KR102385562B1 - Rna 전달을 위한 이온화가능한 양이온성 지질 - Google Patents

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KR102385562B1
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스티븐 피. 태니스
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Abstract

기재된 것은 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 화학식 I의 화합물은
[화학식 I]
Figure 112021100425379-pat00194

R1이 -CH((CH2)nCH3)2 또는 -CH((CH2)nCH3)((CH2)n-1CH3)2(여기서, n은 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8임), 또는 -CH((CH2)p(CH=CH)(CH2)qCH3)2(여기서, p 및 q는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며, p + q < 8임)이고; R2가 탄소수 2 내지 20의 선형 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이거나, 또는 -CH((CH2)nCH3)2 또는 -CH((CH2)nCH3)((CH2)n-1CH3)2(여기서, n은 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8임), 또는 -CH((CH2)p(CH=CH)(CH2)qCH3)2(여기서, p 및 q는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며, p + q < 8임)이고; L1 및 L2가 동일하거나 상이하며, 각각 탄소수 1 내지 20의 선형 알킬렌이거나, 또는 탄소수 2 내지 20의 선형 알케닐렌이고; X1이 S 또는 O이고; R3이 탄소수 1 내지 6의 선형 또는 분지형 알킬렌이고; R4 및 R5가 동일하거나 상이하며, 각각 수소 또는 탄소수 1 내지 6의 선형 또는 분지형 알킬인 화합물로 이루어진다.

Description

RNA 전달을 위한 이온화가능한 양이온성 지질{ionizable cationic lipid for rna delivery}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2016년 12월 21일자로 출원된 미국 특허 출원 제15/387,067호에 대한 우선권을 주장한다.
현재, 다수의 상이한 유형의 핵산이 다수의 질병의 치료를 위한 치료제로서 개발되고 있다. 이들 분자가 개발되고 있음에 따라, 안정하고 긴 보관 수명을 가지며 무수 유기 용매 또는 무수 극성 비양성자성 용매 내로 용이하게 도입되어 극성 수용액 또는 비극성 용매에서 일어날 수 있는 부반응 없이 핵산의 캡슐화를 가능하게 하는 형태로 이들을 생성할 필요성이 제기되어 왔다.
본 발명은 생물학적으로 활성인 치료적 분자의 세포내 전달을 용이하게 하는 신규한 지질 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 약제학적 조성물은 그러한 지질 조성물을 포함하고, 치료적 유효량의 생물학적 활성 분자를 환자의 세포 내로 전달하는 데 유용하다.
대상체에 대한 치료적 화합물의 전달은 그의 치료적 효과에 중요하며, 통상 그것은 표적화된 세포 및 조직에 도달하는 화합물의 제한된 능력에 의해 방해받을 수 있다. 다양한 양이온성 지질이 국제 특허 출원 공개 WO2016/081029호에 개시되어 있으며, 이에는 화합물 ATX-B-6, ATX-B-7, 및 ATX-B-8이 포함된다.
Figure 112021100425379-pat00001
Figure 112021100425379-pat00002
Figure 112021100425379-pat00003
그러한 화합물이 다양한 전달 수단에 의해 표적화된 세포 또는 조직에 진입하는 것의 개선은 중요하다. 본 발명은 생물학적 활성 분자의 표적화된 세포내 전달을 용이하게 하는, 조성물 내의 신규한 지질, 및 제조 방법에 관한 것이다.
환자의 조직에 대한 효과적인 표적화가 종종 달성되지 않는 생물학적 활성 분자의 예에는 다수의 단백질, 예컨대 면역글로불린 단백질, 폴리뉴클레오티드(예컨대, 게놈 DNA, cDNA, 또는 mRNA 안티센스 폴리뉴클레오티드); 및 합성이든 천연 발생이든 어느 것이든 간에, 다수의 저분자량 화합물(예컨대, 펩티드 호르몬 및 항생제)이 포함된다.
의료 종사자들이 지금 직면하고 있는 기본적인 과제 중 하나는 현재 다수의 상이한 유형의 핵산이 다수의 질병의 치료를 위한 치료제로서 개발되고 있다는 것이다. 이들 핵산은 유전자 발현을 위한 mRNA, 유전자 요법에서의 DNA, 플라스미드, 짧은 간섭 핵산(siNA), siRNA, 및 RNA 간섭(RNAi)에 사용하기 위한 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 분자, 리보자임, 안타고미르(antagomir), 및 압타머(aptamer)를 포함한다. 이들 핵산이 개발되고 있음에 따라, 제조가 용이하고 표적 조직에 용이하게 전달될 수 있는 지질 제형을 생성할 필요가 존재한다.
기재된 것의 일 태양은 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 화학식 I의 화합물은
[화학식 I]
Figure 112021100425379-pat00004
R1이 -CH((CH2)nCH3)2 또는 -CH((CH2)nCH3)((CH2)n-1CH3)2(여기서, n은 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8임), 또는 -CH((CH2)p(CH=CH)(CH2)qCH3)2(여기서, p 및 q는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며, p + q < 8임)이고;
R2가 탄소수 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 선형 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이거나, 또는 -CH((CH2)nCH3)2 또는 -CH((CH2)nCH3)((CH2)n-1CH3)2(여기서, n은 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8임), 또는 -CH((CH2)p(CH=CH)(CH2)qCH3)2(여기서, p 및 q는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며, p + q < 8임)이고;
L1 및 L2가 동일하거나 상이하며, 각각 탄소수 1 내지 20의 선형 알칸이거나, 또는 탄소수 2 내지 20의 선형 알켄이고;
X1이 S 또는 O이고;
R3이 탄소수 1 내지 6의 선형 또는 분지형 알킬렌이고;
R4 및 R5가 동일하거나 상이하며, 각각 수소 또는 탄소수 1 내지 6의 선형 또는 분지형 알킬인 화합물로 이루어진다.
기재된 것의 다른 태양은 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I]
Figure 112021100425379-pat00005
(상기 식에서,
R1은 -CH((CH2)nCH3)2 또는 -CH((CH2)nCH3)((CH2)n-1CH3)2(여기서, n은 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8임), 또는 -CH((CH2)p(CH=CH)(CH2)qCH3)2(여기서, p 및 q는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며, p + q < 8임)이고;
L1은 탄소수 1 내지 15의 선형 알킬렌이고;
R2는 탄소수 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 선형 알킬 또는 알케닐이거나, 또는
-CH((CH2)nCH3)2 또는 -CH((CH2)nCH3)((CH2)n-1CH3)2(여기서, n은 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8임), 또는 -CH((CH2)p(CH=CH)(CH2)qCH3)2(여기서, p 및 q는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며, p + q < 8임)이고;
L2는 탄소수 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 선형 알킬렌이고;
X1는 O 또는 S이고;
R3은 탄소수 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 선형 알킬렌이고;
R4 및 R5는 동일하거나 상이하며, 각각 탄소수 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 선형 또는 분지형의 비환형 알킬임).
일 실시 형태에서, R1은 탄소수 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 또는 17이다.
다른 실시 형태에서, R1은 2개의 동일한 알킬 또는 알케닐 기를 포함한다.
다른 실시 형태에서, R1은 알케닐 기를 포함한다.
다른 실시 형태에서, R2는 알케닐이다.
다른 실시 형태에서, R2는 분지형의 비환형 알킬이다.
다른 실시 형태에서, L2는 탄소수 4, 5, 6, 또는 7이다.
바람직하게는, 화합물은 화학식 ATX-0082, ATX-0085, ATX-0083, ATX-0121, ATX-0091, ATX-0102, ATX-0098, ATX-0092, ATX-0084, ATX-0095, ATX-0125, ATX-0094, ATX-0109, ATX-0110, ATX-0118, ATX-0108, ATX-0107, ATX-0093, ATX-0097, 및 ATX-0096의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112021100425379-pat00006
Figure 112021100425379-pat00007
Figure 112021100425379-pat00008
Figure 112021100425379-pat00009
Figure 112021100425379-pat00010
기재된 것의 다른 태양은 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물로서:
[화학식 I]
Figure 112021100425379-pat00011
(상기 식에서,
R1은 -CH((CH2)nCH3)2 또는 -CH((CH2)nCH3)((CH2)n-1CH3)2(여기서, n은 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10임), 또는 -CH((CH2)p(CH=CH)(CH2)qCH3)2(여기서, 각각의 p 및 q는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5이며, p + q < 8임)이고;
L1은 탄소수 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15의 선형 알킬렌이고;
R2는 탄소수 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 선형 알킬 또는 알케닐이거나, 또는
-CH((CH2)nCH3)2 또는 -CH((CH2)nCH3)((CH2)n-1CH3)2(여기서, n은 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8임)이고;
L2는 탄소수 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15의 선형 알킬렌이고;
X1는 O 또는 S이고;
R3은 탄소수 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 선형 알킬렌이고;
R4 및 R5는 동일하거나 상이하며, 각각 탄소수 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 선형 또는 분지형의 비환형 알킬임),
상기 화합물의 1 mM 용액은 6-(p-톨루이디노)-2-나프탈렌설폰산의 형광에 의해 측정될 때 pKa가 5.6 내지 7.0이고;
상기 화합물은 c-LogD 값이 10 내지 14이다.
일 실시 형태에서, R1은 탄소수 12, 13, 14, 16, 또는 17이다.
다른 실시 형태에서, R1은 2개의 동일한 알킬 또는 알케닐 기를 포함한다.
다른 실시 형태에서, R1은 알킬 기를 포함한다.
다른 실시 형태에서, R2는 알케닐이다.
다른 실시 형태에서, R2는 분지형의 비환형 알킬이다.
다른 실시 형태에서, L1 및 L2는 독립적으로 탄소수 1, 2, 또는 3이다.
다른 실시 형태에서, L1 및 L2 둘 모두는 탄소수 3이다.
다른 실시 형태에서, R3은 프로필렌 또는 부틸렌이다.
다른 실시 형태에서, 상기 화합물의 c-LogD 값은 적어도 11이고, 상기 화합물의 측정된 pKa는 6보다 더 염기성이다.
다른 실시 형태에서, 상기 화합물은 화학식 ATX-0111, ATX-0132, ATX-0134, ATX-0100, ATX-0117, ATX-0114, ATX-0115, ATX-0101, ATX-0106, ATX-0116, ATX-0086, ATX-0058, ATX-0081, ATX-0123, ATX-0122, ATX-0057, ATX-0088, ATX-0087, ATX-0124, ATX-0126, 및 ATX-0129의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112021100425379-pat00012
Figure 112021100425379-pat00013
Figure 112021100425379-pat00014
Figure 112021100425379-pat00015
Figure 112021100425379-pat00016
Figure 112021100425379-pat00017
기재된 것의 다른 태양은 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I]
Figure 112021100425379-pat00018
(상기 식에서,
R1은 -CH((CH2)nCH3)2 또는 -CH((CH2)nCH3)((CH2)n-1CH3)2(여기서, n은 6, 7, 8, 9, 또는 10임)이고;
L1은 탄소수 1, 2, 또는 3의 선형 알킬렌이고;
R2는 탄소수 8, 9, 10, 11 또는 12의 선형 알케닐이거나, 또는 -CH((CH2)nCH3)2 또는
-CH((CH2)nCH3)((CH2)n-1CH3)(여기서, n은 is 6, 7, 8, 또는 9임)이고;
L2는 탄소수 1, 2, 또는 3의 선형 알킬렌이고;
X는 O 또는 S이고;
R3은 탄소수 2 또는 3의 선형 알킬렌이고;
R4 및 R5는 동일하거나 상이하며, 각각 탄소수 1 또는 2의 선형 알킬임).
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 양이온성 지질은 약제학적 조성물 내에 존재한다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 핵산, 바람직하게는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 지질 나노입자는 바람직하게는 순환에서 RNA의 수명을 증가시킨다. 다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물의 투여 시에, 그 안의 지질 나노입자는 핵산을 체내 세포에 전달한다. 바람직하게는, 핵산은 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 갖는다. 대안적으로, 핵산은 신체의 세포에서의 발현 시에 그것이 인코딩하는 단백질의 생성을 증가시키는 활성을 갖는다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 임의의 상기 조성물을 사용하여 포유류의 세포 내로 핵산을 도입시키는 방법이다. 세포는 간, 폐, 신장, 뇌, 혈액, 비장, 또는 뼈에 존재할 수 있다. 본 조성물은 바람직하게는 정맥내, 피하, 복막내, 또는 경막내 투여된다. 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 조성물은 암 또는 염증성 질병을 치료하는 방법에 사용된다. 상기 질병은 면역 장애, 암, 신장 질병, 섬유성 질병, 유전자 비정상, 염증, 및 심혈관 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
도 1은 헥사노에이트(SM 1), 4-아미노부탄산(SM 2), 및 4-브로모부티르산(SM 3)으로부터의 ATX-0043의 합성 경로를 나타낸다. 중간체(Int) 1 내지 8 및 반응은 실시예 2에 기재되어 있다.
도 2는 옥타노에이트(SM 1), 4-아미노부탄산(SM 2), 및 4-브로모부티르산(SM 3)으로부터의 ATX-0057의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 8 및 반응은 실시예 3에 기재되어 있다.
도 3은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3으로부터의 ATX-0058의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 7 및 반응은 실시예 4에 기재되어 있다.
도 4는 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3으로부터의 ATX-0081의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 8 및 반응은 실시예 5에 기재되어 있다.
도 5는 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3으로부터의 ATX-0082의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 7 및 반응은 실시예 6에 기재되어 있다.
도 6은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3으로부터의 ATX-0086의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 8 및 반응은 실시예 7에 기재되어 있다.
도 7은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3으로부터의 ATX-0087의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 8 및 반응은 실시예 8에 기재되어 있다.
도 8은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3으로부터의 ATX-0088의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 8 및 반응은 실시예 9에 기재되어 있다.
도 9는 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3으로부터의 ATX-0083의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 8 및 반응은 실시예 10에 기재되어 있다.
도 10은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3으로부터의 ATX-0084의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 8 및 반응은 실시예 11에 기재되어 있다.
도 11은 도 1에서와 동일한 SM 1 및 SM 2로부터의 ATX-0061의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 5 및 반응은 실시예 12에 기재되어 있다.
도 12는 도 1에서와 동일한 SM 1 및 SM 2로부터의 ATX-0063의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 5 및 반응은 실시예 13에 기재되어 있다.
도 13은 도 1에서와 동일한 SM 1 및 SM 2로부터의 ATX-0064의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 5 및 반응은 실시예 14에 기재되어 있다.
도 14는 ATX-0081의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 6 및 반응은 실시예 15에 기재되어 있다.
도 15는 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3으로부터의 ATX-0085의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 11 및 반응은 실시예 16에 기재되어 있다.
도 16은 ATX-0134의 합성 경로를 나타낸다. Int 1 내지 Int 6 및 반응은 실시예 17에 기재되어 있다.
도 17은 ATX-002, ATX-0057, ATX-0081, ATX-0082, ATX-0083, ATX-0084, ATX-0085, ATX-0086, 또는 ATX-0087 양이온성 지질을 포함하는 나노입자 중 0.03 mg/㎏ 및 0.1 mg/㎏ mRNA를 마우스 내로 주사한 후의 EPO mRNA 수준(ng/ml)을 나타낸다.
도 18은 ATX-002 및 대조군(PBS 단독)의 활성과 대비하여 ATX-0057 및 ATX-0058을 갖는 리포좀의 항-인자 VII 녹다운(knockdown) 활성을 나타낸다.
도 19는 ATX-002의 활성과 대비하여 ATX-0057을 갖는 리포좀의 항-EPO 녹다운 활성을 나타낸다.
정의
"적어도 하나"는 하나 이상(예를 들어, 1 내지 3, 1 또는 2, 또는 1)을 의미한다.
"조성물"은 특정 양의 특정 성분을 포함하는 생성물뿐만 아니라, 특정 양의 특정 성분들의 조합으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생성되는 임의의 생성물을 의미한다.
"~와 병용하여"는 본 발명의 치료 방법에서 화학식 I의 화합물을 다른 약제와 함께 투여하는 것을 의미하는 것으로, 이는, 화학식 I의 화합물 및 다른 약제가 별개의 투여 형태로 순차적으로 또는 동시에 투여되거나, 또는 동일한 투여 형태로 동시에 투여되는 것을 의미한다.
"포유동물"은 인간 또는 다른 포유동물을 의미하거나, 또는 인간을 의미한다.
"환자"는 인간 및 다른 포유동물 둘 모두, 바람직하게는 인간을 의미한다.
"알킬"은 포화 또는 불포화, 직선형 또는 분지형 탄화수소 사슬을 의미한다. 다양한 실시 형태에서, 알킬 기는 탄소수 1 내지 18이며, 즉 C1-C18 기이거나, 또는 C1-C12 기, C1-C6 기, 또는 C1-C4 기이다. 독립적으로, 다양한 실시 형태에서, 알킬 기는 0개의 분지(즉, 직쇄임), 1개의 분지, 2개의 분지, 또는 2개 초과의 분지를 갖는다. "알케닐"은 1개의 이중 결합, 2개의 이중 결합, 또는 2개 초과의 이중 결합을 가질 수 있는 불포화 알킬이다. "알키닐"은 1개의 삼중 결합, 2개의 삼중 결합, 또는 2개 초과의 삼중 결합을 가질 수 있는 불포화 알킬이다. 알킬 사슬은 1개의 치환체(즉, 알킬 기가 일치환됨), 또는 1개 또는 2개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체, 또는 1 내지 4개의 치환체 등으로 선택적으로 치환될 수 있다. 치환체는 하이드록시, 아미노, 알킬아미노, 보로닐, 카르복시, 니트로, 시아노 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 알킬 기가 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 경우, 알킬 기는 본 명세서에서 헤테로알킬 기로 지칭된다. 알킬 기 상의 치환체가 탄화수소인 경우, 생성되는 기는 단순히 치환된 알킬로 지칭된다. 다양한 태양에서, 치환체를 포함하는 알킬 기는 탄소수 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 또는 7 미만이다.
"저급 알킬"은 직선형 또는 분지형일 수 있는 사슬 내의 탄소수가 1 내지 6인 기를 의미한다. 적합한 알킬 기의 비제한적인 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, t-부틸, n-펜틸, 및 헥실이 포함된다.
"알콕시"는 알킬-O-기를 의미하며, 여기서 알킬은 상기에 정의된 바와 같다. 알콕시 기의 비제한적인 예에는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소프로폭시, n-부톡시 및 헵톡시가 포함된다. 모 모이어티(parent moiety)에 대한 결합은 에테르 산소를 통해 이루어진다.
"알콕시알킬"은 알콕시-알킬-기를 의미하며, 여기서 알콕시 및 알킬은 앞서 기재된 바와 같다. 바람직한 알콕시알킬은 저급 알킬 기를 포함한다. 모 모이어티에 대한 결합은 알킬을 통해 이루어진다.
"알킬아릴"은 알킬-아릴-기를 의미하며, 여기서 알킬 및 아릴은 앞서 기재된 바와 같다. 바람직한 알킬아릴은 저급 알킬 기를 포함한다. 모 모이어티에 대한 결합은 아릴을 통해 이루어진다.
"아미노알킬"은 NH2-알킬-기를 의미하며, 여기서 알킬은 상기에 정의된 바와 같으며, 상기 기는 알킬 기를 통해 모 모이어티에 결합된다.
"카르복시알킬"은 HOOC-알킬-기를 의미하며, 여기서 알킬은 상기에 정의된 바와 같으며, 상기 기는 알킬 기를 통해 모 모이어티에 결합된다.
본 명세서에 기재된 실시예에 사용된 화학물질 및 "구매가능한 화학물질"은 표준 상업적 공급원으로부터 입수될 수 있으며, 그러한 공급원에는, 예를 들어 Acros Organics(미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재), Sigma-Adrich Chemical(미국 위스콘신주 밀워키 소재), Avocado Research(영국 랭커셔 소재), Bionet(영국 콘월 소재), Boron Molecular(미국 노스 캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크 소재), Combi-Blocks(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), Eastman Organic Chemicals, 이스트만 코닥 컴퍼니(미국 뉴욕주 로체스터 소재), Fisher Scientific Co.(미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재), Frontier Scientific(미국 유타주 로건 소재), ICN Biomedicals, Inc.(미국 캘리포니아주 코스타 메사 소재), Lancaster Synthesis(미국 뉴햄프셔 윈드햄 소재), Maybridge Chemical Co.(영국 콘월 소재), Pierce Chemical Co.(미국 일리노이주 록포드 소재), Riedel de Haen(독일 하노버 소재), Spectrum Quality Product, Inc.(미국 뉴저지주 뉴브룬즈윅 소재), TCI America(미국 오리건주 포틀랜드 소재), 및 Wako Chemicals USA, Inc.(미국 버지니아주 리치몬드 소재)가 포함된다.
"화학 문헌에 기재된 화합물"은 당업자에게 공지된 바와 같이, 화학적 화합물 및 화학 반응에 관한 참고서적 및 데이터베이스를 통해 확인될 수 있다. 본 명세서에 개시된 화합물의 제조에 유용한 반응물질(reactant)의 합성을 상세히 설명하거나, 또는 본 명세서에 개시된 화합물의 제조를 설명하는 기사에 대한 참고문헌을 제공하는 적합한 참고서적 및 논문에는, 예를 들어, 문헌[" Synthetic Organic Chemistry", John Wiley and Sons, Inc. New York]; 문헌[S. R. Sandler et al, "Organic Functional Group Preparations," 2nd Ed., Academic Press, New York, 1983]; 문헌[H. O. House, "Modern Synthetic Reactions," 2nd Ed., W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, Calif., 1972]; 문헌[T. L. Glichrist, "Heterocyclic Chemistry," 2nd Ed. John Wiley and Sons, New York, 1992]; 문헌[J. March, "Advanced Organic Chemistry: reactions, Mechanisms and Structure," 5th Ed., Wiley Interscience, New York, 2001]이 포함된다. 특정 반응물질 및 유사한 반응물질이 또한 미국 화학회(American Chemical Society)의 화학 초록 서비스(Chemical Abstract Service)에 의해 준비된 공지된 화학물질의 인덱스를 통해 확인될 수 있는데, 이는 대부분의 공공 도서관 및 대학 도서관에서 이용가능할 뿐만 아니라, 온라인 데이터베이스를 통해 이용가능하다(더 상세한 내용을 위해서는 미국 워싱턴 D.C 소재의 미국 화학회에 접촉될 수 있다). 알려져 있지만 카탈로그에서 구매가능하지 않은 화학물질은 주문형 화학물질 합성업체에 의해 제조될 수 있는데, 여기서는 (상기에 열거된 것들과 같은) 다수의 표준 화학물질 공급업체가 주문형 합성 서비스를 제공한다.
"할로"는 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도 기를 의미한다. 플루오로, 클로로 또는 브로모가 바람직하며, 플루오로 및 클로로가 더 바람직하다.
"할로겐"은 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드를 의미한다. 불소, 염소 및 브롬이 바람직하다.
"헤테로알킬"은 탄소 및 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 포화 또는 불포화, 직선형 또는 분지형 사슬을 의미한다. 다양한 실시 형태에서, 헤테로알킬 기는 1개의 헤테로원자, 또는 1개 또는 2개의 헤테로원자, 또는 1 내지 3개의 헤테로원자, 또는 1 내지 4개의 헤테로원자를 가질 수 있다. 일 태양에서, 헤테로알킬 사슬은 1 내지 18개(즉, 1-18)의 구성원 원자(탄소 및 헤테로원자)를 함유하며, 다양한 실시 형태에서는 1 내지 12개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 구성원 원자를 함유한다. 독립적으로, 다양한 실시 형태에서, 헤테로알킬 기는 0개의 분지(즉, 직쇄임), 1개의 분지, 2개의 분지, 또는 2개 초과의 분지를 갖는다. 독립적으로, 일 실시 형태에서, 헤테로알킬 기는 포화된다. 다른 실시 형태에서, 헤테로알킬 기는 불포화된다. 다양한 실시 형태에서, 불포화 헤테로알킬은 1개의 이중 결합, 2개의 이중 결합, 2개 초과의 이중 결합, 및/또는 1개의 삼중 결합, 2개의 삼중 결합, 또는 2개 초과의 삼중 결합을 가질 수 있다. 헤테로알킬 사슬은 치환 또는 비치환될 수 있다. 일 실시 형태에서, 헤테로알킬 사슬은 비치환된다. 다른 실시 형태에서, 헤테로알킬 사슬은 치환된다. 치환된 헤테로알킬 사슬은 1개의 치환체를 가질 수 있거나(즉, 일치환에 의해), 또는, 예를 들어 1개 또는 2개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체, 또는 1 내지 4개의 치환체를 가질 수 있다. 예시적인 헤테로알킬 치환체는 에스테르(-C(O)-O-R) 및 카르보닐(-C(O)-)을 포함한다.
"하이드록시알킬"은 HO-알킬-기를 의미하며, 여기서 알킬은 앞서 정의되어 있다. 바람직한 하이드록시알킬은 저급 알킬을 함유한다. 적합한 하이드록시알킬 기의 비제한적인 예에는 하이드록시메틸 및 2-하이드록시에틸이 포함된다.
"수화물"은 용매 분자가 H2O인 용매화물을 의미한다.
"지질"은, 지방산의 에스테르를 포함하고 물 중에서는 불용성이지만 많은 유기 용매 중에서는 가용성인 것을 특징으로 하는 유기 화합물을 의미한다. 지질은 통상 적어도 3가지 부류로 나누어진다: (1) 지방 및 오일뿐만 아니라 왁스를 포함한 "단순 지질"; (2) 인지질, 당지질, 양이온성 지질, 비양이온성 지질, 중성 지질, 및 음이온성 지질(이들은 모두 본 명세서에 더 상세히 기재되어 있음)을 포함한 "화합물 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도된 지질".
"지질 입자"는 치료적 핵산(예를 들어, mRNA)을 대상 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형을 의미한다. 바람직한 실시 형태에서, 지질 입자는 핵산-지질 입자로서, 이는 전형적으로 양이온성 지질, 비양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질(예를 들어, PEG-지질), 및 선택적으로 콜레스테롤로부터 형성된다. 전형적으로, 치료적 핵산(예를 들어, mRNA)은 입자의 지질 부분 내에 캡슐화되어, 그것을 효소적 분해로부터 보호할 수 있다.
지질 입자는 전형적으로 평균 직경이 30 nm 내지 150 nm, 40 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 150 nm, 60 nm 내지 130 nm, 70 nm 내지 110 nm, 70 nm 내지 100 nm, 80 nm 내지 100 nm, 90 nm 내지 100 nm, 70 내지 90 nm, 80 nm 내지 90 nm, 70 nm 내지 80 nm, 또는 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm이고, 실질적으로 비독성이다. 게다가, 핵산은, 본 발명의 지질 입자 내에 존재할 때, 수용액 중에서 뉴클레아제에 의한 분해에 저항한다.
"지질 캡슐화된"은 치료적 핵산, 예컨대 mRNA에 완전 캡슐화, 부분 캡슐화, 또는 둘 모두를 제공하는 지질 입자를 의미한다. 바람직한 실시 형태에서, 핵산(예를 들어, mRNA)은 지질 입자 내에 완전 캡슐화된다.
"지질 접합체"는 지질 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 의미한다. 그러한 지질 접합체는 PEG-지질 접합체, 예컨대 다이알킬옥시프로필에 결합된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합체), 다이아실글리세롤에 결합된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 결합된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 결합된 PEG, 및 세라마이드에 접합된 PEG, 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드 올리고머, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG 또는 POZ를 지질에 결합시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 에스테르-비함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티가 포함된다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 에스테르-비함유 링커 모이어티, 예컨대 아미드 또는 카르바메이트가 사용된다.
"양친매성 지질"은, 지질 물질의 소수성 부분은 소수성 상 내로 배향되고, 한편 친수성 부분은 수성 상을 향해 배향되는 물질을 의미한다. 친수성 특성은 극성 또는 하전된 기, 예컨대 탄수화물, 포스페이트, 카르복실, 설페이토, 아미노, 설프하이드릴, 니트로, 하이드록실, 및 다른 유사 기의 존재로부터 유래된다. 소수성은 비극성 기의 포함에 의해 부여될 수 있으며, 이러한 비극성 기에는 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기, 및 하나 이상의 방향족, 지환족, 또는 헤테로사이클릭 기(들)에 의해 치환된 그러한 기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 양친매성 화합물의 예에는 인지질, 아미노지질, 및 스핑고지질이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
인지질의 대표적인 예에는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 다이팔미토일포스파티딜콜린, 다이올레일포스파티딜콜린, 다이스테아로일포스파티딜콜린, 및 다이리놀레오일포스파티딜콜린이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 인이 결여된 다른 화합물, 예컨대 스핑고지질, 글리코스핑고지질 패밀리, 다이아실글리세롤, 및 β-아실옥시산이 또한 양친매성 지질로 명명된 그룹 내에 있다. 추가적으로, 전술된 양친매성 지질은 다른 지질과 혼합될 수 있으며, 이러한 다른 지질에는 트라이글리세라이드 및 스테롤이 포함된다.
"중성 지질"은 선택된 pH에서 비하전된 또는 중성인 쯔비터이온성 형태로 존재하는 지질종을 의미한다. 생리학적 pH에서, 그러한 지질은, 예를 들어 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로사이드, 및 다이아실글리세롤을 포함한다.
"비양이온성 지질"은 양친매성 지질 또는 중성 지질 또는 음이온성 지질을 의미하며, 하기에 더 상세히 설명되어 있다.
"음이온성 지질"은 생리학적 pH에서 음으로 하전된 지질을 의미한다. 이들 지질은 포스파티딜글리세롤, 카르디오리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-석시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 라이실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 결합된 다른 음이온성 변형 기를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
"소수성 지질"은 비극성 기를 갖는 화합물을 의미하며, 이러한 비극성 기에는 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기, 및 하나 이상의 방향족, 지환족, 또는 헤테로사이클릭 기(들)에 의해 선택적으로 치환된 그러한 기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 적합한 예에는 다이아실글리세롤, 다이알킬글리세롤, N-N-다이알킬아미노, 1,2-다이아실옥시-3-아미노프로판, 및 1,2-다이알킬-3-아미노프로판이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
"양이온성 지질"과 "아미노 지질"은 상호교환 가능하게 사용되며, 이들은 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 지방산 또는 지방 알킬 사슬 및 pH-적정가능한 아미노 헤드 기(예를 들어, 알킬아미노 또는 다이알킬아미노 헤드 기)를 갖는 지질 및 이의 염을 의미한다. 양이온성 지질은 전형적으로 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서는 양성자화되고(즉, 양으로 하전되고), pKa 초과의 pH에서는 실질적으로 중성이다. 본 발명의 양이온성 지질은 적정가능한 양이온성 지질로도 칭해질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 지질은 양성자성 3차 아민(예를 들어, pH-적정가능한) 헤드 기; C18 알킬 사슬 - 여기서, 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 0 내지 3개(예를 들어, 0, 1, 2, 또는 3개)의 이중 결합을 가짐 -; 및 헤드 기와 알킬 사슬 사이의 에테르, 에스테르, 또는 케탈 결합을 갖는다. 그러한 양이온성 지질은 DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA, γ-DLenDMA, DLin-K-DMA, DLin-K-C2-DMA(DLin-C2K-DMA, XTC2, 및 C2K로도 알려짐), DLin-K-C3 -DM A, DLin-K-C4-DMA, DLen-C2K-DMA, y-DLen-C2K-DMA, DLin- M-C2-DMA(MC2로도 알려짐), DLin-M-C3 -DMA(MC3으로도 알려짐) 및 (DLin-MP- DMA)(1-Bl 1로도 알려짐)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
"치환된"은 수소 이외의 특정 기, 또는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 기, 모이어티, 또는 라디칼로의 치환을 의미하며, 이들 각각은, 예를 들어, 독립적으로 선택된다.
"안티센스 핵산"은 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 또는 RNA-PNA(단백질 핵산; 문헌[Egholm et al., 1993 Nature 365, 566]) 상호작용에 의해 표적 RNA에 결합하고, 표적 RNA의 활성을 변경시키는 비효소적 핵산 분자를 의미한다(검토를 위해, 문헌[Stein and Cheng, 1993 Science 261, 1004] 및 Woolf 등의 미국 특허 제5,849,902호 참조). 전형적으로, 안티센스 분자는 안티센스 분자의 단일 연속 서열을 따라 표적 서열에 상보적이다. 그러나, 소정의 실시 형태에서, 안티센스 분자는 기질 분자가 루프를 형성하도록 기질에 결합할 수 있고/있거나, 안티센스 분자는 안티센스 분자가 루프를 형성하도록 결합할 수 있다. 따라서, 안티센스 분자는 2개의(또는 심지어 더 많은) 불연속 기질 서열에 상보적일 수 있거나, 또는 안티센스 분자의 2개의(또는 심지어 더 많은) 불연속 서열 부분이 표적 서열에 상보적일 수 있거나, 또는 둘 모두일 수 있다. 게다가, 안티센스 DNA는 DNA-RNA 상호작용에 의해 RNA를 표적화함으로써 이중체 내의 표적 RNA를 분해시키는 RNase H를 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 RNAse H 절단을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 RNAse H 활성화 영역을 포함할 수 있다. 안티센스 DNA는 화학적으로 합성되거나 또는 단일가닥 DNA 발현 벡터 또는 이의 등가물의 사용을 통해 발현될 수 있다. "안티센스 RNA"는 표적 유전자 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 RNA 가닥으로서, 이는 표적 유전자 mRNA에 결합함으로써 RNAi를 유도할 수 있다. "안티센스 RNA"는 표적 유전자 mRNA에 상보적인 서열을 갖고, 표적 유전자 mRNA에 결합함으로써 RNAi를 유도하는 것으로 여겨지는 RNA 가닥이다. "센스 RNA"는 안티센스 RNA에 상보적인 서열을 가지며, 이의 상보적 안티센스 RNA에 어닐링되어 iNA를 형성한다. 이들 안티센스 및 센스 RNA는 통상적으로 RNA 합성기에 의해 합성되어 왔다.
"핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 의미한다. 이 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 결합(linkage)을 함유하는 핵산을 포함하며, 이러한 핵산은 합성, 천연 발생, 및 천연 비발생 핵산이고, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 기준 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사된다. 그러한 유사체의 예에는, 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 및 펩티드-핵산(PNA)이 포함된다.
"RNA"는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보-푸라노스 모이어티의 2' 위치에 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다. 이들 용어는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 단리된 RNA, 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환, 및/또는 변경에 의해 천연 발생 RNA와 상이한 변경된 RNA를 포함한다. 그러한 변경은, 예를 들어, 간섭 RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비-뉴클레오티드 물질을 부가하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자 내의 뉴클레오티드는 또한 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 천연 비발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 천연 발생 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "리보핵산" 및 "RNA"는, siRNA, 안티센스 RNA, 단일가닥 RNA, 마이크로RNA, mRNA, 논코딩 RNA, 및 다가 RNA를 포함한, 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 함유하는 분자를 지칭한다. 리보뉴클레오티드는 β-D-리보-푸라노스 모이어티의 2' 위치에 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오티드이다. 이들 용어는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 단리된 RNA, 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환, 변형, 및/또는 변경에 의해 천연 발생 RNA와 상이한 변형된 및 변경된 RNA를 포함한다. RNA의 변경은, 예를 들어, 간섭 RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어 RNA 분자 내의 RNA 뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드 - 이에는 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 천연 비발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드가 포함됨 - 에 비-뉴클레오티드 물질을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체로 지칭될 수 있다.
"뉴클레오티드"는 당업계에 잘 알려진 천연 염기(표준) 및 변형된 염기를 의미한다. 그러한 염기는 일반적으로 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치에 위치한다. 뉴클레오티드는 일반적으로 염기, 당, 및 포스페이트 기를 포함한다. 뉴클레오티드는 당, 포스페이트, 및/또는 염기 모이어티에서 비변형 또는 변형될 수 있다(이것은 뉴클레오티드 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 비천연 뉴클레오티드, 비표준 뉴클레오티드 및 기타로도 상호교환 가능하게 지칭되며; 예를 들어, 문헌[Usman and McSwiggen, 상기 참조]; Eckstein 등의 국제 특허 출원 공개 WO 92/07065호; Usman 등의 국제 특허 출원 공개 WO 93/15187호; 문헌[Uhlman & Peyman, 상기 참조]을 참조함). 문헌[Limbach, et al, Nucleic Acids Res. 22:2183, 1994]에 의해 요약된 바와 같이 당업계에 알려진 변형된 핵산 염기의 몇몇 예가 있다. 핵산 분자 내로 도입될 수 있는 염기 변형의 비제한적인 예의 일부에는 하기가 포함된다: 이노신, 퓨린, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실, 2,4,6-트라이메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 다이하이드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘(예를 들어, 5-메틸시티딘), 5-알킬우리딘(예를 들어, 리보티미딘), 5-할로우리딘(예를 들어, 5-브로모우리딘) 또는 6-아자피리미딘 또는 6-알킬피리미딘(예를 들어, 6-메틸우리딘), 프로핀, 및 기타(문헌[Burgin, et al., Biochemistry 35:14090, 1996]; 문헌[Uhlman & Peyman, 상기 참조]). 이러한 측면에서의 "변형된 염기"는 1' 위치에서의 아데닌, 구아닌, 시토신, 및 우라실 이외의 뉴클레오티드 염기 또는 이들의 등가물을 의미한다.
"상보적 뉴클레오티드 염기들"은 서로 수소 결합을 형성하는 한 쌍의 뉴클레오티드 염기를 의미한다. 아데닌(A)은 RNA 내의 티민(T) 또는 우라실(U)과 쌍을 이루고, 구아닌(G)은 시토신(C)과 쌍을 이룬다. 핵산의 상보적 세그먼트들 또는 가닥들은 서로 혼성화된다(즉, 수소 결합에 의해 결합된다). "상보적"이란, 핵산이 전통적인 왓슨-크릭(Watson-Crick)에 의해 또는 다른 비전통적인 결합 방식에 의해 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성할 수 있음을 의미한다.
"마이크로RNA"(miRNA)는 21 내지 23개 길이의 뉴클레오티드의 단일가닥 RNA 분자를 의미하는 것으로, 이는 DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 유전자에 의해 인코딩되는 유전자 발현 miRNA를 조절하며(논코딩 RNA); 대신에, 이들은 프라이(pri)-miRNA로 알려진 1차 전사체로부터 프리(pre)-miRNA로 불리는 짧은 스템-루프 구조로 그리고 최종적으로 기능성 miRNA로 가공된다. 성숙 miRNA 분자는 하나 이상의 메신저 RNA(mRNA) 분자에 부분 상보적이며, 이들의 주요 기능은 유전자 발현을 하향조절하는 것이다.
"짧은 간섭 RNA(siRNA)" 및 "짧은 간섭 RNA" 및 "침묵 RNA"는 생물학에서 다양한 역할을 하는, 16 내지 40 개의 뉴클레오티드 길이의 이중가닥 RNA 분자의 부류를 의미한다. 가장 특히, siRNA는 RNA 간섭(RNAi) 경로에 관여하며, 여기서 그것은 특정 유전자의 발현을 방해한다. RNAi 경로에 있어서의 역할에 더하여, siRNA는 또한 RNAi-관련 경로에서, 예를 들어 항바이러스 기전으로서 또는 게놈의 염색질 구조를 형상화하는 데 작용하며; 이들 경로의 복잡성이 단지 이제서야 해명되고 있다.
"RNAi"는, RNA-유도 침묵 복합체(RISC)에 의해 제어되고 세포 내의 짧은 이중가닥 RNA 분자에 의해 개시되는 RNA-의존성 유전자 침묵 과정을 의미하는 것으로, 여기서 짧은 이중가닥 RNA 분자는 촉매 RISC 성분 아르고노트(argonaute)와 상호작용한다. 이중가닥 RNA 또는 RNA-유사 iNA 또는 siRNA가 외인성(RNA 게놈을 가진 바이러스에 의한 감염으로부터 유래하거나 또는 형질감염된 iNA 또는 siRNA로부터 유래함)인 경우, RNA 또는 iNA는 세포질 내로 직접 유입되고 효소 다이서에 의해 짧은 단편으로 절단된다. 개시 dsRNA는 또한, 게놈에서 RNA-코딩 유전자로부터 발현되는 프리-마이크로RNA에서와 같이, 내인성(세포에서 기원됨)일 수 있다. 그러한 유전자로부터의 1차 전사체는 먼저 가공되어 핵에서 프리-miRNA의 특징적인 스템-루프 구조를 형성하고, 이어서 세포질로 내보내져 다이서에 의해 절단된다. 따라서, 외인성 및 내인성인 2개의 dsRNA 경로는 RISC 복합체에서 수렴된다. RNA-유도 침묵 복합체(RISC)의 활성 성분은 아르고노트 단백질이라고 불리는 엔도뉴클레아제이며, 이것은 그의 결합된 siRNA 또는 iNA에 상보적인 표적 mRNA 가닥을 절단한다. 다이서에 의해 생성된 단편은 이중가닥이기 때문에, 이들은 각각 이론적으로 기능성 siRNA 또는 iNA를 생성할 수 있다. 그러나, 2개의 가닥 중 단지 하나(가이드 가닥(guide strand)으로 알려짐)만이 아르고노트 단백질에 결합하고 유전자 침묵을 유도한다. 다른 하나의 안티-가이드 가닥 또는 패신저 가닥은 RISC 활성화 동안 저하된다.
화학식 I의 화합물
달리 지시되지 않는 한, 본 명세서의 화학식 I의 화합물에 대한 언급은 이의 염에 대한 언급을 포함하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "염(들)"은 무기 및/또는 유기 산으로 형성된 산성 염뿐만 아니라, 무기 및/또는 유기 염기로 형성된 염기성 염을 나타낸다. 게다가, 화학식 I의 화합물이, 피리딘 또는 이미다졸과 같은 그러나 이로 한정되지 않는 염기성 모이어티, 및 카르복실산과 같은 그러나 이로 한정되지 않는 산성 모이어티 둘 모두를 함유하는 경우, 쯔비터이온("내염(inner salt)")이 형성될 수 있으며, 이는 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "염(들)" 내에 포함된다. 염은 약제학적으로 허용되는(즉, 비독성, 생리학적으로 허용되는) 염일 수 있지만, 다른 염이 또한 유용하다. 화학식 I의 화합물의 염은, 예를 들어, 화학식 I의 화합물을, 매체, 예컨대 염이 침전되는 것 중에서, 또는 수성 매체 중에서 소정량, 예컨대 당량의 산 또는 염기와 반응시킨 후, 동결건조시킴으로써 형성될 수 있다.
예시적인 산 부가 염에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 석시네이트, 설페이트, 설포네이트(예컨대, 본 명세서에 언급된 것들), 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트(토실레이트로도 알려짐), 운데카노에이트 등이 포함된다. 추가적으로, 염기성 약제학적 화합물로부터의 약제학적으로 유용한 염의 형성에 적합한 것으로 일반적으로 여겨지는 산은, 예를 들어 문헌[S. Berge et al, J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1)1-19]; 문헌[P. Gould, International J. Pharmaceutics (1986) 33 201-217]; 문헌[Anderson et al., The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York]에 의해; 그리고 문헌[The Orange Book (미국 워싱턴 D.C. 소재의 Food & Drug Administration; 이의 웹사이트 상에 있음)]에 논의되어 있다.
예시적인 염기성 염에는 암모늄 염, 알칼리 금속 염, 예컨대 나트륨, 리튬, 및 칼륨 염, 알칼리 토금속 염, 예컨대 칼슘 및 마그네슘 염, 유기 염기(예를 들어, 유기 아민), 예컨대 벤자틴, 다이사이클로헥실아민, 하이드라바민(N,N-비스(데하이드로아비에틸)에틸렌다이아민으로 형성됨), N-메틸-D-글루카민, N-메틸-D-글루카미드, t-부틸 아민과의 염, 및 아미노산, 예컨대 아르기닌 또는 라이신과의 염이 포함된다. 염기성 질소-함유 기는 저급 알킬 할라이드(예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드, 및 요오다이드), 다이알킬 설페이트(예를 들어, 다이메틸, 다이에틸, 다이부틸, 및 다이아밀 설페이트), 장쇄 할라이드(예를 들어, 데실, 라우릴, 미리스틸, 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드, 및 요오다이드), 아릴알킬 할라이드(예를 들어, 벤질 및 페네틸 브로마이드) 등과 같은 작용제로 4차화될 수 있다.
그러한 모든 산 및 염기 염은 본 발명의 범주 내에서 약제학적으로 허용되는 염인 것으로 의도되며, 모든 산 및 염기 염은 본 발명의 목적상 상응하는 화학식 I의 화합물의 유리 형태와 동등한 것으로 간주된다.
화학식 I의 화합물은 비용매화된 형태, 및 수화된 형태를 포함한 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 약제학적으로 허용되는 용매, 예컨대 물, 에탄올 등을 갖는 용매화된 형태는 본 발명의 목적상 비용매화된 형태와 동등하다.
화학식 I의 화합물 및 이의 염, 용매화물은 (예를 들어, 아미드 또는 이미노 에테르로서) 이들의 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 그러한 모든 호변이성질체 형태는 본 명세서에서 본 발명의 일부로서 고려된다.
또한, 본 발명의 화합물의 다형체가 본 발명의 범주 내에 있다(즉, 화학식 I의 화합물의 다형체는 본 발명의 범주 내에 있다).
본 화합물(이에는 본 화합물의 염, 용매화물, 및 전구약물뿐만 아니라 전구약물의 염 및 용매화물의 것들이 포함됨)의 모든 입체이성질체(예를 들어, 기하 이성질체, 광학 이성질체 등), 예컨대 다양한 치환체 상의 비대칭 탄소로 인해 존재할 수 있는 것들 - 이에는 거울상 이성질체 형태(이는 비대칭 탄소의 부재 하에서도 존재할 수 있음), 회전 이성질체 형태, 회전장애 이성질체, 및 부분입체 이성질체 형태가 포함됨 - 이 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 본 발명의 화합물의 개별 입체이성질체에는, 예를 들어 다른 이성질체가 실질적으로 없을 수 있거나, 또는, 예를 들어 라세미체로서 혼합될 수 있거나 다른 모든, 또는 다른 선택된 입체이성질체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 화합물의 키랄 중심은 문헌[IUPAC 1974 Recommendations]에 의해 정의된 바와 같은 S 또는 R 배치를 가질 수 있다. 용어 "염", "용매화물" 등의 사용은 개시된 화합물의 거울상 이성질체, 입체이성질체, 회전이성질체, 호변이성질체, 라세미체, 또는 전구약물의 염 및 용매화물에 동일하게 적용되는 것으로 의도된다.
화학치료제(항신생물제)로서 사용될 수 있는 화합물의 부류에는 알킬화제, 항대사물질제, 천연 산물 및 이들의 유도체, 호르몬 및 스테로이드(합성 유사체를 포함함), 및 합성물질이 포함된다. 이들 부류 내의 화합물의 예가 하기에 주어져 있다.
지질 입자
화학식 I의 화합물은 지질 분자의 이중층 또는 나노입자를 포함하는 지질 조성물 내의 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 지질 이중층은 바람직하게는 중성 지질 또는 중합체를 추가로 포함한다. 지질 조성물은 바람직하게는 액체 매체를 포함한다. 이 조성물은 바람직하게는 추가로 핵산을 캡슐화한다. 핵산은 바람직하게는 RNA 간섭(RNAi)을 이용함으로써 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 갖는다. 지질 조성물은 바람직하게는 핵산 및 중성 지질 또는 중합체를 추가로 포함한다. 지질 조성물은 바람직하게는 핵산을 캡슐화한다.
본 발명은 지질 입자를 제공하며, 상기 지질 입자는 그 안에 캡슐화된 하나 이상의 치료적 mRNA 분자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, mRNA는 지질 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화되어, 지질 입자 내의 mRNA가 수용액 중에서 뉴클레아제 분해에 저항성을 나타내게 한다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 지질 입자는 포유동물, 예컨대 인간에 대해 실질적으로 비독성이다. 지질 입자는 전형적으로 평균 직경이 30 nm 내지 150 nm, 40 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 150 nm, 60 nm 내지 130 nm, 70 nm 내지 110 nm, 또는 70 내지 90 nm이다. 본 발명의 지질 입자는 또한 전형적으로 지질:RNA 비(질량/질량 비)가 1:1 내지 100:1, 1:1 내지 50:1, 2:1 내지 25:1, 3:1 내지 20:1, 5:1 내지 15:1, 또는 5:1 내지 10:1, 또는 10:1 내지 14:1, 또는 9:1 내지 20:1이다. 일 실시 형태에서, 지질 입자는 지질: RNA 비(질량/질량 비)가 12:1이다. 다른 실시 형태에서, 지질 입자는 지질: mRNA 비(질량/질량 비)가 13:1이다.
바람직한 실시 형태에서, 지질 입자는 mRNA, 양이온성 지질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 양이온성 지질 또는 이의 염), 인지질, 및 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질(예를 들어, 하나 이상의 PEG-지질 접합체)을 포함한다. 지질 입자는 또한 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 지질 입자는 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 mRNA를 포함할 수 있다.
핵산-지질 입자에서, mRNA는 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화되어, 뉴클레아제 분해로부터 핵산을 보호할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, mRNA를 포함하는 지질 입자는 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화되어, 뉴클레아제 분해로부터 핵산을 보호한다. 소정의 경우에, 지질 입자 내의 mRNA는 37℃에서 적어도 20, 30, 45, 또는 60분 동안 뉴클레아제에 대한 입자의 노출 후에 실질적으로 분해되지 않는다. 소정의 다른 경우에, 지질 입자 내의 mRNA는 37℃에서 적어도 30, 45, 또는 60분 동안 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 또는 36시간 동안 혈청 중에서의 입자의 인큐베이션 후에 실질적으로 분해되지 않는다. 다른 실시 형태에서, mRNA는 입자의 지질 부분과 복합체화된다. 본 발명의 제형의 이점 중 하나는 핵산-지질 입자 조성물이 포유동물, 예컨대 인간에 대해 실질적으로 비독성이라는 점이다.
"완전히 캡슐화된"은 핵산-지질 입자 내의 핵산(예를 들어, mRNA)이 유리 RNA를 유의하게 분해시킬 뉴클레아제 검정 또는 혈청에 대한 노출 후에 유의하게 분해되지 않음을 의미한다. 완전히 캡슐화되는 경우, 100%의 유리 핵산을 통상 분해하게 될 처리에서, 바람직하게는 입자 내의 핵산의 25% 미만이 분해되며, 더 바람직하게는 입자 내의 핵산의 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 5% 미만이 분해된다. "완전히 캡슐화된"은 또한 생체내(in vivo) 투여 시에 핵산-지질 입자가 그의 성분 부분으로 신속하게 분해되지 않음을 의미한다.
핵산과 관련하여, 핵산과 회합될 때 형광이 향상되는 염료를 사용하는 막-불투과성 형광 염료 배제 분석을 수행함으로써 완전 캡슐화가 결정될 수 있다. 캡슐화는, 염료를 리포좀 제형에 첨가하고, 얻어지는 형광을 측정하고, 이것을 소량의 비이온성 표면활성제의 첨가 시에 관찰되는 형광과 대비함으로써 결정된다. 리포좀 이중층의 표면활성제-매개 파괴는 캡슐화된 핵산을 방출시켜, 그것이 막-불투과성 염료와 상호작용할 수 있게 한다. 핵산 캡슐화는 E = (I0 - I)/I0으로서 계산될 수 있으며, 여기서 I 및 I0은 표면활성제의 첨가 전과 후의 형광 강도를 지칭한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 복수의 핵산-지질 입자를 포함하는 핵산-지질 입자 조성물을 제공한다.
지질 입자는 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화된 mRNA를 포함하여, 입자의 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 90% 내지 100%, 30% 내지 95%, 40% 내지 95%, 50% 내지 95%, 60% 내지 95%, 70% 내지 95%, 80% 내지 95%, 85% 내지 95%, 90% 내지 95%, 30% 내지 90%, 40% 내지 90%, 50% 내지 90%, 60% 내지 90%, 70% 내지 90%, 80% 내지 90%, 또는 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)가 그 안에 캡슐화된 mRNA를 갖도록 한다.
지질 입자의 의도된 용도에 따라, 성분들의 비율이 변동될 수 있으며, 특정 제형의 전달 효율은 당업계에 알려진 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
양이온성 지질
본 발명은 소정의 양이온성 지질 화합물의 합성을 포함한다. 본 화합물은 이어지는 섹션에서 입증된 바와 같이 세포 및 조직에 폴리뉴클레오티드를 전달하는 데 특히 적합하다. 이뿐만 아니라, 본 명세서에 기재된 지질거대사이클(lipomacrocycle) 화합물은 다른 목적에 사용될 수 있으며, 예를 들어 수령체(recipient) 및 첨가제로서 사용될 수 있다.
양이온성 지질 화합물의 합성 방법은 당업계의 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 당업자는 이들 화합물을 생성할, 그리고 또한 본 발명의 다른 화합물을 생성할 다른 방법을 인식할 것이다.
양이온성 지질 화합물은 작용제와 배합되어 미세입자, 나노입자, 리포좀, 또는 미셀을 형성할 수 있다. 입자, 리포좀, 또는 미셀에 의해 전달되는 작용제는 기체, 액체, 또는 고체 형태일 수 있으며, 작용제는 폴리뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 또는 소분자일 수 있다. 지질거대사이클 화합물은 다른 양이온성 지질 화합물, 중합체(합성 또는 천연), 계면활성제, 콜레스테롤, 탄수화물, 단백질, 또는 지질과 배합되어 입자를 형성할 수 있다. 이어서, 이들 입자는 선택적으로 약제학적 부형제와 배합되어 약제학적 조성물을 형성할 수 있다.
본 발명은 신규한 양이온성 지질 화합물 및 그러한 양이온성 지질 화합물의 사용에 기초한 약물 전달 시스템을 제공한다. 본 시스템은 환자, 조직, 기관, 또는 세포에 폴리뉴클레오티드, 단백질, 소분자, 펩티드, 항원, 또는 약물을 전달하기 위한 제약/약물 전달 기술분야에 사용될 수 있다. 이들 신규한 화합물은 또한 코팅, 첨가제, 부형제, 재료, 또는 바이오엔지니어링(bioengineering)을 위한 물질로서 사용될 수 있다.
본 발명의 양이온성 지질 화합물은 약물 전달 기술분야에서 몇몇 상이한 용도를 제공한다. 양이온성 지질 화합물의 아민-함유 부분은 폴리뉴클레오티드를 복합체화하는 데 사용되어, 폴리뉴클레오티드의 전달을 향상시키고 이들의 분해를 방지할 수 있다. 양이온성 지질 화합물은 또한 전달하고자 하는 작용제를 함유하는 피코입자, 나노입자, 미세입자, 리포좀, 및 미셀의 형성에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 양이온성 지질 화합물은 생체적합성이고 생분해성이며, 형성된 입자는 또한 생분해성이고 생체적합성이며 전달하고자 하는 작용제의 제어된 지속 방출을 제공하는 데 사용될 수 있다. 이들 입자 및 이들의 상응하는 입자는 또한, 이들이 더 낮은 pH에서 양성자화되는 것을 고려하면, pH 변화에 반응할 수 있다. 이들은 또한 세포에 대한 작용제의 전달 시에 양성자 스펀지로서 작용하여 엔도솜 용해를 야기할 수 있다.
소정의 실시 형태에서, 양이온성 지질 화합물은 비교적 비세포독성이다. 양이온성 지질 화합물은 생체적합성이고 생분해성일 수 있다. 양이온성 지질은 (제형 환경에서) 측정된 pKa가 대략 5.5 내지 대략 7.5, 더 바람직하게는 대략 6.0 내지 대략 7.0의 범위일 수 있다. 이것은 대략 3.0 내지 대략 9.0, 또는 대략 5.0 내지 대략 8.0의 원하는 pKa를 갖도록 설계될 수 있다. 본 명세서에 기재된 양이온성 지질 화합물은 다음과 같은 몇 가지 이유로 약물 전달에 특히 매력적이다: 이들은 DNA, RNA, 다른 폴리뉴클레오티드, 및 다른 음으로 하전된 작용제와 상호작용하기 위한, pH를 완충시키기 위한, 엔도-삼투용해(endo-osmolysis)를 야기하기 위한, 전달하고자 하는 작용제를 보호하기 위한 아미노 기를 함유하고/하거나; 이들은 구매가능한 출발 물질로부터 합성될 수 있고/있거나; 이들은 pH 반응성이고 원하는 pKa로 조작될 수 있다.
중성 헬퍼 지질
비양이온성 지질의 비제한적인 예에는 인지질, 예컨대 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카르디오리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 다이세틸포스페이트, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이올레일포스파티딜콜린(DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이올레일포스파티딜글리세롤(DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜글리세롤(POPG), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 다이팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE), 다이미리스토일-포스파티딜에탄올아민(DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 다이메틸-포스파티딜에탄올아민, 다이엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 스테아로일올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 리소포스파티딜콜린, 다이리놀레오일포스파티딜콜린, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 다른 다이아실포스파티딜콜린 및 다이아실포스파티딜에탄올아민 인지질이 또한 사용될 수 있다. 이들 지질 내의 아실 기는 바람직하게는 C10-C24 탄소 사슬을 갖는 지방산으로부터 유도되는 아실 기, 예를 들어 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일, 또는 올레오일이다.
비양이온성 지질의 추가의 예에는 스테롤, 예컨대 콜레스테롤 및 이의 유도체가 포함된다. 콜레스테롤 유도체의 비제한적인 예에는 극성 유사체, 예컨대 5α-콜레스타놀, 5α-코프로스타놀, 콜레스테릴-(2'-하이드록시)-에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르, 및 6-케토콜레스타놀; 비극성 유사체, 예컨대 5α-콜레스탄, 콜레스테논, 5α-콜레스타논, 5α-콜레스타논, 및 콜레스테릴 데카노에이트; 및 이들의 혼합물이 포함된다. 바람직한 실시 형태에서, 콜레스테롤 유도체는 극성 유사체, 예컨대 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르이다.
일부 실시 형태에서, 지질 입자에 존재하는 비양이온성 지질은 하나 이상의 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시 형태에서, 지질 입자에 존재하는 비양이온성 지질은 하나 이상의 인지질을 포함하거나 이로 이루어지며, 예를 들어 콜레스테롤-무함유 지질 입자 제형이다. 다른 실시 형태에서, 지질 입자에 존재하는 비양이온성 지질은 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 포함하거나 이로 이루어지며, 예를 들어 인지질-무함유 지질 입자 제형이다.
비양이온성 지질의 다른 예에는 비인(nonphosphorous) 함유 지질, 예컨대 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤 리시놀레에이트, 헥사데실 스테아레이트, 아이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴 중합체, 트라이에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트 폴리에틸옥실화 지방산 아미드, 다이옥타데실다이메틸 암모늄 브로마이드, 세라마이드, 및 스핑고미엘린이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 비양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 10 몰% 내지 60 몰%, 20 몰% 내지 55 몰%, 20 몰% 내지 45 몰%, 20 몰% 내지 40 몰%, 25 몰% 내지 50 몰%, 25 몰% 내지 45 몰%, 30 몰% 내지 50 몰%, 30 몰% 내지 45 몰%, 30 몰% 내지 40 몰%, 35 몰% 내지 45 몰%, 37 몰% 내지 42 몰%, 또는 35 몰%, 36 몰%, 37 몰%, 38 몰%, 39 몰%, 40 몰%, 41 몰%, 42 몰%, 43 몰%, 44 몰%, 또는 45 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
지질 입자가 인지질 및 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체의 혼합물을 함유하는 실시 형태에서, 상기 혼합물은 입자에 존재하는 총 지질의 최대 40 몰%, 45 몰%, 50 몰%, 55 몰%, 또는 60 몰%를 구성할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 혼합물 내의 인지질 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 2 몰% 내지 20 몰%, 2 몰% 내지 15 몰%, 2 몰% 내지 12 몰%, 4 몰% 내지 15 몰%, 또는 4 몰% 내지 10 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성할 수 있다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 혼합물 내의 인지질 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 5 몰% 내지 10 몰%, 5 몰% 내지 9 몰%, 5 몰% 내지 8 몰%, 6 몰% 내지 9 몰%, 6 몰% 내지 8 몰%, 또는 5 몰%, 6 몰%, 7 몰%, 8 몰%, 9 몰%, 또는 10 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
다른 실시 형태에서, 혼합물 내의 콜레스테롤 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 25 몰% 내지 45 몰%, 25 몰% 내지 40 몰%, 30 몰% 내지 45 몰%, 30 몰% 내지 40 몰%, 27 몰% 내지 37 몰%, 25 몰% 내지 30 몰%, 또는 35 몰% 내지 40 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성할 수 있다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 혼합물 내의 콜레스테롤 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 25 몰% 내지 35 몰%, 27 몰% 내지 35 몰%, 29 몰% 내지 35 몰%, 30 몰% 내지 35 몰%, 30 몰% 내지 34 몰%, 31 몰% 내지 33 몰%, 또는 30 몰%, 31 몰%, 32 몰%, 33 몰%, 34 몰%, 또는 35 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
지질 입자가 인지질-무함유인 실시 형태에서, 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 입자에 존재하는 총 지질의 최대 25 몰%, 30 몰%, 35 몰%, 40 몰%, 45 몰%, 50 몰%, 55 몰%, 또는 60 몰%를 구성할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 인지질-무함유 지질 입자 제형 내의 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 입자에 존재하는 총 지질의 25 몰% 내지 45 몰%, 25 몰% 내지 40 몰%, 30 몰% 내지 45 몰%, 30 몰% 내지 40 몰%, 31 몰% 내지 39 몰%, 32 몰% 내지 38 몰%, 33 몰% 내지 37 몰%, 35 몰% 내지 45 몰%, 30 몰% 내지 35 몰%, 35 몰% 내지 40 몰%, 또는 30 몰%, 31 몰%, 32 몰%, 33 몰%, 34 몰%, 35 몰%, 36 몰%, 37 몰%, 38 몰%, 39 몰%, 또는 40 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 비양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 5 몰% 내지 90 몰%, 10 몰% 내지 85 몰%, 20 몰% 내지 80 몰%, 10 몰%(예를 들어, 인지질 단독), 또는 60 몰%(예를 들어, 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체)(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
지질 입자에 존재하는 비양이온성 지질의 백분율은 목표량이며, 제형에 존재하는 비양이온성 지질의 실제량은, 예를 들어 ± 5 몰%만큼 변동될 수 있다.
양이온성 지질 화합물을 함유하는 조성물은 30 내지 70%의 양이온성 지질 화합물, 0 내지 60%의 콜레스테롤, 0 내지 30%의 인지질 및 1 내지 10%의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 30 내지 40%의 양이온성 지질 화합물, 40 내지 50%의 콜레스테롤, 및 10 내지 20%의 PEG이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 50 내지 75%의 양이온성 지질 화합물, 20 내지 40%의 콜레스테롤 및 5 내지 10%의 인지질, 및 1 내지 10%의 PEG이다. 조성물은 60 내지 70%의 양이온성 지질 화합물, 25 내지 35%의 콜레스테롤, 및 5 내지 10%의 PEG를 함유할 수 있다. 조성물은 최대 90%의 양이온성 지질 화합물 및 2 내지 15%의 헬퍼 지질을 함유할 수 있다.
제형은, 예를 들어 8 내지 30%의 화합물, 5 내지 30%의 헬퍼 지질, 및 0 내지 20%의 콜레스테롤; 4 내지 25%의 양이온성 지질, 4 내지 25%의 헬퍼 지질, 2 내지 25%의 콜레스테롤, 10 내지 35%의 콜레스테롤-PEG, 및 5%의 콜레스테롤-아민; 또는 2 내지 30%의 양이온성 지질, 2 내지 30%의 헬퍼 지질, 1 내지 15%의 콜레스테롤, 2 내지 35%의 콜레스테롤-PEG, 및 1 내지 20%의 콜레스테롤-아민; 또는 최대 90%의 양이온성 지질 및 2 내지 10%의 헬퍼 지질, 또는 심지어 100%의 양이온성 지질을 함유하는 지질 입자 제형일 수 있다.
지질 접합체
양이온성 지질에 더하여, 본 명세서에 기재된 지질 입자는 지질 접합체를 추가로 포함할 수 있다. 접합된 지질은 그것이 입자의 응집을 방지한다는 점에 있어서 유용하다. 적합한 접합된 지질은 PEG-지질 접합체, 양이온성-중합체-지질 접합체, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
바람직한 실시 형태에서, 지질 접합체는 PEG-지질이다. PEG-지질의 예에는 다이알킬옥시프로필에 결합된 PEG(PEG-DAA), 다이아실글리세롤에 결합된 PEG(PEG-DAG), 포스파티딜에탄올아민과 같은 인지질에 결합된 PEG(PEG-PE), 세라마이드에 접합된 PEG, 콜레스테롤 또는 이의 유도체에 접합된 PEG, 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
PEG는 2개의 말단 하이드록실 기를 갖는 에틸렌 PEG 반복 단위의 선형 수용성 중합체이다. PEG는 그들의 분자량으로 분류되며, 하기가 포함된다: 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜- 석시네이트(MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석신이미딜 석시네이트(MePEG-S- NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민(MePEG-NH2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트(MePEG-TRES), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카르보닐(MePEG-IM)뿐만 아니라, 말단 메톡시 기 대신에 말단 하이드록실 기를 함유하는 그러한 화합물(예를 들어, HO-PEG-S, HO-PEG-S-NHS, HO-PEG-NH2).
본 명세서에 기재된 PEG-지질 접합체의 PEG 모이어티는 평균 분자량이 550 달톤 내지 10,000 달톤의 범위일 수 있다. 소정의 경우에, PEG 모이어티는 평균 분자량이 750 달톤 내지 5,000 달톤(예를 들어, 1,000 달톤 내지 5,000 달톤, 1,500 달톤 내지 3,000 달톤, 750 달톤 내지 3,000 달톤, 750 달톤 내지 2,000 달톤)이다. 바람직한 실시 형태에서, PEG 모이어티는 평균 분자량이 2,000 달톤 또는 750 달톤이다.
소정의 경우에, PEG는 알킬, 알콕시, 아실, 또는 아릴 기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. PEG는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG를 지질에 결합시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 에스테르-비함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티가 포함된다. 바람직한 실시 형태에서, 링커 모이어티는 에스테르-비함유 링커 모이어티이다. 적합한 에스테르-비함유 링커 모이어티는 아미도(-C(O)NH-), 아미노(-NR-), 카르보닐(-C(O)-), 카르바메이트(-NHC(O)O-), 우레아(-NHC(O)NH-), 다이설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 석시닐(-(O)CCH2CH2C(O)-), 석신아미딜(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), 에테르, 다이설파이드뿐만 아니라 이들의 조합(예컨대, 카르바메이트 링커 모이어티 및 아미도 링커 모이어티 둘 모두를 함유하는 링커)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 바람직한 실시 형태에서, 카르바메이트 링커가 PEG를 지질에 결합시키는 데 사용된다.
다른 실시 형태에서, 에스테르-함유 링커 모이어티가 PEG를 지질에 결합시키는 데 사용된다. 적합한 에스테르-함유 링커 모이어티는, 예를 들어 카르보네이트(-OC(O)O-), 석시노일, 포스페이트 에스테르(-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르, 및 이들의 조합을 포함한다.
다양한 사슬 길이 및 포화도의 다양한 아실 사슬 기를 갖는 포스파티딜에탄올아민이 PEG에 접합되어 지질 접합체를 형성할 수 있다. 그러한 포스파티딜에탄올아민은 구매가능하거나, 또는 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 단리되거나 합성될 수 있다. 탄소 사슬 길이가 C10 내지 C20의 범위인 포화 또는 불포화 지방산을 함유하는 포스파티딜에탄올아민이 바람직하다. 모노- 또는 다이-불포화 지방산 및 포화 지방산과 불포화 지방산의 혼합물을 갖는 포스파티딜에탄올아민이 또한 사용될 수 있다. 적합한 포스파티딜에탄올아민은 다이미리스토일-포스파티딜에탄올아민(DMPE), 다이팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE), 다이올레일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 및 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
용어 "다이아실글리세롤" 또는 "DAG"는 2개의 지방 아실 사슬, R1 및 R2를 갖는 화합물을 포함하며, 이들 둘 모두는 독립적으로 에스테르 결합에 의해 글리세롤의 1- 및 2-위치에 결합된 2 내지 30개의 탄소를 갖는다. 아실 기는 포화되거나 다양한 불포화도를 가질 수 있다. 적합한 아실 기에는 라우로일(C12), 미리스토일(C14), 팔미토일(C16), 스테아로일(C18), 및 아이코소일(C20)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 바람직한 실시 형태에서, R1과 R2는 동일하며, 즉 R1 및 R2는 둘 모두 미리스토일(즉, 다이미리스토일)이고, R1 및 R2는 둘 모두 스테아로일(즉, 다이스테아로일)이다.
용어 "다이알킬옥시프로필" 또는 "DAA"는 2개의 알킬 사슬, R1 및 R2를 갖는 화합물을 포함하며, 이들 둘 모두는 독립적으로 2 내지 30개의 탄소를 갖는다. 알킬 기는 포화되거나 다양한 불포화도를 가질 수 있다.
바람직하게는, PEG-DAA 접합체는 PEG-다이데실옥시프로필(C10) 접합체, PEG-다이라우릴옥시프로필(C12) 접합체, PEG-다이미리스틸옥시프로필(C14) 접합체, PEG-다이팔미토일옥시프로필(C16) 접합체, 또는 PEG-다이스테아릴옥시프로필(C18) 접합체이다. 이들 실시 형태에서, PEG는 바람직하게는 평균 분자량이 750 또는 2,000 달톤이다. 특정 실시 형태에서, PEG의 말단 하이드록실 기는 메틸 기로 치환된다.
전술한 것에 더하여, 다른 친수성 중합체가 PEG 대신에 사용될 수 있다. PEG 대신에 사용될 수 있는 적합한 중합체의 예에는 폴리비닐피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리다이메틸아크릴아미드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 유도체화된 셀룰로스, 예컨대 하이드록시메틸셀룰로스 또는 하이드록시에틸셀룰로스가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 지질 접합체(예를 들어, PEG-지질)는 입자에 존재하는 총 지질의 0.1 몰% 내지 2 몰%, 0.5 몰% 내지 2 몰%, 1 몰% 내지 2 몰%, 0.6 몰% 내지 1.9 몰%, 0.7 몰% 내지 1.8 몰%, 0.8 몰% 내지 1.7 몰%, 0.9 몰% 내지 1.6 몰%, 0.9 몰% 내지 1.8 몰%, 1 몰% 내지 1.8 몰%, 1 몰% 내지 1.7 몰%, 1.2 몰% 내지 1.8 몰%, 1.2 몰% 내지 1.7 몰%, 1.3 몰% 내지 1.6 몰%, 또는 1.4 몰% 내지 1.5 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다. 다른 실시 형태에서, 지질 접합체(예를 들어, PEG-지질)는 입자에 존재하는 총 지질의 0 몰% 내지 20 몰%, 0.5 몰% 내지 20 몰%, 2 몰% 내지 20 몰%, 1.5 몰% 내지 18 몰%, 2 몰% 내지 15 몰%, 4 몰% 내지 15 몰%, 2 몰% 내지 12 몰%, 5 몰% 내지 12 몰%, 또는 2 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
추가의 실시 형태에서, 지질 접합체(예를 들어, PEG-지질)는 입자에 존재하는 총 지질의 4 몰% 내지 10 몰%, 5 몰% 내지 10 몰%, 5 몰% 내지 9 몰%, 5 몰% 내지 8 몰%, 6 몰% 내지 9 몰%, 6 몰% 내지 8 몰%, 또는 5 몰%, 6 몰%, 7 몰%, 8 몰%, 9 몰%, 또는 10 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
본 발명의 지질 입자에 존재하는 지질 접합체(예를 들어, PEG-지질)의 백분율은 목표량이며, 제형에 존재하는 지질 접합체의 실제량은, 예를 들어 ± 2 몰%만큼 변동될 수 있다. 당업자는 지질 접합체의 농도가, 사용되는 지질 접합체 및 지질 입자가 융합유도성(fusogenic)이 되는 속도에 따라 변동될 수 있음을 이해할 것이다.
지질 접합체의 조성 및 농도를 제어함으로써, 지질 접합체가 지질 입자로부터 교환되는 속도, 및 결과적으로, 지질 입자가 융합유도성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 게다가, 예를 들어 pH, 온도, 또는 이온 강도를 포함한 다른 변수가, 지질 입자가 융합유도성이 되는 속도를 변동시키고/시키거나 제어하는 데 사용될 수 있다. 지질 입자가 융합유도성이 되는 속도를 제어하는 데 사용될 수 있는 다른 방법은 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백해질 것이다. 또한, 지질 접합체의 조성 및 농도를 제어함으로써, 지질 입자 크기를 제어할 수 있다.
투여를 위한 조성물 및 제형
본 발명의 핵산-지질 조성물은 다양한 경로에 의해, 예를 들어 전신 전달을 달성하기 위해 정맥내, 비경구, 복막내, 또는 국소 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, siRNA가, 예를 들어 폐 또는 간과 같은 표적 조직의 세포에서 또는 염증 조직에서, 세포내 전달될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 생체내에서의 siRNA의 전달 방법을 제공한다. 핵산-지질 조성물은 대상체에게 정맥내, 피하, 또는 복막내 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 포유류 대상체의 폐에 간섭 RNA를 생체내 전달하는 방법을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 포유류 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 핵산, 양이온성 지질, 양친매성 물질, 인지질, 콜레스테롤, 및 PEG-연결된 콜레스테롤을 함유하는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량이, 상기 조성물에 의해 저하, 감소, 하향조절, 또는 침묵될 수 있는 유전자의 발현 또는 과발현과 관련된 질병 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 다양한 점막 투여 방식에 의해 대상체에게 투여될 수 있으며, 이에는 경구, 직장내, 질내, 비강내, 폐내, 또는 경피 또는 피부 전달에 의한 것, 또는 눈, 귀, 피부, 또는 다른 점막 표면으로의 국소 전달에 의한 것이 포함된다. 본 발명의 일부 태양에서, 점막 조직 층은 상피 세포 층을 포함한다. 상피 세포는 폐, 기관, 기관지, 폐포, 비강, 협측, 표피, 또는 위장 상피 세포일 수 있다. 본 발명의 조성물은 통상적인 액츄에이터, 예컨대 기계식 분무 장치뿐만 아니라 가압형, 전기 작동형, 또는 다른 유형의 액츄에이터를 사용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비강 또는 폐 스프레이로서 수용액으로 투여될 수 있으며, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 분무 형태로 분배될 수 있다. 본 발명의 조성물의 폐 전달은, 예를 들어 에어로졸화(aerosolize), 무화(atomize), 또는 연무화(nebulize)될 수 있는 액적, 입자, 또는 분무의 형태로 조성물을 투여함으로써 달성된다. 조성물, 분무, 또는 에어로졸의 입자는 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 비강 스프레이로서 액체를 분배하기에 바람직한 시스템이 미국 특허 제4,511,069호에 개시되어 있다. 그러한 제형은 본 발명에 따른 조성물을 물 중에 용해시켜 수용액을 생성하고, 상기 용액을 멸균되게 함으로써 편리하게 제조될 수 있다. 제형은 다회-용량 용기로, 예를 들어 미국 특허 제4,511,069호에 개시된 밀봉된 분배 시스템으로 제공될 수 있다. 다른 적합한 비강 스프레이 전달 시스템이 문헌[TRANSDERMAL SYSTEMIC MEDICATION, Y. W. Chien ed., Elsevier Publishers, New York, 1985]; 및 미국 특허 제4,778,810호에 기재되어 있다. 추가의 에어로졸 전달 형태는, 예를 들어, 압축 공기-, 제트-, 초음파-, 및 압전 네뷸라이저(piezoelectric nebulizer)를 포함할 수 있는데, 이들은 약제학적 용매, 예를 들어 물, 에탄올, 또는 이들의 혼합물 중에 용해되거나 현탁된 생물학적 활성제를 전달한다.
본 발명의 비강 및 폐 분무 용액은 전형적으로, 선택적으로 표면 활성제, 예컨대 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트-80), 및 하나 이상의 완충제와 함께 제형화되는, 전달하고자 하는 약물 또는 약물들을 포함한다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 비강 분무 용액은 추진제를 추가로 포함한다. 비강 분무 용액의 pH는 pH 6.8 내지 7.2일 수 있다. 사용되는 약제학적 용매는 또한 pH 4 내지 6의 약간 산성인 수성 완충제일 수 있다. 화학적 안정성을 향상시키거나 유지하기 위하여, 방부제, 계면활성제, 분산제, 또는 가스를 비롯한 다른 성분이 첨가될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 함유하는 용액 및 폐, 점막, 또는 비강내 분무 또는 에어로졸을 위한 액추에이터를 포함하는 의약 제품이다.
본 발명의 조성물의 투여 형태는 액체일 수 있으며, 이때 액체는 액적 또는 에멀젼의 형태이거나, 또는 에어로졸의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 형태는 고체일 수 있으며, 이는 투여 전에 액체 중에 재구성될 수 있다. 고체는 분말로서 투여될 수 있다. 고체는 캡슐, 정제, 또는 겔의 형태일 수 있다.
본 개시내용 내에서 폐 전달을 위한 조성물을 제형화하기 위하여, 생물학적 활성제는 다양한 약제학적으로 허용되는 첨가제뿐만 아니라 활성제(들)의 분산을 위한 기제(base) 또는 담체와 배합될 수 있다. 첨가제의 예에는 pH 제어제, 예컨대 아르기닌, 수산화나트륨, 글리신, 염산, 시트르산, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 다른 첨가제에는 국소 마취제(예를 들어, 벤질 알코올), 등장화제(예를 들어, 염화나트륨, 만니톨, 소르비톨), 흡착 억제제(예를 들어, Tween 80), 용해도 향상제(예를 들어, 사이클로덱스트린 및 이의 유도체), 안정화제(예를 들어, 혈청 알부민), 및 환원제(예를 들어, 글루타티온)가 포함된다. 점막 전달용 조성물이 액체일 때, 제형의 장성(tonicity)은, 1로서 취해진 0.9% (w/v) 생리학적 식염수의 장성을 기준으로 하여 측정될 때, 전형적으로, 투여 부위의 점막에서 실질적으로 비가역적인 조직 손상이 유발되지 않는 값으로 조정된다. 일반적으로, 용액의 장성은 1/3 내지 3, 더 전형적으로는 1/2 내지 2, 그리고 가장 흔하게는 3/4 내지 1.7의 값으로 조정된다.
생물학적 활성제는 활성제 및 임의의 원하는 첨가제를 분산시키는 능력을 갖는 친수성 화합물을 포함할 수 있는 기제 또는 비히클 중에 분산될 수 있다. 기제는 폴리카르복실산 또는 이의 염, 카르복실산 무수물(예를 들어, 말레산 무수물)과 다른 단량체(예를 들어, 메틸(메트)아크릴레이트, 아크릴산 등)의 공중합체, 친수성 비닐 중합체, 예컨대 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스 유도체, 예컨대 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 등, 및 천연 중합체, 예컨대 키토산, 콜라겐, 소듐 알기네이트, 젤라틴, 히알루론산, 및 이들의 비독성 금속 염을 포함하지만 이로 한정되지 않는 광범위한 적합한 담체로부터 선택될 수 있다. 종종, 생분해성 중합체가 기제 또는 담체로서 선택되는데, 예를 들어 폴리락트산, 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체, 폴리하이드록시부티르산, 폴리(하이드록시부티르산-글리콜산) 공중합체, 및 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 합성 지방산 에스테르, 예컨대 폴리글리세린 지방산 에스테르, 수크로스 지방산 에스테르 등이 담체로서 사용될 수 있다. 친수성 중합체 및 다른 담체가 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있으며, 부분 결정화, 이온 결합, 가교결합 등에 의해 향상된 구조적 완전성이 담체에 부여될 수 있다. 담체는 유동성 또는 점성 용액, 겔, 페이스트, 분말, 미소구체, 및 비강 점막에 직접 적용하기 위한 필름을 비롯한 다양한 형태로 제공될 수 있다. 이와 관련하여 선택된 담체의 사용은 생물학적 활성제의 흡수 촉진을 가져올 수 있다.
점막, 비강, 또는 폐 전달을 위한 제형은 기제 또는 부형제로서 친수성 저분자량 화합물을 함유할 수 있다. 그러한 친수성 저분자량 화합물은 수용성 활성제, 예컨대 생리학적으로 활성인 펩티드 또는 단백질이 활성제가 흡수되는 신체 표면으로 기제를 통해 확산될 수 있게 하는 통과 매체를 제공한다. 친수성 저분자량 화합물은 선택적으로 점막 또는 투여 분위기로부터 수분을 흡수하고 수용성 활성 펩티드를 용해시킨다. 친수성 저분자량 화합물의 분자량은 일반적으로 10,000 이하, 그리고 바람직하게는 3,000 이하이다. 친수성 저분자량 화합물의 예에는 폴리올 화합물, 예컨대 올리고당류, 이당류 및 단당류가 포함되며, 이들에는 수크로스, 만니톨, 락토스, L-아라비노스, D-에리트로스, D-리보스, D-자일로스, D-만노스, D-갈락토스, 락툴로스, 셀로비오스, 겐티비오스, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 친수성 저분자량 화합물의 추가의 예에는 N-메틸피롤리돈, 알코올(예를 들어, 올리고비닐 알코올, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등), 및 이들의 혼합물이 포함된다.
본 발명의 조성물은 대안적으로 생리학적 조건과 근사해지는 데 필요한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 장성 조정제, 및 습윤제, 예를 들어 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트라이에탄올아민 올레에이트, 및 이들의 혼합물을 함유한다. 고체 조성물의 경우, 통상적인 비독성의 약제학적으로 허용되는 담체가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등이 포함된다.
본 발명의 소정 실시 형태에서, 생물학적 활성제는 시한-방출 제형으로, 예를 들어 저속 방출 중합체를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 활성제는 급속 방출에 대해 보호할 담체, 예를 들어 제어 방출 비히클, 예컨대 중합체, 마이크로캡슐화된 전달 시스템, 또는 생체접착성 겔과 함께 제조될 수 있다. 본 발명의 다양한 조성물에서, 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 하이드로겔 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써, 활성제의 장기간의 전달을 가져올 수 있다.
본 발명이 소정 실시 형태와 관련하여 기재되어 있고, 많은 상세사항들이 예시를 목적으로 설명되어 있지만, 본 발명은 추가의 실시 형태를 포함하고 본 명세서에 기재된 상세사항들 중 일부는 본 발명으로부터 벗어나지 않고서 상당히 변화될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 그러한 추가의 실시 형태, 변형, 및 등가물을 포함한다.
실시예
실시예 1: 예시적인 지질
예시적인 화학식 I의 화합물이 표 1에 제공되어 있다. 화합물의 구조는 제1 열에 나타나 있다. 화합물의 명칭은 화학식 I에 따라 주어진다.
[화학식 I]
Figure 112021100425379-pat00019
첫 번째 숫자 쌍은 L1 및 L2에 대한, 카르보닐을 포함한 에스테르 내의 탄소의 수를 나타내고; 괄호 안의 숫자의 쌍은 분지형 알킬, R1, 또는 R2가 또한 분지형인 경우, R1/R2(별표는 이중 결합을 나타냄)의 각각의 분지 내의 탄소의 수를 나타내고; R3 내의 탄소의 수가 주어지고; 마지막 선은 R4 및 R5에 대한 치환을 나타낸다. ATX 번호는 본 명세서에 참고로 제공된다. 계산된 LogD 값(c-LogD) 및 계산된 pKa(c-pKa) 값이 제공될 뿐만 아니라, 괄호 안의 측정된 pKa(제형 환경에서 측정됨)가 제공된다. C-LogD 및 c-pKa 값은 ACD Labs Structure Designer v12.0에 의해 생성된다. 생물활성은 달리 명시되지 않는 한 0.03 mg/㎏의 용량에서의 생체내 인자 VII 녹다운의 백분율이다.
[표 1]
Figure 112021100425379-pat00020
Figure 112021100425379-pat00021
Figure 112021100425379-pat00022
Figure 112021100425379-pat00023
Figure 112021100425379-pat00024
Figure 112021100425379-pat00025
Figure 112021100425379-pat00026
Figure 112021100425379-pat00027
Figure 112021100425379-pat00028
Figure 112021100425379-pat00029
Figure 112021100425379-pat00030
Figure 112021100425379-pat00031
Figure 112021100425379-pat00032
.
실시예 2: ATX-0043의 합성
도 1은 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0043의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0043: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00033
500 mL 1구 둥근바닥 플라스크 내에, 다이클로로메탄(DCM; 200 mL) 중에 용해된 25 g의 헥산산(SM 1; 1 당량)을 넣고, 이어서 질소 분위기 하에서 교반하면서, 0℃에서 27.6 ml의 염화옥살릴(1.5 당량)을 서서히 첨가하고, 이어서 0.5 ml의 다이메틸포름아미드(DMF; 촉매)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
별도의 1 리터 2구 둥근바닥 플라스크에서, DCM(200 ml) 중 31.4 g의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드(1.5 당량)에, 89.8 ml의 트라이에틸아민(Et3N, 3 당량)을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 DCM(100 ml) 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 질소 분위기 하에서 20분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 박층 크로마토그래피(TLC)(20% 에틸아세테이트(EtOAc)/헥산; Rf: 0.5)로 모니터링하였다. 반응물(reaction mass)을 물(300 ml)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(3 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다.
조(crude) 화합물에 (60 내지 120 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 20.0 g; 수율, 58%.
ATX-0043: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00034
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 500 ml 2구 둥근바닥 플라스크 내에 넣어진, 테트라하이드로푸란(THF; 100 ml) 중 33 g의 펜틸 마그네슘 브로마이드(1.5 당량)의 용액에, (200 ml의 THF 중에 용해된) 20 g의 N-메톡시-N-메틸 헥산아미드(1 당량) 용액을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(150 ml)으로 켄칭(quenching)하고, 이어서 EtOAc(300 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 15.0 g; 수율, 66%.
ATX-0043: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00035
150 ml의 THF 중 25 ml의 메탄올(MeOH) 중에 용해된 15 g의 운데칸-6-온(1 당량)의 용액에, 4.9 g의 붕수소화나트륨(1.5 당량)을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(100 ml)으로 켄칭하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 조 물질을 EtOAc(150 ml)와 물(150 ml) 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 14.0 g; 수율, 93%.
ATX-0043: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00036
150 ml의 THF 중에 용해된 15 g의 4-아미노부탄산(1 당량)의 용액에, 순차적으로 첨가 깔때기를 사용하여, 145 ml의 1 N NaOH 수용액(1 당량)을 0℃에서 첨가한 후, 43.4 ml의 Boc 무수물(1.3 당량)을 첨가하였으며, 이러한 첨가는 각각의 것에 대해 15분의 기간에 걸쳐 수행하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(클로로포름(CHCl3) 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 5% HCl(150 ml)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(100 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다. 생성량, 20.0 g; 수율, 68%.
ATX-0043: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00037
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(200 ml) 중에 용해된 12 g의 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노) 부탄산(1 당량)의 용액에 14.7 g의 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보다이이미드(EDC).HCl(1.3 당량), 10.6 ml의 Et3N(1.3 당량), 및 0.72 g의 4-다이메틸아미노피리딘(DMAP; 0.1 당량)을 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 알코올을 DCM(50 ml) 중에 용해시켜 첨가 깔때기를 사용하여 동일한 온도에서 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(100 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 50 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(100 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 50 ml)로 추출하였다. 유기 층을 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 8.5 g; 수율, 48%.
ATX-0043: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00038
70 ml의 DCM 중에 용해된 8.5 g의 운데칸-6-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노) 부타노에이트(1 당량)의 용액에, 0℃에서 트라이플루오로아세트산(TFA; 10 당량)을 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(70% EtOAc/헥산; Rf: 0.2)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(150 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 100 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 ml의 트라이에틸아민)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 알코올을 회수하였다. 생성량, 5.0 g; 수율, 33%(알코올에 대해).
ATX-0043: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00039
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(100 ml) 중에 용해된 14 g의 4-브로모 부티르산(1 당량)의 용액에 21 g의 EDC.HCl(1.3 당량), 15.2 ml의 Et3N(1.3 당량), 및 1 g의 DMAP(0.1 당량)를 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 8.3 g의 (Z)-논-2-엔-1-올(0.7 당량)을 50 ml의 DCM 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 16시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(50 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 50 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(100 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 50 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 5% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 생성량, 11.0 g; 수율, 64%.
ATX-0043: 단계 8
Figure 112021100425379-pat00040
250 ml 둥근바닥 플라스크에, DMF 중 2 g의 운데칸-6-일 4-아미노부타노에이트(1 당량) 및 2.2 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트(1 당량), 1.2 g의 탄산칼륨(1.2 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소 분위기 하에서 90℃에서 4시간 동안 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 빙수를 반응물에 첨가하고, 이어서 EtOAc로 추출하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 15% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(100 내지 200 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 출발 아민 및 브로모 화합물을 회수하였다. 생성량, 1.45 g; 수율, 40%.
ATX-0043: 단계 9
Figure 112021100425379-pat00041
건성 DCM 중에 용해된 1.45 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-((4-옥소-4-(운데칸-6-일옥시)부틸)아미노)부타노에이트(1 당량)의 용액에 1.29 ml의 트라이에틸아민(3 당량) 및 360 mg의 트라이포스겐(0.4 당량)을 질소 분위기 하에서 0℃에서 5분 간격으로 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 250 ml 2구 둥근바닥 플라스크 내의 건성 THF(20 ml) 중에 용해된 360 mg의 수소화나트륨(5.5 당량)에, THF(30 ml) 중 2.1 g의 2-(다이메틸아미노)에탄-1-티올 하이드로클로라이드(5.5 당량)를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 5분 동안 교반을 유지하였다. 이 생성된 용액에, THF(50 mL) 중에 용해된 상기 카르보닐 클로라이드를 첨가 깔때기를 사용하여 약 15분 동안 서서히 첨가하고, 이 생성된 용액에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
반응물을 포화 NH4Cl 용액(20 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(20 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 20 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 생성된 조 물질에 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 반응의 진행을 TLC(60% EtOAc/Hex; Rf: 0.5; PMA 탄화(charring))에 의해 모니터링하였다.
실리카 겔(100 내지 200 메시; 18% EtOAc/헥산) 크로마토그래피를 사용하여 정제를 행하였다. 생성량, 500 mg; 수율, 26%; 1H NMR에 의해 확인됨; HPLC; 및 질량 분석(Mass).
ATX-0043 / RL-43A: 1 H-NMR (PPM, 400 ㎒, CDCl3): δ = 5.63 (m, 1), 5.54 (m, 1), 4.87 (m, 1), 4.63 (d, J = 7.0, 2), 3.37 (brs, 4), 3.03 (t, J = 7.0, 2), 2.27 (s, 6), 2.22-2.32 (4), 2.09 (m, 2), 1.80-1.90 (4), 1.45-1.55 (4), 1.20-1.40 (22), 0.83-0.92 (9).
실시예 3: ATX-0057의 합성
도 2는 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0057의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0057: 단계 1: N-메톡시-N-메틸옥탄아미드
Figure 112021100425379-pat00042
2 리터 2구 둥근바닥 플라스크 내에, DCM(300 ml) 중에 용해된 옥탄산(1 당량)을 넣고, 이어서 질소 분위기 하에서 교반하면서, 0℃에서 1.5 당량의 염화옥살릴을 서서히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 별도의 2 리터 2구 둥근바닥 플라스크에서, DCM(200 ml) 중 2 당량의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드에, 3 당량의 트라이메틸아민을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 DCM(150 ml) 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 질소 분위기 하에서 20분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(250 ml)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(3 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 85 g; 수율, 65%.
ATX-0057: 단계 2: 헥사데칸-8-온
Figure 112021100425379-pat00043
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 1 리터 2구 둥근바닥 플라스크 내에 넣어진, THF(100 ml) 중 옥틸 마그네슘 브로마이드의 용액에, (200 ml의 THF 중에 용해된) N-메톡시-N-메틸옥탄아미드 용액을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(250 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(350 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 65 g; 수율, 63%.
ATX-0057: 단계 3: 헥사데칸-8-올
Figure 112021100425379-pat00044
MeOH/THF 중에 용해된 헥사데칸-8-온(1 당량)의 용액에, 1 당량의 붕수소화나트륨을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 켄칭하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 조 물질을 EtOAc(150 ml)와 물(100 ml) 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 60 g; 수율, 91%.
ATX-0057: 단계 4: 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노)부탄산
Figure 112021100425379-pat00045
THF 중에 용해된 4-아미노부탄산의 용액에, 15분의 기간에 걸쳐, 순차적으로 첨가 깔때기를 사용하여, 1 N NaOH 수용액을 0℃에서 첨가한 후, Boc 무수물을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 5% HCl(250 ml)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(300 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 150 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다. 생성량, 80 g; 수율, 81%.
ATX-0057: 단계 5: 헥사데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트
Figure 112021100425379-pat00046
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(200 ml) 중에 용해된 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노) 부탄산의 용액에 EDC.HCl, Et3N, 및 4-다이메틸아미노피리딘(DMAP)을 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 1 당량의 헥사데칸-8-올 알코올을 DCM(150 ml) 중에 용해시켜 첨가 깔때기를 사용하여 동일한 온도에서 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(150 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(150 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(200 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 80 g(조 물질; 원하는 화합물 및 알코올).
ATX-0057: 단계 6: 헥사데칸-8-일 4-아미노부타노에이트
Figure 112021100425379-pat00047
DCM 중에 용해된 헥사데칸-8-일-4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트의 용액에, 0℃에서 TFA를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(300 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 200 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 ml의 트라이에틸아민)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 알코올을 회수하였다. 생성량, 40 g; 수율, 2개의 단계에 대해 59%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0057: 단계 7: (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트
Figure 112021100425379-pat00048
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(400 ml) 중에 용해된 4-브로모 부티르산의 용액에 EDC.HCl, Et3N, 및 DMAP를 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, (Z)-논-2-엔-1-올을 100 ml의 DCM 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(300 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 150 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(200 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(150 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 5% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 알코올을 회수하였다. 생성량, 27 g; 수율, 51%.
ATX-0057: 단계 8: 헥사데칸-8-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸)아미노)부타노에이트
Figure 112021100425379-pat00049
아세토니트릴(ACN) 중 헥사데칸-8-일 4-아미노부타노에이트, (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트의 용액에, 탄산칼륨을 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소 분위기 하에서 90℃에서 4시간 동안 환류시켰다. 반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 여과하고, ACN(20 ml)으로 세척하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 15% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(100 내지 200 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 출발 물질인 아민 및 브로모 화합물을 회수하였다. 생성량, 20 g; 수율, 40%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0057: 단계 9
Figure 112021100425379-pat00050
건성 DCM 중에 용해된 헥사데칸-8-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸) 아미노) 부타노에이트의 용액에, 트라이메틸아민 및 트라이포스겐을 질소 분위기 하에서 0℃에서 5분 간격으로 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 100 ml 2구 둥근바닥 플라스크 내의 건성 THF(50 ml) 중에 용해된 수소화나트륨에, 2-(다이메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 5분 동안 교반을 유지하였다. 이 생성된 용액에, THF(80 ml) 중에 용해된 상기 카르바모일 클로라이드를 주사기를 통해 약 10분 동안 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 6시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(60% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(150 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 40 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 생성된 조 물질에 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.
실리카 겔(60 내지 120 메시)을 사용하여 첫 번째 정제를 행하였다. 22 g의 조 화합물을 60 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고, 컬럼 내에 넣어진 500 g의 실리카 겔에 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. HPLC 등급 용매와 함께 중성 알루미나를 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 조 화합물(7.5 g)을 18 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고, 생성물을 컬럼 내에 넣어진 130 g의 중성 알루미나에 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. 수율, 29%; 1H NMR, HPLC 및 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0057 / RL-43C: 1 H-NMR (PPM, 400 ㎒, CDCl3): δ = 5.63 (m, 1), 5.51 (m, 1), 4.68 (m, 1), 4.83 (d, J = 7.0, 2), 3.19 (brs, 4), 3.22 (m, 2), 2.52 (m, 2), 2.23-2.37 (4), 2.18 (s, 6), 2.08 (m, 2), 1.84-1.93 (4), 1.46-1.54 (4), 1.20-1.40 (30), 0.83-0.91 (9).
실시예 4: ATX-0058의 합성
도 3은 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0058의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0058: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00051
N2 분위기 하에서 500 ml 2구 둥근바닥 플라스크 내에, 200 ml의 DCM 중에 용해된 30 g의 8-브로모옥탄산(1 당량)을 넣고, 이어서 질소 분위기 하에서 교반하면서, 0℃에서 26.7 ml의 염화옥살릴(1.5 당량)에 서서히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
별도의 1 리터 2구 둥근바닥 플라스크에서, 300 ml의 DCM 중 40.5 g의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드(2 당량)에, 87 ml의 트라이메틸아민(3 당량)을 첨가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 500 ml의 DCM 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 15분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(300 ml)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 28 g;
ATX-0058: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00052
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, THF(100 ml) 중 28 g의 헥실 마그네슘 브로마이드(1 당량)의 용액에, 200 ml의 THF 중 36.8 g의 N-메톡시-N-메틸옥타탄아미드(1.3 당량)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(100 ml)으로 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 2% 에틸 아세테이트/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 24 g; 수율, 77%.
ATX-0058: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00053
MeOH/THF 중에 용해된 24 g의 테트라데칸-7-온(1 당량)의 용액에, 4.27 g의 붕수소화나트륨(1 당량)을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(50 ml)으로 켄칭하였다. 메탄올을 감압 하에서 감소시켰다. 생성된 조 물질을 EtOAc(200 ml)와 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 80 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 21.5 g; 수율, 89%.
ATX-0058: 단계 4
*
Figure 112021100425379-pat00054
140 ml의 THF 중에 용해된 20 g의 4-아미노부탄산의 용액에, 196 ml의 1 N NaOH 수용액을 0℃에서 첨가한 후, 36.8 g의 Boc 무수물을 깔때기를 사용하여 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 5% HCl(100 ml)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(200 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다. 생성량, 30 g; 수율, 76%.
ATX-0058: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00055
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(150 ml) 중에 용해된 10 g의 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부탄산(1 당량)의 용액에, 12.2 g의 EDC.HCl(1.3 당량), 20.4 ml의 Et3N(3 당량), 및 488 mg의 DMAP(0.1 당량)를 10분 간격으로 순차적으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 알코올을 DCM 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(100 ml)로 켄칭하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 50 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액으로 세척하고, EtOAc(100 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 12.7 g(조 물질).
ATX-0058: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00056
100 ml의 DCM 중에 용해된 12.5 g의 테트라데칸-7-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트(1 당량)의 용액에, 0℃에서 23.9 ml의 TFA(10 당량)를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(100 ml)으로 세척하고, EtOAc(100 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 알코올을 회수하였다. 생성량, 2개의 단계에 대해 7 g; 수율, 47%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0058: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00057
0℃로 냉각된, DCM(150 ml) 중에 용해된 20 g의 4-브로모 부티르산(1 당량)의 용액에, 1.5 당량의 EDC.HCl, 3 당량의 Et3N, 및 0.1 당량의 DMAP를 10분 간격으로 순차적으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 0.7 당량의 (Z)-논-2-엔-1-올을 100 ml의 DCM 중에 용해시켜, 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(100 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액으로 세척하고, EtOAc(150 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 5% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 17 g; 수율, 69%; 1H NMR에 의해 확인됨.
ATX-0058: 단계 8
Figure 112021100425379-pat00058
ACN(125 ml) 중 6 g의 테트라데칸-7-일 4-아미노부타노에이트(1 당량), 5.8 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트(1 당량)의 용액에, 2.7 g의 탄산칼륨(1.2 당량)을 첨가하고, 생성물을 질소 분위기 하에서 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 여과하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (100 내지 200 메시 실리카 겔; 15% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 4.5 g; 수율, 44%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0058: 단계 9
Figure 112021100425379-pat00059
30 ml의 건성 DCM 중에 용해된 4.4 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-((4-옥소-4-(테트라데칸-7-일옥시)부틸)아미노)부타노에이트(1 당량)의 용액에, 0.83 ml의 트라이메틸아민(3 당량) 및 418 mg의 트라이포스겐(0.5 당량)을 질소 분위기 하에서 0℃에서 5분 간격으로 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다.
2구 100 ml 둥근바닥 플라스크 내의 건성 THF(25 ml) 중에 용해된 192 mg의 수소화나트륨(10 당량)에, 0℃에서 564 mg의 2-(다이메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드(5 당량)를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 5분 동안 교반을 유지하였다. 이 생성된 용액에, THF(35 ml) 중에 용해된 상기 카르바모일 클로라이드를 주사기를 통해 약 10분 동안 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(60% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl(30 ml)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(100 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 50 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 생성된 조 물질에 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.
실리카 겔(60 내지 120 메시)을 사용하여 첫 번째 정제를 행하였다. 5.0 g의 조 화합물을 9 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고, 컬럼 내에 넣어진 90 g의 실리카 겔에 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. HPLC 등급 용매와 함께 중성 알루미나를 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 1.5 g의 조 화합물을 4 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고, 생성물을 컬럼 내에 넣어진 40 g의 중성 알루미나에 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. 생성량, 1.2 g; 수율, 21%; 1H NMR에 의해 확인됨; HPLC; 질량 분석.
ATX-0058 / RL-43B: 1 H-NMR (PPM, 400 ㎒, CDCl3): δ = 5.65 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.86 (m, 1), 4.63 (d, J = 7.0, 2), 3.37 (brs, 4), 3.02 (t, J = 6.0, 2), 2.53 (t, J = 6.0, 2), 2.27-2.36 (4), 2.27 (s, 6), 2.09 (m, 2), 1.83-1.96 (4), 1.46-1.54 (4), 1.20-1.40 (26), 0.84-0.91 (9).
실시예 5: ATX-0081의 합성
도 4는 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0081의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0081: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00060
2 리터 2구 둥근바닥 플라스크 내에, DCM(200 ml) 중에 용해된 옥탄산을 넣고, 이어서 질소 분위기 하에서 교반하면서, 0℃에서 1.5 당량의 염화옥살릴을 서서히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 별도의 2 리터 2구 둥근바닥 플라스크에서, DCM(200 ml) 중 2 당량의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드에, 3 당량의 트라이메틸아민을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 DCM(150 ml) 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 질소 분위기 하에서 20분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(250 ml)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(3 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 33 g; 수율, 84%.
ATX-0081: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00061
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 1 리터 2구 둥근바닥 플라스크 내에 넣어진, THF(100 ml) 중 22 g의 헵틸 마그네슘 브로마이드(1.5 당량)의 용액에, (200 ml의 THF 중에 용해된) N-메톡시-N-메틸옥탄아미드(1 당량) 용액을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(250 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(350 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 22 g; 수율, 65%.
ATX-0081: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00062
MeOH/THF 중에 용해된 22 g의 펜타데칸-8-온(1 당량)의 용액에, 1.5 당량의 붕수소화나트륨을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 켄칭하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 조 물질을 EtOAc(150 ml)와 물(100 ml) 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 20 g; 수율, 90%.
ATX-0081: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00063
350 ml의 THF 중에 용해된 50 g의 4-아미노부탄산의 용액에, 15분의 기간에 걸쳐, 순차적으로 첨가 깔때기를 사용하여, 490 ml의 1 N NaOH 수용액을 0℃에서 첨가한 후, 140 ml의 Boc 무수물을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 5% HCl(250 ml)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(300 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 150 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다. 생성량, 80 g; 수율, 81%.
ATX-0081: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00064
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(250 ml) 중에 용해된 10 g의 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노) 부탄산의 용액에 1.3 당량의 EDC.HCl, Et3N, 및 4-다이메틸아미노피리딘(DMAP)을 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 1 당량의 펜타데칸-7-올 알코올을 DCM(150 ml) 중에 용해시켜 첨가 깔때기를 사용하여 동일한 온도에서 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(150 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(150 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(200 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 8.5 g(조 물질; 원하는 화합물 및 알코올).
ATX-0081: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00065
65 ml의 DCM 중에 용해된 8.5 g의 펜타데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트의 용액에, 0℃에서 10 당량의 TFA를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(300 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 200 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 ml의 트라이에틸아민)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 알코올을 회수하였다. 생성량, 2개의 단계에 대해 4 g; 수율, 25%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0081: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00066
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(300 ml) 중에 용해된 4-브로모 부티르산의 용액에 EDC.HCl, Et3N, 및 DMAP를 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 20 g의 (Z)-논-2-엔-1-올을 100 ml의 DCM 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(300 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 150 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(200 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(150 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 5% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 알코올을 회수하였다. 생성량, 19 g; 수율, 55%.
ATX-0081: 단계 8
Figure 112021100425379-pat00067
70 ml의 아세토니트릴(ACN) 중 4.5 g의 펜타데칸-8-일 4-아미노부타노에이트, 1 당량의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트의 용액에, 1.4 당량의 탄산칼륨을 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소 분위기 하에서 90℃에서 4시간 동안 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 여과하고, ACN(20 ml)으로 세척하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 15% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(100 내지 200 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 출발 물질인 아민 및 브로모 화합물을 회수하였다. 생성량, 2.1 g; 수율, 27%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0081: 단계 9
Figure 112021100425379-pat00068
150 ml의 건성 DCM 중에 용해된 2.1 g의 펜타데칸-8-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸) 아미노) 부타노에이트의 용액에, 3 당량의 트라이에틸아민 및 트라이포스겐을 질소 분위기 하에서 0℃에서 5분 간격으로 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 100 ml 2구 둥근바닥 플라스크 내의 건성 THF(80 ml) 중에 용해된 7 당량의 수소화나트륨에, 3.5 당량의 2-(다이메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 5분 동안 교반을 유지하였다. 이 생성된 용액에, THF(80 ml) 중에 용해된 상기 카르바모일 클로라이드를 주사기를 통해 약 10분 동안 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 0℃에서 실온에 이르기까지 하룻밤 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(60% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(150 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 40 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 생성된 조 물질에 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.
실리카 겔(60 내지 120 메시)을 사용하여 첫 번째 정제를 행하였다. 조 화합물을 60 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고, 컬럼 내에 넣어진 500 g의 실리카 겔에 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. HPLC 등급 용매와 함께 중성 알루미나를 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 조 화합물을 18 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고, 생성물을 컬럼 내에 넣어진 130 g의 중성 알루미나에 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. 생성량, 1.5 g; 수율, 45%; 1H NMR, HPLC 및 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0081 / RL-48B: 1 H-NMR (PPM, 500 ㎒, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.86 (m, 1), 4.63 (d, J = 7.0, 2), 3.31-3.44 (4), 3.02 (t, J = 7.0, 2), 2.52 (t, J = 7.0, 2), 2.26-2.36 (4), 2.27 (s, 6), 2.10 (m, 2), 1.84-1.95 (4), 1.46-1.54 (4), 1.20-1.40 (26), 0.85-0.94 (9).
실시예 6: ATX-0082의 합성
도 5는 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0082의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0082: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00069
2 리터 2구 둥근바닥 플라스크 내에, DCM(200 ml) 중에 용해된 30 g의 옥탄산을 넣고, 이어서 질소 분위기 하에서 교반하면서, 0℃에서 1.5 당량의 염화옥살릴을 서서히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 별도의 2 리터 2구 둥근바닥 플라스크에서, DCM(200 ml) 중 2 당량의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드에, 3 당량의 트라이메틸아민을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 DCM(150 ml) 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 질소 분위기 하에서 20분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(250 ml)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(3 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 33 g; 수율, 84%.
ATX-0082: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00070
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 1 리터 2구 둥근바닥 플라스크 내에 넣어진, THF(100 ml) 중 헵틸 마그네슘 브로마이드(1.5 당량)의 용액에, (200 ml의 THF 중에 용해된) 28 g의 N-메톡시-N-메틸옥탄아미드(1 당량) 용액을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(250 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(350 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 22 g; 수율, 65%.
ATX-0082: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00071
MeOH/THF 중에 용해된 22 g의 펜타데칸-8-온(1 당량)의 용액에, 1.5 당량의 붕수소화나트륨을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 켄칭하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 조 물질을 EtOAc(150 ml)와 물(100 ml) 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 20 g; 수율, 90%.
ATX-0082: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00072
120 ml의 THF 중에 용해된 15 g의 4-아미노부탄산의 용액에, 15분의 기간에 걸쳐, 순차적으로 첨가 깔때기를 사용하여, 185 ml의 1 N NaOH 수용액을 0℃에서 첨가한 후, 50 ml의 Boc 무수물을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 5% HCl(250 ml)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(300 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 150 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다. 생성량, 27 g; 수율, 85%.
ATX-0082: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00073
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(250 ml) 중에 용해된 10 g의 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노) 부탄산의 용액에 1.3 당량의 EDC.HCl, Et3N, 및 4-다이메틸아미노피리딘(DMAP)을 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 1 당량의 펜타데칸-7-올 알코올을 DCM(150 ml) 중에 용해시켜 첨가 깔때기를 사용하여 동일한 온도에서 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(150 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(150 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(200 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 8 g(조 물질; 원하는 화합물 및 알코올).
ATX-0082: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00074
60 ml의 DCM 중에 용해된 8.0 g의 펜타데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트의 용액에, 0℃에서 10 당량의 TFA를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(300 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 200 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 ml의 트라이에틸아민)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 알코올을 회수하였다. 생성량, 4 g; 수율, 2개의 단계에 대해 25%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0082: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00075
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(400 ml) 중에 용해된 4-브로모 부티르산의 용액에 1.5 당량의 EDC.HCl, 3 당량의 Et3N, 및 DMAP를 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 20 g의 (Z)-논-2-엔-1-올을 100 ml의 DCM 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(300 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 150 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(200 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(150 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 5% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 알코올을 회수하였다. 생성량, 18 g; 수율, 55%.
ATX-0082: 단계 8
Figure 112021100425379-pat00076
90 ml의 ACN 중 4.0 g의 펜타데칸-8-일 4-아미노부타노에이트, 1 당량의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트의 용액에, 1.4 당량의 탄산칼륨을 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소 분위기 하에서 90℃에서 4시간 동안 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 여과하고, ACN(20 ml)으로 세척하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 15% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(100 내지 200 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 출발 물질(아민 및 브로모 화합물)을 회수하였다. 생성량, 2.2 g; 수율, 30%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0082: 단계 9
Figure 112021100425379-pat00077
25 ml의 건성 DCM 중에 용해된 2.2 g의 펜타데칸-8-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸) 아미노) 부타노에이트의 용액에, 3 당량의 트라이에틸아민 및 트라이포스겐을 질소 분위기 하에서 0℃에서 5분 간격으로 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 100 ml 2구 둥근바닥 플라스크 내의 건성 THF(100 ml) 중에 용해된 7 당량의 수소화나트륨에, 3.5 당량의 2-(다이메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 5분 동안 교반을 유지하였다. 이 생성된 용액에, THF(100 ml) 중에 용해된 상기 카르바모일 클로라이드를 주사기를 통해 약 10분 동안 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 0℃에서 실온에 이르기까지 하룻밤 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(60% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(150 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 40 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 생성된 조 물질에 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.
실리카 겔(60 내지 120 메시)을 사용하여 첫 번째 정제를 행하였다. 조 화합물을 60 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고, 컬럼 내에 넣어진 500 g의 실리카 겔에 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. HPLC 등급 용매와 함께 중성 알루미나를 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 조 화합물을 18 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고, 생성물을 컬럼 내에 넣어진 130 g의 중성 알루미나에 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. 생성량, 1.2 g; 수율, 43%; 1H NMR, HPLC 및 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0082 / RL-47A: 1 H-NMR (PPM, 500 ㎒, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.87 (m, 1), 4.62 (d, J = 7.0, 2), 3.61 (t, J = 7.0, 2), 3.28-3.37 (2), 3.02 (t, J = 7.0, 2), 2.61 (m, 2), 2.52 (t, J = 7.0, 2), 2.31 (m, 2), 2.27 (s, 6), 2.10 (m, 2), 1.62-1.70 (6), 1.21-1.40 (32), 0.85-0.91 (9).
실시예 7: ATX-0086의 합성
도 6은 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0086의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0086: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00078
2 리터 2구 둥근바닥 플라스크 내에, DCM(200 ml) 중에 용해된 30 g의 옥탄산을 넣고, 이어서 질소 분위기 하에서 교반하면서, 0℃에서 1.5 당량의 염화옥살릴을 서서히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 별도의 2 리터 2구 둥근바닥 플라스크에서, DCM(200 ml) 중 2 당량의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드에, 3 당량의 트라이메틸아민을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 DCM(150 ml) 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 질소 분위기 하에서 20분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(250 ml)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(3 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 38 g; 수율, 84%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0086: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00079
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 1 리터 2구 둥근바닥 플라스크 내에 넣어진, THF(100 ml) 중 헥실 마그네슘 브로마이드(1.5 당량)의 용액에, (200 ml의 THF 중에 용해된) 38 g의 N-메톡시-N-메틸옥탄아미드(1 당량) 용액을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(250 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(350 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 44 g; 수율, 65%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0086: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00080
MeOH/THF 중에 용해된 44 g의 트라이데칸-7-온(1 당량)의 용액에, 1.5 당량의 붕수소화나트륨을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 켄칭하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 조 물질을 EtOAc(150 ml)와 물(100 ml) 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 40 g; 수율, 90%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0086: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00081
350 ml의 THF 중에 용해된 50 g의 4-아미노부탄산의 용액에, 15분의 기간에 걸쳐, 순차적으로 첨가 깔때기를 사용하여, 490 ml의 1 N NaOH 수용액을 0℃에서 첨가한 후, 140 ml의 Boc 무수물을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 5% HCl(250 ml)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(300 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 150 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다. 생성량, 80 g; 수율, 81%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0086: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00082
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(250 ml) 중에 용해된 10 g의 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노) 부탄산의 용액에 1.3 당량의 EDC.HCl, Et3N, 및 4-다이메틸아미노피리딘(DMAP)을 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 1 당량의 펜타데칸-7-올 알코올을 DCM(150 ml) 중에 용해시켜 첨가 깔때기를 사용하여 동일한 온도에서 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(150 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(150 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(200 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 8 g(조 물질; 원하는 화합물 및 알코올).
ATX-0086: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00083
60 ml의 DCM 중에 용해된 8.0 g의 펜타데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트의 용액에, 0℃에서 10 당량의 TFA를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(300 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 200 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 mL의 트라이에틸아민)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 알코올을 회수하였다. 생성량, 3.5 g; 수율, 2개의 단계에 대해 52%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0086: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00084
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(400 ml) 중에 용해된 4-브로모 부티르산의 용액에 1.5 당량의 EDC.HCl, 2 당량의 Et3N, 및 DMAP를 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 20 g의 (Z)-논-2-엔-1-올을 100 ml의 DCM 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(300 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 150 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(200 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(150 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 5% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 알코올을 회수하였다. 생성량, 18 g; 수율, 55%.
ATX-0086: 단계 8
Figure 112021100425379-pat00085
90 ml의 ACN 중 4.0 g의 트라이데칸-7-일 4-아미노부타노에이트, 1 당량의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트의 용액에, 1.4 당량의 탄산칼륨을 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소 분위기 하에서 90℃에서 4시간 동안 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 여과하고, ACN(20 ml)으로 세척하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 15% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(100 내지 200 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 출발 물질인 아민 및 브로모 화합물을 회수하였다. 생성량, 2.2 g; 수율, 30%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0086: 단계 9
Figure 112021100425379-pat00086
25 ml의 건성 DCM 중에 용해된 2.2 g의 트라이데칸-7-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸) 아미노) 부타노에이트의 용액에, 3 당량의 트라이에틸아민 및 트라이포스겐을 질소 분위기 하에서 0℃에서 5분 간격으로 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 100 ml 2구 둥근바닥 플라스크 내의 건성 THF(100 ml) 중에 용해된 7 당량의 수소화나트륨에, 3.5 당량의 2-(다이메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 5분 동안 교반을 유지하였다. 이 생성된 용액에, THF(100 ml) 중에 용해된 상기 카르바모일 클로라이드를 주사기를 통해 약 10분 동안 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 0℃에서 실온에 이르기까지 하룻밤 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(60% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(150 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 40 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 생성된 조 물질에 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.
실리카 겔(60 내지 120 메시)을 사용하여 첫 번째 정제를 행하였다. 조 화합물을 60 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고, 컬럼 내에 넣어진 500 g의 실리카 겔에 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. HPLC 등급 용매와 함께 중성 알루미나를 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 조 화합물을 18 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고, 생성물을 컬럼 내에 넣어진 130 g의 중성 알루미나에 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. 생성량, 1.2 g; 수율, 43%; 1H NMR, HPLC 및 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0086 / RL-48A: 1 H-NMR (PPM, 500 ㎒, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.51 (m, 10, 4.87 (m, 1), 4.63 (d, J = 7.0, 2), 3.30-3.44 (4), 3.02 (t, J = 7.0, 2), 2.52 (t, J = 7.0, 2), 2.26-2.36 (4), 2.27 (s, 6), 2.09 (m, 2), 1.82-1.96 (4), 1.46-1.54 (4), 1.21-1.40 (24), 0.84-0.91 (9).
실시예 8: ATX-0087의 합성
도 7은 9개의 단계를 포함하는 ATX-0087의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0087: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00087
2 리터 2구 둥근바닥 플라스크 내에, DCM(200 ml) 중에 용해된 20 g의 옥탄산을 넣고, 이어서 질소 분위기 하에서 교반하면서, 0℃에서 1.5 당량의 염화옥살릴을 서서히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 별도의 2 리터 2구 둥근바닥 플라스크에서, DCM(200 ml) 중 2 당량의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드에, 3 당량의 트라이메틸아민을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 DCM(150 ml) 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 질소 분위기 하에서 20분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(250 ml)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(3 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 20 g; 수율, 84%.
ATX-0087: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00088
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 1 리터 2구 둥근바닥 플라스크 내에 넣어진, THF(100 ml) 중 헥실 마그네슘 브로마이드(1.5 당량)의 용액에, (200 ml의 THF 중에 용해된) 20 g의 N-메톡시-N-메틸옥탄아미드(1 당량) 용액을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(250 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(350 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 25 g; 수율, 65%.
ATX-0087: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00089
MeOH/THF 중에 용해된 25 g의 트라이데칸-7-온(1 당량)의 용액에, 1.5 당량의 붕수소화나트륨을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 켄칭하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 조 물질을 EtOAc(150 ml)와 물(100 ml) 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 22 g; 수율, 90%.
ATX-0087: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00090
350 ml의 THF 중에 용해된 50 g의 4-아미노부탄산의 용액에, 15분의 기간에 걸쳐, 순차적으로 첨가 깔때기를 사용하여, 490 ml의 1 N NaOH 수용액을 0℃에서 첨가한 후, 140 ml의 Boc 무수물을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 5% HCl(250 ml)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(300 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 150 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다. 생성량, 80 g; 수율, 81%.
ATX-0087: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00091
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(250 ml) 중에 용해된 17 g의 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노) 부탄산의 용액에 1.3 당량의 EDC.HCl, Et3N, 및 4-다이메틸아미노피리딘(DMAP)을 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 1 당량의 트라이데칸-7-올을 DCM(150 ml) 중에 용해시켜 첨가 깔때기를 사용하여 동일한 온도에서 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(150 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(150 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(200 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 15 g(조 물질; 원하는 화합물 및 알코올).
ATX-0087: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00092
80 ml의 DCM 중에 용해된 15.0 g의 펜타데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트의 용액에, 0℃에서 10 당량의 TFA를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(300 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 200 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 mL의 트라이에틸아민)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 알코올을 회수하였다. 생성량, 7 g; 수율, 2개의 단계에 대해 24%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0087: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00093
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(400 ml) 중에 용해된 4-브로모 부티르산의 용액에 1.5 당량의 EDC.HCl, 2 당량의 Et3N, 및 DMAP를 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 20 g의 (Z)-논-2-엔-1-올을 100 ml의 DCM 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(300 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 150 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(200 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(150 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 5% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 알코올을 회수하였다. 생성량, 19 g; 수율, 55%.
ATX-0087: 단계 8
Figure 112021100425379-pat00094
90 ml의 ACN 중 4.0 g의 트라이데칸-7-일 4-아미노부타노에이트, 1 당량의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트의 용액에, 1.4 당량의 탄산칼륨을 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소 분위기 하에서 90℃에서 4시간 동안 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 여과하고, ACN(20 ml)으로 세척하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 15% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(100 내지 200 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 출발 물질인 아민 및 브로모 화합물을 회수하였다. 생성량, 2.2 g; 수율, 30%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0087: 단계 9
Figure 112021100425379-pat00095
25 ml의 건성 DCM 중에 용해된 2.2 g의 트라이데칸-7-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸) 아미노) 부타노에이트의 용액에, 3 당량의 트라이에틸아민 및 트라이포스겐을 질소 분위기 하에서 0℃에서 5분 간격으로 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 100 ml 2구 둥근바닥 플라스크 내의 건성 THF(100 ml) 중에 용해된 7 당량의 수소화나트륨에, 3.5 당량의 2-(다이메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 5분 동안 교반을 유지하였다. 이 생성된 용액에, THF(100 ml) 중에 용해된 상기 카르바모일 클로라이드를 주사기를 통해 약 10분 동안 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 0℃에서 실온에 이르기까지 하룻밤 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(60% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(150 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 40 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 생성된 조 물질에 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.
실리카 겔(60 내지 120 메시)을 사용하여 첫 번째 정제를 행하였다. 조 화합물을 60 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고, 컬럼 내에 넣어진 500 g의 실리카 겔에 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. HPLC 등급 용매와 함께 중성 알루미나를 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 조 화합물을 18 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고, 생성물을 컬럼 내에 넣어진 130 g의 중성 알루미나에 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. 생성량, 1.2 g; 수율, 43%; 1H NMR, HPLC 및 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0087 / RL-48C: 1 H-NMR (PPM, 500 ㎒, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.87 (m, 1), 4.63 (d, J=7.0, 2), 3.30-3.44 (4), 3.02 (t, J = 7.0, 2), 2.52 (t, J = 7.0, 2), 2.26-2.36 (4), 2.27 (s, 6), 2.09 (m, 2), 1.83-1.96 (4), 1.46-1.54 (4), 1.21-1.40 (32), 0.85-0.90 (9).
실시예 9: ATX-0088의 합성
도 8은 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0088의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0088: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00096
N2 분위기 하에서 500 ml 2구 둥근바닥 플라스크 내에, 200 ml의 DCM 중에 용해된 25 g의 8-브로모옥탄산(1 당량)을 넣고, 이어서 질소 분위기 하에서 교반하면서, 0℃에서 염화옥살릴(1.5 당량)에 서서히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
별도의 1 리터 2구 둥근바닥 플라스크에서, 300 ml의 DCM 중 2 당량의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드에, 0℃에서 3 당량의 트라이메틸아민을 첨가하고 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 500 ml의 DCM 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 15분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(300 ml)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 21 g; 수율, 66%.
ATX-0088: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00097
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, THF(100 ml) 중 1.3 당량의 옥틸 마그네슘 브로마이드의 용액에, 100 ml의 THF 중 20 g의 N-메톡시-N-메틸옥타탄아미드를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(100 ml)으로 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 2% 에틸 아세테이트/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 정량 수율은 17.4 g(68%)였다.
ATX-0088: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00098
135 ml의 MeOH/THF 중에 용해된 17 g의 헥사데칸-7-온(1 당량)의 용액에, 1.5 당량의 붕수소화나트륨을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(50 ml)으로 켄칭하였다. 메탄올을 감압 하에서 감소시켰다. 생성된 조 물질을 EtOAc(200 ml)와 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 80 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 14.5 g; 수율, 85%.
ATX-0088: 단계 4
*
Figure 112021100425379-pat00099
350 ml의 THF 중에 용해된 50 g의 4-아미노부탄산의 용액에, 490 ml의 1 N NaOH 수용액을 0℃에서 첨가한 후, 140 ml의 Boc 무수물을 깔때기를 사용하여 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 5% HCl(100 ml)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(200 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다. 생성량, 80 g; 수율, 81%.
ATX-0088: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00100
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(200 ml) 중에 용해된 1 당량의 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부탄산의 용액에, 3 당량의 EDC.HCl, Et3N(3 당량), 및 DMAP(0.1 당량)를 10분 간격으로 순차적으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 알코올을 DCM 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(100 ml)로 켄칭하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 50 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액으로 세척하고, EtOAc(100 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 19 g(조 물질).
ATX-0088: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00101
140 ml의 DCM 중에 용해된 19 g의 헥사데칸-7-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트(1 당량)의 용액에, 0℃에서 10 당량의 TFA를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(100 ml)으로 세척하고, EtOAc(100 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 알코올을 회수하였다. 생성량, 9.4 g; 수율, 2개의 단계에 대해 50%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0088: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00102
0℃로 냉각된, DCM(500 ml) 중에 용해된 30 g의 4-브로모 부티르산(1 당량)의 용액에, 1.5 당량의 EDC.HCl, 3 당량의 Et3N, 및 0.1 당량의 DMAP를 10분 간격으로 순차적으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 0.7 당량의 (Z)-논-2-엔-1-올을 100 ml의 DCM 중에 용해시켜, 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(100 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액으로 세척하고, EtOAc(150 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 5% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 27 g; 수율, 51%; 1H NMR에 의해 확인됨.
ATX-0088: 단계 8
Figure 112021100425379-pat00103
ACN(70 ml) 중 6 g의 헥사데칸-8-일 4-아미노부타노에이트(1 당량), 1.5 당량의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트의 용액에, 1.2 당량의 탄산칼륨을 첨가하고, 생성물을 질소 분위기 하에서 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 여과하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (100 내지 200 메시 실리카 겔; 15% EtOAc/헥산)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 4.5 g; 수율, 44%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0088: 단계 9
Figure 112021100425379-pat00104
30 ml의 건성 DCM 중에 용해된 4.4 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-((4-옥소-4-(테트라데칸-7-일옥시)부틸)아미노)부타노에이트(1 당량)의 용액에, 0.83 ml의 트라이메틸아민(3 당량) 및 418 mg의 트라이포스겐(0.5 당량)을 질소 분위기 하에서 0℃에서 5분 간격으로 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다.
2구 100 ml 둥근바닥 플라스크 내의 건성 THF(25 ml) 중에 용해된 192 mg의 수소화나트륨(10 당량)에, 0℃에서 564 mg의 3-(디에틸아미노)프로판-1-티올(5 당량)를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 5분 동안 교반을 유지하였다. 이 생성된 용액에, THF(35 ml) 중에 용해된 상기 카르바모일 클로라이드를 주사기를 통해 약 10분 동안 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(60% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(30 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(100 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 50 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 생성된 조 물질에 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.
실리카 겔(60 내지 120 메시)을 사용하여 첫 번째 정제를 행하였다. 5.0 g의 조 화합물을 9 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고, 컬럼 내에 넣어진 90 g의 실리카 겔에 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. HPLC 등급 용매와 함께 중성 알루미나를 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 조 화합물(1.5 g)을 4 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고, 생성물을 컬럼 내에 넣어진 40 g의 중성 알루미나에 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. 생성량, 1.2 g; 수율, 21%; 1H NMR에 의해 확인됨; HPLC; 질량 분석.
ATX-0088 / RL-48D: 1 H-NMR (PPM, 500 ㎒, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.51 (m, 1), 4.87 (m, 1), 4.63 (d, J = 7.0, 2), 3.30-3.44 (4), 2.90 (t, J = 7.0, 2), 2.46-2.55 (6), 2.26-2.37 (4), 2.09 (m, 2), 1.71-1.80 (4), 1.46-1.55 (4), 1.21-1.41 (32), 1.01 (t, J = 7.0, 6), 00.85-0.91 (9).
실시예 10: ATX-0083의 합성
도 9는 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0083의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0083: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00105
500 ml 1구 둥근바닥 플라스크 내에, DCM(200 ml) 중에 용해된 50 g의 옥탄산(1 당량)을 넣고, 이어서 질소 분위기 하에서 교반하면서, 첨가 깔때기를 통해 0℃에서 44.6 ml의 염화옥살릴(1.5 당량)을 서서히 첨가하고, 이어서 1 ml의 DMF(촉매)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
별도의 2 리터 2구 둥근바닥 플라스크에서, DCM(300 ml) 중 67.4 g의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드(2 당량)에, 144 ml의 트라이에틸아민(3 당량)을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 DCM(350 ml) 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 질소 분위기 하에서 20분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(300 ml)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(3 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 10% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 생성량, 55.0 g; 수율, 84%.
ATX-0083: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00106
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 2 l 2구 둥근바닥 플라스크 내에 넣어진, 에테르 중 55 g의 헵틸 마그네슘 브로마이드(1 당량)의 용액에, 400 ml의 건성 에테르 중에 용해된 89.6 g의 N-메톡시-N-메틸옥탄아미드(1.5 당량) 용액을 첨가하고, 생성된 반응 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(250 ml)으로 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에테르(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 2% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 생성량, 50.0 g; 수율, 75%.
ATX-0083: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00107
290 ml의 MeOH/THF 중에 용해된 50 g의 펜타데칸-8-온(1 당량)의 용액에, 12.5 g의 붕수소화나트륨(1.5 당량)을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(80 ml)으로 켄칭하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 조 물질을 EtOAc(250 ml)와 물(100 ml) 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 80 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시키고, 진공 하에서 건조시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 46.0 g; 수율, 90%.
ATX-0083: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00108
THF 중에 용해된 50 g의 4-아미노부탄산(1 당량)의 용액에, 15분의 기간에 걸쳐, 순차적으로 첨가 깔때기를 사용하여, 490 ml의 1 N NaOH 수용액(1 당량)을 0℃에서 첨가한 후, 140 ml의 Boc 무수물(1.3 당량)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 5% HCl(350 ml)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(300 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 150 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다. 생성량, 77.0 g; 수율, 78%.
ATX-0083: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00109
합성을 4개의 배치(batch)로 행하였다. 각각에서는, 0℃ 미만으로 냉각된 DCM(400 ml) 중 23 g의 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노)부탄산(1 당량)의 용액에, 32.3 g의 EDC.HCl(1.5 당량), 47 ml의 Et3N(3 당량), 및 1.3 g의 DMAP(0.1 당량)를 질소 분위기 하에서 10분 간격으로 순차적으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 20 g의 펜타데칸-8-올(0.77 당량)을 DCM(200 ml) 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.4)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(250 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 이 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(150 ml)으로 세척하고, EtOAc(250 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시키고, 이어서 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 105 g(조 물질; 원하는 화합물 및 알코올).
ATX-0083: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00110
450 ml의 DCM 중에 용해된 105 g의 펜타데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트(1 당량)의 용액에, 0℃에서 194 ml의 TFA(10 당량)를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(200 ml)과 함께 10분 동안 교반하고, 이어서 EtOAc(300 ml)와 함께 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 4% MeOH/CHCl3 및 1 ml의 트라이에틸아민을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 60 내지 120 메시)를 수행하였다. 생성량, 2개의 단계에 대해 60.0 g; 수율, 54%.
ATX-0083: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00111
반응을 2개의 배치로 행하였다. 각각에서는, 0℃ 미만으로 냉각된, DCM(300 ml) 중에 용해된 20 g의 6-브로모헥산산(1 당량)의 용액에 29.3 g의 EDC.HCl(1.5 당량), 42.8 ml의 Et3N(3 당량), 및 1.2 g의 DMAP(0.1 당량)를 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 14.5 g의 (Z)-논-2-엔-1-올(1 당량)을 (100 ml의 DCM 중에 용해시켜) 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(200 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(150 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 150 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 4% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 알코올 반응물질을 회수하였다. 생성량, 36.0 g; 수율, 55%.
ATX-0083: 단계 8
Figure 112021100425379-pat00112
반응을 6개의 배치로 행하였다. 각각에서는, 120 ml의 ACN 중 10 g의 펜타데칸-8-일 4-아미노부타노에이트(Int 6, 1 당량), 10.1 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 6-브로모헥사노에이트(Int 7, 1 당량)의 용액에, 6.1 g의 무수 탄산칼륨(1.4 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소 분위기 하에서 90℃에서 4시간 동안 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 여과하고, ACN(2 × 20 ml)으로 세척하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 20 내지 80% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 100 내지 200 메시)를 수행하였다. 출발 물질을 회수하였다. 생성량, 36.9 g; 수율, 35%.
ATX-0083: 단계 9
Figure 112021100425379-pat00113
반응을 3개의 배치로 행하였다. 각각에서는, 100 ml의 건성 DCM 중에 용해된 10 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 6-((4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)아미노)헥사노에이트(1 당량)의 용액에, 7.5 ml의 트라이에틸아민(3 당량) 및 2.68 g의 트라이포스겐(0.5 당량)을 질소 분위기 하에서 0℃에서 5분 간격으로 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 500 ml 2구 둥근바닥 플라스크 내의 건성 THF(100 ml) 중 3 g의 수소화나트륨(7 당량)의 현탁액에, 8.9 g의 2-(다이메틸아미노)에탄-1-티올 하이드로클로라이드(3.5 당량)를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 5분 동안 교반을 유지하였다. 이 생성된 용액에, 건성 THF(200 ml) 중에 용해된 상기 카르바모일 클로라이드를 주사기를 통해 약 10분 동안 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 하룻밤 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(100 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(350 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 80 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
중성 알루미나를 사용하여 첫 번째 정제를 행하였다. 헥산 중에 용해된 조 화합물을 중성 알루미나(700 g이 컬럼 내에 로딩됨)의 상부에 로딩하였다. 화합물을 8 내지 10% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. 실리카 겔(100 내지 200 메시)을 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 헥산 중에 용해된 화합물을 실리카 겔(500 g이 컬럼 내에 로딩됨)의 상부에 로딩하였다. 화합물을 20 내지 25% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. (헥산 중에 용해된) 최종 화합물에 차콜 처리(200 mg/g)를 수행하고, (20분 동안 교반한 후에) 셀라이트 베드를 통해 여과하고, 이어서 시린지 및 막 필터(PTFE; 0.2 마이크로미터, 25 mm 직경)에 통과시켰다. 생성된 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 생성량, 15.5 g; 수율, 41%.
ATX-0083 / RL-47B: 1 H-NMR (PPM, 500 ㎒, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.87 (m, 1), 4.62 (d, J = 7.0, 2), 3.24-3.42 (4), 3.02 (t, J = 7.0, 2), 2.53 (t, J = 7.0, 2), 2.26-2.34 (4), 2.26 (s, 6), 2.10 (m, 2), 1.45-1.70 (6), 1.20-1.41 (34), 0.84-0.92 (9).
실시예 11: ATX-0084의 합성
도 10은 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0084의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0084: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00114
500 ml 1구 둥근바닥 플라스크 내에, DCM(200 ml) 중에 용해된 30 g의 헵탄산(1 당량)을 넣고, 이어서 질소 분위기 하에서 교반하면서, 0℃에서 26.7 g의 염화옥살릴(1.5 당량)을 서서히 첨가하고, 이어서 1 ml의 DMF(촉매)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
별도의 1 l 2구 둥근바닥 플라스크에서, DCM(250 ml) 중 40.5 g의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드(2 당량)에, 86.6 ml의 트라이메틸아민(3 당량)을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 DCM(100 ml) 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 질소 분위기 하에서 20분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(250 ml)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(3 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 10% EtOAc/헥산을 사용하는, (60 내지 120 실리카 겔)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 38.0 g; 수율, 84%.
ATX-0084: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00115
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 1 리터 2구 둥근바닥 플라스크 내에 넣어진, 250 ml의 건성 에테르 중 8 g의 헥실 마그네슘 브로마이드(1 당량)의 용액에, 250 ml의 에테르 중에 용해된 2.3 g의 N-메톡시-N-메틸헵탄아미드(0.5 당량)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(200 ml)으로 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에테르(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 2% EtOAc/헥산을 사용하는, (60 내지 120 메시 실리카 겔)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 30.8g; 수율, 71%.
ATX-0084: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00116
200 ml의 MeOH/THF 중에 용해된 30 g의 트라이데칸-7-온(1 당량)의 용액에, 8.5 g의 붕수소화나트륨(0.5 당량)을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(80 ml)으로 켄칭하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 조 물질을 EtOAc(200 ml)와 물(100 ml) 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 70 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 27.2 g; 수율, 90%.
ATX-0084: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00117
120 ml의 THF 중에 용해된 5 g의 6-아미노헥산산(1 당량)의 용액에, 15분의 기간에 걸쳐, 순차적으로 첨가 깔때기를 사용하여, 125 ml의 1 N NaOH 수용액을 0℃에서 첨가한 후, 34 ml의 Boc 무수물(1.3 당량)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 5% HCl(100 ml)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(150 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다. 생성량, 22.4 g; 수율, 85%.
ATX-0084: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00118
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(200 ml) 중에 용해된 10 g의 6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)헥산산(1 당량)의 용액에, 10.7 g의 EDC.HCl(1.3 당량), 18 ml의 Et3N(3 당량), 및 525 mg의 DMAP(0.1 당량)를 질소 분위기 하에서 10분 간격으로 순차적으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 6 g의 트라이데칸-7-올(Int 3, 0.7 당량)을 DCM(50 ml) 중에 용해시켜 첨가 깔때기를 사용하여 동일한 온도에서 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.4)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(150 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 75 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(100 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 100 ml)로 추출하고, 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 8.5 g(조 물질; 원하는 화합물 및 알코올).
ATX-0084: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00119
65 ml의 DCM 중에 용해된 10 g의 트라이데칸-7-일 6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)헥사노에이트(1 당량)의 용액에, 0℃에서 18.5 ml의 TFA(10 당량)를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(100 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(3 × 100 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 ml의 트라이에틸아민)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 알코올 출발 물질을 회수하였다. 양, 2개의 단계에 대해 4.5 g; 수율, 33%.
ATX-0084: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00120
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(300 ml) 중에 용해된 20 g의 6-브로모헥산산(1 당량)의 용액에 29.3 g의 EDC.HCl(1.5 당량), 42.8 ml의 Et3N(3 당량), 및 1.2 g의 DMAP(0.1 당량)를 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 100 ml의 DCM 중에 용해된 14.5 g의 (Z)-논-2-엔-1-올(1 당량)을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(200 ml)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 100 ml)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(150 ml)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 150 ml)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 4% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(60 내지 120 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 알코올 출발 물질을 회수하였다. 생성량, 18.0 g; 수율, 55%.
ATX-0084: 단계 8
Figure 112021100425379-pat00121
90 ml의 ACN 중 4.5 g의 트라이데칸-7-일 6-아미노헥사노에이트(Int 6, 1 당량) 및 4.5 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 6-브로모헥사노에이트(Int 7, 1 당량)의 용액에, 2.7 g의 탄산칼륨(1.4 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소 분위기 하에서 90℃에서 4시간 동안 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 여과하고, ACN(2 × 20 ml)으로 세척하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 20% EtOAc/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(100 내지 200 메시 실리카 겔)를 수행하였다. 출발 물질을 회수하였다. 생성량, 3.0 g; 수율, 37%.
ATX-0084: 단계 9
Figure 112021100425379-pat00122
30 ml의 건성 DCM 중에 용해된 2.5 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 6-((6-옥소-6-(트라이데칸-7-일옥시)헥실)아미노)헥사노에이트(1 당량)의 용액에, 1.8 ml의 트라이에틸아민(3 당량) 및 672 mg의 트라이포스겐(0.5 당량)을 질소 분위기 하에서 0℃에서 5분 간격으로 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 250 ml 2구 둥근바닥 플라스크 내의 건성 THF(50 ml) 중 761 mg의 수소화나트륨의 현탁액에, 2.2 g의 2-(다이메틸아미노)에탄-1-티올 하이드로클로라이드(3.5 당량)를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 5분 동안 교반을 유지하였다. 생성된 용액에, THF(60 ml) 중에 용해된 상기 카르바모일 클로라이드를 주사기를 통해 약 10분 동안 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 하룻밤 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(60 ml)으로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(130 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 40 ml)로 세척하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 생성된 조 물질에 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.
실리카 겔(100 내지 200 메시)을 사용하여 첫 번째 정제를 행하였다. 4.6 g의 조 화합물을 10.0 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고, 컬럼 내에 넣어진 90.0 g의 실리카 겔에 부었다. 화합물을 50% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. HPLC 등급 용매와 함께 중성 알루미나를 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 2.0 g의 조 화합물을 6.0 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고, 생성물을 컬럼 내에 넣어진 40.0 g의 중성 알루미나에 부었다. 화합물을 20% EtOAc/헥산으로 용리시켰다. 생성량, 1.2 g; 수율, 38%(300 mg의 혼합물).
ATX-0084 / RL-47C: 1H-NMR (PPM, 500 ㎒, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.86 (m, 1), 4.62 (d, J = 7.0, 2), 3.22-3.35 (4), 3.01 (t, J = 7.0, 2), 2.53 (t, J = 7.0, 2), 2.25-2.34 (4), 2.27 (s, 6), 2.10 (m, 2), 1.45-1-73 (10), 1.20-1.40 (30), 00.84-0.91 (9).
실시예 12: ATX-0061의 합성
도 11은 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0061의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0061: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00123
12 g의 글리신 에스테르(1 당량)를 THF(100 ml) 중에 용해시키고, 0℃ 미만으로 냉각시켰다. 이 용액에, 24.2 ml의 트라이에틸아민(1.5 당량) 및 38.11 g의 Boc 무수물(1.5 당량)을 첨가 깔때기를 통해 순차적으로 첨가하였다.
반응의 진행을 50% EtOAc/헥산; Rf: 0.4를 사용하는 TLC에 의해 모니터링하였다.
반응물을 물로 켄칭하고, 16시간 후에 EtOAc(100 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 40 ml)로 세척하고, 합한 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 생성물에 60 내지 120 실리카 겔(25% EtOAc/헥산)을 수행하였다. 생성량, 20.8; 수율, 88%.
ATX-0061: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00124
THF(130 ml) 중에 용해된 18.9 g의 N-Boc 글리신 에스테르(1 당량)의 용액에 5.85 g의 LiOH(1.5 당량)의 수용액을 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응을 TLC(60% EtOAc/헥산; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였으며, SM은 부재한다.
반응물을 농축시키고, 조 물질을 5% HCl(pH 3)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(4 × 80 ml)로 추출하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 화합물을 얻었다. 생성량, 15 g; 수율, 92%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0061: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00125
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(30 ml) 중에 용해된 5 g의 N-Boc-글리신 에스테르(Int 1, 1 당량)의 용액에, 4.5 ml의 Et3N(1.2 당량) 및 6.44 g의 EDC.HCl(1.2 당량)을 첨가하였다. 이 반응 용액에, 20 ml의 DCM 중 5.12 g의 헵타덴-9-올(0.7 당량)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다.
TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.6)에 의해 출발 물질이 부재한 것으로 관찰되었다. 반응물을 포화 NaHCO3 용액으로 희석시키고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(2 × 30 ml)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다(6.8 ㎏; 생성물 및 알코올의 혼합물).
ATX-0061: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00126
4 g의 헵타데칸-9-일 (tert-부톡시카르보닐)글리시네이트(Int 2, 1 당량)를 DCM(40 ml) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, 7.4 ml의 TFA(10 당량)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
2시간만에 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 반응의 완료가 확인되었다.
반응물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 포화 중탄산나트륨 용액(30 ml)으로 세척하고, EtOAc(3 × 30 ml)로 추출하고, 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 Int 3을 얻었다.
조 생성물에 1 내지 3% MeOH/CHCl3 및 2 mL의 Et3N을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(실리카, 60 내지 120)를 수행하였다. 생성량, 1 g; 1H-NMR 및 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0061: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00127
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(35 ml) 중에 용해된 4 g의 브로모 아세트산(1 당량)의 용액에 4.7 ml의 Et3N(1.2 당량) 및 354 mg의 DMAP(0.1 당량)를 첨가한 후, 13.23 g의 HATU(1.2 당량)를 첨가하였다. 이 반응 용액에, 20 ml의 DCM 중 2.88 g의 (Z)-논-2-엔-1-올(0.7 당량)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다.
반응을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 포화 NaHCO3 용액(80 ml)으로 희석시키고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(40 ml)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔(60 내지 120) 컬럼 크로마토그래피(1.5% EtOAc/헥산)로 정제하였다. 생성량, 4 g; 수율, 52%.
ATX-0061: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00128
1 g의 헵타데칸-9-일 글리시네이트(Int 3, 1 당량)를 THF(25 ml) 중에 용해시키고, 0.5 ml의 TEA(1.3 당량) 및 1.08 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 2-브로모아세테이트 유도체(Int 4, 1.3 당량)를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.4)에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 물(30 ml)로 희석시키고, EtOAc(20 ml × 2)로 추출하고, 합한 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
잔류물을 컬럼(실리카 겔; 100 내지 200) 크로마토그래피(2% EtOAc/헥산)로 정제하였다. 생성량, 700 mg; 수율, 47%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0061: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00129
5℃ 미만으로 냉각된, 15 ml의 DCM 중에 용해된 700 mg의 헵타데칸-9-일 (Z)-(2-(논-2-엔-1-일옥시)-2-옥소에틸)글리시네이트)(1 당량)의 용액에, 10분 동안 0.4 ml의 Et3N(3 당량)에 이어서, 209 mg의 트라이포스겐(0.5 당량)을 일부씩 첨가하였다.
반응 혼합물의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였으며, 반응은 0.5시간에 완료되었고, 반응물을 감압 하에서 농축시켰다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 건성 THF(10 ml) 및 DMF(3 ml) 중 423 mg의 N, N-다이메틸 에탄티올 하이드로클로라이드(3 당량)의 용액에 144 mg의 수소화나트륨(6 당량)을 첨가하였다. 10분 후에, 이 반응물에, THF(15 ml) 중에 용해시켜, 상기 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
1시간 후에 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5)에 의해 반응의 완료가 관찰되었다.
반응물을 포화 NH4Cl 용액(20 ml), 물(20 ml)로 켄칭하고, EtOAc(30 ml)를 첨가하였다. 수성 층을 EtOAc(2 × 20 ml)로 세척하고, 합한 유기 층을 염수 용액(20 ml)으로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 물질에 15% EtOAc/헥산과 함께 실리카 겔(100 내지 200)을 사용하고, 이어서 15% EtOAc/헥산과 함께 중성 알루미나를 사용하는, 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 순수한 화합물을 얻었다. 생성량, 520 mg; 수율, 58%; 1H NMR, HPLC 및 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0061 / RL-42D: 1 H-NMR (PPM, 400 ㎒, CDCl3): δ = 5.67 (m, 1), 5.51 (m, 1), 4.92 (m, 1), 4.70 (m, 2), 4.16-4.27 (4), 3.07 (m, 2), 2.53 (m, 2), 2.27 (s, 6), 2.10 (m, 2), 1-47-1.57 (4), 1.19-1.40 (32), 0.83-0.92 (9).
실시예 13: ATX-0063의 합성
도 12는 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0063의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0063: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00130
12 g의 글리신 에스테르(1 당량)를 THF(100 mL) 중에 용해시키고, 0℃ 미만으로 냉각시켰다. 이 용액에, 24.2 ml의 트라이에틸아민(1.5 당량) 및 38.11 g의 Boc 무수물(1.5 당량)을 첨가 깔때기를 통해 순차적으로 첨가하였다.
반응의 진행을 50% EtOAc/헥산; Rf: 0.4를 사용하는 TLC에 의해 모니터링하였다.
반응물을 물로 켄칭하고, 16시간 후에 EtOAc(100 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 40 ml)로 세척하고, 합한 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 생성물에 60 내지 120 실리카 겔(25% EtOAc/헥산)을 수행하였다. 생성량, 20.8; 수율, 88%.
ATX-0063: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00131
THF(130 ml) 중에 용해된 18.9 g의 N-Boc 글리신 에스테르(1 당량)의 용액에 5.85 g의 LiOH(1.5 당량)의 수용액을 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응을 TLC(60% EtOAc/헥산; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였으며, 출발 물질은 반응 생성물로부터 부재하였다.
반응물을 농축시키고, 조 물질을 5% HCl(pH 3)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(4 × 80 ml)로 추출하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 화합물을 얻었다. 생성량, 15 g; 수율, 92%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0063: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00132
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(50 ml) 중에 용해된 5 g의 N-Boc-글리신 에스테르(Int 1, 1 당량)의 용액에, 4.5 ml의 Et3N(1.2 당량) 및 6.4 g의 EDC.HCl(1.2 당량)을 첨가하였다. 이 반응 용액에, 20 ml의 DCM 중 3.4 g의 운데칸-6-올(0.7 당량)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다.
TLC(15% EtOAc/헥산; Rf: 0.6)에 의해 출발 물질이 부재한 것으로 관찰되었다. 반응물을 포화 NaHCO3 용액(20 ml)으로 희석시키고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(2 × 40 mL)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 컬럼 여과 후에, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다(5.5 g; 생성물 및 알코올의 혼합물).
ATX-0063: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00133
3.3 g의 조 운데칸-6-일 (tert-부톡시카르보닐)글리시네이트(Int 2, 1 당량)를 DCM(20 ml) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, 7.6 ml의 TFA(10 당량)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
2시간만에 TLC(10% MeOH/DCM; Rf: 0.5)에 의해 반응의 완료가 확인되었다. 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 포화 중탄산나트륨 용액(50 ml)으로 세척하고, EtOAc(3 × 25 ml)로 추출하고, 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 Int 3을 얻었다.
조 생성물에 1 내지 3% MeOH/CHCl3 및 2 ml의 Et3N을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(실리카, 60 내지 120)를 수행하였다. 생성량, 1.2 g; 수율, 40%; 1H-NMR 및 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0063: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00134
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(35 mL) 중에 용해된 4 g의 브로모 아세트산(1 당량)의 용액에 4.7 ml의 Et3N(1.2 당량)을 첨가한 후, 13.23 g의 HATU(1.2 당량) 및 354 mg의 DMAP(0.1 당량)를 첨가하였다. 이 반응 용액에, 20 mL의 DCM 중 2.88 g의 (Z)-논-2-엔-1-올(0.7 당량)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다.
반응을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 포화 NaHCO3 용액(80 ml)으로 희석시키고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(40 ml)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔(60 내지 120) 컬럼 크로마토그래피(1.5% EtOAc/헥산)로 정제하였다. 생성량, 4 g; 수율, 52%.
ATX-0063: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00135
1.2 g의 운데칸-6-일 글리시네이트(Int 3, 1 당량)를 25 ml의 THF 중에 용해시키고, 0.9 ml의 TEA(1.3 당량) 및 1.37 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 2-브로모아세테이트(Int 4, 1 당량)를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 물(30 ml)로 희석시키고, EtOAc(20 ml × 2)로 추출하고, 합한 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
잔류물을 컬럼(실리카 겔; 100 내지 200) 크로마토그래피(3% EtOAc/헥산)로 정제하였다. 생성량, 800 mg; 수율, 37%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0063: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00136
5℃ 미만으로 냉각된, DCM 중에 용해된 800 mg의 (Z)-논-2-엔-1-일 (2-옥소-2-(운데칸-6-일옥시)에틸)글리시네이트(1 당량)의 용액에, 10분 동안 0.4 ml의 Et3N(3 당량)에 이어서, 209 mg의 트라이포스겐(0.5 당량)을 일부씩 첨가하였다.
반응 혼합물의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였으며, 반응은 1시간에 완료되었고, 반응물을 감압 하에서 농축시켰다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 건성 THF 및 DMF(각각 10 ml 및 5 ml) 중 423 mg의 N, N-다이메틸 에탄티올 하이드로클로라이드(3 당량)의 용액에 144 mg의 수소화나트륨(6 당량)을 첨가하였다. 10분 후에, 이 반응물에, THF 중에 용해시켜, 상기 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
1시간 후에 TLC(70% EtOAc/헥산; Rf: 0.4)에 의해 반응의 완료가 관찰되었다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(25 ml), 물(20 ml)로 켄칭하고, EtOAc(20 ml)를 첨가하였다. 수성 층을 EtOAc(2 × 20 ml)로 세척하고, 합한 유기 층을 염수 용액(20 ml)으로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 물질에 20% EtOAc/헥산과 함께 실리카 겔(100 내지 200)을 사용하고, 이어서 5% EtOAc/헥산과 함께 중성 알루미나를 사용하는, 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 순수한 화합물을 얻었다. 생성량, 510 mg; 수율, 48%; 1H NMR, HPLC 및 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0063 / RL-42A: 1 H-NMR (PPM, 400 ㎒, CDCl3): δ = 5.67 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.92 (m, 1), 4.70 (m, 2), 4.15-4.27 (4), 3.06 (m, 2), 2.53 (m, 2), 2.27 (s, 6), 2.09 (m, 2), 1.47-1.57 (4), 1.20-1.41 (20), 0.82-0.92 (9).
실시예 14: ATX-0064의 합성
도 13은 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0064의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0064: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00137
12 g의 에틸 글리시네이트(1 당량)를 THF(100 ml) 중에 용해시키고, 0℃ 미만으로 냉각시켰다. 이 생성된 용액에, 24.2 ml의 트라이에틸아민(1.5 당량) 및 38.11 g의 Boc 무수물(1.5 당량)을 첨가 깔때기를 통해 순차적으로 첨가하였다.
반응의 진행을 50% EtOAc/헥산; Rf: 0.4를 사용하는 TLC에 의해 모니터링하였다.
반응물을 물로 켄칭하고, 16시간 후에 EtOAc(100 ml)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 40 ml)로 세척하고, 합한 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 생성물에 60 내지 120 실리카 겔(25% EtOAc/헥산)을 수행하였다. 생성량, 20.8; 수율, 88%.
ATX-0064: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00138
THF(130 ml) 중에 용해된 18.9 g의 N-Boc 글리신 에스테르(1 당량)의 용액에 5.85 g의 LiOH(1.5 당량)의 수용액을 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응을 TLC(60% EtOAc/헥산; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였으며, 출발 물질은 반응 생성물로부터 부재하였다.
반응물을 농축시키고, 조 물질을 5% HCl(pH 3)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(4 × 80 ml)로 추출하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 화합물을 얻었다. 생성량, 15 g; 수율, 92%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0064: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00139
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(50 mL) 중에 용해된 5 g의 N-Boc-글리신 에스테르(Int 1, 1 당량)의 용액에, 4.5 ml의 Et3N(1.2 당량) 및 6.4 g의 EDC.HCl(1.2 당량)을 첨가하였다. 이 반응 용액에, 15 ml의 DCM 중 4.84 g의 헥사데칸-10-올(0.7 당량)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다.
TLC(15% EtOAc/헥산; Rf: 0.6)에 의해 출발 물질이 부재한 것으로 관찰되었다. 반응물을 포화 NaHCO3 용액으로 희석시키고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(2 × 30 ml)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
컬럼 여과 후에, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다(5.5 g; 생성물 및 알코올의 혼합물).
ATX-0064: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00140
3.85 g의 조 헵타데칸-9-일 (tert-부톡시카르보닐)글리시네이트(Int 2, 1 당량)를 30 ml의 DCM 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, 7.4 ml의 TFA(10 당량)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
2시간만에 TLC(10% MeOH/DCM; Rf: 0.5)에 의해 반응의 완료가 확인되었다.
반응물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 포화 중탄산나트륨 용액(30 ml)으로 세척하고, EtOAc(3 × 30 ml)로 추출하고, 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 Int 3을 얻었다.
조 생성물에 1 내지 3% MeOH/CHCl3 및 2 ml의 Et3N을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(실리카, 60 내지 120)를 수행하였다. 생성량, 2.2 g; 1H-NMR 및 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0064: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00141
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(35 mL) 중에 용해된 4 g의 브로모 아세트산(1 당량)의 용액에 4.7 ml의 Et3N(1.2 당량)을 첨가한 후, 13.23 g의 HATU(1.2 당량) 및 354 mg의 DMAP(0.1 당량)를 첨가하였다. 이 반응 용액에, 20 ml의 DCM 중 2.88 g의 (Z)-논-2-엔-1-올(0.7 당량)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다.
반응을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 포화 NaHCO3 용액(80 ml)으로 희석시키고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(40 ml)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
잔류물을 실리카 겔(60 내지 120) 컬럼 크로마토그래피(1.5% EtOAc/헥산)로 정제하였다. 생성량, 4 g; 수율, 52%.
ATX-0064: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00142
2.1 g의 헥사데칸-8-일 글리시네이트(Int 3, 1 당량)를 50 ml의 THF 중에 용해시키고, 1.2 ml의 TEA(1.3 당량) 및 2.39 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 2-브로모아세테이트(Int 4, 1.3 당량)를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 물(30 ml)로 희석시키고, EtOAc(2 × 30 ml)로 추출하고, 합한 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
잔류물을 컬럼(실리카 겔; 100 내지 200) 크로마토그래피(3% EtOAc/헥산)로 정제하였다. 생성량, 2.2 g; 수율, 65%; 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0064: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00143
5℃ 미만으로 냉각된, 15 ml의 DCM 중에 용해된 2.2 g의 헵타데칸-9-일 (Z)-(2-(논-2-엔-1-일옥시)-2-옥소에틸)글리시네이트)(1 당량)의 용액에, 10분 동안 1.6 ml의 Et3N(3 당량)에 이어서, 678 mg의 트라이포스겐(0.5 당량)을 일부씩 첨가하였다.
반응 혼합물의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였으며, 반응은 1시간에 완료되었고, 반응물을 감압 하에서 농축시켰다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 건성 THF 및 DMF(각각 35 ml 및 15 ml) 중 3.94 g의 N, N-다이메틸 에탄티올 하이드로클로라이드(7 당량)의 용액에 672 mg의 수소화나트륨(7 당량)을 첨가하였다. 10분 후에, 이 반응물에, THF 중에 용해시켜, 상기 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
1시간 후에 TLC(70% EtOAc/헥산; Rf: 0.4)에 의해 반응의 완료가 관찰되었다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액(25 ml), 물(20 ml)로 켄칭하고, EtOAc(20 ml)를 첨가하였다. 수성 층을 EtOAc(20 ml × 2)로 세척하고, 합한 유기 층을 염수 용액(20 ml)으로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 물질에 25% EtOAc/헥산과 함께 실리카 겔(100 내지 200)을 사용하고, 이어서 15 내지 20% EtOAc/헥산과 함께 중성 알루미나를 사용하는, 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 순수한 화합물을 얻었다. 생성량, 1.0 mg; 수율, 40%; 1H NMR, HPLC 및 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0064 / RL-42C: 1 H-NMR (PPM, 400 ㎒, CDCl3): δ = 5.67 (m, 1), 5.50 (m, 1), 4.92 (m, 1), 4.70 (t, J = 7.0, 2), 3.06 (, m, 2), 2.53 (m, 2), 2.27 (s, 6), 1.47-1.57 (4), 1.17-1.40 (30), 0.82-0.93 (9).
실시예 15: ATX-0081의 합성
도 14는 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0081의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0081: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00144
질소 분위기 하에서 -15℃로 냉각된, 370 mL의 건성 THF 중 헵틸 마그네슘 브로마이드(1.5 당량)의 용액(계내(in situ) 생성됨)에, 80 mL의 THF 중에 용해된 에틸포르메이트(0.5 당량)를 첨가 깔때기를 통해 20분에 걸쳐 적가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 하룻밤 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 포화 NH4Cl 용액(500 mL)으로 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 100 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 20% EtOAc/Hex를 사용하는 실리카 겔(60 내지 120 메시) 상에서의 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 169.0 g; 수율, 60%.
ATX-0081: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00145
THF 중 100 g의 4-아미노부탄산(1 당량)의 용액에, 15분의 기간에 걸쳐 순차적으로 첨가 깔때기를 사용하여, 빙조에서 1 N NaOH 수용액(1.065 리터)(1.1 당량)을 첨가한 후, 1.3 당량의 Boc 무수물을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온되게 하고, 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 5% HCl(1 리터)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(300 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 200 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다.
조 화합물에 80 내지 100% EtOAc/Hex를 사용하는 실리카 겔(60 내지 120 메시) 상에서의 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 161.0 g; 수율, 82%.
ATX-0081: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00146
빙조에서 냉각된, DCM(350 mL) 중 3 × 17.8 g의 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노) 부탄산(1 당량)의 용액에, 2 × 25.1 g의 EDC.HCl(1.5 당량), Et3N(2.0 당량), 및 3 × 1.0 g의 DMAP(0.1 당량)를 질소 분위기 하에서 10분 간격으로 순차적으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, (150 mL의 DCM 중) 3 × 20.0 g의 알코올(1.0 당량)을 동일한 온도에서 첨가 깔때기를 통해 적가하고, 생성된 반응물을 실온으로 가온되게 하고, 질소 분위기 하에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(Hex 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 물(450 ml)로 켄칭하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(3 × 100 mL)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(300 mL)과 함께 5분 동안 교반하고, 수성 상을 EtOAc(3 × 150 mL)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 69.0 g(조 물질; 원하는 화합물 및 알코올).
ATX-0081: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00147
DCM 중에 용해된 69.0 g의 펜타데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노) 부타노에이트(1 당량)의 용액에, 빙조에서 TFA(10 당량)를 첨가하고, 생성된 반응 용액을 실온으로 가온되게 하고, 질소 분위기 하에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(450 mL)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(3 × 150 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 mL의 트라이에틸아민)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 알코올을 회수하였다. 생성량, 47.0 g; 수율, 2개의 단계에 대해 57%;
ATX-0081: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00148
0℃ 미만으로 냉각된, 2구 둥근바닥 플라스크 내에 넣어진 DCM(450 mL) 중 50.0 g의 4-브로모 부티르산(1.0 당량)의 용액에, 86.0 g의 EDC.HCl(1.5 당량), 83.3 mL의 Et3N(2.0 당량), 및 3.6 g의 DMAP(0.1 당량)를 질소 분위기 하에서 순차적으로 10분 간격으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 42.5 g의 알코올(1.0 당량)을 (200 mL의 DCM 중에 용해시켜) 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 생성된 용액을 실온으로 가온하고, 질소 분위기 하에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(Hex 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 물(250 ml)로 켄칭하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 150 mL)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(150 mL)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(2 × 150 mL)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 5% EtOAc/Hex를 사용하는 실리카 겔(60 내지 120 메시 실리카 겔) 상에서의 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 55.0 g; 수율, 63%.
ATX-0081: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00149
180 ml의 ACN 중 2 × 20.0 g의 펜타데칸-8-일 4-아미노부타노에이트(1 당량), 2 × 18.5 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트(1 당량)의 용액에, 2 × 17.6 g의 탄산칼륨(2 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소 분위기 하에서 70℃에서 5시간 동안 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.4)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 여과하고, ACN(2 × 20 mL)으로 세척하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 30% EtOAc/Hex를 사용하는 컬럼 크로마토그래피(100 내지 200 메시 실리카 겔)를 수행하였다. SM(아민)을 회수하였다. 생성량, 24.0 g; 수율, 36%.
ATX-0081: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00150
250 mL의 건성 DCM 중에 용해된 24.0 g의 (Z)-논-2-엔-1-일 4-((4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)아미노)부타노에이트(1 당량)의 용액에, 13.5 g의 트라이포스겐(1 당량)을 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 18.4 mL의 피리딘(5 당량)을 10분의 기간에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 4시간 동안 교반하였다.
DCM을 감압 하에서 제거하고, 혼합물을 피리딘(300 mL)으로 흡수시켰다. 0℃로 냉각시킨 후에, 32.3 g의 다이메틸아미노에탄티올 하이드로클로라이드 염(5 당량)을 일부씩 첨가하고, 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 20℃에서 하룻밤 동안 교반하였다.
TLC 확인 후, 반응물을 감압 하에서 농축 건조시켰다. 이 잔류물에 250 mL의 EA 및 200 mL의 (10%)시트르산을 첨가하였다. 유기 상을 분리하고, 이어서 유기 층을 10% 시트르산(100 mL)으로 다시 1회 세척하고, 10% 염수(200 mL)로 다시 1회 세척하였다. 생성된 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 조 생성물을 얻었다.
실리카 겔(100 내지 200 메시; 500 g) 상에서 첫 번째 정제를 행하였다. 구배 용리로, 화합물을 70% EtOAc/Hex로 용리시켰다. 농축 후, 화합물(22.0 g)은 적색을 띤 색으로 나타났다. HPLC 등급 용매와 함께 중성 알루미나(400 g)를 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 화합물을 15% EtOAc/Hex로 용리시키고, 순수한 분획을 감압 하에서 농축시켜 19.0 g의 황색 액체를 얻었다.
생성물(14.0 g)을 200 mL의 EtOH(HPLC 등급)로 희석시키고, 이어서 차콜(50% W/W) 7.0 g을 용액에 첨가하고, 실온에서 하룻밤 동안 계속 교반하였다. 생성된 용액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 농축시켰다. 마지막으로, 화합물을 120 mL의 50% EtOAc/Hex 중에 용해시키고, (알루미나 및 실리카 입자를 제거하기 위해) 면 플러그를 통해 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 최종 화합물(11.5 g)은 밝은 황색으로 나타났다.
제2 배치(5.0 g)를 80 mL의 EtOH(HPLC 등급)로 희석시키고, 이어서 차콜(50% W/W) 2.5 g을 용액에 첨가하고, 실온에서 하룻밤 동안 계속 교반하였다. 생성된 용액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 농축시켰다. 마지막으로, 화합물을 60 mL의 50% EtOAc/Hex 중에 용해시키고, (알루미나 및 실리카 입자를 제거하기 위해) 면 플러그를 통해 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 최종 화합물(4.0 g)은 적색을 띤 황색으로 나타났다. 생성량, 15.5 g; 수율, 51%.
ATX-0081: 1 H-NMR (PPM, 400 ㎒, CDCl3): δ =5.62 (m, 1), 5.51 (m, 1), 4.86 (m, 1), 4.62 (d, J = 6.0 ㎐, 2), 3.37 (brs, 4), 3.01 (t, J = 7.1 ㎐, 2), 2.51 (t, J = 7.1 ㎐, 2), 2.31 (m, 4), 2.26 (s, 6), 2.07 (m, 2), 1.89 (brs, 4), 1.42-1.57 (4), 1.16-1.40 (28), 0.82-0.91 (9)
실시예 15: ATX-0085의 합성
도 15는 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0085의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0085: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00151
500 mL 1구 둥근바닥 플라스크 내에, DCM(200 mL) 중에 용해된 30.0 g의 헵탄산(1 당량)을 넣고, 이어서 질소 분위기 하에서 교반하면서, 0℃에서 26.7 mL의 염화옥살릴(1.5 당량)을 서서히 첨가하고, 이어서 1 ml의 DMF(촉매)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
별도의 1 리터 2구 둥근바닥 플라스크에서, DCM(250 mL) 중 40.5 g의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드(2 당량)에, 86.6 mL의 트라이메틸아민(3 당량)을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 DCM(100 mL) 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 질소 분위기 하에서 20분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(250 mL)로 희석시켰다.
유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(3 × 100 mL)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 10% EtOAc/Hex를 사용하는, (60 내지 120 실리카 겔)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 38.0 g; 수율, 84%.
ATX-0085: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00152
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 1 L 2구 둥근바닥 플라스크 내에 넣어진, 에테르 중 62.3 g의 헥실마그네슘 브로마이드(1.5 당량)의 용액에, 250 mL의 에테르 중에 용해된 38.0 g의 N-메톡시-N-메틸헵탄아미드(1 당량)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 포화 NH4Cl 용액(200 mL)으로 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에테르(2 × 100 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 2% EtOAc/Hex를 사용하는, (60 내지 120 메시 실리카 겔)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 30.8g; 수율, 71%.
ATX-0085: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00153
200의 MeOH/THF(10:1, v:v) 중에 용해된 30.0 g의 트라이데칸-7-온(1 당량)의 용액에, 8.5 g의 붕수소화나트륨(1.5 당량)을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 포화 NH4Cl 용액(80 mL)으로 켄칭하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 조 물질을 EtOAc(200 mL)와 물(100 mL) 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 70 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 27.2 g; 수율, 90%.
ATX-0085: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00154
THF 중에 용해된 50.0 g의 4-아미노부탄산(1 당량)의 용액에, 15분의 기간에 걸쳐, 순차적으로 첨가 깔때기를 사용하여, NaOH 수용액(490 mL)을 0℃에서 첨가한 후, 140 mL의 Boc 무수물(1.3 당량)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 5% HCl(250 mL)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(300 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 150 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 검질 액체를 얻었다. 생성량, 80.0 g; 수율, 81%. 1H NMR에 의해 확인됨. 주: Boc-산(Int 4)은 약간의 불순물(20 내지 30%)이 1H NMR에서 관찰되고 있기 때문에, 그것을 단계 5 및 단계 6 수율에 반영하였다.
ATX-0085: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00155
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(200 mL) 중에 용해된 10.0 g의 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노)부탄산(1 당량)의 용액에, 12.2 g의 EDC.HCl(1.3 당량), 20.4 mL의 Et3N(3 당량), 및 601 mg의 DMAP(0.1 당량)를 질소 분위기 하에서 10분 간격으로 순차적으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 알코올을 DCM(150 ml) 중에 용해시켜 첨가 깔때기를 사용하여 동일한 온도에서 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(Hex 중 10% EtOAc; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 물(150 mL)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 75 mL)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(100 mL)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(200 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 생성량, 8.0 g(조 물질; 원하는 화합물 및 알코올).
ATX-0085: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00156
65 mL의 DCM 중에 용해된 8.0 g의 트라이데칸-7-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트(1 당량)의 용액에, 0℃에서 15.7 mL의 TFA(10 당량)를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(CHCl3 중 10% MeOH; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(100 mL)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(3 × 100 mL)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 (60 내지 120 메시 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 mL의 트라이에틸아민)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 알코올을 회수하였다. 생성량, 3.5 g; 수율, 2개의 단계에 대해 25%. 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0085: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00157
DCM(150 mL) 중에 용해된 20.0 g의 헥산산(1 당량)에, 질소 분위기 하에서 교반하면서, 0℃에서 22.1 mL의 염화옥살릴(1.5 당량)을 서서히 첨가하고, 이어서 1 mL의 DMF(촉매)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
별도의 플라스크에서, DCM(250 mL) 중 33.5 g의 N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드(2 당량)에, 71.7 mL의 트라이메틸아민(3 당량)을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 생성된 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축시킨 후에 DCM(100 mL) 중에 용해시켜, 첨가 깔때기를 사용하여 질소 분위기 하에서 20분 동안 적가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 물(250 mL)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(2 × 100 mL)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 10% EtOAc/Hex를 사용하는, (60 내지 120 실리카 겔)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 21.0 g; 수율, 76%.
ATX-0085: 단계 8
Figure 112021100425379-pat00158
질소 분위기 하에서 0℃에서 에테르 중 33.0 g의 펜틸마그네슘 브로마이드(1.5 당량)의 용액에, 220 mL의 에테르 중에 용해된 20.0 g의 N-메톡시-N-메틸헥산아미드(1 당량)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(헥산 중 10% EtOAc; Rf: 0.6)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 포화 NH4Cl 용액(200 mL)으로 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에테르(2 × 100 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 2% EtOAc/Hex를 사용하는, (60 내지 120 메시 실리카 겔)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 15.4 g; 수율, 72%.
ATX-0085: 단계 9
Figure 112021100425379-pat00159
100 mL의 MeOH/15 mL의 THF 중에 용해된 15.0 g의 운데칸-6-온(1 당량)의 용액에, 4.9 g의 붕수소화나트륨(1.5 당량)을 0℃에서 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 포화 NH4Cl 용액(80 mL)으로 켄칭하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 조 물질을 EtOAc(200 mL)와 물(100 mL) 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 70 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 백색 고체를 얻었다. 생성량, 13.9 g; 백색 고체; 수율, 92%.
ATX-0085: 단계 10
Figure 112021100425379-pat00160
0℃ 미만으로 냉각된, DCM(300 mL) 중에 용해된 10.0 g의 5-브로모펜탄산(1 당량)의 용액에, 13.7 g의 EDC.HCl(1.3 당량), 23.0 mL의 Et3N(3 당량), 및 674 mg의 DMAP를 질소 분위기 하에서 10분 간격으로 순차적으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, 9.5 g의 알코올(1 당량)을 DCM(150 mL) 중에 용해시켜 첨가 깔때기를 사용하여 동일한 온도에서 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(Hex 중 10% EtOAc; Rf: 0.7)에 의해 모니터링하였다.
*반응물을 물(200 mL)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 100 mL)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(100 mL)으로 세척하고, 이어서 EtOAc(3 × 100 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시키고, 조 물질 상태로 다음 단계로 진행하였다. 조 화합물에 5% EtOAc/Hex를 사용하는, (60 내지 120 메시 실리카 겔)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, SM(알코올)을 회수하였다. 생성량, 11.6 g; 수율, 62%.
ATX-0085: 단계 11
Figure 112021100425379-pat00161
ACN 중 4.5 g의 트라이데칸-7-일 4-아미노부타노에이트(1 당량), 5.2 g 운데칸-6-일 5-브로모펜타노에이트(1 당량)의 용액에, 3.0 g의 탄산칼륨(1.4 당량)을 첨가하고, 생성 혼합물을 질소 분위기 하에서 90℃에서 4시간 동안 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.45)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 여과하고, ACN(2 × 20 mL)으로 세척하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 20% EtOAc/Hex를 사용하는 컬럼 크로마토그래피(100 내지 200 메시 실리카 겔)를 수행하였다. SM(아민 및 브로모 화합물)을 회수하였다. 생성량, 2.2 그램의 순수한 화합물; 수율, 25%; 및 1.1 그램의 혼합물. 질량 분석에 의해 확인됨.
ATX-0085: 단계 12
Figure 112021100425379-pat00162
건성 DCM 중에 용해된 2.2 g의 운데칸-6-일 5-((4-옥소-4-(트라이데칸-7-일옥시)부틸)아미노)펜타노에이트(1 당량)의 용액에, 1.6 mL의 트라이메틸아민(3 당량) 및 604 mg의 트라이포스겐(0.5 당량)을 질소 분위기 하에서 0℃에서 5분 간격으로 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다.
질소 분위기 하에서 0℃에서 교반된, 플라스크 내의 건성 THF(30 mL) 중 684 mg의 수소화나트륨(7 당량)의 현탁액에, 2.0 g의 2-(다이메틸아미노)에탄-1-티올 하이드로클로라이드(3.5 당량)를 첨가하고, 질소 분위기 하에서 5분 동안 교반을 유지하였다. 이 생성된 용액에, THF(50 mL) 중에 용해된 상기 카르바모일 클로라이드를 주사기를 통해 약 10분 동안 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 하룻밤 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 포화 NH4Cl(40 mL)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(100 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 40 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 생성된 조 물질에 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 실리카 겔(100 내지 200 메시)을 사용하여 첫 번째 정제를 행하였다. 5.0 g의 조 화합물을 9.0 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고, 컬럼 내에 넣어진 70 g의 실리카 겔에 부었다. 화합물을 50% EtOAc/Hex로 용리시켰다. HPLC 등급 용매와 함께 중성 알루미나를 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 2.0 g의 조 화합물을 7.0 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고, 생성물을 컬럼 내에 넣어진 40 g의 중성 알루미나에 부었다. 화합물을 25% EtOAc/Hex로 용리시켰다. 양: 1.4 g; 수율: 51%. 1H NMR에 의해 확인됨.
ATX-0085 1 H-NMR (PPM, 400 ㎒, CDCl3): δ = 4.87 (m, 2), 3.36 (brs, 4), 3.02 (t, J = 7.1 ㎐, 2), 2.52 (t, J = 7.1 ㎐, 2), 2.31 (m, 4), 2.27 (s, 6), 1.88 (brs, 2), 1.56-1.66 (4), 1.46-1.54 (8), 1.21-1.34 (30), 0.89 (m, 12).
실시예 15: ATX-0134의 합성
도 16은 하기와 같이 추가로 설명되는 ATX-0134의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-0134: 단계 1
Figure 112021100425379-pat00163
1 L 1구 둥근바닥 플라스크에서, 400 mL의 DMF 중 50.0 g의 메틸 2-브로모아세테이트(1 당량)의 교반 용액에, 질소 분위기 하에서 빙조 온도에서 90.3 g의 탄산칼륨(2 당량), 이어서 17.5 g의 벤질 아민(0.5 당량)을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온으로 가온되게 하고, 36시간 동안 계속 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(20% EtOAc/헥산; Rf: 0.4; 닌히드린 탄화)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 빙수(1 L)로 희석시키고, 이어서 EtOAc(250 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(3 × 100 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 빙수(500 mL)로 다시 세척하고, 생성된 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다.
조 화합물에 15 내지 20% EtOAc/Hex를 사용하는 실리카 겔(60 내지 120 메시) 상에서의 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 35.0 g; 수율, 85%.
ATX-0134: 단계 2
Figure 112021100425379-pat00164
10.5 g의 10% Pd/C를 EtOAc 중 35.0 g의 다이메틸 2,2'-(벤질아잔다이일)다이아세테이트가 담긴 500 mL 수소화 반응 플라스크에 첨가하고, 출발 물질이 사라질 때까지(2시간), Parr 진탕기(60 psi)를 사용하여 반응물을 수소화하였다.
반응의 진행을 TLC(5% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5; 닌히드린 탄화)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, EtOAc(2 × 60 mL)로 세척하였다. 합한 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 생성량, 30.0 g(조 물질).
ATX-0134: 단계 3
Figure 112021100425379-pat00165
THF 중 30.0 g의 다이메틸 2,2'-아잔다이일다이아세테이트(1.0 당량)의 용액에, 빙조 온도에서 순차적으로 첨가 깔때기를 사용하여, 38.7 mL의 트라이에틸아민(1.5 당량), 이어서 55.5 mL의 Boc 무수물(1.3 당량)을 첨가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 하룻밤 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(40% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 물(250 mL)로 희석시키고, 이어서 EtOAc(150 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 15% 내지 20% EtOAc/Hex를 사용하는 실리카 겔(60 내지 120 메시) 상에서의 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 35.0 g; 수율, 96%.
ATX-0134: 단계 4
Figure 112021100425379-pat00166
빙조 온도 하에서 교반된, THF 중 35.0 g의 다이메틸 2,2'-((tert-부톡시카르보닐)아잔다이일)다이아세테이트(1.0 당량)의 용액에, 16.8 g의 수산화리튬의 수용액(5.3 M, 75 mL)(3 당량)을 첨가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 분위기 하에서 실온에서 5시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.2)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 5% HCl(400 mL)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(200 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 100 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 100% EtOAc를 사용하는 실리카 겔(60 내지 120 메시) 상에서의 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 29.0 g; 수율, 93%.
ATX-0134: 단계 5
Figure 112021100425379-pat00167
1 2,2'-((tert-부톡시카르보닐)아잔다이일)다이아세트산 233.22 0.051 1.0
2 알코올 228.42 0.102 2.0
3 EDC.HCl 191.70 0.154 3.0
4 트라이에틸아민 101 0.154 3.0
5 DMAP 122.17 0.002 0.1
6 DCM 400 mL
0℃ 내지 50℃(빙조)로 냉각된, 250 mL의 DCM 중 12.0 g의 4,4'-((tert-부톡시카르보닐)아잔다이일)다이부탄산(1 당량)의 용액에, 29.5 g의 EDC.HCl(3 당량), 21.4 mL의 Et3N(3 당량), 및 628 mg의 DMAP(0.1 당량)를 질소 분위기 하에서 10분 간격으로 순차적으로 첨가하였다. 이 생성된 용액에, (150 mL의 DCM 중) 23.5 g의 알코올(2 당량)을 동일한 온도에서 첨가 깔때기를 통해 첨가하고, 생성된 반응물을 실온으로 가온되게 하고, 질소 분위기 하에서 24시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(Hex 중 10% EtOAc; Rf: 0.6; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 물(100 mL)로 켄칭하고, 이어서 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM(2 × 80 mL)으로 세척하였다. 합한 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(100 mL)과 함께 5분 동안 교반하여 미반응 산을 제거하고, 이어서 EtOAc(2 × 80 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 2 내지 3% EtOAc/Hex를 사용하는 실리카 겔(60 내지 120 메시) 상에서의 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 생성량, 15.0 g; 수율, 44%.
ATX-0134: 단계 6
Figure 112021100425379-pat00168
120 mL의 DCM 중 15.0 g의 다이(펜타데칸-8-일) 2,2'-((tert-부톡시카르보닐)아잔다이일)다이아세테이트(1 당량)의 용액에, 0℃ 내지 50℃(빙조)의 17.7 mL의 TFA(10 당량)를 첨가하고, 반응물을 실온으로 가온되게 하고, 질소 분위기 하에서 4시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC(10% ETOAc/Hex; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 조 물질을 포화 NaHCO3 용액(100 mL)과 함께 5분 동안 교반하고(그 결과 미량의 TFA를 제거하고), 수성 상을 EtOAc(3 × 100 mL)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축시켰다. 조 화합물에 실리카 겔(60 내지 120 메시) 상에서의 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 화합물을 10% EtOAc/Hex로 용리시켰다. 생성량, 10.4 g; 수율, 82%.
ATX-0134: 단계 7
Figure 112021100425379-pat00169
20 mL의 건성 DCM 중 1.5 g의 다이(펜타데칸-8-일) 2,2'-아잔다이일다이아세테이트(1 당량)의 용액에, 1.1 mL의 트라이메틸아민(3 당량) 및 401 mg의 트라이포스겐(0.5 당량)을 빙조 온도 및 질소 분위기 하에서 5분 간격으로 첨가하였다. 이어서, 생성된 용액을 실온으로 가온되게 하고, 질소 분위기 하에서 1시간 동안 교반하였다. 출발 물질의 완료(TLC에 의해 확인됨) 후에, 생성된 반응물을 감압 하에서 농축시키고, 질소 분위기 하에서 유지하였다. 10 mL의 THF 중에 용해된 1.1 g의 3-(다이에틸아미노)프로판-1-티올(3 당량)을, 질소 분위기 하에서 0℃ 내지 50℃로 냉각된, 건성 THF(10 mL) 중 129 mg의 수소화나트륨(2 당량)의 현탁액에 첨가하고, 5분 동안 교반을 계속하였다. 이 생성된 용액에, THF(30 mL) 중에 용해된 상기 카르바모일 클로라이드를 첨가 깔때기를 통해 동일한 온도에서 약 5분 동안 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고, 질소 분위기 하에서 하룻밤 교반을 계속하였다.
반응의 진행을 TLC(10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5; PMA 탄화)에 의해 모니터링하였다.
반응물을 포화 NH4Cl(30 mL)로 켄칭하고, 이어서 EtOAc(50 mL)를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(2 × 40 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 생성된 조 물질에 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 중성 알루미나(100 g)를 사용하여 첫 번째 정제를 행하였다. 구배 용리로, 화합물을 20% EtOAc/Hex로 용리시켰다. HPLC 등급 용매와 함께 실리카 겔(100 내지 200 메시; 80 g)을 사용하여 두 번째 정제를 행하였다. 화합물을 50% EtOAc/Hex로 용리시켰다. 양: 680 mg; 수율: 34%.
ATX-0134 1 H-NMR (PPM, 400 ㎒, CDCl3): δ = 4.91 (m, 2), 4.21 (s, 2), 4.16 (s, 2), 2.95 (t, J = 7.1 ㎐, 2), 2.54 (m, 6), 1.79 (m, 2), 1.46-1.52 (8), 1.17-1.36 (40), 1.03 (t, J = 7.8 ㎐, 6), 0.87 (t, J = 7.1 ㎐, 12).
실시예 15: ATX-0044 및 ATX-0091 내지 ATX-0133의 합성.
앞서의 실시예의 방법을 사용하여 ATX-0044, ATX-0085, ATX-0111, ATX-0132, ATX-0100, ATX-0117, ATX-0114, ATX-0115, ATX-0101, ATX-0106, ATX-0116, ATX-0122, ATX-0123, ATX-0124, ATX-0126, ATX-0129, 및 ATX-0133을 합성하였다.
실시예 16: pKa 값
LNP 또는 미셀 제형 내의 양이온성 지질의 pK a 를 문헌[Jayaraman, 2012, Angew. Chem. Int. Ed., 51:8529-33]의 절차에 의해 측정하였다. 지질 미셀 또는 LNP를 pH 민감성 형광 프로브인 0.06 mg/mL의 6-(p-톨루이디노)-2-나프탈렌설폰산 나트륨 염(TNS) 시약(Sigma Aldrich)의 존재 하에서 3 내지 12의 pH 범위를 갖는 범용 완충액 중 1 mM 총 지질로 희석시킨다. 음이온성 TNS 분자는 양으로 하전된 막의 표면과 회합될 때에는 형광을 나타내지만, 용액 중에 없을 때에는 형광을 나타내지 않아서, pK a 의 측정을 가능하게 한다. TNS 신호는 스펙트럼 플레이트 판독기 상에서 측정된다. TNS 신호를 pH의 함수로서 도표로 나타내고 비선형(볼츠만)을 사용하여 분석하여 pK a 를 결정한다.
검정에 사용되는 시약은 하기를 포함한다:
Figure 112021100425379-pat00170
Hepes 유리산, CAS: 7365-45-9 (VWR, 0511-1KG 또는 등가물)
Figure 112021100425379-pat00171
MES, HPLC 등급: (Sigma 105228-100G 또는 등가물)
Figure 112021100425379-pat00172
암모늄 아세테이트, HPLC 등급: (Sigma 90335-100mL 또는 등가물)
Figure 112021100425379-pat00173
염화나트륨, HPLC 등급 (VWR EM-MX0475-1 또는 등가물)
Figure 112021100425379-pat00174
TNS (Sigma-Aldrich T9792-250mg 또는 등가물)
Figure 112021100425379-pat00175
염산
Figure 112021100425379-pat00176
DMSO
Figure 112021100425379-pat00177
칼슘 및 마그네슘이 없는 DPBS (GE, SH30028.O2 또는 등가물)
Figure 112021100425379-pat00178
H2O, HPLC 등급 (OmniSolv, WX0004-1 또는 등가물)
폴리스티렌 멸균 저장병에서 범용 완충액(UB)의 스톡 용액을 제조하기 위하여, 하기 표를 사용하여 1 L를 제조한다.
Figure 112021100425379-pat00179
시약은 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과된다. UB 용액의 제조는 5 mL의 1 M HCl을 350 mL의 스톡 용액에 첨가하는 것을 포함한다.
pH 래더(ladder)를 제조하기 위하여, 20 mL의 UB 완충액이 담긴 원심분리 튜브(50 mL)를 사용한다. (약 pH 3) 및 상이한 양의 2 N NaOH. DMSO 중 1 mg/mL의 TNS의 스톡 용액. 1 mg/mL의 60 μL의 TNS를 940 μL의 물에 첨가하여 0.06 mg/mL의 작업 용액 농도에 도달한다. 플레이트당 5개의 시험 샘플, 1 mM 총 지질의 PBS 중 1 mL의 LNP 샘플, 및 1개의 참조 샘플을 분석한다. 상이한 pH 값의 샘플을 0.06 mg/mL의 25 μL의 TNS가 첨가된 웰에서 제조한다. 웰당 15 μL의 시험 샘플을 첨가한다. 마이크로플레이트를 암소에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. TNS 템플릿을 사용하여 플레이트 판독기로부터의 데이터를 포맷할 수 있다. Origin Pro 8 또는 등가의 소프트웨어에서 샘플의 비선형(볼츠만) 회귀 분석을 수행한다.
결과는 표 1에 나타나 있다. 일반적으로, 이온화가능한 헤드 기 부근의 에스테르를 통한 친유성의 증가는 계산된 pKa를 더 염기성이 되게 하면서 측정된 pKa를 낮춘다. 에스테르 사슬의 길이를 짧게 하면서 알코올에 친유성을 추가하는 것은 측정된 pKa에 큰 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 에스테르를 부타노에이트로 짧게 하는 것은 알코올의 친유성이 증가될 때 분지형 알킬 기에 영향을 주지 않는다(ATX-0057 및 ATX-0058 vs. ATX-0002 참조). 에스테르를 아세테이트로 짧게 할 때 큰 영향이 관찰되며, 예를 들어 다음과 같다: 1-분지형/1-Z-2-노네놀 에스테르의 경우 ATX-0061/ATX-0064(Δ = -0.90) 및 ATX-0063(Δ = -0.7); 및 아세테이트/비스-분지형 에스테르의 경우 ATX-0062/ATX-0065(Δ = -3.20), 이때 ΔcLogP +4.0 vs. ATX-0002.
이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 결과는, 예측된 pKa와 비교하여 측정된 pKa를 낮추고 지질 나노입자의 생물활성을 증가시키는 데 있어서의 사슬 단축과 조합된 증가된 친유성(cLogP에 의해 측정됨)의 중요성을 나타낸다.
실시예 17: 생체내 EPO mRNA 안정성
혈장 중 mRNA 수준을 측정하고, 상이한 양이온성 지질을 포함하는 나노입자를 주사한 후에 비교하였다. 암컷 Balb/c 마우스(6 내지 8주령)를, 지질 캡슐화된 마우스 혈장 에리트로포이에틴(EPO) mRNA를 주사한 후의 생체내 EPO 수준을 평가하는 데 사용하였다. 모든 제형을 5 ml/㎏의 투여 부피로 0.03 및 0.1 mg/㎏의 용량으로 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하였다. 제형 주사 후 6시간째에, 2% 아이소플루란 하에서 심장 천자를 통해 말단 혈액 수집을 수행하였다. 혈액을 0.109 M 시트르산 완충액 튜브 내에 수집하고, 10분 동안 5000 rpm으로 원심분리하여 처리하였다. 혈청을 수집하고, EPO mRNA 수준을 분석하였다. 결과가 도 17에 나타나 있다. 결과는 ATX-0057, ATX-0081, ATX-0082, ATX-0083, ATX-0084, ATX-0085, ATX-0086, 및 ATX-0087의 경우 ATX-0002에 비해 상당한 개선을 나타낸다.
실시예 18: 생체내 마우스 인자 VII 침묵 및 EPO 발현
리포좀 라이브러리의 간-유도 생체내 스크린을 사용하여, 일련의 화합물을 시험하였는데, 이들은 간세포 - 이 세포는 간실질을 포함함 - 에서의 고수준의 siRNA 매개 유전자 침묵을 촉진시킨다. 혈액-응고 인자인 인자 VII은 간으로의 기능성 siRNA 전달을 검정하기에 적합한 표적 유전자이다. 이 인자는 특히 간세포에서 생성되기 때문에, 유전자 침묵은, 망상-내피 시스템의 세포(예를 들어, 쿠퍼 세포)로의 전달과는 대조적으로, 실질로의 성공적인 전달을 나타낸다. 더욱이, 인자 VII는 혈청에서 용이하게 측정될 수 있는 분비 단백질이어서, 동물을 안락사해야 할 필요성을 없애준다. mRNA 수준에 있어서의 침묵은 단백질의 수준을 측정함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 이는 단백질의 짧은 반감기(2 내지 5 시간) 때문이다. 인자 VIII로 향하는 siRNA를 갖는 조성물을 지질과 함께 제형화하고, 비교 샘플 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비하였다. FVII siRNA 녹다운(KD) 실험을 위해 암컷 C57BL/6 마우스(6 내지 8주령)를 사용하였다.
모든 제형을 5 mg/㎏의 투여 부피로 0.03 및 0.1 mg/㎏의 용량으로 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하였다. 제형 주사 후 48시간째에, 2% 아이소플루란 하에서 심장 천자를 통해 말단 혈액 수집을 수행하였다. 혈액을 0.109 M 시트르산 완충액 튜브 내에 수집하고, 10분 동안 1200 G로 원심분리하여 처리하였다. 혈장을 수집하고, 인자 VII 단백질 수준을 발색 검정(Biophen FVII, Aniara Corporation)에 의해 분석하였다. PBS-주사된 마우스로부터의 샘플을 사용하여 표준 곡선을 작성하였고, 처리군을 미처리된 PBS 대조군과 대비함으로써 상대 인자 VII 발현을 결정하였다. 결과는 ATX-0057 및 ATX-0058이 0.03 및 0.1 mg/㎏ 둘 모두에서 ATX-002보다 실질적으로 더 효과적임을 나타내었다(도 18).
표 1은 본 명세서에 개시된 지질을 포함하는 지질 나노입자로부터 얻어지는 녹다운을 보여준다.
본 명세서에 기재된 지질을 포함하는 지질 나노입자를 사용하여 mRNA를 전달한 후의 EPO 발현을 측정하였다.
암컷 Balb/c 마우스(6 내지 8주령)를, 지질 캡슐화된 마우스 EPO mRNA를 전달한 후의 생체내 EPO 단백질 발현을 평가하는 데 사용하였다. 모든 제형을 5 mL/㎏의 투여 부피로 0.03 및 0.1 mg/㎏의 용량으로 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하였다. 제형 주사 후 6시간째에, 2% 아이소플루란 하에서 심장 천자를 통해 말단 혈액 수집을 수행하였다. 혈액을 0.109 M 시트르산 완충액 튜브 내에 수집하고, 10분 동안 5000 rpm으로 원심분리하여 처리하였다. 혈청을 수집하고, EPO ELISA 검정(R&D Systems)에 의해 EPO 단백질 수준을 분석하였다. PBS-주사된 마우스로부터의 샘플을 사용하여 표준 곡선을 작성하였고, 처리군을 미처리된 PBS 대조군과 대비함으로써 상대 인자 VII 발현을 결정하였다. 결과는 0.1 mg/ml에서 ATX-002보다 ATX-0057 나노입자에서 EPO mRNA가 실질적으로 더 높은 양으로 발현됨을 나타내었다(도 19).

Claims (25)

  1. 핵산을 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 조성물, 여기서 지질 나노입자는 ATX-0082, ATX-0085, ATX-0083, ATX-0121, ATX-0091, ATX-0102, ATX-0098, ATX-0092, ATX-0084, ATX-0095, ATX-0125, ATX-0094, ATX-0109, ATX-0110, ATX-0118, ATX-0108, ATX-0107, ATX-0093, ATX-0097, ATX-0096 ATX-0111, ATX-0132, ATX-0134, ATX-0100, ATX-0117, ATX-0114, ATX-0115, ATX-0101, ATX-0106, ATX-0116, ATX-0086, ATX-0058, ATX-0081, ATX-0122, ATX-0057, ATX-0088, ATX-0087, ATX-0124, ATX-0126, ATX-0129, 및 ATX-0123로부터 선택되는 양이온성 지질을 포함함
    Figure 112021150006784-pat00180

    Figure 112021150006784-pat00181

    Figure 112021150006784-pat00182

    Figure 112021150006784-pat00183

    Figure 112021150006784-pat00184

    Figure 112021150006784-pat00185

    Figure 112021150006784-pat00186

    Figure 112021150006784-pat00187

    Figure 112021150006784-pat00214

    Figure 112021150006784-pat00189

    Figure 112021150006784-pat00190
  2. 제 1항에 있어서, 양이온성 지질은 ATX-0095인 조성물
    Figure 112021150006784-pat00191
  3. 제 1항에 있어서, 양이온성 지질은 ATX-0126인 조성물
    Figure 112021150006784-pat00192
  4. 제 1항에 있어서, 양이온성 지질은 ATX-0088인 조성물
    Figure 112021150006784-pat00193
  5. 제 1항에 있어서, 핵산은 RNA 또는 DNA인 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, RNA은 짧은 간섭 RNA (siRNA), 안티센스 RNA, 단일가닥 RNA, 마이크로RNA, mRNA, 논코딩 RNA, 및 다가 RNA로부터 선택되는 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, RNA은 mRNA인 조성물.
  8. 제 6항에 있어서, RNA은 siRNA인 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 지질 나노입자는 콜레스테롤을 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 콜레스테롤은 지질 나노입자 내에 존재하는 총 지질의 25 mol % 내지 45 mol %을 구성하는 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 지질 나노입자는 헬퍼 지질을 추가로 포함하는 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 헬퍼 지질은 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카르디오리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 다이세틸포스페이트, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이올레일포스파티딜콜린(DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이올레일포스파티딜글리세롤(DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜글리세롤(POPG), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 다이팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE), 다이미리스토일-포스파티딜에탄올아민(DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 다이메틸-포스파티딜에탄올아민, 다이엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 스테아로일올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 리소포스파티딜콜린 및 다이리놀레오일포스파티딜콜린으로부터 선택되는 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 헬퍼 지질은 DSPC인 조성물.
  14. 제 11항에 있어서, 헬퍼 지질은 지질 나노입자 내에 존재하는 총 지질의 2 mol% 내지 30 mol%을 구성하는 조성물.
  15. 제 1항에 있어서, 지질 나노입자는 지질 접합체를 추가로 포함하는 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 지질 접합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 지질 접합체인 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, PEG-지질 접합체는 다이알킬옥시프로필에 결합된 PEG(PEG-DAA), 다이아실글리세롤에 결합된 PEG(PEG-DAG), 인지질에 결합된 PEG, 세라마이드에 접합된 PEG, 스테롤에 접합된 PEG로부터 선택되는 조성물.
  18. 제 16항에 있어서, PEG-지질 접합체의 PEG는 750 달톤 내지 5,000 달톤의 분자량을 가지는 조성물.
  19. 제 15항에 있어서, 지질 접합체는 지질 나노입자 내에 존재하는 총 지질의 0.1 mol % 내지 2 mol %을 구성하는 조성물.
  20. 제 1항에 있어서, 양이온성 지질은 지질 나노입자 내에 존재하는 총 지질의 30 mol% 내지 70 mol%을 구성하는 조성물.
  21. 포유류에의 투여를 통해 포유류의 세포 내로 핵산을 도입하기 위한 제1항의 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 투여는 정맥내, 피하, 복막내, 또는 경막내 투여인 조성물.
  23. 제 21항에 있어서, 투여는 경구, 직장내, 질내, 비강내, 폐내, 또는 경피 또는 피부 전달, 또는 눈, 귀, 피부, 또는 점막 표면으로의 투여인 조성물.
  24. 제 21항에 있어서, 세포는 간, 폐, 신장, 뇌, 혈액, 비장, 또는 뼈에 존재하는 조성물.
  25. 제 21항에 있어서, 세포는 상피 세포인 조성물.
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