CPA.9.086의 생물리학적 및 기능적 특성화를 보고한다. 본 발명자는 또한 TIGIT와 새로운 체크포인트 억제제 PVRIG의 공동-차단이 T 세포 반응을 증강시키는 것을 입증한다.
재료 및 방법: 인간 파지 디스플레이 및 마우스 하이브리도마 항체 발견 연구을 수행하여 치료 항-TIGIT 항체를 생성하였다. 결과로 생성된 항체를 재조합 및 세포-표면 발현된 인간 TIGIT에 높은 친화성으로 결합시키는 능력에 대해 평가하였다. 시노몰거스 머카크와 마우스 TIGIT에 대한 항체의 교차-반응성도 역시 조사되었다. 인간 TIGIT에 높은 친화성으로 결합하고 시노몰거스 TIGIT에 교차-반응하는 항체의 하위집합을 TIGIT와 PVR 간의 상호작용을 차단하는 능력에 대해 추가로 특성화하였다. 차단 항체는 시험관내에서 단독으로 또는 항-PVRIG 항체인 CHA.7.518.1.H4 (S241P)와 조합하여 항원-특이적 T 세포 활성화를 증진시키는 능력에 대해 스크리닝하였다.
결과: 인간 TIGIT에 펨토몰 고친화성으로 결합하는 리드 항체, CPA.9.086이 확인되었다. 이 항체는 테스트된 벤치마크 항체보다 높은 친화성으로 인간 CD8+ T 세포에 내인성으로 발현된 TIGIT에 결합하고 시노몰거스 및 마우스 TIGIT와도 역시 교차-반응하였다. CPA.9.086은 시험관내에서 활성을 테스트할 때 테스트된 벤치마크 항체보다 우월하거나 동등한 효능으로 CMV-특이적 CD8+ T 세포에 의한 사이토카인 분비 및 종양 세포 살상을 증강시켰다. CPA.9.086과 항-PD1 항체 또는 CHA.7.518.1.H4 (S241P)의 조합은 증진된 CMV-특이적 CD8+ T 세포 활성을 유도하였다. 또한, 본 발명자는 TIGIT가 말초혈액과 비교하여 고형 종양으로부터의 Treg 및 효과기 CD8+ T 세포에서 우세하게 발현되는 사실을 입증했으며, 이들 집단이 CPA.9.086에 의해 우선적으로 표적화될 가능성이 있음을 시사한다.
결론: 현재 전임상 진행 중인 매우 높은 친화성의 길항적 TIGIT 항체, CPA.9.086의 개발이 기술된다. 본 발명자는 CPA.9.086의 펨토몰 친화성이 환자에서 더 낮고 덜 빈번한 투약을 유도할 수 있는 점을 가정한다. CPA.9.086은 단독으로 또는 다른 체크포인트 항체와 조합하여 인간 T 세포 활성화를 증진시킬 수 있다 따라서, 이 데이타는 암 치료를 위한 TIGIT, PD1 및 PVRIG 표적화의 유용성을 보여준다.
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Humanized sequences of CHA.7.518 antibody VL <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Asn, Gln, Ser, Ala or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Asn, Gln, Ser, Ala or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> Asn, Gln, Ser, Ala or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> Trp, Tyr, Phe or His <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Xaa Ile Tyr Ser Xaa 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Glu Ala Thr Xaa Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Xaa Gly Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 40 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VH <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 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Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 44 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VH <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (105)..(105) <223> Trp, Tyr, Phe or His <400> 44 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Xaa Pro Gly Ser Gly Gly Ile Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Thr His Asp Thr Xaa Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VH <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (105)..(105) <223> Trp, Tyr, Phe or His <400> 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Xaa Pro Gly Ser Gly Gly Ile Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Thr His Asp Thr Xaa Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VH <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (105)..(105) <223> Trp, Tyr, Phe or His <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Xaa Pro Gly Ser Gly Gly Ile Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Thr His Asp Thr Xaa Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VH <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (105)..(105) <223> Trp, Tyr, Phe or His <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Xaa Pro Gly Ser Gly Gly Ile Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Thr His Asp Thr Xaa Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VL <400> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VL <400> 49 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 50 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VL <400> 50 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VL <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> Trp, Tyr, Phe or His <220> <221> MOD_RES <222> (93)..(93) <223> Asn, Gln, Ser, Ala or Asp <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Ile Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Arg Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Xaa Xaa Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 52 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VL <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> Tyr, Phe or His <220> <221> MOD_RES <222> (93)..(93) <223> Gln, Ser, Ala or Asp <400> 52 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Xaa Xaa Thr Pro Pro 85 90 95 <210> 53 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VL <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> Trp, Tyr, Phe or His <220> <221> MOD_RES <222> (93)..(93) <223> Asn, Gln, Ser, Ala or Asp <400> 53 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Arg Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Xaa Xaa Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_1 antibody VL <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> Trp, Tyr, Phe or His <220> <221> MOD_RES <222> (93)..(93) <223> Asn, Gln, Ser, Ala or Asp <400> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Arg Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Xaa Xaa Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 55 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_2 antibody VH <400> 55 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_2 antibody VH <400> 56 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 57 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_2 antibody VH <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Trp, Tyr, Phe or His <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <400> 57 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30 Xaa Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Xaa Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Ala Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 58 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_2 antibody VH <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Tyr, Phe or His <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> Gln, Ser or Ala <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30 Xaa Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Xaa Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 59 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_2 antibody VH <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Trp, Tyr, Phe or His <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30 Xaa Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Xaa Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Ala Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 60 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_2 antibody VH <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Trp, Tyr, Phe or His <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <400> 60 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30 Xaa Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Xaa Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Ala Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 61 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequences of CHA.7.538_2 antibody VH <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Trp, Tyr, Phe or His <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> Asn, Gln, Ser or Ala <400> 61 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30 Xaa Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Xaa Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Ala Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized CHA.7.518 VH h518HH1 <400> 62 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Lys Thr Ala Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized CHA.7.518 VH h518HH2 <400> 63 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Lys Thr Ala Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 64 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized CHA.7.518 VH h518HH3 <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Lys Thr Ala Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 65 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized CHA.7.518 VH h518HH4 <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Asn Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Lys Thr Ala Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 66 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized CHA.7.518 VL h518HL1 <400> 66 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Glu Ala Thr Asn Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 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Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Glu Ala Thr Asn Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 69 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized CHA.7.538_1 VH h5381HH1 <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ile Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Thr His Asp Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 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110 Ser Ile Ser Leu Ile Leu Glu Gly Ser Gly Ala Ser Ser Pro Cys Ala 115 120 125 Asn Thr Thr Phe Cys Cys Lys Phe Ala Ser Phe Pro Glu Gly Ser Trp 130 135 140 Glu Ala Cys Gly Ser Leu Pro Pro Ser Ser Asp Pro Gly Leu Ser Ala 145 150 155 160 Pro Pro Thr Pro Ala Pro Ile Leu Arg Ala Asp Leu Ala Gly Ile Leu 165 170 175 Gly Val Ser Gly Val Leu Leu Phe Gly Cys Val Tyr Leu Leu His Leu 180 185 190 Leu Arg Arg His Lys His Arg Pro Ala Pro Arg Leu Gln Pro Ser Arg 195 200 205 Thr Ser Pro Gln Ala Pro Arg Ala Arg Ala Trp Ala Pro Ser Gln Ala 210 215 220 Ser Gln Ala Ala Leu His Val Pro Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ser Cys 225 230 235 240 Arg Pro Ala Thr Leu Asp Thr Ala His Pro His Gly Gly Pro Ser Trp 245 250 255 Trp Ala Ser Leu Pro Thr His Ala Ala His Arg Pro Gln Gly Pro Ala 260 265 270 Ala Trp Ala Ser Thr Pro Ile Pro Ala Arg Gly Ser Phe Val Ser Val 275 280 285 Glu Asn Gly Leu Tyr Ala Gln Ala Gly Glu Arg Pro Pro His Thr Gly 290 295 300 Pro Gly Leu Thr Leu Phe Pro Asp Pro Arg Gly Pro Arg Ala Met Glu 305 310 315 320 Gly Pro Leu Gly Val Arg 325

Claims (16)

  1. a) 서열번호 160으로 표시되는 가변 중쇄 도메인; 및
    b) 서열번호 165로 표시되는 가변 경쇄 도메인
    을 포함하는, 항체 도메인.
  2. 제1항에 따른 항체 도메인을 포함하는 조성물로서,
    상기 도메인은 인간 TIGIT (서열번호 97)에 결합하는 도메인인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은
    a) VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 중쇄로서, 상기 VH는 서열번호 160으로 표시되는, 중쇄; 및
    b) VL-VC를 포함하는 경쇄로서, 상기 VL은 서열번호 165로 표시되고, VC는 카파 또는 람다 둘 중 하나인, 경쇄
    를 포함하는 항체를 함유하는, 조성물,
  4. 제3항에 있어서,
    상기 CH1-힌지-CH2-CH3 서열은 인간 IgG1, IgG2, IgG4 및 이의 변이체로부터 선택되는, 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 중쇄는 서열번호 164로 표시되고, 상기 경쇄는 서열번호 169로 표시되는, 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    인간 체크포인트 수용체 단백질에 결합하는 제2 항체를 추가로 포함하는, 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제2 항체는 인간 PD-1과 결합하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제2 항체는 인간 PVRIG(서열번호 2)와 결합하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제2 항체는 서열번호 5로 표시되는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 10으로 표시되는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제2 항체의 중쇄는 서열번호 9로 표시되고, 상기 제2 항체의 경쇄는 서열번호 14로 표시되는, 조성물.
  11. a) 서열번호 160으로 표시되는 가변 중쇄 도메인을 인코딩하는 제 1 핵산; 및
    b) 서열번호 165로 표시되는 가변 경쇄 도메인을 인코딩하는 제 2 핵산
    을 포함하는 핵산 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제 1 핵산은 VH-CH1-힌지-CH2-CH3를 포함하는 중쇄를 인코딩하고,
    상기 VH는 서열번호 160으로 표시되며;
    상기 제 2 핵산은 VL-VC를 포함하는 경쇄를 인코딩하고,
    상기 VL은 서열번호 165로 표시되며, VC는 람다 도메인인, 핵산 조성물.
  13. i) 제11항 또는 제12항에 정의된 상기 제 1 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터, 및 제11항 또는 제12항에 정의된 상기 제 2 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터를 각각 포함하거나,
    ii) 제11항 또는 제12항에 정의된 상기 제 1 핵산, 및 제11항 또는 제12항에 정의된 상기 제 2 핵산을 각각 포함하는 발현 벡터
    를 포함하는 발현 벡터 조성물.
  14. 제13항에 따른 상기 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  15. a) 제14항에 따른 숙주 세포를 항체가 발현되는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
    b) 상기 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 항-TIGIT 항체의 제조 방법.
  16. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, T 세포를 활성화시킴으로써 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
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