KR20190134593A - Rna 전달을 위한 이온화가능한 양이온성 지질 - Google Patents

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KR20190134593A
KR20190134593A KR1020197021153A KR20197021153A KR20190134593A KR 20190134593 A KR20190134593 A KR 20190134593A KR 1020197021153 A KR1020197021153 A KR 1020197021153A KR 20197021153 A KR20197021153 A KR 20197021153A KR 20190134593 A KR20190134593 A KR 20190134593A
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조셉 이. 페인
파드마나브 치부쿨라
프리야 카르말리
스티븐 피. 태니스
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아크투루스 쎄라퓨틱스, 인크.
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Abstract

기술된 것은 R1는 10 내지 31 탄소로 구성된 분지쇄 알킬이고; R2는 2 내지 20 탄소로 구성된 선형 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이고; L1 및 L2는 동일 또는 상이하고, 각각 2 내지 20 탄소의 선형 알킬렌 1 내지 20 탄소의 또는 선형 알케닐렌; X1는 S 또는 O; R3는 1 내지 6 탄소로 구성된 선형 또는 분지 알킬렌이고; 그리고 R4 및 R5는 동일 또는 상이하고, 각각 수소 또는 1 내지 6 탄소로 구성된 선형 또는 분지 알킬;인 화합물로 구성된 식 I의 화합물
Figure pct00124

또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다.

Description

RNA 전달을 위한 이온화가능한 양이온성 지질
관련 출원과의 상호 참조
본출원은 2016년 12월 21일에 출원된 미국특허출원 제 15/387,067호에 대해 우선권을 주장하고, 그 내용은 전체가 참고로서 여기에 포함된다.
2015년 5월 8일에 출원되고, 2016년 6월 14일에 미국특허 제 9,365,610호로 등록된 미국특허출원 제 14/707,876호, 2015년 5월 8일에 출원되고 2017년 2월 14일에 미국특허 제 9,567,296호로 등록된 미국특허출원 제 14/707,796호, 2014년 11월 18일에 출원되고2017년 3월 14일에 미국특허 제 9,593,077호로 등록된 미국특허출원 제 14/546,105호, 및 2013년 11월 18일에 제출된 미국가특허출원 제 61/905,724호는 전체가 참고로서 여기에 포함된다.
다수의 상이한 유형의 핵산이 다수의 질병의 치료를 위한 치료제로서 현재 개발되고 있다. 이들 분자가 개발되고 있음에 따라, 안정하고 긴 보관 수명을 가지며 무수 유기 용매 또는 무수 극성 비양성자성 용매 내로 용이하게 함입되어 극성 수용액 또는 비극성 용매에서 일어날 수 있는 부반응 없이 핵산의 캡슐화를 가능하게 하는 형태로 이들을 생성할 필요성이 제기되어 왔다.
본 발명은 생물학적으로 활성인 치료적 분자의 세포내 전달을 용이하게 하는 신규한 지질 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 약제학적 조성물은 그러한 지질 조성물을 포함하고, 치료적 유효량의 생물학적 활성 분자를 환자의 세포 내로 전달하는 데 유용하다.
대상체로의 치료적 화합물의 전달은 그의 치료적 효과에 중요하며, 통상 그것은 표적화된 세포 및 조직에 도달하는 화합물의 제한된 능력에 의해 방해받을 수 있다. 다양한 전달 수단에 의해 그러한 화합물이 표적화된 세포 또는 조직에 진입하는 것의 개선이 중요하다. 본 발명은 생물학적 활성 분자의 표적화된 세포내 전달을 용이하게 하는, 조성물, 및 제조 방법에서의 신규한 지질에 관한 것이다.
환자의 조직에 대한 효과적인 표적화가 종종 달성되지 않는 생물학적 활성 분자의 예에는 다수의 단백질, 예컨대 면역글로불린 단백질, 폴리뉴클레오티드 가령, 게놈 DNA, cDNA, 또는 mRNA 안티센스 폴리뉴클레오티드; 및 합성 또는 자연 발생적인 다수의 저분자량 화합물 가령, 펩티드 호르몬 및 항생제가 포함된다.
의료 종사자들이 지금 직면하고 있는 기본적인 과제 중 하나는 현재 다수의 상이한 유형의 핵산이 다수의 질병의 치료를 위한 치료제로서 개발되고 있다는 것이다. 이들 핵산은 유전자 발현을 위한 mRNA, 유전자 요법에서의 DNA, 플라스미드, 짧은 간섭 핵산(siNA), siRNA, 및 RNA 간섭(RNAi)에 사용하기 위한 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 분자, 리보자임, 안타고미르(antagomir), 및 압타머(aptamer)를 포함한다. 이들 핵산이 개발되고 있음에 따라, 제조가 용이하고 표적 조직에 용이하게 전달될 수 있는 지질 제형을 생성할 필요가 있다.
기술된 것은 식 I의 화합물
Figure pct00001
여기서
R1는 10 내지 31 탄소로 구성된 분지쇄 알킬이고,
R2는 2 내지 20 탄소로 구성된 선형 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
L1 및 L2는 동일 또는 상이하고, 각각 1 내지 20 탄소의 선형 알킬렌 또는 2 내지 20 탄소로 구성된 선형 알케닐렌,
X1는 S 또는 O,
R3는 1 내지 6 탄소로 구성된 선형 또는 분지 알킬렌이고, 및
R4 및 R5는 동일 또는 상이하고, 각각 수소 또는 1 내지 6 탄소로 구성된 선형 또는 분지 알킬;
또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.
한 구체예에서 상기 화합물은 다음과 같이 식 ATX-43, ATX-57, ATX-58, ATX-61, ATX-63, ATX-64, ATX-81, ATX-82, ATX-83, ATX-84, ATX-86, ATX-87, 및 ATX-88로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물이다.
Figure pct00002
Figure pct00004
한 구체예에서, 여기서 기술된 것은 R1는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31 탄소로 구성된 분지쇄 알킬이고; R2는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 탄소로 구성된 선형 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고; L1 및 L2는 동일 또는 상이하고, 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19 또는 20 탄소의 선형 알킬렌 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19 또는 20 탄소로 구성된 선형 알케닐렌; X1는 S 또는 O; R3는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 6 탄소로 구성된 선형 또는 분지 알킬렌이고; 및 R4 및 R5는 동일 또는 상이하고, 각각 수소 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 탄소로 구성된 선형 또는 분지 알킬인 화합물로 구성된다.
바람직한 구체예에서, R1은 -CH((CH2)nCH3)2이고, 여기서 n은 4, 5, 6, 또는 7 탄소이고; R2는 선형 알케닐이고; L1는 1, 2, 3, 또는 5 탄소의 선형 알킬렌이고; L2는 1, 3, 또는 5 탄소의 선형 알킬렌이고; X1는 S; R3는 2 또는 3 탄소의 선형 알킬렌이고; 및 R4 및 R5는 동일 또는 상이하고, 각각 1 또는 2 탄소이다.
한 구체예에서, 본 명세서에 기재된 양이온성 지질은 약제학적 조성물 내에 존재한다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 핵산, 바람직하게는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 지질 나노입자는 바람직하게는 순환에서 RNA의 수명을 증가시킨다. 다른 구체예에서, 약제학적 조성물의 투여 시에, 그 안의 지질 나노입자는 핵산을 체내 세포에 전달한다. 바람직하게는, 핵산은 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 갖는다. 대안적으로, 핵산은 신체의 세포에서의 발현 시에 그것이 인코딩하는 단백질의 생성을 증가시키는 활성을 갖는다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 임의의 상기 조성물을 사용하여 포유류의 세포 내로 핵산을 도입시키는 방법이다. 세포는 간, 폐, 신장, 뇌, 혈액, 비장, 또는 뼈에 존재할 수 있다. 본 조성물은 바람직하게는 정맥내, 피하, 복막내, 또는 경막내 투여된다. 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 조성물은 암 또는 염증성 질병을 치료하는 방법에 사용된다. 상기 질병은 면역 장애, 암, 신장 질병, 섬유성 질병, 유전자 비정상, 염증, 및 심혈관 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
도 1은 헥사노에이트 (SM 1), 4-아미노부탄산 (SM 2), 및 4-브로모부티르산 (SM 3)로부터의 ATX-43 (RL-43A)의 합성 경로를 나타낸다. 중간체 (Ints) 1-8 및 반응은 실시예 2에 기술되어 있다.
도 2은 옥탄오에이트 (SM 1), 4-아미노부탄산 (SM 2), 및 4-브로모부티르산 (SM 3)로부터의 ATX-57 (RL-43C)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-8 및 반응은 실시예 3에 기술되어 있다.
도 3은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3로부터의 ATX-58 (RL-43B)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-7 및 반응은 실시예 4에 기술되어 있다.
도 4은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3로부터의 ATX-81 (RL-48B)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-8 및 반응은 실시예 5에 기술되어 있다.
도 5은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3로부터의 ATX-82 (RL-47A)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-7 및 반응은 실시예 6에 기술되어 있다.
도 6은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3로부터의 ATX-86 (RL-48A)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-8 및 반응은 실시예 7에 기술되어 있다.
도 7은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3로부터의 ATX-87 (RL-48C)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-8 및 반응은 실시예 8에 기술되어 있다.
도 8은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3로부터의 ATX-88 (RL-48D)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-8 및 반응은 실시예 9에 기술되어 있다.
도 9은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3로부터의 ATX-83 (RL-47B)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-8 및 반응은 실시예 10에 기술되어 있다.
도 10은 도 2에서와 동일한 SM 1, SM 2 및 SM3로부터의 ATX-84 (RL-47C)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-8 및 반응은 실시예 11에 기술되어 있다.
도 11은 도 1에서와 동일한 SM 1 및 SM 2로부터의 ATX-61 (RL-42D)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-5 및 반응은 실시예 12에 기술되어 있다.
도 12은 도 1에서와 동일한 SM 1 및 SM 2로부터의 ATX-63 (RL-42A)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-5 및 반응은 실시예 13에 기술되어 있다.
도 13은 도 1에서와 동일한 SM 1 및 SM 2로부터의 ATX-64 (RL-42C)의 합성 경로를 나타낸다. Ints 1-5 및 반응은 실시예 14에 기술되어 있다.
도 14은 마우스 내로 ATX-2, ATX-57, ATX-81, ATX-82, ATX-83, ATX-84, ATX-85, ATX-86, 또는 ATX-87 양이온성 지질을 포함하는 나노입자 내 0.03 mg/kg 및 0.1 mg/kg mRNA의 주사 이후의 EPO mRNA 수준 (ng/ml)을 나타낸다.
도 15은 ATX-57 및 ATX-58를 갖는 리포좀의 항-인자 VII 넉다운 활성 vs. ATX-2 및 대조구 (PBS 단독)의 활성을 나타낸다.
도 16은 ATX-57를 갖는 리포좀의 항-EPO 넉다운 활성 vs. ATX-2의 활성을 나타낸다.
정의
"적어도 하나"는 하나 이상(예를 들어, 1 내지 3, 1 또는 2, 또는 1)을 의미한다.
"조성물"은 특정 양의 특정 성분을 포함하는 생성물뿐만 아니라, 특정 양의 특정 성분들의 조합으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생성되는 임의의 생성물을 의미한다.
"~와 병용하여"는 본 발명의 치료 방법에서 화학식 I의 화합물을 다른 약제와 함께 투여하는 것을 의미하는 것으로, 이는, 화학식 I의 화합물 및 다른 약제가 별개의 투여 형태로 순차적으로 또는 동시에 투여되거나, 또는 동일한 투여 형태로 동시에 투여되는 것을 의미한다.
"포유동물"은 인간 또는 다른 포유동물을 의미하거나, 또는 인간을 의미한다.
"환자"는 인간 및 다른 포유동물 둘 모두, 바람직하게는 인간을 의미한다.
"알킬"은 포화 또는 불포화, 직선형 또는 분지형 탄화수소 사슬을 의미한다. 다양한 구체예에서, 알킬 기는 탄소수 1 내지 18이며, 즉 C1-C18 기이거나, 또는 C1-C12 기, C1-C6 기, 또는 C1-C4 기이다. 독립적으로, 다양한 구체예에서, 알킬 기는 0개의 분지(즉, 직쇄임), 1개의 분지, 2개의 분지, 또는 2개 초과의 분지를 갖는다. "알케닐"은 1개의 이중 결합, 2개의 이중 결합, 또는 2개 초과의 이중 결합을 가질 수 있는 불포화 알킬이다. "알키닐"은 1개의 삼중 결합, 2개의 삼중 결합, 또는 2개 초과의 삼중 결합을 가질 수 있는 불포화 알킬이다. 알킬 사슬은 1개의 치환체(즉, 알킬 기가 일치환됨), 또는 1개 또는 2개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체, 또는 1 내지 4개의 치환체 등으로 선택적으로 치환될 수 있다. 치환체는 하이드록시, 아미노, 알킬아미노, 보로닐, 카르복시, 니트로, 시아노 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 알킬 기가 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 경우, 알킬 기는 본 명세서에서 헤테로알킬 기로 지칭된다. 알킬 기 상의 치환체가 탄화수소인 경우, 생성되는 기는 단순히 치환된 알킬로 지칭된다. 다양한 태양에서, 치환체를 포함하는 알킬 기는 탄소수가 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 또는 7 미만이다.
"저급 알킬"은 직선형 또는 분지형일 수 있는 사슬 내의 탄소수가 1 내지 6인 기를 의미한다. 적합한 알킬 기의 비제한적인 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, t-부틸, n-펜틸, 및 헥실이 포함된다.
"알콕시"는 알킬-O-기를 의미하며, 여기서 알킬은 상기에 정의된 바와 같다. 알콕시 기의 비제한적인 예에는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소프로폭시, n-부톡시 및 헵톡시가 포함된다. 모 모이어티(parent moiety)에 대한 결합은 에테르 산소를 통해 이루어진다.
"알콕시알킬"은 알콕시-알킬-기를 의미하며, 여기서 알콕시 및 알킬은 앞서 기재된 바와 같다. 바람직한 알콕시알킬은 저급 알킬 기를 포함한다. 모 모이어티에 대한 결합은 알킬을 통해 이루어진다.
"알킬아릴"은 알킬-아릴-기를 의미하며, 여기서 알킬 및 아릴은 앞서 기재된 바와 같다. 바람직한 알킬아릴은 저급 알킬 기를 포함한다. 모 모이어티에 대한 결합은 아릴을 통해 이루어진다.
"아미노알킬"은 NH2-알킬-기를 의미하며, 여기서 알킬은 상기에 정의된 바와 같으며, 상기 기는 알킬 기를 통해 모 모이어티에 결합된다.
"카르복시알킬"은 HOOC-알킬-기를 의미하며, 여기서 알킬은 상기에 정의된 바와 같으며, 상기 기는 알킬 기를 통해 모 모이어티에 결합된다.
본 명세서에 기재된 실시예에 사용된 화학물질 및 "구매가능한 화학물질"은 표준 상업적 공급원으로부터 입수될 수 있으며, 그러한 공급원에는, 예를 들어 Acros Organics (Pittsburgh, Pa.), Sigma-Adrich Chemical (Milwaukee, Wis.), Avocado Research (Lancashire, U.K.), Bionet (Cornwall, U.K.), Boron Molecular (Research Triangle Park, N.C.), Combi-Blocks (San Diego, Calif.), Eastman Organic Chemicals, Eastman Kodak Company (Rochester, N.Y.), Fisher Scientific Co. (Pittsburgh, Pa.), Frontier Scientific (Logan, Utah), ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, Calif.), Lancaster Synthesis (Windham, N.H.), Maybridge Chemical Co. (Cornwall, U.K.), Pierce Chemical Co. (Rockford, Ill.), Riedel de Haen (Hannover, Germany), Spectrum Quality Product, Inc. (New Brunswick, N.J.), TCI America (Portland, Oreg.), 및 Wako Chemicals USA, Inc. (Richmond, Va.)가 포함된다.
"화학 문헌에 기재된 화합물"은 당업자에게 공지된 바와 같이, 화학적 화합물 및 화학 반응에 관한 참고서적 및 데이터베이스를 통해 확인될 수 있다. 본 명세서에 개시된 화합물의 제조에 유용한 반응물질(reactant)의 합성을 상세히 설명하거나, 또는 본 명세서에 개시된 화합물의 제조를 설명하는 기사에 대한 참고문헌을 제공하는 적합한 참고서적 및 논문에는, 예를 들어, "Synthetic Organic Chemistry", John Wiley and Sons, Inc. New York; S. R. Sandler et al, "Organic Functional Group Preparations," 2nd Ed., Academic Press, New York, 1983; H. O. House, "Modern Synthetic Reactions," 2nd Ed., W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, Calif., 1972; T. L. Glichrist, "Heterocyclic Chemistry," 2nd Ed. John Wiley and Sons, New York, 1992; J. March, "Advanced Organic Chemistry: reactions, Mechanisms and Structure," 5th Ed., Wiley Interscience, New York, 2001이 포함된다. 또한 대부분의 공공 도서관 및 대학 도서관에서 이용가능한 미국 화학회(American Chemical Society)의 화학 초록 서비스(Chemical Abstract Service)에 의해 준비된 공지된 화학물질의 인덱스를 통해, 또한 온라인 데이터베이스를 통해 특정 반응물질 및 유사한 반응물질을 확인할 수 있다 (더 상세한 내용을 위해서는 미국 워싱턴 D.C 소재의 미국 화학회에 연락할 수 있다). 알려져 있지만 카탈로그에서 구매가능하지 않은 화학물질은 주문형 화학물질 합성업체에 의해 제조될 수 있는데, 여기서 (상기에 열거된 것들과 같은) 다수의 표준 화학물질 공급업체가 주문형 합성 서비스를 제공한다.
"할로"는 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도 기를 의미한다. 플루오로, 클로로 또는 브로모가 바람직하며, 플루오로 및 클로로가 더 바람직하다.
"할로겐"은 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드를 의미한다. 불소, 염소 및 브롬이 바람직하다.
"헤테로알킬"은 탄소 및 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 포화 또는 불포화, 직선형 또는 분지형 사슬을 의미한다. 다양한 구체예에서, 헤테로알킬 기는 1개의 헤테로원자, 또는 1개 또는 2개의 헤테로원자, 또는 1 내지 3개의 헤테로원자, 또는 1 내지 4개의 헤테로원자를 가질 수 있다. 일 태양에서, 헤테로알킬 사슬은 1 내지 18개(즉, 1-18)의 구성원 원자(탄소 및 헤테로원자)를 함유하며, 다양한 구체예에서 1 내지 12개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 구성원 원자를 함유한다. 독립적으로, 다양한 구체예에서, 헤테로알킬 기는 0개의 분지(즉, 직쇄임), 1개의 분지, 2개의 분지, 또는 2개 초과의 분지를 갖는다. 독립적으로, 일 구체예에서, 헤테로알킬 기는 포화된다. 다른 구체예에서, 헤테로알킬 기는 불포화된다. 다양한 구체예에서, 불포화 헤테로알킬은 1개의 이중 결합, 2개의 이중 결합, 2개 초과의 이중 결합, 및/또는 1개의 삼중 결합, 2개의 삼중 결합, 또는 2개 초과의 삼중 결합을 가질 수 있다. 헤테로알킬 사슬은 치환 또는 비치환될 수 있다. 일 구체예에서, 헤테로알킬 사슬은 비치환된다. 다른 구체예에서, 헤테로알킬 사슬은 치환된다. 치환된 헤테로알킬 사슬은 1개의 치환체를 가질 수 있거나(즉, 일치환에 의해), 또는, 예를 들어 1개 또는 2개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체, 또는 1 내지 4개의 치환체를 가질 수 있다. 예시적인 헤테로알킬 치환체는 에스테르(―C(O)―O―R) 및 카르보닐(―C(O)―)을 포함한다.
"하이드록시알킬"은 HO-알킬-기를 의미하며, 여기서 알킬은 앞서 정의되어 있다. 바람직한 하이드록시알킬은 저급 알킬을 함유한다. 적합한 하이드록시알킬 기의 비제한적인 예에는 하이드록시메틸 및 2-하이드록시에틸이 포함된다.
"수화물"은 용매 분자가 H2O인 용매화물을 의미한다.
"지질"은, 지방산의 에스테르를 포함하고 물 중에서는 불용성이지만 많은 유기 용매 중에서는 가용성인 것을 특징으로 하는 유기 화합물을 의미한다. 지질은 통상 적어도 3가지 부류로 나누어진다: (1) 지방 및 오일뿐만 아니라 왁스를 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질".
"지질 입자"는 치료적 핵산(예를 들어, mRNA)을 대상 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 지질 입자는 핵산-지질 입자로서, 이는 전형적으로 양이온성 지질, 비양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질(예를 들어, PEG-지질), 및 선택적으로 콜레스테롤로부터 형성된다. 전형적으로, 치료적 핵산(예를 들어, mRNA)은 입자의 지질 부분 내에 캡슐화되어, 치료적 핵산을 효소적 분해로부터 보호할 수 있다.
지질 입자는 전형적으로 평균 직경이 30 nm 내지 150 nm, 40 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 150 nm, 60 nm 내지 130 nm, 70 nm 내지 110 nm, 70 nm 내지 100 nm, 80 nm 내지 100 nm, 90 nm 내지 100 nm, 70 내지 90 nm, 80 nm 내지 90 nm, 70 nm 내지 80 nm, 또는 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm이고, 실질적으로 비독성이다. 게다가, 핵산은, 본 발명의 지질 입자 내에 존재할 때, 수용액 중에서 뉴클레아제에 의한 분해에 저항성이다.
"용매화물"은 본 명세서에 개시된 화합물과 하나 이상의 용매 분자의 물리적 결합물을 의미한다. 이 물리적 결합물은 수소 결합을 포함하는, 다양한 정도의 이온성 및 공유결합성 결합을 수반한다. 특정의 경우, 용매화물은 예를 들어 결정성 고체의 결정 격자 내에 하나 이상의 용매 분자가 함입되어 있는 경우 분리할 수 있다. "용매화물"은 용액-상 및 분리가능한 용매화물 둘 다를 포함한다. 적절한 용매화물의 비제한적 예시는 에탄올화물, 메탄올화물, 등을 포함한다.
" 캡슐화된 지질"은 완전 캡슐화, 부분 캡슐화, 또는 둘 모두로 치료적 핵산, 예컨대 mRNA를 제공하는 지질 입자를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 핵산(예를 들어, mRNA)은 지질 입자 내에 완전 캡슐화된다.
"지질 접합체"는 지질 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 의미한다. 그러한 지질 접합체는 PEG-지질 접합체, 예컨대 다이알킬옥시프로필에 결합된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합체), 다이아실글리세롤에 결합된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 결합된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 결합된 PEG, 및 세라마이드에 접합된 PEG, 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드 올리고머, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG 또는 POZ를 지질에 결합시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 비-에스테르-함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티가 포함된다. 특정의 바람직한 구체예에서, 비-에스테르-함유 링커 모이어티, 예컨대 아미드 또는 카르바메이트가 사용된다.
"양친매성 지질"은, 지질 물질의 소수성 부분은 소수성 상 내로 배향되고, 한편 친수성 부분은 수성 상을 향해 배향되는 물질을 의미한다. 친수성 특성은 극성 또는 하전된 기, 예컨대 탄수화물, 포스페이트, 카르복실, 설페이토, 아미노, 설프하이드릴, 니트로, 하이드록실, 및 다른 유사 기의 존재로부터 유래된다. 소수성은 비극성 기의 포함에 의해 부여될 수 있으며, 이러한 비극성 기에는 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기, 및 하나 이상의 방향족, 지환족, 또는 헤테로사이클릭 기(들)에 의해 치환된 그러한 기가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 양친매성 화합물의 예에는 인지질, 아미노지질, 및 스핑고지질이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
인지질의 대표적인 예에는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 다이팔미토일포스파티딜콜린, 다이올레일포스파티딜콜린, 다이스테아로일포스파티딜콜린, 및 다이리놀레오일포스파티딜콜린이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 인이 결여된 다른 화합물, 예컨대 스핑고지질, 글리코스핑고지질 패밀리, 다이아실글리세롤, 및 β-아실옥시산이 또한 양친매성 지질로 명명된 그룹 내에 있다. 추가적으로, 전술된 양친매성 지질은 다른 지질과 혼합될 수 있으며, 이러한 다른 지질에는 트라이글리세라이드 및 스테롤이 포함된다.
"중성 지질"은 선택된 pH에서 비하전된 또는 중성인 쌍성이온성 형태로 존재하는 지질종을 의미한다. 생리학적 pH에서, 그러한 지질은, 예를 들어 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로사이드, 및 다이아실글리세롤을 포함한다.
"비양이온성 지질"은 양친매성 지질 또는 중성 지질 또는 음이온성 지질을 의미하며, 하기에 더 상세히 설명되어 있다.
"음이온성 지질"은 생리학적 pH에서 음으로 하전된 지질을 의미한다. 이들 지질은 포스파티딜글리세롤, 카르디오리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-석시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 라이실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 결합된 다른 음이온성 변형 기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
"소수성 지질"은 비극성 기를 갖는 화합물을 의미하며, 이러한 비극성 기에는 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기, 및 하나 이상의 방향족, 지환족, 또는 헤테로사이클릭 기(들)에 의해 선택적으로 치환된 그러한 기가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 적합한 예에는 다이아실글리세롤, 다이알킬글리세롤, N-N-다이알킬아미노, 1,2-다이아실옥시-3-아미노프로판, 및 1,2-다이알킬-3-아미노프로판이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
"양이온성 지질"과 "아미노 지질"은 상호교환 가능하게 사용되며, 이들은 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 지방산 또는 지방 알킬 사슬 및 pH-적정가능한 아미노 헤드 기(예를 들어, 알킬아미노 또는 다이알킬아미노 헤드 기)를 갖는 지질 및 이의 염을 의미한다. 양이온성 지질은 전형적으로 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서는 양성자화되고(즉, 양으로 하전되고), pKa 초과의 pH에서는 실질적으로 중성이다. 본 발명의 양이온성 지질은 적정가능한 양이온성 지질로도 칭해질 수 있다. 일부 구체예에서, 양이온성 지질은 양성자성 3차 아민(예를 들어, pH-적정가능한) 헤드 기; C18 알킬 사슬 - 여기서, 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 0 내지 3개(예를 들어, 0, 1, 2, 또는 3개)의 이중 결합을 가짐 -; 및 헤드 기와 알킬 사슬 사이의 에테르, 에스테르, 또는 케탈 결합을 갖는다. 그러한 양이온성 지질은 DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA, γ-DLenDMA, DLin-K-DMA, DLin-K-C2-DMA(DLin-C2K-DMA, XTC2, 및 C2K로도 알려짐), DLin-K-C3 -DM A, DLin-K-C4-DMA, DLen-C2K-DMA, y-DLen-C2K-DMA, DLin- M-C2-DMA(MC2로도 알려짐), DLin-M-C3 -DMA(MC3으로도 알려짐) 및 (DLin-MP- DMA)(1-Bl 1로도 알려짐)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
"치환된"은 수소 이외의 특정 기, 또는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 기, 모이어티, 또는 라디칼로의 치환을 의미하며, 이들 각각은, 예를 들어, 독립적으로 선택된다.
"안티센스 핵산"은 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 또는 RNA-PNA(단백질 핵산; Egholm et al., 1993 Nature 365, 566) 상호작용에 의해 표적 RNA에 결합하고, 표적 RNA의 활성을 변경시키는 비효소적 핵산 분자를 의미한다(검토를 위해, Stein and Cheng, 1993 Science 261, 1004 및 Woolf 등의 미국 특허 제5,849,902호 참조). 전형적으로, 안티센스 분자는 안티센스 분자의 단일 인접 서열을 따라 표적 서열에 상보적이다. 그러나, 특정의 구체예에서, 안티센스 분자는 기질 분자가 루프를 형성하도록 기질에 결합할 수 있고/있거나, 안티센스 분자는 안티센스 분자가 루프를 형성하도록 결합할 수 있다. 따라서, 안티센스 분자는 2개의(또는 심지어 더 많은) 비인접 기질 서열에 상보적일 수 있거나, 또는 안티센스 분자의 2개의(또는 심지어 더 많은) 비인접 서열 부분이 표적 서열에 상보적일 수 있거나, 또는 둘 모두일 수 있다. 게다가, 안티센스 DNA는 DNA-RNA 상호작용에 의해 RNA를 표적화함으로써 이중체 내의 표적 RNA를 분해시키는 RNase H를 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 RNAse H 절단을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 RNAse H 활성화 영역을 포함할 수 있다. 안티센스 DNA는 화학적으로 합성되거나 또는 단일가닥 DNA 발현 벡터 또는 이의 등가물의 사용을 통해 발현될 수 있다. "안티센스 RNA"는 표적 유전자 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 RNA 가닥으로서, 이는 표적 유전자 mRNA에 결합함으로써 RNAi를 유도할 수 있다. "안티센스 RNA"는 표적 유전자 mRNA에 상보적인 서열을 갖고, 표적 유전자 mRNA에 결합함으로써 RNAi를 유도하는 것으로 여겨지는 RNA 가닥이다. "센스 RNA"는 안티센스 RNA에 상보적인 서열을 가지며, 이의 상보적 안티센스 RNA에 어닐링되어 iNA를 형성한다. 이들 안티센스 및 센스 RNA는 통상적으로 RNA 합성기에 의해 합성되어 왔다.
"핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 의미한다. 이 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 결합(linkage)을 함유하는 핵산을 포함하며, 이러한 핵산은 합성, 자연 발생, 및 천연 비발생 핵산이고, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 기준 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사된다. 그러한 유사체의 예에는, 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 및 펩티드-핵산(PNA)이 포함된다.
"RNA"는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보-푸라노스 모이어티의 2' 위치에 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다. 이들 용어는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 단리된 RNA, 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환, 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 상이한 변경된 RNA를 포함한다. 그러한 변경은, 예를 들어, 간섭 RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비-뉴클레오티드 물질을 부가하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자 내의 뉴클레오티드는 또한 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 천연 비발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "리보핵산" 및 "RNA"는, siRNA, 안티센스 RNA, 단일가닥 RNA, 마이크로RNA, mRNA, 논코딩 RNA, 및 다가 RNA를 포함한, 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 함유하는 분자를 지칭한다. 리보뉴클레오티드는 β-D-리보-푸라노스 모이어티의 2' 위치에 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오티드이다. 이들 용어는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 단리된 RNA, 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환, 변형, 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 상이한 변형된 및 변경된 RNA를 포함한다. RNA의 변경은, 예를 들어, 간섭 RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어 RNA 분자 내의 RNA 뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드 - 이에는 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 천연 비발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드가 포함됨 - 에 비-뉴클레오티드 물질을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체로 지칭될 수 있다.
"뉴클레오티드"는 당업계에 잘 알려진 천연 염기(표준) 및 변형된 염기를 의미한다. 그러한 염기는 일반적으로 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치에 위치한다. 뉴클레오티드는 일반적으로 염기, 당, 및 포스페이트 기를 포함한다. 뉴클레오티드는 당, 포스페이트, 및/또는 염기 모이어티에서 비변형 또는 변형될 수 있다(뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 비천연 뉴클레오티드, 비표준 뉴클레오티드 및 기타로도 상호교환 가능하게 지칭되며; 예를 들어, Usman and McSwiggen, 상기함; Eckstein 등의 국제 특허 출원 공개 WO 92/07065호; Usman 등의 국제 특허 출원 공개 WO 93/15187호; Uhlman & Peyman, 상기함, 참조, 이들 모두는 이로써 본 명세서에 참고로서 포함됨). Limbach, et al, Nucleic Acids Res. 22:2183, 1994에 의해 요약된 바와 같이 당업계에 알려진 변형된 핵산 염기의 몇몇 예가 있다. 핵산 분자 내로 도입될 수 있는 염기 변형의 비제한적인 예의 일부에는 하기가 포함된다: 이노신, 퓨린, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실, 2,4,6-트라이메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 다이하이드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘(예를 들어, 5-메틸시티딘), 5-알킬우리딘(예를 들어, 리보티미딘), 5-할로우리딘(예를 들어, 5-브로모우리딘) 또는 6-아자피리미딘 또는 6-알킬피리미딘(예를 들어, 6-메틸우리딘), 프로핀, 및 기타(Burgin, et al., Biochemistry 35:14090, 1996]; 문헌[Uhlman & Peyman, 상기함). 이러한 측면에서의 "변형된 염기"는 1' 위치에서의 아데닌, 구아닌, 시토신, 및 우라실 이외의 뉴클레오티드 염기 또는 이들의 등가물을 의미한다.
"상보적 뉴클레오티드 염기들"은 서로 수소 결합을 형성하는 한 쌍의 뉴클레오티드 염기를 의미한다. 아데닌(A)은 RNA 내의 티민(T) 또는 우라실(U)과 쌍을 이루고, 구아닌(G)은 시토신(C)과 쌍을 이룬다. 핵산의 상보적 세그먼트들 또는 가닥들은 서로 혼성화된다(즉, 수소 결합에 의해 결합된다). "상보적"이란, 핵산이 전통적인 왓슨-크릭(Watson-Crick)에 의해 또는 다른 비전통적인 결합 방식에 의해 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성할 수 있음을 의미한다.
"마이크로RNA"(miRNA)는 유전자 발현 miRNA를 조절하는, 21 내지 23개 길이의 뉴클레오티드의 단일가닥 RNA 분자를 의미하는 것으로서, DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 유전자(논코딩 RNA)에 의해 인코딩되고; 대신에, 이들은 pri-miRNA로 알려진 1차 전사체로부터 pre-miRNA로 불리는 짧은 스템-루프 구조로, 그리고 최종적으로 기능성 miRNA로 가공된다. 성숙 miRNA 분자는 하나 이상의 메신저 RNA(mRNA) 분자에 부분 상보적이며, 이들의 주요 기능은 유전자 발현을 하향조절하는 것이다.
"짧은 간섭 RNA(siRNA)" 및 "짧은 간섭 RNA" 및 "침묵 RNA"는 생물학에서 다양한 역할을 하는, 16 내지 40 개의 뉴클레오티드 길이의 이중가닥 RNA 분자의 부류를 의미한다. 가장 특히, siRNA는 RNA 간섭(RNAi) 경로에 관여하며, 여기서 siRNA는 특정 유전자의 발현을 방해한다. RNAi 경로에 있어서의 역할에 더하여, siRNA는 또한 RNAi-관련 경로에서, 예를 들어 항바이러스 기전으로서 또는 게놈의 염색질 구조를 형상화하는 데 작용하며; 이들 경로의 복잡성이 겨우 이제서야 해명되고 있다.
"RNAi"는, RNA-유도 침묵화 복합체(RISC)에 의해 제어되고 세포 내의 짧은 이중가닥 RNA 분자에 의해 개시되는 RNA-의존성 유전자 침묵화 과정을 의미하는 것으로, 여기서 짧은 이중가닥 RNA 분자는 촉매 RISC 성분 아르고노트(argonaute)와 상호작용한다. 이중가닥 RNA 또는 RNA-유사 iNA 또는 siRNA가 외인성(RNA 게놈을 가진 바이러스에 의한 감염으로부터 유래하거나 또는 형질감염된 iNA 또는 siRNA로부터 유래함)인 경우, RNA 또는 iNA는 세포질 내로 직접 유입되고 효소 다이서에 의해 짧은 단편으로 절단된다. 개시 dsRNA는 또한, 게놈에서 RNA-코딩 유전자로부터 발현되는 pre-마이크로RNA에서와 같이, 내인성(세포에서 기원됨)일 수 있다. 그러한 유전자로부터의 1차 전사체는 먼저 가공되어 핵에서 pre-miRNA의 특징적인 스템-루프 구조를 형성하고, 이어서 세포질로 내보내져 다이서에 의해 절단된다. 따라서, 외인성 및 내인성인 2개의 dsRNA 경로는 RISC 복합체에서 수렴된다. RNA-유도 침묵 복합체(RISC)의 활성 성분은 아르고노트 단백질이라고 불리는 엔도뉴클레아제이며, 이것은 그의 결합된 siRNA 또는 iNA에 상보적인 표적 mRNA 가닥을 절단한다. 다이서에 의해 생성된 단편은 이중가닥이기 때문에, 이들은 각각 이론적으로 기능성 siRNA 또는 iNA를 생성할 수 있다. 그러나, 2개의 가닥 중 단지 하나(가이드 가닥(guide strand)으로 알려짐)만이 아르고노트 단백질에 결합하고 유전자 침묵을 유도한다. 다른 하나의 안티-가이드 가닥 또는 패신저 가닥은 RISC 활성화 동안 분해된다.
화학식 I의 화합물
달리 나타내지 않는 한, 본 명세서의 화학식 I의 화합물에 대한 언급은 이의 염에 대한 언급을 포함하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "염(들)"은 무기 및/또는 유기 산으로 형성된 산성 염뿐만 아니라, 무기 및/또는 유기 염기로 형성된 염기성 염을 나타낸다. 게다가, 화학식 I의 화합물이, 피리딘 또는 이미다졸과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 염기성 모이어티, 및 카르복실산과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 산성 모이어티 둘 모두를 함유하는 경우, 쌍성이온("내염(inner salt)")이 형성될 수 있으며, 이는 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "염(들)" 내에 포함된다. 염은 약제학적으로 허용되는(즉, 비독성, 생리학적으로 허용되는) 염일 수 있지만, 다른 염이 또한 유용하다. 화학식 I의 화합물의 염은, 예를 들어, 화학식 I의 화합물을, 매체, 예컨대 염이 침전되는 매체 중에서, 또는 수성 매체 중에서 소정량, 예컨대 당량의 산 또는 염기와 반응시킨 후, 동결건조시킴으로써 형성될 수 있다.
예시적인 산 부가 염에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 석시네이트, 설페이트, 설포네이트(예컨대, 본 명세서에 언급된 것들), 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트(토실레이트로도 알려짐), 운데카노에이트 등이 포함된다. 추가적으로, 염기성 약제학적 화합물로부터의 약제학적으로 유용한 염의 형성에 적합한 것으로 일반적으로 여겨지는 산은, 예를 들어 S. Berge et al, J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1)1-19; P. Gould, International J. Pharmaceutics (1986) 33 201-217; Anderson et al., The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York에 의해; 그리고 The Orange Book (미국 워싱턴 D.C. 소재의 Food & Drug Administration, 이의 웹사이트 상에 있음)에 논의되어 있다. 이들 개시내용은 본 명세서에 참고로서 포함된다.
예시적인 염기성 염에는 암모늄 염, 알칼리 금속 염, 예컨대 나트륨, 리튬, 및 칼륨 염, 알칼리 토금속 염, 예컨대 칼슘 및 마그네슘 염, 유기 염기(예를 들어, 유기 아민), 예컨대 벤자틴, 다이사이클로헥실아민, 하이드라바민(N,N-비스(데하이드로아비에틸)에틸렌다이아민으로 형성됨), N-메틸-D-글루카민, N-메틸-D-글루카미드, t-부틸 아민과의 염, 및 아미노산, 예컨대 아르기닌 또는 라이신과의 염이 포함된다. 염기성 질소-함유 기는 저급 알킬 할라이드(예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드, 및 요오다이드), 다이알킬 설페이트(예를 들어, 다이메틸, 다이에틸, 다이부틸, 및 다이아밀 설페이트), 장쇄 할라이드(예를 들어, 데실, 라우릴, 미리스틸, 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드, 및 요오다이드), 아릴알킬 할라이드(예를 들어, 벤질 및 페네틸 브로마이드) 등과 같은 물질로 4차화될 수 있다.
그러한 모든 산 및 염기 염은 본 발명의 범주 내에서 약제학적으로 허용되는 염인 것으로 의도되며, 모든 산 및 염기 염은 본 발명의 목적상 상응하는 화학식 I의 화합물의 유리 형태와 동등한 것으로 간주된다.
화학식 I의 화합물은 비용매화된 형태, 및 수화된 형태를 포함하는 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 약제학적으로 허용되는 용매, 예컨대 물, 에탄올 등을 갖는 용매화된 형태는 본 발명의 목적상 비용매화된 형태와 동등하다.
화학식 I의 화합물 및 이의 염, 용매화물은 이들의 호변이성질체 형태로서 (예를 들어, 아미드 또는 이미노 에테르로서) 존재할 수 있다. 그러한 모든 호변이성질체 형태는 본 명세서에서 본 발명의 일부로서 고려된다.
또한, 본 발명의 화합물의 다형체가 본 발명의 범주 내에 있다(즉, 화학식 I의 화합물의 다형체는 본 발명의 범주 내에 있다).
본 화합물(이에는 본 화합물의 염, 용매화물, 및 전구약물뿐만 아니라 전구약물의 염 및 용매화물의 것들이 포함됨)의 모든 입체이성질체(예를 들어, 기하 이성질체, 광학 이성질체 등), 예컨대 다양한 치환체 상의 비대칭 탄소로 인해 존재할 수 있는 것들 - 이에는 거울상 이성질체 형태(이는 비대칭 탄소의 부재 하에서도 존재할 수 있음), 회전 이성질체 형태, 회전장애 이성질체, 및 부분입체 이성질체 형태가 포함됨 - 이 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 본 발명의 화합물의 개별 입체이성질체에는, 예를 들어 다른 이성질체가 실질적으로 없을 수 있거나, 또는, 예를 들어 라세미체로서 혼합될 수 있거나 다른 모든, 또는 다른 선택된 입체이성질체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 화합물의 키랄 중심은 IUPAC 1974 Recommendations에 의해 정의된 바와 같은 S 또는 R 배열을 가질 수 있다. 용어 "염", "용매화물" 등의 사용은 개시된 화합물의 거울상 이성질체, 입체이성질체, 회전이성질체, 호변이성질체, 라세미체, 또는 전구약물의 염 및 용매화물에 동일하게 적용되는 것으로 의도된다.
화학치료제(항신생물제)로서 사용될 수 있는 화합물의 부류에는 알킬화제, 항대사물질제, 천연 산물 및 이들의 유도체, 호르몬 및 스테로이드(합성 유사체를 포함함), 및 합성물질이 포함된다. 이들 부류 내의 화합물의 예가 하기에 주어져 있다.
지질 입자
화학식 I의 화합물은 지질 분자의 이중층 또는 나노입자를 포함하는 지질 조성물 내의 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 지질 이중층은 바람직하게는 중성 지질 또는 중합체를 추가로 포함한다. 지질 조성물은 바람직하게는 액체 매체를 포함한다. 이 조성물은 바람직하게는 추가로 핵산을 캡슐화한다. 핵산은 바람직하게는 RNA 간섭(RNAi)을 이용함으로써 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 갖는다. 지질 조성물은 바람직하게는 핵산 및 중성 지질 또는 중합체를 추가로 포함한다. 지질 조성물은 바람직하게는 핵산을 캡슐화한다.
본 발명은 지질 입자를 제공하며, 상기 지질 입자는 그 안에 캡슐화된 하나 이상의 치료적 mRNA 분자를 포함한다.
일부 구체예에서, mRNA는 지질 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화되어, 지질 입자 내의 mRNA가 수용액 중에서 뉴클레아제 분해에 저항성을 나타내게 한다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 지질 입자는 포유동물, 예컨대 인간에 대해 실질적으로 비독성이다. 지질 입자는 전형적으로 평균 직경이 30 nm 내지 150 nm, 40 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 150 nm, 60 nm 내지 130 nm, 70 nm 내지 110 nm, 또는 70 내지 90 nm이다. 본 발명의 지질 입자는 또한 전형적으로 지질:RNA 비(질량/질량 비)가 1:1 내지 100:1, 1:1 내지 50:1, 2:1 내지 25:1, 3:1 내지 20:1, 5:1 내지 15:1, 또는 5:1 내지 10:1, 또는 10:1 내지 14:1, 또는 9:1 내지 20:1이다. 일 구체예에서, 지질 입자는 지질: RNA 비(질량/질량 비)가 12:1이다. 다른 구체예에서, 지질 입자는 지질: mRNA 비(질량/질량 비)가 13:1이다.
바람직한 구체예에서, 지질 입자는 mRNA, 양이온성 지질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 양이온성 지질 또는 이의 염), 인지질, 및 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질(예를 들어, 하나 이상의 PEG-지질 접합체)을 포함한다. 지질 입자는 또한 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 지질 입자는 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 mRNA를 포함할 수 있다.
핵산-지질 입자에서, mRNA는 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화되어, 뉴클레아제 분해로부터 핵산을 보호할 수 있다. 바람직한 구체예에서, mRNA를 포함하는 지질 입자는 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화되어, 뉴클레아제 분해로부터 핵산을 보호한다. 특정의 경우에, 지질 입자 내의 mRNA는 37℃에서 적어도 20, 30, 45, 또는 60분 동안 뉴클레아제에 대한 입자의 노출 후에 실질적으로 분해되지 않는다. 특정의 다른 경우에, 지질 입자 내의 mRNA는 37℃에서 적어도 30, 45, 또는 60분 동안 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 또는 36시간 동안 혈청 중에서의 입자의 인큐베이션 후에 실질적으로 분해되지 않는다. 다른 구체예에서, mRNA는 입자의 지질 부분과 복합체화된다. 본 발명의 제형의 이점 중 하나는 핵산-지질 입자 조성물이 포유동물, 예컨대 인간에 대해 실질적으로 비독성이라는 점이다.
"완전히 캡슐화된"은 유리 RNA를 상당히 분해시키는 뉴클레아제 검정 또는 혈청에 대한 노출 후에 핵산-지질 입자 내의 핵산(예를 들어, mRNA)이 상당히 분해되지 않음을 의미한다. 완전히 캡슐화되는 경우, 100%의 유리 핵산을 통상 분해하는 처리에서, 바람직하게는 입자 내의 핵산의 25% 미만이 분해되며, 더 바람직하게는 입자 내의 핵산의 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 5% 미만이 분해된다. "완전히 캡슐화된"은 또한 생체내(in vivo) 투여 시에 핵산-지질 입자가 그의 성분 부분으로 신속하게 분해되지 않음을 의미한다.
핵산과 관련하여, 완전 캡슐화는 핵산과 회합될 때 형광이 향상되는 염료를 사용하는 막-불투과성 형광 염료 배제 분석을 수행함으로써 결정될 수 있다. 캡슐화는, 염료를 리포좀 제형에 첨가하고, 얻어지는 형광을 측정하고, 이것을 소량의 비이온성 표면활성제의 첨가 시에 관찰되는 형광과 대비함으로써 결정된다. 리포좀 이중층의 표면활성제-매개된 파괴는 캡슐화된 핵산을 방출시켜, 캡슐화된 핵산이 막-불투과성 염료와 상호작용할 수 있게 한다. 핵산 캡슐화는 E = (I0 - I)/I0으로서 계산될 수 있으며, 여기서 I 및 I0은 표면활성제의 첨가 전과 후의 형광 강도를 지칭한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 복수의 핵산-지질 입자를 포함하는 핵산-지질 입자 조성물을 제공한다.
지질 입자는 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화된 mRNA를 포함하여, 입자의 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 90% 내지 100%, 30% 내지 95%, 40% 내지 95%, 50% 내지 95%, 60% 내지 95%, 70% 내지 95%, 80% 내지 95%, 85% 내지 95%, 90% 내지 95%, 30% 내지 90%, 40% 내지 90%, 50% 내지 90%, 60% 내지 90%, 70% 내지 90%, 80% 내지 90%, 또는 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)가 그 안에 캡슐화된 mRNA를 갖는다.
지질 입자의 의도된 용도에 따라, 성분들의 비율이 변동될 수 있으며, 특정 제형의 전달 효율은 당업계에 알려진 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
양이온성 지질
본 발명은 특정의 양이온성 지질 화합물의 합성을 포함한다. 본 화합물은 이어지는 섹션에서 입증된 바와 같이 세포 및 조직에 폴리뉴클레오티드를 전달하는 데 특히 적합하다. 이뿐만 아니라, 본 명세서에 기재된 지질거대사이클(lipomacrocycle) 화합물은, 예를 들어 수령체(recipient) 및 첨가제로서뿐만 아니라 다른 목적에 사용될 수 있다.
양이온성 지질 화합물의 합성 방법은 당업계의 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 당업자는 이들 화합물을 생성하고, 그리고 또한 본 발명의 다른 화합물을 생성하는 다른 방법을 이해할 것이다.
양이온성 지질 화합물은 물질과 배합되어 미세입자, 나노입자, 리포좀, 또는 미셀을 형성할 수 있다. 입자, 리포좀, 또는 미셀에 의해 전달되는 물질은 기체, 액체, 또는 고체 형태일 수 있으며, 물질은 폴리뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 또는 소분자일 수 있다. 지질거대사이클 화합물은 다른 양이온성 지질 화합물, 중합체(합성 또는 천연), 계면활성제, 콜레스테롤, 탄수화물, 단백질, 또는 지질과 배합되어 입자를 형성할 수 있다. 이어서, 이들 입자는 선택적으로 약제학적 부형제와 배합되어 약제학적 조성물을 형성할 수 있다.
본 발명은 신규한 양이온성 지질 화합물 및 그러한 양이온성 지질 화합물의 사용에 기초한 약물 전달 시스템을 제공한다. 본 시스템은 환자, 조직, 기관, 또는 세포에 폴리뉴클레오티드, 단백질, 소분자, 펩티드, 항원, 또는 약물을 전달하기 위한 제약/약물 전달 기술분야에 사용될 수 있다. 이들 신규한 화합물은 또한 코팅, 첨가제, 부형제, 재료, 또는 바이오엔지니어링(bioengineering)을 위한 물질로서 사용될 수 있다.
본 발명의 양이온성 지질 화합물은 약물 전달 기술분야에서 몇몇 상이한 용도를 제공한다. 양이온성 지질 화합물의 아민-함유 부분은 폴리뉴클레오티드를 복합체화하는 데 사용되어, 폴리뉴클레오티드의 전달을 향상시키고 이들의 분해를 방지할 수 있다. 양이온성 지질 화합물은 또한 전달하고자 하는 물질을 함유하는 피코입자, 나노입자, 미세입자, 리포좀, 및 미셀의 형성에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 양이온성 지질 화합물은 생체적합성이고 생분해성이며, 형성된 입자는 또한 생분해성이고 생체적합성이며 전달하고자 하는 물질의 제어된 지속 방출을 제공하는 데 사용될 수 있다. 이들 입자 및 이들의 상응하는 입자는 또한, 이들이 더 낮은 pH에서 양성자화되는 것을 고려하면, pH 변화에 반응할 수 있다. 이들은 또한 세포에 대한 물질의 전달 시에 양성자 스펀지로서 작용하여 엔도솜 용해를 야기할 수 있다.
특정의 구체예에서, 양이온성 지질 화합물은 비교적 비세포독성이다. 양이온성 지질 화합물은 생체적합성이고 생분해성일 수 있다. 양이온성 지질은 pKa가 대략 5.5 내지 대략 7.5, 더 바람직하게는 대략 6.0 내지 대략 7.0의 범위일 수 있다. 이것은 대략 3.0 내지 대략 9.0, 또는 대략 5.0 내지 대략 8.0의 원하는 pKa를 갖도록 설계될 수 있다. 본 명세서에 기재된 양이온성 지질 화합물은 다음과 같은 몇 가지 이유로 약물 전달에 특히 매력적이다: 이들은 DNA, RNA, 다른 폴리뉴클레오티드, 및 다른 음으로 하전된 물질과 상호작용하기 위한, pH를 완충시키기 위한, 엔도-삼투용해(endo-osmolysis)를 야기하기 위한, 전달하고자 하는 물질을 보호하기 위한 아미노 기를 함유하고/하거나; 이들은 구매가능한 출발 물질로부터 합성될 수 있고/있거나; 이들은 pH 반응성이고 원하는 pKa로 조작될 수 있다.
중성 헬퍼 지질
비양이온성 지질의 비제한적인 예에는 인지질, 예컨대 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카르디오리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 다이세틸포스페이트, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이올레일포스파티딜콜린(DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이올레일포스파티딜글리세롤(DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜글리세롤(POPG), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 다이팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE), 다이미리스토일-포스파티딜에탄올아민(DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 다이메틸-포스파티딜에탄올아민, 다이엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 스테아로일올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 리소포스파티딜콜린, 다이리놀레오일포스파티딜콜린, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 다른 다이아실포스파티딜콜린 및 다이아실포스파티딜에탄올아민 인지질이 또한 사용될 수 있다. 이들 지질 내의 아실 기는 바람직하게는 C10-C24 탄소 사슬을 갖는 지방산으로부터 유도되는 아실 기, 예를 들어 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일, 또는 올레오일이다.
비양이온성 지질의 추가의 예에는 스테롤, 예컨대 콜레스테롤 및 이의 유도체가 포함된다. 콜레스테롤 유도체의 비제한적인 예에는 극성 유사체, 예컨대 5α-콜레스타놀, 5α-코프로스타놀, 콜레스테릴-(2'-하이드록시)-에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르, 및 6-케토콜레스타놀; 비극성 유사체, 예컨대 5α-콜레스탄, 콜레스테논, 5α-콜레스타논, 5α-콜레스타논, 및 콜레스테릴 데카노에이트; 및 이들의 혼합물이 포함된다. 바람직한 구체예에서, 콜레스테롤 유도체는 극성 유사체, 예컨대 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르이다.
일부 구체예에서, 지질 입자에 존재하는 비양이온성 지질은 하나 이상의 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 구체예에서, 지질 입자에 존재하는 비양이온성 지질은 하나 이상의 인지질을 포함하거나 이로 이루어지며, 예를 들어 콜레스테롤-무함유 지질 입자 제형이다. 다른 구체예에서, 지질 입자에 존재하는 비양이온성 지질은 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 포함하거나 이로 이루어지며, 예를 들어 인지질-무함유 지질 입자 제형이다.
비양이온성 지질의 다른 예에는 비인(nonphosphorous) 함유 지질, 예컨대 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤 리시놀레에이트, 헥사데실 스테아레이트, 아이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴 중합체, 트라이에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트 폴리에틸옥실화 지방산 아미드, 다이옥타데실다이메틸 암모늄 브로마이드, 세라마이드, 및 스핑고미엘린이 포함된다.
일부 구체예에서, 비양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 10 몰% 내지 60 몰%, 20 몰% 내지 55 몰%, 20 몰% 내지 45 몰%, 20 몰% 내지 40 몰%, 25 몰% 내지 50 몰%, 25 몰% 내지 45 몰%, 30 몰% 내지 50 몰%, 30 몰% 내지 45 몰%, 30 몰% 내지 40 몰%, 35 몰% 내지 45 몰%, 37 몰% 내지 42 몰%, 또는 35 몰%, 36 몰%, 37 몰%, 38 몰%, 39 몰%, 40 몰%, 41 몰%, 42 몰%, 43 몰%, 44 몰%, 또는 45 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
지질 입자가 인지질 및 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체의 혼합물을 함유하는 구체예에서, 상기 혼합물은 입자에 존재하는 총 지질의 최대 40 몰%, 45 몰%, 50 몰%, 55 몰%, 또는 60 몰%를 구성할 수 있다.
일부 구체예에서, 혼합물 내의 인지질 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 2 몰% 내지 20 몰%, 2 몰% 내지 15 몰%, 2 몰% 내지 12 몰%, 4 몰% 내지 15 몰%, 또는 4 몰% 내지 10 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성할 수 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, 혼합물 내의 인지질 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 5 몰% 내지 10 몰%, 5 몰% 내지 9 몰%, 5 몰% 내지 8 몰%, 6 몰% 내지 9 몰%, 6 몰% 내지 8 몰%, 또는 5 몰%, 6 몰%, 7 몰%, 8 몰%, 9 몰%, 또는 10 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
다른 구체예에서, 혼합물 내의 콜레스테롤 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 25 몰% 내지 45 몰%, 25 몰% 내지 40 몰%, 30 몰% 내지 45 몰%, 30 몰% 내지 40 몰%, 27 몰% 내지 37 몰%, 25 몰% 내지 30 몰%, 또는 35 몰% 내지 40 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성할 수 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, 혼합물 내의 콜레스테롤 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 25 몰% 내지 35 몰%, 27 몰% 내지 35 몰%, 29 몰% 내지 35 몰%, 30 몰% 내지 35 몰%, 30 몰% 내지 34 몰%, 31 몰% 내지 33 몰%, 또는 30 몰%, 31 몰%, 32 몰%, 33 몰%, 34 몰%, 또는 35 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
지질 입자가 인지질-무함유인 구체예에서, 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 입자에 존재하는 총 지질의 최대 25 몰%, 30 몰%, 35 몰%, 40 몰%, 45 몰%, 50 몰%, 55 몰%, 또는 60 몰%를 구성할 수 있다.
일부 구체예에서, 인지질-무함유 지질 입자 제형 내의 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 입자에 존재하는 총 지질의 25 몰% 내지 45 몰%, 25 몰% 내지 40 몰%, 30 몰% 내지 45 몰%, 30 몰% 내지 40 몰%, 31 몰% 내지 39 몰%, 32 몰% 내지 38 몰%, 33 몰% 내지 37 몰%, 35 몰% 내지 45 몰%, 30 몰% 내지 35 몰%, 35 몰% 내지 40 몰%, 또는 30 몰%, 31 몰%, 32 몰%, 33 몰%, 34 몰%, 35 몰%, 36 몰%, 37 몰%, 38 몰%, 39 몰%, 또는 40 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성할 수 있다.
다른 구체예에서, 비양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 5 몰% 내지 90 몰%, 10 몰% 내지 85 몰%, 20 몰% 내지 80 몰%, 10 몰%(예를 들어, 인지질 단독), 또는 60 몰%(예를 들어, 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체)(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
지질 입자에 존재하는 비양이온성 지질의 백분율은 목표량이며, 제형에 존재하는 비양이온성 지질의 실제량은, 예를 들어 ± 5 몰%만큼 변동될 수 있다.
양이온성 지질 화합물을 함유하는 조성물은 30 내지 70%의 양이온성 지질 화합물, 0 내지 60%의 콜레스테롤, 0 내지 30%의 인지질 및 1 내지 10%의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 30 내지 40%의 양이온성 지질 화합물, 40 내지 50%의 콜레스테롤, 및 10 내지 20%의 PEG이다. 다른 바람직한 구체예에서, 조성물은 50 내지 75%의 양이온성 지질 화합물, 20 내지 40%의 콜레스테롤 및 5 내지 10%의 인지질, 및 1 내지 10%의 PEG이다. 조성물은 60 내지 70%의 양이온성 지질 화합물, 25 내지 35%의 콜레스테롤, 및 5 내지 10%의 PEG를 함유할 수 있다. 조성물은 최대 90%의 양이온성 지질 화합물 및 2 내지 15%의 헬퍼 지질을 함유할 수 있다.
제형은, 예를 들어 8 내지 30%의 화합물, 5 내지 30%의 헬퍼 지질, 및 0 내지 20%의 콜레스테롤; 4 내지 25%의 양이온성 지질, 4 내지 25%의 헬퍼 지질, 2 내지 25%의 콜레스테롤, 10 내지 35%의 콜레스테롤-PEG, 및 5%의 콜레스테롤-아민; 또는 2 내지 30%의 양이온성 지질, 2 내지 30%의 헬퍼 지질, 1 내지 15%의 콜레스테롤, 2 내지 35%의 콜레스테롤-PEG, 및 1 내지 20%의 콜레스테롤-아민; 또는 최대 90%의 양이온성 지질 및 2 내지 10%의 헬퍼 지질, 또는 심지어 100%의 양이온성 지질을 함유하는 지질 입자 제형일 수 있다.
지질 접합체
양이온성 지질에 더하여, 본 명세서에 기재된 지질 입자는 지질 접합체를 추가로 포함할 수 있다. 접합된 지질은 그것이 입자의 응집을 방지한다는 점에 있어서 유용하다. 적합한 접합된 지질은 PEG-지질 접합체, 양이온성-중합체-지질 접합체, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
바람직한 구체예에서, 지질 접합체는 PEG-지질이다. PEG-지질의 예에는 다이알킬옥시프로필에 결합된 PEG(PEG-DAA), 다이아실글리세롤에 결합된 PEG(PEG-DAG), 포스파티딜에탄올아민과 같은 인지질에 결합된 PEG(PEG-PE), 세라마이드에 접합된 PEG, 콜레스테롤 또는 이의 유도체에 접합된 PEG, 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
PEG는 2개의 말단 하이드록실 기를 갖는 에틸렌 PEG 반복 단위의 선형 수용성 중합체이다. PEG는 그들의 분자량으로 분류되며, 하기가 포함된다: 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜- 석시네이트(MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석신이미딜 석시네이트(MePEG-S- NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민(MePEG-NH2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트(MePEG-TRES), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카르보닐(MePEG-IM)뿐만 아니라, 말단 메톡시 기 대신에 말단 하이드록실 기를 함유하는 그러한 화합물(예를 들어, HO-PEG-S, HO-PEG-S-NHS, HO-PEG-NH2).
본 명세서에 기재된 PEG-지질 접합체의 PEG 모이어티는 평균 분자량이 550 달톤 내지 10,000 달톤의 범위일 수 있다. 특정의 경우에, PEG 모이어티는 평균 분자량이 750 달톤 내지 5,000 달톤(예를 들어, 1,000 달톤 내지 5,000 달톤, 1,500 달톤 내지 3,000 달톤, 750 달톤 내지 3,000 달톤, 750 달톤 내지 2,000 달톤)이다. 바람직한 구체예에서, PEG 모이어티는 평균 분자량이 2,000 달톤 또는 750 달톤이다.
특정의 경우에, PEG는 알킬, 알콕시, 아실, 또는 아릴 기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. PEG는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG를 지질에 결합시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 에스테르-비함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티가 포함된다. 바람직한 구체예에서, 링커 모이어티는 에스테르-비함유 링커 모이어티이다. 적합한 에스테르-비함유 링커 모이어티는 아미도(-C(O)NH-), 아미노(-NR-), 카르보닐(-C(O)-), 카르바메이트(-NHC(O)O-), 우레아(-NHC(O)NH-), 다이설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 석시닐(-(O)CCH2CH2C(O)-), 석신아미딜(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), 에테르, 다이설파이드뿐만 아니라 이들의 조합(예컨대, 카르바메이트 링커 모이어티 및 아미도 링커 모이어티 둘 모두를 함유하는 링커)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 카르바메이트 링커가 PEG를 지질에 결합시키는 데 사용된다.
다른 구체예에서, 에스테르-함유 링커 모이어티가 PEG를 지질에 결합시키는 데 사용된다. 적합한 에스테르-함유 링커 모이어티는, 예를 들어 카르보네이트(-OC(O)O-), 석시노일, 포스페이트 에스테르(-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르, 및 이들의 조합을 포함한다.
다양한 사슬 길이 및 포화도의 다양한 아실 사슬 기를 갖는 포스파티딜에탄올아민이 PEG에 접합되어 지질 접합체를 형성할 수 있다. 그러한 포스파티딜에탄올아민은 구매가능하거나, 또는 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 단리되거나 합성될 수 있다. 탄소 사슬 길이가 C10 내지 C20의 범위인 포화 또는 불포화 지방산을 함유하는 포스파티딜에탄올아민이 바람직하다. 모노- 또는 다이-불포화 지방산 및 포화 지방산과 불포화 지방산의 혼합물을 갖는 포스파티딜에탄올아민이 또한 사용될 수 있다. 적합한 포스파티딜에탄올아민은 다이미리스토일-포스파티딜에탄올아민(DMPE), 다이팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE), 다이올레일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 및 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "다이아실글리세롤" 또는 "DAG"는 2개의 지방 아실 사슬, R1 및 R2를 갖는 화합물을 포함하며, 이들 둘 모두는 독립적으로 에스테르 결합에 의해 글리세롤의 1- 및 2-위치에 결합된 2 내지 30개의 탄소를 갖는다. 아실 기는 포화되거나 다양한 불포화도를 가질 수 있다. 적합한 아실 기에는 라우로일(C12), 미리스토일(C14), 팔미토일(C16), 스테아로일(C18), 및 아이코소일(C20)이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구체예에서, R1과 R2는 동일하며, 즉 R1 및 R2는 둘 모두 미리스토일(즉, 다이미리스토일)이고, R1 및 R2는 둘 모두 스테아로일(즉, 다이스테아로일)이다.
용어 "다이알킬옥시프로필" 또는 "DAA"는 2개의 알킬 사슬, R1 및 R2를 갖는 화합물을 포함하며, 이들 둘 모두는 독립적으로 2 내지 30개의 탄소를 갖는다. 알킬 기는 포화되거나 다양한 불포화도를 가질 수 있다.
바람직하게는, PEG-DAA 접합체는 PEG-다이데실옥시프로필(C10) 접합체, PEG-다이라우릴옥시프로필(C12) 접합체, PEG-다이미리스틸옥시프로필(C14) 접합체, PEG-다이팔미토일옥시프로필(C16) 접합체, 또는 PEG-다이스테아릴옥시프로필(C18) 접합체이다. 이들 구체예에서, PEG는 바람직하게는 평균 분자량이 750 또는 2,000 달톤이다. 특정 구체예에서, PEG의 말단 하이드록실 기는 메틸 기로 치환된다.
전술한 것에 더하여, 다른 친수성 중합체가 PEG 대신에 사용될 수 있다. PEG 대신에 사용될 수 있는 적합한 중합체의 예에는 폴리비닐피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리다이메틸아크릴아미드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 유도체화된 셀룰로스, 예컨대 하이드록시메틸셀룰로스 또는 하이드록시에틸셀룰로스가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 지질 접합체(예를 들어, PEG-지질)는 입자에 존재하는 총 지질의 0.1 몰% 내지 2 몰%, 0.5 몰% 내지 2 몰%, 1 몰% 내지 2 몰%, 0.6 몰% 내지 1.9 몰%, 0.7 몰% 내지 1.8 몰%, 0.8 몰% 내지 1.7 몰%, 0.9 몰% 내지 1.6 몰%, 0.9 몰% 내지 1.8 몰%, 1 몰% 내지 1.8 몰%, 1 몰% 내지 1.7 몰%, 1.2 몰% 내지 1.8 몰%, 1.2 몰% 내지 1.7 몰%, 1.3 몰% 내지 1.6 몰%, 또는 1.4 몰% 내지 1.5 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다. 다른 구체예에서, 지질 접합체(예를 들어, PEG-지질)는 입자에 존재하는 총 지질의 0 몰% 내지 20 몰%, 0.5 몰% 내지 20 몰%, 2 몰% 내지 20 몰%, 1.5 몰% 내지 18 몰%, 2 몰% 내지 15 몰%, 4 몰% 내지 15 몰%, 2 몰% 내지 12 몰%, 5 몰% 내지 12 몰%, 또는 2 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
추가의 구체예에서, 지질 접합체(예를 들어, PEG-지질)는 입자에 존재하는 총 지질의 4 몰% 내지 10 몰%, 5 몰% 내지 10 몰%, 5 몰% 내지 9 몰%, 5 몰% 내지 8 몰%, 6 몰% 내지 9 몰%, 6 몰% 내지 8 몰%, 또는 5 몰%, 6 몰%, 7 몰%, 8 몰%, 9 몰%, 또는 10 몰%(또는 이들의 임의의 일부 또는 그 안의 범위)를 구성한다.
본 발명의 지질 입자에 존재하는 지질 접합체(예를 들어, PEG-지질)의 백분율은 목표량이며, 제형에 존재하는 지질 접합체의 실제량은, 예를 들어 ± 2 몰%만큼 변동될 수 있다. 당업자는 지질 접합체의 농도가, 사용되는 지질 접합체 및 지질 입자가 융합유도성(fusogenic)이 되는 속도에 따라 변동될 수 있음을 이해할 것이다.
지질 접합체의 조성 및 농도를 제어함으로써, 지질 접합체가 지질 입자로부터 교환되는 속도, 및 결과적으로, 지질 입자가 융합유도성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 게다가, 예를 들어 pH, 온도, 또는 이온 강도를 포함하는 다른 변수가, 지질 입자가 융합유도성이 되는 속도를 변동시키고/시키거나 제어하는 데 사용될 수 있다. 지질 입자가 융합유도성이 되는 속도를 제어하는 데 사용될 수 있는 다른 방법은 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백해질 것이다. 또한, 지질 접합체의 조성 및 농도를 제어함으로써, 지질 입자 크기를 제어할 수 있다.
투여를 위한 조성물 및 제형
본 발명의 핵산-지질 조성물은 다양한 경로에 의해, 예를 들어 전신 전달을 달성하기 위해 정맥내, 비경구, 복막내, 또는 국소 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, siRNA가, 예를 들어 폐 또는 간과 같은 표적 조직의 세포에서 또는 염증 조직에서, 세포내 전달될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 생체내에서의 siRNA의 전달 방법을 제공한다. 핵산-지질 조성물은 대상체에게 정맥내, 피하, 또는 복막내 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 포유류 대상체의 폐에 간섭 RNA를 생체내 전달하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 포유류 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 핵산, 양이온성 지질, 양친매성 물질, 인지질, 콜레스테롤, 및 PEG-연결된 콜레스테롤을 함유하는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량이, 상기 조성물에 의해 저하, 감소, 하향조절, 또는 침묵될 수 있는 유전자의 발현 또는 과발현과 관련된 질병 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 다양한 점막 투여 방식에 의해 대상체에게 투여될 수 있으며, 이에는 경구, 직장내, 질내, 비강내, 폐내, 또는 경피 또는 피부 전달에 의한 것, 또는 눈, 귀, 피부, 또는 다른 점막 표면으로의 국소 전달에 의한 것이 포함된다. 본 발명의 일부 태양에서, 점막 조직 층은 상피 세포 층을 포함한다. 상피 세포는 폐, 기관, 기관지, 폐포, 비강, 협측, 표피, 또는 위장 상피 세포일 수 있다. 본 발명의 조성물은 통상적인 액츄에이터, 예컨대 기계식 분무 장치뿐만 아니라 가압형, 전기 작동형, 또는 다른 유형의 액츄에이터를 사용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비강 또는 폐 스프레이로서 수용액으로 투여될 수 있으며, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 분무 형태로 분배될 수 있다. 본 발명의 조성물의 폐 전달은, 예를 들어 에어로졸화(aerosolize), 무화(atomize), 또는 연무화(nebulize)될 수 있는 액적, 입자, 또는 분무의 형태로 조성물을 투여함으로써 달성된다. 조성물, 분무, 또는 에어로졸의 입자는 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 비강 스프레이로서 액체를 분배하기에 바람직한 시스템이 미국 특허 제4,511,069호에 개시되어 있다. 그러한 제형은 본 발명에 따른 조성물을 물 중에 용해시켜 수용액을 생성하고, 상기 용액을 멸균되게 함으로써 편리하게 제조될 수 있다. 제형은 다회-용량 용기로, 예를 들어 미국 특허 제4,511,069호에 개시된 밀봉된 분배 시스템으로 제공될 수 있다. 다른 적합한 비강 스프레이 전달 시스템이 문헌[TRANSDERMAL SYSTEMIC MEDICATION, Y. W. Chien ed., Elsevier Publishers, New York, 1985]; 및 미국 특허 제4,778,810호에 기재되어 있다. 추가의 에어로졸 전달 형태는, 예를 들어, 압축 공기-, 제트-, 초음파-, 및 압전 네뷸라이저(piezoelectric nebulizer)를 포함할 수 있는데, 이들은 약제학적 용매, 예를 들어 물, 에탄올, 또는 이들의 혼합물 중에 용해되거나 현탁된 생물학적 활성제를 전달한다.
본 발명의 비강 및 폐 분무 용액은 전형적으로, 선택적으로 표면 활성제, 예컨대 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트-80), 및 하나 이상의 완충제와 함께 제형화되는, 전달하고자 하는 약물 또는 약물들을 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 비강 분무 용액은 추진제를 추가로 포함한다. 비강 분무 용액의 pH는 pH 6.8 내지 7.2일 수 있다. 사용되는 약제학적 용매는 또한 pH 4 내지 6의 약간 산성인 수성 완충제일 수 있다. 화학적 안정성을 향상시키거나 유지하기 위하여, 방부제, 계면활성제, 분산제, 또는 가스를 비롯한 다른 성분이 첨가될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 함유하는 용액 및 폐, 점막, 또는 비강내 분무 또는 에어로졸을 위한 액추에이터를 포함하는 의약 제품이다.
본 발명의 조성물의 투여 형태는 액체일 수 있으며, 이때 액체는 액적 또는 에멀젼의 형태이거나, 또는 에어로졸의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 형태는 고체일 수 있으며, 이는 투여 전에 액체 중에 재구성될 수 있다. 고체는 분말로서 투여될 수 있다. 고체는 캡슐, 정제, 또는 겔의 형태일 수 있다.
본 개시내용 내에서 폐 전달을 위한 조성물을 제형화하기 위하여, 생물학적 활성제는 다양한 약제학적으로 허용되는 첨가제뿐만 아니라 활성제(들)의 분산을 위한 기제(base) 또는 담체와 배합될 수 있다. 첨가제의 예에는 pH 제어제, 예컨대 아르기닌, 수산화나트륨, 글리신, 염산, 시트르산, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 다른 첨가제에는 국소 마취제(예를 들어, 벤질 알코올), 등장화제(예를 들어, 염화나트륨, 만니톨, 소르비톨), 흡착 억제제(예를 들어, Tween 80), 용해도 향상제(예를 들어, 사이클로덱스트린 및 이의 유도체), 안정화제(예를 들어, 혈청 알부민), 및 환원제(예를 들어, 글루타티온)가 포함된다. 점막 전달용 조성물이 액체일 때, 제형의 장성(tonicity)은, 1로서 취해진 0.9% (w/v) 생리학적 식염수의 장성을 기준으로 하여 측정될 때, 전형적으로, 투여 부위의 점막에서 실질적으로 비가역적인 조직 손상이 유발되지 않는 값으로 조정된다. 일반적으로, 용액의 장성은 1/3 내지 3, 더 전형적으로는 1/2 내지 2, 그리고 가장 흔하게는 3/4 내지 1.7의 값으로 조정된다.
생물학적 활성제는 활성제 및 임의의 원하는 첨가제를 분산시키는 능력을 갖는 친수성 화합물을 포함할 수 있는 기제 또는 비히클 중에 분산될 수 있다. 기제는 폴리카르복실산 또는 이의 염, 카르복실산 무수물(예를 들어, 말레산 무수물)과 다른 단량체(예를 들어, 메틸(메트)아크릴레이트, 아크릴산 등)의 공중합체, 친수성 비닐 중합체, 예컨대 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스 유도체, 예컨대 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 등, 및 천연 중합체, 예컨대 키토산, 콜라겐, 소듐 알기네이트, 젤라틴, 히알루론산, 및 이들의 비독성 금속 염을 포함하지만 이에 한정되지 않는 광범위한 적합한 담체로부터 선택될 수 있다. 종종, 생분해성 중합체가 기제 또는 담체로서 선택되는데, 예를 들어 폴리락트산, 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체, 폴리하이드록시부티르산, 폴리(하이드록시부티르산-글리콜산) 공중합체, 및 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 합성 지방산 에스테르, 예컨대 폴리글리세린 지방산 에스테르, 수크로스 지방산 에스테르 등이 담체로서 사용될 수 있다. 친수성 중합체 및 다른 담체가 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있으며, 부분 결정화, 이온 결합, 가교결합 등에 의해 향상된 구조적 완전성이 담체에 부여될 수 있다. 담체는 유동성 또는 점성 용액, 겔, 페이스트, 분말, 미소구체, 및 비강 점막에 직접 적용하기 위한 필름을 비롯한 다양한 형태로 제공될 수 있다. 이와 관련하여 선택된 담체의 사용은 생물학적 활성제의 흡수 촉진을 가져올 수 있다.
점막, 비강, 또는 폐 전달을 위한 제형은 기제 또는 부형제로서 친수성 저분자량 화합물을 함유할 수 있다. 그러한 친수성 저분자량 화합물은 수용성 활성제, 예컨대 생리학적으로 활성인 펩티드 또는 단백질이 활성제가 흡수되는 신체 표면으로 기제를 통해 확산될 수 있게 하는 통과 매체를 제공한다. 친수성 저분자량 화합물은 선택적으로 점막 또는 투여 분위기로부터 수분을 흡수하고 수용성 활성 펩티드를 용해시킨다. 친수성 저분자량 화합물의 분자량은 일반적으로 10,000 이하, 그리고 바람직하게는 3,000 이하이다. 친수성 저분자량 화합물의 예에는 폴리올 화합물, 예컨대 올리고당류, 이당류 및 단당류가 포함되며, 이들에는 수크로스, 만니톨, 락토스, L-아라비노스, D-에리트로스, D-리보스, D-자일로스, D-만노스, D-갈락토스, 락툴로스, 셀로비오스, 겐티비오스, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 친수성 저분자량 화합물의 추가의 예에는 N-메틸피롤리돈, 알코올(예를 들어, 올리고비닐 알코올, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등), 및 이들의 혼합물이 포함된다.
본 발명의 조성물은 대안적으로 생리학적 조건과 근사해지는 데 필요한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 장성 조정제, 및 습윤제, 예를 들어 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트라이에탄올아민 올레에이트, 및 이들의 혼합물을 함유한다. 고체 조성물의 경우, 통상적인 비독성의 약제학적으로 허용되는 담체가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등이 포함된다.
본 발명의 소정 구체예에서, 생물학적 활성제는 시한-방출 제형으로, 예를 들어 저속 방출 중합체를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 활성제는 급속 방출에 대해 보호할 담체, 예를 들어 제어 방출 비히클, 예컨대 중합체, 마이크로캡슐화된 전달 시스템, 또는 생체접착성 겔과 함께 제조될 수 있다. 본 발명의 다양한 조성물에서, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 하이드로겔 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써, 활성제의 장기간의 전달을 가져올 수 있다.
본 발명이 소정 구체예와 관련하여 기재되어 있고, 많은 상세사항들이 예시를 목적으로 설명되어 있지만, 본 발명은 추가의 구체예를 포함하고 본 명세서에 기재된 상세사항들 중 일부는 본 발명으로부터 벗어나지 않고서 상당히 변화될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 그러한 추가의 구체예, 변형, 및 등가물을 포함한다. 상세하게는, 본 발명은 다양한 예시적인 구성요소 및 예의 특징, 용어, 또는 요소의 임의의 조합을 포함한다.
실시예
실시예 1: 예시적 지질
식 I의 예시적 화합물이 표 1에 제공된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예 2: ATX-43의 합성
도 1은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-43 (RL-43A)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-43: 단계 1
Figure pct00008
500 mL 단일 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, 디클로로메탄 (DCM; 200 mL) 내에 용해된 25 g 헥산산 (SM 1;1 eq.)를 취하고 이후 27.6 ml 옥살릴 클로라이드 (1.5 eq.)를 천천히 0℃에서 부가하고, 질소 분위기 하에서 교반하고 이후 0.5 ml 디메틸포름아미드 (DMF; 촉매적)를 부가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다.
별도의 1 리터 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내 31.4 g N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드 (1.5 eq.)에, 89.8 ml 트리에틸아민 (Et3N, 3 eq.)를 부가적 퍼넬을 사용하여 부가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 얻어진 용액에, 상기 산 클로라이드를, 감압 하에서 농축 후, DCM (100 ml) 내에 용해시킴에 의해, 한방울씩 부가 퍼넬을 사용하여 20 분 동안 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 반응 용액을 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 박층 크로마토그래피 (TLC) (20% 에틸아세테이트 (EtOAc)/헥산; Rf: 0.5)에 의해 모니터링하였다. 반응물 전체를 물로 희석하였다 (300 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 DCM로 세척하였다 (3 x 100ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 20.0 g; 수율, 58%.
ATX-43: 단계 2
Figure pct00009
0℃에서 질소 분위기 하에서 교반한, 500 ml 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에 취한 테트라하이드로푸란 (THF; 100 ml) 내 33 g 펜틸 마그네슘 브로마이드 (1.5 eq.)의 용액에, 20 g N-메톡시-N-메틸 헥산아미드 (1 eq.) 용액 (200 ml의 THF 내에 용해된)를 부가하고 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (150 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (300 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 15.0 g; 수율, 66%.
ATX-43: 단계 3
Figure pct00010
150 ml THF 내 25 ml 메탄올 (MeOH) 내에 용해된 15 g 운데칸-6-온 (1 eq.)의 용액에, 4.9 g 소듐 보로하이드리드 (1.5 eq.)를 0℃에서 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액으로 급냉하였다 (100 ml). 용매를 감압 하에서 제거하고 얻어진 크루드를 EtOAc (150 ml) 및 물 (150 ml) 사이에서 분배하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 백색 고체를 얻었다. 제조된 양, 14.0 g; 수율, 93%.
ATX-43: 단계 4
Figure pct00011
150 ml THF 내에 용해된 15 g 4-아미노부탄산 (1 eq.)의 용액에, 0℃에서 145 ml 수성 1 N NaOH 용액 (1 eq.), 이후 43.4 ml Boc 무수물 (1.3 eq.)를, 순차적으로 부가적 퍼넬을 사용하여, 각각 15 분의 기간에 걸쳐 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (클로로포름 (CHCl3) 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 5% HCl (150 ml)로 급냉하고 이후 EtOAc (100 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 점착성 액체를 얻었다. 제조된 양, 20.0 g; 수율, 68%.
ATX-43: 단계 5
Figure pct00012
DCM (200 ml) 내에 용해된, 0℃ 아래로 냉각한 12 g 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노) 부탄산 (1 eq.)의 용액에 14.7 g 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC).HCl (1.3 eq.), 10.6 ml Et3N (1.3 eq.), 및 0.72 g 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP; 0.1 eq.)를 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 알콜을, DCM (50 ml) 내에 용해시킴에 의해 동일 온도에서 부가적 퍼넬을 사용하여 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물(100 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 50 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (100 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (2 x 50 ml). 유기 층을 감압 하에서 농축하고 크루드로 다음 단계로 진행하였다. 제조된 양, 8.5 g; 수율, 48%.
ATX-43: 단계 6
Figure pct00013
70 ml DCM 내에 용해된 8.5 g 운데칸-6-일 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노) 부타노에이트 (1 eq.) 용액에, 트리플루오로아세트산 (TFA; 10 eq.)를 0℃에서 부가하고 실온에서 4 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (70% EtOAc/헥산; Rf: 0.2). 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액(150 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (2 x 100 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1ml의 트리에틸아민)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하고, 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 5.0 g; 수율, 33% (알콜에 대해).
ATX-43: 단계 7
Figure pct00014
0℃ 아래로 냉각된, DCM (100 ml) 내에 용해된 14 g 4-브로모 부티르산 (1 eq.)의 용액에 21 g EDC.HCl (1.3 eq.), 15.2 ml Et3N (1.3 eq.), 및 1 g DMAP (0.1 eq.)를 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 부가적 퍼넬을 사용하여, 50 ml의 DCM 내에 용해시킴에 의해 8.3 g (Z)-논-2-엔-1-올 (0.7 eq.)를 부가하고, 실온에서 16 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 물(50 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 50 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (100 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (2 x 50 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 5% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (60-120 메쉬 실리카 겔). 제조된 양, 11.0 g; 수율, 64%.
ATX-43: 단계 8
Figure pct00015
250 ml 둥근 바닥 플라스크에, DMF 내 2 g 운데칸-6-일 4-아미노부타노에이트 (1 eq.) 및 2.2 g (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트 (1 eq.), 1.2 g 포타슘 카르보네이트 (1.2 eq.)를 부가하고 얻어진 혼합물을 90℃에서 4 시간 동안 질소 분위기 하에서 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 얼음-물을 반응물 전체에 부가하고 이후 EtOAc로 추출하고 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 15% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (100-200 메쉬 실리카 겔). 출발 아민 및 브로모 화합물을 회수하였다. 제조된 양, 1.45 g; 수율, 40%.
ATX-43: 단계 9
Figure pct00016
건조 DCM 내에 용해된 1.45 g (Z)-논-2-엔-1-일 4-((4-옥소-4-(운데칸-6-일옥시)부틸)아미노)부타노에이트 (1 eq.)의 용액에, 1.29 ml 트리에틸아민 3 eq.) 및 360 mg 트리포스겐 (0.4 eq.)를 5 분 간격으로 0℃에서 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서, 질소 분위기 하에서 1 시간 동안 교반하였다. 얻어진 반응물 전체를 감압 하에서 농축하고 질소 분위기 하에서 유지시켰다.
2 목 250 ml 둥근 바닥 플라스크 내에서 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된, 건조 THF (20 ml) 내에 용해된 360 mg 소듐 히드리드 (5.5 eq.)에, THF (30 ml) 내 2.1 g 2-(디메틸아미노)에탄-1-티올 하이드로클로라이드 (5.5 eq.)를 부가하고 5 분 동안 질소 분위기 하에서 교반하면서 유지시켰다. 이 얻어진 용액에 THF (50 mL) 내에 용해된 상기 카르보닐 클로라이드를 부가적 퍼넬을 사용하여 천천히 약 15 분 동안, 이 얻어진 용액에 부가하고 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액(20 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (20 mL)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x20 mL). 조합시킨 유기 층을 농축하고 얻어진 크루드를 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (60% EtOAc/Hex; Rf: 0.5; PMA 탄화).
정제를 실리카 겔 (100-200 메쉬; 18% EtOAc/헥산) 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다. 제조된 양, 500 mg; 수율, 26%; 1H NMR에 의해 확인됨; HPLC; 및 질량 분광법 (Mass).
ATX-43 / RL-43A: 1 H-NMR (PPM, 400 MHz, CDCl3): δ = 5.63 (m, 1), 5.54 (m, 1), 4.87 (m, 1), 4.63 (d, J = 7.0, 2), 3.37 (brs, 4), 3.03 (t, J = 7.0, 2), 2.27 (s, 6), 2.22-2.32 (4), 2.09 (m, 2), 1.80-1.90 (4), 1.45-1.55 (4), 1.20-1.40 (22), 0.83-0.92 (9).
실시예 3: ATX-57의 합성
도 2은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-57 (RL-43C)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-57: 단계 1: N-메톡시-N-메틸옥탄아미드
Figure pct00017
2 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (300 ml) 내에 용해된 옥탄산 (1 eq.)를 취하고 이후 1.5 eq. 옥살릴 클로라이드를 천천히 0℃에서 부가하고, 질소 분위기 하에서 교반하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 별도의 2 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내 2 eq. N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드에, 3 eq. 트리메틸아민을 부가적 퍼넬을 사용하여 부가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 얻어진 용액에, 상기 산 클로라이드를, 감압 하에서 농축 후, 질소 분위기 하에서 DCM (150 ml) 내에 용해시킴에 의해, 한방울씩 부가 퍼넬을 사용하여 20 분 동안 부가하였다. 얻어진 반응 용액을 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물로 희석하였다 (250 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 DCM로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 85 g; 수율, 65%.
ATX-57: 단계 2: 헥사데칸-8-온
Figure pct00018
1 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에 취한, 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 THF (100 ml) 내 옥틸 마그네슘 브로마이드의 용액에, N-메톡시-N-메틸옥탄아미드 용액 (200 ml THF 내에 용해된)를 부가하고 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (250 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (350 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 65 g; 수율, 63%.
ATX-57: 단계 3: 헥사데칸-8-올
Figure pct00019
MeOH/THF 내에 용해된 헥사데칸-8-온 (1 eq.)의 용액에, 1 eq. 소듐 보로하이드리드를 0℃에서 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액으로 급냉하였다 (75 ml). 용매를 감압 하에서 제거하고 얻어진 크루드를 EtOAc (150 ml) 및 물 (100 ml) 사이에서 분배하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 백색 고체를 얻었다. 제조된 양, 60 g; 수율, 91%.
ATX-57: 단계 4: 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노)부탄산
Figure pct00020
THF 내에 용해된 4-아미노부탄산의 용액에, 수성 1 N NaOH 용액, 이후 Boc 무수물을, 순차적으로 부가적 퍼넬을 사용하여, 15 분의 기간에 걸쳐 0℃에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 5% HCl (250 ml)로 급냉하고 이후 EtOAc (300 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 150 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 점착성 액체를 얻었다. 제조된 양, 80 g; 수율, 81%.
ATX-57: 단계 5: 헥사데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트
Figure pct00021
0℃ 아래로 냉각된, DCM (200 ml) 내에 용해된 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노)부탄산의 용액에, EDC.HCl, Et3N, 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)를, 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에, 1 eq. 헥사데칸-8-올 알콜을 부가적 퍼넬을 사용하여 DCM (150 ml) 내에 용해시킴에 의해 동일 온도에서 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물 (150 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (150 ml) 으로 세척하고 이후 EtOAc (200 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축하고, 크루드로 다음 단계로 진행하였다. 제조된 양, 80 g (크루드; 요구되는 화합물 및 알콜).
ATX-57: 단계 6: 헥사데칸-8-일 4-아미노부타노에이트
Figure pct00022
DCM 내에 용해된 헥사데칸-8-일-4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트의 용액에, TFA를 0℃에서 부가하고 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다. 반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.3). 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (300 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (2 x 200 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1ml의 트리에틸아민)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하고, 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 40 g; 수율, 2 단계에 대해 59%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-57: 단계 7: (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트
Figure pct00023
0℃ 아래로 냉각된, DCM (400 ml) 내에 용해된 4-브로모 부티르산의 용액에, EDC.HCl, Et3N, 및 DMAP를 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 부가적 퍼넬을 사용하여 100 ml의 DCM 내에 용해시킴에 의해 (Z)-논-2-엔-1-올을 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 물 (300 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 150 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (200 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (150 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 5% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (60-120 메쉬 실리카 겔). 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 27 g; 수율, 51%.
ATX-57: 단계 8: 헥사데칸-8-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸)아미노)부타노에이트
Figure pct00024
아세토니트릴 (ACN) 내 헥사데칸-8-일 4-아미노부타노에이트의 용액에, (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트, 포타슘 카르보네이트를 부가하고 얻어진 혼합물을 90℃에서 4 시간 동안 질소 분위기 하에서 환류시켰다. 반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 여과하고, ACN (20 ml)로 세척하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 15% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (100-200 메쉬 실리카 겔). 출발 물질, 아민 및 브로모 화합물을 회수하였다. 제조된 양, 20 g; 수율, 40%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-57: 단계 9
Figure pct00025
건조 DCM 내에 용해된 헥사데칸-8-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸) 아미노) 부타노에이트의 용액에, 트리메틸아민 및 트리포스겐을 5 분 간격으로 0℃에서 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서, 질소 분위기 하에서 1 시간 동안 교반하였다. 얻어진 반응물 전체를 감압 하에서 농축하고 질소 분위기 하에서 유지시켰다.
2 목 100 ml 둥근 바닥 플라스크 내에서 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 건조 THF (50 ml) 내에 용해된 소듐 히드리드에, 2-(디메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드를 부가하고 5 분 동안 질소 분위기 하에서 교반하면서 유지시켰다. 이 얻어진 용액에 THF (80 ml) 내에 용해된 상기 카바밀 클로라이드를 시린지를 통해 천천히 약 10 분 동안 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 6 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (60% EtOAC/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (150 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 40 ml). 조합시킨 유기 층을 농축하고 얻어진 크루드를 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다.
제 1 정제를 실리카 겔 (60-120 메쉬)를 사용하여 수행하였고 22 g의 크루드 화합물을 60 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고 칼럼 내에 취한 500 g의 실리카 겔 상으로 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제 2 정제를 HPLC 등급 용매로 중성 알루미나를 사용하여 수행하였다. 크루드 화합물, 7.5 g를 18 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고 얻어진 것을 칼럼 내에 취한 130 g의 중성 알루미나 상으로 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 수율, 29%; 1H NMR, HPLC, 및 Mass에 의해 확인됨.
ATX-57 / RL-43C: 1 H-NMR (PPM, 400MHz, CDCl3): δ = 5.63 (m, 1), 5.51 (m, 1), 4.68 (m, 1), 4.83 (d, J = 7.0, 2), 3.19 (brs, 4), 3.22 (m, 2), 2.52 (m, 2), 2.23-2.37 (4), 2.18 (s, 6), 2.08 (m, 2), 1.84-1.93 (4), 1.46-1.54 (4), 1.20-1.40 (30), 0.83-0.91 (9).
실시예 4: ATX-58의 합성
도 3은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-58 (RL-43B)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-58: 단계 1
Figure pct00026
N2 분위기 하에서 500 ml 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, 200 ml의 DCM 내에 용해된 30 g 8-브로모옥탄산 (1 eq.)를 취하고 이후 천천히 26.7 ml 옥살릴 클로라이드 (1.5 eq.)에 0℃에서, 질소 분위기 하에서 교반하면서 부가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다.
별도의 1 리터 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, 300 ml DCM 내 40.5 g N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드 (2 eq.)를 0℃에서 교반된 87 ml 트리메틸아민 (3 eq.)에 부가하였다. 이 얻어진 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축 후, 500 ml DCM 내에 용해시킴에 의해, 한방울씩 부가 퍼넬을 사용하여 15 분 동안 부가하였다. 얻어진 반응 용액을 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물로 희석하였다 (300 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 28 g.
ATX-58: 단계 2
Figure pct00027
THF (100 ml) 내, 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 28 g 헥실 마그네슘 브로마이드 (1 eq.)의 용액에, 200 ml THF 내 36.8 g N-메톡시-N-메틸옥탄아미드 (1.3 eq.)를 부가하고 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (100 ml)으로 급냉하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 2% 에틸 아세테이트/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 24 g; 수율, 77%.
ATX-58: 단계 3
Figure pct00028
MeOH/THF 내에 용해된 24 g 테트라데칸-7-온 (1 eq.)의 용액에, 4.27 g 소듐 보로하이드리드 (1 eq.)를 0℃에서 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (50 ml)으로 급냉하였다. 메탄올을 감압 하에서 감소시켰다. 얻어진 크루드를 EtOAc (200 ml) 및 물 사이에서 분배하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 80 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 백색 고체를 얻었다. 제조된 양, 21.5 g; 수율, 89%.
ATX-58: 단계 4
Figure pct00029
140 ml THF 내에 용해된 20 g 4-아미노부탄산의 용액에, 196 ml의 수성 1N NaOH 용액, 이후 36.8 g Boc 무수물을 0℃에서, 퍼넬을 사용하여 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5). 반응물 전체를 5% HCl (100 ml)로 급냉하고 이후 EtOAc (200 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 점착성 액체를 얻었다. 제조된 양, 30 g; 수율, 76%.
ATX-58: 단계 5
Figure pct00030
0℃ 아래로 냉각된, DCM (150 ml) 내에 용해된 10 g 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부탄산 (1 eq.)의 용액에 12.2 g EDC.HCl (1.3 eq.), 20.4 ml Et3N (3 eq.), 및 488 mg DMAP (0.1 eq.)를 순차적으로 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 DCM 내에 용해시킴에 의해, 부가적 퍼넬을 사용하여 알콜을 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물(100 ml)로 급냉하고 유기 층을 분리하였다. 수층을 DCM로 세척하였다 (2 x 50 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액으로 세척하고 EtOAc (100 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하고, 크루드로 다음 단계로 진행하였다. 제조된 양, 12.7 g (크루드).
ATX-58: 단계 6
Figure pct00031
100 ml DCM 내에 용해된 12.5 g 테트라데칸-7-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트 (1 eq.)의 용액에, 23.9 ml TFA (10 eq.)를 0℃에서 부가하고 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.3). 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (100 ml)으로 세척하고 EtOAc (100 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하고 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 2 단계에 대해 7 g; 수율, 47%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-58: 단계 7
Figure pct00032
DCM (150 ml) 내에 용해된, 0℃로 냉각된 20 g 4-브로모 부티르산 (1 eq.)의 용액에 1.5 eq. EDC.HCl, 3 eq. Et3N, 및 0.1 eq. DMAP를 순차적으로 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 0.7 eq. (Z)-논-2-엔-1-올을, 100 ml DCM 내에 용해시킴에 의해, 퍼넬을 사용하여 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7). 반응물 전체를 물(100 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액으로 세척하고 EtOAc (150 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 5% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 17 g; 수율, 69%; 1H NMR에 의해 확인됨.
ATX-58: 단계 8
Figure pct00033
ACN (125 ml) 내 6 g 테트라데칸-7-일 4-아미노부타노에이트 (1 eq.), 5.8 g (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트 (1 eq.)의 용액에, 2.7 g 포타슘 카르보네이트 (1.2 eq.)를 부가하고 얻어진 것을 90℃에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5). 반응물 전체를 여과하고 여액을 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (100-200 메쉬 실리카 겔; 15% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 4.5 g; 수율, 44%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-58: 단계 9
Figure pct00034
30 ml 건조 DCM 내에 용해된 4.4 g (Z)-논-2-엔-1-일 4-((4-옥소-4-(테트라데칸-7-일옥시)부틸)아미노)부타노에이트 (1 eq.)의 용액에, 0.83 ml 트리메틸아민 (3 eq.) 및 418 mg 트리포스겐 (0.5 eq.)를 5 분 간격으로, 0℃에서 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서, 질소 분위기 하에서 1 시간 동안 교반하였다. 얻어진 반응물 전체를 감압 하에서 농축하고 질소 분위기 하에서 유지시켰다.
2 목 100 ml 둥근 바닥 플라스크 내에 건조 THF (25 ml) 내에 용해된 192 mg 소듐 히드리드 (10 eq.)에, 564 mg 2-(디메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드 (5 eq.)를 0℃에서 부가하고 5 분 동안 질소 분위기 하에서 교반하면서 유지시켰다. 이 얻어진 용액에 THF 내에 용해된 (35 ml)상기 카바밀 클로라이드를 시린지를 통해 천천히 약 10 분 동안 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4h 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (60% EtOAC/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화). 반응물 전체를 포화 NH4Cl (30 ml) 로 급냉하고 이후 EtOAc (100 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 50 ml). 조합시킨 유기 층을 농축하고 얻어진 크루드를 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다.
제 1 정제를 실리카 겔 (60-120 메쉬)를 사용하여 수행하였다. 5.0 g의 크루드 화합물을 9 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고 칼럼 내에 취한 90 g의 실리카 겔 상으로 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제 2 정제를 HPLC 등급 용매로 중성 알루미나를 사용하여 수행하였다. 1.5 g의 크루드 화합물을 4 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고 얻어진 것을 칼럼 내에 취한 40 g의 중성 알루미나 상으로 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제조된 양, 1.2 g; 수율, 21%; 1H NMR; HPLC; Mass에 의해 확인됨.
ATX-58 / RL-43B: 1 H-NMR (PPM, 400MHz, CDCl3): δ = 5.65 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.86 (m, 1), 4.63 (d, J = 7.0, 2), 3.37 (brs, 4), 3.02 (t, J = 6.0, 2), 2.53 (t, J = 6.0, 2), 2.27-2.36 (4), 2.27 (s, 6), 2.09 (m, 2), 1.83-1.96 (4), 1.46-1.54 (4), 1.20-1.40 (26), 0.84-0.91 (9).
실시예 5: ATX-81의 합성
도 4은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-81 (RL-48B)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-81: 단계 1
Figure pct00035
2 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내에 용해된 옥탄산을 취하고 이후 천천히 0℃에서, 질소 분위기 하에서 교반하면서1.5 eq. 옥살릴 클로라이드를 부가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 별도의 2 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내 2 eq. N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드에, 부가적 퍼넬을 사용하여 3 eq. 트리메틸아민을 부가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 얻어진 용액에, 상기 산 클로라이드를, 감압 하에서 농축 후, DCM (150 ml) 내에 용해시킴에 의해, 한방울씩 부가 퍼넬을 사용하여 20 분 동안 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 반응 용액을 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물로 희석하였다 (250 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 DCM로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 33 g; 수율, 84%.
ATX-81: 단계 2
Figure pct00036
1 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에 취한, 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 THF (100 ml) 내 22 g 헵틸 마그네슘 브로마이드 (1.5 eq.)의 용액에, N-메톡시-N-메틸옥탄아미드 (1 eq.) 용액 (200 ml THF 내에 용해된)를 부가하고 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (250 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (350 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 22 g; 수율, 65%.
ATX-81: 단계 3
Figure pct00037
MeOH/THF 내에 용해된 22 g 펜타데칸-8-온 (1 eq.)의 용액에, 1.5 eq. 소듐 보로하이드리드를 0℃에서 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액으로 급냉하였다 (75 ml). 용매를 감압 하에서 제거하고 얻어진 크루드를 EtOAc (150 ml) 및 물 (100 ml) 사이에서 분배하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 백색 고체를 얻었다. 제조된 양, 20 g; 수율, 90%.
ATX-81: 단계 4
Figure pct00038
350 ml THF 내에 용해된 50 g 4-아미노부탄산의 용액에, 490 ml 수성 1 N NaOH, 이후 140 ml Boc 무수물 용액을, 순차적으로 부가적 퍼넬을 사용하여, 15 분의 기간에 걸쳐0℃에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 5% HCl (250 ml) 로 급냉하고 이후 EtOAc (300 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 150 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 점착성 액체를 얻었다. 제조된 양, 80 g; 수율, 81%.
ATX-81: 단계 5
Figure pct00039
0℃ 아래로 냉각된, DCM (250 ml) 내에 용해된 10 g 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노)부탄산의 용액에, 1.3 eq. EDC.HCl, Et3N, 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)를, 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에, 1 eq. 펜타데칸-7-올 알콜을 부가적 퍼넬을 사용하여 DCM (150 ml) 내에 용해시킴에 의해 동일 온도에서 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물로 급냉하고 (150 ml) 및 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (150 ml) 으로 세척하고 이후 EtOAc (200 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축하고, 크루드로 다음 단계로 진행하였다. 제조된 양, 8.5 g (크루드; 요구되는 화합물 및 알콜).
ATX-81: 단계 6
Figure pct00040
65 ml DCM 내에 용해된 8.5 g 펜타데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트의 용액에, 10 eq. TFA를 0℃에서 부가하고 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.3). 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (300 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (2 x 200 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 ml의 트리에틸아민)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하고, 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 2 단계에 대해 4 g; 수율, 25%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-81: 단계 7
Figure pct00041
0℃ 아래로 냉각된, DCM (300 ml) 내에 용해된 4-브로모 부티르산의 용액에, EDC.HCl, Et3N, 및 DMAP를 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 20 g (Z)-논-2-엔-1-올을, 부가적 퍼넬을 사용하여 100 ml의 DCM 내에 용해시킴에 의해 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 물 (300 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 150 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (200 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (150 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 5% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (60-120 메쉬 실리카 겔). 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 19 g; 수율, 55%.
ATX-81: 단계 8
Figure pct00042
70 ml 아세토니트릴 (ACN) 내 4.5 g 펜타데칸-8-일 4-아미노부타노에이트, 1 eq. (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트의 용액에, 1.4 eq. 포타슘 카르보네이트를 부가하고 얻어진 혼합물을 90℃에서 4 시간 동안 질소 분위기 하에서 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 여과하고, ACN (20 ml)로 세척하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 15% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (100-200 메쉬 실리카 겔). 출발 물질, 아민 및 브로모 화합물을 회수하였다. 제조된 양, 2.1 g; 수율, 27%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-81: 단계 9
Figure pct00043
150 ml 건조 DCM 내에 용해된 2.1 g 펜타데칸-8-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸) 아미노) 부타노에이트의 용액에, 3 eq. 트리에틸아민 및 트리포스겐을 5 분 간격으로 0℃에서 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서, 질소 분위기 하에서 1 시간 동안 교반하였다. 얻어진 반응물 전체를 감압 하에서 농축하고 질소 분위기 하에서 유지시켰다.
건조 THF (80 ml) 내에 용해된, 2 목 100 ml 둥근 바닥 플라스크 내에서 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 7 eq. 소듐 히드리드에, 3.5 eq. 2-(디메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드를 부가하고 5 분 동안 질소 분위기 하에서 교반하면서 유지시켰다. 이 얻어진 용액에 THF (80 ml) 내에 용해된 상기 카바밀 클로라이드를 시린지를 통해 천천히 약 10 분 동안 부가하였다. 얻어진 용액을 0℃ 내지 실온에서 밤새 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (60% EtOAC/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (150 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 40 ml). 조합시킨 유기 층을 농축하고 얻어진 크루드를 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다.
제 1 정제를 실리카 겔 (60-120 메쉬)를 사용하여 수행하였다. 크루드 화합물을 60 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고 칼럼 내에 취한 500 g의 실리카 겔 상으로 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제 2 정제를 HPLC 등급 용매로 중성 알루미나를 사용하여 수행하였다. 크루드 화합물을 18 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고 얻어진 것을 칼럼 내에 취한 130 g의 중성 알루미나 상으로 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제조된 양, 1.5 g; 수율, 45%; 1H NMR, HPLC, 및 Mass에 의해 확인됨.
ATX-81 / RL-48B: 1 H-NMR (PPM, 500 MHz, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.86 (m, 1), 4.63 (d, J = 7.0, 2), 3.31-3.44 (4), 3.02 (t, J = 7.0, 2), 2.52 (t, J = 7.0, 2), 2.26-2.36 (4), 2.27 (s, 6), 2.10 (m, 2), 1.84-1.95 (4), 1.46-1.54 (4), 1.20-1.40 (26), 0.85-0.94 (9).
실시예 6: ATX-82의 합성
도 5은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-82 (RL-47A)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-82: 단계 1
Figure pct00044
2 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내에 용해된 30 g 옥탄산을 취하고 이후 질소 분위기 하에서 교반하면서 1.5 eq. 옥살릴 클로라이드를 천천히 0℃에서 부가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 별도의 2 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내 2 eq. N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드에, 부가적 퍼넬을 사용하여 3 eq. 트리메틸아민을 부가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 얻어진 용액에, 상기 산 클로라이드를, 감압 하에서 농축 후, DCM (150 ml) 내에 용해시킴에 의해, 한방울씩 부가 퍼넬을 사용하여 20 분 동안 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 반응 용액을 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물로 희석하였다 (250 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 DCM로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 33 g; 수율, 84%.
ATX-82: 단계 2
Figure pct00045
1 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에 취한, 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 THF (100 ml) 내 헵틸 마그네슘 브로마이드 (1.5 eq.)의 용액에, 28 g N-메톡시-N-메틸옥탄아미드 (1 eq.) 용액 (200 ml THF 내에 용해된)를 부가하고 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (250 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (350 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 22 g; 수율, 65%.
ATX-82: 단계 3
Figure pct00046
MeOH/THF 내에 용해된 22 g 펜타데칸-8-온 (1 eq.)의 용액에, 1.5 eq. 소듐 보로하이드리드를 0℃에서 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액으로 급냉하였다 (75 ml). 용매를 감압 하에서 제거하고 얻어진 크루드를 EtOAc (150 ml) 및 물 (100 ml) 사이에서 분배하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 백색 고체를 얻었다. 제조된 양, 20 g; 수율, 90%.
ATX-82: 단계 4
Figure pct00047
120 ml THF 내에 용해된 15 g 4-아미노부탄산의 용액에, 185 ml 수성 1 N NaOH 용액, 이후 50 ml Boc 무수물을, 순차적으로 부가적 퍼넬을 사용하여, 15 분의 기간에 걸쳐0℃에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 5% HCl (250 ml)로 급냉하고 이후 EtOAc (300 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 150 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 점착성 액체를 얻었다. 제조된 양, 27 g; 수율, 85%.
ATX-82: 단계 5
Figure pct00048
0℃ 아래로 냉각된, DCM (250 ml) 내에 용해된 10 g 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노)부탄산의 용액에, 1.3 eq. EDC.HCl, Et3N, 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)를, 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에, 1 eq. 펜타데칸-7-올 알콜을 부가적 퍼넬을 사용하여 DCM (150 ml) 내에 용해시킴에 의해, 동일 온도에서 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물 (150 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (150 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc (200 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축하고, 크루드로 다음 단계로 진행하였다. 제조된 양, 8 g (크루드; 요구되는 화합물 및 알콜).
ATX-82: 단계 6
Figure pct00049
60 ml DCM 내에 용해된 8.0 g 펜타데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트의 용액에, 10 eq. TFA를 0℃에서 부가하고 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.3). 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (300 ml)로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (2 x 200 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 ml의 트리에틸아민)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하고, 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 4 g; 수율, 2 단계에 대해 25%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-82: 단계 7
Figure pct00050
0℃ 아래로 냉각된, DCM (400 ml) 내에 용해된 4-브로모 부티르산의 용액에, 1.5 eq. EDC.HCl, 3 eq. Et3N, 및 DMAP를 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 20 g (Z)-논-2-엔-1-올을, 부가적 퍼넬을 사용하여 100 ml의 DCM 내에 용해시킴에 의해 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 물 (300 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 150 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (200 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (150 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 5% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (60-120 메쉬 실리카 겔). 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 18 g; 수율, 55%.
ATX-82: 단계 8
Figure pct00051
90 ml ACN 내 4.0 g 펜타데칸-8-일 4-아미노부타노에이트, 1 eq. (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트의 용액에, 1.4 eq. 포타슘 카르보네이트를 부가하고 얻어진 혼합물을 90℃에서 4 시간 동안 질소 분위기 하에서 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 여과하고, ACN (20 ml)로 세척하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 15% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (100-200 메쉬 실리카 겔). 출발 물질 (아민 및 브로모 화합물)을 회수하였다. 제조된 양, 2.2 g; 수율, 30%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-82: 단계 9
Figure pct00052
25 ml 건조 DCM 내에 용해된 2.2 g 펜타데칸-8-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸) 아미노) 부타노에이트의 용액에, 3 eq. 트리에틸아민 및 트리포스겐을 5 분 간격으로 0℃에서 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서, 질소 분위기 하에서 1 시간 동안 교반하였다. 얻어진 반응물 전체를 감압 하에서 농축하고 질소 분위기 하에서 유지시켰다.
2 목 100 ml 둥근 바닥 플라스크 내에서 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된, 건조 THF (100 ml) 내에 용해된 7 eq. 소듐 히드리드에, 3.5 eq. 2-(디메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드를 부가하고 5 분 동안 질소 분위기 하에서 교반하면서 유지시켰다. 이 얻어진 용액에 THF (100 ml) 내에 용해된 상기 카바밀 클로라이드를 시린지를 통해 천천히 약 10 분 동안 부가하였다. 얻어진 용액을 0℃ 내지 실온에서 밤새 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (60% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (150 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 40 ml). 조합시킨 유기 층을 농축하고 얻어진 크루드를 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다.
제 1 정제를 실리카 겔 (60-120 메쉬)를 사용하여 수행하였다. 크루드 화합물을 60 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고 칼럼 내에 취한 500 g의 실리카 겔 상으로 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제 2 정제를 HPLC 등급 용매로 중성 알루미나를 사용하여 수행하였다. 크루드 화합물을 18 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고 얻어진 것을 칼럼 내에 취한 130 g의 중성 알루미나 상으로 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제조된 양, 1.2 g; 수율, 43%; 1H NMR, HPLC, 및 Mass에 의해 확인됨.
ATX-82 / RL-47A: 1 H-NMR (PPM, 500 MHz, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.87 (m, 1), 4.62 (d, J = 7.0, 2), 3.61 (t, J = 7.0, 2), 3.28-3.37 (2), 3.02 (t, J = 7.0, 2), 2.61 (m, 2), 2.52 (t, J = 7.0, 2), 2.31 (m, 2), 2.27 (s, 6), 2.10 (m, 2), 1.62-1.70 (6), 1.21-1.40 (32), 0.85-0.91 (9).
실시예 7: ATX-86의 합성
도 6은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-86 (RL-48A)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-86: 단계 1
Figure pct00053
2 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내에 용해된 30 g 옥탄산을 취하고 이후 질소 분위기 하에서 교반하면서 1.5 eq. 옥살릴 클로라이드를 천천히 0℃에서 부가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 별도의 2 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내 2 eq. N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드에, 부가적 퍼넬을 사용하여 3 eq. 트리메틸아민을 부가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 얻어진 용액에, 상기 산 클로라이드를, 감압 하에서 농축 후, 질소 분위기 하에서 DCM (150 ml) 내에 용해시킴에 의해, 한방울씩 부가 퍼넬을 사용하여 20 분 동안 부가하였다. 얻어진 반응 용액을 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물로 희석하였다 (250 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 DCM로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 38 g; 수율, 84%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-86: 단계 2
Figure pct00054
1 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에 취한, 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 THF (100 ml) 내 헥실 마그네슘 브로마이드 (1.5 eq.)의 용액에, 38 g N-메톡시-N-메틸옥탄아미드 (1 eq.) 용액 (200 ml THF 내에 용해된)를 부가하고 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (250 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (350 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 44 g; 수율, 65%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-86: 단계 3
Figure pct00055
MeOH/THF 내에 용해된 44 g 트리데칸-7-온 (1 eq)의 용액에, 1.5 eq. 소듐 보로하이드리드를 0℃에서 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액으로 급냉하였다 (75 ml). 용매를 감압 하에서 제거하고 얻어진 크루드를 EtOAc (150 ml) 및 물 (100 ml) 사이에서 분배하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 백색 고체를 얻었다. 제조된 양, 40 g; 수율, 90%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-86: 단계 4
Figure pct00056
350 ml THF 내에 용해된 50 g 4-아미노부탄산의 용액에, 490 ml 수성 1 N NaOH 용액, 이후 140 ml Boc 무수물을, 순차적으로 부가적 퍼넬을 사용하여, 15 분의 기간에 걸쳐0℃에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 5% HCl (250 ml)로 급냉하고 이후 EtOAc (300 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 150 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 점착성 액체를 얻었다. 제조된 양, 80 g; 수율, 81%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-86: 단계 5
Figure pct00057
0℃ 아래로 냉각된, DCM (250 ml) 내에 용해된 10 g 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노)부탄산의 용액에, 1.3 eq. EDC.HCl, Et3N, 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)를, 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에, 1 eq. 펜타데칸-7-올 알콜을 부가적 퍼넬을 사용하여 DCM (150 ml) 내에 용해시킴에 의해, 동일 온도에서 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물 (150 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (150 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc (200 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축하고, 크루드로 다음 단계로 진행하였다. 제조된 양, 8 g (크루드; 요구되는 화합물 및 알콜).
ATX-86: 단계 6
Figure pct00058
60 ml DCM 내에 용해된 8.0 g 펜타데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트의 용액에, 0℃에서 10 eq. TFA 를 부가하고 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.3). 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (300 ml)로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (2 x 200 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1ml의 트리에틸아민)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하고, 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 3.5 g; 수율, 2 단계에 대해 52%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-86: 단계 7
Figure pct00059
0℃ 아래로 냉각된, DCM (400 ml) 내에 용해된 4-브로모 부티르산의 용액에, 1.5 eq. EDC.HCl, 2 eq. Et3N, 및 DMAP를 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 20 g (Z)-논-2-엔-1-올을, 부가적 퍼넬을 사용하여 100 ml의 DCM 내에 용해시킴에 의해 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 물 (300 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 150 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (200 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (150 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 5% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (60-120 메쉬 실리카 겔). 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 18 g; 수율, 55%.
ATX-86: 단계 8
Figure pct00060
90 ml ACN 내 4.0 g 트리데칸-7-일 4-아미노부타노에이트, 1 eq. (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트의 용액에, 1.4 eq. 포타슘 카르보네이트를 부가하고 얻어진 혼합물을 90℃에서 4 시간 동안 질소 분위기 하에서 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 여과하고, ACN (20 ml)로 세척하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 15% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (100-200 메쉬 실리카 겔). 출발 물질, 아민 및 브로모 화합물을 회수하였다. 제조된 양, 2.2 g; 수율, 30%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-86: 단계 9
Figure pct00061
25 ml 건조 DCM 내에 용해된 2.2 g 트리데칸-7-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸) 아미노) 부타노에이트의 용액에, 3 eq. 트리에틸아민 및 트리포스겐을 5 분 간격으로 0℃에서 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서, 질소 분위기 하에서 1 시간 동안 교반하였다. 얻어진 반응물 전체를 감압 하에서 농축하고 질소 분위기 하에서 유지시켰다.
2 목 100 ml 둥근 바닥 플라스크 내에서 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된, 건조 THF (100 ml) 내에 용해된 7 eq. 소듐 히드리드에, 3.5 eq. 2-(디메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드를 부가하고 5 분 동안 질소 분위기 하에서 교반하면서 유지시켰다. 이 얻어진 용액에 THF (100 ml) 내에 용해된 상기 카바밀 클로라이드를 시린지를 통해 천천히 약 10 분 동안 부가하였다. 얻어진 용액을 0℃ 내지 실온에서 밤새 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (60% EtOAC/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (150 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 40 ml). 조합시킨 유기 층을 농축하고 얻어진 크루드를 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다.
제 1 정제를 실리카 겔 (60-120 메쉬)를 사용하여 수행하였다. 크루드 화합물을 60 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고 칼럼 내에 취한 500 g의 실리카 겔 상으로 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제 2 정제를 HPLC 등급 용매로 중성 알루미나를 사용하여 수행하였다. 크루드 화합물을 18 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고 얻어진 것을 칼럼 내에 취한 130 g의 중성 알루미나 상으로 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제조된 양, 1.2 g; 수율, 43%; 1H NMR, HPLC, 및 Mass에 의해 확인됨.
ATX-86 / RL-48A: 1 H-NMR (PPM, 500 MHz, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.51 (m, 10, 4.87 (m, 1), 4.63 (d, J = 7.0, 2), 3.30-3.44 (4), 3.02 (t, J = 7.0, 2), 2.52 (t, J = 7.0, 2), 2.26-2.36 (4), 2.27 (s, 6), 2.09 (m, 2), 1.82-1.96 (4), 1.46-1.54 (4), 1.21-1.40 (24), 0.84-0.91 (9).
실시예 8: ATX-87의 합성
도 7은 9 단계를 수반하는 ATX-87 (RL-48C)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-87: 단계 1
Figure pct00062
2 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내에 용해된 20 g 옥탄산을 취하고 이후 질소 분위기 하에서 교반하면서 1.5 eq. 옥살릴 클로라이드를 천천히 0℃에서 부가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 별도의 2 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내 2 eq. N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드에, 부가적 퍼넬을 사용하여 3 eq. 트리메틸아민을 부가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 얻어진 용액에, 상기 산 클로라이드를, 감압 하에서 농축 후, 질소 분위기 하에서 DCM (150 ml) 내에 용해시킴에 의해, 한방울씩 부가 퍼넬을 사용하여 20 분 동안 부가하였다. 얻어진 반응 용액을 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물로 희석하였다 (250 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 DCM로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 20 g; 수율, 84%.
ATX-87: 단계 2
Figure pct00063
1 리터, 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에 취한, 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 THF (100 ml) 내 헥실 마그네슘 브로마이드 (1.5 eq.)의 용액에, 20 g N-메톡시-N-메틸옥탄아미드 (1 eq.) 용액 (200 ml THF 내에 용해된)를 부가하고 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (250 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (350 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 2% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 25 g; 수율, 65%.
ATX-87: 단계 3
Figure pct00064
MeOH/THF 내에 용해된 25 g 트리데칸-7-온 (1 eq)의 용액에, 1.5 eq. 소듐 보로하이드리드를 0℃에서 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액으로 급냉하였다 (75 ml). 용매를 감압 하에서 제거하고 얻어진 크루드를 EtOAc(150 ml) 및 물 (100 ml) 사이에서 분배하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 백색 고체를 얻었다. 제조된 양, 22 g; 수율, 90%.
ATX-87: 단계 4
Figure pct00065
350 ml THF 내에 용해된 50 g 4-아미노부탄산의 용액에, 490 ml 수성 1 N NaOH 용액 0℃에서, 이후 140 ml Boc 무수물을, 순차적으로 부가적 퍼넬을 사용하여, 15 분의 기간에 걸쳐 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 5% HCl (250 ml)로 급냉하고 이후 EtOAc (300 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 150 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 점착성 액체를 얻었다. 제조된 양, 80 g; 수율, 81%.
ATX-87: 단계 5
Figure pct00066
0℃ 아래로 냉각된, DCM (250 ml) 내에 용해된 17 g 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노)부탄산의 용액에, 1.3 eq. EDC.HCl, Et3N, 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)를, 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에, 1 eq. 트리데칸-7-올을 부가적 퍼넬을 사용하여 DCM (150 ml) 내에 용해시킴에 의해, 동일 온도에서 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물 (150 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (150 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc (200 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고, 감압 하에서 농축하고, 크루드로 다음 단계로 진행하였다. 제조된 양, 15 g (크루드; 요구되는 화합물 및 알콜).
ATX-87: 단계 6
Figure pct00067
80 ml DCM 내에 용해된 15.0 g 펜타데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트의 용액에, 10 eq. TFA를 0℃에서 부가하고 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.3). 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (300 ml)로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (2 x 200 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1ml의 트리에틸아민)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하고, 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 7 g; 수율, 2 단계에 대해 24%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-87: 단계 7
Figure pct00068
0℃ 아래로 냉각된, DCM (400 ml) 내에 용해된 4-브로모 부티르산의 용액에, 1.5 eq. EDC.HCl, 2 eq. Et3N, 및 DMAP를 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 20 g (Z)-논-2-엔-1-올을, 부가적 퍼넬을 사용하여 100 ml의 DCM 내에 용해시킴에 의해 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 물 (300 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 150 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (200 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (150 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 5% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (60-120 메쉬 실리카 겔). 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 19 g; 수율, 55%.
ATX-87: 단계 8
Figure pct00069
90 ml ACN 내 4.0 g 트리데칸-7-일 4-아미노부타노에이트, 1 eq. (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트의 용액에, 1.4 eq. 포타슘 카르보네이트를 부가하고 얻어진 혼합물을 90℃에서 4 시간 동안 질소 분위기 하에서 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 여과하고, ACN (20 ml)로 세척하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 크루드 화합물을 15% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (100-200 메쉬 실리카 겔). 출발 물질, 아민 및 브로모 화합물을 회수하였다. 제조된 양, 2.2 g; 수율, 30%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-87: 단계 9
Figure pct00070
25 ml 건조 DCM 내에 용해된 2.2 g 트리데칸-7-일 (Z)-4-((4-(논-2-엔-1-일옥시)-4-옥소부틸) 아미노) 부타노에이트의 용액에, 3 eq. 트리에틸아민 및 트리포스겐을 5 분 간격으로 0℃에서 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서, 질소 분위기 하에서 1 시간 동안 교반하였다. 얻어진 반응물 전체를 감압 하에서 농축하고 질소 분위기 하에서 유지시켰다.
2 목 100 ml 둥근 바닥 플라스크 내에서 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된, 건조 THF (100 ml) 내에 용해된 7 eq. 소듐 히드리드에, 3.5 eq. 2-(디메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드를 부가하고 5 분 동안 질소 분위기 하에서 교반하면서 유지시켰다. 이 얻어진 용액에 THF (100 ml) 내에 용해된 상기 카바밀 클로라이드를 시린지를 통해 천천히 약 10 분 동안 부가하였다. 얻어진 용액을 0℃ 내지 실온에서 밤새 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (60% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액(75 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (150 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 40 ml). 조합시킨 유기 층을 농축하고 얻어진 크루드를 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다.
제 1 정제를 실리카 겔 (60-120 메쉬)를 사용하여 수행하였다. 크루드 화합물을 60 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고 칼럼 내에 취한 500 g의 실리카 겔 상으로 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제 2 정제를 HPLC 등급 용매로 중성 알루미나를 사용하여 수행하였다. 크루드 화합물을 18 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고 얻어진 것을 칼럼 내에 취한 130 g의 중성 알루미나 상으로 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제조된 양, 1.2 g; 수율, 43%; 1H NMR, HPLC, 및 Mass에 의해 확인됨.
ATX-87 / RL-48C: 1 H-NMR (PPM, 500 MHz, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.87 (m, 1), 4.63 (d, J=7.0, 2), 3.30-3.44 (4), 3.02 (t, J = 7.0, 2), 2.52 (t, J = 7.0, 2), 2.26-2.36 (4), 2.27 (s, 6), 2.09 (m, 2), 1.83-1.96 (4), 1.46-1.54 (4), 1.21-1.40 (32), 0.85-0.90 (9).
실시예 9: ATX-88의 합성
도 8은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-88 (RL-48D)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-88: 단계 1
Figure pct00071
N2 분위기 하에서 500 ml 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, 200 ml의 DCM 내에 용해된 25 g 8-브로모옥탄산 (1 eq.)를 취하고 이후 질소 분위기 하에서 교반하면서 천천히 옥살릴 클로라이드, 1.5 eq.를, 0℃에서 부가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다.
별도의 1 리터 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, 300 ml DCM 내 2 eq. N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드를 3 eq. 트리메틸아민에 부가하고 0℃에서 교반하였다. 이 얻어진 용액에, 상기 산 클로라이드를 감압 하에서 농축 후, 500 ml DCM 내에 용해시킴에 의해, 한방울씩 부가 퍼넬을 사용하여 15 분 동안 부가하였다. 얻어진 반응 용액을 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물로 희석하였다 (300 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 10% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 21 g; 수율, 66%.
ATX-88: 단계 2
Figure pct00072
0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 THF (100 ml) 내1.3 eq. 옥틸 마그네슘 브로마이드의 용액에, 100 ml THF 내 20 g N-메톡시-N-메틸옥탄아미드를 부가하고 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (100 ml)으로 급냉하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 2% 에틸 아세테이트/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 양 수율은 17.4 g; 68% 였다.
ATX-88: 단계 3
Figure pct00073
135 ml MeOH/THF 내에 용해된 17 g 헥사데칸-7-온 (1 eq.)의 용액에, 1.5 eq. 소듐 보로하이드리드를 0℃에서 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (50 ml)으로 급냉하였다. 메탄올을 감압 하에서 감소시켰다. 얻어진 크루드를 EtOAc (200 ml) 및 물 사이에서 분배하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 80 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 백색 고체를 얻었다. 제조된 양, 14.5 g; 수율, 85%.
ATX-88: 단계 4
Figure pct00074
350 ml THF 내에 용해된 50 g 4-아미노부탄산의 용액에, 490 ml의 수성 1N NaOH 용액, 이후 140 ml Boc 무수물을 퍼넬을 사용하여 0℃에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5). 반응물 전체를 5% HCl (100 ml)로 급냉하고 이후 EtOAc (200 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 점착성 액체를 얻었다. 제조된 양, 80 g; 수율, 81%.
ATX-88: 단계 5
Figure pct00075
0℃ 아래로 냉각된, DCM (200 ml) 내에 용해된 1 eq. 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부탄산의 용액에 3 eq. EDC.HCl, Et3N (3 eq.), 및 DMAP (0.1 eq.)를 순차적으로 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 DCM 내에 용해시킴에 의해, 부가적 퍼넬을 사용하여 알콜을 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물(100 ml)로 급냉하고 유기 층을 분리하였다. 수층을 DCM로 세척하였다 (2 x 50 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액으로 세척하고 EtOAc (100 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하고, 크루드로 다음 단계로 진행하였다. 제조된 양, 19 g (크루드).
ATX-88: 단계 6
Figure pct00076
140 ml DCM 내에 용해된 19 g 헥사데칸-7-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트 (1 eq.)의 용액에, 0℃에서 10 eq. TFA 를 부가하고 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.3). 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (100 ml)으로 세척하고 EtOAc (100 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하고 알콜을 회수하였다. 제조된 양, 9.4 g; 수율, 2 단계에 대해 50%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-88: 단계 7
Figure pct00077
DCM (500 ml) 내에 용해된, 0℃로 냉각된 30 g 4-브로모 부티르산 (1 eq.)의 용액에 1.5 eq. EDC.HCl, 3 eq. Et3N, 및 0.1 eq. DMAP를 순차적으로 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 0.7 eq. (Z)-논-2-엔-1-올을, 100 ml DCM 내에 용해시킴에 의해, 퍼넬을 사용하여 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7). 반응물 전체를 물(100 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액으로 세척하고 EtOAc (150 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 5% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 27 g; 수율, 51%; 1H NMR에 의해 확인됨.
ATX-88: 단계 8
Figure pct00078
ACN (70 ml) 내 6 g 헥사데칸-8-일 4-아미노부타노에이트 (1 eq.), 1 eq.5 (Z)-논-2-엔-1-일 4-브로모부타노에이트의 용액에, 1.2 eq. 포타슘 카르보네이트를 부가하고 얻어진 것을 90℃에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5). 반응물 전체를 여과하고 여액을 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (100-200 메쉬 실리카 겔; 15% EtOAc/헥산)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 4.5g; 수율, 44%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-88: 단계 9
Figure pct00079
30 ml 건조 DCM 내에 용해된 4.4 g (Z)-논-2-엔-1-일 4-((4-옥소-4-(테트라데칸-7-일옥시)부틸)아미노)부타노에이트 (1 eq.)의 용액에, 0.83 ml 트리메틸아민 (3 eq.) 및 418 mg 트리포스겐 (0.5 eq.)를 5 분 간격으로, 0℃에서 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서, 질소 분위기 하에서 1 시간 동안 교반하였다. 얻어진 반응물 전체를 감압 하에서 농축하고 질소 분위기 하에서 유지시켰다.
2 목 100 ml 둥근 바닥 플라스크 내에서, 건조 THF (25 ml) 내에 용해된 192 mg 소듐 히드리드 (10 eq.)에, 564 mg 2-(디메틸아미노)프로판-1-티올 하이드로클로라이드 (5 eq.)를 0℃에서 부가하고 5 분 동안 질소 분위기 하에서 교반하면서 유지시켰다. 이 얻어진 용액에 THF (35 ml) 내에 용해된 상기 카바밀 클로라이드를 시린지를 통해 천천히 약 10 분 동안 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (60% EtOAC/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (30 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (100 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 50 ml). 조합시킨 유기 층을 농축하고 얻어진 크루드를 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다.
제 1 정제를 실리카 겔 (60-120 메쉬)를 사용하여 수행하였다. 5.0 g의 크루드 화합물을 9 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고 칼럼 내에 취한 90 g의 실리카 겔 상으로 부었다. 화합물을 35% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제 2 정제를 HPLC 등급 용매로 중성 알루미나를 사용하여 수행하였다. 크루드 화합물, 1.5 g를 4 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고 얻어진 것을 칼럼 내에 취한 40 g의 중성 알루미나 상으로 부었다. 화합물을 10% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제조된 양, 1.2 g; 수율, 21%; 1H NMR; HPLC; Mass에 의해 확인됨.
ATX-88 / RL-48D: 1 H-NMR (PPM, 500 MHz, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.51 (m, 1), 4.87 (m, 1), 4.63 (d, J = 7.0, 2), 3.30-3.44 (4), 2.90 (t, J = 7.0, 2), 2.46-2.55 (6), 2.26-2.37 (4), 2.09 (m, 2), 1.71-1.80 (4), 1.46-1.55 (4), 1.21-1.41 (32), 1.01 (t, J = 7.0, 6), 00.85-0.91 (9).
실시예 10: ATX-83의 합성
도 9은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-83 (RL-47B)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-83: 단계 1
Figure pct00080
500 mL 단일 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내에 용해된 50 g 옥탄산 (1 eq.)를 취하고 이후 44.6 ml 옥살릴 클로라이드 (1.5 eq.)를 천천히 0℃에서, 부가적 퍼넬을 통해, 질소 분위기 하에서 교반하면서 부가하고 이후 1 ml DMF (촉매적)를 부가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다.
별도의 2 리터 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에 DCM (300 ml) 내 67.4 g N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드 (2 eq.)에, 144 ml 트리에틸아민 (3 eq.)를 부가적 퍼넬을 사용하여 부가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 얻어진 용액에, 상기 산 클로라이드를, 감압 하에서 농축 후, 질소 분위기 하에서 DCM (350 ml) 내에 용해시킴에 의해, 한방울씩 부가 퍼넬을 사용하여 20 분 동안 부가하였다. 얻어진 반응 용액을 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화). 반응물 전체를 물로 희석하였다 (300 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 DCM로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 10% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (60-120 메쉬 실리카 겔). 제조된 양, 55.0 g; 수율, 84%
ATX-83: 단계 2
Figure pct00081
2 l 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에 취한, 0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 에테르 내55 g 헵틸 마그네슘 브로마이드 (1 eq.)의 용액에, 400 ml의 건조 에테르 내에 용해된 89.6 g N-메톡시-N-메틸옥탄아미드 용액 (1.5 eq.)를 부가하고 얻어진 반응 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7; PMA 탄화). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액으로 급냉하였다 (250 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 에테르 (2 x 100 ml)로 세척하였다. 조합시킨 유기 층을 anh.Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 2% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (60-120 메쉬 실리카 겔). 제조된 양, 50.0g; 수율, 75%.
ATX-83: 단계 3
Figure pct00082
290 ml MeOH/THF 내에 용해된 50 g 펜타데칸-8-온 (1 eq.)의 용액에, 12.5 g 소듐 보로하이드리드 (1.5 eq.)를 0℃에서 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.5; PMA 탄화). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액으로 급냉하였다 (80 ml). 용매를 감압 하에서 제거하고 얻어진 크루드를 EtOAc (250 ml) 및 물 (100 ml) 사이에서 분배시켰다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 80 ml). 조합시킨 유기 층을 anh.Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하고 진공 하에서 건조시키고 백색 고체를 얻었다. 제조된 양, 46.0 g; 수율, 90%.
ATX-83: 단계 4
Figure pct00083
THF 내에 용해된 50 g 4-아미노부탄산 (1 eq.)의 용액에, 490 ml 1 N 수성 NaOH 용액 (1 eq.), 이후 140 ml Boc 무수물 (1.3 eq.)를, 순차적으로 부가적 퍼넬을 사용하여, 15 분의 기간에 걸쳐0℃에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 5% HCl (350 ml)로 급냉하고 이후 EtOAc (300 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 150 ml). 조합시킨 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 점착성 액체를 얻었다. 제조된 양, 77.0 g; 수율, 78%.
ATX-83: 단계 5
Figure pct00084
합성을 4 배치로 수행하였다. 각각에서, 0℃ 아래로 냉각된 DCM (400 ml) 내 23 g 4-((tert-부톡시카르보닐) 아미노)부탄산 (1 eq.)의 용액에, 32.3 g EDC.HCl (1.5 eq.), 47 ml Et3N (3 eq.), 및 1.3 g DMAP (0.1 eq.)을 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 min 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 20 g 펜타데칸-8-올 (0.77 eq.)를, DCM 내에 용해시킴에 의해 (200 ml), 부가적 퍼넬을 사용하여 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.4). 반응물 전체를 물 (250 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 이 얻어진 크루드에 포화 NaHCO3 용액 (150 ml)를 세척하고 EtOAc (250 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고, anh.Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하고 이후 크루드로 다음 단계로 진행하였다. 제조된 양, 105 g (크루드; 요구되는 화합물 및 알콜)
ATX-83: 단계 6
Figure pct00085
450 ml DCM 내에 용해된 105 g 펜타데칸-8-일 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)부타노에이트 (1 eq.)의 용액에, 194 ml TFA (10 eq.)를 0℃에서 부가하고 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.3).
반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3용액 (200 ml) 및 이후 EtOAc (300 ml) 와 함께 10 분 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 4% MeOH/CHCl3 및 1ml의 트리에틸아민을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (실리카 겔 60-120 메쉬). 제조된 양, 2 단계에 대해 60.0 g; 수율, 54%.
ATX-83: 단계 7
Figure pct00086
반응을 2 배치로 수행하였다. 각각에서, 0℃ 아래로 냉각된 DCM (300 ml) 내에 용해된 20 g 6-브로모헥산산 (1 eq.)의 용액에 29.3 g EDC.HCl (1.5 eq.), 42.8 ml Et3N (3 eq.), 및 1.2 g DMAP (0.1 eq.)를 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 부가적 퍼넬을 사용하여 14.5 g (Z)-논-2-엔-1-올 (1 eq.)를 (100 ml의 DCM 내에 용해시킴에 의해) 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 물 (200 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (150 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (2 x 150 ml). 유기 층을 분리하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 4% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (60-120 메쉬 실리카 겔). 알콜 반응물을 회수하였다. 제조된 양, 36.0 g; 수율, 55%.
ATX-83: 단계 8
Figure pct00087
반응을 6 배치로 수행하였다. 각각에서, 120 ml ACN 내 10 g 펜타데칸-8-일 4-아미노부타노에이트 (Int 6, 1 eq.), 10.1 g (Z)-논-2-엔-1-일 6-브로모헥사노에이트 (Int 7, 1 eq.)의 용액에, 6.1 g 무수 포타슘 카르보네이트 (1.4 eq.)를 부가하고 얻어진 혼합물을 90℃에서 4 시간 동안 질소 분위기 하에서 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 여과하고, ACN (2 x 20 ml)로 세척하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 20-80% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (실리카 겔 100-200 메쉬). 출발 물질을 회수하였다. 제조된 양, 36.9 g; 수율, 35%.
ATX-83: 단계 9
Figure pct00088
반응을 3 배치로 수행하였다. 각각에서, 100 ml 건조 DCM 내에 용해된 10 g (Z)-논-2-엔-1-일 6-((4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)아미노)헥사노에이트 (1 eq.)의 용액에 7.5 ml 트리에틸아민 (3 eq.) 및 2.68 g 트리포스겐 (0.5 eq.)를 5 분 간격으로 0℃에서 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서, 질소 분위기 하에서 1 시간 동안 교반하였다. 얻어진 반응물 전체를 감압 하에서 농축하고 질소 분위기 하에서 유지시켰다.
0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 2 목 500 ml RB 플라스크 내 건조 THF (100 ml) 내 3 g 소듐 히드리드 (7 eq.)의 현탁액에, 8.9 g 2-(디메틸아미노)에탄-1-티올 하이드로클로라이드 (3.5 eq.)를 부가하고 5 분 동안 질소 분위기 하에서 교반하면서 유지시켰다. 이 얻어진 용액에 건조 THF (200 ml) 내에 용해된 상기 카바밀 클로라이드를 시린지를 통해 천천히 약 10 분 동안 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 밤새 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액(100 ml)으로 급냉하고 이후 EtOAc (350 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 80 ml). 조합시킨 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
제 1 정제를 중성 알루미나를 사용하여 수행하였다. 헥산 내에 용해된 크루드 화합물을 중성 알루미나 (칼럼 내에서 700 g 로딩된)의 상단에서 로딩시켰다. 화합물을 8-10% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제 2 정제를 실리카 겔 (100-200 메쉬)를 사용하여 수행하였다. 헥산 내에 용해된 화합물을 실리카 겔 (칼럼 내에서 500g 로딩된)의 상단에서 로딩시켰다. 화합물을 20-25% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 최종 화합물 (헥산 내에 용해된)를 차콜 처리 (200 mg/g)로 처리하고 셀라이트 층 (20 분 동안 교반 후)를 통해 여과하고, 이후 시린지 말단 막 필터 (PTFE; 0.2 미크론, 25 mm 직경)를 통해 통과시켰다. 얻어진 여액을 감압 하에서 농축하였다. 제조된 양, 15.5 g; 수율, 41%.
ATX-83 / RL-47B: 1 H-NMR (PPM, 500 MHz, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.87 (m, 1), 4.62 (d, J = 7.0, 2), 3.24-3.42 (4), 3.02 (t, J = 7.0, 2), 2.53 (t, J = 7.0, 2), 2.26-2.34 (4), 2.26 (s, 6), 2.10 (m, 2), 1.45-1.70 (6), 1.20-1.41 (34), 0.84-0.92 (9).
실시예 11: ATX-84의 합성
도 10은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-84 (RL-47C)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-84: 단계 1
Figure pct00089
500 mL 단일 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (200 ml) 내에 용해된 30 g 헵탄산 (1 eq.)를 취하고 이후 교반하면서 26.7 g 옥살릴 클로라이드 (1.5 eq.)를 천천히 0℃에서, 질소 분위기 하에서 부가하고 이후 1 ml DMF (촉매적)를 부가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다.
별도의 1 l 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에서, DCM (250 ml) 내 40.5 g N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드 (2 eq.)에, 86.6 ml 트리메틸아민 (3 eq.)를 부가적 퍼넬을 사용하여 부가하고, 0℃에서 교반하였다. 이 얻어진 용액에, 상기 산 클로라이드를, 감압 하에서 농축 후, 질소 분위기 하에서 DCM (100 ml) 내에 용해시킴에 의해, 한방울씩 부가 퍼넬을 사용하여 20 분 동안 부가하였다. 얻어진 반응 용액을 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (20% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 물로 희석하였다 (250 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 DCM로 세척하였다 (3 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 10% EtOAc/헥산을 사용하여 (60-120 실리카 겔)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 38.0 g; 수율, 84%.
ATX-84: 단계 2
Figure pct00090
0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된, 1 리터 2 목 둥근 바닥 플라스크 내에 취한 250 ml 건조 에테르 내 8 g 헥실 마그네슘 브로마이드 (1 eq.)의 용액에, 250 ml의 에테르 내에 용해된 2.3 g N-메톡시-N-메틸헵탄아미드 (0.5 eq.)를 부가하고 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액으로 급냉하였다 (200 ml). 유기 층을 분리하고 수층을 에테르 (2 x 100 ml)로 세척하였다. 조합시킨 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 2% EtOAc/헥산을 사용하여 (60-120 메쉬 실리카 겔)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다. 제조된 양, 30.8g; 수율, 71%.
ATX-84: 단계 3
Figure pct00091
200 ml MeOH/THF 내에 용해된 30 g 트리데칸-7-온 (1 eq.)의 용액에, 8.5 g 소듐 보로하이드리드 (0.5 eq.)를 0℃에서 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액으로 급냉하였다 (80 ml). 용매를 감압 하에서 제거하고 얻어진 크루드를 EtOAc (200 ml) 및 물 (100 ml) 사이에서 분배시켰다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 70 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 백색 고체를 얻었다. 제조된 양, 27.2 g; 수율, 90%.
ATX-84: 단계 4
Figure pct00092
120 ml THF 내에 용해된 5 g 6-아미노헥산산 (1 eq.)의 용액에, 125 ml의 1N 수성 NaOH 용액, 이후 34 ml Boc 무수물 (1.3 eq.)를, 0℃에서 순차적으로 부가적 퍼넬을 사용하여, 15 min의 기간에 걸쳐 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 5% HCl (100 ml)로 급냉하고 이후 EtOAc (150 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하여 점착성 액체를 얻었다. 제조된 양, 22.4 g; 수율, 85%.
ATX-84: 단계 5
Figure pct00093
0℃ 아래로 냉각된, DCM (200 ml) 내에 용해된 10 g 6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)헥산산 (1 eq.)의 용액에 10.7 g EDC.HCl (1.3 eq.), 18 ml Et3N (3 eq.), 및 525 mg DMAP (0.1 eq.)를 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 6 g 트리데칸-7-올 (Int 3, 0.7 eq.)를, DCM (50 ml) 내에 용해시킴에 의해, 부가적 퍼넬을 사용하여 동일 온도에서 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.4). 반응물 전체를 물 (150 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 75 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3용액 (100 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc (2 x 100 ml)로 추출하고 부가하였다. 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하고, 크루드로 다음 단계로 진행하였다. 제조된 양, 8.5 g (크루드; 요구되는 화합물 및 알콜).
ATX-84: 단계 6
Figure pct00094
65 ml DCM 내에 용해된 10 g 트리데칸-7-일 6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)헥사노에이트 (1 eq.)의 용액에, 18.5 ml TFA (10 eq.)를 0℃에서 부가하고 실온에서 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.3). 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (100 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (3 x 100 ml). 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 (60-120 메쉬 실리카 겔; 4% MeOH/CHCl3 및 1 ml 트리에틸아민)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하고, 알콜 출발 물질을 회수하였다. 양, 2 단계로 4.5 g; 수율, 33%.
ATX-84: 단계 7
Figure pct00095
0℃ 아래로 냉각된, DCM (300 ml) 내에 용해된 20 g 6-브로모헥산산 (1 eq.)의 용액에 29.3 g EDC.HCl (1.5 eq.), 42.8 ml Et3N (3 eq.), 및 1.2 g DMAP (0.1 eq.)를 순차적으로 질소 분위기 하에서 10 분 간격으로 부가하였다. 이 얻어진 용액에 100 ml의 DCM 내에 용해된 14.5 g (Z)-논-2-엔-1-올 (1 eq.)를, 부가적 퍼넬을 사용하여 부가하고, 실온에서 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (헥산 내 10% EtOAc; Rf: 0.7). 반응물 전체를 물 (200 ml)로 급냉하고 이후 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 세척하였다 (2 x 100 ml). 조합시킨 유기 층을 감압 하에서 농축하였다. 얻어진 크루드를 포화 NaHCO3 용액 (150 ml)으로 세척하고 이후 EtOAc로 추출하였다 (2 x 150 ml). 유기 층을 분리하고, anh.Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 4% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (60-120 메쉬 실리카 겔). 알콜 출발 물질을 회수하였다. 제조된 양, 18.0 g; 수율, 55%.
ATX-84: 단계 8
Figure pct00096
90 ml ACN 내 4.5 g 트리데칸-7-일 6-아미노헥사노에이트 (Int 6, 1 eq.) 및 4.5 g (Z)-논-2-엔-1-일 6-브로모헥사노에이트 (Int 7, 1 eq.)의 용액에, 2.7 g 포타슘 카르보네이트 (1.4 eq.)를 부가하고 얻어진 혼합물을 90℃에서 4 시간 동안 질소 분위기 하에서 환류시켰다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (CHCl3 내 10% MeOH; Rf: 0.5). 반응물 전체를 여과하고, ACN (2 x 20 ml)로 세척하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다.
크루드 화합물을 20% EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (100-200 메쉬 실리카 겔). 출발 물질을 회수하였다. 제조된 양, 3.0 g; 수율, 37%.
ATX-84: 단계 9
Figure pct00097
30 ml 건조 DCM 내에 용해된 2.5 g (Z)-논-2-엔-1-일 6-((6-옥소-6-(트리데칸-7-일옥시)헥실)아미노)헥사노에이트 (1 eq.)의 용액에, 1.8 ml 트리에틸아민 (3 eq.) 및 672 mg 트리포스겐 (0.5 eq.)를 5 분 간격으로 0℃에서 질소 분위기 하에서 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 질소 분위기 하에서 1 시간 동안 교반하였다. 얻어진 반응물 전체를 감압 하에서 농축하고 질소 분위기 하에서 유지시켰다.
0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 2 목 250 ml 둥근 바닥 플라스크 내에서 건조 THF (50 ml) 내 761 mg 소듐 히드리드의 현탁액에, 2.2 g 2-(디메틸아미노)에탄-1-티올 하이드로클로라이드 (3.5 eq.)를 부가하고 5 분 동안 질소 분위기 하에서 교반하면서 유지시켰다. 얻어진 용액에 THF (60 ml) 내에 용해된 상기 카바밀 클로라이드를 시린지를 통해 천천히 약 10 분 동안 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 밤새 질소 분위기 하에서 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5; PMA 탄화). 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (60 ml) 으로 급냉하고 이후 EtOAc (130 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고 수층을 EtOAc로 세척하였다 (3 x 40 ml). 조합시킨 유기 층을 농축하고 얻어진 크루드를 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다.
제 1 정제를 실리카 겔 (100-200 메쉬)를 사용하여 수행하였다. 4.6 g의 크루드 화합물을 10.0 g의 실리카 겔 상에 흡착시키고 칼럼 내에 취한 90.0 g의 실리카 겔 상으로 부었다. 화합물을 50% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제 2 정제를 HPLC 등급 용매로 중성 알루미나를 사용하여 수행하였다. 2.0 g의 크루드 화합물을 6.0 g의 중성 알루미나 상에 흡착시키고 얻어진 것을 칼럼 내에 취한 40.0 g의 중성 알루미나 상으로 부었다. 화합물을 20% EtOAc/헥산에서 용리하였다. 제조된 양, 1.2 g; 수율, 38 % (300 mg 혼합물).
ATX-84 / RL-47C: 1H-NMR (PPM, 500 MHz, CDCl3): δ = 5.64 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.86 (m, 1), 4.62 (d, J = 7.0, 2), 3.22-3.35 (4), 3.01 (t, J = 7.0, 2), 2.53 (t, J = 7.0, 2), 2.25-2.34 (4), 2.27 (s, 6), 2.10 (m, 2), 1.45-1-73 (10), 1.20-1.40 (30), 00.84-0.91 (9).
실시예 12: ATX-61의 합성
도 10은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-61 (RL-42D)의 합성 경로를 나타낸다
ATX-61: 단계 1
Figure pct00098
12 g 글리세린 에스테르 (1 eq.)를 THF (100 ml) 내에 용해시키고 0℃ 아래로 냉각시켰다. 이 용액에, 부가적 퍼넬을 통해 24.2 ml 트리에틸아민 (1.5 eq.) 및 38.11 g Boc 무수물 (1.5 eq.)을 순차적으로 부가하였다.
반응의 진행을 50% EtOAc/헥산; Rf: 0.4를 사용하여 TLC에 의해 모니터링하였다.
반응물 전체를 물로 급냉하고 EtOAc (100 ml)를 16h 후 부가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 40 ml)로 세척하고 조합시킨 유기 층을 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 생성물을 60-120 실리카 겔 (25% EtOAc/헥산)로 처리하였다. 제조된 양, 20.8; 수율, 88%.
ATX-61: 단계 2
Figure pct00099
THF (130 ml) 내에 용해된 18.9 g N-Boc 글리세린 에스테르 (1 eq.)의 용액에 5.85 g LiOH (1.5eq.)의 수성 용액을 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응을 TLC에 의해 모니터링하였고 (60% EtOAc/헥산; Rf: 0.3), SM는 없다.
반응물 전체를 농축하고 크루드 질량을 5% HCl (pH 3)로 급냉하고 이후 EtOAc (4 x 80 ml)로 추출하고, 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 상기 화합물을 얻었다. 제조된 양, 15g; 수율, 92%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-61: 단계 3
Figure pct00100
0℃ 아래로 냉각된, DCM (30 ml) 내에 용해된 5 g N-Boc-글리세린 에스테르 (Int 1, 1 eq.)의 용액에 4.5 ml Et3N (1.2 eq.) 및 6.44 g EDC.HCl (1.2 eq.)를 부가하였다. 이 반응 용액에 20 ml DCM 내 5.12 g 헵타덴-9-올 (0.7 eq.)를 부가하고 실온에서 밤새 교반하였다.
출발 물질은 TLC (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.6)에 의해 부재로 관찰되었다. 반응물 전체를 포화 NaHCO3 용액으로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(2 x 30 ml)로 세척하고 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다. 크루드로 다음 단계로 진행하였다 (6.8 g; 생성물 및 알콜의 혼합물).
ATX-61: 단계 4
Figure pct00101
4 g 헵타데칸-9-일 (tert-부톡시카르보닐)글리시네이트 (Int 2, 1 eq.)를 DCM (40 ml) 내에 용해시키고 0℃ 냉각하고, 7.4 ml TFA (10 eq.)를 부가하고 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
반응 완료를 TLC (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5)에 의해 2 시간 내에 확인하였다.
반응물 전체를 감압 하에서 농축하고, 잔류물을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액 (30 ml)로 세척하고 EtOAc(3 x 30 ml)로 추출하고, 유기 층 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 Int 3를 얻었다.
크루드 생성물을 1-3% MeOH/CHCl3 및 2 ml의 Et3N를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (실리카, 60-120). 제조된 양, 1 g; 1H-NMR 및 Mass에 의해 확인됨.
ATX-61: 단계 5
Figure pct00102
DCM 내에 용해된 (35 ml), 0℃ 아래로 냉각된 4 g 브로모 아세트산 (1 eq.)의 용액에 4.7 ml Et3N (1.2 eq.) 및 354 mg DMAP (0.1 eq.), 이후 13.23 g HATU (1.2 eq.)를 부가하였다. 이 반응 용액에 20 ml의 DCM 내 2.88 g (Z)-논-2-엔-1-올 (0.7 eq.)를 부가하고 실온에서 밤새 교반하였다.
반응을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7).
반응물 전체를 포화 NaHCO3 용액 (80 ml)로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM (40 ml)로 세척하고, 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 (60-120) 칼럼 크로마토그래피 (1.5% EtOAc/헥산)에 의해 정제하였다. 제조된 양, 4 g; 수율, 52%.
ATX-61: 단계 6
Figure pct00103
1 g 헵타데칸-9-일 글리시네이트 (Int 3, 1 eq.)를 THF (25 ml) 내에 용해시키고, 0.5 ml TEA (1.3 eq.) 및 1.08 g (Z)-논-2-엔-1-일 2-브로모아세테이트 유도체 (Int 4, 1.3 eq.)를 부가하고, 실온에서 밤새 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10%EtOAc/헥산; Rf: 0.4). 반응 혼합물을 물 (30 ml)로 희석하고 EtOAc (20 ml x 2)로 추출하고, 조합시킨 유기 층을 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
잔류물을 칼럼 (실리카 겔; 100-200) 크로마토그래피 (2% EtOAc/헥산)에 의해 정제하였다. 제조된 양, 700mg; 수율, 47%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-61: 단계 7
Figure pct00104
5℃ 아래로 냉각된, 15 ml DCM 내에 용해된 700 mg 헵타데칸-9-일 (Z)-(2-(논-2-엔-1-일옥시)-2-옥소에틸)글리시네이트) (1 eq.)의 용액에 0.4 ml Et3N (3 eq.), 이후 209 mg 트리포스겐 (0.5 eq.)를 조금씩 10 분 동안 부가하였다.
반응 혼합물의 진행을 TLC에 의해 모니터링하고, 반응을 0.5 시간 동안 완료하고, 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다.
0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 건조 THF (10 ml) 및 DMF (3 ml) 내 423 mg N, N-디메틸 에탄티올 하이드로클로라이드 (3 eq.)의 용액에, 144 mg 소듐 히드리드 (6 eq.)를 부가하였다. 10 분 후, 이 반응물 전체에 THF (15 ml) 내에 용해시킴에 의해 상기 용액을 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
1 시간 후 TLC (10% MeOH/CHCl3; Rf: 0.5)에 의해 반응 완료가 관찰되었다.
반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (20 ml)으로 급냉하고, 물 (20 ml) 및 EtOAc (30 ml)를 부가하였다. 수성 층을 EtOAc (2 x 20 ml)로 세척하고, 조합시킨 유기 층을 식염수 용액 (20 ml)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드를 15% EtOAC/헥산을 사용한 실리카 겔 (100-200), 및 이후 % EtOAc/헥산을 사용한 중성 알루미나를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 순수한 화합물을 얻었다. 제조된 양, 520 mg; 수율, 58%; 1H-NMR, HPLC 및 Mass에 의해 확인됨.
ATX-61 / RL-42D: 1 H-NMR (PPM, 400MHz, CDCl3): δ = 5.67 (m, 1), 5.51 (m, 1), 4.92 (m, 1), 4.70 (m, 2), 4.16-4.27 (4), 3.07 (m, 2), 2.53 (m, 2), 2.27 (s, 6), 2.10 (m, 2), 1-47-1.57 (4), 1.19-1.40 (32), 0.83-0.92 (9).
실시예 13: ATX-63의 합성
도 12은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-63 (RL-42A)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-63: 단계 1
Figure pct00105
12 g 글리세린 에스테르 (1 eq.)를 THF (100 ml) 내에 용해시키고 0℃ 아래로 냉각시켰다. 이 용액에, 24.2 ml 트리에틸아민 (1.5 eq.) 및 38.11 g Boc 무수물 (1.5 eq.)을 부가적 퍼넬을 통해 순차적으로 부가하였다.
반응의 진행을 50% EtOAc/헥산; Rf: 0.4를 사용하여 TLC에 의해 모니터링하였다.
반응물 전체를 물로 급냉하고 16 시간 후 EtOAc (100 ml)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 40 ml)로 세척하고 조합시킨 유기 층을 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 생성물을 60-120 실리카 겔 (25% EtOAc/헥산)로 처리하였다. 제조된 양, 20.8; 수율, 88%.
ATX-63: 단계 2
Figure pct00106
THF (130 ml) 내에 용해된 18.9 g N-Boc 글리세린 에스테르 (1 eq.)의 용액에 5.85 g LiOH (1.5 eq.)의 수성 용액을 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응을 TLC (60% EtOAc/헥산; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하고, 반응 생성물로부터의 출발 물질은 부재였다.
반응물 전체를 농축하고 크루드 질량을 5% HCl (pH 3)로 급냉하고 이후 EtOAc (4 x 80 ml)로 추출하고, 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 상기 화합물을 얻었다. 제조된 양, 15 g; 수율, 92%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-63: 단계 3
Figure pct00107
0℃ 아래로 냉각된, DCM (50 ml) 내에 용해된 5 g N-Boc-글리세린 에스테르 (Int 1, 1 eq.)의 용액에, 4.5 ml Et3N (1.2 eq.) 및 6.4 g EDC.HCl (1.2 eq.)를 부가하였다. 이 반응 용액에 20 ml의 DCM 내 3.4 g 운데칸-6-올 (0.7 eq.)를 부가하고 실온에서 밤새 교반하였다.
출발 물질은 TLC (15% EtOAc/헥산; Rf: 0.6)에 의해 부재로 관찰되었다. 반응물 전체를 포화 NaHCO3 용액 (20 ml)으로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM (2 x 40 mL)로 세척하고 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다. 칼럼 여과 후 크루드로 다음 단계로 진행하였다 (5.5 g; 생성물 및 알콜의 혼합물).
ATX-63: 단계 4
Figure pct00108
3.3 g 크루드 운데칸-6-일 (tert-부톡시카르보닐)글리시네이트 (Int 2, 1 eq.)를 DCM (20 ml) 내에 용해하고 0℃로 냉각하고, 7.6 ml TFA (10 eq.)를 부가하고 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
반응 완료를 TLC (10% MeOH/DCM; Rf: 0.5)에 의해 2 시간 내에 확인하였다. 반응물 전체를 감압 하에서 농축하고, 잔류물을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액 (50 ml)으로 세척하고 EtOAc (3 x 25 ml)로 추출하고, 유기 층 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 Int 3를 얻었다.
크루드 생성물을 1-3% MeOH/CHCl3 및 2 ml Et3N를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (실리카, 60-120). 제조된 양, 1.2 g; 수율, 40%; 1H-NMR 및 Mass에 의해 확인됨.
ATX-63: 단계 5
Figure pct00109
0℃ 아래로 냉각된, DCM (35 ml) 내에 용해된 4 g 브로모 아세트산 (1 eq.)의 용액에 4.7 ml Et3N (1.2 eq.) 이후 13.23 g HATU (1.2 eq.) 및 354 mg DMAP (0.1 eq.)를 부가하였다. 이 반응 용액에 20ml의 DCM 내 2.88 g (Z)-논-2-엔-1-올 (0.7 eq.)를 부가하고 실온에서 밤새 교반하였다.
반응을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7).
반응물 전체를 포화 NaHCO3 용액 (80 ml)으로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM (40 ml)로 세척하고, 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 (60-120) 칼럼 크로마토그래피 (1.5% EtOAc/헥산)에 의해 정제하였다. 제조된 양, 4 g; 수율, 52%.
ATX-63: 단계 6
Figure pct00110
1.2 g 운데칸-6-일 글리시네이트 (Int 3, 1 eq.)를 25 ml THF 내에 용해시키고, 0.9 ml TEA (1.3 eq.) 및 1.37 g (Z)-논-2-엔-1-일 2-브로모아세테이트 (Int 4, 1 eq.)를 부가하고, 실온에서 밤새 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응 혼합물을 물 (30 ml)로 희석하고 EtOAc (20 ml x 2)로 추출하고, 조합시킨 유기 층을 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
잔류물을 칼럼 (실리카 겔; 100-200) 크로마토그래피 (3% EtOAc/헥산)에 의해 정제하였다. 제조 양, 800 mg; 수율, 37%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-63: 단계 7
Figure pct00111
5℃ 아래로 냉각된, DCM 내에 용해된 800 mg (Z)-논-2-엔-1-일 (2-옥소-2-(운데칸-6-일옥시)에틸)글리시네이트 (1 eq.)의 용액에 0.4 ml Et3N (3 eq.), 이후 209 mg 트리포스겐 (0.5 eq.)를 조금씩 10 분 동안 부가하였다.
반응 혼합물의 진행을 TLC에 의해 모니터링하고, 반응을 1 시간 동안 완료하고, 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다.
0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 건조 THF 및 DMF (10 ml 및 5 ml, 각각) 내 423 mg N, N-디메틸 에탄티올 하이드로클로라이드 (3 eq.)의 용액에, 144 mg 소듐 히드리드 (6 eq.)를 부가하였다. 10 분 후, 이 반응물 전체에 상기 용액을 THF 내에 용해시킴에 의해 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
TLC (70% EtOAc/헥산; Rf: 0.4)에 의해 반응 완료가 1 시간 후 관찰되었다. 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (25 ml)으로 급냉하고, 물 (20 ml) 및 EtOAc (20 ml)를 부가하였다. 수성 층을 EtOAc (2 x 20 ml)로 세척하고, 조합시킨 유기 층을 식염수 용액 (20 ml)으로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드를 20% EtOAc/헥산을 사용한 실리카 겔 (100-200), 및 이후 5% EtOAc/헥산을 사용한 중성 알루미나를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하여, 순수한 화합물을 얻었다. 제조된 양, 510 mg; 수율, 48%; 1H-NMR, HPLC 및 Mass에 의해 확인됨.
ATX-63 / RL-42A: 1 H-NMR (PPM, 400MHz, CDCl3): δ = 5.67 (m, 1), 5.52 (m, 1), 4.92 (m, 1), 4.70 (m, 2), 4.15-4.27 (4), 3.06 (m, 2), 2.53 (m, 2), 2.27 (s, 6), 2.09 (m, 2), 1.47-1.57 (4), 1.20-1.41 (20), 0.82-0.92 (9).
실시예 14: ATX-64의 합성
도 13은 다음과 같이 추가로 기술된 ATX-64 (RL-42C)의 합성 경로를 나타낸다.
ATX-64: 단계 1
Figure pct00112
12 g 에틸 글리시네이트 (1 eq.)를 THF (100 ml) 내에 용해시키고 0℃ 아래로 냉각시켰다. 이 얻어진 용액에, 부가적 퍼넬을 통해 24.2 ml 트리에틸아민 (1.5 eq.) 및 38.11 g Boc 무수물 (1.5 eq.)을 순차적으로 부가하였다.
반응의 진행을 50% EtOAc/헥산; Rf: 0.4를 사용하여 TLC에 의해 모니터링하였다.
반응물 전체를 물로 급냉하고 16 시간 후 EtOAc (100 m)를 부가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 40 ml)로 세척하고 조합시킨 유기 층을 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드 생성물을 60-120 실리카 겔 (25% EtOAc/헥산)로 처리하였다. 제조된 양, 20.8; 수율, 88%.
ATX-64: 단계 2
Figure pct00113
THF (130 ml) 내에 용해된 18.9 g N-Boc 글리세린 에스테르 (1 eq.)의 용액에 5.85 g LiOH (1.5 eq.)의 수성 용액을 부가하고 얻어진 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다.
반응을 TLC (60% EtOAc/헥산; Rf: 0.3)에 의해 모니터링하고, 반응 생성물로부터의 출발 물질은 부재였다.
반응물 전체를 농축하고 크루드 질량을 5% HCl (pH 3)로 급냉하고 이후 EtOAc (4 x 80 ml)로 추출하고, 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 상기 화합물을 얻었다. 제조된 양, 15 g; 수율, 92%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-64: 단계 3
Figure pct00114
DCM 내에 용해된 (50 mL), 0℃ 아래로 냉각된 5 g N-Boc-글리세린 에스테르 (Int 1, 1 eq.)의 용액에, 4.5 ml Et3N (1.2 eq.) 및 6.4 g EDC.HCl (1.2 eq.)를 부가하였다. 이 반응 용액에 15 ml의 DCM 내 4.84 g 헥사데칸-10-올 (0.7 eq.)를 부가하고 실온에서 밤새 교반하였다.
출발 물질은 TLC (15% EtOAc/헥산; Rf: 0.6)에 의해 부재로 관찰되었다. 반응물 전체를 포화 NaHCO3 용액으로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM(2 x 30 ml)로 세척하고 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
칼럼 여과 후 크루드로 다음 단계로 진행하였다 (5.5 g; 생성물 및 알콜의 혼합물).
ATX-64: 단계 4
Figure pct00115
3.85 g 크루드 헵타데칸-9-일 (tert-부톡시카르보닐)글리시네이트 (Int 2, 1 eq.)를 30 ml DCM 내에 용해시키고 0℃ 냉각하고, 7.4 ml TFA (10 eq.)를 부가하고, 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
반응 완료를 TLC (10% MeOH/DCM; Rf: 0.5)에 의해 2 시간 내에 확인하였다.
반응물 전체를 감압 하에서 농축하고, 잔류물을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액 (30 ml)으로 세척하고 EtOAc(3 x 30 ml)로 추출하고, 유기 층을 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 Int 3를 얻었다.
크루드 생성물을 1-3% MeOH/CHCl3 및 2 ml의 Et3N를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하였다 (실리카, 60-120). 제조된 양, 2.2 g; 1H-NMR 및 Mass에 의해 확인됨.
ATX-64: 단계 5
Figure pct00116
DCM 내에 용해된 (35 mL), 0℃ 아래로 냉각된 4 g 브로모 아세트산 (1 eq.)의 용액에 4.7 ml Et3N (1.2 eq.) 이후 13.23 g HATU (1.2 eq.) 및 354 mg DMAP (0.1 eq.)를 부가하였다. 이 반응 용액에 20 ml의 DCM 내 2.88 g (Z)-논-2-엔-1-올 (0.7 eq.)를 부가하고 실온에서 밤새 교반하였다.
반응을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.7).
반응물 전체를 포화 NaHCO3 용액 (80 ml)으로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM (40 ml)로 세척하고, 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
잔류물을 실리카 겔 (60-120) 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (1.5% EtOAc/헥산). 제조된 양, 4 g; 수율, 52%.
ATX-64: 단계 6
Figure pct00117
2.1 g 헥사데칸-8-일 글리시네이트 (Int 3, 1 eq.)를 50 ml THF 내에 용해시키고, 1.2 ml TEA (1.3 eq.) 및 2.39 g (Z)-논-2-엔-1-일 2-브로모아세테이트 (Int 4, 1.3 eq.)를 부가하고, 실온에서 밤새 교반하였다.
반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다 (10% EtOAc/헥산; Rf: 0.5). 반응 혼합물을 물 (30 ml)로 희석하고 EtOAc (2 x 30 ml)로 추출하고, 조합시킨 유기 층을 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
잔류물을 칼럼 (실리카 겔; 100-200) 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (3% EtOAc/헥산). 제조된 양, 2.2 g; 수율, 65%; Mass에 의해 확인됨.
ATX-64: 단계 7
Figure pct00118
15 ml DCM 내에 용해된, 5℃ 아래로 냉각된 2.2 g 헵타데칸-9-일 (Z)-(2-(논-2-엔-1-일옥시)-2-옥소에틸)글리시네이트) (1 eq.)의 용액에 1.6 ml Et3N (3 eq.), 이후 678 mg 트리포스겐 (0.5 eq.)를 조금씩 10 분 동안 부가하였다.
반응 혼합물의 진행을 TLC에 의해 모니터링하고, 반응을 1 시간 동안 완료하고, 반응물 전체를 감압 하에서 농축하였다.
0℃에서 질소 분위기 하에서 교반된 건조 THF 및 DMF (35 ml 및 15 ml, 각각) 내 3.94 g N, N-디메틸 에탄티올 하이드로클로라이드 (7 eq.)의 용액에, 672 mg 소듐 히드리드 (7 eq.)를 부가하였다. 10 분 후, 이 반응물 전체에 상기 용액을 THF 내에 용해시킴에 의해 부가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
1hr 후 TLC (70% EtOAc/헥산; Rf: 0.4)에 의해 반응 완료가 관찰되었다. 반응물 전체를 포화 NH4Cl 용액 (25 ml)으로 급냉하고, 물 (20 ml) 및 EtOAc (20 ml)를 부가하였다. 수성 층을 EtOAc (20 ml x 2)로 세척하고, 조합시킨 유기 층을 식염수 용액 (20 ml)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다.
크루드를 25% EtOAc/헥산을 사용한 실리카 겔 (100-200), 및 이후 15-20% EtOAc/헥산을 사용한 중성 알루미나를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 처리하여, 순수한 화합물을 얻었다. 제조된 양, 1.0 mg; 수율, 40%; 1H-NMR, HPLC 및 Mass에 의해 확인됨.
ATX-64 / RL-42C: 1 H-NMR (PPM, 400MHz, CDCl3): δ = 5.67 (m, 1), 5.50 (m, 1), 4.92 (m, 1), 4.70 (t, J = 7.0, 2), 3.06 (, m, 2), 2.53 (m, 2), 2.27 (s, 6), 1.47-1.57 (4), 1.17-1.40 (30), 0.82-0.93 (9).
실시예 15: pKa 값
그의 pKa 값을 측정하기 위해 지질을 적정하였다. 그 결과를 다음 표에 나타낸다.
Figure pct00119
실시예 16: 생체내 EPO mRNA 안정성
혈장 중 mRNA 수준을 측정하고, 상이한 양이온성 지질을 포함하는 나노입자를 주사한 후에 비교하였다. 암컷 Balb/c 마우스(6 내지 8주령)를, 지질 캡슐화된 마우스 혈장 에리트로포이에틴(EPO) mRNA를 주사한 후의 생체내 EPO 수준을 평가하는 데 사용하였다. 모든 제형을 5 ml/㎏의 투여 부피로 0.03 및 0.1 mg/㎏의 용량으로 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하였다. 제형 주사 후 6시간째에, 2% 아이소플루란 하에서 심장 천자를 통해 말단 혈액 수집을 수행하였다. 혈액을 0.109 M 시트르산 완충액 튜브 내에 수집하고, 10분 동안 5000 rpm으로 원심분리하여 처리하였다. 혈청을 수집하고, EPO mRNA 수준을 분석하였다. 결과가 도 17에 나타나 있다. 결과는 ATX-57, ATX-81, ATX-82, ATX-83, ATX-84, ATX-85, ATX-86, 및 ATX-87의 경우 ATX-2에 비해 상당한 개선을 나타낸다.
실시예 17: 생체내 마우스 인자 VII 침묵 및 EPO 발현
리포좀 라이브러리의 간-유도 생체내 스크린을 사용하여, 일련의 화합물을 시험하였는데, 이들은 간세포 - 이 세포는 간실질을 포함함 - 에서의 고수준의 siRNA 매개 유전자 침묵을 촉진시킨다. 혈액-응고 인자인 인자 VII은 간으로의 기능성 siRNA 전달을 검정하기에 적합한 표적 유전자이다. 이 인자는 특히 간세포에서 생성되기 때문에, 유전자 침묵은, 망상-내피 시스템의 세포(예를 들어, 쿠퍼 세포)로의 전달과는 대조적으로, 실질로의 성공적인 전달을 나타낸다. 더욱이, 인자 VII는 혈청에서 용이하게 측정될 수 있는 분비 단백질이어서, 동물을 안락사해야 할 필요성을 없애준다. mRNA 수준에 있어서의 침묵은 단백질의 수준을 측정함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 이는 단백질의 짧은 반감기(2 내지 5 시간) 때문이다. 인자 VIII로 향하는 siRNA를 갖는 조성물을 ATX-ATX-002, ATX-57, 및 ATX-58과 함께 제형화하고, 비교 샘플 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비하였다. FVII siRNA 녹다운(KD) 실험을 위해 암컷 C57BL/6 마우스(6 내지 8주령)를 사용하였다.
모든 제형을 5 mg/㎏의 투여 부피로 0.03 및 0.1 mg/㎏의 용량으로 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하였다. 제형 주사 후 48시간째에, 2% 아이소플루란 하에서 심장 천자를 통해 말단 혈액 수집을 수행하였다. 혈액을 0.109 M 시트르산 완충액 튜브 내에 수집하고, 10분 동안 1200 G로 원심분리하여 처리하였다. 혈장을 수집하고, 인자 VII 단백질 수준을 발색 검정(Biophen FVII, Aniara Corporation)에 의해 분석하였다. PBS-주사된 마우스로부터의 샘플을 사용하여 표준 곡선을 작성하였고, 처리군을 미처리된 PBS 대조군과 대비함으로써 상대 인자 VII 발현을 결정하였다. 결과는 ATX-57 및 ATX-58이 0.03 및 0.1 mg/㎏ 둘 모두에서 ATX-002보다 실질적으로 더 효과적임을 나타내었다(도 15).
암컷 Balb/c 마우스(6 내지 8주령)를, 지질 캡슐화된 마우스 EPO mRNA를 전달한 후의 생체내 EPO 단백질 발현을 평가하는 데 사용하였다. 모든 제형을 5 mL/㎏의 투여 부피로 0.03 및 0.1 mg/㎏의 용량으로 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하였다. 제형 주사 후 6시간째에, 2% 아이소플루란 하에서 심장 천자를 통해 말단 혈액 수집을 수행하였다. 혈액을 0.109 M 시트르산 완충액 튜브 내에 수집하고, 10분 동안 5000 rpm으로 원심분리하여 처리하였다. 혈청을 수집하고, EPO ELISA 검정(R&D Systems)에 의해 EPO 단백질 수준을 분석하였다. PBS-주사된 마우스로부터의 샘플을 사용하여 표준 곡선을 작성하였고, 처리군을 미처리된 PBS 대조군과 대비함으로써 상대 인자 VII 발현을 결정하였다. 결과는 0.1 mg/ml에서 ATX-2보다 ATX-57 나노입자에서 EPO mRNA가 실질적으로 더 높은 양으로 발현됨을 나타내었다(도 16).

Claims (21)

  1. 식 I의 화합물
    Figure pct00120

    여기서
    R1는 10 내지 31 탄소로 구성된 분지쇄 알킬이고,
    R2는 2 내지 20 탄소로 구성된 선형 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
    R3는 1 내지 6 탄소로 구성된 선형 또는 분지 알킬렌이고,
    R4 및 R5는 동일 또는 상이하고, 각각 수소 또는 1 내지 6 탄소로 구성된 선형 또는 분지 알킬;
    L1 및 L2는 동일 또는 상이하고, 각각 1 내지 20 탄소의 선형 알킬렌 또는 2 내지 20 탄소의 선형 알케닐렌이고, 그리고
    X1는 S 또는 O;
    또는 그의 염 또는 용매화물.
  2. 제 1항에 있어서, X1는 S로 구성되는 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, R3는 에틸렌 또는 프로필렌으로 구성되는 화합물.
  4. 제 1항에 있어서, R4 및 R5는 별도로 메틸 또는 에틸인 화합물.
  5. 제 1항에 있어서, L2는 1, 3, 또는 5 탄소로 구성된 알케닐인 화합물.
  6. 제 5항에 있어서, L1는 1, 2, 3, 또는 5 탄소로 구성된 알케닐인 화합물.
  7. 제 1항에 있어서, R2는 알케닐인 화합물.
  8. 제 7 항에 있어서, R2는 9 탄소로 구성된 알케닐인 화합물.
  9. 제 7항에 있어서, R1는 -CH((CH2)nCH3)2로 구성되고, 여기서 n은 4, 5, 6, 또는 7인 화합물.
  10. 제 9항에 있어서, n은 5이고 L1는 1 또는 3 탄소로 구성된 알케닐인 화합물.
  11. 제 9항에 있어서, n은 6이고 L1는 3 또는 5 탄소로 구성된 알케닐인 화합물.
  12. 제 9항에 있어서, n은 7이고 L1는 1, 2, 또는 3 탄소로 구성된 알케닐인 화합물.
  13. 제 9항에 있어서, n은 8이고 L1는 1 또는 3 탄소로 구성된 알케닐인 화합물.
  14. 제 7항에 있어서, R1는 -CH((CH2)nCH3)((CH2)n+1CH3)로 구성되고, 여기서 n은 6 또는 7인 화합물.
  15. 제 1항에 있어서, 식 ATX-43, ATX-57, ATX-58, ATX-61, ATX-63, ATX-64, ATX-81, ATX-82, ATX-83, ATX-84, ATX-86, ATX-87, 및 ATX-88의 화합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물.
    Figure pct00121

    Figure pct00122

    Figure pct00123
  16. 제 1항의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제 1항에 있어서, 지질 나노입자 내에 제 1항의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 지질 나노입자는 중성 지질 및 복합 지질을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제 17항에 있어서, 지질 나노입자는 mRNA를 캡슐화하는 약제학적 조성물.
  20. 제 17항에 있어서, 생물학적으로 활성인 단백질을 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 제 17항에 있어서, 표적 세포 내에서 mRNA에 상동인 누클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
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