ES2969232T3 - Lípido catiónico ionizable para la administración de ARN - Google Patents

Lípido catiónico ionizable para la administración de ARN Download PDF

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Priya Karmali
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Abstract

Lo que se describe es un compuesto de fórmula (I) que consiste en un compuesto en el que R1 es un alquilo de cadena ramificada que consta de 10 a 31 carbonos; R2 es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal que consta de 2 a 20 carbonos, o un alquilo de cadena ramificada que consta de 10 a 31 carbonos; L1 y L2 son iguales o diferentes, cada uno de ellos un alcano lineal de 1 a 20 carbonos o un alqueno lineal de 2 a 20 carbonos; X1 es S u O; R3 es un alquileno lineal o ramificado que consta de 1 a 6 carbonos; y R4 y R5 son iguales o diferentes, siendo cada uno un hidrógeno o un alquilo lineal o ramificado que consta de 1 a 6 carbonos; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Lípido catiónico ionizable para la administración de ARN
ANTECEDENTES
[0001]Un número de diferentes tipos de ácidos nucleicos se están desarrollado actualmente como agentes terapéuticos para el tratamiento de una serie de enfermedades. Dado que estas moléculas están siendo desarrolladas, se ha creado una necesidad de producirlas en una forma que sea estable y tenga una vida útil larga y que puedan incorporarse en un disolvente orgánico anhidro o aprótico polar anhidro para permitir las encapsulaciones de los ácidos nucleicos sin reacciones secundarias que puedan tener lugar en una solución acuosa polar o disolventes no polares.
[0002]La descripción del presente documento se refiere a composiciones nuevas de lípidos que facilitan el suministro intracelular de moléculas biológicamente activas y terapéuticas. La descripción se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden tales composiciones de lípidos y que son útiles para administrar cantidades terapéuticamente eficaces de moléculas biológicamente activas a las células de pacientes.
[0003]La administración de un compuesto terapéutico a un sujeto es importante por sus efectos terapéuticos y normalmente puede obstaculizarse por la capacidad limitada del compuesto para alcanzar células y tejidos diana. Se dan a conocer diferentes lípidos catiónicos en el documento WO2016/081029, incluyendo los compuestos ATX-B-6, ATX-B-7 y ATX-B-8. La mejora de tales compuestos para penetrar las células diana de tejidos mediante una variedad de medios de suministro es crucial. La descripción del presente documento se refiere a lípidos nuevos, en composiciones y procedimientos de preparación que facilitan el suministro intracelular dirigido de moléculas biológicamente activas.
[0004]Los ejemplos de moléculas biológicamente activas para los cuales a menudo no se alcanza el direccionamiento eficaz hacia un tejido de paciente incluyen: múltiples proteínas que incluyen proteínas de inmunoglobulina, polinucleótidos, tales como ADN genómico, ADNc o polinucleótidos antisentido de ARNm; y muchos compuestos de bajo peso molecular, tanto de origen sintético como natural, tales como las hormonas peptídicas y antibióticos.
[0005]Uno de los desafíos fundamentales a los que se enfrentan actualmente los médicos es que un conjunto de tipos diferentes de ácidos nucleicos se están desarrollando actualmente como agentes terapéuticos para el tratamiento de un conjunto de enfermedades. Estos ácidos nucleicos incluyen ARNm para la expresión de genes, ADN en terapia génica, plásmidos, pequeños ácidos nucleicos de interferencia (Anpi), ARNpi y microARN (miARN) para ser utilizados en ARN de interferencia (ARNi), moléculas antisentido, ribozimas, antagomirs y aptámeros. Debido a que todos estos ácidos nucleicos están siendo desarrollados, existe una necesidad de producir formulaciones de lípidos que sean fáciles de producir y puedan administrarse fácilmente a un tejido diana. El documento WO2016/081029 describe lípidos catiónicos ionizables para la administración de ARN que son diferentes de los compuestos de la presente solicitud en la naturaleza de los grupos R1 y L2.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0006]La presente invención se define en las reivindicaciones.
[0007]Se da a conocer un compuesto de fórmula I
en el que
R1 es un alquilo o alquenilo ramificado, no cíclico de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 carbonos; L1 es un alcano lineal de 1 a 15 carbonos;
Ri es un alquilo o alquenilo ramificado, no cíclico de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 carbonos; L2 es un alquileno lineal de 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 carbonos;
X es O o S;
R3 es un alquileno lineal de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 carbonos; y
R4 y R5 son los mismos o diferentes, siendo cada uno un alquilo lineal o ramificado, no cíclico de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 carbonos;
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0008]En una realización, R1 tiene 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16 o 17 carbonos.
[0009]En otra realización, R1 comprende dos grupos alquilo o alquenilo idénticos.
[0010]En otra realización, R1 comprende un grupo alquenilo.
[0011]En otra realización, R2 es un alquenilo.
[0012]En otra realización, R2 es un alquilo ramificado, no cíclico.
[0013]En otra realización, L2 tiene 4, 5, 6 o 7 carbonos.
[0014]Preferiblemente, el compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en compuestos de fórmulas ATX-0082, ATX- 0085, ATX-0121, ATX-0091, ATX-0102, ATX-0098, ATX-0092, ATX-0084, ATX-0095, ATX-0125, ATX-0094, ATX-0109, ATX-0110, ATX-0118, ATX-0108, ATX-0107, ATX-0093, ATX-0097 y ATX-0096
�
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[0015]Otro aspecto de lo que se describe como un compuesto de la formula I tal como se define en la reivindicación 1 , en la que
una solución 1 mM del compuesto tiene un pKa de 5,6 a 7,0 tal como se mide mediante fluorescencia de ácido 6-(ptoluidino)-2-naftalenosulfónico; y
el compuesto tiene un valor de c-LogD entre 10 y 14;
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0016]En una realización, R1 tiene 12, 13, 14, 16 o 17 carbonos.
[0017]En otra realización, R1 comprende dos grupos alquilo o alquenilo idénticos.
[0018]En otra realización, R1 comprende un grupo alquilo.
[0019]En otra realización, R2 es un alquenilo.
[0020]En otra realización, R2 es un alquilo ramificado, no cíclico.
[0021]En otra realización, L1 y L2 tienen de manera independiente 1, 2 o 3 carbonos.
[0022]En otra realización, ambos L1 y L2 tienen 3 carbonos.
[0023]En otra realización, R3 es propileno o butileno.
[0024]En otra realización, el valor c-LogD del compuesto es como mínimo 11 y su pKa medido es más básico que 6.
[0025]En otra realización, el compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en compuestos de fórmulas ATX-0111, ATX-0132, ATX-0134, ATX-0100, ATX-0117, ATX-0114, ATX-0115, ATX-0101, ATX-0106, ATX-0116, ATX-0086, ATX-0123, ATX-0122, ATX-0087, ATX-0124, ATX-0126 y ATX-0129.
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[0026]Otro aspecto de lo que se describe es un compuesto de fórmula I
en el que
Ri es un alquilo ramificado, no cíclico de 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 carbonos;
Li es un alcano lineal de 1, 2 o 3 carbonos;
R2 es un alquenilo lineal de 8, 9, 10, 11 o 12 carbonos o un alquilo ramificado, no cíclico de 12, 13, 14, 16 o 17 carbonos;
L2 es un alcano lineal de 1, 2 o 3 carbonos
X es O o S;
R3 es un alcano lineal de 2 o 3 carbonos;
R4 y R5 son los mismos o diferentes, cada uno es un alquilo lineal o ramificado, no cíclico de 1 o 2 carbonos;
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0027]En otra realización, los lípidos catiónicos descritos en el presente documento se encuentran en una composición farmacéutica. Preferiblemente la composición farmacéutica comprende una nanopartícula lipídica que comprende un ácido nucleico, preferiblemente un polinucleótido de ARN. Preferiblemente la nanopartícula lipídica aumenta la vida del ARN en la circulación. En otra realización, tras la administración de la composición farmacéutica, la nanopartícula lipídica en ella suministra el ácido nucleico a las células en el cuerpo. Preferiblemente, el ácido nucleico tiene una actividad de supresión de la expresión de un gen diana. De manera alternativa, el ácido nucleico posee una actividad de aumento de la producción de una proteína que codifica tras la expresión en las células del cuerpo.
[0028]En el presente documento también se describe un procedimiento de introducción de un ácido nucleico en una célula de un mamífero utilizando cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente. La célula puede estar en un hígado, pulmón, riñón, cerebro, sangre, bazo o hueso. Preferiblemente la composición se administra por vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intratecal. Preferiblemente, las composiciones descritas en el presente documento se utilizan en un procedimiento de tratamiento de cáncer o enfermedad inflamatoria. La enfermedad puede ser una seleccionada entre el grupo que consiste en trastorno inmune, cáncer, enfermedad renal, enfermedad fibrótica, anormalidad genética, inflamación y trastorno cardiovascular.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0029]
Figura 1 muestra la ruta sintética de ATX-0043 (Ejemplo de comparación) a partir de hexanoato(SM 1),ácido 4-aminobutanoico(SM 2),y ácido 4-bromobutírico(SM 3). Los intermedios(Ints) 1-8y las reacciones se describen en el Ejemplo 2.
Figura 2 muestra la ruta sintética de ATX-0057 (Ejemplo de comparación) a partir de octanoato(SM 1),ácido 4-aminobutanoico(SM 2),y ácido 4-bromobutírico(SM 3). LosInts 1-8y las reacciones se describen en el Ejemplo 3. Figura 3 muestra la ruta sintética de ATX-0058 (Ejemplo de comparación) a partir deSM 1, SM 2ySM3,que son los mismos que en la Figura 2. LosInts 1-7y las reacciones se describen en el Ejemplo 4.
Figura 4 muestra la ruta sintética de ATX-0081 (Ejemplo de comparación) a partir deSM 1, SM 2ySM3,que son los mismos que en la Figura 2. LosInts 1-8y las reacciones se describen en el Ejemplo 5.
Figura 5 muestra la ruta sintética de ATX-0082 a partir deSM 1, SM 2ySM3,que son los mismos que en la Figura 2. LosInts 1-7y las reacciones se describen en el Ejemplo 6.
Figura 6 muestra la ruta sintética de ATX-0086 a partir deSM 1, SM 2ySM3,que son los mismos que en la Figura 2.
Los Ints 1-8y las reacciones se describen en el Ejemplo 7.
Figura 7 muestra la ruta sintética de ATX-0087 a partir deSM 1, SM 2ySM3,que son los mismos que en la Figura 2. LosInts 1-8y las reacciones se describen en el Ejemplo 8.
Figura 8 muestra la ruta sintética de ATX-0088 (Ejemplo de comparación) a partir deSM 1, SM 2ySM3,que son los mismos que en la Figura 2. LosInts 1-8y las reacciones se describen en el Ejemplo 9.
Figura 9 muestra la ruta sintética de ATX-0083 (Ejemplo de comparación) a partir deSM 1ySM 2, SM3,que son los mismos que en la Figura 2. Los Ints 1-8 y las reacciones se describen en el Ejemplo 10.
Figura 10 muestra la ruta sintética de ATX-0084 a partir de SM 1, SM 2 y SM3, que son los mismos que en la Figura 2. Los Ints 1-8 y las reacciones se describen en el Ejemplo 11.
Figura 11 muestra la ruta sintética de ATX-0061 (Ejemplo de comparación) a partir de SM 1 y SM 2, que son los mismos que en la Figura 1. Los Ints 1-5 y las reacciones se describen en el Ejemplo 12.
Figura 12 muestra la ruta sintética de ATX-0063 (Ejemplo de comparación) a partir de SM 1 y SM 2, que son los mismos que en la Figura 1. Los Ints 1-5 y las reacciones se describen en el Ejemplo 13.
Figura 13 muestra la ruta sintética de ATX-0064 (Ejemplo de comparación) a partir de SM 1 y SM 2, que son los mismos que en la Figura 1. Los Ints 1-5 y las reacciones se describen en el Ejemplo 14.
Figura 14 muestra la ruta sintética de ATX-0081 (Ejemplo de comparación). Los Ints 1-6 y las reacciones se describen en el Ejemplo 15.
Figura 15 muestra la ruta sintética de ATX-0085 a partir de SM 1, SM 2 y SM3, que son los mismos que en la Figura 2. Los Ints 1-11 y las reacciones se describen en el Ejemplo 16.
Figura 16 muestra la ruta sintética de ATX-0134. Los Ints 1-6 y las reacciones se describen en el Ejemplo 17.
Figura 17 muestra los niveles de ARNm de EPO (ng/ml) después de la inyección de 0,03 mg/kg y 0,1 mg/kg de ARNm en nanopartículas que comprenden lípido catiónico ATX-002, ATX-0057 (Ejemplo de comparación), ATX-0081 (Ejemplo de comparación),<a>T<x>-0082, ATX- 0083 (Ejemplo de comparación), A<t>X-0084, ATX-0085, ATX-0086 o ATX-0087 a ratones.
Figura 18 muestra la actividad “knockdown” del anti-Factor VII de liposomas con ATX-0057 (Ejemplo de comparación) y ATX- 0058 (Ejemplo de comparación) frente a la actividad de ATX-002 y control (PBS solo).
Figura 19 muestra la actividad “knockdown” anti-EPO de liposomas con ATX-0057 (Ejemplo de comparación) frente a la actividad de ATX-002.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS
Definiciones
[0030] «Como mínimo uno» significa uno o más (por ejemplo, 1-3, 1-2 o 1).
[0031] «Composición» significa un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que proviene, directa o indirectamente, de la combinación de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas.
[0032] «En combinación con» significa la administración de un compuesto de la fórmula 1 con otros medicamentos en los procedimientos de tratamiento de la presente invención, lo que significa que los compuestos de la fórmula I y los otros medicamentos se administran de manera secuencial o simultánea en formas de dosificación separadas o se administran simultáneamente en la misma forma de administración.
[0033] «Mamífero» significa un humano u otro mamífero o significa un ser humano.
[0034] «Paciente» significa tanto un humano como otros mamíferos, preferiblemente humanos.
[0035] «Alquilo» significa una cadena de hidrocarburos lineal o ramificada saturada. En varias realizaciones, el grupo alquilo tiene 1-18 carbonos, es decir, es un grupo C1-C18 o es un grupo C1-C12, un grupo C1-C6 o un grupo C1-C4. Independientemente, en varias realizaciones, el grupo alquilo posee cero ramificaciones (es decir, es una cadena lineal), una ramificación, dos ramificaciones o más de dos ramificaciones. «Alquenilo» es un alquilo no saturado que puede tener un doble enlace, dos dobles enlace o más de dos dobles enlaces. «Alquinilo» es un alquilo no saturado que puede tener un triple enlace triple, dos triples enlaces o más de dos triples enlaces. Las cadenas de alquilo pueden sustituirse de manera opcional con 1 sustituyente (es decir, el grupo alquilo es monosustituido) o 1-2 sustituyentes, o 1-3 sustituyentes, o 1-4 sustituyentes, etc. Los sustituyentes pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en hidroxilo, amino, alquilamino, boronilo, carboxi, nitro, ciano y similares. Cuando el grupo alquilo insorpora uno o más heteroátomos, el grupo alquilo se denomina en el presente documento como un grupo heteroalquilo. Cuando los sustituyentes en un grupo alquilo son hidrocarburos, a continuación, se hace referencia al grupo resultante simplemente como a un alquilo sustituido. En diversos aspectos, el grupo alquilo que incluye sustituyentes contiene menos de 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 o 7 carbonos.
[0036] «Alquilo inferior» significa un grupo que contiene desde uno hasta seis carbonos en la cadena, cuya cadena puede ser lineal o ramificada. Los ejemplos no limitativos de grupos alquilo adecuados incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo y hexilo.
[0037] «Alcoxi» significa un grupo alquil-O en donde alquilo es tal como se define anteriormente. Los ejemplos no limitativos de grupos alcoxi incluyen: metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi y heptoxi. El enlace con la parte original se realiza a través del oxígeno del éter.
[0038] «Alcoxialquilo» significa un grupo alcoxi-alquilo en el que el alcoxi y el alquilo son tal como se describen anteriormente. Un alcoxialquilo preferido comprende un grupo alquilo inferior. El enlace con la parte original se realiza a través del alquilo.
[0039] «Alquilarlo» significa un grupo alquil-arilo en el que el alquilo y el arilo son tal como se describen anteriormente. Los alquilarilos preferidos comprenden un grupo alquilo inferior. El enlace con la parte original se realiza a través del arilo.
[0040] «Aminoalquilo» significa un grupo NH2-alquilo, en el que alquilo es tal como se define anteriormente, enlazado con la parte original a través del grupo alquilo.
[0041] «Carboxialquilo» significa un grupo HOOC-alquilo, en el que alquilo es tal como se define anteriormente, enlazado con la parte original a través del grupo alquilo.
[0042] «Productos químicos disponibles comercialmente» y los productos químicos utilizados en los Ejemplos enunciados en el presente documento pueden obtenerse a partir de fuentes comerciales habituales, donde tales fuentes incluyen, por ejemplo, Acros Organics (Pittsburgh, Pa.), Sigma-Adrich Chemical (Milwaukee, Wis.), Avocado Research (Lancashire, Reino Unido), Bionet (Cornwall, Reino Unido), Boron Molecular (Research Triangle Park, N.C.), Combi-Blocks (San Diego, California), Eastman Organic Chemicals, Eastman Kodak Company (Rochester, Nueva York), Fisher Scientific Co. (Pittsburgh, Pa.), Frontier Scientific (Logan, Utah), ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, California), Lancaster Synthesis (Windham, N.H.), Maybridge Chemical Co. (Cornwall, Reino Unido), Pierce Chemical Co. (Rockford, Ill.), Riedel de Haen (Hannover, Alemania), Spectrum Quality Product, Inc. (New Brunswick, N.J.), TCI America (Portland, Oreg.) y Wako Chemicals USA, Inc. (Richmond, Va.).
[0043] «Compuestos descritos en la literatura química» pueden identificarse a través de libros y bases de datos de referencia dirigidos a compuestos químicos y reacciones químicas, tal como se conocen por el experto en la técnica. Los libros y tratados de referencia adecuados que detallan la síntesis de reactivos útiles en la preparación de compuestos divulgados en el presente documento, o proporcionan referencias a artículos que describen la preparación de compuestos divulgados en el presente documento, incluyen, por ejemplo, «Synthetic Organic Chemistry», John Wiley y Sons, Inc. Nueva York; S. R. Sandler et al, «Organic Functional Group Preparations», 2a Edición, Academic Press, Nueva York, 1983; H. O. House, «Modern Synthetic Reactions», 2a Edición, W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, Calif., 1972; T. L. Glichrist, «Heterocyclic Chemistry», 2a Edición John Wiley e Hijos, Nueva York, 1992; J. March, «Advanced Organic Chemistry: reactions, Mechanisms and Structure», 5a edición, Wiley Interscience, Nueva York, 2001; los reactivos específicos y análogos pueden identificarse también a través de los índices de productos químicos conocidos preparados por el Chemical Abstract Service de la American Chemical Society, que están disponibles en la mayoría de las bibliotecas públicas y universitarias, así como a través de bases de datos en línea (puede ponerse en contacto con la American Chemical Society, Washington, D.C. para obtener más detalles). Los productos químicos que se conocen, pero que no están disponibles comercialmente en catálogos, pueden prepararse por empresas de síntesis de productos químicos por encargo, donde muchas de las empresas de distribución de productos químicos habituales (tales como aquellas mencionadas anteriormente) prestan servicios de síntesis personalizada.
[0044] «Halo» significa los grupos fluoro, cloro, bromo o yodo. Los preferidos son flúor, cloro o bromo y más preferidos son flúor y cloro.
[0045] «Halógeno» significa flúor, cloro, bromo o yodo. Los preferidos son flúor, cloro y bromo.
[0046] «Heteroalquilo» significa una cadena saturada o insaturada, lineal o ramificada que contiene carbono y como mínimo un heteroátomo. En varias realizaciones, el grupo heteroalquilo puede tener un heteroátomo o 1-2 heteroátomos o 1-3 heteroátomos, o 1-4 heteroátomos. En un aspecto, la cadena de heteroalquilo contiene de 1 a 18 (es decir, 1-18) átomos miembros (carbono y heteroátomos), y en varias realizaciones contiene 1-12, o 1-6, o 1-4 átomos miembros. Independientemente, en varias realizaciones, el grupo heteroalquilo tiene cero ramificaciones (es decir, es una cadena lineal), una ramificación, dos ramificaciones o más de dos ramificaciones. Independientemente, en una realización, el grupo heteroalquilo es saturado. En otra realización, el grupo heteroalquilo es insaturado. En varias realizaciones, el heteroalquilo insaturado puede tener un doble enlace, dos dobles enlaces, más de dos dobles enlaces y/o un triple enlace, dos triples enlaces o más de dos triples enlaces. Las cadenas de heteroalquilo pueden estar sustituidas o no sustituidas. En una realización, la cadena de heteroalquilo está no sustituida. En otra realización, la cadena de heteroalquilo está sustituida. Una cadena de heteroalquilo sustituida puede tener 1 sustituyente (es decir, mediante monosustitución), o puede tener, por ejemplo, 1-2 sustituyentes o 1-3 sustituyentes, o 1-4 sustituyentes. Los sustituyentes de heteroalquilo de ejemplo incluyen ésteres (-C(O)-O-R) y carbonilos (-C(O)-).
[0047] «Hidroxialquilo» significa un grupo HO-alquilo, en el que alquilo se define previamente. Los hidroxialquilos preferidos contienen alquilo inferior. Los ejemplos no limitativos de grupos hidroxialquilo adecuados incluyen hidroximetilo y 2-hidroxietilo.
[0048] «Hidrato» significa un solvato en donde la molécula de disolvente es H2O.
[0049] «Lípido» significa un compuesto orgánico que comprende un éster de ácido graso y se caracteriza por ser insoluble en agua, pero soluble en muchos disolventes orgánicos. Normalmente los lípidos se dividen en como mínimo tres clases: (1) «lípidos simples», que incluyen grasas y aceites, así como ceras; (2) «lípidos compuestos», que incluyen fosfolípidos, glicolípidos, lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos, lípidos neutros y lípidos aniónicos, todos descritos con más detalle en el presente documento; y (3) «lípidos derivados» tales como esteroides.
[0050] «Partícula lipídica» significa una formulación de lípidos que se puede utilizar para administrar un ácido nucleico terapéutico (por ejemplo, ARNm) a un sitio de interés diana (por ejemplo, célula, tejido, órgano y similares). En realizaciones preferidas, la partícula lipídica es una partícula de ácido nucleico-lípido, que se forma típicamente a partir de un lípido catiónico, un lípido no catiónico (por ejemplo, un fosfolípido), un lípido conjugado que previene la agregación de la partícula (por ejemplo, un PEG-lípido) y, opcionalmente, colesterol. Típicamente, el ácido nucleico terapéutico (por ejemplo, ARNm) se puede encapsular en la parte lipídica de la partícula, protegiéndolo de este modo de la degradación enzimática.
[0051] Típicamente las partículas lipídicas tienen un diámetro promedio de 30 nm a 150 nm, de 40 nm a 150 nm, de 50 nm a 150 nm, de 60 nm a 130 nm, de 70 nm a 110 nm, de 70 nm a 100 nm, de 80 nm a 100 nm, de 90 nm a 100 nm, de 70 a 90 nm, de 80 nm a 90 nm, de 70 nm a 80 nm, o 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm o 150 nm y son sustancialmente no tóxicas. Adicionalmente, los ácidos nucleicos, cuando están presentes en las partículas lipídicas de la presente invención, son resistentes a la degradación con una nucleasa en una solución acuosa.
[0052] «Lípido encapsulado» significa una partícula lipídica que proporciona un ácido nucleico terapéutico, tal como un ARNm con encapsulación completa, encapsulación parcial o ambas. En una realización preferida, el ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) se encapsula completamente en la partícula lipídica.
[0053] «Conjugado de lípido» significa un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas lipídicas. Tales conjugados de lípidos incluyen, pero no se limitan a, conjugados de PEG-lípido, tales como, por ejemplo, PEG acoplado a dialquiloxipropilos (por ejemplo, conjugados de PEG-DAA), PEG acoplado a diacilgliceroles (por ejemplo, conjugados de P<e>G-D<a>G), PEG acoplado a colesterol, PEG acoplado a fosfatidiletanolaminas y PEG conjugado con ceramidas, lípidos con PEG catiónicos, conjugados de polioxazolina (POZ)-lípido, oligómeros de poliamida y mezclas de los mismos. PEG o POZ pueden conjugarse directamente con el lípido o pueden enlazarse con el lípido a través de un resto enlazador. Se puede utilizar cualquier resto enlazador adecuad para el acoplamiento del PEG o la POZ a un lípido que incluye, por ejemplo, restos enlazadores que no contienen ésteres y restos enlazadores que contienen ésteres. En determinadas realizaciones preferidas, se utilizan los restos enlazadores que no contienen ésteres, tales como amidas o carbamatos.
[0054] «Lípido anfipático» significa el material en el que la parte hidrófoba del material lipídico se orienta a una fase hidrófoba, mientras que la parte hidrófila se orienta hacia la fase acuosa. Las características hidrófilas derivan de la presencia de grupos polares o cargados, tales como carbohidratos, fosfato, carboxílico, sulfato, amino, sulfhidrilo, nitro, hidroxilo y otros grupos similares. La hidrofobia se puede conferir por la inclusión de grupos apolares que incluyen, pero no se limitan a, grupos de hidrocarburos alifáticos saturados e insaturados de cadena larga y tales grupos están sustituidos por uno o más grupos aromáticos, cicloalifáticos o heterocíclicos. Los ejemplos de compuestos anfipáticos incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos, aminolípidos y esfingolípidos.
[0055] Los ejemplos representativos de fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, palmitoiloleoil fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, diestearoil fosfatidilcolina y dilinoleoilfosfatidilcolina. Otros compuestos que carecen de fósforo, tales como esfingolípido, familias de glicoesfingolípidos, diacilgliceroles y p-aciloxiácidos, se encuentran también en el grupo denominado como lípidos anfipáticos. Adicionalmente, los lípidos anfipáticos descritos anteriormente se pueden mezclar con otros lípidos que incluyen triglicéridos y esteroles.
[0056] «Lípido neutro» significa una especie de lípido que existe en una forma zwitteriónica no cargada o neutra a un pH seleccionado. A pH fisiológico, tales lípidos incluyen, por ejemplo, diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, cefalina, colesterol, cerebrósidos y diacilgliceroles.
[0057] «Lípido no catiónico» significa un lípido anfipático o un lípido neutro o un lípido aniónico, y se describe con más detalle a continuación.
[0058] «Lípido aniónico» significa un lípido que está cargado negativamente a pH fisiológico. Estos lípidos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilgliceroles, cardiolipinas, diacilfosfatidilserinas, ácidos diacilfosfatídicos, N-dodecanoil fosfatidiletanolaminas, N-succinil fosfatidiletanolaminas, N-glutarilfosfatidiletanolaminas, lisilfosfatidilgliceroles, palmitoiloleiolfosfatidilglicerol (POPG), y otros grupos de modificación aniónicos unidos a lípidos neutros.
[0059] «Lípidos hidrófobos» significa compuestos que tienen grupos apolares que incluyen, pero no se limitan a, grupos de hidrocarburos alifáticos saturados e insaturados de cadena larga y tales grupos están sustituidos opcionalmente por uno o más grupos aromáticos, cicloalifáticos o heterocíclicos. Los ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a, diacilglicerol, dialquilglicerol, N-N-dialquilamino, 1,2-diaciloxi-3-aminopropano y 1,2-dialquil-3-aminopropano.
[0060] «Lípido catiónico» y «aminolípido» se utilizan de manera intercambiable para indicar aquellos lípidos y sales de los mismos que tienen una, dos, tres o más cadenas de ácidos grasos o alquilo graso y un grupo de cabeza de amino valorable con el pH (por ejemplo, un grupo de cabeza de alquilamino o dialquilamino). Típicamente el lípido catiónico está protonado (es decir, está cargado positivamente) a un pH inferior al pKa del lípido catiónico y es sustancialmente neutro a un pH superior al pKa. Se puede calificar también los lípidos catiónicos de la invención como lípidos catiónicos valorables. En algunas realizaciones, los lípidos catiónicos comprenden: un grupo de cabeza de amina terciaria protonable (por ejemplo, valorable con el pH); cadenas de alquilo C18, en donde cada cadena de alquilo tiene de manera independiente de 0 a 3 (por ejemplo, 0, 1,2 o 3) dobles enlaces; y enlaces de éter, éster o cetal entre el grupo de cabeza y cadenas de alquilo. Tales lípidos catiónicos incluyen, pero no se limitan a, DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA, Y-DLenDMA, DLin-K-DMA, DLin-K-C2-DMA (también conocido como DLin-C2K-DMA, XTC2 y C2K), DLin-K-C3 -DM A, DLin-K-C4-DMA, DLen-C2K-DMA, y-DLen-C2K-DMA, DLin-M-C2-DMA (también conocido como MC2), DLin-M-C3 -DMA (también conocido como MC3) y (DLin-MP-DMA) (también conocido como 1-Bl 1).
[0061] «Sustituido» significa una sustitución con grupos específicos diferentes a hidrógeno o por uno o más grupos, restos o radicales que pueden ser iguales o diferentes, cada uno, por ejemplo, siendo seleccionado de manera independiente.
[0062] «Ácido nucleico antisentido» significa una molécula de ácido nucleico no enzimática que se une al ARN diana a través de las interacciones de ARN-ARN o ARN-ADN o ARN-APN (ácido nucleico peptídico; Egholm et al., 1993 Nature 365, 566) y altera la actividad del ARN diana (para una revisión, véase Stein y Cheng, 1993 Science 261, 1004 y Woolf et al., patente de EE. UU. N°. 5,849,902). Típicamente, las moléculas antisentido son complementarias a una secuencia diana a lo largo de una secuencia contigua única de la molécula antisentido. Sin embargo, en determinadas realizaciones, una molécula antisentido puede unirse a sustrato de tal modo que la molécula de sustrato forma un bucle, y/o una molécula antisentido puede unirse de tal modo que la molécula antisentido forma un bucle. Por consiguiente, la molécula antisentido puede ser complementaria a dos (o incluso más) secuencias de sustrato no contiguas o dos (o incluso más) partes de secuencia no contiguas de una molécula antisentido pueden ser complementarias a una secuencia diana o ambas. Adicionalmente, el ADN antisentido puede utilizarse para el direccionamiento de ARN a través de interacciones de ADN-ARN, activando de este modo la ARNasa H, que digiere el ARN diana en el dúplex. Los oligonucleótidos antisentido pueden comprender una o más regiones de activación de ARNsa H, que es capaz de activar la disociación de ARNsa H de un ARN diana. Se puede sintetizar ADN antisentido químicamente o se puede expresar a través del uso de un vector de expresión de ADN monocatenario o un equivalente del mismo. «ARN antisentido» es una cadena de ARN que tiene una secuencia complementaria a un ARNm de gen diana, que puede inducir ARNi mediante la unión al ARNm del gen diana. «ARN antisentido» es una cadena de ARN que tiene una secuencia complementaria a un ARNm de gen diana y se piensa que induce ARNi mediante la unión al ARNm del gen diana. «ARN de sentido» tiene una secuencia complementaria al ARN antisentido y se aparea con su ARN antisentido complementario para formar ANi. Estos ARN antisentido y de sentido han sido sintetizados de manera convencional con un sintetizador de ARN.
[0063] «Ácido nucleico» significa desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos monocatenarios o con forma de doble cadena. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos de esqueleto modificados o enlazadores, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que poseen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2'-O-metil ribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (APN).
[0064] «ARN» significa una molécula que comprende como mínimo un residuo de ribonucleótido. Por «ribonucleótido» se entiende un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un resto de p-D-ribo-furanosa. Los términos incluyen ARN de doble cadena, ARN de cadena única, ARN aislado, tal como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN generado de manera recombinante, así como ARN alterado que se diferencia de ARN de origen natural mediante la adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material que no es nucleótido, tal como en el extremo o extremos de un ARN de interferencia o de forma interna, por ejemplo, en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN de la presente invención pueden comprender también nucleótidos no estándares, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos sintetizados químicamente o desoxinucleótidos. Estos ARNs alterados pueden denominarse análogos o análogos de ARN de origen natural. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos «ácido ribonucleico» y «ARN» se refieren a una molécula que contiene como mínimo un residuo de ribonucleótido, que incluye ARNpi, ARN antisentido, ARN monocatenario, microARN, ARNm, ARN no codificante y ARN multivalente. Un ribonucleótido es un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un residuo de p-D-ribo-furanosa. Estos términos incluyen ARN de doble cadena, ARN de cadena única, ARN aislado, tal como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN generado de manera recombinante, así como ARN modificado y alterado que se diferencia de ARN de origen natural mediante la adición, eliminación, sustitución, modificación y/o alteración de uno o más nucleótidos. Las alteraciones de un ARN pueden incluir la adición de material que no es nucleótido, tal como en el extremo o extremos de un ARN de interferencia o de forma interna, por ejemplo, en uno o más nucleótidos de un ARN. Los nucleótidos en una molécula de ARN incluyen nucleótidos no estándares, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos sintetizados químicamente o desoxinucleótidos. Se puede hacer referencia a estos ARN alterados como análogos.
[0065]«Nucleótidos» significa bases naturales (estándares) y bases modificadas bien conocidas en la técnica. Tales bases se sitúan generalmente en la posición 1' de un resto de azúcar de nucleótido. Generalmente, los nucleótidos comprenden una base, un azúcar y un grupo fosfato. Los nucleótidos pueden ser no modificados o modificados en el resto de azúcar, fosfato y/o base, (a los que se refiere también de manera intercambiable como análogos de nucleótidos, nucleótidos modificados, nucleótidos no naturales, nucleótidos no estándares y otros; véanse, por ejemplo, Usman y McSwiggen, supra; Eckstein, et al., Publicación de PCT internacional número WO 92/07065; Usman, et al, Publicación de PCT internacional número WO 93/15187; Uhlman & Peyman, supra). Existen varios ejemplos de bases de ácido nucleico modificadas conocidas en la técnica tal como se recogen en Limbach, et al, Nucleic Acids Res. 22:2183, 1994. Algunos de los ejemplos no limitativos de modificaciones de bases que se pueden introducir en moléculas de ácido nucleico incluyen: inosina, purina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4,6-trimetoxibenceno, 3-metiluracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidinas (por ejemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridinas (por ejemplo, ribotimidina), 5-halouridina(porejemplo, 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6-alquilpirimidinas (por ejemplo, 6-metiluridina), propina y otros (Burgin, et al., Biochemistry 35:14090, 1996; Uhlman & Peyman, supra). En este aspecto, «bases modificadas» significa las bases de nucleótidos distintas a adenina, guanina, citosina y uracilo en la posición 1' o sus equivalentes.
[0066]«Bases de nucleótidos complementarias» significa un par de bases de nucleótidos que forman enlaces de hidrógeno una con la otra. Adenina (A) se empareja con timina (T) o con uracilo (U) en ARN, y guanina (G) se empareja con citosina (C). Los segmentos o cadenas de ácido nucleico complementarias que hibridan (es decir, se unen mediante el enlace de hidrógeno) entre sí. Por «complementaria» se entiende que un ácido nucleico puede formar un enlace o enlaces de hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico mediante Watson-Crick tradicional o a través de otro modo de unión no tradicional.
[0067] «MicroARNs» (miARN) significa moléculas de ARN de cadena única de 21-23 nucleótidos de longitud, que regulan la expresión génica. Los miARNs son codificados por genes que se transcriben a partir de ADN, pero no se traducen en proteína (ARN no codificante); en cambio se procesan a partir de las transcripciones primarias conocidas como pri-miARN para acortar las estructuras del tipo tallo-bucle denominadas pre-miARN y finalmente a miARN funcional. Las moléculas de miARN maduras son parcialmente complementarias a una o más moléculas de ARN mensajero (ARNm), y su función principal es regular negativamente la expresión de genes.
[0068]«ARN pequeño de interferencia (ARNpi)» y «ARN corto de interferencia» y «ARN de silenciamiento» significan una clase de moléculas de ARN de doble cadena, con 16-40 nucleótidos de longitud, que juegan una serie de papeles en biología. De forma destacada, ARNpi está involucrado en la vía del ARN de interferencia (ARNi), donde interfiere con la expresión de un gen específico. Además de su papel en la vía de ARNi, ARNpi actúan también en las vías relacionadas con ARNi, por ejemplo, como un mecanismo antiviral o en la configuración de la estructura de cromatina de un genoma; la complejidad de estas vías solo ahora está siendo elucidada.
[0069]«ARNi» significa un proceso de silenciamiento de gen dependiente de ARN que se controla por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) y se inicia a través de moléculas de ARN corto de doble cadena en una célula, donde interactúan con el componente catalítico de RISC argonauta. Cuando el ARN de doble cadena o ANi similar a ARN o ARNpi son exógenos (proceden de una infección por un virus con un genoma de ARN o de ANi o ARNpi transfectados), el ARN o ANi se importan directamente en el citoplasma y se escinden en fragmentos cortos por una enzima dicer. El ARN bicatenario iniciador puede ser también endógeno (que se origina en la célula), como en premicroARNs que se expresan a partir de genes que codifican ARN en el genoma. Las transcripciones primarias a partir de tales genes se procesan primero para formar la estructura característica de tallo-bucle de pre-miARN en el núcleo, a continuación, se exportan al citoplasma para escindirse por dicer. Por consiguiente, las dos vías de ARN bicatenario, exógena y endógena, covergen en el complejo RISC. Los componentes activos de un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) son endonucleasas denominadas proteínas argonautas que escinden la cadena de ARNm diana complementaria a su ARNpi o Ani unidos. Debido a que los fragmentos producidos por dicer son de doble cadena, en teoría cada uno podría producir un ARNpi o ANi funcionales. Sin embargo, solamente una de las dos cadenas, que se conoce como la cadena guía, se une a la proteína argonauta y controla el silenciamiento de genes. La otra cadena antiguía o cadena pasajera se degrada durante la activación de RISC.
Compuesto de la Fórmula I
[0070]En el presente documento la referencia a un compuesto de la fórmula I se entiende que incluye la referencia a sales del mismo, a menos que se indique lo contrario. El término «sal(es)» tal como se utiliza en el presente documento indica sales ácidas formadas con ácidos inorgánicos y/u orgánicos, así como sales básicas formadas con bases inorgánicas y/u orgánicas. Adicionalmente, cuando el compuesto de la fórmula I contiene tanto un resto básico, tal como, pero no limitado a, una piridina o un imidazol, y un resto ácido, tal como, pero no limitado a, un ácido carboxílico, pueden formarse zwitteriones («sales internas») y están incluidos en el término «sal(es)» tal como se utiliza en el presente documento. Las sales pueden ser sales farmacéuticamente aceptables (es decir, no tóxicas, fisiológicamente aceptables), aunque otras sales también son útiles. Las sales de un compuesto de fórmula I puede formarse, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula I con una cantidad de ácido o base, tal como una cantidad equivalente, en un medio, tal como uno en el que la sal se precipita o en un medio acuoso seguido de liofilización.
[0071]Las sales de adición ácidas de ejemplo incluyen acetatos, adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, bencenosulfonatos, bisulfatos, boratos, butiratos, citratos, alcanforatos, alcanforsulfonatos, ciclopentanpropionatos, digluconatos, dodecilsulfatos, etanosulfonatos, fumaratos, glucoheptanoatos, glicerofosfatos, hemisulfatos, heptanoatos, hexanoatos, clorhidratos, bromhidratos, yodhidratos, 2-hidroxietanosulfonatos, lactatos, maleatos, metanosulfonatos, 2-naftalenosulfonatos, nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfatos, 3-fenilpropionatos, fosfatos, picratos, pivalatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos, sulfonatos (tales como aquellos mencionados en el presente documento), tartratos, tiocianatos, toluenosulfonatos (también conocidos como tosilatos), undecanoatos y similares. Adicionalmente, los ácidos que generalmente se consideran adecuados para la formación de sales útiles farmacéuticamente a partir de un compuesto farmacéutico básico se tratan, por ejemplo, en S. Berge et al, J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1) 1-19; P. Gould, International J. Pharmaceutics (1986) 33201 217; Anderson et al, The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, Nueva York; y en The Orange Book (Food & Drug Administration, Washington, D.C. en su página web).
[0072]Las sales básicas de ejemplo incluyen sales de amonio, sales de metal alcalino, tales como sales de sodio, litio y potasio, sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas (por ejemplo, aminas orgánicas), tales como benzatinas, diciclohexilaminas, hidrabaminas (formadas con N,N-bis(deshidroabietil)etilendiamina), N-metil-D-glucaminas, N-metil-D-glucamidas, t-butil aminas, y sales con aminoácidos, tales como arginina o lisina. Los grupos básicos que contienen nitrógeno pueden cuaternizarse con agentes, tales como haluros de alquilo inferior (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo), sulfatos de dialquilo (por ejemplo, sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo), haluros de cadena larga (por ejemplo, cloruro,s bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo,), haluros de arilalquilo (por ejemplo, bromuros de bencilo y fenetilo) y otros.
[0073]Todas dichas sales ácidas y básicas pretenden ser sales farmacéuticamente aceptables dentro del alcance de la divulgación y todas las sales ácidas y básicas se consideran equivalentes a las formas libres del compuesto de la fórmula I correspondiente a efectos de la divulgación.
[0074]El compuesto de la fórmula I puede existir en formas no solvatadas y solvatadas, que incluyen formas hidratadas. De manera general, las formas solvatadas, con disolventes farmacéuticamente aceptables, tales como agua, etanol y similares son equivalentes a las formas no solvatadas para los objetivos de esta divulgación.
[0075]El compuesto de la fórmula I y sales, solvatos del mismo, puede existir en su forma tautomérica (por ejemplo, como una amida o imino éter). Todas de dichas formas tautoméricas se contemplan en el presente documento como parte de la presente divulgación.
[0076]Las clases de los compuestos que se pueden utilizar como el agente quimioterapéutico (agente antineoplásico) incluyen: agentes alquilantes, antimetabolitos, productos naturales y sus derivados, hormonas y esteroides (incluyendo análogos sintéticos) y sintéticos. Los ejemplos de los compuestos que se encuentran dentro de estas clases se proporcionan a continuación.
Partículas Lipídicas
[0077]Un compuesto de las fórmulas I incluye una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una composición lipídica, que comprende una nanopartícula o una bicapa de moléculas lipídicas. Preferiblemente, la bicapa lipídica comprende adicionalmente un lípido neutro o un polímero. Preferiblemente, la composición lipídica comprende un medio líquido. Preferiblemente, la composición encapsula adicionalmente un ácido nucleico. Preferiblemente, el ácido nucleico tiene actividad de supresión de la expresión del gen diana utilizando un ARN de interferencia (ARNi). Preferiblemente, la composición lipídica comprende adicionalmente un ácido nucleico y un lípido neutro o un polímero. Preferiblemente, la composición lipídica encapsula el ácido nucleico.
[0078]La descripción proporciona partículas lipídicas que comprenden una o más moléculas de ARNm terapéutico encapsuladas dentro de las partículas lipídicas.
[0079]En algunas realizaciones, el ARNm se encapsula por completo en la parte lipídica de la partícula lipídica de tal modo que el ARNm en la partícula lipídica es resistente en una solución acuosa a la degradación por nucleasa. En otras realizaciones, las partículas lipídicas descritas en el presente documento son sustancialmente no tóxicas para mamíferos, tales como humanos. Típicamente las partículas lipídicas tienen un diámetro promedio que de 30 nm a 150 nm, de 40 nm a 150 nm, de 50 nm a 150 nm, de 60 nm a 130 nm, de 70 nm a 110 nm o de 70 a 90 nm. También típicamente las partículas lipídicas de la presente invención tienen una proporción de lípido:ARN (proporción de masa/masa) de 1:1 a 100:1, de 1:1 a 50:1, de 2:1 a 25:1, de 3:1 a 20:1, de 5:1 a 15:1 o de 5:1 a 10:1, o de 10:1 a 14:1, o de 9:1 a 20:1. En una realización, las partículas lipídicas tienen una proporción de lípido:ARN (proporción de masa/masa) de 12:1. En otra realización, las partículas lipídicas tienen una proporción de lípido:ARNm (proporción de masa/masa) de 13:1.
[0080]En realizaciones preferidas, las partículas lipídicas comprenden un ARNm, un lípido catiónico (por ejemplo, uno o más lípidos catiónicos o sales de los mismos descritos en el presente documento), un fosfolípido y un lípido conjugado que inhibe la agregación de las partículas (por ejemplo, uno o más conjugados de PEG-lípido). Las partículas lipídicas pueden incluir también colesterol. Las partículas lipídicas pueden comprender como mínimo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más ARNm que expresan uno o más polipéptidos.
[0081]En las partículas de ácido nucleico-lípido, el ARNm puede estar completamente encapsulado dentro de la parte lipídica de la partícula, protegiendo de ese modo el ácido nucleico de la degradación por nucleasa. En realizaciones preferidas, una partícula lipídica que comprende un ARNm está completamente encapsulada dentro de la parte lipídica de la partícula, protegiendo de ese modo el ácido nucleico de la degradación por nucleasa. En determinados casos, el ARNm en la partícula lipídica no se degrada de manera sustancial después de la exposición de la partícula a una nucleasa a 37 °C durante un periodo de como mínimo 20, 30, 45 o 60 minutos. En otros determinados ejemplos, el ARNm en la partícula lipídica no se degrada de manera sustancial después de la incubación de la partícula en suero a 37 °C durante como mínimo 30, 45 o 60 minutos o como mínimo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36 horas. En otras realizaciones, el ARNm forma un complejo con la parte lipídica de la partícula. Una de las ventajas de las formulaciones de la presente invención es que las composiciones con partículas de ácido nucleico-lípido son sustancialmente no tóxicas para mamíferos, tales como seres humanos.
[0082]«Encapsulado completamente» significa que el ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) en la partícula de ácido nucleico-lípido no se degrada de manera significativa después de la exposición a suero o un ensayo con nucleasa que degradaría de forma significativa el ARN libre. Cuando se encapsula completamente, preferiblemente menos del 25 % del ácido nucleico en la partícula se degrada en un tratamiento que normalmente degradaría el 100 % de ácido nucleico libre, más preferiblemente, menos del 10 % y ,lo más preferiblemente, menos del 5 % del ácido nucleico en la partícula se degrada. «Completamente encapsulado» significa también que las partículas de ácido nucleico-lípido no se descomponen fácilmente en partes integrantes tras ser administradasin vivo.
[0083]En el contexto de ácidos nucleicos, la encapsulación completa puede determinarse realizando un ensayo de exclusión con colorante fluorescente impermeable a membrana, que utiliza un colorante que potencia la fluorescencia cuando se asocia al ácido nucleico. La encapsulación se determina añadiendo el colorante a una formulación liposomal, midiendo la fluorescencia resultante y comparándola con la fluorescencia observada tras la adición de una pequeña cantidad de detergente no iónico. La alteración mediada por detergente de la bicapa liposomal libera el ácido nucleico encapsulado, permitiendo su interacción con el colorante impermeable a membrana. Se puede calcular la encapsulación de ácido nucleico como E = (I0 - I)/I<ü>, donde I e I0 hacen referencia a las intensidades de fluorescencia antes y después de la adición de detergente.
[0084]En otras realizaciones, la presente invención da a conocer una composición de partículas de ácido nucleicolípido que comprende una pluralidad de partículas de ácido nucleico-lípido.
[0085]La partícula lipídica comprende ARNm que está completamente encapsulado en la parte lipídica de las partículas, de tal modo que de 30 % a 100 %, de 40 % a 100 %, de 50 % a 100 %, de 60 % a 100 %, de 70 % a 100 %, de 80 % a 100 %, de 90 % a 100 %, de 30 % a 95 %, de 40 % a 95 %, de 50 % a 95 %, de 60 % a 95 %, de 70 % a 95 %, de 80 % a 95 %, de 85 % a 95 %, de 90 % a 95 %, de 30 % a 90 %, de 40 % a 90 %, de 50 % a 90 %, de 60 % a 90 %, de 70 % a 90 %, de 80 % a 90 %, o como mínimo 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % (o cualquier fracción de los mismos o intervalo de los mismos) de las partículas tienen el ARNm encapsulado en las mismas.
[0086]Dependiendo del uso previsto de las partículas lipídicas, las proporciones de los componentes pueden variar y la eficacia de la administración de una formulación particular puede medirse utilizando los ensayos conocidos en la técnica.
Lípidos catiónicos
[0087]La descripción incluye la síntesis de determinados compuestos de lípidos catiónicos. Los compuestos son particularmente adecuados para el suministro de polinucleótidos a células y tejidos, tal como se demuestra en las secciones posteriores. El compuesto lipídico en macrociclo descrito en el presente documento puede utilizarse con otros fines, así como, por ejemplo, receptores y aditivos.
[0088]Los procedimientos sintéticos de los compuestos de lípidos catiónicos pueden sintetizarse con las capacidades de la técnica. Los expertos en la técnica reconocerán otros procedimientos para producir estos compuestos y para producir también otros compuestos de la descripción.
[0089]Los compuestos de lípidos catiónicos pueden combinarse con un agente para formar micropartículas, nanopartículas, liposomas o micelas. El agente que es suministrado por las partículas, liposomas o micelas puede estar en forma de un gas, líquido o sólido y el agente puede ser un polinucleótido, proteína, péptido o molécula pequeña. Los compuestos lipídicos en macrociclo pueden combinarse con otros compuestos lipídicos catiónicos, polímeros (sintéticos o naturales), tensioactivos, colesterol, carbohidratos, proteínas o lípidos para formar las partículas. A continuación, estas partículas pueden combinarse de manera opcional con un excipiente farmacéutico para formar una composición farmacéutica.
[0090] La presente descripción proporciona compuestos lipídicos catiónicos nuevos y sistemas de administración de fármacos basados en el uso de tales compuestos lipídicos catiónicos. El sistema puede utilizarse en las técnicas de administración farmacéutica/de fármacos para administrar polinucleótidos, proteínas, pequeñas moléculas, péptidos, antígeno o fármaco a un paciente, tejido, órgano o célula. Estos compuestos nuevos pueden utilizarse también como materiales para recubrimiento, aditivos, excipientes, materiales o bioingeniería.
[0091] Los compuestos lipídicos catiónicos de la presente descripción proporcionan varios usos diferentes en la técnica de suministro de fármacos. La parte que contiene amina de los compuestos lipídicos catiónicos se puede utilizar para formar complejos con polinucleótidos, potenciando de ese modo el suministro de polinucleótido y previniendo su degradación. Los compuestos lipídicos catiónicos pueden utilizarse también en la formación de picopartículas, nanopartículas, micropartículas, liposomas y micelas que contienen el agente para su suministro. Preferiblemente, los compuestos lipídicos catiónicos son biocompatibles y biodegradables y las partículas formadas también son biodegradables y biocompatibles y pueden utilizarse para proporcionar una liberación controlada, sostenida del agente para su administración. Estas y sus partículas correspondientes pueden ser también sensibles a cambios de pH dado que están protonadas a un pH inferior. También pueden actuar como esponjas de protones en el suministro de un agente a una célula para causar lisis de endosomas.
[0092] En determinadas realizaciones, los compuestos lipídicos catiónicos son relativamente no tóxicos. Los compuestos lipídicos catiónicos pueden ser biocompatibles y biodegradables. El lípido catiónico puede tener un pKa medido (en el medio de formulación) que oscila de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5, más preferiblemente entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,0. Puede estar diseñado para tener un pKa deseado entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 9,0, o entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0. Los compuestos lipídicos catiónicos descritos en el presente documento son particularmente atractivos para el suministro de fármacos por varias razones: contienen grupos amino para su interacción con ADN, ARN, otros polinucleótidos y otros agentes cargados negativamente, para regular el pH, para provocar endoosmólisis, para proteger el agente que se suministra, pueden sintetizarse a partir de materiales de partida disponibles comercialmente; y/o son sensibles a pH y pueden diseñarse con un pKa deseado.
Lípidos auxiliares neutros
[0093] Los ejemplos no limitativos de lípidos no catiónicos incluyen fosfolípidos, tales como lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, esfingomielina de huevo (ESM), cefalina, cardiolipina, ácido fosfatídico, cerebrósidos, dicetilfosfato, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoil-fosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), palmitoiloleiol-fosfatidilglicerol (POPG), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), estearoiloleoilfosfatidiletanolamina (SOPE), lisofosfatidilcolina, dilinoleoilfosfatidilcolina y mezclas de los mismos. Se pueden utilizar también otros fosfolípidos de diacilfosfatidilcolina y diacilfosfatidiletanolamina. Los grupos acilo en estos lípidos son preferiblemente grupos acilo derivados de ácidos grasos que tienen cadenas de carbono C10-C24, por ejemplo, lauroilo, miristoilo, palmitoilo, estearoilo u oleoilo.
[0094] Los ejemplos adicionales de lípidos no catiónicos incluyen esteroles, tales como colesterol y derivados del mismo. Los ejemplos no limitativos de derivados de colesterol incluyen análogos polares, tales como 5a-colestanol, 5a-coprostanol, éter colesteril-(2'-hidroxi)-etílico, éter colesteril-(4'-hidroxi)-butílico y 6-cetocolestanol; análogos no polares, tales como 5a-colestano, colestenona, 5a-colestanona, 5a-colestanona y decanoato de colesterilo; y mezclas de los mismos. En realizaciones preferidas, el derivado de colesterol es un análogo polar, tal como éter colesteril-(4'-hidroxi)-butílico.
[0095] En algunas realizaciones, el lípido no catiónico presente en partículas lipídicas comprende o consiste en una mezcla de uno o más fosfolípidos y colesterol o un derivado del mismo. En otras realizaciones, el lípido no catiónico presente en las partículas lipídicas comprende o consiste en uno o más fosfolípidos, por ejemplo, una formulación de partículas lipídicas libres de colesterol. En otras realizaciones adicionales, el lípido no catiónico presente en partículas lipídicas comprende o consiste en colesterol o un derivado del mimo, por ejemplo, una formulación de partículas lipídicas libres de fosfolípidos.
[0096] Otros ejemplos de lípidos no catiónicos incluyen lípidos que no contienen fósforo, tales como, por ejemplo, estearilamina, dodecilamina, hexadecilamina, palmitato de acetilo, ricinoleato de glicerol, estearato de hexadecilo, miristato de isopropilo, polímeros acrílicos anfóteros, lauril sulfato de trietanolamina, amidas de ácidos grasos polietiloxilados de sulfato de alquil-arilo, bromuro de dioctadecildimetil amonio, ceramida y esfingomielina.
[0097]En algunas realizaciones, el lípido no catiónico comprende desde 10 % en moles hasta 60 % en moles, desde 20 % en moles hasta 55 % en moles, desde 20 % en moles hasta 45 % en moles, desde 20 % en moles hasta 40 % en moles, desde 25 % en moles hasta 50 % en moles, desde 25 % en moles hasta 45 % en moles, desde 30 % en moles hasta 50 % en moles, desde 30 % en moles hasta 45 % en moles, desde 30 % en moles hasta 40 % en moles, desde 35 % en moles hasta 45 % en moles, desde 37 % en moles hasta 42 % en moles, o 35 % en moles, 36 % en moles, 37 % en moles, 38 % en moles, 39 % en moles, 40 % en moles, 41 % en moles, 42 % en moles, 43 % en moles, 44 % en moles o 45 % en moles (o cualquier fracción de los mismos o intervalo intermedio) del lípido total presente en la partícula.
[0098]En realizaciones, donde las partículas lipídicas contienen una mezcla de fosfolípido y colesterol o un derivado de colesterol, la mezcla puede comprender hasta el 40 % en moles, 45 % en moles, 50 % en moles, 55 % en moles o 60 % en moles del lípido total presente en la partícula.
[0099]En algunas realizaciones, el componente de fosfolípido en la mezcla puede comprender desde 2 % en moles hasta 20 % en moles, desde 2 % en moles hasta 15 % en moles, desde 2 % en moles hasta 12 % en moles, desde 4 % en moles hasta 15 % en moles o desde 4 % en moles hasta 10 % en moles (o cualquier fracción de los mismos o intervalo intermedio) del lípido total presente en la partícula. En determinadas realizaciones preferidas, el componente con fosfolípido en la mezcla comprende desde 5 % en moles hasta 10 % en moles, desde 5 % en moles hasta 9 % en moles, desde 5 % en moles hasta 8 % en moles, desde 6 % en moles hasta 9 % en moles, desde 6 % en moles hasta 8 % en moles o 5 % en moles, 6 % en moles, 7 % en moles, 8 % en moles, 9 % en moles o 10 % en moles (o cualquier fracción de los mismos o intervalo entremedio) del lípido total presente en la partícula.
[0100]En otras realizaciones, el componente de colesterol en la mezcla puede comprender desde 25 % en moles hasta 45 % en moles, desde 25 % en moles hasta 40 % en moles, desde 30 % en moles hasta 45 % en moles, desde 30 % en moles hasta 40 % en moles, desde 27 % en moles hasta 37 % en moles, desde 25 % en moles hasta 30 % en moles o desde 35 % en moles hasta 40 % en moles (o cualquier fracción de los mismos o intervalo entremedio) del lípido total presente en la partícula. En determinadas realizaciones preferidas, el componente de colesterol en la mezcla comprende desde 25 % en moles hasta 35 % en moles, desde 27 % en moles hasta 35 % en moles, desde 29 % en moles hasta 35 % en moles, desde 30 % en moles hasta 35 % en moles, desde 30 % en moles hasta 34 % en moles, desde 31 % en moles hasta 33 % en moles o 30 % en moles, 31 % en moles, 32 % en moles, 33 % en moles, 34 % en moles o 35 % en moles (o cualquier fracción de los mismos o intervalo entremedio) del lípido total presente en la partícula.
[0101]En realizaciones, en las que las partículas lipídicas están libres de fosfolípido, el colesterol o el derivado del mismo puede comprender hasta el 25 % en moles, 30 % en moles, 35 % en moles, 40 % en moles, 45 % en moles, 50 % en moles, 55 % en moles o 60 % en moles del lípido total presente en la partícula.
[0102]En algunas realizaciones, el colesterol o un derivado del mismo en la formulación de partículas lipídicas libre de fosfolípido puede comprender desde el 25 % en moles hasta 45 % en moles, desde 25 % en moles hasta 40 % en moles, desde 30 % en moles hasta 45 % en moles, desde 30 % en moles hasta 40 % en moles, desde 31 % en moles hasta 39 % en moles, desde 32 % en moles hasta 38 % en moles, desde 33 % en moles hasta 37 % en moles, desde 35 % en moles hasta 45 % en moles, desde 30 % en moles hasta 35 % en moles, desde 35 % en moles hasta 40 % en moles o el 30 % en moles, 31 % en moles, 32 % en moles, 33 % en moles, 34 % en moles, 35 % en moles, 36 % en moles, 37 % en moles, 38 % en moles, 39 % en moles o 40 % en moles (o cualquier fracción de los mismos o intervalo entremedio) del lípido total presente en la partícula.
[0103]En otras realizaciones, el lípido no catiónico comprende desde 5 % en moles hasta 90 % en moles, desde 10 % en moles hasta 85 % en moles, desde 20 % en moles hasta 80 % en moles, 10 % en moles (por ejemplo, fosfolípido solo) o 60 % en moles (por ejemplo, fosfolípido y colesterol o derivado de los mismos) (o cualquier fracción de los mismos o intervalo entremedio) del lípido total presente en la partícula.
[0104]El porcentaje de lípido no catiónico presente en las partículas lipídicas es una cantidad objetivo, y la cantidad real de lípido no catiónico presente en la formulación puede variar, por ejemplo, en ± 5 % en moles.
[0105]Una composición que contiene un compuesto de lipídico catiónico puede contener un 30-70 % de compuesto de lipídico catiónico, 0-60 % de colesterol, 0-30 % de fosfolípido y 1-10 % de polietilenglicol (PEG). Preferiblemente, la composición contiene 30-40 % de compuesto de lipídico catiónico, 40- 50 % de colesterol y 10-20 % de PEG. En otras realizaciones preferidas, la composición contiene 50-75 % de compuesto de lipídico catiónico, 20-40 % de colesterol y 5-10 % de fosfolípido y 1-10 % de PEG. La composición puede contener 60-70 % de compuesto de lipídico catiónico, 25-35 % de colesterol y 5-10 % de PEG. La composición puede contener hasta el 90 % de compuesto de lipídico catiónico y 2-15 % de lípido auxiliar.
[0106]La formulación puede ser una formulación con partículas lipídicas, por ejemplo, que contiene 8-30 % de compuesto, 5-30 % de lípido auxiliar y 0-20 % de colesterol; 4-25 % de lípido catiónico, 4-25 % de lípido auxiliar, 2 25%de colesterol, 10- 35%de colesterol-PEG y 5%de colesterol-amina; o 2-30%de lípido catiónico, 2-30%de lípido auxiliar, 1-15 % de colesterol, 2- 35 % de colesterol-PEG y 1-20 % de colesterol-amina; o hasta 90 % de lípido catiónico y 2-10 % de lípidos auxiliares o incluso 100 % de lípido catiónico.
Conjugados de lípidos
[0107]Además de catiónicas, las partículas lipídicas descritas en el presente documento pueden comprender un conjugado de lípidos. El lípido conjugado es útil dado que previene la agregación de partículas. Los lípidos conjugados adecuados incluyen, pero no se limitan a, conjugados de PEG-lípido, conjugados de lípido-polímero-catiónico y mezclas de los mismos.
[0108]En una realización preferida, el conjugado de lípido es un PEG-lípido. Los ejemplos de PEG-lípidos incluyen, pero no se limitan a, PEG acoplado a dialquiloxipropilos (PEG-DAA), PEG acoplado a diacilglicerol (PEG-DAG), PEG acoplado a fosfolípidos, tales como fosfatidiletanolamina (PEG-PE), PEG conjugado con ceramidas, PEG conjugado con colesterol o un derivado de los mismos y mezclas de los mismos.
[0109]PEG es un polímero lineal, soluble en agua de unidades de repetición de etileno con dos grupos hidroxilo terminales. Los PEGs se clasifican según sus pesos moleculares; e incluyen los siguientes: monometoxipolietilenglicol (MePEG-OH), monometoxipolietilenglicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietilenglicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS), monometoxipolietilenglicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietilenglicol-tresilato (MePEG-TRES), monometoxipolietilenglicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-IM), así como dichos compuestos que contienen un grupo hidroxi terminal en vez de un grupo metoxi terminal (por ejemplo, HO-PEG-S, HO-PEG-S-NHS, HO-PEG-NH2).
[0110]El resto de PEG de los conjugados de PEG-lípido descritos en el presente documento puede comprender un peso molecular promedio que oscila de 550 dalton a 10.000 dalton. En determinados ejemplos, el resto de PEG tiene un peso molecular promedio de 750 dalton a 5.000 dalton (por ejemplo, de 1.000 dalton a 5.000 dalton, de 1.500 dalton a 3.000 dalton, de 750 dalton a 3.000 dalton, de 750 dalton a 2.000 dalton). En realizaciones preferidas, el resto de PEG tiene un peso molecular promedio de 2.000 dalton o 750 dalton.
[0111]En determinados casos, el PEG puede sustituirse opcionalmente por un grupo alquilo, alcoxi, acilo o arilo. El PEG puede conjugarse directamente con el lípido o puede enlazarse al lípido a través de un resto enlazador. Se puede utilizar cualquier resto enlazador adecuado para el acoplamiento del PEG al lípido que incluye, por ejemplo, restos enlazadores que no contienen ésteres y restos enlazadores que contienen ésteres. En una realización preferida, el resto enlazador es un resto enlazador que no contiene éster. Los restos enlazadores que no contienen ésteres adecuados incluyen, pero no se limitan a, amido (-C(O)NH-), amino (-NR-), carbonilo (-C(O)-), carbamato (-NHC(O)O-), urea (-Nh C(O)Nh -), disulfuro (-S-S-), éter (-O-), succinilo (-(O)CCH2c H2C(O)-), succinamidilo (-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), éter, disulfuro, así como las combinaciones de los mismos (tales como un enlazador que contiene tanto un resto enlazador de carbamato como un resto enlazador de amido). En una realización preferida, un enlazador de carbamato se utiliza para acoplar el PEG al lípido.
[0112]En otras realizaciones, se utiliza un resto enlazador que contiene éster para acoplar el PEG al lípido. Los restos enlazadores que contienen ésteres adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato (-OC(O)O-), succinoílo, ésteres de fosfato (-O-(O)POH-O-), ésteres de sulfonato y combinaciones de los mismos.
[0113]Las fosfatidiletanolaminas que tienen una variedad de grupos de cadena de acilo con diferentes longitudes de cadena y niveles de saturación pueden conjugarse con PEG para formar el conjugado de lípido. Tales fosfatidiletanolaminas están disponibles comercialmente o pueden aislarse o sintetizarse utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. Se prefieren fosfatidiletanolaminas que contienen ácidos grasos saturados o insaturados con longitudes de cadena de carbono que oscilan entre C10 y C20. También se pueden utilizar fosfatidiletanolaminas con ácidos grasos mono- o di-insaturados y mezclas de ácidos grasos saturados e insaturados. Las fosfatidiletanolaminas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) y diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE).
[0114]El término «diacilglicerol» o «DAG» incluye un compuesto que tiene 2 cadenas de acilo graso, R1 y R2, ambos tienen independientemente entre 2 y 30 carbonos unidos a la posición 1 y 2 de glicerol mediante enlaces éster. Los grupos acilo pueden estar saturados o tener diferentes grados de insaturación. Los grupos acilo adecuados incluyen, pero no se limitan a, lauroilo (C12), miristoilo (C14), palmitoilo (C-ia), estearoilo (C-m) e icosoilo (C20). En realizaciones preferidas, R1 y R2 son iguales, es decir, R1 y R2 ambos son miristoilo (es decir, dimiristoilo), R1 y R2 ambos son estearoilo (es decir, diestearoilo).
[0115]El término «dialquiloxipropilo» o «DAA» incluye un compuesto que tiene 2 cadenas de alquilo, R1 y R2 , ambos tienen de manera independiente entre 2 y 30 carbonos. Los grupos alquilo pueden estar saturados o tener diferentes grados de insaturación.
[0116]Preferiblemente, el conjugado de PEG-DAA es un conjugado de PEG-dideciloxipropilo (C10), un conjugado de PEG-dilauriloxipropilo (C12), un conjugado de PEG-dimiristiloxipropilo (C14), un conjugado de PEG-dipalmitiloxipropilo (Cía) o un conjugado de PEG-diesteariloxipropilo (C18), En estas realizaciones, el PEG tiene preferiblemente un peso molecular promedio de 750 o 2.000 dalton. En realizaciones particulares, el grupo hidroxilo terminal del PEG se sustituye por un grupo metilo.
[0117]Además de lo mencionado anteriormente, pueden utilizarse otros polímeros hidrófilos en lugar de PEG. Los ejemplos de polímeros adecuados que se pueden utilizar en lugar de PEG incluyen, pero no se limitan a, polivinilpirrolidona, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida y polidimetilacrilamida, ácido poliláctico, ácido poliglicólico y celulosas derivadas, tales como hidroximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa.
[0118]En algunas realizaciones, el conjugado de lípido (por ejemplo, PEG-lípido) comprende desde 0,1 % en moles hasta 2 % en moles, desde 0,5 % en moles hasta 2 % en moles, desde 1 % en moles hasta 2 % en moles, desde 0,6 % en moles hasta 1,9 % en moles, desde 0,7 % en moles hasta 1,8 % en moles, desde 0,8 % en moles hasta 1,7 % en moles, desde 0,9 % en moles hasta 1,6 % en moles, desde 0,9 % en moles hasta 1,8 % en moles, desde 1 % en moles hasta 1,8 % en moles, desde 1 % en moles hasta 1,7 % en moles, desde 1,2 % en moles hasta 1,8 % en moles, desde 1,2 % en moles hasta 1,7 % en moles, desde 1,3 % en moles hasta 1,6 % en moles o desde 1,4 % en moles hasta 1,5 % en moles (o cualquier fracción de los mismos o intervalo entremedio) del lípido total presente en la partícula. En otras realizaciones, el conjugado de lípido (por ejemplo, PEG-lípido) comprende desde 0 % en moles hasta 20 % en moles, desde 0,5 % en moles hasta 20 % en moles, desde 2 % en moles hasta 20 % en moles, desde 1,5 % en moles hasta 18 % en moles, desde 2 % en moles hasta 15 % en moles, desde 4 % hasta 15 % en moles, desde 2 % en moles hasta 12 % en moles, desde 5 % en moles hasta 12 % en moles o 2 % en moles (o cualquier fracción de los mismos o intervalo entremedio) del lípido total presente en la partícula.
[0119]En realizaciones adicionales, el conjugado de lípido (por ejemplo, PEG-lípido) comprende desde 4 % en moles hasta 10 % en moles, desde 5 % en moles hasta 10 % en moles, desde 5 % en moles hasta 9 % en moles, desde 5 % en moles hasta 8 % en moles, desde 6 % hasta 9 % en moles, desde 6 % en moles hasta 8 % en moles o 5 % en moles, 6 % en moles, 7 % en moles, 8 % en moles, 9 % en moles o 10 % en moles (o cualquier fracción de los mismos o intervalo entremedio) del lípido total presente en la partícula.
[0120]El porcentaje de conjugado de lípido (por ejemplo, PEG-lípido) presente en las partículas lipídicas de la presente invención es una cantidad objetivo, y la cantidad real del conjugado de lípido presente en la formulación puede variar, por ejemplo, en ± 2 % en moles. Un experto en la técnica entenderá que la concentración del conjugado de lípido pueda variar dependiendo del conjugado de lípido utilizado y la velocidad a la que la partícula lipídica se vuelve fusogénica.
[0121]Controlando la composición y la concentración del conjugado de lípido, se puede controlar la velocidad a la que el conjugado de lípido intercambia la partícula lipídica y, a su vez, la velocidad a la que la partícula lipídica se vuelve fusogénica. Adicionalmente, se pueden utilizar otras variables que incluyen, por ejemplo, pH, temperatura o fuerza iónica, para variar y/o controlar la velocidad a la que la partícula lipídica se vuelve fusogénica. Para los expertos en la técnica serán evidentes otros procedimientos que se pueden utilizar para controlar la velocidad a la que la partícula lipídica se vuelve fusogénica tras la lectura de esta divulgación. También, mediante el control de la composición y la concentración del conjugado de lípido, se puede controlar el tamaño de partícula lipídica.
Composiciones y Formulaciones para Administración
[0122]Las composiciones de ácido nucleico-lípido de esta divulgación pueden administrarse por vías diferentes, por ejemplo, para realizar la administración sistémica a través de las vías intravenosa, parenteral, intraperitoneal o tópica. En algunas realizaciones, se puede administrar un ARNpi por la vía intracelular, por ejemplo, a células de un tejido diana, tal como pulmón o hígado, o a tejidos inflamados. En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona un procedimiento de administración de ARNpiin vivo.Una composición de ácido nucleico-lípido puede administrarse por la vía intravenosa, subcutánea o intraperitoneal a un sujeto. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona procedimientos de administraciónin vivode ARN interferente al pulmón de un sujeto mamífero.
[0123]En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un sujeto mamífero. Se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de esta divulgación que contiene un ácido nucleico, un lípido catiónico, una molécula anfifílica, un fosfolípido, colesterol, y colesterol enlazado con PEG a un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión o la sobreexpresión de un gen que se puede reducir, disminuir, regular negativamente o silenciar mediante la composición.
[0124]Las composiciones y los procedimientos de la divulgación pueden administrarse a sujetos mediante una variedad de modos de administración a la mucosa, que incluyen administración oral, rectal, vaginal, intranasal, intrapulmonar o transdérmica o dérmica o mediante administración tópica a los ojos, orejas, piel u otras superficies de mucosas. En algunos aspectos de esta divulgación, la capa de tejido de mucosa incluye una capa de células epiteliales. La célula epitelial puede ser pulmonar, traqueal, bronquial, alveolar, nasal, bucal, epidérmica o gastrointestinal. Las composiciones de esta divulgación pueden administrarse utilizando accionadores convencionales tales como dispositivos de pulverización mecánicos, así como presurizados, activados eléctricamente u otros tipos de accionadores.
[0125]Las composiciones de esta divulgación pueden administrarse en una solución acuosa como un pulverizador nasal o pulmonar y puede dispensarse en forma de pulverizador mediante una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. La administración pulmonar de una composición de esta divulgación se logra mediante la administración de la composición en forma de gotas, partículas o pulverizador, que puede estar, por ejemplo, aerosolizado, atomizado o nebulizado. Las partículas de la composición, pulverizador o aerosol pueden encontrarse en forma líquida o sólida. Los sistemas preferidos de dispensación de líquidos, tales como un pulverizador nasal, se dan a conocer en la Patente de EE. UU. N.°4.511.069. Tales formulaciones pueden prepararse de manera conveniente disolviendo las composiciones de acuerdo con la presente divulgación en agua para generar una solución acuosa y para hacer que dicha solución sea estéril. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes multidosis, por ejemplo, en el sistema de dispensación hermético divulgado en la Patente de EE. UU. N.° 4.511.069. Otros sistemas de administración por pulverización nasal adecuados se han descrito en TRANSDERMAL SYSTEMIC MEDICATION, Y. W. Chien ed., Elsevier Publishers, Nueva York, 1985; y en la Patente de EE. UU. número 4.778.810. Las formas de administración en aerosol adicionales pueden incluir, por ejemplo, nebulizadores de aire comprimido, de chorro, ultrasónicos y piezoeléctricos, que administran el agente activo biológicamente disuelto o suspendido en un disolvente farmacéutico, por ejemplo, agua, etano o mezclas de los mismos.
[0126]Las soluciones en pulverizador nasal y pulmonar de la presente divulgación comprenden típicamente el fármaco o el fármaco para ser administrado, opcionalmente formulado con un agente activo de superficie, tal como un tensoactivo no iónico (por ejemplo, polisorbato-80) y uno o más tampones. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la solución nasal en pulverizador comprende adicionalmente un propulsor. El pH de la solución nasal en pulverizador puede ser de pH 6,8 a 7,2. Los disolventes farmacéuticos utilizados pueden ser también un tampón acuoso ligeramente ácido de pH 4-6. Se pueden añadir otros componentes para potenciar o mantener estabilidad química, que incluyen conservantes, tensoactivos, dispersantes o gases.
[0127]En algunas realizaciones, esta divulgación es un producto farmacéutico que incluye una solución que contiene una composición de esta divulgación y un accionador para un pulverizador o aerosol pulmonar, mucoso o intranasal.
[0128]Una forma de dosificación de la composición de esta divulgación puede ser líquida, en forma de gotas o una emulsión, o en forma de un aerosol.
[0129]Una forma de dosificación de la composición de esta divulgación puede ser sólida, que puede reconstituirse en un líquido antes de su administración. El sólido puede administrarse como un polvo. El sólido puede estar en forma de una cápsula, comprimido o gel.
[0130]Para formular composiciones para la administración pulmonar dentro de la presente divulgación, el agente activo biológicamente puede combinarse con diferentes aditivos farmacéuticamente aceptables, así como con una base o portador para la dispersión del agente o agentes activos. Los ejemplos de aditivos incluyen agentes de control de pH, tales como arginina, hidróxido de sodio, glicina, ácido clorhídrico, ácido cítrico y mezclas de los mismos. Otros aditivos incluyen anestésicos locales (por ejemplo, alcohol bencílico), agentes isotonizantes (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol, sorbitol), inhibidores de adsorción (por ejemplo, Tween 80), agentes que potencian solubilidad (por ejemplo, ciclodextrinas y derivados de las mismas), estabilizadores (por ejemplo, albúmina de suero) y agentes reductores (por ejemplo, glutatión). Cuando la composición para la administración por mucosa es un líquido, la tonicidad de la formulación, medida con referencia a la tonicidad de una solución salina fisiológica al 0,9 % (p/v) tomada como unidad, se ajusta típicamente hasta un valor con el que no se induzca ningún daño sustancial, irreversible en la mucosa en el sitio de administración. De manera general, la tonicidad de la solución se ajusta hasta un valor de 1/3 a 3, más típicamente de 1/2 a 2 y lo más a menudo de 3/4 a 1,7.
[0131]El agente biológicamente activo puede dispersarse en una base o vehículo, que puede comprender un compuesto hidrofóbico que tiene capacidad de dispersar el agente activo y cualquier aditivo deseado. La base puede seleccionarse entre una amplia variedad de portadores adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, copolímeros de ácidos policarboxílicos o sales de los mismos, anhídridos carboxílicos (por ejemplo, anhídrido maleico) con otros monómeros (por ejemplo, (met)acrilato de metilo, ácido acrílico, etc.), polímeros de vinilo hidrófilos, tales como acetato de polivinilo, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, derivados de celulosa, tales como hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, etc., y polímeros naturales, tales como quitosano, colágeno, alginato de sodio, gelatina, ácido hialurónico y sales de metales no tóxicos de los mismos. A menudo, un polímero biodegradable se selecciona como una base o portador, por ejemplo, ácido poliláctico, copolímero de poli(ácido láctico-ácido glicólico), ácido polihidroxibutírico, copolímero de poli(ácido hidroxibutírico-ácido glicólico) y mezclas de los mimos. De manera alternativa o adicionalmente, los ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como ésteres de ácidos grasos de poliglicerina, ésteres de ácidos grasos de sacarosa, etc. pueden utilizarse como portadores. Los polímeros hidrófilos y otros portadores pueden utilizarse solos o en combinación y se puede transmitir integridad estructural potenciada al portador mediante cristalización parcial, enlazado iónico, reticulación y similares. Se puede suministrar el portador en una variedad de formas, que incluyen fluido o soluciones viscosas, geles, pastas, polvos, microesferas y películas de aplicación directa a la mucosa nasal. El uso de un portador seleccionado en este contexto puede dar lugar a una promoción de absorción del agente activo biológicamente.
[0132]Las formulaciones para la administración a través de la mucosa, nasal o pulmonar pueden contener un compuesto hidrófilo de bajo peso molecular como una base o un excipiente. Tales compuestos hidrófilos de bajo peso molecular proporcionan un medio de pasaje a través del cual un agente activo soluble en agua, tal como un péptido o una proteína activo fisiológicamente, puede difundirse a través de la base hasta la superficie corporal, donde se absorbe el agente activo. El compuesto hidrófilo de bajo peso molecular absorbe de manera opcional humedad de la mucosa o la atmósfera de administración y disuelve el péptido activo soluble en agua. El peso molecular del compuesto hidrófilo de bajo peso molecular generalmente no supera 10.000 y preferiblemente no es superior a 3.000. Los ejemplos de compuestos hidrófilos de bajo peso molecular incluyen compuestos de poliol, tales como oligo-, di- y monosacáridos que incluyen sacarosa, manitol, lactosa, L-arabinosa, D-eritrosa, D-ribosa, D-xilosa, D-manosa, D-galactosa, lactulosa, celobiosa, gentibiosa, glicerina, polietilenglicol y mezclas de los mismos. Ejemplos adicionales de compuestos hidrófilos de bajo peso molecular incluyen N-metilpirrolidona, alcoholes (por ejemplo, alcohol oligovinílico, etanol, etilenglicol, propilenglicol, etc.) y mezclas de los mismos.
[0133]Las composiciones de esta divulgación pueden contener de manera alternativa como portadores farmacéuticamente aceptables, según sea necesario, para aproximar condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH y agentes tamponadores, agentes de ajuste de tonicidad y agentes humectantes, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina y mezclas de los mismos. Para composiciones sólidas, se pueden utilizar portadores farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.
[0134]En determinadas realizaciones de la divulgación, el agente biológicamente activo puede administrarse en una formulación de liberación temporal, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. El agente activo puede prepararse con portadores que protegerán contra la liberación rápida, por ejemplo, un vehículo de liberación controlada, tal como polímero, sistema de administración microencapsulado o gel bioadhesivo. Se puede lograr la administración prolongada del agente activo en diferentes composiciones de la divulgación, incluyendo en la composición agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, hidrogeles de monoestearato de aluminio y gelatina.
Ejemplos
Ejemplo 1: Lípidos de ejemplo
[0135]Los compuestos de ejemplo de la fórmula I se proporcionan en la Tabla 1. La estructura del Compuesto se muestra en la primera columna. La denominación del compuesto se otorga de acuerdo con la fórmula I. El primer par de números indica el número de carbonos en el éster, que incluye el carbonilo, para L1 y L2; el par de números entre paréntesis indica el número de carbonos en cada ramificación del alquilo ramificado, R1 o si R2 también está ramificado, R1/R2 (un asterisco indica un doble enlace); se proporciona el número de carbonos en R3; y la última línea indica la sustitución para R4 y R5. El número ATX se proporciona como referencia en el presente documento. Se proporcionan los valores de LogD calculados (c-LogD) y los valores de pKa (c-pKa) calculados, así como pKa medido entre paréntesis (medido en un entorno de formulación). Los valores de c-LogD y c-pKa se generan mediante ACD
Labs Structure Designer v12.0. La bioactividad es el porcentaje del “knockdown” del Factor VII in vivo a una dosis de 0,03 mg/kg, a menos que se indique lo contrario.
Tabla 1
Ejemplo 2: Síntesis de ATX-0043 (Ejemplo de comparación)
[0136] La FIGURA 1 muestra la ruta sintética de ATX-0043 tal como se describe adicionalmente tal como se indica a continuación.
ATX-0043: Etapa 1
[0137]
[0138] En un matraz con fondo redondo de cuello único de 500 ml se recogieron 25 g de ácido hexanoico (SM 1;1 eq.) disuelto en diclorometano (DCM; 200 ml) y, a continuación, se añadieron lentamente a 27,6 ml de cloruro de oxalilo (1,5 eq.) a 0°C, con agitación bajo atmósfera de nitrógeno y, a continuación, se añadieron 0,5 ml de dimetilformamida (DMF; catalítica). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas.
[0139] En un matraz con fondo redondo de dos cuellos de 1 litro separado, a 31,4 g de clorhidrato de N,O-dimethilhidroxilamina (1,5 eq.) en DCM (200 ml), se le añadieron 89,8 ml de trietilamina (Et3N, 3 eq.) usando embudo adicional, se agitó a 0 °C. A esta solución resultante, se añadió el cloruro de ácido anterior, después de concentrarlo a presión reducida, en una atmósfera de nitrógeno disolviéndolo en DCM (100 ml), gota a gota usando un embudo de adición durante 20 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0140] El progreso de la reacción se controló mediante cromatografía en capa fina (CCF) (acetato de etilo (EtOAc) al 20 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se diluyó con agua (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con DCM (3 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida.
[0141] El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice 60-120; EtOAc al 10 %/hexano). Cantidad producida, 20,0 g; rendimiento, 58 %.
ATX-0043: Etapa 2
[0142]
[0143] A una solución de 33 g de bromuro de pentilmagnesio (1,5 eq.) en tetrahidrofurano (THF; 100 ml), tomada en un matraz de fondo redondo de dos bocas de 500 ml, agitada a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 20 g de una solución de N-metoxi-N-metil hexanamida (1 eq.) (disuelta en 200 ml de THF) y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0144] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (150 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida.
[0145] El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; EtOAc al 2 %/hexano). Cantidad producida, 15,0 g; rendimiento, 66 %.
ATX-0043: Etapa 3
[0146]
[0147] A una solución de 15 g de undecan-6-ona (1 eq.) disuelta en 25 ml de metanol (MeOH) en 150 ml de THF, se añadieron 4,9 g de borohidruro de sodio (1,5 eq.) a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas.
[0148] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (100 ml). El disolvente se eliminó a presión reducida y el producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (150 ml) y agua (150 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 14,0 g; rendimiento, 93 %.
ATX-0043: Etapa 4
[0149]
H° Y ^ NH2(Boc)2Q r HOy ^ ^ n .B cc
o o H
[0150] A una solución de 15 g de ácido 4-aminobutanoico (1 eq.) disuelta en 150 ml de THF, se le añadieron 145 ml de una solución acuosa de NaOH 1 N (1 eq.) a 0 °C, seguido de 43,4 ml de anhídrido Boc (1,3 eq.), de forma secuencial utilizando un embudos adicional, en un periodo de 15 minutos cada uno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0151] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (MeOH al 10 % en cloroformo (CHCh); Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con HCl al 5% (150 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (100 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un líquido gomoso. Cantidad producida, 20,0 g; rendimiento, 68 %.
ATX-0043: Etapa 5
[0152]
[0153] A una solución de 12 g de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico (1 eq.) disuelto en DCM (200 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 14,7 g de 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC).HCl (1,3 eq.), 10,6 ml de Et3N (1,3 eq.) y 0,72 g de 4-dimetilaminopiridina (DMAP; 0,1 eq.) secuencialmente en una atmósfera de nitrógeno con intervalos de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadió alcohol a la misma temperatura, disolviéndolo en DCM (50 ml), usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0154] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con agua (100 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 50 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (100 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml). La capa orgánica se concentró a presión reducida y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 8,5 g; rendimiento, 48 %.
ATX-0043: Etapa 6
[0155]
[0156] A una solución de 8,5 g de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato de undecan-6-ilo (1 eq.) disuelto en 70 ml de DCM, se le añadió ácido trifluoroacético (TFA; 10 eq.) a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas en atmósfera de nitrógeno.
[0157] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 70 %/hexano; Rf: 0,2). La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (150 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida.
[0158] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; MeOH/CHCl3 al 4 % y 1 ml de trietilamina) y se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 5,0 g; rendimiento, 33 % (respecto al alcohol).
ATX-0043: Etapa 7
[0159]
[0160] A una solución de 14 g de ácido 4-bromobutírico (1 eq.) disuelto en DCM (100 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 21 g de EDC.HCl (1,3 eq.), 15,2 ml de EtsN (1,3 eq.) y 1 g de DMAP (0,1 eq.) secuencialmente en atmósfera de nitrógeno con intervalos de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadieron 8,3 g de (Z)-non-2-en-1-ol (0,7 eq.), disolviéndolos en 50 ml de DCM, usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0161] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con agua (50 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 50 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (100 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida.
[0162] El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc/hexano al 5 %. Cantidad producida, 11,0 g; rendimiento, 64 %.
[0163]
[0164] A un matraz de fondo redondo de 250 ml, se añadieron 2 g de 4-aminobutanoato de undecan-6-ilo (1 eq.) y 2,2 g de 4-bromobutanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo (1 eq.) en DMF, se añadieron 1,2 g de carbonato potásico (1,2 eq.) y la mezcla resultante se sometió a reflujo a 90 °C durante 4 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0165] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (MeOH al 10% en CHCl3 ; Rf: 0,5). Se añadió agua helada a la masa de reacción y, a continuación, se extrajo con EtOAc y se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida.
[0166] El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) usando EtOAc/hexano al 15%. Se recuperaron los compuestos de amina y bromo de partida. Cantidad producida, 1,45 g; rendimiento, 40 %.
ATX-0043: Etapa 9
[0167]
[0168] A una solución de 1,45 g de 4-((4-oxo-4-(undecan-6-iloxi)butil)amino)butanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo (1 eq.) disuetlo en DCM anhidro, se añadieron 1,29 ml de trietilamina (3 eq.) y 360 mg de trifosgeno (0,4 eq.) con intervalos de 5 minutos a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno, durante 1 hora. La masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno.
[0169] A 360 mg de hidruro de sodio (5,5 eq.) disuelto en THF anhidro (20 ml), en un matraz de fondo redondo de 250 ml de 2 bocas, agitado a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno, se añadieron 2,1 g de clorhidrato de 2-(dimetilamino)etano-1-tiol (5,5 eq.) en THF (30 ml) y se mantuvo en agitación durante 5 minutos en atmósfera de nitrógeno. A esta solución resultante se le añadió lentamente el cloruro de carbonilo anterior disuelto en THF (50 ml) usando un embudo adicional durante aproximadamente 15 minutos, se añadió a esta solución resultante y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0170] La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (20 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (20 ml). Se separó la capa orgánica y se lavó la capa acuosa con EtOAc (2 x 20 ml). La capa orgánica combinada se concentró y el producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna. El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 60 %/Hex; Rf: 0,5; carbonización con PMA).
[0171] La purificación se realizó usando cromatografía en gel de sílice (malla 100-200; EtOAc al 18 %/hexano). Cantidad producida, 500 mg; rendimiento, 26 %; confirmado por 1H RMN; HPLC; y espectroscopia de masas (Masa).
[0172] ATX-0043/RL-43A: 1H-RMN (PPM, 400 MHz, CDCla): 8 = 5,63 (m, 1), 5,54 (m, 1), 4,87 (m, 1), 4,63 (d, J = 7,0, 2), 3,37 (s amplio, 4), 3,03 (t, J = 7,0, 2), 2,27 (s, 6), 2,22-2,32 (4), 2,09 (m, 2), 1,80- 1,90 (4), 1,45-1,55 (4), 1,20-1,40 (22), 0,83-0,92 (9).
Ejemplo 3: Síntesis de ATX-0057 (Ejemplo de comparación)
[0173] La figura 2 muestra la ruta sintética de ATX-0057 que se describe con más detalle a continuación.
ATX-0057: Etapa 1: N-metoxi-N-metiloctanamida
[0174]
[0175] En un matraz de fondo redondo de dos bocas y 2 litros, se tomó ácido octanoico (1 eq.) disuelto en DCM (300 ml) y, a continuación, se añadió 1,5 eq. cloruro de oxalilo lentamente a 0 °C, agitando en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. En un matraz de fondo redondo de dos bocas y 2 litros separado, a 2 eq. de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina en DCM (200 ml) se añadieron 3 eq. de trimetilamina usando un embudo adicional, se agitó a 0 °C. A esta solución resultante, se añadió el cloruro de ácido anterior, después de concentrarlo a presión reducida, en una atmósfera de nitrógeno disolviéndolo en DCM (150 ml), gota a gota usando un embudo de adición durante 20 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0176] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se diluyó con agua (250 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con DCM (3 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; EtOAc al 10 %/hexano). Cantidad producida, 85 g; rendimiento, 65 %.
ATX-0057: Etapa 2: hexadecano-8-ona
[0177]
[0178] A una solución de bromuro de octilmagnesio en THF ( 100 ml), tomada en un matraz de fondo redondo de dos bocas de 1 litro, agitada a 0°C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadió una solución de N-metoxi-N-metiloctanamida (disuelta en 200 ml de THF) y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0179] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (350 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60 120; EtOAc al 2 %/hexano). Cantidad producida, 65 g; rendimiento, 63 %.
ATX-0057: Etapa 3: hexadecano-8-ol
[0180]
[0181] A una solución de hexadecan-8-ona (1 eq.) disuelta en MeOH/THF, se le añadió 1 eq. de borohidruro de sodio a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas.
[0182] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (75 ml). Se extrajo el disolvente a presión reducida y el producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (150 ml) y agua (100 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 60 g; rendimiento, 91 %.
ATX-0057: Etapa 4: Ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico
[0183]
[0184] A una solución de ácido 4-aminobutanoico, disuelto en THF, se añadió una solución acuosa de NaOH 1 N a 0 °C, seguido de anhídrido de Boc, secuencialmente usando un embudo adicional, durante un período de 15 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0185] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 150 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un líquido gomoso. Cantidad producida, 80 g; rendimiento, 81 %.
ATX-0057: Etapa 5: 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato de hexadecan-8-ilo
[0186]
[0187] A una solución de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico, disuelto en DCM (200 ml), enfriada por debajo de 0°C, se le añadieron EDC.HCl, Et3N y 4-dimetilaminopiridina (DMAP), secuencialmente bajo atmósfera de nitrógeno con intervalos de 10 minutos. A esta solución resultante, se añadió 1 eq. de alcohol hexadecano-8-ol a la misma temperatura, disolviéndolo en DCM (150 ml), usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0188] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con agua (150 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (150 ml) y después se añadió EtOAc (200 ml). La capa orgánica se separó, se concentró a presión reducida y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 80 g (en bruto; compuesto requerido y alcohol).
ATX-0057: Etapa 6: 4-aminobutanoato de hexadecan-8-ilo
[0189]
[0190] A una solución de hexadecan-8-il-4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato, disuelto en DCM, se le añadió TFA a 0°C y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno. El progreso de la reacción se controló mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,3). La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (300 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 200 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; MeOH al 4 %/CHCl3 y 1 ml de trietilamina) y se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 40 g; rendimiento, 59 % para dos etapas; confirmado mediante Masas. ATX-0057: Etapa 7: 4-bromobutanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo
[0191]
[0192] A una solución de ácido 4-bromobutírico, disuelto en DCM (400 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadió EDC.HCl, Et3N y DMAP secuencialmente en una atmósfera de nitrógeno con intervalos de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadió (Z)-non-2-en-1-ol, disolviéndolo en 100 ml de DCM, usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0193] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 10%en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con agua (300 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 150 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (200 ml) y después se extrajo con EtOAc (150 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc al 5 %/hexano. Se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 27 g; rendimiento, 51 %.
ATX-0057: Etapa 8: (Z)-4-((4-(non-2-en-1-iloxi)-4-oxobutil)amino)butanoato de hexadecan-8-ilo
[0195] A una solución de 4-aminobutanoato de hexadecan-8-ilo, 4-bromobutanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo en acetonitrilo (ACN), se añadió carbonato de potasio y la mezcla resultante se sometió a reflujo a 90 °C durante 4 horas bajo atmósfera de nitrógeno. El progreso de la reacción se controló mediante CCF (MeOH al 10% en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se filtró, se lavó con ACN (20 ml) y el filtrado se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) usando EtOAc al 15 %/hexano. Se recuperaron los materiales de partida, compuestos de amina y bromo. Cantidad producida, 20 g; rendimiento, 40 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0057: Etapa 9
[0196]
[0197] A una solución de (Z)-4-((4-(non-2-en-1-iloxi)-4-oxobutil)amino)butanoato de hexadecan-8-ilo, disuelto en DCM anhidro, se le añadió trimetilamina y trifosgeno con intervalos de 5 minutos a 0 °C bajo atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno, durante 1 hora. La masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno.
[0198] A hidruro de sodio disuelto en THF anhidro (50 ml), en un matraz de fondo redondo de 100 ml de dos bocas agitado a 0°C en atmósfera de nitrógeno, se le añadió clorhidrato de 2-(dimetilamino)propano-1-tiol y se mantuvo agitando durante 5 minutos bajo atmósfera de nitrógeno. A esta solución resultante se añadió lentamente mediante una jeringa el cloruro de carbamoílo anterior, disuelto en THF (80 ml), durante aproximadamente 10 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0199] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAC al 60 %/hexano; Rf: 0,5; carbonización con PMA). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH44Cl (75 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (150 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 40 ml). La capa orgánica combinada se concentró y el producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna.
[0200] La primera purificación se realizó usando gel de sílice (malla 60-120). Se adsorbieron 22 g de compuesto en bruto en 60 g de gel de sílice y se vertieron sobre 500 g de gel de sílice recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 35 %/hexano. La segunda purificación se realizó utilizando alúmina neutra con disolventes de calidad HPLC. Se adsorbieron 7,5 g del compuesto en bruto en 18 g de alúmina neutra y el resultado se vertió sobre 130 g de alúmina neutra recogida en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 10 %/hexano. Rendimiento, 29 %; confirmado por 1H RMN, HPLC y masas.
[0201] ATX-0057/RL-43C: 1H-RMN (PPM, 400MHz, CDCla): 8 = 5,63 (m, 1), 5,51 (m, 1), 4,68 (m, 1), 4,83 (d , J = 7,0, 2), 3,19 (s amplio, 4), 3,22 (m, 2), 2,52 (m, 2), 2,23-2,37 (4), 2,18 (s, 6), 2,08 (m, 2), 1,84-1,93 (4), 1,46-1,54 (4), 1,20 1,40 (30), 0,83-0,91 (9).
Ejemplo 4: Síntesis de ATX-0058 (Ejemplo de comparación)
[0202] La figura 3 muestra la ruta sintética de ATX-0058 que se describe con más detalle a continuación.
ATX-0058: Etapa 1
[0203]
[0204] En un matraz de fondo redondo de dos bocas de 500 ml en atmósfera de N2, se recogieron 30 g de ácido 8-bromooctanoico (1 eq.) disueltos en 200 ml de DCM y, a continuación, se añadieron lentamente a 26,7 ml de cloruro de oxalilo (1,5 eq.) a 0°C, agitando bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas.
[0205] En un matraz de fondo redondo de dos bocas de 1 litro separado, a 40,5 g de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (2 eq.) en 300 ml de DCM se añadieron 87 ml de trimetilamina (3 eq.) agitados a 0 °C. A esta solución resultante, se añadió gota a gota el cloruro de ácido anterior después de concentrarlo a presión reducida, disolviéndolo en 500 ml de DCM, usando un embudo de adición durante 15 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0206] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se diluyó con agua (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida.
[0207] El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; EtOAc al 10 %/hexano). Cantidad producida, 28 g.
ATX-0058: Etapa 2
[0208]
[0209] A una solución de 28 g de bromuro de hexilmagnesio (1 eq.) en THF (100 ml), agitada a 0 °C en atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 36,8 g de N-metoxi-N-metiloctanamida (1,3 eq.) en 200 ml de THF y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas.
[0210] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (100 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida.
[0211] El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; acetato de etilo al 2 %/hexano). Cantidad producida, 24 g; rendimiento, 77 %.
ATX-0058: Etapa 3
[0212]
[0213] A una solución de 24 g de tetradecan-7-ona (1 eq.) disuelta en MeOH/THF, se le añadieron 4,27 g de borohidruro de sodio (1 eq.) a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0214] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (50 ml). El metanol se redujo a presión reducida. El producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (200 ml) y agua. Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 80 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 21,5 g; rendimiento, 89 %.
ATX-0058: Etapa 4
[0215]
[0216] A una solución de 20 g de ácido 4-aminobutanoico disuelto en 140 ml de THF, se le añadieron 196 ml de solución acuosa de NaOH 1 N a 0°C, seguido de 36,8 g de anhídrido Boc, usando un embudo. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0217] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCl3; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (100 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (200 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un líquido gomoso. Cantidad producida, 30 g; rendimiento, 76 %.
ATX-0058: Etapa 5
[0218]
[0219] A una solución de 10 g de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico (1 eq.) disuelto en DCM (150 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 12,2 g de EDC.HCl (1,3 eq.), 20,4 ml de Et3N (3 eq.) y 488 mg de DMAP (0,1 eq.) secuencialmente con un intervalo de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadió alcohol, disolviéndolo en DCM, usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0220] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con agua (100 ml) y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 50 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 y se añadió EtOAc (100 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 12,7 g (en bruto).
ATX-0058: Etapa 6
[0221]
[0222] A una solución de 12,5 g de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato de tetradecan-7-ilo (1 eq.) disuelto en 100 ml de DCM, se le añadieron 23,9 ml de TFA (10 eq.) a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno.
[0223] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCh ;Rf: 0,3). La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (100 ml) y se añadió EtOAc (100 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida.
[0224] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; MeOH al 4 %/CHCl3) y se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 7 g para dos etapas; rendimiento, 47 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0058: Etapa 7
[0225]
[0226] A una solución de 20 g de ácido 4-bromobutírico (1 eq.) disuelto en DCM (150 ml), enfriada a 0 °C, se le añadieron 1,5 eq. EDC.HCl, 3 eq. De Et3N y 0,1 eq.de DMAP secuencialmente con intervalo de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadieron 0,7 eq. de (Z)-non-2-en-1-ol disolviéndolo en 100 ml de DCM, usando un embudo, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0227] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con agua (100 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCOay se añadió EtOAc (150 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida.
[0228] El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; EtOAc al 5 %/hexano). Cantidad producida, 17 g; rendimiento, 69 %; confirmado por 1H RMN.
ATX-0058: Etapa 8
[0229]
[0230] A una solución de 6 g de 4-aminobutanoato de tetradecan-7-ilo (1 eq.), 5,8 g de 4-bromobutanoato de (Z)-non-2-en-1 -ilo (1 eq.) en ACN ( 125 ml), se añadieron 2,7 g de carbonato potásico (1,2 eq.) y el resultado se sometió a reflujo a 90 °C durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0231] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCl3; Rf: 0,5). La masa de reacción se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida.
[0232] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 100-200; EtOAc al 15 %/hexano). Cantidad producida, 4,5 g; rendimiento, 44 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0058: etapa 9
[0233]
[0234] A una solución de 4,4 g de 4-((4-oxo-4-(tetradecan-7-iloxi)butil)amino)butanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo (1 eq.) disuelto en 30 ml de DCM anhidro, se añadieron 0,83 ml de trimetilamina (3 eq.) y 418 mg de trifosgeno (0,5 eq.) con un intervalo de 5 minutos, a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno, durante 1 hora. La masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno.
[0235] A 192 mg de hidruro de sodio (10 eq.) disuelto en THF anhidro (25 ml), en un matraz de fondo redondo de 100 ml de dos bocas, se le añadieron 564 mg de clorhidrato de 2-(dimetilamino)propano-1-tiol (5 eq.) a 0 °C y se mantuvo en agitación durante 5 minutos en atmósfera de nitrógeno. A esta solución resultante se añadió lentamente mediante una jeringa el cloruro de carbamoílo anterior, disuelto en THF (35 ml), durante aproximadamente 10 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0236] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAC al 60 %/hexano; Rf: 0,5; carbonización con PMA). La masa de reacción se inactivó con NH4O saturado (30 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (100 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 50 ml). La capa orgánica combinada se concentró y el producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna.
[0237] Se realizó una primera purificación usando gel de sílice (malla 60-120). Se adsorbieron 5,0 g del compuesto en bruto en 9 g de gel de sílice y se vertieron sobre 90 g de gel de sílice recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 35 %/hexano. Se realizó una segunda purificación utilizando alúmina neutra con disolventes de calidad HPLC. Se adsorbieron 1,5 g del compuesto en bruto en 4 g de alúmina neutra y el resultado se vertió sobre 40 g de alúmina neutra recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 10 %/hexano. Cantidad producida, 1,2 g; rendimiento, 21 %; confirmado p o r1H RMN; HPLC; Masa.
[0238] ATX-0058/RL-43B: 1H-RMN (PPM, 400MHz, CDCla) : 8 = 5,65 (m, 1), 5,52 (m, 1), 4,86 (m, 1), 4,63 (d , J = 7,0, 2), 3,37 (s amplio, 4), 3,02 (t, J = 6,0, 2), 2,53 (t, J = 6,0, 2), 2,27-2,36 (4), 2,27 (s, 6) , 2,09 (m, 2), 1,83-1,96 (4), 1,46 1,54 (4), 1,20-1,40 (26), 0,84-0,91 (9).
Ejemplo 5: Síntesis de ATX-0081 (Ejemplo de comparación)
[0239] La figura 4 muestra la ruta sintética de ATX-0081 que se describe con más detalle a continuación.
ATX-0081: Etapa 1
[0240]
[0241] En un matraz de fondo redondo de dos bocas y 2 litros, se recogió ácido octanoico disuelto en DCM (200 ml) y, a continuación, se añadió 1,5 eq. cloruro de oxalilo lentamente a 0 °C, agitando en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. En un matraz de fondo redondo de dos bocas y 2 litros separado, a 2 eq. de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina en DCM (200 ml) se añadieron 3 eq. de trimetilamina usando un embudo adicional, se agitó a 0°C. A esta solución resultante, se añadió gota a gota el cloruro de ácido anterior, después de concentrarlo a presión reducida, en una atmósfera de nitrógeno disolviéndolo en DCM (150 ml), usando un embudo de adición durante 20 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0242] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se diluyó con agua (250 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con DCM (3 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; EtOAc al 10 %/hexano). Cantidad producida, 33 g; rendimiento, 84 %.
ATX-0081: Etapa 2
[0243]
[0244] A una solución de 22 g de bromuro de heptilmagnesio (1,5 eq.) en THF (100 ml), recogidos en un matraz de fondo redondo de dos bocas y 1 litro, agitada a 0 °C en atmósfera de nitrógeno, se le añadió N-metoxi-N-metiloctanamida (1 eq.) (disuelta en 200 ml de THF) y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0245] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (350 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60 120; EtOAc al 2 %/hexano). Cantidad producida, 22 g; rendimiento, 65 %.
ATX-0081: Etapa 3
[0246]
[0247] A una solución de 22 g de pentadecan-8-ona (1 eq.) disuelta en MeOH/THF, se le añadieron 1,5 eq. de borohidruro de sodio a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0248] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (75 ml). Se extrajo el disolvente a presión reducida y el producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (150 ml) y agua (100 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 20 g; rendimiento, 90 %.
ATX-0081: Etapa 4
[0249]
H° Y ^ Nh2(BockO „
o
[0250] A una solución de 50 g de ácido 4-aminobutanoico disuelto en 350 ml de THF, se añadieron 490 ml de una solución acuosa de NaOH 1 N a 0 °C, seguido de 140 ml de anhídrido Boc, secuencialmente usando un embudo adicional, durante un período de 15 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0251] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 150 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un líquido gomoso. Cantidad producida, 80 g; rendimiento, 81 %.
ATX-0081: Etapa 5
[0252]
[0253] A una solución de 10 g de acido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico, disuelto en DCM (250 ml), enfriada por debajo de 0°C, se le añadieron 1,3 eq. EDC.HCl, Et3N y 4-dimetilaminopiridina (DMAP), secuencialmente bajo atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 minutos. A esta solución resultante, se añadió 1 eq.de alcohol pentadecano-7-ol a la misma temperatura, disolviéndolo en DCM (150 ml), usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0254] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con agua (150 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3(150 ml) y después se añadió EtOAc (200 ml). La capa orgánica se separó, se concentró a presión reducida y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 8,5 g (bruto; compuesto requerido y alcohol).
ATX-0081: Etapa 6
[0255]
[0256] A una solución de 8,5 g de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato de pentadecan-8-ilo disueltos en 65 ml de DCM, se le añadieron 10 eq. de TFA a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno.
[0257] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,3). La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (300 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 200 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; MeOH al 4 %/CHCl3 y 1 ml de trietilamina) y se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 4 g para dos etapas; rendimiento, 25 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0081: Etapa 7
[0258]
[0259] A una solución de ácido 4-bromobutírico, disuelto en DCM (300 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadió EDC.HCl, Et3N y DMAP secuencialmente en una atmósfera de nitrógeno con intervalos de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadieron 20 g de (Z)-non-2-en-1-ol, disolviéndolos en 100 ml de DCM, usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0260] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con agua (300 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 150 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (200 ml) y después se extrajo con EtOAc (150 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc al 5 %/hexano. Se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 19 g; rendimiento, 55 %.
ATX-0081: Etapa 8
[0261]
[0262] A una solución de 4,5 g de 4-aminobutanoato de pentadecan-8-ilo, 1 eq. 4-bromobutanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo en 70 ml de acetonitrilo (ACN), se añadieron 1,4 eq. de carbonato potásico y la mezcla resultante se sometió a reflujo a 90 °C durante 4 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0263] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se filtró, se lavó con ACN (20 ml) y el filtrado se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) usando EtOAc al 15%/hexano. Se recuperaron los materiales de partida, compuestos de amina y bromo. Cantidad producida, 2,1 g; rendimiento, 27%; confirmado mediante Masas.
ATX-0081: Etapa 9
[0264]
[0265] A una solución de 2,1 g de (Z)-4-((4-(non-2-en-1-iloxi)-4-oxobutil)amino)butanoato de pentadecan-8-ilo, disueltos en 150 ml de DCM anhidro, se añadieron 3 eq. de trietilamina y trifosgeno con un intervalo de 5 minutos a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno, durante 1 hora. La masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno.
[0266] A 7 eq. de hidruro de sodio disuelto en THF anhidro (80 ml), en un matraz de fondo redondo de 100 ml de dos bocas agitado a 0°C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 3,5 eq. de clorhidrato de 2-(dimetilamino)propano-1-tiol y se mantuvo en agitación durante 5 minutos en atmósfera de nitrógeno. A esta solución resultante se añadió lentamente mediante una jeringa el cloruro de carbamoílo anterior, disuelto en THF (80 ml), durante aproximadamente 10 minutos. La solución resultante se agitó desde 0 °C hasta temperatura ambiente durante la noche en una atmósfera de nitrógeno.
[0267] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (EtOAC al 60 %/hexano; Rf: 0,5; carbonización con PMA). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NHaCl (75 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (150 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 40 ml). La capa orgánica combinada se concentró y el producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna.
[0268] La primera purificación se realizó usando gel de sílice (malla 60-120). El compuesto en bruto se adsorbió en 60 g de gel de sílice y se vertió sobre 500 g de gel de sílice recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 35 %/hexano. La segunda purificación se realizó utilizando alúmina neutra con disolventes de calidad HPLC. El compuesto en bruto se adsorbió en 18 g de alúmina neutra y el resultado se vertió sobre 130 g de alúmina neutra recogida en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 10 %/hexano. Cantidad producida, 1,5 g; rendimiento, 45 %; confirmado por 1H RMN, H<p>LC y masa.
[0269] ATX-0081/RL-48B: 1H-RMN (PPM, 500 MHz, CDCla): 8 = 5,64 (m, 1), 5,52 (m, 1), 4,86 (m, 1), 4,63 (d, J = 7,0, 2), 3,31-3,44 (4), 3,02 (t, J = 7,0, 2), 2,52 (t, J = 7,0, 2), 2,26-2,36 (4), 2,27 (s, 6 ), 2,10 (m, 2), 1,84-1,95 (4), 1,46-1,54 (4), 1,20-1,40 (26), 0,85-0,94 (9).
Ejemplo 6: Síntesis de ATX-0082
[0270] La figura 5 muestra la ruta sintética de ATX-0082 que se describe con más detalle a continuación.
ATX-0082: Etapa 1
[0271]
[0272] En un matraz de fondo redondo de dos bocas y 2 litros, se recogieron 30 g de ácido octanoico disueltos en DCM (200 ml) y, a continuación, se añadieron 1,5 eq. de cloruro de oxalilo lentamente a 0 °C, agitando en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. En un matraz de fondo redondo de dos bocas y 2 litros separado, a 2 eq. de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina en DCM (200 ml) se añadieron 3 eq. de trimetilamina usando un embudo adicional, se agitó a 0 °C. A esta solución resultante, se añadió gota a gota el cloruro de ácido anterior, después de concentrarlo a presión reducida, en una atmósfera de nitrógeno disolviéndolo en DCM (150 ml), usando un embudo de adición durante 20 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0273] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se diluyó con agua (250 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con DCM (3 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; EtOAc al 10 %/hexano). Cantidad producida, 33 g; rendimiento, 84 %.
ATX-0082: Etapa 2
[0274]
[0275] A una solución de bromuro de heptilmagnesio (1,5 eq.) en THF (100 ml), recogida en un matraz de fondo redondo de dos bocas y 1 litro, agitada a 0°C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 28 g de N-metoxi-N-metiloctanamida (1 eq.) (disuelta en 200 ml de THF) y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0276] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (350 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60 120; EtOAc al 2 %/hexano). Cantidad producida, 22 g; rendimiento, 65 %.
ATX-0082: Etapa 3
[0277]
[0278] A una solución de 22 g de pentadecan-8-ona (1 eq.) disuelta en MeOH/THF, se le añadieron 1,5 eq. de borohidruro de sodio a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0279] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (75 ml). Se extrajo el disolvente a presión reducida y el producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (150 ml) y agua (100 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 20 g; rendimiento, 90 %.
ATX-0082: Etapa 4
[0280]
H
H° Y ^ / NH2 (B0C>2° - H° Y ^ N'BOC
O o
[0281] A una solución de 15 g de ácido 4-aminobutanoico disuelto en 120 ml de THF, se añadieron 185 ml de una solución acuosa de NaOH 1 N a 0 °C, seguido de 50 ml de anhídrido Boc, secuencialmente usando un embudo adicional, durante un período de 15 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0282] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 150 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un líquido gomoso. Cantidad producida, 27 g; rendimiento, 85 %.
ATX-0082: Etapa 5
[0284] A una solución de 10 g de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico, disuelto en DCM (250 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 1,3 eq. de EDC.HCl, Et3N y 4-dimetilaminopiridina (DMAP), secuencialmente bajo atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 minutos. A esta solución resultante, se le añadió 1 eq. de alcohol pentadecano-7-ol a la misma temperatura, disolviéndolo en DCM (150 ml), usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0285] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con agua (150 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (150 ml) y después se añadió EtOAc (200 ml). La capa orgánica se separó, se concentró a presión reducida y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 8 g (en bruto; compuesto requerido y alcohol).
ATX-0082: Etapa 6
[0286]
[0287] A una solución de 8,0 g de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato de pentadecan-8-ilo disueltos en 60 ml de DCM, se le añadieron 10 eq. de TFA a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno.
[0288] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,3). La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (300 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 200 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; MeOH al 4 %/CHCh y 1 ml de trietilamina) y se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 4 g; rendimiento, 25 % para dos etapas; confirmado mediante Masas.
ATX-0082: Etapa 7
[0290] A una solución de ácido 4-bromobutírico, disuelto en DCM (400 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 1,5 eq. de EDC.HCl, 3 eq. de Et3N y DMAP secuencialmente bajo atmósfera de nitrógeno con intervalos de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadieron 20 g de (Z)-non-2-en-1-ol, disolviéndolos en 100 ml de DCM, usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0291] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con agua (300 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 150 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (200 ml) y después se extrajo con EtOAc (150 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc al 5 %/hexano. Se recuperó alcohol. Cantidad producida, 18 g; rendimiento, 55 %.
ATX-0082: Etapa 8
[0292]
[0293] A una solución de 4,0 g de 4-aminobutanoato de pentadecan-8-ilo, 1 eq. 4-bromobutanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo en 90 ml de ACN, se le añadió 1,4 eq. de carbonato potásico y la mezcla resultante se sometió a reflujo a 90 °C durante 4 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0294] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se filtró, se lavó con ACN (20 ml) y el filtrado se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) usando EtOAc al 15 %/hexano. Se recuperaron los materiales de partida (compuestos de amina y bromo). Cantidad producida, 2,2 g; rendimiento, 30 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0082: Etapa 9
[0295]
[0296] A una solución de 2,2 g de (Z)-4-((4-(non-2-en-1-iloxi)-4-oxobutil)amino)butanoato de pentadecan-8-ilo, disueltos en 25 ml de DCM anhidro, se añadieron 3 eq. de trietilamina y trifosgeno con un intervalo de 5 minutos a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno, durante 1 hora. La masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno.
[0297] A 7 eq. Hidruro de sodio disuelto en THF anhidro (100 ml), en un matraz de fondo redondo de 100 ml de dos bocas agitado a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno, se añadieron 3,5 eq. de clorhidrato de 2-(dimetilamino)propano-1-tiol y se mantuvo en agitación durante 5 minutos en atmósfera de nitrógeno. A esta solución resultante se añadió lentamente mediante una jeringa el cloruro de carbamoílo anterior, disuelto en THF (100 ml), durante aproximadamente 10 minutos. La solución resultante se agitó desde 0 °C hasta temperatura ambiente durante la noche en una atmósfera de nitrógeno.
[0298] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 60 %/hexano; Rf: 0,5; carbonización con PMA). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (75 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (150 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 40 ml). La capa orgánica combinada se concentró y el producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna.
[0299] La primera purificación se realizó usando gel de sílice (malla 60-120). El compuesto en bruto se adsorbió en 60 g de gel de sílice y se vertió sobre 500 g de gel de sílice tomados en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 35 %/hexano. La segunda purificación se realizó utilizando alúmina neutra con disolventes de calidad HPLC. El compuesto en bruto se adsorbió en 18 g de alúmina neutra y el resultado se vertió sobre 130 g de alúmina neutra recogida en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 10 %/hexano. Cantidad producida, 1,2 g; rendimiento, 43 %; confirmado por 1H RMN, H<p>LC y masa.
[0300] ATX-0082/RL-47A: 1H-RMN (PPM, 500 MHz, CDCla): 8 = 5,64 (m, 1), 5,52 (m, 1), 4,87 (m, 1), 4,62 ( d, J = 7,0, 2), 3,61 (t, J = 7,0, 2), 3,28-3,37 (2), 3,02 (t, J = 7,0, 2), 2,61 (m, 2), 2,52 (t, J = 7,0, 2), 2,31 (m, 2), 2,27 (s, 6), 2,10 (m, 2), 1,62-1,70 (6), 1,21-1,40 (32), 0,85-0,91 (9).
Ejemplo 7: Síntesis de ATX-0086
[0301] La figura muestra la ruta sintética de ATX-0086 que se describe con más detalle a continuación.
ATX-0086: Etapa 1
[0302]
[0303] En un matraz de fondo redondo de dos bocas y 2 litros, se recogieron 30 g de ácido octanoico disueltos en DCM (200 ml) y, a continuación, se añadieron 1,5 eq. de cloruro de oxalilo lentamente a 0 °C, agitando en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. En un matraz de fondo redondo de dos bocas y 2 litros separado, a 2 eq. de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina en DCM (200 ml) se añadieron 3 eq. de trimetilamina usando un embudo adicional, se agitó a 0 °C. A esta solución resultante, se añadió gota a gota el cloruro de ácido anterior, después de concentrarlo a presión reducida, en una atmósfera de nitrógeno disolviéndolo en DCM (150 ml), usando un embudo de adición durante 20 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0304] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se diluyó con agua (250 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con DCM (3 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; EtOAc al 10 %/hexano). Cantidad producida, 38 g; rendimiento, 84%; confirmado mediante Masas.
ATX-0086: Etapa 2
[0305]
[0306] Auna solución de bromuro de hexilmagnesio (1,5 eq.) en THF (100 ml), recogida en un matraz de fondo redondo de dos bocas y 1 litro, agitada a 0°C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 38 g de N-metoxi-N-metiloctanamida (1 eq.) (disuelta en 200 ml de THF) y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0307] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (350 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60 120; EtOAc al 2 %/hexano). Cantidad producida, 44 g; rendimiento, 65 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0086: Etapa 3
[0308]
[0309] A una solución de 44 g de tridecano-7-ona (1 eq.) disuelta en MeOH/THF, se le añadieron 1,5 eq. de borohidruro de sodio a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0310] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (75 ml). Se extrajo el disolvente a presión reducida y el producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (150 ml) y agua (100 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 40 g; rendimiento, 90 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0086: Etapa 4
[0311]
H° Y ^ Nh2(Boc)2Q r H O , ^ ^ n .B cc
o o H
[0312] A una solución de 50 g de ácido 4-aminobutanoico disuelto en 350 ml de THF, se le añadieron 490 ml de una solución acuosa de NaOH 1 N a 0 °C, seguido de 140 ml de anhídrido Boc, secuencialmente usando un embudo adicional, durante un período de 15 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0313] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 150 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un líquido gomoso. Cantidad producida, 80 g; rendimiento, 81 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0086: Etapa 5
[0314]
[0315] A una solución de 10 g de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico, disuelto en DCM (250 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 1,3 eq. de EDC.HCl, Et3N y 4-dimetilaminopiridina (DMAP), secuencialmente bajo atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 minutos. A esta solución resultante, se añadió 1 eq. de alcohol pentadecano-7-ol a la misma temperatura, disolviéndolo en DCM (150 ml), usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0316] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con agua (150 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3(150 ml) y después se añadió EtOAc (200 ml). La capa orgánica se separó, se concentró a presión reducida y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 8 g (en bruto; compuesto requerido y alcohol).
ATX-0086: Etapa 6
[0317]
[0318] A una solución de 8,0 g de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato de pentadecan-8-ilo disueltos en 60 ml de DCM, se le añadieron 10 eq. de TFA a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno.
[0319] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,3). La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (300 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 200 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; MeOH al 4 %/CHCl3 y 1 ml de trietilamina) y se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 3,5 g; rendimiento, 52 % para dos etapas; confirmado mediante Masas.
ATX-0086: Etapa 7
[0321] A una solución de ácido 4-bromobutírico, disuelto en DCM (400 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 1,5 eq. de EDC.HCl, 2 eq. de Et3N y DMAP secuencialmente bajo atmósfera de nitrógeno con intervalos de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadieron 20 g de (Z)-non-2-en-1-ol, disolviéndolos en 100 ml de DCM, usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0322] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con agua (300 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 150 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (200 ml) y después se extrajo con EtOAc (150 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc al 5 %/hexano. Se recuperó alcohol. Cantidad producida, 18 g; rendimiento, 55 %.
- : apa
[0323]
[0324] A una solución de 4,0 g de 4-aminobutanoato de tridecan-7-ilo, 1 eq. de 4-bromobutanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo en 90 ml de ACN, se añadieron 1,4 eq. de carbonato potásico y la mezcla resultante se sometió a reflujo a 90 °C durante 4 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0325] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se filtró, se lavó con ACN (20 ml) y el filtrado se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) usando EtOAc al 15%/hexano. Se recuperaron los materiales de partida, compuestos de amina y bromo. Cantidad producida, 2,2 g; rendimiento, 30 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0086: Etapa 9
[0326]
[0327] A una solución de 2,2 g de (Z)-4-((4-(non-2-en-1-iloxi)-4-oxobutil)amino)butanoato de tridecan-7-ilo, disueltos en 25 ml de DCM anhidro, se añadieron 3 eq. de trietilamina y trifosgeno con un intervalo de 5 minutos a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno, durante 1 hora. La masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno.
[0328] A 7 eq. de hidruro de sodio disuelto en THF anhidro (100 ml), en un matraz de fondo redondo de 100 ml de dos bocas agitado a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno, se añadieron 3,5 eq. de clorhidrato de 2-(dimetilamino)propano-1-tiol y se mantuvo en agitación durante 5 minutos en atmósfera de nitrógeno. A esta solución resultante se añadió lentamente mediante una jeringa el cloruro de carbamoílo anterior, disuelto en THF (100 ml), durante aproximadamente 10 minutos. La solución resultante se agitó desde 0 °C hasta temperatura ambiente durante la noche en una atmósfera de nitrógeno.
[0329] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAC al 60 %/hexano; Rf: 0,5; carbonización con PMA). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (75 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (150 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 40 ml). La capa orgánica combinada se concentró y el producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna.
[0330] La primera purificación se realizó usando gel de sílice (malla 60-120). El compuesto en bruto se adsorbió en 60 g de gel de sílice y se vertió sobre 500 g de gel de sílice recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 35 %/hexano. La segunda purificación se realizó utilizando alúmina neutra con disolventes de calidad HPLC. El compuesto en bruto se adsorbió en 18 g de alúmina neutra y el resultado se vertió sobre 130 g de alúmina neutra recogida en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 10 %/hexano. Cantidad producida, 1,2 g; rendimiento, 43 %; confirmado por 1H RMN, H<p>LC y masa.
[0331] ATX-0086/RL-48A: 1H-RMN (PPM, 500 MHz, CDCla): 8 = 5,64 (m, 1), 5,51 (m, 10, 4,87 (m, 1), 4,63 (d , J = 7,0, 2), 3,30-3,44 (4), 3,02 (t, J = 7,0, 2), 2,52 (t, J = 7,0, 2), 2,26-2,36 (4), 2,27 (s, 6) , 2,09 (m, 2), 1,82-1,96 (4), 1,46-1,54 (4), 1,21-1,40 (24), 0,84-0,91 (9).
Ejemplo 8: Síntesis de ATX-0087
[0332] LA figura 7 muestra la ruta sintética de ATX-0087 que implica nueve etapas.
ATX-0087: etapa 1
[0333]
[0334] En un matraz de fondo redondo de dos bocas y 2 litros, se recogieron 20 g de ácido octanoico disueltos en DCM (200 ml) y, a continuación, se añadieron 1,5 eq. de cloruro de oxalilo lentamente a 0 °C, agitando en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. En un matraz de fondo redondo de dos bocas y 2 litros separado, a 2 eq. de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina en DCM (200 ml) se añadieron 3 eq. de trimetilamina usando un embudo adicional, se agitó a 0°C. A esta solución resultante, se añadió gota a gota el cloruro de ácido anterior, después de concentrarlo a presión reducida, en una atmósfera de nitrógeno disolviéndolo en DCM (150 ml), usando un embudo de adición durante 20 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0335] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se diluyó con agua (250 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con DCM (3 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; EtOAc al 10 %/hexano). Cantidad producida, 20 g; rendimiento, 84 %.
ATX-0087: Etapa 2
[0336]
[0337] A una solución de bromuro de hexilmagnesio (1,5 eq.) en THF (100 ml), recogida en un matraz de fondo redondo de dos bocas y 1 litro, agitada a 0°C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 20 g de N-metoxi-N-metiloctanamida (1 eq.) (disuelta en 200 ml de THF) y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0338] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH44Cl (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (350 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60 120; EtOAc al 2 %/hexano). Cantidad producida, 25 g; rendimiento, 65 %.
ATX-0087: Etapa 3
[0339]
[0340] A una solución de 25 g de tridecano-7-ona (1 eq) disuelta en MeOH/THF, se le añadieron 1,5 eq. de borohidruro de sodio a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0341] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10%en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (75 ml). Se extrajo el disolvente a presión reducida y el producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (150 ml) y agua (100 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 22 g; rendimiento, 90 %.
ATX-0087: Etapa 4
[0342]
H° Y ^ Nh2(BochO r H O ^ ^ ^ ^ B c c
o o H
[0343] A una solución de 50 g de ácido 4-aminobutanoico disuelto en 350 ml de THF, se le añadieron 490 ml de una solución acuosa de NaOH 1 N a 0°C, seguido de 140 ml de anhídrido Boc, secuencialmente usando un embudo adicional, durante un período de 15 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 150 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un líquido gomoso. Cantidad producida, 80 g; rendimiento, 81 %.
ATX-0087: Etapa 5
[0345]
[0346] A una solución de 17 g de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico, disuelto en DCM (250 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 1,3 eq. de EDC.HCl, Et3N y 4-dimetilaminopiridina (DMAP), secuencialmente bajo atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 minutos. A esta solución resultante, se añadió 1 eq. de tridecano-7-ol a la misma temperatura, disolviéndolo en DCM (150 ml), usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0347] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con agua (150 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (150 ml) y después se añadió EtOAc (200 ml). La capa orgánica se separó, se concentró a presión reducida y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 15 g (en bruto; compuesto requerido y alcohol).
ATX-0087: Etapa 6
[0348]
[0349] A una solución de 15,0 g de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato de pentadecan-8-ilo disueltos en 80 ml de DCM, se le añadieron 10 eq. de TFA a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno.
[0350] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,3). La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (300 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 200 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; MeOH al 4 %/CHCl3 y 1 ml de trietilamina) y se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 7 g; rendimiento, 24 % para dos etapas; confirmado mediante Masas.
[0351]
[0352] A una solución de ácido 4-bromobutírico, disuelto en DCM (400 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 1,5 eq. de EDC.HCl, 2 eq. de Et3N y DMAP secuencialmente bajo atmósfera de nitrógeno con intervalos de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadieron 20 g de (Z)-non-2-en-1-ol, disolviéndolos en 100 ml de DCM, usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0353] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con agua (300 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 150 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (200 ml) y después se extrajo con EtOAc (150 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc al 5 %/hexano. Se recuperó alcohol. Cantidad producida, 19 g; rendimiento, 55 %.
ATX-0087: Etapas 8
[0355] A una solución de 4,0 g de 4-aminobutanoato de tridecan-7-ilo, 1 eq. de 4-bromobutanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo en 90 ml de ACN, se añadieron 1,4 eq. de carbonato potásico y la mezcla resultante se sometió a reflujo a 90 °C durante 4 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0356] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se filtró, se lavó con ACN (20 ml) y el filtrado se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) usando EtOAc al 15 %/hexano. Se recuperaron los materiales de partida, compuestos de amina y bromo. Cantidad producida, 2,2 g; rendimiento, 30 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0087: Etapa 9
[0357]
[0358] A una solución de 2,2 g de (Z)-4-((4-(non-2-en-1-iloxi)-4-oxobutil)amino)butanoato de tridecan-7-ilo, disueltos en 25 ml de DCM anhidro, se añadieron 3 eq. de trietilamina y trifosgeno con un intervalo de 5 minutos a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno, durante 1 hora. La masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno.
[0359] A 7 eq. de hidruro de sodio disuelto en THF anhidro (100 ml), en un matraz de fondo redondo de 100 ml de dos bocas agitado a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno, se añadieron 3,5 eq. de clorhidrato de 2-(dimetilamino)propano-1-tiol y se mantuvo en agitación durante 5 minutos en atmósfera de nitrógeno. A esta solución resultante se añadió lentamente mediante una jeringa el cloruro de carbamoílo anterior, disuelto en THF (100 ml), durante aproximadamente 10 minutos. La solución resultante se agitó desde 0 °C hasta temperatura ambiente durante la noche en una atmósfera de nitrógeno.
[0360] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 60 %/hexano; Rf: 0,5; carbonización con PMA). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (75 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (150 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 40 ml). La capa orgánica combinada se concentró y el producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna.
[0361] La primera purificación se realizó usando gel de sílice (malla 60-120). El compuesto en bruto se adsorbió en 60 g de gel de sílice y se vertió sobre 500 g de gel de sílice recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 35 %/hexano. La segunda purificación se realizó utilizando alúmina neutra con disolventes de calidad HPLC. El compuesto en bruto se adsorbió en 18 g de alúmina neutra y el resultado se vertió sobre 130 g de alúmina neutra recogida en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 10 %/hexano. Cantidad producida, 1,2 g; rendimiento, 43 %; confirmado por 1H RMN, Hp LC y masas.
[0362] ATX-0087/RL-48C: 1H-RMN (PPM, 500 MHz, CDCla): 8 = 5,64 (m, 1), 5,52 (m, 1), 4,87 (m, 1), 4,63 (d, 7,0, 2), 3,30-3,44 (4), 3,02 (t, J = 7,0, 2), 2,52 (t, J = 7,0, 2), 2,26-2,36 (4), 2,27 (s, 6), 2,09 (m, 2), 1,83-1,96 (4), 1,46-1,54 (4), 1,21-1,40 (32), 0,85-0,90 (9).
Ejemplo 9: Síntesis de ATX-0088 (Ejemplo de comparación)
[0363] La figura 8 muestra la ruta sintética de ATX-0088 que se describe con más detalle a continuación.
-[0364]
[0365] En un matraz de fondo redondo de dos bocas de 500 ml en atmósfera de N2, se recogieron 25 g de ácido 8-bromooctanoico (1 eq.) disueltos en 200 ml de DCM y, a continuación, se añadieron lentamente a cloruro de oxalilo, 1,5 eq., a 0° C, agitando bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas.
[0366] En un matraz de fondo redondo de dos bocas de 1 litro separado, a 2 eq. de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina en 300 ml de DCM se añadieron 3 eq. de trimetilamina y se agitó a 0 °C. A esta solución resultante, se añadió gota a gota el cloruro de ácido anterior después de concentrarlo a presión reducida, disolviéndolo en 500 ml de DCM, usando un embudo de adición durante 15 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0367] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se diluyó con agua (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida.
[0368] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; EtOAC al 10 %/hexano). Cantidad producida, 21 g; rendimiento, 66 %.
ATX-0088: Etapa 2
[0369]
[0370] A una solución de 1,3 eq. de bromuro de octilmagnesio en THF (100 ml), se agitó a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno, se añadieron 20 g de N-metoxi-N-metiloctanamida en 100 ml de THF y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0371] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (100 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida.
[0372] El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; acetato de etilo al 2 %/hexano). El rendimiento cuantitativo fue de 17,4 g; 68 %.
ATX-0088: Etapa 3
[0373]
[0374] A una solución de 17 g de hexadecan-7-ona (1 eq.) disuelta en 135 ml de MeOH/THF, se le añadieron 1,5 eq. de borohidruro de sodio a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0375] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (50 ml). El metanol se redujo a presión reducida. El producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (200 ml) y agua. Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 80 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 14,5 g; rendimiento, 85 %.
[0376]
[0377] A una solución de 50 g de ácido 4-aminobutanoico disueltos en 350 ml de THF, se le añadieron 490 ml de solución acuosa de NaOH 1 N a 0 °C, seguido de 140 ml de anhídrido Boc, usando un embudo. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0378] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCl3; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (100 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (200 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un líquido gomoso. Cantidad producida, 80 g; rendimiento, 81 %.
ATX-0088: Etapa 5
[0379]
[0380] A una solución de 1 eq. de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico disuelto en DCM (200 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se añadieron 3 eq. de EDC.HCl, Et3N (3 eq.) y DMAP (0,1 eq.) secuencialmente con intervalo de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadió alcohol, disolviéndolo en DCM, usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0381] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con agua (100 ml) y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 50 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 y se añadió EtOAc (100 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 19 g (bruto).
ATX-0088: Etapa 6
[0382]
[0383] A una solución de 19 g de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato de hexadecan-7-ilo (1 eq.) disueltos en 140 ml de DCM, se le añadieron 10 eq. de TFA a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno.
[0384] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCl3; Rf: 0,3). La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (100 ml) y se añadió EtOAc (100 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida.
[0385] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; MeOH al 4 %/CHCl3) y se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 9,4 g; rendimiento, 50 % para dos etapas; confirmado mediante Masas.
ATX-0088: Etapa 7
[0386]
[0387] A una solución de 30 g de ácido 4-bromobutírico (1 eq.) disueltos en DCM (500 ml), enfriada a 0 °C, se le añadieron 1,5 eq. de EDC.HCl, 3 eq. de Et3N y 0,1 eq. de DMAP secuencialmente con intervalo de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadieron 0,7 eq. de (Z)-non-2-en-1-ol disolviéndolo en 100 ml de DCM, usando un embudo, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0388] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con agua (100 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 y se añadió EtOAc (150 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida.
[0389] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; EtOAc al 5 %/hexano). Cantidad producida, 27 g; rendimiento, 51 %; confirmado p o r1H RMN.
ATX-0088: Etapa 8
[0390]
[0391] A una solución de 6 g de 4-aminobutanoato de hexadecan-8-ilo (1 eq.), 1 eq.5 de 4-bromobutanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo en ACN (70 ml), se añadieron 1,2 eq. de carbonato potásico y el resultado se sometió a reflujo a 90 °C durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0392] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida.
[0393] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 100-200; EtOAc al 15 %/hexano). Cantidad producida, 4,5 g; rendimiento, 44 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0088: Etapa 9
[0394]
[0395] A una solución de 4,4 g de 4-((4-oxo-4-(tetradecan-7-iloxi)butil)amino)butanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo (1 eq.) disueltos en 30 ml de DCM anhidro, se añadieron 0,83 ml de trimetilamina (3 eq.) y 418 mg de trifosgeno (0,5 eq.) con un intervalo de 5 minutos, a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno, durante 1 hora. La masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno.
[0396] A 192 mg de hidruro sódico (10 eq.) disueltos en THF anhidro (25 ml), en un matraz de fondo redondo de 100 ml y dos bocas, se le añadieron 564 mg de 3-(dietilamino)propano-1-tiol (5 eq.) a 0 °C y se mantuvo en agitación durante 5 minutos en atmósfera de nitrógeno. A esta solución resultante se añadió lentamente mediante una jeringa el cloruro de carbamoílo anterior, disuelto en THF (35 ml), durante aproximadamente 10 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0397] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAC al 60 %/hexano; Rf: 0,5; carbonización con PMA). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (30 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (100 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 50 ml). La capa orgánica combinada se concentró y el producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna.
[0398] Se realizó una primera purificación usando gel de sílice (malla 60-120). Se adsorbieron 5,0 g del compuesto en bruto en 9 g de gel de sílice y se vertieron sobre 90 g de gel de sílice recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 35 %/hexano. Se realizó una segunda purificación utilizando alúmina neutra con disolventes de calidad HPLC. Se adsorbieron 1,5 g del compuesto en bruto en 4 g de alúmina neutra y el resultado se vertió sobre 40 g de alúmina neutra recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 10 %/hexano. Cantidad producida, 1,2 g; rendimiento, 21 %; confirmado p o r1H RMN; HPLC; Masas.
[0399] ATX-0088/RL-48D: 1H-RMN (PPM, 500 MHz, CDCla): 8 = 5,64 (m, 1), 5,51 (m, 1), 4,87 (m, 1), 4,63 (d, J = 7,0, 2), 3,30-3,44 (4), 2,90 (t, J = 7,0, 2), 2,46-2,55 (6), 2,26-2,37 (4), 2,09 (m, 2), 1,71- 1,80 (4), 1,46-1,55 (4), 1,21-1,41 (32), 1,01 (t, J = 7,0, 6), 00,85-0,91 (9).
Ejemplo 10: Síntesis de ATX-0083 (Ejemplo de comparación)
[0400] La figura 9 muestra la ruta sintética de ATX-0083 que se describe con más detalle a continuación.
ATX-0083: Etapa 1
[0401]
[0402] En un matraz de fondo redondo de una sola boca de 500 ml, se recogieron 50 g de ácido octanoico (1 eq.) disueltos en DCM (200 ml) y, a continuación, se añadieron 44,6 ml de cloruro de oxalilo (1,5 eq.) lentamente a 0 °C mediante un embudo adicional, agitando bajo atmósfera de nitrógeno y, a continuación, se añadió 1 ml de DMF (catalítico). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas.
[0403] En un matraz de fondo redondo de dos bocas, 2 litros, separado, a 67,4 g de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (2 eq.) en DCM (300 ml), se le añadieron 144 ml de trietilamina (3 eq.) usando un embudo adicional, se agitó a 0 °C. A esta solución resultante, se añadió gota a gota el cloruro de ácido anterior, después de concentrarlo a presión reducida, en una atmósfera de nitrógeno disolviéndolo en DCM (350 ml), usando un embudo de adición durante 20 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0404] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,5; carbonización con PMA). La masa de reacción se diluyó con agua (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con DCM (3 x 100 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida.
[0405] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc/hexano al 10 %. Cantidad producida, 55,0 g; rendimiento, 84 %
[0406]
[0407] A una solución de 55 g de bromuro de heptilmagnesio (1 eq.) en éter, recogida en un matraz de fondo redondo de dos bocas de 2 litros, agitado a 0°C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 89,6 g de una solución de N-metoxi-N-metiloctanamida (1,5 eq.) disueltos en 400 ml de éter anhidro y la solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0408] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7; carbonización de PMA). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (250 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con éter (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida.
[0409] El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc al 2 %/hexano. Cantidad producida, 50,0 g; rendimiento, 75 %.
ATX-0083: Etapa 3
[0410]
[0411] A una solución de 50 g de pentadecan-8-ona (1 eq.) disueltos en 290 ml de MeOH/THF, se le añadieron 12,5 g de borohidruro de sodio (1,5 eq.) a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente. temperatura durante 2 horas.
[0412] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5; carbonización con PMA). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (80 ml). Se extrajo el disolvente a presión reducida y el producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (250 ml) y agua (100 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 80 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro, se concentró a presión reducida y se secó al vacío para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 46,0 g; rendimiento, 90 %.
ATX-0083: Etapa 4
[0413]
h° Y ^ ^ N H2(BockO , H O s ^ /s ^ /s .N„Bcc
O O H
[0414] A una solución de 50 g de ácido 4-aminobutanoico (1 eq.) disueltos en THF, se le añadieron 490 ml de solución acuosa de NaOH 1 N (1 eq.) a 0 °C, seguido de 140 ml de anhídrido Boc (1,3 eq.), secuencialmente utilizando un embudo adicional, durante un período de 15 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0415] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (350 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 150 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida para obtener un líquido gomoso. Cantidad producida, 77,0 g; rendimiento, 78 %.
ATX-0083: Etapa 5
[0416]
[0417] La síntesis se realizó en 4 lotes. En cada uno, a una solución de 23 g de ácido 4-((tercbutoxicarbonil)amino)butanoico (1 eq.) en DCM (400 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se añadieron 32,3 g de EDC.HCl (1,5 eq.), 47 ml de Et3N (3 eq.) y 1,3 g de DMAP (0,1 eq.) secuencialmente en atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 min. A esta solución resultante se le añadieron 20 g de pentadecan-8-ol (0,77 eq.), disolviéndolo en DCM (200 ml), usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0418] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,4). La masa de reacción se inactivó con agua (250 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. Este producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (150 ml) y se le añadió EtOAc (250 ml). La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida y, a continuación, se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 105 g (en bruto; compuesto requerido y alcohol)
ATX-0083: Etapa 6
[0419]
[0420] A una solución de 105 g de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato de pentadecan-8-ilo (1 eq.) disueltos en 450 ml de DCM, se le añadieron 194 ml de TFA (10 eq.) a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno.
[0421] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,3).
[0422] La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se agitó con una solución saturada de NaHCO3 (200 ml) durante 10 minutos y, a continuación, con EtOAc (300 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida.
[0423] El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 60-120) usando MeOH/CHCl3 al 4 % y 1 ml de trietilamina. Cantidad producida, 60,0 g para dos etapas; rendimiento, 54 %.
ATX-0083: Etapa 7
[0424]
[0425] La reacción se realizó en dos lotes. En cada uno, a una solución de 20 g de ácido 6-bromohexanoico (1 eq.) disueltos en DCM (300 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 29,3 g de EDC.HCl (1,5 eq.), 42,8 ml de Et 3 N (3 eq.) y 1,2 g de DMAP (0,1 eq.) secuencialmente bajo atmósfera de nitrógeno con intervalos de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadieron 14,5 g de (Z)-non-2-en-1-ol (1 eq.) (disolviéndolos en 100 ml de DCM) usando un embudo adicional y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0426] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con agua (200 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con solución saturada de NaHCO3 (150 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 150 ml). La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida.
[0427] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc al 4 %/hexano. Se recuperó el reactivo alcohol. Cantidad producida, 36,0 g; rendimiento, 55 %.
ATX-0083: Etapa 8
[0428]
[0429] La reacción se realizó en seis lotes. En cada uno, a una solución de 10 g de 4-aminobutanoato de pentadecan-8-ilo (Int 6, 1 eq.), 10,1 g de 6-bromohexanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo (Int 7, 1 eq.) en 120 ml de ACN, se añadieron 6,1 g de carbonato potásico anhidro (1,4 eq.) y la mezcla resultante se sometió a reflujo a 90°C durante 4 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0430] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se filtró, se lavó con ACN (2 x 20 ml) y el filtrado se concentró a presión reducida.
[0431] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) usando EtOAc/hexano al 20-80 %. Se recuperaron los materiales de partida. Cantidad producida, 36,9 g; rendimiento, 35 %.
ATX-0083: Etapa 9
[0432]
[0433] La reacción se realizó en tres lotes. En cada uno, a una solución de 10 g de 6-((4-oxo-4-(pentadecan-8-iloxi)butil)amino)hexanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo (1 eq.) disueltos en 100 ml de DCM anhidro, se añadieron 7,5 ml de trietilamina (3 eq.) y 2,68 g de trifosgeno (0,5 eq.) con intervalos de 5 minutos a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno, durante 1 hora. La masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno.
[0434] A una suspensión de 3 g de hidruro de sodio (7 eq.) en THF anhidro (100 ml), en un matraz RB de 500 ml de 2 bocas agitado a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 8,9 g de clorhidrato de 2-(dimetilamino) etano-1-tiol (3,5 eq.) y se mantuvo en agitación durante 5 minutos en atmósfera de nitrógeno. A esta solución resultante se añadió lentamente mediante una jeringa el cloruro de carbamoílo anterior, disuelto en THF anhidro(200 ml), durante aproximadamente 10 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche en una atmósfera de nitrógeno.
[0435] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10%/hexano; Rf: 0,5; carbonización con PMA). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (100 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (350 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 80 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida.
[0436] Se realizó una primera purificación usando alúmina neutra. Se cargó el compuesto en bruto, disuelto en hexano, en la parte superior de alúmina neutra (700 g cargados en la columna). El compuesto se eluyó con EtOAc al 8-10%/hexano. Se realizó una segunda purificación usando gel de sílice (malla 100-200). Se cargó el compuesto, disuelto en hexano, en la parte superior de gel de sílice (se cargaron 500 g en la columna). El compuesto se eluyó con EtOAc al 20-25 %/hexano. El compuesto final (disuelto en hexano) se sometió a un tratamiento con carbón (200 mg/g) y se filtró a través de un lecho de celite (después de agitar durante 20 minutos), y, a continuación, se pasó a través de un filtro de membrana con extremo de jeringa (PTFE; 0,2 micrómetros, 25 mm de diámetro). El filtrado resultante se concentró a presión reducida. Cantidad producida, 15,5 g; rendimiento, 41 %.
[0437] ATX-0083/RL-47B: 1H-RMN (PPM, 500 MHz, CDCla): 8 = 5,64 (m, 1), 5,52 (m, 1), 4,87 (m, 1), 4,62 (d, J = 7,0, 2), 3,24-3,42 (4), 3,02 (t, J = 7,0, 2), 2,53 (t, J = 7,0, 2), 2,26-2,34 (4), 2,26 (s, 6 ), 2,10 (m, 2), 1,45-1,70 (6), 1,20-1,41 (34), 0,84-0,92 (9).
Ejemplo 11: Síntesis de ATX-0084
[0438] La figura 10 muestra la ruta sintética de ATX-0084 que se describe con más detalle a continuación.
ATX-0084: Etapa 1
[0439]
[0440] En un matraz de fondo redondo de una sola boca de 500 ml, se recogieron 30 g de ácido heptanoico (1 eq.) disueltos en DCM (200 ml) y, a continuación, se añadieron 26,7 g de cloruro de oxalilo (1,5 eq.) lentamente a 0 °C, agitando bajo atmósfera de nitrógeno y, a continuación, se añadió 1 ml de DMF (catalítico). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas.
[0441] En un matraz de fondo redondo de dos bocas de 1 litro separado, a 40,5 g de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (2 eq.), en DCM (250 ml), se le añadieron 86,6 ml de trimetilamina (3 eq.) usando un embudo adicional, se agitó a 0°C. A esta solución resultante, se añadió gota a gota el cloruro de ácido anterior, después de concentrarlo a presión reducida, en una atmósfera de nitrógeno disolviéndolo en DCM (100 ml), usando un embudo de adición durante 20 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0442] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se diluyó con agua (250 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con DCM (3 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida.
[0443] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice 60-120) usando EtOAc/hexano al 10 %. Cantidad producida, 38,0 g; rendimiento, 84 %.
ATX-0084: Etapa 2
[0444]
[0445] A una solución de 8 g de bromuro de hexilmagnesio (1 eq.) en 250 ml de éter anhidro, recogida en un matraz de fondo redondo de dos bocas de 1 litro, agitada a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 2,3 g de N-metoxi-N-metilheptanamida (0,5 eq.) disueltos en 250 ml de éter y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0446] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (200 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con éter (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida.
[0447] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc al 2 %/hexano. Cantidad producida, 30,8 g; rendimiento, 71 %.
ATX-0084: Etapa 3
[0448]
[0449] A una solución de 30 g de tridecan-7-ona (1 eq.) disueltos en 200 ml de MeOH/THF, se le añadieron 8,5 g de borohidruro de sodio (0,5 eq.) a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas.
[0450] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (80 ml). Se extrajo el disolvente a presión reducida y el producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (200 ml) y agua (100 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 70 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 27,2 g; rendimiento, 90 %.
ATX-0084: Etapa 4
[0451]
[0452] A una solución de 5 g de ácido 6-aminohexanoico (1 eq.), disueltos en 120 ml de THF, se le añadieron 125 ml de solución acuosa de NaOH 1 N a 0 °C, seguido de 34 ml de anhídrido Boc (1,3 eq.), secuencialmente utilizando un embudo adicional, durante un período de 15 min. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0453] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (100 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (150 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un líquido gomoso. Cantidad producida, 22,4 g; rendimiento, 85 %.
ATX-0084: Etapa 5
[0454]
[0455] A una solución de 10 g de ácido 6-((terc-butoxicarbonil)amino)hexanoico (1 eq.) disueltos en DCM (200 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 10,7 g de EDC.HCl (1,3 eq.), 18 ml de EtsN (3 eq.) y 525 mg de DMAP (0,1 eq.) secuencialmente en atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadieron 6 g de tridecan-7-ol (Int 3, 0,7 eq.) a la misma temperatura, disolviéndolos en DCM (50 ml), usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0456] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,4). La masa de reacción se inactivó con agua (150 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 75 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con una solución saturada de NaHCO3(100 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 8,5 g (bruto; compuesto requerido y alcohol).
ATX-0084: Etapa 6
[0457]
[0458] A una solución de 10 g de 6-((terc-butoxicarbonil)amino)hexanoato de tridecan-7-ilo (1 eq.) disueltos en 65 ml de DCM, se le añadieron 18,5 ml de TFA (10 eq.) a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno.
[0459] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCI3; Rf: 0,3). La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con solución saturada de NaHCO3 (100 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida.
[0460] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; MeOH/CHCl3 al 4 % y 1 ml de trietilamina) y se recuperó el material de partida de alcohol. Cantidad, 4,5 g en dos etapas; rendimiento, 33 %.
ATX-0084: Etapa 7
[0461]
[0462] A una solución de 20 g de ácido 6-bromohexanoico (1 eq.) disueltos en DCM (300 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 29,3 g de EDC.HCl (1,5 eq.), 42,8 ml de EtsN (3 eq.) y 1,2 g de Dm AP (0,1 eq.) secuencialmente en atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 minutos. A esta solución resultante se le añadieron 14,5 g de (Z)-non-2-en-1-ol (1 eq.), disueltos en 100 ml de DCM, usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0463] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7). La masa de reacción se inactivó con agua (200 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con solución saturada de NaHCO3(150 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 150 ml). La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida.
[0464] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc al 4 %/hexano. Se recuperó el material de partida de alcohol. Cantidad producida, 18,0 g; rendimiento, 55 %.
ATX-0084: Etapa 8
[0465]
[0466] A una solución de 4,5 g de 6-aminohexanoato de tridecan-7-ilo (Int 6, 1 eq.) y 4,5 g de 6-bromohexanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo (Int 7, 1 eq.) en 90 ml de ACN, se añadieron 2,7 g de carbonato potásico (1,4 eq.) y la mezcla resultante se sometió a reflujo a 90 °C durante 4 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0467] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5). La masa de reacción se filtró, se lavó con ACN (2 x 20 ml) y el filtrado se concentró a presión reducida.
[0468] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) usando EtOAc/hexano al 20 %. Se recuperaron los materiales de partida. Cantidad producida, 3,0 g; rendimiento, 37 %.
ATX-0084: Etapa 9
[0469]
[0470] Se disolvió en una solución de 2,5 g de 6-((6-oxo-6-(tridecan-7-iloxi)hexil)amino)hexanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo (1 eq.) en 30 ml de DCM anhidro, se añadieron 1,8 ml de trietilamina (3 eq.) y 672 mg de trifosgeno (0,5 eq.) con un intervalo de 5 minutos a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno durante 1 hora. La masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno.
[0471] A una suspensión de 761 mg de hidruro sódico en THF anhidro (50 ml), en un matraz de fondo redondo de 250 ml de 2 bocas, agitado a 0°C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 2,2 g de clorhidrato de 2-(dimetilamino)etano-1-tiol (3,5 eq.) y se mantuvo en agitación durante 5 minutos en atmósfera de nitrógeno. A la solución resultante se añadió lentamente mediante una jeringa el cloruro de carbamoílo anterior, disuelto en THF (60 ml), durante aproximadamente 10 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche en una atmósfera de nitrógeno.
[0472] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10%/hexano; Rf: 0,5; carbonización con PMA). La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4Cl (60 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (130 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 40 ml). La capa orgánica combinada se concentró y el producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna.
[0473] Se realizó una primera purificación usando gel de sílice (malla 100-200). Se adsorbieron 4,6 g del compuesto en bruto en 10,0 g de gel de sílice y se vertieron sobre 90,0 g de gel de sílice recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 50 %/hexano. Se realizó una segunda purificación utilizando alúmina neutra con disolventes de calidad HPLC. Se adsorbieron 2,0 g del compuesto en bruto en 6,0 g de alúmina neutra y el resultado se vertió sobre 40,0 g de alúmina neutra recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 20 %/hexano. Cantidad producida, 1,2 g; rendimiento, 38 % (mezcla de 300 mg).
[0474] ATX-0084/RL-47C: 1H-RMN (PPM, 500 MHz, CDCla): 8 = 5,64 (m, 1), 5,52 (m, 1), 4,86 (m, 1), 4,62 (d, J = 7,0, 2), 3,22-3,35 (4), 3,01 (t, J = 7,0, 2), 2,53 (t, J = 7,0, 2), 2,25-2,34 (4), 2,27 (s, 6 ), 2,10 (m, 2), 1,45-1-73 (10), 1,20 1,40 (30), 00,84-0,91 (9).
Ejemplo 12: Síntesis de ATX-0061 (Ejemplo de comparación)
[0475] La figura 11 muestra la ruta sintética de ATX-0061 que se describe con más detalle a continuación
ATX-0061: Etapa 1
[0476]
[0477] Se disolvieron 12 g de éster de glicina (1 eq.) en THF (100 ml) y se enfriaron por debajo de 0 °C. A esta solución, se añadieron secuencialmente 24,2 ml de trietilamina (1,5 eq.) y 38,11 g de anhídrido Boc (1,5 eq.) a través de un embudo adicional.
[0478] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF usando EtOAc al 50 %/hexano; Rf: 0,4.
[0479] La masa de reacción se inactivó con agua y se añadió EtOAc (100 ml), después de 16 horas. Se separó la capa orgánica, se lavó la capa acuosa con EtOAc (2 x 40 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida.
[0480] El producto en bruto se sometió a gel de sílice 60-120 (25% EtOAc/hexano). Cantidad producida, 20,8; rendimiento, 88 %.
ATX-0061: Etapa 2
[0481]
[0482] A una solución de 18,9 g de éster de glicina N-Boc (1 eq.) disueltos en THF (130 ml) se le añadió una solución acuosa de 5,85 g de LiOH (1,5 eq.) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0483] La reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 60 %/hexano; Rf: 0,3), El material de partida está ausente.
[0484] Se concentró la masa de reacción y se inactivó la masa en bruto con HCl al 5 % (pH 3) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (4 x 80 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida para obtener el compuesto. Cantidad producida, 15 g; rendimiento, 92 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0061: Etapa 3
[0485]
[0486] A una solución de 5 g de éster de glicina N-Boc (Int 1, 1 eq.) disueltos en DCM (30 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 4,5 ml de Et3N (1,2 eq.) y 6,44 g de EDC.HCl (1,2 eq.). A esta solución de reacción se le añadieron 5,12 g de heptaden-9-ol (0,7 eq.) en 20 ml de DCM y se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
[0487] Se observó que el material de partida estaba ausente mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,6). La masa de reacción se diluyó con solución saturada de NaHCO3, se separó la capa orgánica, se lavó la capa acuosa con DCM (2 x 30 ml) y se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida. Se procedió a la siguiente etapa con crudo (6,8 g; mezcla de producto y alcohol).
ATX-0061: Etapa 4
[0488]
[0489] Se disolvieron 4 g de (terc-butoxicarbonil)glicinato de heptadecan-9-ilo (Int 2, 1 eq.) en DCM (40 ml) y se enfriaron a 0 °C, se añadieron 7,4 ml de TFA (10 eq.) y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0490] Se comprobó la finalización de la reacción en 2 horas mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,5).
[0491] La masa de reacción se concentró a presión reducida, la masa residual se lavó con solución saturada de bicarbonato de sodio (30 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 30 ml), la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida para obtener Int 3.
[0492] El producto en bruto se sometió a cromatografía en columna (sílice, 60-120) usando MeOH/CHCh al 1-3 % y 2 ml de Et3N. Cantidad producida, 1 g; confirmado por 1H-RMN y masas.
- : apa
[0493]
[0494] A una solución de 4 g de ácido bromoacético (1 eq.) disueltos en DCM (35 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 4,7 ml de Et3N (1,2 eq.) y 354 mg de DMAP (0,1 eq.), seguido de 13,23 g de HATU (1,2 eq.). A esta solución de reacción se le añadieron 2,88 g de (Z)-non-2-en-1-ol (0,7 eq.) en 20 ml de DCM y se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
[0495] La reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,7).
[0496] Se diluyó la masa de reacción con solución saturada de NaHCO3 (80 ml), se separó la capa orgánica, se lavó la capa acuosa con DCM (40 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida. La masa residual se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (60-120) (EtOAc al 1,5 %/hexano). Cantidad producida, 4 g; rendimiento, 52 %.
ATX-0061: Etapa 6
[0497]
[0498] Se disolvió 1 g de glicinato de heptadecan-9-ilo (Int 3, 1 eq.) en THF (25 ml), se añadieron 0,5 ml de TEA (1,3 eq.) y 1,08 g de derivado de 2-bromoacetato de (Z)-non-2-en-1-ilo (Int 4, 1,3 eq.), y se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
[0499] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,4). La mezcla de reacción se diluyó con agua (30 ml) y se extrajo con EtOAc (20 ml x 2), la capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida.
[0500] La masa residual se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice; 100-200) (EtOAc al 2 %/hexano). Cantidad producida, 700 mg; rendimiento, 47 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0061: Etapa 7
[0501]
[0502] A una solución de 700 mg de (Z)-(2-(non-2-en-1-iloxi)-2-oxoetil)glicinato) de heptadecan-9-ilo (1 eq.) disueltos en 15 ml de DCM, enfriada por debajo de 5 °C, se añadieron 0,4 ml de Et3N (3 eq.), seguido de 209 mg de trifosgeno (0,5 eq.) en porciones durante 10 minutos.
[0503] Se controló el progreso de la mezcla de reacción mediante CCF, la reacción se completó durante 0,5 horas, la masa de reacción se concentró a presión reducida.
[0504] A una solución de 423 mg de clorhidrato de N,N-dimetiletanotiol (3 eq.) en THF anhidro (10 ml) y DMF (3 ml), agitada a 0°C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 144 mg de hidruro de sodio (6 equivalentes). Después de 10 minutos, a esta masa de reacción se añadió la solución anterior, disolviéndola en THF (15 ml). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0505] Se observó la finalización de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCl3; Rf: 0,5), después de 1 hora.
[0506] La masa de reacción se inactivó con solución saturada de NH4Cl (20 ml), agua (20 ml) y se añadió EtOAc (30 ml). La capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 20 ml) y la capa orgánica combinada se lavó con solución acuosa saturada de cloruro sódico (20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida.
[0507] El producto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando gel de sílice (100-200) con EtOAC al 15%/hexano, y, a continuación, con alúmina neutra con EtOAc al 15%/hexano, para obtener el compuesto puro. Cantidad producida, 520 mg; rendimiento, 58 %; confirmado por 1H-RMN, HPLC y masas.
[0508] ATX-0061/RL-42D: 1H-RMN (PPM, 400MHz, CDCla): 8 = 5,67 (m, 1), 5,51 (m, 1), 4,92 (m, 1), 4,70 (m , 2), 4,16 4,27 (4), 3,07 (m, 2), 2,53 (m, 2), 2,27 (s, 6), 2,10 (m, 2), 1-47-1,57 (4), 1,19- 1,40 (32), 0,83-0,92 (9).
Ejemplo 13: Síntesis de ATX-0063 (Ejemplo de comparación)
[0509] La figura 12 muestra la ruta sintética de ATX-0063 que se describe con más detalle a continuación.
ATX-0063: Etapa 1
[0510]
[0511] Se disolvieron 12 g de éster de glicina (1 eq.) en THF (100 ml) y se enfriaron por debajo de 0°C. A esta solución, se añadieron secuencialmente 24,2 ml de trietilamina (1,5 eq.) y 38,11 g de anhídrido Boc (1,5 eq.) a través de un embudo adicional.
[0512] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF usando EtOAc al 50 %/hexano; Rf: 0,4.
[0513] La masa de reacción se inactivó con agua y se añadió EtOAc (100 ml), después de 16 horas. Se separó la capa orgánica, se lavó la capa acuosa con EtOAc (2 x 40 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida.
[0514] El producto en bruto se sometió a gel de sílice 60-120 (25% EtOAc/hexano). Cantidad producida, 20,8; rendimiento, 88 %.
ATX-0063: Etapa 2
[0515]
[0516] A una solución de 18,9 g de éster de glicina N-Boc (1 eq.) disueltos en THF (130 ml) se le añadió una solución acuosa de 5,85 g de LiOH (1,5 eq.) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0517] La reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 60 %/hexano; Rf: 0,3), el material de partida estaba ausente del producto de reacción.
[0518] La masa de reacción se concentró y la masa en bruto se inactivó con HCl al 5 % (pH 3) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (4 x 80 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida para obtener el compuesto. Cantidad producida, 15 g; rendimiento, 92 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0063: Etapa 3
[0519]
[0520] A una solución de 5 g de éster de glicina N-Boc (Int 1, 1 eq.), disueltos en DCM (50 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 4,5 ml de Et3N (1,2 eq.) y 6,4 g de EDC.HCl (1,2 eq.). A esta solución de reacción se le añadieron 3,4 g de undecan-6-ol (0,7 eq.) en 20 ml de DCM y se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
[0521] Se observó que el material de partida estaba ausente mediante CCF (EtOAc al 15 %/hexano; Rf: 0,6). La masa de reacción se diluyó con una solución saturada de NaHCO3 (20 ml), la capa orgánica se separó, la capa acuosa se lavó con DCM (2 x 40 ml) y se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida. Se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto (5,5 g; mezcla de producto y alcohol), después de filtración en columna.
ATX-0063: Etapa 4
[0522]
[0523] Se disolvieron 3,3 g de (terc-butoxicarbonil)glicinato de undecan-6-ilo en bruto (Int 2, 1 eq.) en DCM (20 ml) y se enfriaron a 0 °C, se añadieron 7,6 ml de TFA (10 eq.) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0524] Se comprobó la finalización de la reacción en 2 horas mediante CCF (MeOH al 10 %/DCM; Rf: 0,5). La masa de reacción se concentró a presión reducida, la masa residual se lavó con solución saturada de bicarbonato de sodio (50 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 25 ml), la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida para obtener Int 3.
[0525] El producto en bruto se sometió a cromatografía en columna (sílice, 60-120) usando MeOH/CHCh al 1-3 % y 2 ml de EtaN. Cantidad producida, 1,2 g; rendimiento, 40 %; confirmado por 1H-RMN y masas.
ATX-0063: Etapa 5
[0526]
[0527] A una solución de 4 g de ácido bromoacético (1 eq.) disueltos en DCM (35 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 4,7 ml de Et3N (1,2 eq.) seguido de 13,23 g de HATU (1,2 eq.) y 354 mg de DMAP (0,1 eq.). A esta solución de reacción se le añadieron 2,88 g de (Z)-non-2-en-1-ol (0,7 eq.) en 20 ml de DCM y se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
[0528] La reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,7).
[0529] La masa de reacción se diluyó con solución saturada de NaHCO3 (80 ml), se separó la capa orgánica, se lavó la capa acuosa con DCM (40 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida. La masa residual se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (60-120) (EtOAc al 1,5 %/hexano). Cantidad producida, 4 g; rendimiento, 52 %.
ATX-0063: Etapa 6
[0531] Se disolvieron 1,2 g de glicinato de undecan-6-ilo (Int 3, 1 eq.) en 25 ml de THF, se añadieron 0,9 ml de TEA (l,3 eq.) y 1,37 g de 2-bromoacetato de (Z)-non-2-en-1-ilo (Int 4, 1 eq.), y se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
[0532] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,5). La mezcla de reacción se diluyó con agua (30 ml) y se extrajo con EtOAc (20 ml x 2), la capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida.
[0533] La masa residual se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice; 100-200) (EtOAc al 3 %/hexano). Cantidad de producto, 800 mg; rendimiento, 37 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0063: Etapa 7
[0534]
[0535] A una solución de 800 mg de (2-oxo-2-(undecan-6-iloxi)etil)glicinato de (Z)-non-2-en-1-ilo (1 eq.) disueltos en DCM, enfriada por debajo de 5 °C, se añadieron 0,4 ml de Et3N (3 eq.), seguido de 209 mg de trifosgeno (0,5 eq.) en porciones durante 10 minutos.
[0536] El progreso de la mezcla de reacción se controló mediante CCF, la reacción se completó durante 1 hora, la masa de reacción se concentró a presión reducida.
[0537] A una solución de 423 mg de clorhidrato de N,N-dimetiletanotiol (3 eq.) en THF y DMF anhidros (10 ml y 5 ml, respectivamente), agitada a 0°C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 144 mg de hidruro de sodio (6 eq.). Después de 10 minutos, a esta masa de reacción se añadió la solución anterior, disolviéndola en THF. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0538] Se observó la finalización de la reacción mediante CCF (EtOAc al 70 %/hexano; Rf: 0,4), después de 1 hora . La masa de reacción se inactivó con solución saturada de NH4Cl (25 ml), agua (20 ml) y se añadió EtOAc (20 ml). La capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 20 ml) y la capa orgánica combinada se lavó con solución acuosa saturada de cloruro sódico (20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida.
[0539] El producto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando gel de sílice (100-200) con EtOAc al 20 %/hexano, y, a continuación, con alúmina neutra con EtOAc al 5 %/hexano, para obtener el compuesto puro. Cantidad producida, 510 mg; rendimiento, 48 %; confirmado por 1H-RMN, HPLC y masas.
[0540] ATX-0063/RL-42A: 1H-RMN (PPM, 400MHz, CDCl3): 5 = 5,67 (m, 1), 5,52 (m, 1), 4,92 (m, 1), 4,70 (m , 2), 4,15 4,27 (4), 3,06 (m, 2), 2,53 (m, 2), 2,27 (s, 6), 2,09 (m, 2), 1,47-1,57 (4), 1,20-1,41 ( 20), 0,82-0,92 (9).
Ejemplo 14: Síntesis de ATX-0064 (Ejemplo de comparación)
[0541] La figura 13 muestra la ruta sintética de ATX-0064 que se describe con más detalle a continuación.
[0542]
[0543] Se disolvieron 12 g de glicinato de etilo (1 eq.) en THF (100 ml) y se enfriaron por debajo de 0°C. A esta solución resultante, se añadieron secuencialmente 24,2 ml de trietilamina (1,5 eq.) y 38,11 g de anhídrido Boc (1,5 eq.) a través de un embudo adicional.
[0544] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF usando EtOAc al 50 %/hexano; Rf: 0,4.
[0545] La masa de reacción se inactivó con agua y se añadió EtOAc (100 m), después de 16 horas. Se separó la capa orgánica, se lavó la capa acuosa con EtOAc (2 x 40 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida.
[0546] El producto en bruto se sometió a gel de sílice 60-120 (25% EtOAc/hexano). Cantidad producida, 20,8; rendimiento, 88 %.
ATX-0064: Etapa 2
[0547]
[0548] A una solución de 18,9 g de éster de glicina N-Boc (1 eq.) disueltos en THF (130 ml) se le añadió una solución acuosa de 5,85 g de LiOH (1,5 eq.) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0549] La reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 60 %/hexano; Rf: 0,3), el material de partida estaba ausente del producto de reacción.
[0550] Se concentró la masa de reacción y se inactivó la masa bruta con HCl al 5 % (pH 3) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (4 x 80 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida para obtener el compuesto. Cantidad producida, 15 g; rendimiento, 92 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0064: Etapa 3
[0551]
[0552] A una solución de 5 g de éster de glicina N-Boc (Int 1, 1 eq.), disueltos en DCM (50 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 4,5 ml de Et3N (1,2 eq.) y 6,4 g de EDC.HCl (1,2 eq.). A esta solución de reacción se le añadieron 4,84 g de hexadecan-10-ol (0,7 eq.) en 15 ml de DCM y se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
[0553] Se observó que el material de partida estaba ausente mediante CCF (EtOAc al 15 %/hexano; Rf: 0,6). La masa de reacción se diluyó con solución saturada de NaHCO3, se separó la capa orgánica, se lavó la capa acuosa con DCM (2 x 30 ml) y se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida.
[0554] Se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto (5,5 g; mezcla de producto y alcohol) después de la filtración en columna.
[0555]
[0556] Se disolvieron 3,85 g de (terc-butoxicarbonil)glicinato de heptadecan-9-ilo en bruto (Int 2, 1 eq.) en 30 ml de DCM y se enfriaron a 0 °C, se añadieron 7,4 ml de TFA (10 eq.) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0557] Se comprobó la finalización de la reacción en 2 horas mediante CCF (MeOH al 10 %/DCM; Rf: 0,5).
[0558] La masa de reacción se concentró a presión reducida, la masa residual se lavó con solución saturada de bicarbonato de sodio (30 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 30 ml), la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida para proporcionar Int 3.
[0559] El producto en bruto se sometió a cromatografía en columna (sílice, 60-120) usando MeOH al 1-3 %/CHCl3 y 2 ml de Et3N. Cantidad producida, 2,2 g; confirmado por 1H-RMN y masas.
ATX-0064: Etapa 5
[0561] A una solución de 4 g de ácido bromoacético (1 eq.) disueltos en DCM (35 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 4,7 ml de Et3N (1,2 eq.), seguido de 13,23 g de HATU (1,2 eq.) y 354 mg de DMAP (0,1 eq.). A esta solución de reacción se le añadieron 2,88 g de (Z)-non-2-en-1-ol (0,7 eq.) en 20 ml de DCM y se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
[0562] La reacción se controló mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,7).
[0563] La masa de reacción se diluyó con solución saturada de NaHCO3 (80 ml), se separó la capa orgánica, se lavó la capa acuosa con DCM (40 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida.
[0564] La masa residual se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (60-120) (EtOAc al 1,5 %/hexano). Cantidad producida, 4 g; rendimiento, 52 %.
ATX-0064: Etapa 6
[0565]
[0566] Se disolvieron 2,1 g de glicinato de hexadecan-8-ilo (Int 3, 1 eq.) en 50 ml de THF, se añadieron 1,2 ml de TEA (1,3 eq.) y 2,39 g de 2-bromoacetato de (Z)-non-2-en-1-ilo (int 4, 1,3 eq.), y se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
[0567] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,5). La mezcla de reacción se diluyó con agua (30 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 30 ml), la capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida.
[0568] La masa residual se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice; 100-200) (EtOAc al 3 %/hexano). Cantidad producida, 2,2 g; rendimiento, 65 %; confirmado mediante Masas.
ATX-0064: Etapa 7
[0569]
[0570] A una solución de 2,2 g de (Z)-(2-(non-2-en-1-iloxi)-2-oxoetil)glicinato) de heptadecan-9-ilo (1 eq.) disueltos en 15 ml de DCM, enfriada por debajo de 5 °C, se añadieron 1,6 ml de Et3N (3 eq.), seguido de 678 mg de trifosgeno (0,5 eq.) en porciones durante 10 minutos.
[0571] Se controló el progreso de la mezcla de reacción mediante CCF, la reacción se completó durante 1 hora, la masa de reacción se concentró a presión reducida.
[0572] A una solución de 3,94 g de clorhidrato de N,N-dimetiletanotiol (7 eq.) en THF y DMF anhidros (35 ml y 15 ml, respectivamente), agitada a 0°C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 672 mg de hidruro de sodio (7 eq.). Después de 10 minutos, a esta masa de reacción se le añadió la solución anterior, disolviéndola en THF. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
[0573] Se observó la finalización de la reacción mediante CCF (EtOAc al 70 %/hexano; Rf: 0,4), después de 1 hora. La masa de reacción se inactivó con solución saturada de NH4Cl (25 ml), agua (20 ml) y se añadió EtOAc (20 ml). La capa acuosa se lavó con EtOAc (20 ml x 2) y la capa orgánica combinada se lavó con solución acuosa saturada de cloruro sódico (20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4y se concentró a presión reducida.
[0574] El producto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando gel de sílice (100-200) con EtOAc al 25 %/hexano, y, a continuación, con alúmina neutra con EtOAc al 15-20 %/hexano, para obtener el compuesto puro. Cantidad producida, 1,0 mg; rendimiento, 40 %; confirmado por 1H-RMN, HPLC y masas.
[0575] ATX-0064/RL-42C: 1H-RMN (PPM, 400MHz, CDCh): 5 = 5,67 (m, 1), 5,50 (m, 1), 4,92 (m, 1), 4,70 (t , J = 7,0, 2), 3,06 (, m, 2), 2,53 (m, 2), 2,27 (s, 6), 1,47-1,57 (4), 1,17-1,40 (30), 0,82-0,93 (9).
Ejemplo 15: Síntesis de ATX-0081
[0576] La figura 14 muestra la ruta sintética de ATX-0081 que se describe con más detalle a continuación.
ATX-0081: Etapa 1
[0577]
[0578] A una solución de bromuro de heptilmagnesio en 370 ml de THF anhidro (generado in situ) (1,5 eq.), enfriada a -15 °C en atmósfera de nitrógeno, se añadió gota a gota formiato de etilo disuelto en 80 ml de THF (0,5 eq.) mediante un embudo de adición durante 20 min, y la mezcla de reacción resultante se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante la noche.
[0579] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,5).
[0580] La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NHaCl (500 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 100 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida.
[0581] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna sobre gel de sílice (malla 60-120) usando EtOAc/Hex al 20 %. Cantidad producida, 169,0 g; rendimiento 60 %.
ATX-0081: Etapa 2
[0582]
H0^ ^ N H2(BocfcO r H O ^ ^ ^ n .Boc
o o H
[0583] A una solución de 100 g de ácido 4-aminobutanoico (1 eq.) en THF se le añadió una solución acuosa de NaOH 1 N (1,065 litros) (1,1 eq.) en un baño de hielo, seguido de 1,3 eq. de anhídrido Boc, secuencialmente usando un embudo de adición durante un período de 15 min. La solución resultante se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 4 horas.
[0584] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCl3; Rf: 0,5).
[0585] La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (1 litro) y, a continuación, se añadió EtOAc (300 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con EtOAc (3 x 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para obtener un líquido gomoso.
[0586] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna sobre gel de sílice (malla 60-120) usando EtOAc/Hex al 80-100 %. Cantidad producida, 161,0 g; rendimiento, 82 %.
ATX-0081: Etapa 3
[0587]
[0588] A una solución de 3 x 17,8 g de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico en DCM (350 ml) (1 eq.), enfriada en un baño de hielo, se le añadieron 2 x 25,1 g de EDC.HCl (1,5 eq), Et3N (2,0 eq.) y 3 x 1,0 g D<m>A<p>(0,1 eq) secuencialmente en atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 min. A esta solución resultante se le añadieron gota a gota 3 x 20,0 g de alcohol (1,0 eq.) (en 150 ml de DCM) mediante un embudo adicional, a la misma temperatura, y la masa de reacción resultante se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 24 horas bajo atmósfera de nitrógeno.
[0589] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en Hex; Rf: 0,5).
[0590] La masa de reacción se inactivó con agua (450 ml) y la capa orgánica se separó. La capa acuosa se lavó con DCM (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida. El producto en bruto resultante se agitó con una solución saturada de NaHCO3 (300 ml), durante 5 min, y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml). La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida, y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 69,0 g (en bruto; compuesto requerido y alcohol);
ATX-0081: Etapa 4
[0591]
[0592] A una solución de 69,0 g de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato de pentadecan-8-ilo (1 eq.) disueltos en DCM, se le añadió TFA (10 eq.) en un baño de hielo y la solución de la reacción resultante se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0593] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,3). La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con solución saturada de NaHCO3 (450 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida.
[0594] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; MeOH al 4 %/CHCl3 y 1 ml de trietilamina) y se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 47,0 g; rendimiento, 57 % para dos etapas.
- : apa
[0595]
[0596] A una solución de 50,0 g de ácido 4-bromobutírico en DCM (450 ml) (1,0 eq.), recogida en un matraz RB de 2 litros, enfriado por debajo de 0 °C, se le añadieron 86,0 g de EDC.Hc I (1,5 eq. ), 83,3 ml de Et3N (2,0 eq.) y 3,6 g de DMAP (0,1 eq.) secuencialmente en atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 min. A esta solución resultante se le añadieron 42,5 g de alcohol (1,0 eq.) (disolviéndolos en 200 ml de DCM) usando un embudo adicional y la solución resultante se calentó hasta temperatura ambiente y se agitó durante 24 h en una atmósfera de nitrógeno.
[0597] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en Hex; Rf: 0,7).
[0598] La masa de reacción se inactivó con agua (250 ml) y la capa orgánica se separó. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 150 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con solución saturada de NaHCO3 (150 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (2 x 150 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida.
[0599] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna sobre gel de sílice (gel de sílice de malla 60 120) usando EtOAc/Hex al 5 %. Cantidad producida, 55,0 g; rendimiento, 63 %.
ATX-0081: Etapa 6
[0601] A una solución de 2 x 20,0 g de 4-aminobutanoato de pentadecan-8-ilo (1 eq.), 2 x 18,5 g de 4-bromobutanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo (1 eq.) en 180 ml de ACN, se añadieron 2 x 17,6 g de carbonato potásico (2 eq.) y la mezcla resultante se sometió a reflujo a 70 °C durante 5 h en una atmósfera de nitrógeno.
[0602] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCh; Rf: 0,4). La masa de reacción se filtró, se lavó con ACN (2 x 20 ml) y el filtrado se concentró a presión reducida.
[0603] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) usando EtOAc al 30 %/Hex. Se recuperó el material de partida (amina). Cantidad producida, 24,0 g; rendimiento, 36 %.
- : apa
[0604]
[0605] A una solución de 24,0 g de 4-((4-oxo-4-(pentadecan-8-iloxi)butil)amino)butanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo (1 eq.), disueltos en 250 ml de DCM anhidro, se añadieron 13,5 g de trifosgeno (1 eq.) y se enfrió la mezcla de reacción a 0 °C y se añadieron gota a gota 18,4 ml de piridina (5 eq.) durante un período de 10 min. La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 4 h.
[0606] Se extrajo el DCM a presión reducida y la mezcla se recogió con piridina (300 ml). Después de enfriar hasta 0 °C, se añadieron en porciones 32,3 g de sal clorhidrato de dimetilaminoetanotiol (5 eq.) y la solución resultante se agitó durante una noche a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno.
[0607] La masa de reacción, después de comprobar mediante CCF, se concentró a presión reducida hasta sequedad. A este residuo se le añadieron 250 ml de EA y 200 ml (10 %) de ácido cítrico. La fase orgánica se separó y, a continuación, la capa orgánica se lavó nuevamente con ácido cítrico al 10 % (100 ml) una vez y nuevamente con solución acuosa saturada de cloruro sódico al 10% (200 ml) una vez. La capa orgánica resultante se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida para obtener el producto en bruto.
[0608] Se realizó una primera purificación en gel de sílice (malla 100-200; 500 g). En elución en gradiente, el compuesto se eluyó con EtOAc al 70 %/Hex. Después de la concentración, el compuesto (22,0 g) apareció de color rojizo. Se realizó una segunda purificación usando alúmina neutra (400 g) con disolventes de calidad HPLC. El compuesto se eluyó con EtOAc al 15 %/Hex y las fracciones puras se concentraron a presión reducida para obtener 19,0 g de líquido amarillo.
[0609] El producto (14,0 g) se diluyó con 200 ml de EtOH (grado HPLC),, a continuación, se añadieron 7,0 g de carbón vegetal (50 % p/p) a la solución y se continuó agitando a temperatura ambiente durante la noche. La solución resultante se filtró a través de un lecho de celite y el filtrado se concentró. Finalmente, el compuesto se disolvió en 120 ml de EtOAc al 50 %/Hex y se filtró (para eliminar las partículas de alúmina y sílice) a través de un tapón de algodón y se concentró a presión reducida. El compuesto final (11,5 g) apareció en color amarillo claro.
[0610] Se diluyó un segundo lote ( 5,0 g) con 80 ml de EtOH (calidad HPLC),, a continuación, se añadieron 2,5 g de carbón vegetal (50 % p/p) a la solución y se continuó agitando a temperatura ambiente durante la noche. La solución resultante se filtró a través de un lecho de celite y el filtrado se concentró. Finalmente, el compuesto se disolvió en 60 ml de EtOAc al 50 %/Hex y se filtró (para eliminar las partículas de alúmina y sílice) a través de un tapón de algodón y se concentró a presión reducida. El compuesto final (4,0 g) apareció en color amarillo rojizo. Cantidad producida, 15,5 g; rendimiento, 51 %.
[0611] ATX-0081: 1H-RMN (PPM, 400MHz, CDCh): 6 =5,62 (m, 1), 5,51 (m, 1), 4,86 (m, 1), 4,62 (d, J = 6,0 Hz, 2), 3,37 (s amplio, 4), 3,01 (t, J = 7,1 Hz, 2), 2,51 (t, J = 7,1 Hz, 2), 2,31 (m, 4), 2,26 (s, 6), 2,07 (m, 2), 1,89 (amplio, 4), 1,42-1,57 (4), 1,16-1,40 (28), 0,82-0,91 (9)
Ejemplo 15: Síntesis de ATX-0085
[0612] La figura 15 muestra la ruta sintética de ATX-0085 que se describe con más detalle a continuación.
ATX-0085: Etapa 1
[0614] En un matraz RB de un solo cuello de 500 ml, se recogieron 30,0 g de ácido heptanoico (1 eq.) disueltos en DCM (200 ml) y, a continuación, se añadieron 26,7 ml de cloruro de oxalilo (1,5 eq.) lentamente a 0 °C, agitando en atmósfera de nitrógeno y, a continuación, se añadió 1 ml de DMF (catalítico).La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h.
[0615] En un matraz RB de dos bocas de 1 litro separado, a 40,5 g de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (2 eq.) en DCM (250 ml), se le añadieron 86,6 ml de trimetilamina (3 eq.) usando un embudo adicional, se agitó a 0 °C. A esta solución resultante, se añadió gota a gota el cloruro de ácido anterior, después de concentrarlo a presión reducida, en una atmósfera de nitrógeno disolviéndolo en DCM (100 ml), usando un embudo de adición durante 20 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 h en una atmósfera de nitrógeno.
[0616] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se diluyó con agua (250 ml).
[0617] Se separó la capa orgánica y se lavó la capa acuosa con DCM (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida.
[0618] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice 60-120) usando EtOAc al 10 %/Hex. Cantidad producida, 38,0 g; rendimiento, 84 %.
ATX-0085: Etapa 2
[0619]
[0620] A una solución de 62,3 g de bromuro de hexilmagnesio (1,5 eq.) en éter, recogida en un matraz RB de dos bocas de 1 litro, agitado a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 38,0 g de N-metoxi-N-metilheptanamida (1 eq.) disueltos en 250 ml de éter y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 h.
[0621] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,7).
[0622] La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NHaCl (200 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con éter (2 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron a presión reducida.
[0623] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120) usando EtOAc al 2 %/Hex. Cantidad producida, 30,8 g; rendimiento, 71 %.
ATX-0085: Etapa 3
[0624]
[0625] A una solución de 30,0 g de tridecan-7-ona (1 eq.), disueltos en 200 MeOH/THF (10:1, v:v), se le añadieron 8,5 g de borohidruro de sodio (1,5 eq.) a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h.
[0626] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,5).
[0627] La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NHaCl (80 ml). El disolvente se extrajo a presión reducida y el producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (200 ml) y agua (100 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 70 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 27,2 g; rendimiento, 90 %.
ATX-0085: Etapa 4
[0628]
[0629] A una solución de 50,0 g de ácido 4-aminobutanoico (1 eq.) disueltos en THF/aq. se añadió una solución de NaOH (490 ml) a 0 °C, seguido de 140 ml de anhídrido Boc (1,3 eq.), secuencialmente usando un embudo adicional, durante un período de 15 min. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0630] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,5).
[0631] La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (300 ml). Se separó la capa orgánica y se lavó la capa acuosa con EtOAc (3 x 150 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida para obtener un líquido gomoso. Cantidad producida, 80,0 g; rendimiento, 81 %. Confirmado por RMN 1H. Nota: Dado que Boc-Acid (Int 4) tiene alguna impureza (20-30%) observada en la RMN 1H, se reflejó en los rendimientos de las etapas 5 y 6.
ATX-0085: Etapa 5
[0632]
[0633] A una solución de 10,0 g de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico (1 eq.) disueltos en DCM (200 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 12,2 g de EDC.HCl (1,3 eq.), 20,4 ml de EtsN (3 eq.) y 601 mg de DMAP (0,1 eq.) secuencialmente en atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 min. A esta solución resultante se le añadió alcohol a la misma temperatura, disolviéndolo en DCM (150 ml), usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0634] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en Hex; Rf: 0,5).
[0635] La masa de reacción se inactivó con agua (150 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 75 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con solución saturada de NaHCO3 (100 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (200 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. Cantidad producida, 8,0 g (en bruto; compuesto requerido y alcohol).
ATX-0085: Etapa 6
[0636]
[0637] A una solución de 8,0 g de 4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoato de tridecan-7-ilo (1 eq.) disuelto en 65 ml de DCM, se le añadieron 15,7 ml de TFA (10 eq.) a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno.
[0638] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 % en CHCh; Rf: 0,3).
[0639] La masa de reacción se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con solución saturada de NaHCO3 (100 ml) y, a continuación, se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120; MeOH al 4 %/CHCl3 y 1 ml de trietilamina) y se recuperó el alcohol. Cantidad producida, 3,5 g; rendimiento, 25 % para dos etapas. Confirmado por Masas.
ATX-0085: Etapa 7
[0640]
[0641] A 20,0 g de ácido hexanoico (1 eq.) disuelto en DCM (150 ml) se le añadieron lentamente 22,1 ml de cloruro de oxalilo (1,5 eq.) a 0 °C, agitando en atmósfera de nitrógeno y, a continuación, se añadió 1 ml de DMF (catalítico).. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas.
[0642] En un matraz separado, a 33,5 g de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (2 eq.) en DCM (250 ml), se añadieron 71,7 ml de trimetilamina (3 eq.) usando un embudo de adición, se agitó a 0 °C. A esta solución resultante, se añadió gota a gota el cloruro de ácido anterior, después de concentrarlo a presión reducida, en una atmósfera de nitrógeno disolviéndolo en DCM (100 ml), usando un embudo de adición durante 20 minutos. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0643] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,5). La masa de reacción se diluyó con agua (250 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida.
[0644] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna usando (gel de sílice 60-120) usando EtOAc/Hex al 10 %. Cantidad producida, 21,0 g; rendimiento, 76 %.
ATX-0085: Etapa 8
[0645]
[0646] A una solución de 33,0 g de bromuro de pentilmagnesio (1,5 eq.) en éter a 0 °C en atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 20,0 g de N-metoxi-N-metilhexanamida (1 eq.) disueltos en 220 ml de éter y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
[0647] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en hexano; Rf: 0,6).
[0648] La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NHaCl (200 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con éter (2 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60-120) EtOAc al 2 %/Hex. Cantidad producida, 15,4 g; rendimiento, 72 %.
ATX-0085: Etapa 9
[0649]
[0650] A una solución de 15,0 g de undecan-6-ona (1 eq.) disueltos en 100 ml de MeOH/15 ml de THF, se le añadieron 4,9 g de borohidruro de sodio (1,5 eq.) a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h.
[0651] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 %/hexano; Rf: 0,5).
[0652] La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NHaCl (80 ml). El disolvente se extrajo a presión reducida y el producto en bruto resultante se repartió entre EtOAc (200 ml) y agua (100 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 70 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para obtener un sólido blanco. Cantidad producida, 13,9 g; Blanco sólido; rendimiento, 92 %
ATX-0085: Etapa 10
[0653]
[0654] A una solución de 10,0 g de ácido 5-bromopentanoico (1 eq.), disueltos en DCM (300 ml), enfriada por debajo de 0 °C, se le añadieron 13,7 g de EDC.HCl (1,3 eq.), 23,0 ml de Et3N (3 eq.) y 674 mg de DMAP, secuencialmente bajo atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 min. A esta solución resultante se le añadieron 9,5 g de alcohol (1 eq.) a la misma temperatura, disolviéndolo en DCM (150 ml), usando un embudo adicional, y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0655] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en Hex; Rf: 0,7).
[0656] La masa de reacción se inactivó con agua (200 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se lavó con solución saturada de NaHCO3(100 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (3 x 100 ml). Las capas orgánicas se separaron y se concentraron a presión reducida, y se procedió a la siguiente etapa con el producto en bruto. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna usando (gel de sílice de malla 60 120) EtOAc/Hex al 5 % y se recuperó el material de partida (alcohol). Cantidad de producto, 11,6 g; rendimiento, 62 %.
ATX-0085: Etapa 11
[0657]
[0658] A una solución de 4,5 g de 4-aminobutanoato de tridecan-7-ilo (1 eq.), 5,2 g de 5-bromopentanoato de undecan-6-ilo (1 eq.) en ACN, se añadieron 3,0 g de carbonato de potasio (1,4 eq.) y la mezcla resultante se sometió a reflujo a 90 °C durante 4 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0659] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCh; Rf: 0,45).
[0660] Se filtró la masa de reacción, se lavó con ACN (2 x 20 ml) y el filtrado se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) usando EtOAc al 20 %/Hex. Se recuperó el material de partida (compuesto de amina y bromo). Cantidad producida, 2,2 gramos del compuesto puro; rendimiento, 25 %; y 1,1 gramos de la mezcla. Confirmado por Masas.
ATX-0085: Etapa 12
[0661]
[0662] A una solución de 2,2 g de 5-((4-oxo-4-(tridecan-7-iloxi)butil)amino)pentanoato de undecan-6-ilo (1 eq.) disueltos en DCM anhidro, se le añadieron 1,6 ml de trimetilamina (3 eq.) y 604 mg de trifosgeno (0,5 eq.) con un intervalo de 5 minutos a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 1 hora. La masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno.
[0663] A una suspensión de 684 mg de hidruro de sodio (7 eq.) en THF anhidro (30 ml), en un matraz agitado a 0 °C en atmósfera de nitrógeno, se le añadieron 2,0 g de clorhidrato de 2-(dimetilamino)etano-1-tiol (3,5 eq.) y se mantuvo en agitación durante 5 min en atmósfera de nitrógeno. A esta solución resultante se añadió lentamente mediante una jeringa el cloruro de carbamoílo anterior, disuelto en THF (50 ml), durante aproximadamente 10 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche en una atmósfera de nitrógeno.
[0664] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCl3; Rf: 0,5; carbonización con PMA).
[0665] La masa de reacción se inactivó con una solución saturada de NHaCl (40 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (100 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 40 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron y el producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna. Se realizó una primera purificación usando gel de sílice (malla 100-200). Se adsorbieron 5,0 g del compuesto en bruto en 9,0 g de gel de sílice y se vertieron sobre 70 g de gel de sílice recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc/Hex al 50 %. Se realizó una segunda purificación utilizando alúmina neutra con disolventes de calidad HPLC. Se adsorbieron 2,0 g del compuesto en bruto en 7,0 g de alúmina neutra y el resultado se vertió sobre 40 g de alúmina neutra recogidos en la columna. El compuesto se eluyó con EtOAc al 25 %/Hex. Cantidad: 1,4 gramos; rendimiento: 51 %. Confirmado por 1H RMN.
[0666] ATX-0085 1H-RMN (PPM, 400MHz, CDCh): 8 = 4,87 (m, 2), 3,36 (s amplio, 4), 3,02 (t, J = 7,1Hz, 2), 2,52 (t , J = 7,1 Hz, 2), 2,31 (m, 4), 2,27 (s, 6), 1,88 (s amplio, 2), 1,56-1,66 (4), 1,46-1,54 (8), 1,21-1,34 (30) , 0,89 (m, 12).
Ejemplo 15: Síntesis de ATX-0134
[0667] La figura 16 muestra la ruta sintética de ATX-0134 que se describe con más detalle a continuación.
ATX-0134: Etapa 1
[0669] En un matraz RB de una sola boca de 1 litro, a una solución agitada de 50,0 g de 2-bromoacetato de metilo (1 eq.) en 400 ml de DMF, se le añadieron 90,3 g de carbonato de potasio (2 eq.) seguido de 17,5 g de bencil amina (0,5 eq.), a la temperatura de un baño de hielo en una atmósfera de nitrógeno, y la mezcla de reacción resultante se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se continuó agitando durante 36 h.
[0670] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 20 %/hexano; Rf: 0,4; carbonización con ninhidrina).
[0671] La masa de reacción se diluyó con agua helada (1 litro) y, a continuación, se añadió EtOAc (250 ml). Se separó la capa orgánica y se lavó la capa acuosa con EtOAc (3 x 100 ml). La capa orgánica combinada se lavó nuevamente con agua helada (500 ml) y la capa orgánica resultante se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida.
[0672] Se sometió el compuesto en bruto a cromatografía en columna sobre gel de sílice (malla 60-120) usando EtOAc/Hex al 15-20 %. Cantidad producida, 35,0 g; rendimiento, 85 %.
ATX-0134: Etapa 2
[0673]
[0674] Se añadieron 10,5 g de Pd al 10 %/C al matraz de reacción de hidrogenación de 500 ml, que contenía 35,0 g de 2,2'-(bencilazanodiil)diacetato de dimetilo en EtOAc, y la masa de reacción se sometió a hidrogenación usando un agitador Parr (60 psi) hasta que desapareció el material de partida (2 h).
[0675] El progreso de la reacción se controló mediante CCF (MeOH al 5 %/CHCl3; Rf: 0,5; carbonización con ninhidrina).
[0676] La masa de reacción se filtró a través de un lecho de celite y se lavó con EtOAc (2 x 60 ml). El filtrado combinado se concentró a presión reducida. Cantidad producida, 30,0 g (bruto).
ATX-0134: Etapa 3
[0677]
[0678] A una solución de 30,0 g de 2,2'-azanodiildiacetato de dimetilo (1,0 eq.) en THF, se le añadieron 38,7 ml de trietilamina (1,5 eq.) seguido de 55,5 ml de anhídrido Boc (1,3 eq.), a temperatura de baño de hielo, utilizando secuencialmente un embudo de adición. La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche en una atmósfera de nitrógeno.
[0679] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 40 %/hexano; Rf: 0,5).
[0680] La masa de reacción se diluyó con agua (250 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (150 ml). Se separó la capa orgánica y se lavó la capa acuosa con EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice (malla 60-120) usando EtOAc al 15 %-20 %/Hex. Cantidad producida, 35,0 g; rendimiento, 96 %.
ATX-0134: Etapa 4
[0681]
[0682] A una solución de 35,0 g de 2,2'-((terc-butoxicarbonil)azanodiil)diacetato de dimetilo (1,0 eq.) en THF agitada a la temperatura de un baño de hielo, se le añadió una solución acuosa de 16,8 g de hidróxido de litio (75 ml de 5,3 M) (3 eq.). La solución de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0683] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCl3; Rf: 0,2).
[0684] La masa de reacción se inactivó con HCl al 5 % (400 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (200 ml). Se separó la capa orgánica y se lavó la capa acuosa con EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice (malla 60-120) usando EtOAc al 100 %. Cantidad producida, 29,0 g; rendimiento, 93 %.
ATX-0134: Etapa 5
[0685]
1 Ácido 2,2'-((terc-butoxicarbonil)azanodiil)diacético 233,22 0,051 1,0 2 Alcohol 228,42 0,102 2,0 3 EDC.HCl 191,70 0,154 3,0 4 Trietilamina 101 0,154 3,0 5 DMAP 122,17 0,002 0,1
6 DCM 400 ml
[0686] A una solución de 12,0 g de ácido 4,4'-((terc-butoxicarbonil)azanodiil)dibutanoico (1 eq.) en 250 ml de DCM, enfriada entre 0 °C y 50 °C (baño de hielo), se añadieron 29,5 g de EDC.HCl (3 eq.), 21,4 ml de Et3N (3 eq.) y 628 mg de DMAP (0,1 eq.) secuencialmente en atmósfera de nitrógeno con un intervalo de 10 min. A esta solución resultante se le añadieron 23,5 g de alcohol (en 150 ml de DCM) (2 eq.) a la misma temperatura mediante un embudo de adición y la masa de reacción resultante se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 24 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0687] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (EtOAc al 10 % en Hex; Rf: 0,6; carbonización con PMA).
[0688] La masa de reacción se inactivó con agua (100 ml) y, a continuación, se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó con DCM (2 x 80 ml). La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto en bruto resultante se agitó con solución saturada de NaHCO3 (100 ml) durante 5 minutos para eliminar el ácido que no había reaccionado y, a continuación, se añadió EtOAc (2 x 80 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice (malla 60-120) usando EtOAc al 2-3 %/Hex. Cantidad producida, 15,0 g; rendimiento, 44 %.
ATX-0134: Etapa 6
[0689]
[0690] A una solución de 15,0 g de 2,2'-((terc-butoxicarbonil)azanodiil)diacetato de di(pentadecan-8-ilo) (1 eq.) en 120 ml de DCM, se le añadieron 17,7 ml de TFA (10 eq.), entre 0 °C y 50 °C (baño de hielo), y la masa de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 4 horas en una atmósfera de nitrógeno.
[0691] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (10 % ETOAc/Hex; Rf: 0,5).
[0692] La masa de reacción se concentró a presión reducida y el producto en bruto resultante se agitó con una solución saturada de NaHCO3 (100 ml) durante 5 min (para eliminar trazas de TFA) y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El compuesto en bruto se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice (malla 60-120) y el compuesto se eluyó con EtOAc al 10 %/Hex. Cantidad producida, 10,4 g; rendimiento, 82 %.
ATX-0134: Etapa 7
[0693]
[0694] A una solución de 1,5 g de 2,2'- azanodiildiacetato de di(pentadecan-8-ilo) (1 eq.) en 20 ml de DCM anhidro, se le añadieron 1,1 ml de trimetilamina (3 eq.) y 401 mg de trifosgeno (0,5 eq.) con un intervalo de 5 min bajo temperatura de baño de hielo y atmósfera de nitrógeno. A continuación, se dejó calentar la solución resultante hasta temperatura ambiente y se agitó durante 1 h en una atmósfera de nitrógeno. Después de acabarse el material de partida (comprobado por CCF), la masa de reacción resultante se concentró a presión reducida y se mantuvo bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadieron 1,1 g de 3-(dietilamino)propano-1-tiol (3 eq.), disueltos en 10 ml de THF, a una suspensión de 129 mg de hidruro sódico (2 eq.) en THF anhidro (10 ml), se enfrió hasta entre 0 °C y 50 °C bajo una atmósfera de nitrógeno y se continuó la agitación durante 5 min. A esta solución resultante se le añadió el cloruro de carbamoílo anterior, disuelto en THF (30 ml), a la misma temperatura mediante un embudo de adición durante aproximadamente 5 minutos. La solución resultante se calentó hasta temperatura ambiente y se continuó agitando durante la noche en atmósfera de nitrógeno.
[0695] Se controló el progreso de la reacción mediante CCF (MeOH al 10 %/CHCl3; Rf: 0,5; carbonización con PMA).
[0696] La masa de reacción se inactivó con NH4Cl sat. (30 ml) y, a continuación, se añadió EtOAc (50 ml). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se lavó con EtOAc (2 x 40 ml). La capa orgánica combinada se concentró y el producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna. La primera purificación se realizó usando alúmina neutra (100 g). En elución en gradiente, el compuesto se eluyó con EtOAc al 20 %/Hex. La segunda purificación se realizó usando gel de sílice (malla 100-200; 80 g) con disolventes de calidad HPLC. El compuesto se eluyó con EtOAc al 50 %/Hex. Cantidad: 680 mg; rendimiento: 34 %.
[0697] ATX-01341H-RMN (PPM, 400MHz, CDCla): 8 = 4,91 (m, 2), 4,21 (s, 2), 4,16 (s, 2), 2,95 (t, J = 7,1Hz , 2), 2,54 (m, 6), 1,79 (m, 2), 1,46-1,52 (8), 1,17-1,36 (40), 1,03 (t, J = 7,8 Hz, 6), 0,87 (t, J = 7,1 Hz, 12).
Ejemplo 15: Síntesis de ATX-0044 y ATX-0091 a ATX-0133.
[0698] ATX-0044, ATX-0085, ATX-0111, ATX-0132, ATX-0100, ATX-0117, ATX-0114, ATX-0115, ATX-0101, ATX-0106, ATX-0116, ATX-0122 , ATX-0123, ATX-0124, ATX-0126, ATX-0129 y ATX-0133 se sintetizaron utilizando los procedimientos de los ejemplos anteriores.
Ejemplo 16: Valores de pKa
[0699] Se midieron los pKa de lípidos catiónicos en LNP o formulaciones micelares mediante el procedimiento de Jayaraman, 2012, Angew. Chem. Int. Ed., 51:8529-33. Las micelas lipídicas o LNP se diluyen hasta 1 mM de lípidos totales en un tampón universal con un rango de pH entre 3 y 12 en presencia de 0,06 mg/ml de reactivo de sal sódica del ácido 6-(p-toluidino)-2-naftalenosulfónico (TNS) (Sigma Aldrich), una sonda de fluorescencia sensible al pH. La molécula aniónica de TNS emite fluorescencia cuando se asocia con la superficie de membranas cargadas positivamente, pero no es fluorescente cuando está libre en solución, lo que permite la medición delpKa.La señal de TNS se mide en un lector de placas espectrales. La señal de TNS se representa gráficamente en función del pH y se analiza utilizando un método no lineal (Boltzman) para determinar elpKa.
[0700] Los reactivos usados en el ensayo incluyen
-Ácido libre, Hepes, CAS: 7365-45-9 (VWR, 0511-1KG o equivalente)
- MES, grado HpLC: (Sigma 105228-100G o equivalente)
- Acetato de amonio, grado HPLC: (Sigma 90335-100mL o equivalente)
- Cloruro de sodio, Grado HPLC (VWR EM-MX0475-1 o equivalente)
- TNS (Sigma-Aldrich T9792-250 mg o equivalente)
- Ácido clorhídrico
- DMSO
- DPBS sin calcio ni magnesio (GE, SH30028.O2 o equivalente)
- H2O, grado HPLC (OmniSolv, WX0004 -1 o equivalente)
[0701] Para preparar una solución madre de tampón universal (UB,Universal Buffer)en una botella de almacenamiento estéril de poliestireno, se prepara 1 litro usando la siguiente tabla.
Los reactivos se filtran de forma estéril a través de un filtro de 0,2 pm. La preparación de la solución UB incluye la adición de 5 ml de HCl 1 M a una solución madre de 350 ml.
[0702] Para preparar una escalera de pH, se utilizan tubos de centrífuga (50 ml) con 20 ml de tampón UB. (pH ~3) y diferentes cantidades de NaOH 2 N. Soluciones madre de TNS a 1 mg/ml en Dm SO. Se añaden 60 pl de TNS a 1 mg/ml a 940 pl de agua para alcanzar una concentración de solución de trabajo de 0,06 mg/ml. Por placa se analizan cinco muestras de prueba, 1 ml de muestra de LNP en PBS con 1 mM de lípidos totales y 1 muestra de referencia. Las muestras a diferentes valores de pH se preparan en pocillos en los que se añaden 25 pl de 0,06 mg/ml de TNS. Se añaden 15 pl de muestras de prueba por pocillo. La microplaca se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La plantilla de TNS se puede utilizar para formatear datos del lector de placas. Se realiza el análisis de regresión no lineal (Boltzman) de las muestras en Origin Pro 8 o software equivalente.
[0703] Los resultados se muestran en la Tabla 1. En general, el aumento de la lipofilicidad a través del éster cerca del grupo de cabeza ionizable reduce el pKa medido mientras que hace que el pKa calculado sea más básico. Añadir lipofilicidad al alcohol mientras se acorta la longitud de la cadena de éster puede tener un impacto importante en el pKa medido. Por ejemplo, acortar el éster a butanoato no tiene ningún impacto cuando la lipofilicidad del alcohol aumenta a un grupo alquilo ramificado (ver: ATX-0057 y ATX-0058 frente a ATX-0002). Se observa un impacto importante al acortar el éster a acetato, por ejemplo, ATX-0061/ATX-0064 (A = -0,90) y ATX-0063 (A = -0,7) para éster 1-ramificado/1-Z-2-nonenol; y ATX-0062/ATX-0065 (A = -3,20) para éster acetato/bis-ramificado con un A cLogP 4,0 frente a ATX-0002.
[0704] Sin ceder a estar ligados a la teoría, los resultados muestran la importancia de una mayor lipofilicidad (medida mediante cLogP) combinada con un acortamiento de la cadena para reducir el pKa medido en comparación con lo previsto, y para aumentar la bioactividad de las nanopartículas lipídicas.
Ejemplo 17: Estabilidad del ARNm de EPO in vivo
[0705] Se midieron y compararon los niveles de ARNm en plasma después de la inyección de nanopartículas que comprenden diferentes lípidos catiónicos. Se utilizaron ratones hembra Balb/c (de 6 a 8 semanas de edad) para la evaluación de los niveles de eritropoyetina (epo) en plasmain vivodespués de la inyección de ARNm de epo de ratón encapsulado en lípidos. Todas las formulaciones se administraron por vía intravenosa mediante inyección en la vena de la cola a una dosis de 0,03 y 0,1 mg/kg en un volumen de dosificación de 5 ml/kg. La extracción de sangre terminal se realizó mediante punción cardíaca con isoflurano al 2 % 6 horas después de las inyecciones de la formulación. La sangre se recogió en un tubo con tampón citrato 0,109 M y se procesó mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos. Se recogió suero y se analizaron los niveles de ARNm de epo. Los resultados se muestran en la figura 17. Los resultados muestran una mejora sustancial con respecto a ATX-0002 para ATX-0057, ATX-0081, ATX-0082, ATX-0083, ATX-0084, ATX-0085, ATX-0086 y ATX-0087.
Ejemplo 18: Silenciamiento del factor VII de ratón in vivo y expresión de EPO
[0706] Usando un cribadoin vivodirigido al hígado de las bibliotecas de liposomas, se probaron una serie de compuestos que facilitan altos niveles de silenciamiento génico mediado por ARNip en hepatocitos, las células que comprenden el parénquima hepático. El factor VII, un factor de coagulación sanguínea, es un gen diana adecuado para analizar el suministro de ARNip funcional al hígado. Debido a que este factor se produce específicamente en los hepatocitos, el silenciamiento génico indica un suministro exitoso al parénquima, en contraposición al suministro a las células del sistema reticuloendotelial (por ejemplo, células de Kupffer). Además, el factor VII es una proteína secretada que puede medirse fácilmente en el suero, lo que evita la necesidad de sacrificar a los animales. El silenciamiento a nivel de ARNm se puede determinar fácilmente midiendo los niveles de proteína. Esto se debe a la corta semivida de la proteína (2-5 horas). Se formularon composiciones con ARNip dirigido al factor VIII con el lípido y la muestra de comparación con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad) para experimentos de “knockdown” de ARNip (KD) de FVII.
[0707] Todas las formulaciones se administraron por vía intravenosa mediante inyección en la vena de la cola a una dosis de 0,03 y 0,1 mg/kg a un volumen de dosificación de 5 mg/kg. La extracción de sangre terminal se realizó mediante punción cardíaca con isoflurano al 2 % 48 horas después de las inyecciones de la formulación. La sangre se recogió en un tubo con tampón citrato 0,109 M y se procesó mediante centrifugación a 1200 G durante 10 minutos. Se recogió plasma y se analizaron los niveles de proteína del factor VII mediante ensayo cromogénico (Biophen FVII, Aniara Corporation). Se construyó una curva estándar utilizando muestras de ratones inyectados con PBS y se determinó la expresión relativa del factor VII comparando los grupos tratados con el control de PBS no tratado. Los resultados mostraron que ATX-0057 y ATX-0058 fueron sustancialmente más efectivos que ATX-002 tanto a 0,03 como a 0,1 mg/kg (Figura 18).
[0708] La Tabla 1 muestra el “knockdown” resultante de nanopartículas lipídicas que comprenden los lípidos descritos en el presente documento.
[0709] Se midió la expresión de Epo después del suministro de ARNm utilizando nanopartículas lipídicas que comprenden los lípidos descritos en el presente documento.
[0710] Se usaron ratones hembra Balb/c (6-8 semanas de edad) para la evaluación de la expresión de la proteína epo in vivo después del suministro de ARNm de epo de ratón encapsulado en lípidos. Todas las formulaciones se administraron por vía intravenosa mediante inyección en la vena de la cola a una dosis de 0,03 y 0,1 mg/kg a un volumen de dosificación de 5 ml/kg. La extracción de sangre terminal se realizó mediante punción cardíaca con isoflurano al 2 % 6 horas después de las inyecciones de la formulación. La sangre se recogió en un tubo con tampón citrato 0,109 M y se procesó mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos. Se recogió suero y los niveles de proteína epo se analizaron mediante un ensayo ELISA de epo (R&D systems). Se construyó una curva estándar utilizando muestras de ratones inyectados con PBS y se determinó la expresión relativa del factor VII comparando los grupos tratados con el control de PBS no tratado. Los resultados mostraron que el ARNm de epo se expresa en cantidades sustancialmente mayores en nanopartículas de ATX-0057 que en ATX-002 a 0,1 mg/ml (figura 19).

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Compuesto de fórmula I
    en el que R1 es un alquilo o alquenilo ramificado, no cíclico de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 carbonos; L1 es un alquileno lineal de 1 a 15 carbonos; R1 es un alquilo o alquenilo ramificado, no cíclico de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 carbonos; L2 es un alquileno lineal de 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 carbonos; X es O o S; R3 es un alquileno lineal de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 carbonos; y R4 y R5 son los mismos o diferentes, siendo cada uno un alquilo lineal o ramificado, no cíclico de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 carbonos; o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. 2. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que el compuesto es
    3. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que R1 tiene 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16 o 17 carbonos. 4. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que R1 comprende dos grupos alquilo o alquenilo idénticos. 5. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que L2 tiene 4, 5, 6 o 7 carbonos. 6. Compuesto seleccionado del grupo que consiste en
    7. Compuesto, según la reivindicación 6, en el que el compuesto es
    10. Composición lipídica que comprende un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y un ácido nucleico. 11. Composición lipídica, según la reivindicación 10, en la que la composición lipídica es una nanopartícula lipídica que encapsula el ácido nucleico. 12. Composición lipídica, según la reivindicación 10, en la que el ácido nucleico es un ARNm.
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