CN110337429B - 用于rna递送的可离子化阳离子脂质 - Google Patents

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Abstract

描述了式I的化合物
Figure DDA0002173777500000011
由一种化合物组成，其中R1为–CH((CH2)nCH3)2或–CH((CH2)nCH3)((CH2)n‑1CH3)，其中n是4、5、6、7或8；R2为由2至20个碳组成的直链烷基、烯基或炔基；L1和L2相同或不同，各自为2至20个碳的直链亚烷基或直链亚烯基；X1为S或O；R3为由1至6个碳组成的直链或支化亚烷基；并且R4和R5相同或不同，各自为氢或由1至6个碳组成的直链或支化烷基；或其药学上可接受的盐。

Description

用于RNA递送的可离子化阳离子脂质
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2016年12月21日提交的美国专利申请15/387,067的优先权，其全部内容通过引用合并于此。
2015年5月8日提交的美国专利申请14/707,876(现以美国专利号9,365,610于2016年6月14日公告)、2015年5月8日提交的美国专利申请14/707,796(现以美国专利号9,567,296于2017年2月14日公告)、2014年11月18日提交的美国专利申请14/546,105(现以美国专利号9,593,077于2017年3月14日公告)以及2013年11年18日提交的美国临时专利申请61/905,724的全部公开内容通过引用合并于此。
背景技术
目前正在开发许多不同类型的核酸作为治疗许多疾病的治疗剂。随着开发这些分子，已发展出如下需要：以稳定且具有长保质期的形式制备它们，并且可容易地将其掺入到无水有机或无水极性非质子溶剂中，使得能够包封核酸，而没有会在极性水溶液或非极性溶剂中发生的那些副反应。
本文的描述涉及促进生物活性和治疗分子的细胞内递送的新型脂质组合物。本说明书还涉及包含此类脂质组合物并且可用于将治疗有效量的生物活性分子递送到患者细胞中的药物组合物。
治疗化合物向受试者的递送对于其治疗效果是重要的，并且它通常可因化合物到达靶细胞和组织的能力有限而受到阻碍。在WO2016/081029中公开了各种阳离子脂质，包括化合物ATX-B-6、ATX-B-7和ATX-B-8：
Figure GDA0002984631940000021
改善此类化合物进入组织的靶细胞所凭借的各种递送方式是至关重要的。本文的描述涉及用于促进生物活性分子的靶向细胞内递送的新型脂质、组合物和制备方法。
通常不能达到有效靶向患者组织的生物活性分子的示例包括：多种蛋白质(包括免疫球蛋白蛋白质)、多核苷酸(诸如基因组DNA、cDNA或mRNA反义多核苷酸；以及许多低分子量化合物(无论是合成的还是天然存在的)，诸如肽激素和抗生素。
目前医疗从业者面临的一个基本挑战是，目前正在开发许多不同类型的核酸作为治疗许多疾病的治疗剂。这些核酸包括用于基因表达的mRNA、基因治疗中的DNA、质粒、小干扰核酸(small interfering nucleic acid，siNA)、siRNA和用于RNA干扰(RNAinterference，RNAi)的微RNA(miRNA)、反义分子、核糖酶、antagomirs和核酸配体。随着这些核酸的开发，需要生产易于制备并且可容易地递送至靶组织的脂质制剂。
发明内容
描述了式I的化合物
Figure GDA0002984631940000031
其中
R1为由10至31个碳组成的支链烷基，
R2为由2至20个碳组成的直链烷基、烯基或炔基，
L1和L2相同或不同，各自为1至20个碳的直链亚烷基或2至20个碳组成的直链亚烯基，
X1为S或O，
R3为由1至6个碳组成的直链或支化亚烷基，并且
R4和R5相同或不同，各自为氢或由1至6个碳组成的直链或支化烷基；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施例中该化合物选自由下式的化合物构成的组：ATX-43、ATX-57、ATX-58、ATX-61、ATX-63、ATX-64、ATX-81、ATX-82、ATX-83、ATX-84、ATX-86、ATX-87和ATX-88
Figure GDA0002984631940000032
Figure GDA0002984631940000041
Figure GDA0002984631940000051
在本文所述的一个实施例中，由以下化合物组成：其中，R1是由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个碳组成的支链烷基；R2是由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳组成的直链烷基、烯基或炔基；L1和L2是相同或不同的，每一个都是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳的直链亚烷基，或由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳组成的直链亚烯基；X1是S或O；R3是由1、2、3、4、5或6个碳组成的直链或支化的亚烷基；R4和R5是相同或不同的，每个是氢或由1、2、3、4、5或6个碳组成的直链或支化烷基。
在一个优选实施例中R1是–CH((CH2)nCH3)2，其中n是4、5、6或7个碳；R2为直链烯基；L1为2、3或5个碳的直链亚烷基；L2为1、3或5个碳的直链亚烷基；X1为S；R3为2或3个碳的直链亚烷基；R4和R5相同或不同，均为1或2个碳。
在一个实施例中，本文所述的阳离子脂质在药物组合物中。该药物组合物优选包含脂质纳米颗粒，该脂质纳米颗粒包含核酸，优选RNA多核苷酸。该脂质纳米颗粒优选增加循环中RNA的寿命。在另一实施例中，在施用药物组合物时，其中的脂质纳米颗粒将核酸递送至体内细胞。优选地，核酸具有抑制靶基因表达的活性。或者，核酸具有增加蛋白质产量的活性，该蛋白质在体内细胞表达时进行编码。
本文还描述了通过使用上述任何组合物将核酸引入哺乳动物细胞的方法。细胞可在肝脏、肺、肾、脑、血液、脾或骨骼中。该组合物优选地通过静脉内、皮下、腹膜内或鞘内施用。优选地，本文所述的组合物用于治疗癌症或炎性疾病的方法中。该疾病可以选自以下构成的组：免疫障碍、癌症、肾病、纤维化疾病、遗传异常、炎症和心血管疾病。
附图说明
图1示出了由己酸酯(SM 1)、4-氨基丁酸(SM 2)和4-溴丁酸(SM 3)的ATX-43(RL-43A)的合成途径。中间体(Int)1-8和反应描述于实例2中。
图2示出了由辛酸酯(SM 1)、4-氨基丁酸(SM 2)和4-溴丁酸(SM 3)的ATX-57(RL-43C)的合成途径。中间体1-8和反应描述于实例3中。
图3示出了由SM 1、SM 2和SM3的ATX-58(RL-43B)的与图2相同的合成途径。中间体1-7和反应描述于实例4中。
图4示出了由SM 1、SM 2和SM3的ATX-81(RL-48B)的与图2相同的合成途径。中间体1-8和反应描述于实例5中。
图5示出了由SM 1、SM 2和SM3的ATX-82(RL-47A)的与图2相同的合成途径。中间体1-7和反应描述于实例6中。
图6示出了由SM 1、SM 2和SM3的ATX-86(RL-48A)的与图2相同的合成途径。中间体1-8和反应描述于实例7中。
图7示出了由SM 1、SM 2和SM3的ATX-87(RL-48C)的与图2相同的合成途径。中间体1-8和反应描述于实例8中。
图8示出了由SM 1、SM 2和SM3的ATX-88(RL-48D)的与图2相同的合成途径。中间体1-8和反应描述于实例9中。
图9示出了由SM 1、SM 2和SM3的ATX-83(RL-47B)的与图2相同的合成途径。中间体1-8和反应描述于实例10中。
图10示出了由SM 1、SM 2和SM3的ATX-84(RL-47C)的与图2相同的合成途径。中间体1-8和反应描述于实例11中。
图11示出了由SM 1和SM 2的ATX-61(RL-42D)的与图1相同的合成途径。中间体1-5和反应描述于实例12中。
图12示出了由SM 1和SM 2的ATX-63(RL-42A)的与图1相同的合成途径。中间体1-5和反应描述于实例13中。
图13示出了由SM 1和SM 2的ATX-64(RL-42C)的与图1相同的合成途径。中间体1-5和反应描述于实例14中。
图14示出了将纳米颗粒中的0.03mg/kg和0.1mg/kg mRNA注射到小鼠体内之后的EPO mRNA水平(ng/ml)，该纳米颗粒包含ATX-2、ATX-57、ATX-81、ATX-82、ATX-83、ATX-84、ATX-85、ATX-86或ATX-87阳离子脂质。
图15示出了具有ATX-57和ATX-08的脂质体的抗因子VII敲除活性与ATX-2和对照(仅PBS)活性的对比。
图16示出了具有ATX-57的脂质体的抗EPO敲除活性与ATX-2活性的对比。
具体实施方式
定义
“至少一个”意指一个或多个(例如，1-3、1-2或1)。
“组合物”意指包含特定量的特定成分的产品，以及直接或间接由特定量的特定成分的组合产生的任何产品。
“与…组合”意指在本发明的治疗方法中一起施用式I的化合物与其他药物，意指式I的化合物和其他药物以单独的剂型相继或同时施用，或者以相同的剂型同时施用。
“哺乳动物”意指人或其他哺乳动物，或意指人。
“患者”意指人和其他哺乳动物，优选人。
“烷基(Alkyl)”意指饱和或不饱和的直链或支化烃链。在各种实施例中，烷基具有1-18个碳，即，为C1-C18基团，或者为C1-C12基团、C1-C6基团或C1-C4基团。独立地，在各种实施例中，烷基具有零个支链(即，为直链)、一个支链、两个支链或超过两个支链。“烯基”为可具有一个双键、两个双键或超过两个双键的不饱和烷基。“炔基”为可具有一个三键、两个三键或超过两个三键的不饱和烷基。烷基链可以可选地取代有1个取代基(即，烷基是单取代的)，或1-2个取代基，或1-3个取代基，或1-4个取代基等。取代基可选自以下项构成的组：羟基、氨基、烷基氨基、硼基、羧基、硝基、氰基等。当烷基包含一个或多个杂原子时，该烷基在本文中被称之为杂烷基。当烷基上的取代基为烃时，则所得的基团简单地称为取代烷基。在各个方面，包括取代基的烷基具有少于25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8或7个碳。
“低级烷基”意指链中具有一至六个碳的基团，该链可以是直链或支化的。合适的烷基的非限制性示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基和己基。
“烷氧基”意指烷基-O-基团，其中烷基如上文定义。烷氧基的非限制性示例包括：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基和庚氧基。与母体部分的键合是通过醚氧。
“烷氧基烷基”意指烷氧基-烷基-基团，其中烷氧基和烷基如前所述。优选的烷氧基烷基包含低级烷基。与母体部分的键合是通过烷基。
“烷基芳基”意指烷基-芳基-基团，其中烷基和芳基如前所述。优选的烷基芳基包含低级烷基。与母体部分的键合是通过芳基。
“氨基烷基”意指NH2-烷基-基团，其中烷基如上文定义，通过烷基与母体部分结合。
“羧基烷基”意指HOOC-烷基-基团，其中烷基如上文定义，通过烷基与母体部分结合。
“可商购的化学品”和本文所述实例中所使用的化学品可获自标准商业来源，其中此类来源包括：例如Acros Organics(宾夕法尼亚州，匹兹堡)、Sigma-Adrich Chemical(威斯康星州，密尔沃基)、Avocado Research(英国，兰开夏郡)、Bionet(英国，康沃尔郡)、Boron Molecular(北卡罗来纳州，科研三角园)、Combi-Blocks(加利福尼亚州，圣迭戈)、Eastman Organic Chemicals、Eastman Kodak Company(纽约州，罗契斯特市)、FisherScientific Co.(宾夕法尼亚州，匹兹堡)、Frontier Scientific(犹他州，洛根市)、ICNBiomedicals,Inc.(加利福尼亚州，科斯塔梅萨)、Lancaster Synthesis(新罕布什尔州，温德姆)、Maybridge Chemical Co.(英国，康沃尔郡)、Pierce Chemical Co.(罗克福德，伊利诺伊州)、Riedel de Haen(德国，汉诺威)、Spectrum Quality Product,Inc.(新泽西州，新宾士威克)、TCI America(俄勒冈州，波特兰)和Wako Chemicals USA,Inc.(弗吉尼亚州，里士满)。
如本领域的普通技术人员所知，“化学文献中描述的化合物”可通过涉及化学化合物和化学反应的参考书籍和数据库来鉴定。详述可用于制备本文所公开的化合物的反应物的合成或为描述本文所公开的化合物的制备的文章提供参考的参考书籍和论文包括：例如，“Synthetic Organic Chemistry”,John Wiley and Sons,Inc.New York；S.R.Sandleret al,“Organic Functional Group Preparations,”2nd Ed.,Academic Press,NewYork,1983；H.O.House,“Modern Synthetic Reactions,”2nd Ed.,W.A.Benjamin,Inc.Menlo Park,Calif.,1972；T.L.Glichrist,“Heterocyclic Chemistry,”2nd Ed.JohnWiley and Sons,New York,1992；J.March,“Advanced Organic Chemistry:reactions,Mechanisms and Structure,”5th Ed.,Wiley Interscience,New York,2001；具体和类似的反应物也可通过美国化学会的化学文摘社制作的已知化学品的索引来鉴定，这些索引可在大多数公共和大学图书馆以及通过在线数据库获得(可联系位于华盛顿特区的美国化学会获取更多详细信息)。目录中已知但尚不能商购的化学品可通过定制化学合成机构制备，其中许多标准化学品供应商(诸如上文所列的那些)提供定制的合成服务。
“卤”意指氟、氯、溴或碘基团。优选的为氟、氯或溴，更优选的为氟和氯。
“卤素”意指氟、氯、溴或碘。优选的为氟、氯和溴。
“杂烷基”意指含有碳和至少一个杂原子的饱和或不饱和的直链或支链。在各种实施例中，杂烷基可具有一个杂原子，或1-2个杂原子，或1-3个杂原子，或1-4个杂原子。在一方面，杂烷基链含有1至18(即1-18)个成员原子(碳和杂原子)，并且在各种实施例中含有1-12、或1-6或1-4个成员原子。独立地，在各种实施例中，杂烷基具有零个支链(即，是直链)、一个支链、两个支链或超过两个支链。独立地，在一实施例中，杂烷基基团是饱和的。在另一实施例中，杂烷基基团是不饱和的。在各种实施例中，不饱和的杂烷基可具有一个双键、两个双键、超过两个双键和/或一个三键、两个三键或超过两个三键。杂烷基链可以是取代或未取代的。在一实施例中，杂烷基链是未取代的。在另一实施例中，杂烷基链是取代的。取代的杂烷基链可具有1个取代基(即，通过单取代)，或者可具有例如1-2个取代基，或1-3个取代基，或1-4个取代基。示例性杂烷基取代基包括酯基(—C(O)—O—R)和羰基(—C(O)—)。
“羟烷基”是指HO-烷基-基团，其中烷基按先前定义。优选的羟烷基含有低级烷基。合适的羟烷基的非限制性示例包括羟甲基和2-羟乙基。
“水合物”意指其中溶剂分子为H2O的溶剂化物。
“脂质”意指包含脂肪酸的酯且特征在于不溶于水但可溶于许多有机溶剂的有机化合物。脂质通常分成至少三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂类；以及(3)“衍生脂质”，诸如类固醇。
“脂质颗粒”是指可用于将治疗性核酸(例如mRNA)递送至感兴趣的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的脂质制剂。在优选的实施例中，脂质颗粒是核酸-脂质颗粒，其通常由阳离子脂质、非阳离子脂质(例如，磷脂)、防止颗粒聚集的缀合脂质(例如，PEG脂质)和可选的胆固醇形成。通常，可将治疗性核酸(例如，mRNA)包封在颗粒的脂质部分中，从而保护它免于酶促降解。
脂质颗粒的平均直径通常为30nm至150nm、40nm至150nm、50nm至150nm、60nm至130nm、70nm至110nm、70nm至100nm、80nm至100nm、90nm至100nm、70nm至90nm、80nm至90nm、70nm至80nm，或30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm，并且基本上无毒。此外，当存在于本发明的脂质颗粒中时，核酸在水溶液中对核酸酶的降解具有抗性。
“溶剂化物”指本公开化合物与一个或多个溶剂分子的物理结合。这种物理结合涉及不同程度的离子键合和共价键合，包括氢键。在某些情况下，溶剂化物将能够分离，例如当一个或多个溶剂分子并入结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”包括溶液相和可孤立溶剂化物。适宜的溶剂化物的非限制性实例包括乙醇化物、甲醇化物等。
“脂质包封的”意指脂质颗粒为治疗性核酸诸如mRNA提供完全包封、部分包封或两者。在优选的实施例中，核酸(例如mRNA)完全包封在脂质颗粒中。
“脂质缀合物”意指抑制脂质颗粒聚集的缀合脂质。此类脂质缀合物包括但不限于：PEG-脂质缀合物，例如，PEG与二烷氧基丙基偶联(例如，PEG-DAA缀合物)、PEG与二酰基甘油偶联(例如，PEG-DAG缀合物)、PEG与胆固醇偶联、PEG与磷脂酰乙醇胺偶联以及PEG与神经酰胺缀合、阳离子PEG脂质；聚恶唑啉(POZ)-脂质缀合物；聚酰胺低聚物；以及它们的混合物。PEG或POZ可直接缀合至脂质或可经由连接基团部分连接到脂质。可使用适于将PEG或POZ偶联至脂质的任何连接基团部分，包括例如不含酯基的连接基团部分和含酯基的连接基团部分。在某些优选的实施例中，使用不含酯基的连接基团部分，诸如酰胺或氨基甲酸酯。
“两亲性脂质”意指其中脂质材料的疏水部分朝疏水相取向而亲水部分朝向水相取向的材料。亲水性特征源于极性或带电基团(诸如碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团)的存在。疏水性可通过包括非极性基团来赋予，所述非极性基团包括但不限于长链饱和及不饱和脂族烃基以及被一个或多个芳基、脂环基或杂环基团取代的此类基团。两亲化合物的示例包括但不限于磷脂、氨基脂和鞘脂。
磷脂的代表性示例包括但不限于：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱。其他缺乏磷的化合物诸如鞘脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸，也在称为两亲性脂质的组中。另外，上述两亲性脂质可与其他脂质(包括甘油三酯和固醇)混合。
“中性脂质”意指在选定的pH下以不带电或中性的两性离子形式存在的脂质物质。在生理pH下，此类脂质包括：例如，二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
“非阳离子脂质”意指两亲性脂质或中性脂质或阴离子脂质，并在下文更详细地描述。
“阴离子脂质”意指在生理pH下带负电的脂质。这些脂质包括但不限于：磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基磷脂酰甘油(POPG)和与中性脂质接合的其他阴离子修饰基团。
“疏水性脂质”意指具有非极性基团的化合物，所述极性基团包括但不限于：长链饱和及不饱和脂族烃基，以及可选地被一个或多个芳基、脂环基或杂环基取代的此类基团。合适的示例包括但不限于：二酰基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1,2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1,2-二烷基-3-氨基丙烷。
“阳离子脂质”和“氨基脂质”可互换使用，意指具有一个、两个、三个或更多个脂肪酸或脂肪烷基链和可pH滴定的氨基头部基团(例如，烷基氨基或二烷基氨基头部基团)的那些脂质及其盐。阳离子脂质通常在低于阳离子脂质的pKa的pH下质子化(即带正电)，并且在高于pKa的pH下为基本上中性的。本发明的阳离子脂质也可称为可滴定的阳离子脂质。在一些实施例中，阳离子脂质包含：可质子化的叔胺(例如，可pH滴定的)头部基团；C18烷基链，其中每个烷基链独立地具有0至3(例如，0、1、2或3)个双键；以及在头部基团与烷基链之间的醚键、酯键或缩酮键。此类阳离子脂质包括但不限于：DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA(也称为DLin-C2K-DMA、XTC2和C2K)、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA(也称为MC2)、DLin-M-C3-DMA(也称为MC3)和(DLin-MP-DMA)(也称为1-B1 1)。
“取代的”意指用氢以外的特定基团或者用一个或多个可相同或不同的基团、部分或自由基取代，其中例如每个取代独立地选择。
“反义核酸”意指通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白质核酸；Egholm et al.,1993Nature 365,566)相互作用与靶RNA结合并改变靶RNA活性的非酶促核酸分子(综述参见：Stein and Cheng,1993Science 261,1004；以及Woolf等人，美国专利5,849,902)。通常，反义分子沿反义分子的单个连续序列与靶序列互补。然而，在某些实施例中，反义分子可与底物结合使得底物分子形成环，和/或，反义分子可结合使得反义分子形成环。因此，反义分子可与两个(或甚至更多个)非连续的底物序列互补，或反义分子的两个(或甚至更多个)非连续的序列部分可与靶序列互补，或两者。此外，反义DNA可用于通过DNA-RNA相互作用靶向RNA，从而激活RNA酶H，该酶消化双链体中的靶RNA。反义寡核苷酸可包含一个或多个RNA酶H激活区，其能够激活RNA酶H切割靶RNA。反义DNA可化学合成或通过使用单链DNA表达载体或其等同物表达。“反义RNA”是具有与靶基因mRNA互补的序列的RNA链，其可通过结合靶基因mRNA来诱导RNAi。“反义RNA”是具有与靶基因mRNA互补的序列的RNA链，并且被认为通过与靶基因mRNA结合来诱导RNAi。“有义RNA”具有与反义RNA互补的序列，并与其互补反义RNA退火以形成iNA。这些反义和有义RNA已常规地用RNA合成器合成。
“核酸”意指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合性质并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
“RNA”意指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。所谓“核糖核苷酸”是指在β-D-核糖-呋喃糖部分的2'位具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，诸如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然RNA的改变的RNA。此类改变可包括添加非核苷酸物质，例如添加到干扰RNA的一个或多个端部或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。本发明的RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可被称为类似物或天然存在的RNA的类似物。如本文所用，术语“核糖核酸”和“RNA”是指含有至少一个核糖核苷酸残基的分子，包括siRNA、反义RNA、单链RNA、微RNA、mRNA、非编码RNA和多价RNA。核糖核苷酸是在β-D-核糖-呋喃糖部分的2'位具有羟基的核苷酸。这些术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，诸如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、取代、修饰和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然RNA的修饰和改变的RNA。RNA的改变可包括添加非核苷酸材料，诸如添加到干扰RNA的一个或多个端部或内部(例如在RNA分子中RNA核苷酸的一个或多个核苷酸处)，包括非标准核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可被称为类似物。
“核苷酸”意指天然碱基(标准)和本领域熟知的修饰碱基。此类碱基通常位于核苷酸糖部分的1'位。核苷酸通常包含碱基、糖和磷酸酯基团。核苷酸可未被修饰或在糖、磷酸酯和/或碱基部分处被修饰(也可互换地称为核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等；参见，例如，Usman和McSwiggen，同上；Eckstein等人，PCT国际公布WO92/07065；Usman等人，PCT国际公布WO93/15187；Uhlman和Peyman，同上，所有文献均以引用方式并入本文。)存在本领域已知的修饰核酸碱基的若干示例，如Limbach,et al,NucleicAcids Res.22:2183,1994所汇总的。可引入核酸分子的碱基修饰的一些非限制性示例包括：肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔等(Burgin,et al.,Biochemistry 35:14090,1996；Uhlman&Peyman，同上)。在这方面，所谓“修饰碱基”意指在1'位的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶以外的核苷酸碱基或它们的等同物。
“互补核苷酸碱基”意指彼此形成氢键的一对核苷酸碱基。在RNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。核酸的互补片段或链彼此杂交(即通过氢键合接合)。所谓“互补”意指核酸可通过传统的Watson-Crick或其他非传统结合模式与另一核酸序列形成一个或多个氢键。
“微RNA”(miRNA)意指长度为21-23个核苷酸的单链RNA分子，其调节由从DNA转录但未翻译成蛋白质的基因编码的基因表达miRNA(非编码RNA)；相反，它们从称为pri-miRNA的初级转录物加工成称为pre-miRNA的短茎环结构，并最后转化成功能性miRNA。成熟miRNA分子与一个或多个信使RNA(mRNA)分子部分互补，并且它们的主要功能是下调基因表达
“小干扰RNA(siRNA)”和“短干扰RNA”和“沉默RNA”意指在生物学中起多种作用的一类长度为16-40个核苷酸的双链RNA分子。最值得注意的是，siRNA参与到RNA干扰(RNAi)途径中，其中它干扰特定基因的表达。除了它们在RNAi途径中的作用外，siRNA还在RNAi相关途径中起作用，例如作为抗病毒机制或用于使基因组的染色质结构成型；这些途径的复杂性现在才被阐明。
“RNAi”意指RNA依赖性基因沉默过程，其由RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)控制并由细胞中的短双链RNA分子启动，其中它们与催化RISC组分argonaute相互作用。当双链RNA或类似RNA的iNA或siRNA是外源的(来自具有RNA基因组的病毒感染或来自转染的iNA或siRNA)时，RNA或iNA被直接导入细胞质中并被dicer酶切割成短片段。起始dsRNA也可以是内源的(起源于细胞)，如在由基因组中的RNA编码基因表达的pre-microRNA中。首先处理来自这些基因的初级转录物以在细胞核中形成pre-miRNA的特征性茎环结构，然后将其输出到细胞质中以通过dicer酶切割。因此，外源和内源这两种dsRNA途径在RISC复合物处会聚。RNA诱导的沉默复合物(RISC)的活性组分是被称为argonaute蛋白的核酸内切酶，其切割与其结合的siRNA或iNA互补的靶mRNA链。由于dicer酶产生的片段是双链的，它们在理论上可各自产生功能性siRNA或iNA。然而，这两条链中的仅一条(称为引导链)结合argonaute蛋白并指导基因沉默。在RISC活化期间，另一抗引导链或过客链被降解。
式I的化合物
除非另外指明，否则本文提及的式I化合物应被理解为包括其盐。如本文所用，术语“盐”代表与无机和/或有机酸形成的酸式盐，以及与无机和/或有机碱形成的碱式盐。此外，当式I的化合物既含有碱性部分(例如但不限于吡啶或咪唑)又含有酸性部分(例如但不限于羧酸)，可以形成两性离子(“内盐”)，该两性离子包括在如本文所用的术语“盐”中。盐可以是药学上可接受的(即，无毒、生理学上可接受的)盐，但是其他盐也是可用的。式I的化合物的盐可通过以下形成，例如，使式I的化合物与一定量的酸或碱(诸如当量)在诸如盐沉淀的介质中或在水性介质中反应，然后冻干。
示例性的酸加成盐包括醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺酸盐(诸如本文所述的那些)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐(toluenesulfonate，也称为tosylate)、十一酸盐等。另外，通常认为，适合于由碱性药物化合物形成药学上可用的盐的酸，例如在以下文献中有所讨论：S.Berge et al,J.Pharmaceutical Sciences(1977)66(1)1-19；P.Gould,InternationalJ.Pharmaceutics(1986)33 201-217；Anderson et al.,The Practice of MedicinalChemistry(1996),Academic Press,New York；以及The Orange Book(Food&DrugAdministration,Washington,D.C.on their website)。这些公开内容以引用方式并入本文。
示例性碱式盐包括：铵盐；碱金属盐，诸如钠盐、锂盐和钾盐；碱土金属盐，诸如钙盐和镁盐；具有有机碱的盐，有机碱例如有机胺，诸如苄星、二环己胺、海巴明(由N,N-双(脱氢枞基)乙二胺形成)、N-甲基-D-葡糖胺、N-甲基-D-葡糖酰胺、叔丁胺；以及，具有氨基酸(诸如精氨酸或赖氨酸)的盐。碱性含氮基团可用以下试剂进行季铵化，诸如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)、二烷基硫酸盐(例如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐)、长链卤化物(例如，癸基、月桂基、十四烷基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物)、芳基烷基卤化物(例如，苄基和苯乙基溴化物)及其他。
所有这样的酸盐和碱盐均旨在是本公开范围内的药学上可接受的盐，并且出于本公开的目的，所有的酸盐和碱盐均被认为等同于对应的式I的化合物的游离形式。
式I的化合物能够以非溶剂化形式和溶剂化形式(包括水合形式)存在。一般来讲，出于本公开的目的，具有药学上可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)的溶剂化形式等同于非溶剂化形式。
式I的化合物以及其盐、溶剂化物可以以它们的互变异构形式(例如，作为酰胺或亚氨基醚)存在。本文设想所有这样的互变异构形式作为本公开的一部分。
在本公开范围内的还有本公开的化合物的多晶型物(即，式I的化合物的多晶型物在本公开的范围内)。
设想本申请的化合物(包括化合物的盐、溶剂化物和前药以及前药的盐和溶剂化物)的所有立体异构体(例如，几何异构体、光学异构体等)也在本公开的范围内，诸如由于各种取代基上的不对称碳而可能存在的那些，包括对映体形式(即使在不存在不对称碳的情况下也可存在)、旋转形式、阻转异构形式和非对映形式。本公开的化合物的单个立体异构体可例如基本上不含其他异构体，或者可例如作为外消旋体或与所有其他或其他选择的立体异构体混合。本文化合物的手性中心可具有如IUPAC 1974推荐所定义的S构型或R构型。术语“盐”、“溶剂化物”等的使用旨在同样适用于所公开化合物的对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、外消旋体或前药的盐和溶剂化物。
可用作化学治疗剂(抗肿瘤剂)的化合物的类别包括：烷化剂、抗代谢物、天然产物及其衍生物、激素和类固醇(包括合成类似物)以及合成剂。以下给出了这些类别中的化合物的示例。
脂质颗粒
在脂质组合物中，式I的化合物包括的其药学上可接受的盐，该脂质组合物包含纳米颗粒或脂质分子的双层。脂质双层优选还包含中性脂质或聚合物。脂质组合物优选包含液体介质。该组合物优选还包封核酸。核酸优选具有通过利用RNA干扰(RNAi)抑制靶基因表达的活性。脂质组合物优选还包含核酸和中性脂质或聚合物。脂质组合物优选包封核酸。
本说明书提供脂质颗粒，所述脂质颗粒包含一种或多种包封在脂质颗粒内的治疗性mRNA分子。
在一些实施例中，mRNA完全包封在脂质颗粒的脂质部分内，使得脂质颗粒中的mRNA在水溶液中对核酸酶降解具有抗性。在其他实施例中，本文所述的脂质颗粒对哺乳动物诸如人类基本上无毒。脂质颗粒的平均直径通常为30nm至150nm、40nm至150nm、50nm至150nm、60nm至130nm、70nm至110nm或70至90nm。本发明的脂质颗粒通常还具有1:1至100:1、1:1至50:1、2:1至25:1、3:1至20:1、5:1至15:1、或5:1至10:1、或10:1至14:1、或9:1至20:1的脂质：RNA比(质量/质量比)。在一个实施例中，脂质颗粒具有12:1的脂质：RNA比(质量/质量比)。在另一个实施例中，脂质颗粒具有13:1的脂质：mRNA比(质量/质量比)。
在优选的实施例中，脂质颗粒包含mRNA、阳离子脂质(例如，本文所述的一种或多种阳离子脂质或其盐)、磷脂和抑制颗粒聚集的缀合脂质(例如，一种或多种PEG-脂质缀合物)。脂质颗粒也可包括胆固醇。脂质颗粒可包含表达一种或多种多肽的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个mRNA。
在核酸-脂质颗粒中，mRNA可完全包封在颗粒的脂质部分内，从而保护核酸免受核酸酶降解。在优选的实施例中，包含mRNA的脂质颗粒被完全包封在颗粒的脂质部分内，从而保护核酸免受核酸酶降解。在某些情况下，在37℃下将颗粒暴露于核酸酶至少20、30、45或60分钟后，脂质颗粒中的mRNA基本上不降解。在某些其他情况下，将颗粒在血清中于37℃下孵育至少30、45或60分钟或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小时后，脂质颗粒中的mRNA基本上不降解。在其他实施例中，mRNA与颗粒的脂质部分复合。本发明制剂的一个益处是核酸-脂质颗粒组合物对哺乳动物诸如人类基本上无毒。
“完全包封”意指核酸-脂质颗粒中的核酸(例如mRNA)在暴露于会显著降解游离RNA的血清或核酸酶试验后不会显著降解。当完全包封时，优选颗粒中小于25％的核酸在通常降解100％的游离核酸的处理中降解，更优选颗粒中小于10％、最优选小于5％的核酸被降解。“完全包封”还意指核酸-脂质颗粒在体内施用时不会快速分解成其组成部分。
在核酸的情况下，完全包封可通过进行渗透不过膜的荧光染料排除试验来测定，所述试验使用当与核酸结合时具有增强的荧光的染料。通过将染料添加到脂质体制剂中，测量所得荧光，并将其与添加少量非离子洗涤剂时观察到的荧光进行比较，来测定包封。洗涤剂介导的对脂质体双层的破坏释放包封的核酸，从而允许其与渗透不过膜的染料相互作用。核酸包封可计算为E＝(I0-I)/I0，其中/并且I0是指添加洗涤剂之前和之后的荧光强度。
在其他实施例中，本发明提供了包含多个核酸-脂质颗粒的核酸-脂质颗粒组合物。
脂质颗粒包含完全包封在颗粒的脂质部分内的mRNA，使得30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％、90％至100％、30％至95％、40％至95％、50％至95％、60％至95％、70％至95％、80％至95％、85％至95％、90％至95％、30％至90％、40％至90％、50％至90％、60％至90％、70％至90％、80％至90％、或至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或其任何分数或任何其中的范围)的颗粒具有包封在其中的mRNA。
根椐脂质颗粒的预期用途，可改变组分的比例，并且可使用本领域已知的试验测量特定制剂的递送效率。
阳离子脂质
本说明书包括某些阳离子脂质化合物的合成。所述化合物特别适于将多核苷酸递送至细胞和组织，如后续章节所示。本文所述的脂类大环化合物可用于其他目的以及例如受体和添加剂。
阳离子脂质化合物的合成方法可通过本领域的技术合成。本领域技术人员将认识到制备这些化合物的其他方法，并且还可制备本说明书的其他化合物。
阳离子脂质化合物可与试剂混合以形成微粒、纳米粒子、脂质体或胶束。由颗粒、脂质体或胶束递送的试剂可以是气体、液体或固体的形式，并且试剂可以是多核苷酸、蛋白质、肽或小分子。脂类大环化合物可与其他阳离子脂质化合物、聚合物(合成或天然的)、表面活性剂、胆固醇、碳水化合物、蛋白质或脂质组合以形成颗粒。然后可选地可以将这些颗粒与药物赋形剂组合以形成药物组合物。
基于使用这样的阳离子脂质化合物，本说明书提供了新颖的阳离子脂质化合物和药物递送系统。该系统可用于药物/药品递送领域，以将多核苷酸、蛋白质、小分子、肽、抗原或药品递送至患者、组织、器官或细胞。这些新颖的化合物也可用作涂层、添加剂、赋形剂、材料或生物工程的材料。
本说明书的阳离子脂质化合物在药物递送领域中提供了若干不同的用途。阳离子脂质化合物的含胺部分可用于复合多核苷酸，从而增强多核苷酸的递送并防止其降解。阳离子脂质化合物还可用于形成含有待递送试剂的超微粒子、纳米粒子、微粒、脂质体和胶束。优选地，阳离子脂质化合物是生物相容性的和可生物降解的，并且所形成的颗粒也是可生物降解的和生物相容性的，并且可用于提供待递送试剂的受控持续释放。这些及其对应的颗粒也可响应pH变化，只要这些颗粒在较低的pH下质子化。它们还可在向细胞递送试剂中起到质子海绵的作用，从而引起内体溶解。
在某些实施例中，阳离子脂质化合物是相对无细胞毒性的。阳离子脂质化合物可以是生物相容性的和可生物降解的。阳离子脂质的pKa可在约5.5至约7.5、更优选在约6.0至约7.0的范围内。其可被设计成期望pKa在约3.0至约9.0之间，或在约5.0至约8.0之间。本文所述的阳离子脂质化合物对于药物递送特别有吸引力，是由于以下若干原因：它们含有氨基，该氨基用于与DNA、RNA、其他多核苷酸和其他带负电的试剂相互作用，用于缓冲pH，用于引起内渗透(endo-osmolysis)，用于保护待递送的试剂，它们可由可商购获得的原料合成；和/或，它们是pH响应性的，并且可工程化具有期望的pKa。
中性助手脂质
非阳离子脂质的非限制性示例包括磷脂，诸如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰甘油(POPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二乙酰-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、以及它们的混合物。也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选是衍生自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基，例如月桂酰、肉豆蔻酰、棕榈酰、硬脂酰或油酰。
非阳离子脂质的其他示例包括固醇，诸如胆固醇及其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性示例包括：极性类似物，诸如5α-胆固烷醇、5α-粪固醇、胆固醇基-(2'-羟基)-乙基醚、胆固醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，诸如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5α-胆甾烷酮和癸酸胆固醇酯；以及它们的混合物。在优选的实施例中，胆固醇衍生物为极性类似物，诸如胆固醇基-(4'-羟基)-丁基醚。
在一些实施例中，存在于脂质颗粒中的非阳离子脂质包含一种或多种磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物，或者由一种或多种磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物组成。在其他实施例中，存在于脂质颗粒中的非阳离子脂质包含一种或多种磷脂或由一种或多种磷脂组成，例如，不含胆固醇的脂质颗粒制剂。在其他实施例中，存在于脂质颗粒中的非阳离子脂质包含胆固醇或其衍生物，或者由胆固醇或其衍生物组成，例如，不含磷脂的脂质颗粒制剂。
非阳离子脂质的其他示例包括不含磷的脂质，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻油酸酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸类聚合物、三乙醇胺-十二烷基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基双甲基溴化铵、神经酰胺和鞘磷脂。
在一些实施例中，非阳离子脂质占存在于颗粒中的总脂质的10mol％至60mol％、20mol％至55mol％、20mol％至45mol％、20mol％至40mol％、25mol％至50mol％、25mol％至45mol％、30mol％至50mol％、30mol％至45mol％、30mol％至40mol％、35mol％至45mol％、37mol％至42mol％，或者35mol％、36mol％、37mol％、38mol％、39mol％、40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％或45mol％(或其任何分数或其中的任何范围)。
在脂质颗粒含有磷脂和胆固醇或胆固醇衍生物的混合物的实施例中，该混合物可占存在于颗粒中的总脂质的至多40mol％、45mol％、50mol％、55mol％或60mol％。
在一些实施例中，混合物中的磷脂组分可占存在于颗粒中的总脂质的2mol％至20mol％、2mol％至15mol％、2mol％至12mol％、4mol％至15mol％或4mol％至10mol％(或其任何分数或其中的任何范围)。在某些优选的实施例中，混合物中的磷脂组分占存在于颗粒中的总脂质的5mol％至10mol％、5mol％至9mol％、5mol％至8mol％、6mol％至9mol％、6mol％至8mol％，或者5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％或10mol％(或其任何分数或其中的任何范围)。
在其他实施例中，混合物中的胆固醇组分可占存在于颗粒中的总脂质的25mol％至45mol％、25mol％至40mol％、30mol％至45mol％、30mol％至40mol％、27mol％至37mol％、25mol％至30mol％或35mol％至40mol％(或其任何分数或其中的任何范围)。在某些优选的实施例中，混合物中的胆固醇组分占存在于颗粒中的总脂质的25mol％至35mol％、27mol％至35mol％、29mol％至35mol％、30mol％至35mol％、30mol％至34mol％、31mol％至33mol％，或者30mol％、31mol％、32mol％、33mol％、34mol％或35mol％。
在脂质颗粒不含磷脂的实施例中，胆固醇或其衍生物可占存在于颗粒中的总脂质的至多25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％、55mol％或60mol％。
在一些实施例中，不含磷脂的脂质颗粒制剂中的胆固醇或其衍生物可占存在于颗粒中的总脂质的25mol％至45mol％、25mol％至40mol％、30mol％至45mol％、30mol％至40mol％、31mol％至39mol％、32mol％至38mol％、33mol％至37mol％、35mol％至45mol％、30mol％至35mol％、35mol％至40mol％，或者30mol％、31mol％、32mol％、33mol％、34mol％、35mol％、36mol％、37mol％、38mol％、39mol％或40mol％(或其任何分数或其中的任何范围)。
在其他实施例中，非阳离子脂质占存在于颗粒中的总脂质的5mol％至90mol％、10mol％至85mol％、20mol％至80mol％、10mol％(例如仅磷脂)或60mol％(例如，磷脂和胆固醇或其衍生物)(或其任何分数或其中的任何范围)。
存在于脂质颗粒中的非阳离子脂质的百分比是目标量，并且制剂中存在的非阳离子脂质的实际量可变化，例如以±5mol％变化。
含有阳离子脂质化合物的组合物可以是30-70％阳离子脂质化合物、0-60％胆固醇、0-30％磷脂和1-10％聚乙二醇(PEG)。优选地，该组合物是30-40％阳离子脂质化合物、40-50％胆固醇和10-20％PEG。在其他优选的实施例中，该组合物是50-75％阳离子脂质化合物、20-40％胆固醇和5-10％磷脂和1-10％PEG。该组合物可含有60-70％阳离子脂质化合物、25-35％胆固醇和5-10％PEG。该组合物可含有至多90％的阳离子脂质化合物和2-15％的辅助脂质。
制剂可以是脂质颗粒制剂，例如，含有：8-30％化合物、5-30％辅助脂质和0-20％胆固醇；4-25％阳离子脂质、4-25％辅助脂质、2-25％胆固醇、10-35％胆固醇-PEG和5％胆固醇胺；或者，2-30％阳离子脂质、2-30％辅助脂质、1-15％胆固醇、2-35％胆固醇-PEG和1-20％胆固醇胺；或者，至多90％的阳离子脂质和2-10％的辅助脂质，或甚至100％的阳离子脂质。
脂质缀合物
除阳离子外，本文所述的脂质颗粒还可包含脂质缀合物。缀合脂质在可防止颗粒聚集上是有用的。合适的缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、阳离子-聚合物-脂质缀合物及其混合物。
在一个优选的实施例中，脂质缀合物是PEG-脂质。PEG-脂质的示例包括但不限于：PEG与二烷氧基丙基偶联(PEG-DAA)、PEG与二酰基甘油偶联(PEG-DAG)、PEG与磷脂(诸如磷脂酰乙醇胺)偶联(PEG-PE)、PEG与神经酰胺缀合、PEG与胆固醇或其衍生物缀合，以及它们的混合物。
PEG是具有两个末端羟基的乙烯PEG重复单元的直链水溶性聚合物。PEG按其分子量分类；包括以下：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)以及含有端部羟基而非端部甲氧基的此类化合物(例如，HO-PEG-S、HO-PEG-S-NHS、HO-PEG-NH2)。
本文所述的PEG-脂质缀合物的PEG部分的平均分子量可以是550道尔顿至10,000道尔顿。在某些情况下，PEG部分的平均分子量为750道尔顿至5,000道尔顿(例如，1,000道尔顿至5,000道尔顿、1,500道尔顿至3,000道尔顿、750道尔顿至3,000道尔顿、750道尔顿至2,000道尔顿)。在优选的实施例中，PEG部分的平均分子量为2,000道尔顿或750道尔顿。
在某些情况下，PEG可选地可以被烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。PEG可直接缀合至脂质，或者可经由连接基团部分连接到脂质。可使用适于将PEG偶联至脂质的任何连接基团部分，包括例如含非酯基的连接基团部分和含酯基的连接基团部分。在一个优选的实施例中，连接基团部分为含非酯基的连接基团部分。合适的含非酯基的连接基团部分包括但不限于：酰氨基(-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)、脲(-NHC(O)NH-)、二硫基(-S-S-)、醚(-O-)、琥珀酰基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、琥珀酰胺基(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚、二硫化物，以及它们的组合(诸如既含有氨基甲酸酯连接基团部分又含有酰氨基连接基团部分的连接基团)。在一个优选的实施例中，使用氨基甲酸酯连接基团将PEG偶联到脂质。
在其他实施例中，使用含酯基的连接基团部分将PEG偶联到脂质。合适的含酯基的连接基团部分包括例如碳酸酯(-OC(O)O-)、琥珀酰基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯以及它们的组合。
具有不同链长和饱和度的多种酰基链基团的磷脂酰乙醇胺可缀合至PEG以形成脂质缀合物。此类磷脂酰乙醇胺是可商购获得的，或者可使用本领域技术人员已知的常规技术分离或合成。含有碳链长度在C10至C20范围内的饱和或不饱和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺是优选的。也可以使用具有单-或二-不饱和脂肪酸以及饱和及不饱和脂肪酸的混合的磷脂酰乙醇胺。合适的磷脂酰乙醇胺包括但不限于：二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
术语“二酰基甘油”或“DAG”包括具有2个脂肪酰基链R1和R2的化合物，两者均独立地具有通过酯键与甘油的1-和2-位键合的2至30个碳。酰基可以是饱和的或具有不同的不饱和度。合适的酰基基团包括但不限于：月桂酰(C12)、肉豆蔻酰(C14)、棕榈酰(C16)、硬脂酰(C18)和二十烷酰(C20)。在优选的实施例中，R1和R2是相同的，即，R1和R2均为肉豆蔻酰(即，二肉豆蔻酰)，R1和R2均为硬脂酰(即，二硬酯酰)。
术语“二烷氧基丙基”或“DAA”包括具有2个烷基链R和R的化合物，两者均独立地具有2至30个碳。烷基基团可以是饱和的或具有不同的不饱和度。
优选地，PEG-DAA缀合物是PEG-二癸氧基丙基(C10)缀合物、PEG-二月桂氧基丙基(C12)缀合物、PEG-二肉豆蔻氧基丙基(C14)缀合物，PEG-二棕榈氧基丙基(C16)缀合物或PEG-二硬脂氧基丙基(C18)缀合物。在这些实施例中，PEG的平均分子量优选为750或2,000道尔顿。在特定实施例中，PEG的端部羟基被甲基基团取代。
除前述之外，可使用其他亲水性聚合物代替PEG。可用于代替PEG的合适聚合物的示例包括但不限于：聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基恶唑啉、聚乙基恶唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸和衍生纤维素(诸如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素)。
在一些实施例中，脂质缀合物(例如，PEG-脂质)占存在于颗粒中的总脂质的0.1mol％至2mol％、0.5mol％至2mol％、1mol％至2mol％、0.6mol％至1.9mol％、0.7mol％至1.8mol％、0.8mol％至1.7mol％、0.9mol％至1.6mol％、0.9mol％至1.8mol％、1mol％至1.8mol％、1mol％至1.7mol％，1.2mol％至1.8mol％、1.2mol％至1.7mol％、1.3mol％至1.6mol％、或1.4mol％至1.5mol％(或其任何分数或其中的任何范围)。在其他实施例中，脂质缀合物(例如，PEG-脂质)占存在于颗粒中的总脂质的0mol％至20mol％、0.5mol％至20mol％、2mol％至20mol％、1.5mol％至18mol％、2mol％至15mol％、4mol％至15mol％、2mol％至12mol％、5mol％至12mol％或2mol％(或其任何分数或其中的任何范围)。
在另一个实施例中，脂质缀合物(例如，PEG-脂质)占存在于颗粒中的总脂质的4mol％至10mol％、5mol％至10mol％、5mol％至9mol％、5mol％至8mol％、6mol％至9mol％、6mol％至8mol％，或者5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％或10mol％(或其任何分数或其中的任何范围)。
存在于本发明的脂质颗粒中的脂质缀合物(例如，PEG-脂质)的百分比是目标量，并且制剂中存在的脂质缀合物的实际量可变化例如±2mol％。本领域普通技术人员将理解，脂质缀合物的浓度可根据所采用的脂质缀合物和脂质颗粒要发生融合的速率而变化。
通过控制脂质缀合物的组成和浓度，可控制脂质缀合物从脂质颗粒中交换出的速率，继而控制脂质颗粒发生融合的速率。此外，其他变量，包括例如pH、温度或离子强度，可用于改变和/或控制脂质颗粒发生融合的速率。在阅读本公开内容后，可用于控制脂质颗粒发生融合的速率的其他方法对于本领域技术人员而言将变得显而易见。另外，通过控制脂质缀合物的组成和浓度，可控制脂质粒度。
用于施用的组合物和制剂
本公开的核酸-脂质组合物可通过各种途径施用，例如经由静脉内、肠胃外、腹膜内或外用(topical)途径实现全身递送。在一些实施例中，siRNA可在细胞内递送，例如在目标组织(诸如肺或肝脏)的细胞中或在发炎的组织中。在一些实施例中，本公开提供了用于体内递送siRNA的方法。核酸-脂质组合物可静脉内、皮下或腹膜内施用给受试者。在一些实施例中，本公开提供了用于将干扰RNA体内递送至哺乳动物受试者的肺的方法。
在一些实施例中，本公开提供了一种治疗哺乳动物受试者体内的疾病或病症的方法。可将治疗有效量的本公开的组合物(含有核酸、阳离子脂质、两亲物、磷脂、胆固醇和PEG连接的胆固醇)施用给受试者，所述受试者患有与能够被该组合物还原、降低、下调或沉默的基因的表达或过表达相关的疾病或病症。
本发明的组合物和方法可通过各种粘膜给药方式给予受试者，包括通过口服、直肠、阴道、鼻内、肺内或透皮或皮肤递送，或通过外用递送至眼睛、耳朵、皮肤或其他粘膜表面。在本公开的一些方面，粘膜组织层包括上皮细胞层。上皮细胞可以是肺、气管、支气管、肺泡、鼻、口腔、表皮或胃肠。本公开的组合物可使用常规的致动器(诸如机械喷雾装置)以及加压、电激活或其他类型的致动器来施用。
本公开的组合物可作为鼻腔或肺部喷雾在水溶液中施用，并且可通过本领域技术人员已知的多种方法以喷雾形式分配。本公开的组合物的肺部递送通过以滴剂、颗粒或喷雾的形式施用组合物来实现，所述组合物可被例如烟雾化、雾化或喷雾化。组合物、喷雾剂或气溶胶的颗粒可为液体形式或固体形式。用于分配液体作为鼻喷剂的优选系统公开于美国专利4,511,069中。这样的制剂可方便地通过下述制备：将根据本公开的组合物溶解于水中以产生水溶液，并使所述溶液无菌。制剂可在多剂量容器中呈现，例如在美国专利4,511,069中公开的密封分配系统中。其他合适的鼻喷剂递送系统已在以下文献中有所描述：TRANSDERMAL SYSTEMIC MEDICATION,Y.W.Chien ed.,Elsevier Publishers,New York,1985；美国专利4,778,810。另外的气溶胶递送形式可包括例如压缩空气、喷射、超声和压电喷雾器，其递送溶解或悬浮在药物溶剂(例如水、乙醇或其混合物)中的生物活性剂。
本公开的鼻腔和肺部喷雾溶液通常包含药物或待递送的药物，可选地用表面活性剂诸如非离子表面活性剂(例如聚山梨酸酯-80)和一种或多种缓冲剂配制。在本公开的一些实施例中，鼻喷雾溶液还包含推进剂。鼻喷雾溶液的pH可为pH 6.8至7.2。所采用的药物溶剂也可以是pH 4-6的微酸性含水缓冲液。可添加其他组分以增强或保持化学稳定性，包括防腐剂、表面活性剂、分散剂或气体。
在一些实施例中，本公开是一种药物产品，该药物产品包括含有本公开的组合物的溶液和用于肺部、粘膜或鼻内喷雾或气溶胶的致动器。
本公开的组合物的剂型可以是液体，以液滴或乳液形式，或者以气溶胶形式。
本公开的组合物的剂型可以是固体，其可在施用之前在液体中重构。固体可作为粉末施用。固体可以是胶囊、片剂或凝胶的形式。
为了在本公开中配制用于肺部递送的组合物，可将生物活性剂与各种药学上可接受的添加剂以及用于分散一种或多种活性剂的基体(base)或载体混合。添加剂的示例包括pH控制剂，诸如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸、及其混合物。其他的添加剂包括局部麻醉剂(例如苯甲醇)、等渗剂(例如氯化钠、甘露糖醇、山梨醇)、吸附抑制剂(例如吐温80)、溶解增强剂(例如环糊精及其衍生物)、稳定剂(例如血清白蛋白)和还原剂(例如谷胱甘肽)。当用于粘膜递送的组合物是液体时，如参考0.9％(w/v)生理盐水溶液的张力作为单位测量的，将制剂的张力通常调节至在施用部位的粘膜中不会引起实质的、不可逆的组织损伤的值。一般来讲，将溶液的张力调节至以下值：1/3至3，更典型地1/2至2，并且最通常的3/4至1.7。
生物活性剂可分散在基体或赋形剂中，所述基体或赋形剂可包含亲水性化合物，该亲水性化合物具有分散活性剂和任何期望添加剂的能力。基体可选自多种合适的载体，包括但不限于：多元羧酸或其盐的共聚物、具有其他单体(例如，甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸等)的羧酸酐(例如马来酸酐)、亲水性乙烯基聚合物(诸如聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮)、纤维素衍生物(诸如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等)以及天然聚合物(诸如壳聚糖、胶原、藻酸钠、明胶、透明质酸)以及它们的无毒金属盐。通常，可生物降解的聚合物被选择为基体或载体，例如，聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-乙醇酸)共聚物、及其混合物。另选地或附加地，合成脂肪酸酯(诸如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等)可用作载体。亲水性聚合物和其他载体可单独使用或组合使用，并且可通过部分结晶、离子键合、交联等赋予载体增强的结构完整性。载体可以以多种形式提供，包括流体或粘稠溶液、凝胶、糊剂、粉末、微球和膜，以用于直接施用于鼻粘膜。在该上下文中使用所选择的载体可带来对生物活性剂吸收的促进。
用于粘膜、鼻腔或肺部递送的制剂可含有亲水性低分子量化合物作为基体或赋形剂。这样的亲水性低分子量化合物提供了通道介质，水溶性活性剂(例如生理活性肽或蛋白质)可通过该通道介质穿过基体扩散至身体表面，在此活性剂被吸收。亲水性低分子量化合物可选地从粘膜或施用环境中吸收水分并溶解水溶性活性肽。亲水性低分子量化合物的分子量通常不超过10,000，并且优选不超过3,000。亲水性低分子量化合物的示例包括：多元醇化合物，诸如低聚糖、二糖和单糖，包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤藓糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、乳果糖、纤维二糖、龙胆二糖、甘油、聚乙二醇及其混合物。亲水性低分子量化合物的其他示例包括：N-甲基吡咯烷酮、醇(例如，低聚乙烯醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)及其混合物。
本公开的组合物可另选地包含根据需要以接近生理条件的作为药学上可接受的载体物质，诸如pH调节和缓冲剂、张力调节剂和润湿剂，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯及其混合物。对于固体组合物，可使用常规的无毒的药学上可接受的载体，其包括：例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
在本公开的某些实施例中，生物活性剂可以延时释放制剂施用，例如在包含缓释聚合物的组合物中施用。活性剂可与防止快速释放的载体一起制备，所述载体例如控释赋形剂(诸如聚合物)、微胶囊化递送系统或生物粘附凝胶。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝水凝胶和明胶)，可在本公开的各种组合物中实现活性剂的延长递送。
虽然已结合某些实施例描述了本公开，并且出于说明的目的已阐述了许多细节，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，本公开包括另外的实施例，并且在不脱离本公开的情况下可显著地改变本文所述的一些细节。本公开包括这样的另外的实施例、修改形式和等同形式。具体地，本公开包括各种例示性组分和实施例的特征、术语或元素的任何组合。
实例
实例1：示例性脂质
式I的示例性化合物提供于表1中。
表1
Figure GDA0002984631940000301
Figure GDA0002984631940000311
Figure GDA0002984631940000321
实例2：ATX-43的合成
图1示出了如下进一步描述的ATX-43(RL-43A)的合成途径。
ATX-43：步骤1
Figure GDA0002984631940000331
在500mL单颈圆底烧瓶中，将25g己酸(SM 1；1当量)溶于二氯甲烷(DCM；200mL)，然后在0℃下缓慢加入27.6ml草酰氯(1.5当量)，在氮气氛下搅拌，然后加入0.5ml二甲基甲酰胺(DMF；催化剂)。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。
在单独的1升双颈圆底烧瓶中，使用另外的漏斗向有31.4g N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(1.5当量)的DCM(200ml)中加入89.8ml三乙胺(Et3N，3当量)，在0℃下搅拌。向该所得溶液中，在氮气氛下加入上述酰基氯(在减压下浓缩后的)——通过溶于DCM(100ml)中，使用加料漏斗滴加20分钟。将所得反应溶液在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过薄层色谱法(TLC)(20％乙酸乙酯(EtOAc)/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用水(300ml)稀释反应物料。分离有机层，并且用DCM(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。
使用(60-120硅胶；10％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，20.0g；收率，58％。
ATX-43：步骤2
Figure GDA0002984631940000332
取有33g戊基溴化镁(1.5当量)的四氢呋喃(THF；100ml)溶液置于500ml双颈圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入有20g N-甲氧基-N-甲基己酰胺(1当量)的溶液(溶于200ml THF中)，并将所得反应混合物在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(150ml)猝灭，然后加入EtOAc(300ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。
使用(60-120目硅胶；2％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，15.0g；收率，66％。
ATX-43：步骤3
Figure GDA0002984631940000341
在0℃下向溶于25ml甲醇(MeOH)的15g十一烷-6-酮(1当量)的150ml THF溶液中加入4.9g硼氢化钠(1.5当量)并将所得溶液在室温下搅拌2小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用饱和NH4Cl溶液(100ml)猝灭反应物料。在减压下去除溶剂，并且将所得粗产物在EtOAc(150ml)和水(150ml)之间分配。分离有机层，并且用EtOAc(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，得到白色固体。产量，14.0g；收率，93％。
ATX-43：步骤4
Figure GDA0002984631940000342
相继使用另外的漏斗，各自隔15分钟的时间段，在0℃下向溶于150ml THF的15g4-氨基丁酸(1当量)溶液中加入145ml 1N NaOH水溶液(1当量)，之后加入43.4ml Boc酸酐(1.3当量)。将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％MeOH的氯仿(CHCl3)溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用5％HCl(150ml)猝灭反应物料，然后加入EtOAc(100ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，得到胶状(gummy)液体。产量，20.0g；收率，68％。
ATX-43：步骤5
Figure GDA0002984631940000351
向冷却至0℃以下的12g 4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸(1当量)溶于DCM(200ml)的溶液中加入14.7g 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC).HCl(1.3当量)、10.6mlEt3N(1.3当量)和0.72g 4-二甲氨基吡啶(DMAP；0.1当量)，在氮气氛下相继以10分钟的间隔顺序进行。在相同温度下，通过溶于DCM(50ml)中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用水(100ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×50ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(100ml)洗涤，然后用EtOAc(2×50ml)萃取。在减压下浓缩有机层，并且用粗产物进行下一步骤。产量，8.5g；收率，48％。
ATX-43：步骤6
Figure GDA0002984631940000352
在0℃下向溶于70ml DCM的8.5g十一烷-6-基-4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸酯(1当量)溶液中加入三氟乙酸(TFA；10当量)，并在氮气氛下于室温搅拌4小时。
通过TLC(70％EtOAc/己烷；Rf：0.2)监测反应进程。在减压下浓缩反应物料。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(150ml)洗涤，然后用EtOAc(2×100ml)萃取。分离有机层并在减压下浓缩。
使用(60-120目硅胶；4％MeOH/CHCl3和1ml的三乙胺)对粗化合物进行柱层析，并回收醇。产量，5.0g；收率，33％(相对于醇)。
ATX-43：步骤7
Figure GDA0002984631940000361
在氮气氛下以10分钟的间隔，向冷却至0℃以下的DCM(100ml)溶有14g 4-溴丁酸(1当量)的溶液中相继加入21g EDC.HCl(1.3当量)、15.2ml Et3N(1.3当量)和1g DMAP(0.1当量)。通过溶于50ml DCM中并在氮气氛下于室温搅拌16小时，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入8.3g(Z)-壬-2-烯-1-醇(0.7当量)。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。用水(50ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×50ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(100ml)洗涤，然后用EtOAc(2×50ml)萃取。分离有机层并在减压下浓缩。
使用5％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(60-120目硅胶)。产量，11.0g；收率，64％。
ATX-43：步骤8
Figure GDA0002984631940000362
向250ml圆底烧瓶中加入有2g十一烷-6-基4-氨基丁酸酯(1当量)和2.2g(Z)-壬-2-烯-1-基4-溴丁酸酯(1当量)的DMF溶液、1.2g碳酸钾(1.2当量)，并将所得混合物在氮气氛下于90℃回流4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。向反应物料中加入冰水，然后用EtOAc萃取、经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。
使用15％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(100-200目硅胶)。回收起始的胺和溴化合物。产量，1.45g；收率，40％。
ATX-43：步骤9
Figure GDA0002984631940000371
在氮气氛下于0℃以5分钟的间隔向干燥DCM溶有1.45g(Z)-壬-2-烯-1-基4-(4-氧代-4-(十一烷-6-基氧基)丁基)氨基)丁酸酯(1当量)的溶液中加入1.29ml三乙胺(3当量)和360mg三光气(0.4当量)。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌1小时。将所得反应物料在减压下浓缩，并且保持在氮气氛下。
360mg氢化钠(5.5当量)溶于干燥THF(20ml)中，在2颈250ml圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入有2.1g 2-(二甲氨基)乙烷-1-硫醇盐酸盐(5.5当量)的THF(30ml)溶液，并在氮气氛下持续搅拌5分钟。向该所得溶液中，使用另外的漏斗缓慢加入溶于THF(50mL)中的上述碳酰氯，约15分钟，加入到该所得溶液中并在室温下搅拌1小时。
将反应物料用饱和NH4Cl溶液(20mL)猝灭，然后加入EtOAc(20mL)。分离有机层，并且用EtOAc(2×20mL)洗涤水层。浓缩合并的有机层，并且将所得粗产物进行柱层析。通过TLC(60％EtOAc/己烷；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。
使用硅胶(100-200目；18％EtOAc/己烷)色谱法进行纯化。产量，500mg；收率，26％；通过1H NMR、HPLC和质谱(Mass)进行确认。
ATX-43/RL-43A：1H-NMR(PPM,400MHz,CDCl3):δ＝5.63(m,1),5.54(m,1),4.87(m,1),4.63(d,J＝7.0,2),3.37(brs,4),3.03(t,J＝7.0,2),2.27(s,6),2.22-2.32(4),2.09(m,2),1.80-1.90(4),1.45-1.55(4),1.20-1.40(22),0.83-0.92(9)。
实例3：ATX-57的合成
图2示出了如下进一步描述的ATX-57(RL-43C)的合成途径。
ATX-57：步骤1：N-甲氧基N-甲基辛酰胺
Figure GDA0002984631940000381
在2升双颈圆底烧瓶中，将辛酸(1当量)溶于DCM(300ml)，然后在0℃下缓慢加入1.5当量草酰氯，在氮气氛下搅拌。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。在单独的2升双颈圆底烧瓶中，使用另外的漏斗向溶有2当量N,O-二甲基羟基胺盐酸盐的DCM(200ml)中加入3当量三甲胺，在0℃下搅拌。向该所得溶液中，在氮气氛下加入上述酰基氯(在减压下浓缩后的)——通过溶于DCM(150ml)中，使用加料漏斗滴加20分钟。将所得反应溶液在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(20％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用水(250ml)稀释反应物料。分离有机层，并且用DCM(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。使用(60-120目硅胶；10％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，85g；收率，65％。
ATX-57：步骤2：十六烷-8-酮
Figure GDA0002984631940000382
取辛基溴化镁的THF(100ml)溶液置于1升双颈圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入N-甲氧基-N-甲基辛酰胺溶液(溶于200ml THF)，并将所得反应混合物在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(250ml)猝灭，然后加入EtOAc(350ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。使用(60-120目硅胶；2％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，65g；收率，63％。
ATX-57：步骤3：十六烷-8-醇
Figure GDA0002984631940000391
在0℃下向溶于MeOH/THF的十六烷-8-酮(1当量)溶液中加入1当量硼氢化钠并将所得溶液在室温下搅拌1.5小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(75ml)猝灭。在减压下去除溶剂，并且将所得粗品在EtOAc(150ml)和水(100ml)之间分配。分离有机层，并且用EtOAc(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，得到白色固体。产量，60g；收率，91％。
ATX-57：步骤4：4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸
Figure GDA0002984631940000392
相继使用另外的漏斗，在15分钟的时间段，在0℃下向溶于THF的4-氨基丁酸溶液中加入1N NaOH水溶液，之后加入Boc酸酐。将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用5％HCl(250ml)猝灭反应物料，然后加入EtOAc(300ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×150ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，获得胶状液体。产量，80g；收率，81％。
ATX-57：步骤5：十六烷-8-基4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸酯
Figure GDA0002984631940000393
在氮气氛下以10分钟的间隔，向冷却至0℃以下的溶于DCM(200ml)的4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸溶液中相继加入EDC.HCl、Et3N和4-二甲氨基吡啶(DMAP)。在相同温度下，通过溶于DCM(150ml)中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入1当量十六烷-8-醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用水(150ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(150ml)洗涤，然后加入EtOAc(200ml)。将有机层分离、在减压下浓缩，并且用粗产物进行下一步骤。产量，80g(粗品；所需的化合物和醇)。
ATX-57：步骤6：十六烷-8-基4-氨基丁酸酯
Figure GDA0002984631940000401
在0℃下向溶于DCM的十六烷-8-基-4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸酯溶液中加入TFA，并在氮气氛下于室温搅拌3小时。通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.3)监测反应进程。在减压下浓缩反应物料。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(300ml)洗涤，然后用EtOAc(2×200ml)萃取。将有机层分离并在减压下浓缩。使用(60-120目硅胶；4％MeOH/CHCl3和1ml的三乙胺)对粗化合物进行柱层析，并回收醇。产量，40g；两步的收率为59％；通过质谱进行确认。
ATX-57：步骤7：(Z)-壬-2-烯-1-基4-溴丁酸酯
Figure GDA0002984631940000402
在氮气氛下以10分钟的间隔向冷却至0℃以下的溶于DCM(400ml)的4-溴丁酸溶液中相继加入EDC.HCl、Et3N和DMAP。通过溶于100ml DCM中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入(Z)-壬-2-烯-1-醇并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。用水(300ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×150ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(200ml)洗涤，然后用EtOAc(150ml)萃取。分离有机层并在减压下浓缩。使用5％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(60-120目硅胶)。回收醇。产量，27g；收率，51％。
ATX-57：步骤8：十六烷-8-基(Z)-4-((4-(壬-2-烯-1-基氧基)-4-氧代丁基)氨基)丁酸酯
Figure GDA0002984631940000411
向十六烷-8-基4-氨基丁酸酯、(Z)-壬-2-烯-1-基4-溴丁酸酯的乙腈(ACN)溶液中加入碳酸钾，并将所得混合物在氮气氛下于90℃回流4小时。通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料过滤、用ACN(20ml)洗涤，并且将滤液在减压下浓缩。使用15％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(100-200目硅胶)。回收原料，胺和溴化合物。产量，20g；收率，40％；通过质谱进行确认。
ATX-57：步骤9
Figure GDA0002984631940000421
在氮气氛下于0℃以5分钟的间隔向溶于干燥DCM的十六烷-8-基(Z)-4-((4-(壬-2-烯-1-基氧基)-4-氧代丁基)氨基)丁酸酯溶液中加入三甲胺和三光气。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌1小时。将所得反应物料在减压下浓缩，并且保持在氮气氛下。
取溶于干燥THF(50ml)的氢化钠置于双颈100ml圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入2-(二甲基氨基)丙烷-1-硫醇盐酸盐，并在氮气氛下持续搅拌5分钟。向该所得溶液中，通过注射器缓慢加入溶于THF(80ml)的上述碳酰氯约10分钟。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌6小时。
通过TLC(60％EtOAC/己烷；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(75ml)猝灭，然后加入EtOAc(150ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×40ml)洗涤水层。浓缩合并的有机层，并且将所得粗产物进行柱层析。
使用硅胶(60-120目)进行第一次纯化。将22g粗化合物吸附在60g硅胶上，并倒入放在柱中的500g硅胶上。以35％EtOAc/己烷洗脱化合物。使用中性氧化铝和HPLC级溶剂进行第二次纯化。将7.5g粗化合物吸附在18g中性氧化铝上，并将所得物倒入放在柱中的130g中性氧化铝上。以10％EtOAc/己烷洗脱化合物。收率，29％；通过1H NMR、HPLC和质谱进行确认。
ATX-57/RL-43C：1H-NMR(PPM,400MHz,CDCl3):δ＝5.63(m,1),5.51(m,1),4.68(m,1),4.83(d,J＝7.0,2),3.19(brs,4),3.22(m,2),2.52(m,2),2.23-2.37(4),2.18(s,6),2.08(m,2),1.84-1.93(4),1.46-1.54(4),1.20-1.40(30),0.83-0.91(9)。
实例4：ATX-58的合成
图3示出了如下进一步描述的ATX-58(RL-43B)的合成途径。
ATX-58：步骤1
Figure GDA0002984631940000431
在N2气氛下，在500ml双颈圆底烧瓶中，将30g 8-溴辛酸(1当量)溶于200ml DCM，然后在0℃下缓慢加入26.7ml草酰氯(1.5当量)，在氮气氛下搅拌。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。
在单独的1升双颈圆底烧瓶中，向有40.5g N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(2当量)的300ml DCM溶液中加入87ml三甲胺(3当量)，在0℃下搅拌。向该所得溶液中，通过溶于500mlDCM中，加入上述酰氯(在减压下浓缩后)，使用加料漏斗滴加15分钟。将所得反应溶液在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(20％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用水(300ml)稀释反应物料。分离有机层，并且用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。
使用(60-120目硅胶；10％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，28g。
ATX-58：步骤2
Figure GDA0002984631940000432
向有28g己基溴化镁(1当量)的THF(100ml)溶液(在氮气氛下于0℃搅拌)中加入有36.8g N-甲氧基-N-甲基辛酰胺(1.3当量)的200ml THF溶液，并将所得反应混合物在室温下搅拌5小时。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.7)监测反应进程。用饱和NH4Cl溶液(100ml)猝灭反应物料。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。
使用(60-120目硅胶；2％乙酸乙酯/己烷)将粗化合物进行柱层析。产量，24g；收率，77％。
ATX-58：步骤3
Figure GDA0002984631940000441
在0℃下向的24g十四烷-7-酮(1当量)溶于MeOH/THF的溶液中加入4.27g硼氢化钠(1当量)，并将所得溶液在室温下搅拌1小时。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用饱和NH4Cl溶液(50ml)猝灭反应物料。在减压下减少甲醇。将所得粗品在EtOAc(200ml)和水之间分配。分离有机层，并且用EtOAc(2×80ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，获得白色固体。产量，21.5g；收率，89％。
ATX-58：步骤4
Figure GDA0002984631940000442
使用漏斗在0℃下向20g 4-氨基丁酸溶于140ml THF的溶液中加入196ml 1N NaOH水溶液，之后加入36.8g Boc酸酐。将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％MeOH/CHCl3；Rf：0.5)监测反应进程。用5％HCl(100ml)猝灭反应物料，然后加入EtOAc(200ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，获得胶状液体。产量，30g；收率，76％。
ATX-58：步骤5
Figure GDA0002984631940000451
以10分钟的间隔相继向冷却至0℃以下的有溶于DCM(150ml)的10g 4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸(1当量)的溶液中加入12.2g EDC.HCl(1.3当量)、20.4ml Et3N(3当量)和488mg DMAP(0.1当量)。通过溶于DCM中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用水(100ml)猝灭反应物料，并分离有机层。用DCM(2×50ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液洗涤，并加入EtOAc(100ml)。将有机层分离、在减压下浓缩，并且用粗产物进行下一步骤。产量，12.7g(粗品)。
ATX-58：步骤6
Figure GDA0002984631940000452
在0℃下向有溶于100ml DCM中的12.5g十四烷-7-基4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸酯(1当量)的溶液中加入23.9ml TFA(10当量)并在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(10％MeOH/CHCl3；Rf：0.3)监测反应进程。在减压下浓缩反应物料。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(100ml)洗涤，并加入EtOAc(100ml)。将有机层分离并在减压下浓缩。
使用(60-120目硅胶；4％MeOH/CHCl3)对粗化合物进行柱层析，并回收醇。两步的产量为7g；收率，47％；通过质谱进行确认。
ATX-58：步骤7
Figure GDA0002984631940000461
以10分钟的间隔向冷却至0℃的有溶于DCM(150ml)的20g 4-溴丁酸(1当量)的溶液中相继加入1.5当量EDC.HCl、3当量Et3N和0.1当量DMAP。通过溶于100ml DCM中，使用漏斗向该所得溶液中加入0.7当量(Z)-壬-2-烯-1-醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.7)监测反应进程。用水(100ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液洗涤，并加入EtOAc(150ml)。将有机层分离并在减压下浓缩。
使用(60-120目硅胶；5％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，17g；收率，69％；通过1H NMR进行确认。
ATX-58：步骤8
Figure GDA0002984631940000462
向6g十四烷-7-基4-氨基丁酸酯(1当量)、5.8g(Z)-壬-2-烯-1-基4-溴丁酸酯(1当量)的ACN(125ml)溶液中加入2.7g碳酸钾(1.2当量)，并将所得物在氮气氛下于90℃回流3小时。
通过TLC(10％MeOH/CHCl3；Rf：0.5)监测反应进程。过滤反应物料，并且将滤液在减压下浓缩。
使用(100-200目硅胶；15％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，4.5g；收率，44％；通过质谱进行确认。
ATX-58：步骤9
Figure GDA0002984631940000471
在氮气氛下于0℃以5分钟的间隔向有溶于30ml干燥DCM的4.4g(Z)-壬-2-烯-1-基4-(4-氧代-4-(十四烷-7-基氧基)丁基)氨基)丁酸酯(1当量)的溶液中加入0.83ml三甲胺(3当量)和418mg三光气(0.5当量)。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌1小时。将所得反应物料在减压下浓缩，并且保持在氮气氛下。
192mg氢化钠(10当量)溶于干燥THF(25ml)中，于100毫升双颈圆底烧瓶中，在0℃下向该溶液中加入564mg 2-(二甲基氨基)丙烷-1-硫醇盐酸盐(5当量)，并在氮气氛下持续搅拌5分钟。向该所得溶液中，通过注射器缓慢加入溶于THF(35ml)的上述碳酰氯约10分钟。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌4h。
通过TLC(60％EtOAC/己烷；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl(30ml)猝灭，然后加入EtOAc(100ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×50ml)洗涤水层。浓缩合并的有机层，并且将所得粗产物进行柱层析。
使用硅胶(60-120目)进行第一次纯化。将5.0g粗化合物吸附在9g硅胶上，并倒入放在柱中的90g硅胶上。以35％EtOAc/己烷洗脱化合物。使用中性氧化铝和HPLC级溶剂进行第二次纯化。将1.5g粗化合物吸附在4g中性氧化铝上，并将所得物倒入放在柱中的40g中性氧化铝上。以10％EtOAc/己烷洗脱化合物。产量，1.2g；收率，21％；通过1H NMR、HPLC、质谱进行确认。
ATX-58/RL-43B：1H-NMR(PPM,400MHz,CDCl3):δ＝5.65(m,1),5.52(m,1),4.86(m,1),4.63(d,J＝7.0,2),3.37(brs,4),3.02(t,J＝6.0,2),2.53(t,J＝6.0,2),2.27-2.36(4),2.27(s,6),2.09(m,2),1.83-1.96(4),1.46-1.54(4),1.20-1.40(26),0.84-0.91(9)。
实例5：ATX-81的合成
图4示出了如下进一步描述的ATX-81(RL-48B)的合成途径。
ATX-81：步骤1
Figure GDA0002984631940000481
在2升双颈圆底烧瓶中，将辛酸溶于DCM(200ml)，然后在0℃下缓慢加入1.5当量草酰氯，在氮气氛下搅拌。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。在单独的2升双颈圆底烧瓶中，使用另外的漏斗向有2当量N,O-二甲基羟基胺盐酸盐的DCM(200ml)溶液中加入3当量三甲胺，在0℃下搅拌。向该所得溶液中，在氮气氛下加入上述酰基氯(在减压下浓缩后的)——通过溶于DCM(150ml)中，使用加料漏斗滴加20分钟。将所得反应溶液在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(20％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用水(250ml)稀释反应物料。分离有机层，并且用DCM(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。使用(60-120目硅胶；10％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，33g；收率，84％。
ATX-81：步骤2
Figure GDA0002984631940000482
取有22g庚基溴化镁(1.5当量)的THF(100ml)溶液置于1升双颈圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入N-甲氧基-N-甲基辛酰胺(1当量)溶液(溶于200mlTHF)，并将所得反应混合物在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(250ml)猝灭，然后加入EtOAc(350ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。使用(60-120目硅胶；2％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，22g；收率，65％。
ATX-81：步骤3
Figure GDA0002984631940000491
在0℃下向溶于MeOH/THF的22g十五烷-8-酮(1当量)溶液中加入1.5当量硼氢化钠并将所得溶液在室温下搅拌1小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(75ml)猝灭。在减压下去除溶剂，并且将所得粗品在EtOAc(150ml)和水(100ml)之间分配。分离有机层，并且用EtOAc(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，得到白色固体。产量，20g；收率，90％。
ATX-81：步骤4
Figure GDA0002984631940000492
相继使用另外的漏斗，在15分钟的时间段，在0℃下向有溶于350ml THF的50g 4-氨基丁酸的溶液中加入490ml 1N NaOH水溶液，之后加入140ml Boc酸酐。将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用5％HCl(250ml)猝灭反应物料，然后加入EtOAc(300ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×150ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，获得胶状液体。产量，80g；收率，81％。
ATX-81：步骤5
Figure GDA0002984631940000501
在氮气氛下以10分钟的间隔，向冷却至0℃以下的有溶于DCM(250ml)的10g 4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸的溶液中相继加入1.3当量EDC.HCl、Et3N和4-二甲氨基吡啶(DMAP)。在相同温度下，通过溶于DCM(150ml)中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入1当量十五烷-7-醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用水(150ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(150ml)洗涤，然后加入EtOAc(200ml)。将有机层分离、在减压下浓缩，并且用粗产物进行下一步骤。产量，8.5克(粗品；所需的化合物和醇)。
ATX-81：步骤6
Figure GDA0002984631940000502
在0℃下向有溶于65ml DCM的8.5g十五烷-8-基4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸酯的溶液中加入10当量TFA，并在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.3)监测反应进程。在减压下浓缩反应物料。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(300ml)洗涤，然后用EtOAc(2×200ml)萃取。将有机层分离并在减压下浓缩。使用(60-120目硅胶；4％MeOH/CHCl3和1ml的三乙胺)对粗化合物进行柱层析，并回收醇。两步的产量为4g；收率，25％；通过质谱进行确认。
ATX-81：步骤7
Figure GDA0002984631940000503
在氮气氛下以10分钟的间隔向冷却至0℃以下的溶于DCM(300ml)的4-溴丁酸的溶液中相继加入EDC.HCl、Et3N和DMAP。使用另外的漏斗，向该所得溶液中加入20g(Z)-壬-2-烯-1-醇——通过溶于100ml DCM中，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。用水(300ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×150ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(200ml)洗涤，然后用EtOAc(150ml)萃取。分离有机层并在减压下浓缩。使用5％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(60-120目硅胶)。回收醇。产量，19g；收率，55％。
ATX-81：步骤8
Figure GDA0002984631940000511
向4.5g十五烷-8-基4-氨基丁酸酯、1当量(Z)-壬-2-烯-1-基4-溴丁酸酯的70ml乙腈(ACN)溶液中加入1.4当量碳酸钾，并将所得混合物在氮气氛下于90℃回流4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料过滤、用ACN(20ml)洗涤，并且将滤液在减压下浓缩。使用15％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(100-200目硅胶)。回收原料，胺和溴化合物。产量，2.1g；收率，27％；通过质谱进行确认。
ATX-81：步骤9
Figure GDA0002984631940000521
在氮气氛下于0℃以5分钟的间隔，向有溶于150ml干燥DCM的2.1g十五烷-8-基(Z)-4-((4-(壬-2-烯-1-基氧基)-4-氧代丁基)氨基)丁酸酯的溶液中加入3当量三乙胺和三光气。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌1小时。将所得反应物料在减压下浓缩，并且保持在氮气氛下。
7当量氢化钠溶于干燥THF(80ml)中，于双颈100ml圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入3.5当量(2-二甲基氨基)丙烷-1-硫醇盐酸盐并在氮气氛下持续搅拌5分钟。向该所得溶液中，通过注射器缓慢加入溶于THF(80ml)的上述碳酰氯约10分钟。将所得溶液在氮气氛下于0℃至室温搅拌过夜。
通过TLC(60％EtOAC/己烷；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(75ml)猝灭，然后加入EtOAc(150ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×40ml)洗涤水层。浓缩合并的有机层，并且将所得粗产物进行柱层析。
使用硅胶(60-120目)进行第一次纯化。将粗化合物吸附在60g硅胶上，并倒入放在柱中的500g硅胶上。以35％EtOAc/己烷洗脱化合物。使用中性氧化铝和HPLC级溶剂进行第二次纯化。将粗化合物吸附在18g中性氧化铝上，并将所得物倒入放在柱中的130g中性氧化铝上。以10％EtOAc/己烷洗脱化合物。产量，1.5g；收率，45％；通过1H NMR、HPLC和质谱进行确认。
ATX-81/RL-48B：1H-NMR(PPM,500MHz,CDCl3):δ＝5.64(m,1),5.52(m,1),4.86(m,1),4.63(d,J＝7.0,2),3.31-3.44(4),3.02(t,J＝7.0,2),2.52(t,J＝7.0,2),2.26-2.36(4),2.27(s,6),2.10(m,2),1.84-1.95(4),1.46-1.54(4),1.20-1.40(26),0.85-0.94(9)。
实例6：ATX-82的合成
图5示出了如下进一步描述的ATX-82(RL-47A)的合成途径。
ATX-82：步骤1
Figure GDA0002984631940000531
在2升双颈圆底烧瓶中，将30g辛酸溶于DCM(200ml)，然后在0℃下缓慢加入1.5当量草酰氯，在氮气氛下搅拌。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。在单独的2升双颈圆底烧瓶中，使用另外的漏斗向有2当量N,O-二甲基羟基胺盐酸盐的DCM(200ml)溶液中加入3当量三甲胺，在0℃下搅拌。向该所得溶液中，在氮气氛下加入上述酰基氯(在减压下浓缩后的)——通过溶于DCM(150ml)中，使用加料漏斗滴加20分钟。将所得反应溶液在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(20％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用水(250ml)稀释反应物料。分离有机层，并且用DCM(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。使用(60-120目硅胶；10％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，33g；收率，84％。
ATX-82：步骤2
Figure GDA0002984631940000532
取庚基溴化镁(1.5当量)的THF(100ml)溶液置于1升双颈圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入28g N-甲氧基-N-甲基辛酰胺(1当量)溶液(溶于200ml THF)，并将所得反应混合物在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(250ml)猝灭，然后加入EtOAc(350ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。使用(60-120目硅胶；2％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，22g；收率，65％。
ATX-82：步骤3
Figure GDA0002984631940000541
在0℃下向有溶于MeOH/THF的22g十五烷-8-酮(1当量)溶液中加入1.5当量硼氢化钠并将所得溶液在室温下搅拌1小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(75ml)猝灭。在减压下去除溶剂，并且将所得粗品在EtOAc(150ml)和水(100ml)之间分配。分离有机层，并且用EtOAc(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，得到白色固体。产量，20g；收率，90％。
ATX-82：步骤4
Figure GDA0002984631940000542
相继使用另外的漏斗，在15分钟的时间段，在0℃下向有溶于120ml THF的15g 4-氨基丁酸溶液中加入185ml 1N NaOH水溶液，之后加入50ml Boc酸酐。将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用5％HCl(250ml)猝灭反应物料，然后加入EtOAc(300ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×150ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，获得胶状液体。产量，27g；收率，85％。
ATX-82：步骤5
Figure GDA0002984631940000551
在氮气氛下，以10分钟的间隔向，冷却至0℃以下的有溶于DCM(250ml)的10g 4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸溶液中相继加入1.3当量EDC.HCl、Et3N和4-二甲氨基吡啶(DMAP)。在相同温度下，通过溶于DCM(150ml)中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入1当量十五烷-7-醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用水(150ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(150ml)洗涤，然后加入EtOAc(200ml)。将有机层分离、在减压下浓缩，并且用粗产物进行下一步骤。产量，8g(粗品；所需的化合物和醇)。
ATX-82：步骤6
Figure GDA0002984631940000552
在0℃下向溶于60ml DCM的8.0g十五烷-8-基4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸酯溶液中加入10当量TFA，并在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.3)监测反应进程。在减压下浓缩反应物料。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(300ml)洗涤，然后用EtOAc(2×200ml)萃取。将有机层分离并在减压下浓缩。使用(60-120目硅胶；4％MeOH/CHCl3和1ml的三乙胺)对粗化合物进行柱层析，并回收醇。产量，4g；两步的收率为25％；通过质谱进行确认。
ATX-82：步骤7
Figure GDA0002984631940000561
在氮气氛下，以10分钟的间隔，向冷却至0℃以下的溶于DCM(400ml)的4-溴丁酸(1当量)溶液中相继加入1.5当量EDC.HCl、3当量Et3N和DMAP。使用另外的漏斗，向该所得溶液中加入20g(Z)-壬-2-烯-1-醇——通过溶于100ml DCM中，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。用水(300ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×150ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(200ml)洗涤，然后用EtOAc(150ml)萃取。分离有机层并在减压下浓缩。使用5％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(60-120目硅胶)。回收醇。产量，18g；收率，55％。
ATX-82：步骤8
Figure GDA0002984631940000562
向4.0g十五烷-8-基4-氨基丁酸酯、1当量(Z)-壬-2-烯-1-基4-溴丁酸酯的90ml(ACN)溶液中加入1.4当量碳酸钾，并将所得混合物在氮气氛下于90℃回流4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料过滤、用ACN(20ml)洗涤，并且将滤液在减压下浓缩。使用15％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(100-200目硅胶)。回收原料(胺和溴化合物)。产量，2.2g；收率，30％；通过质谱进行确认。
ATX-82：步骤9
Figure GDA0002984631940000571
在氮气氛下于0℃以5分钟的间隔，向有溶于25ml干燥DCM的2.2g十五烷-8-基(Z)-4-((4-(壬-2-烯-1-基氧基)-4-氧代丁基)氨基)丁酸酯的溶液中加入3当量三乙胺和三光气。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌1小时。将所得反应物料在减压下浓缩，并且保持在氮气氛下。
7当量氢化钠溶于干燥THF(100ml)，于双颈100ml圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入3.5当量(2-二甲基氨基)丙烷-1-硫醇盐酸盐，并在氮气氛下持续搅拌5分钟。向该所得溶液中，通过注射器缓慢加入溶于THF(100ml)的上述碳酰氯约10分钟。将所得溶液在氮气氛下于0℃至室温搅拌过夜。
通过TLC(60％EtOAc/己烷；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(75ml)猝灭，然后加入EtOAc(150ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×40ml)洗涤水层。浓缩合并的有机层，并且将所得粗产物进行柱层析。
使用硅胶(60-120目)进行第一次纯化。将粗化合物吸附在60g硅胶上，并倒入放在柱中的500g硅胶上。以35％EtOAc/己烷洗脱化合物。使用中性氧化铝和HPLC级溶剂进行第二次纯化。将粗化合物吸附在18g中性氧化铝上，并将所得物倒入放在柱中的130g中性氧化铝上。以10％EtOAc/己烷洗脱化合物。产量，1.2g；收率，43％；通过1H NMR、HPLC和质谱进行确认。
ATX-82/RL-47A：1H-NMR(PPM,500MHz,CDCl3):δ＝5.64(m,1),5.52(m,1),4.87(m,1),4.62(d,J＝7.0,2),3.61(t,J＝7.0,2),3.28-3.37(2),3.02(t,J＝7.0,2),2.61(m,2),2.52(t,J＝7.0,2),2.31(m,2),2.27(s,6),2.10(m,2),1.62-1.70(6),1.21-1.40(32),0.85-0.91(9)。
实例7：ATX-86的合成
图6示出了如下进一步描述的ATX-86(RL-48A)的合成途径。
ATX-86：步骤1
Figure GDA0002984631940000581
在2升双颈圆底烧瓶中，将30g辛酸溶于DCM(200ml)，然后在0℃下缓慢加入1.5当量草酰氯，在氮气氛下搅拌。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。在单独的2升双颈圆底烧瓶中，使用另外的漏斗向有2当量N,O-二甲基羟基胺盐酸盐的DCM(200ml)溶液中加入3当量三甲胺，在0℃下搅拌。向该所得溶液中，在氮气氛下加入上述酰基氯(在减压下浓缩后的)——通过溶于DCM(150ml)中，使用加料漏斗滴加20分钟。将所得反应溶液在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(20％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用水(250ml)稀释反应物料。分离有机层，并且用DCM(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。使用(60-120目硅胶；10％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，38g；收率，84％；通过质谱进行确认。
ATX-86：步骤2
Figure GDA0002984631940000582
取己基溴化镁(1.5当量)的THF(100ml)溶液置于1升双颈圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入38g N-甲氧基-N-甲基辛酰胺(1当量)溶液(溶于200ml THF)，并将所得反应混合物在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(250ml)猝灭，然后加入EtOAc(350ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。使用(60-120目硅胶；2％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，44g；收率，65％；通过质谱进行确认。
ATX-86：步骤3
Figure GDA0002984631940000591
在0℃下向溶于MeOH/THF的44g十三烷-7-酮(1当量)溶液中加入1.5当量硼氢化钠并将所得溶液在室温下搅拌1小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(75ml)猝灭。在减压下去除溶剂，并且将所得粗品在EtOAc(150ml)和水(100ml)之间分配。分离有机层，并且用EtOAc(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，得到白色固体。产量，40g；收率，90％；通过质谱进行确认。
ATX-86：步骤4
Figure GDA0002984631940000592
相继使用另外的漏斗，在15分钟的时间段，在0℃下向有溶于350ml THF的50g 4-氨基丁酸的溶液中加入490ml 1N NaOH水溶液，之后加入140ml Boc酸酐。将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用5％HCl(250ml)猝灭反应物料，然后加入EtOAc(300ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×150ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，获得胶状液体。产量，80g；收率，81％；通过质谱进行确认。
ATX-86：步骤5
Figure GDA0002984631940000601
在氮气氛下，以10分钟的间隔，向冷却至0℃以下的有溶于DCM(250ml)的10g 4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸的溶液中相继加入1.3当量EDC.HCl、Et3N和4-二甲氨基吡啶(DMAP)。在相同温度下，通过溶于DCM(150ml)中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入1当量十五烷-7-醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用水(150ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(150ml)洗涤，然后加入EtOAc(200ml)。将有机层分离、在减压下浓缩，并且用粗产物进行下一步骤。产量，8g(粗品；所需的化合物和醇)。
ATX-86：步骤6
Figure GDA0002984631940000602
在0℃下向有溶于60ml DCM的8.0g十五烷-8-基4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸酯的溶液中加入10当量TFA，并在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.3)监测反应进程。在减压下浓缩反应物料。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(300ml)洗涤，然后用EtOAc(2×200ml)萃取。将有机层分离并在减压下浓缩。使用(60-120目硅胶；4％MeOH/CHCl3和1mL的三乙胺)对粗化合物进行柱层析，并回收醇。产量，3.5g；两步的收率为52％；通过质谱进行确认。
ATX-86：步骤7
Figure GDA0002984631940000611
在氮气氛下，以10分钟的间隔，向冷却至0℃以下的溶于DCM(400ml)的4-溴丁酸(1当量)的溶液中相继加入1.5当量EDC.HCl、2当量Et3N和DMAP。通过溶于100ml DCM中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入20g(Z)-壬-2-烯-1-醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。用水(300ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×150ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(200ml)洗涤，然后用EtOAc(150ml)萃取。分离有机层并在减压下浓缩。使用5％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(60-120目硅胶)。回收醇。产量，18g；收率，55％。
ATX-86：步骤8
Figure GDA0002984631940000612
向4.0g十三烷-7-基4-氨基丁酸酯、1当量(Z)-壬-2-烯-1-基4-溴丁酸酯的90ml(ACN)溶液中加入1.4当量碳酸钾，并将所得混合物在氮气氛下于90℃回流4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料过滤、用ACN(20ml)洗涤，并且将滤液在减压下浓缩。使用15％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(100-200目硅胶)。回收原料，胺和溴化合物。产量，2.2g；收率，30％；通过质谱进行确认。
ATX-86：步骤9
Figure GDA0002984631940000621
在氮气氛下于0℃以5分钟的间隔，向有溶于25ml干燥DCM的2.2g十三烷-7-基(Z)-4-((4-(壬-2-烯-1-基氧基)-4-氧代丁基)氨基)丁酸酯的溶液中加入3当量三乙胺和三光气。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌1小时。将所得反应物料在减压下浓缩，并且保持在氮气氛下。
7当量氢化钠溶于干燥THF(100ml)，于双颈100ml圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入3.5当量(2-二甲基氨基)丙烷-1-硫醇盐酸盐，并在氮气氛下持续搅拌5分钟。向该所得溶液中，通过注射器缓慢加入溶于THF(100ml)的上述碳酰氯约10分钟。将所得溶液在氮气氛下于0℃至室温搅拌过夜。
通过TLC(60％EtOAC/己烷；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(75ml)猝灭，然后加入EtOAc(150ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×40ml)洗涤水层。浓缩合并的有机层，并且将所得粗产物进行柱层析。
使用硅胶(60-120目)进行第一次纯化。将粗化合物吸附在60g硅胶上，并倒入放在柱中的500g硅胶上。以35％EtOAc/己烷洗脱化合物。使用中性氧化铝和HPLC级溶剂进行第二次纯化。将粗化合物吸附在18g中性氧化铝上，并将所得物倒入放在柱中的130g中性氧化铝上。以10％EtOAc/己烷洗脱化合物。产量，1.2g；收率，43％；通过1H NMR、HPLC和质谱进行确认。
ATX-86/RL-48A：1H-NMR(PPM,500MHz,CDCl3):δ＝5.64(m,1),5.51(m,10,4.87(m,1),4.63(d,J＝7.0,2),3.30-3.44(4),3.02(t,J＝7.0,2),2.52(t,J＝7.0,2),2.26-2.36(4),2.27(s,6),2.09(m,2),1.82-1.96(4),1.46-1.54(4),1.21-1.40(24),0.84-0.91(9)。
实例8：ATX-87的合成
图7示出了涉及九个步骤的ATX-87(RL-48C)的合成途径。
ATX-87：步骤1
Figure GDA0002984631940000631
在2升双颈圆底烧瓶中，将20g辛酸溶于DCM(200ml)，然后在0℃下缓慢加入1.5当量草酰氯，在氮气氛下搅拌。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。在单独的2升双颈圆底烧瓶中，使用另外的漏斗向有2当量N,O-二甲基羟基胺盐酸盐的DCM(200ml)溶液中加入3当量三甲胺，在0℃下搅拌。向该所得溶液中，在氮气氛下加入在减压下浓缩后的上述酰基氯——通过溶于DCM(150ml)中，使用加料漏斗滴加20分钟。将所得反应溶液在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(20％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用水(250ml)稀释反应物料。分离有机层，并且用DCM(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。使用(60-120目硅胶；10％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，20g；收率，84％。
ATX-87：步骤2
Figure GDA0002984631940000632
取己基溴化镁(1.5当量)的THF(100ml)溶液置于1升双颈圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入20g N-甲氧基-N-甲基辛酰胺(1当量)溶液(溶于200ml THF)，并将所得反应混合物在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(250ml)猝灭，然后加入EtOAc(350ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。使用(60-120目硅胶；2％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，25g；收率，65％。
ATX-87：步骤3
Figure GDA0002984631940000641
在0℃下向有溶于MeOH/THF的25g十三烷-7-酮(1当量)的溶液中加入1.5当量硼氢化钠，并将所得溶液在室温下搅拌1小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(75ml)猝灭。在减压下去除溶剂，并且将所得粗品在EtOAc(150ml)和水(100ml)之间分配。分离有机层，并且用EtOAc(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，得到白色固体。产量，22g；收率，90％。
ATX-87：步骤4
Figure GDA0002984631940000642
相继使用另外的漏斗，在15分钟的时间段，在0℃下向有溶于350ml THF的50g 4-氨基丁酸的溶液中加入490ml 1N NaOH水溶液，之后加入140ml Boc酸酐。将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用5％HCl(250ml)猝灭反应物料，然后加入EtOAc(300ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×150ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，获得胶状液体。产量，80g；收率，81％。
ATX-87：步骤5
Figure GDA0002984631940000651
在氮气氛下，以10分钟的间隔，向冷却至0℃以下的有溶于DCM(250ml)的17g 4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸的溶液中相继加入1.3当量EDC.HCl、Et3N和4-二甲氨基吡啶(DMAP)。在相同温度下，通过溶于DCM(150ml)中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入1当量十三烷-7-醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用水(150ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(150ml)洗涤，然后加入EtOAc(200ml)。将有机层分离、在减压下浓缩，并且用粗产物进行下一步骤。产量，15g(粗品；所需的化合物和醇)。
ATX-87：步骤6
Figure GDA0002984631940000652
在0℃下向有溶于80ml DCM的15.0g十五烷-8-基4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸酯的溶液中加入10当量TFA，并在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.3)监测反应进程。在减压下浓缩反应物料。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(300ml)洗涤，然后用EtOAc(2×200ml)萃取。将有机层分离并在减压下浓缩。使用(60-120目硅胶；4％MeOH/CHCl3和1mL的三乙胺)对粗化合物进行柱层析，并回收醇。产量，7g；两步的收率为24％；通过质谱进行确认。
ATX-87：步骤7
Figure GDA0002984631940000661
在氮气氛下，以10分钟的间隔，向冷却至0℃以下的溶于DCM(400ml)的4-溴丁酸(1当量)溶液中相继加入1.5当量EDC.HCl、2当量Et3N和DMAP。通过溶于100ml DCM中，使用另外的漏斗，向该所得溶液中加入20g(Z)-壬-2-烯-1-醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。用水(300ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×150ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(200ml)洗涤，然后用EtOAc(150ml)萃取。分离有机层并在减压下浓缩。使用5％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(60-120目硅胶)。回收醇。产量，19g；收率，55％。
ATX-87：步骤8
Figure GDA0002984631940000662
向4.0g十三烷-7-基4-氨基丁酸酯、1当量(Z)-壬-2-烯-1-基4-溴丁酸酯的90ml(ACN)溶液中加入1.4当量碳酸钾，并将所得混合物在氮气氛下于90℃回流4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料过滤、用ACN(20ml)洗涤，并且将滤液在减压下浓缩。使用15％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(100-200目硅胶)。回收原料，胺和溴化合物。产量，2.2g；收率，30％；通过质谱进行确认。
ATX-87：步骤9
Figure GDA0002984631940000671
在氮气氛下于0℃以5分钟的间隔，向有溶于25ml干燥DCM的2.2g十三烷-7-基(Z)-4-((4-(壬-2-烯-1-基氧基)-4-氧代丁基)氨基)丁酸酯的溶液中加入3当量三乙胺和三光气。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌1小时。将所得反应物料在减压下浓缩，并且保持在氮气氛下。
7当量氢化钠溶于干燥THF(100ml)，于双颈100ml圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入3.5当量(2-二甲基氨基)丙烷-1-硫醇盐酸盐，并在氮气氛下持续搅拌5分钟。向该所得溶液中，通过注射器缓慢加入溶于THF(100ml)的上述碳酰氯约10分钟。将所得溶液在氮气氛下于0℃至室温搅拌过夜。
通过TLC(60％EtOAc/己烷；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(75ml)猝灭，然后加入EtOAc(150ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×40ml)洗涤水层。浓缩合并的有机层，并且将所得粗产物进行柱层析。
使用硅胶(60-120目)进行第一次纯化。将粗化合物吸附在60g硅胶上，并倒入放在柱中的500g硅胶上。以35％EtOAc/己烷洗脱化合物。使用中性氧化铝和HPLC级溶剂进行第二次纯化。将粗化合物吸附在18g中性氧化铝上，并将所得物倒入放在柱中的130g中性氧化铝上。在10％EtOAc/己烷下洗脱化合物。产量，1.2g；收率，43％；通过1H NMR、HPLC和质谱进行确认。
ATX-87/RL-48C：1H-NMR(PPM,500MHz,CDCl3):δ＝5.64(m,1),5.52(m,1),4.87(m,1),4.63(d,J＝7.0,2),3.30-3.44(4),3.02(t,J＝7.0,2),2.52(t,J＝7.0,2),2.26-2.36(4),2.27(s,6),2.09(m,2),1.83-1.96(4),1.46-1.54(4),1.21-1.40(32),0.85-0.90(9)。
实例9：ATX-88的合成
图8示出了如下进一步描述的ATX-88(RL-48D)的合成途径。
ATX-88：步骤1
Figure GDA0002984631940000681
在N2气氛下，在500ml双颈圆底烧瓶中，将25g 8-溴辛酸(1当量)溶于200ml DCM，然后在0℃下缓慢加入草酰氯(1.5当量)，在氮气氛下搅拌。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。
在单独的1升双颈圆底烧瓶中，向有2当量N,O-二甲基羟基胺盐酸盐的300ml DCM溶液中加入3当量三甲胺，并在0℃下搅拌。向该所得溶液中，加入上述酰氯(在减压下浓缩后的)——通过溶于500ml DCM中，使用加料漏斗滴加15分钟。将所得反应溶液在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(20％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用水(300ml)稀释反应物料。分离有机层，并且用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。
使用(60-120目硅胶；10％EtOAC/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，21g；收率，66％。
ATX-88：步骤2
Figure GDA0002984631940000682
向有1.3当量辛基溴化镁的THF(100ml)溶液(在氮气氛下于0℃搅拌)中加入20gN-甲氧基-N-甲基辛酰胺的100ml THF溶液，并将所得反应混合物在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.7)监测反应进程。用饱和NH4Cl溶液(100ml)猝灭反应物料。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。
使用(60-120目硅胶；2％乙酸乙酯/己烷)将粗化合物进行柱层析。产量、收率为17.4g、68％。
ATX-88：步骤3
Figure GDA0002984631940000691
在0℃下向有溶于135ml MeOH/THF的17g十六烷-7-酮(1当量)溶液中加入1.5当量硼氢化钠，并将所得溶液在室温下搅拌1小时。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用饱和NH4Cl溶液(50ml)猝灭反应物料。在减压下减少甲醇。将所得粗品在EtOAc(200ml)和水之间分配。分离有机层，并且用EtOAc(2×80ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，获得白色固体。产量，14.5g；收率，85％。
ATX-88：步骤4
Figure GDA0002984631940000692
使用漏斗在0℃下向有溶于350ml THF的50g 4-氨基丁酸的溶液中加入490ml 1NNaOH水溶液，之后加入140ml Boc酸酐。将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％MeOH/CHCl3；Rf：0.5)监测反应进程。用5％HCl(100ml)猝灭反应物料，然后加入EtOAc(200ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，获得胶状液体。产量，80g；收率，81％。
ATX-88：步骤5
Figure GDA0002984631940000701
以10分钟的间隔向冷却至0℃以下的有溶于DCM(200ml)的1当量4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸的溶液中相继加入3当量EDC.HCl、Et3N(3当量)和DMAP(0.1当量)。通过溶于DCM中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用水(100ml)猝灭反应物料，并分离有机层。用DCM(2×50ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液洗涤，并加入EtOAc(100ml)。将有机层分离、在减压下浓缩，并且用粗产物进行下一步骤。产量，19g(粗品)。
ATX-88：步骤6
Figure GDA0002984631940000702
在0℃下向有溶于140ml DCM的19g十六烷-7-基4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸酯(1当量)的溶液中加入10当量TFA，并在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(10％MeOH/CHCl3；Rf：0.3)监测反应进程。在减压下浓缩反应物料。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(100ml)洗涤，并加入EtOAc(100ml)。将有机层分离并在减压下浓缩。
使用(60-120目硅胶；4％MeOH/CHCl3)对粗化合物进行柱层析，并回收醇。产量，9.4g；两步的收率为50％；通过质谱进行确认。
ATX-88：步骤7
Figure GDA0002984631940000711
以10分钟的间隔向冷却至0℃的有溶于DCM(500ml)的30g 4-溴丁酸(1当量)的溶液中相继加入1.5当量EDC.HCl、3当量Et3N和0.1当量DMAP。通过溶于100ml DCM中，使用漏斗向该所得溶液中加入0.7当量(Z)-壬-2-烯-1-醇，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.7)监测反应进程。用水(100ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液洗涤，并加入EtOAc(150ml)。将有机层分离并在减压下浓缩。
使用(60-120目硅胶；5％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，27g；收率，51％；通过1H NMR进行确认。
ATX-88：步骤8
Figure GDA0002984631940000712
向6g十六烷-8-基4-氨基丁酸酯(1当量)、1.5当量(Z)-壬-2-烯-1-基4-溴丁酸酯的ACN(70ml)溶液中加入1.2当量碳酸钾，并将所得物在氮气氛下于90℃回流3小时。
通过TLC(10％MeOH/CHCl3；Rf：0.5)监测反应进程。过滤反应物料，并且将滤液在减压下浓缩。
使用(100-200目硅胶；15％EtOAc/己烷)对粗化合物进行柱层析。产量，4.5g；收率，44％；通过质谱进行确认。
ATX-88：步骤9
Figure GDA0002984631940000721
在氮气氛下于0℃以5分钟的间隔，向有溶于30ml干燥DCM的4.4g(Z)-壬-2-烯-1-基4-(4-氧代-4-(十四烷-7-基氧基)丁基)氨基)丁酸酯(1当量)的溶液中加入0.83ml三甲胺(3当量)和418mg三光气(0.5当量)。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌1小时。将所得反应物料在减压下浓缩，并且保持在氮气氛下。
192mg氢化钠(10当量)溶于干燥THF(25ml)，于100毫升双颈圆底烧瓶中，在0℃下向该溶液中加入564mg 3-(二乙基氨基)丙烷-1-硫醇盐酸盐(5当量)，并在氮气氛下持续搅拌5分钟。向该所得溶液中，通过注射器缓慢加入溶于THF(35ml)的上述碳酰氯约10分钟。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌4小时。
通过TLC(60％EtOAC/己烷；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(30ml)猝灭，然后加入EtOAc(100ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×50ml)洗涤水层。浓缩合并的有机层，并且将所得粗产物进行柱层析。
使用硅胶(60-120目)进行第一次纯化。将5.0g粗化合物吸附在9g硅胶上，并倒入放在柱中的90g硅胶上。以35％EtOAc/己烷洗脱化合物。使用中性氧化铝和HPLC级溶剂进行第二次纯化。将1.5g粗化合物吸附在4g中性氧化铝上，并将所得物倒入放在柱中的40g中性氧化铝上。在10％EtOAc/己烷下洗脱化合物。产量，1.2g；收率，21％；通过1H NMR、HPLC、质谱进行确认。
ATX-88/RL-48D：1H-NMR(PPM,500MHz,CDCl3):δ＝5.64(m,1),5.51(m,1),4.87(m,1),4.63(d,J＝7.0,2),3.30-3.44(4),2.90(t,J＝7.0,2),2.46-2.55(6),2.26-2.37(4),2.09(m,2),1.71-1.80(4),1.46-1.55(4),1.21-1.41(32),1.01(t,J＝7.0,6),00.85-0.91(9)。
实例10：ATX-83的合成
图9示出了如下进一步描述的ATX-83(RL-47B)的合成途径。
ATX-83：步骤1
Figure GDA0002984631940000731
在500ml单颈圆底烧瓶中，将50克辛酸(1当量)溶于DCM(200ml)，然后在0℃下通过另外的漏斗缓慢加入44.6ml草酰氯(1.5当量)，在氮气氛下搅拌，然后加入1ml DMF(催化剂)。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。
在单独的2升双颈圆底烧瓶中，使用另外的漏斗向有67.4g N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(2当量)的DCM(300ml)溶液中加入144ml三乙胺(3当量)，在0℃下搅拌。向该所得溶液中，在氮气氛下加入在减压下浓缩后的上述酰基氯——通过溶于DCM(350ml)中，使用加料漏斗滴加20分钟。将所得反应溶液在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(20％EtOAc/己烷；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。用水(300ml)稀释反应物料。分离有机层，并且用DCM(3×100ml)洗涤水层。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩。
使用10％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(60-120目硅胶)。产量，55.0g；收率，84％
ATX-83：步骤2
Figure GDA0002984631940000741
55g庚基溴化镁(1当量)的醚溶液，置于2升双颈圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入溶于400ml干燥醚的89.6g N-甲氧基-N-甲基辛酰胺溶液(1.5当量)，并将所得反应溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7；PMA显色)监测反应进程。用饱和NH4Cl溶液(250ml)猝灭反应物料。分离有机层，并且用醚(2×100ml)洗涤水层。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩。
使用2％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(60-120目硅胶)。产量，50.0g；收率，75％。
ATX-83：步骤3
Figure GDA0002984631940000742
在0℃下向有溶于290ml MeOH/THF的50g十五烷-8-酮(1当量)的溶液中加入12.5g硼氢化钠(1.5当量)，并将所得溶液在室温下搅拌2小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。用饱和NH4Cl溶液(80ml)猝灭反应物料。在减压下去除溶剂，并且将所得粗产物在EtOAc(250ml)和水(100ml)之间分配。分离有机层，并且用EtOAc(3×80ml)洗涤水层。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，在减压下浓缩并真空干燥，得到白色固体。产量，46.0g；收率，90％。
ATX-83：步骤4
Figure GDA0002984631940000743
相继使用另外的漏斗，在15分钟的时间段内，在0℃下向有溶于THF的50g 4-氨基丁酸(1当量)的溶液中加入490ml 1N NaOH水溶液(1当量)，之后加入140ml Boc酸酐(1.3当量)。将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用5％HCl(350ml)猝灭反应物料，然后加入EtOAc(300ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×150ml)洗涤水层。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到胶状液体。产量，77.0g；收率，78％。
ATX-83：步骤5
Figure GDA0002984631940000751
合成分4批进行。在每一批中，在氮气氛下以10分钟的间隔相继向冷却至0℃以下的有23g 4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸(1当量)的DCM(400ml)溶液中加入32.3g EDC.HCl(1.5当量)、47ml Et3N(3当量)和1.3g DMAP(0.1当量)。通过溶于DCM(200ml)中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入20g十五烷-8-醇(0.77当量)并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.4)监测反应进程。用水(250ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将该所得粗品用饱和NaHCO3溶液(150ml)洗涤，然后加入EtOAc(250ml)。将有机层分离、经无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩，然后用粗产物进行下一步骤。产量，105g(粗品；所需化合物和醇)
ATX-83：步骤6
Figure GDA0002984631940000752
在0℃下向有溶于450ml DCM中的105g十五烷-8-基4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸酯(1当量)的溶液中加入194ml TFA(10当量)并在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.3)监测反应进程。
在减压下浓缩反应物料。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(200ml)搅拌10分钟，然后用EtOAc(300ml)搅拌。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩。
使用4％MeOH/CHCl3和1ml的三乙胺对粗化合物进行柱层析(硅胶60-120目)。两步的产量为60.0g；收率，54％。
ATX-83：步骤7
Figure GDA0002984631940000761
反应分两批进行，在每一批中，在氮气氛下以10分钟的间隔向冷却至0℃以下的
Figure GDA0002984631940000762
溶于DCM(300ml)的20g 6-溴己酸(1当量)的溶液中相继加入29.3g EDC.HCl(1.5当量)、42.8ml Et3N(3当量)和1.2g DMAP(0.1当量)。使用另外的漏斗向该所得溶液中加入14.5g(Z)-壬-2-烯-1-醇(1当量)(通过溶于100ml DCM中)，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。用水(200ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(150ml)洗涤，然后用EtOAc(2×150ml)萃取。分离有机层，经无水Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。
使用4％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(60-120目硅胶)。回收醇反应物。产量，36.0g；收率，55％。
ATX-83：步骤8
Figure GDA0002984631940000771
反应分六批进行。在每一批中，向10g十五烷-8-基4-氨基丁酸(中间体6，1当量)、10.1g(Z)-壬-2-烯-1-基6-溴己酸酯(中间体7，1当量)的120ml ACN溶液中加入6.1g无水碳酸钾(1.4当量)，并将所得混合物在氮气氛下于90℃回流4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料过滤、用ACN(2×20ml)洗涤，并且将滤液在减压下浓缩。
使用20-80％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(硅胶100-200目)。回收原料。产量，36.9g；收率，35％。
ATX-83：步骤9
Figure GDA0002984631940000772
反应分三批进行。在每一批中，在氮气氛下于0℃以5分钟的间隔，向有溶于100ml干燥DCM的10g(Z)-壬-2-烯-1-基6-((4-氧代-4-(十五烷-8-基氧基)丁基)氨基)己酸酯(1当量)的溶液中加入7.5ml三乙胺(3当量)和2.68g三光气(0.5当量)。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌1小时。将所得反应物料在减压下浓缩，并且保持在氮气氛下。
3g氢化钠(7当量)的干燥THF(100ml)悬浮液，于2颈500ml圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入8.9g 2-(二甲氨基)乙烷-1-硫醇盐酸盐(3.5当量)并在氮气氛下持续搅拌5分钟。向该所得溶液中，通过注射器缓慢加入溶于干燥THF(200ml)的上述碳酰氯约10分钟。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌过夜。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(100ml)猝灭，然后加入EtOAc(350ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×80ml)洗涤水层。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩。
使用中性氧化铝进行第一次纯化。将溶于己烷中的粗化合物加载到中性氧化铝(700g加载在柱中)的顶部。以8-10％EtOAc/己烷下洗脱化合物。使用硅胶(100-200目)进行第二次纯化。将溶于己烷中的化合物加载到硅胶(500g加载在柱中)的顶部。以20-25％EtOAc/己烷洗脱化合物。将最终化合物(溶于己烷中)进行活性炭处理(200mg/g)并通过硅藻土床过滤(搅拌20分钟后)，然后通过注射器端部膜过滤器(PTFE；0.2微米，25mm直径)。将所得滤液在减压下浓缩。产量，15.5g；收率，41％。
ATX-83/RL-47B：1H-NMR(PPM,500MHz,CDCl3):δ＝5.64(m,1),5.52(m,1),4.87(m,1),4.62(d,J＝7.0,2),3.24-3.42(4),3.02(t,J＝7.0,2),2.53(t,J＝7.0,2),2.26-2.34(4),2.26(s,6),2.10(m,2),1.45-1.70(6),1.20-1.41(34),0.84-0.92(9)。
实例11：ATX-84的合成
图10示出了如下进一步描述的ATX-84(RL-47C)的合成途径。
ATX-84：步骤1
Figure GDA0002984631940000781
在500ml单颈圆底烧瓶中，将30g庚酸(1当量)溶于DCM(200ml)，然后在0℃下缓慢加入26.7g草酰氯(1.5当量)，在氮气氛下搅拌，然后加入1ml DMF(催化剂)。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。
在单独的1升双颈圆底烧瓶中，使用另外的漏斗向有40.5g N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(2当量)的DCM(250ml)溶液中加入86.6ml三乙胺(3当量)，在0℃下搅拌。向该所得溶液中，在氮气氛下加入在减压下浓缩后的上述酰基氯——通过溶于DCM(100ml)中，使用加料漏斗滴加20分钟。将所得反应溶液在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(20％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用水(250ml)稀释反应物料。分离有机层，并且用DCM(3×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。
使用(60-120硅胶)10％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析。产量，38.0g；收率，84％。
ATX-84：步骤2
Figure GDA0002984631940000791
将有8g己基溴化镁(1当量)的250ml干燥醚溶液置于1升双颈圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入溶于250ml醚的2.3gN-甲氧基-N-甲基庚酰胺(0.5当量)，并将所得反应混合物在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。用饱和NH4Cl溶液(200ml)猝灭反应物料。分离有机层，并且用醚(2×100ml)洗涤水层。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩。
使用(60-120目硅胶)2％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析。产量，30.8g；收率，71％。
ATX-84：步骤3
Figure GDA0002984631940000792
在0℃下向有溶于200ml MeOH/THF的30g十三烷-7-酮(1当量)的溶液中加入8.5g硼氢化钠(0.5当量)，并将所得溶液在室温下搅拌2小时。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。用饱和NH4Cl溶液(80ml)猝灭反应物料。在减压下去除溶剂，并且将所得粗品在EtOAc(200ml)和水(100ml)之间分配。分离有机层，并且用EtOAc(2×70ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，得到白色固体。产量，27.2g；收率，90％。
ATX-84：步骤4
Figure GDA0002984631940000801
相继使用另外的漏斗，在15分钟的时间段内，在0℃下向有溶于120ml THF的5g 6-氨基己酸(1当量)的溶液中加入125ml 1N NaOH水溶液，之后加入34ml Boc酸酐(1.3当量)。将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。用5％HCl(100ml)猝灭反应物料，然后加入EtOAc(150ml)。分离有机层，并且用EtOAc(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层，得到胶状液体。产量，22.4g；收率，85％。
ATX-84：步骤5
Figure GDA0002984631940000802
在氮气氛下，以10分钟的间隔，向冷却至0℃以下的有溶于DCM(200ml)的10g 6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸(1当量)的溶液中相继加入10.7g EDC.HCl(1.3当量)、18mlEt3N(3当量)和525mg DMAP(0.1当量)。在相同温度下，通过溶于DCM(50ml)中，使用另外的漏斗向该所得溶液中加入6g十三烷-7-醇(中间体3，0.7当量)并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.4)监测反应进程。用水(150ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×75ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(100ml)洗涤，然后加入EtOAc(2×100ml)萃取。将有机层分离、在减压下浓缩，并且用粗产物进行下一步骤。产量，8.5克(粗品；所需的化合物和醇)。
ATX-84：步骤6
Figure GDA0002984631940000811
在0℃下向有溶于65ml DCM中的10g十六烷-7-基6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸酯(1当量)的溶液中加入18.5ml TFA(10当量)并在氮气氛下于室温搅拌3小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.3)监测反应进程。在减压下浓缩反应物料。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(100ml)洗涤，然后用EtOAc(3×100ml)萃取。分离有机层并在减压下浓缩。
使用(60-120目硅胶；4％MeOH/CHCl3和1ml的三乙胺)对粗化合物进行柱层析，并回收醇起始材料。两步的产量为4.5g；收率，33％。
ATX-84：步骤7
Figure GDA0002984631940000812
在氮气氛下，以10分钟的间隔，向冷却至0℃以下的有溶于DCM(300ml)的20g 6-溴己酸(1当量)的溶液中相继加入29.3g EDC.HCl(1.5当量)、42.8ml Et3N(3当量)和1.2gDMAP(0.1当量)。使用另外的漏斗向该所得溶液中加入溶于100ml DCM的14.5g(Z)-壬-2-烯-1-醇(1当量)，并在氮气氛下于室温搅拌24小时。
通过TLC(10％EtOAc的己烷溶液；Rf：0.7)监测反应进程。用水(200ml)猝灭反应物料，然后分离有机层。用DCM(2×100ml)洗涤水层。在减压下浓缩合并的有机层。将所得粗品用饱和NaHCO3溶液(150ml)洗涤，然后用EtOAc(2×150ml)萃取。分离有机层，经无水Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。
使用4％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(60-120目硅胶)。回收醇原料。产量，18.0g；收率，55％。
ATX-84：步骤8
Figure GDA0002984631940000821
向4.5g十六烷-7-基6-氨基己酸酯(中间体6，1当量)和4.5g(Z)-壬-2-烯-1-基6-溴己酸酯(中间体7，1当量)的90ml ACN溶液中加入2.7g碳酸钾(1.4当量)，并将所得混合物在氮气氛下于90℃回流4小时。
通过TLC(10％MeOH的CHCl3溶液；Rf：0.5)监测反应进程。将反应物料过滤、用ACN(2×20ml)洗涤，并且将滤液在减压下浓缩。
使用20％EtOAc/己烷对粗化合物进行柱层析(100-200目硅胶)。回收原料。产量，3.0g；收率，37％。
ATX-84：步骤9
Figure GDA0002984631940000831
在氮气氛下于0℃以5分钟的间隔，向有溶于30ml干燥DCM的2.5g(Z)-壬-2-烯-1-基6-((6-氧代-6-(十三烷-7-基氧基)己基)氨基)己酸酯(1当量)的溶液中加入1.8ml三甲胺(3当量)和672mg三光气(0.5当量)。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌1小时。将所得反应物料在减压下浓缩，并且保持在氮气氛下。
761mg氢化钠在干燥THF(50ml)中悬浮液，于2颈250ml圆底烧瓶中，在氮气氛下于0℃搅拌，向该溶液中加入2.2g 2-(二甲氨基)乙烷-1-硫醇盐酸盐(3.5当量)，并在氮气氛下持续搅拌5分钟。向所得溶液中，通过注射器缓慢加入溶于THF(60ml)的上述碳酰氯约10分钟。将所得溶液在氮气氛下于室温搅拌过夜。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.5；PMA显色)监测反应进程。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(60ml)猝灭，然后加入EtOAc(130ml)。分离有机层，并且用EtOAc(3×40ml)洗涤水层。浓缩合并的有机层，并且将所得粗产物进行柱层析。
使用硅胶(100-200目)进行第一次纯化。将4.6g粗化合物吸附在10.0g硅胶上，并倒入放在柱中的90.0g硅胶上。以50％EtOAc/己烷洗脱化合物。使用中性氧化铝和HPLC级溶剂进行第二次纯化。将2.0g粗化合物吸附在6.0g中性氧化铝上，并将所得物倒入放在柱中的40.0g中性氧化铝上。以20％EtOAc/己烷洗脱化合物。产量，1.2g；收率，38％(300mg混合物)。
ATX-84/RL-47C：1H-NMR(PPM,500MHz,CDCl3):δ＝5.64(m,1),5.52(m,1),4.86(m,1),4.62(d,J＝7.0,2),3.22-3.35(4),3.01(t,J＝7.0,2),2.53(t,J＝7.0,2),2.25-2.34(4),2.27(s,6),2.10(m,2),1.45-1-73(10),1.20-1.40(30),00.84-0.91(9)。
实例12：ATX-61的合成
图10示出了如下进一步描述的ATX-61(RL-42D)的合成途径
ATX-61：步骤1
Figure GDA0002984631940000841
将12g甘氨酸酯(1当量)溶于THF(100ml)中并冷却至0℃以下。通过另外的漏斗向该溶液中相继加入24.2ml三乙胺(1.5当量)和38.11gBoc酸酐(1.5当量)。
通过TLC使用50％EtOAc/己烷；Rf：0.4监测反应进程。
用水猝灭反应物料，16h后加入EtOAc(100ml)。分离有机层，用EtOAc(2×40ml)洗涤水层，并且将合并的有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。
将粗产物用60-120硅胶(25％EtOAc/己烷)处理。产量，20.8；收率，88％。
ATX-61：步骤2
Figure GDA0002984631940000842
向有溶于THF(130ml)的18.9g N-Boc甘氨酸酯(1当量)的溶液中加入5.85g LiOH(1.5当量)的水溶液，并将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(60％EtOAc/己烷；Rf：0.3)监测反应，不存在SM。
浓缩反应物料，将粗物料用5％HCl(pH 3)猝灭，然后用EtOAc(4×80ml)萃取，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩得到化合物。产量，15g；收率，92％；通过质谱进行确认。
ATX-61：步骤3
Figure GDA0002984631940000851
向冷却至0℃以下的有溶于DCM(30ml)的5g N-Boc-甘氨酸酯(中间体1，1当量)的溶液中加入4.5ml Et3N(1.2当量)和6.44g EDC.HCl(1.2当量)。向该反应溶液中加入5.12g七庚-9-醇(0.7当量)的20ml DCM溶液并在室温下搅拌过夜。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.6)观察到原料不存在。用饱和NaHCO3溶液稀释反应物料，分离有机层，用DCM(2×30ml)洗涤水层，以及经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。用粗品(6.8g；产物和醇的混合物)进行下一步。
ATX-61：步骤4
Figure GDA0002984631940000852
将4g十七烷-9-基(叔丁氧基羰基)甘氨酸盐(中间体2，1当量)溶于DCM(40ml)中并冷却至0℃，加入7.4ml TFA(10当量)并在室温下搅拌1小时。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.5)在2小时内检查反应完成。
在减压下浓缩反应物料，将残余物料用饱和碳酸氢钠溶液(30ml)洗涤并用EtOAc(3×30ml)萃取，将有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩，得到中间体3。
使用1-3％MeOH/CHCl3和2mL Et3N对粗产物进行柱层析(硅胶，60-120)。产量，1g；通过1H NMR和质谱进行确认。
ATX-61：步骤5
Figure GDA0002984631940000861
向冷却至0℃以下的有溶于DCM(35ml)的4g溴乙酸(1当量)的溶液中加入4.7mlEt3N(1.2当量)和354mg DMAP(0.1当量)，之后加入13.23g HATU(1.2当量)。向该反应溶液中加入有2.88g(Z)-壬-2-烯-1-醇(0.7当量)的20ml DCM溶液并在室温下搅拌过夜。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.7)监测反应。
用饱和NaHCO3溶液(80ml)稀释反应物料，分离有机层，用DCM(40ml)洗涤水层，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。通过硅胶(60-120)柱色谱(1.5％EtOAc/己烷)纯化残余物料。产量，4g；收率，52％。
ATX-61：步骤6
Figure GDA0002984631940000862
将1g十七烷-9-基甘氨酸盐(中间体3，1当量)溶于THF(25ml)中，加入0.5ml TEA(1.3当量)和1.08g(Z)-壬-2-烯-1-基2-溴乙酸酯衍生物(中间体4，1.3当量)，并在室温下搅拌过夜。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.4)监测反应进程。将反应混合物用水(30ml)稀释并用EtOAc(20ml×2)萃取，将合并的有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。
通过柱(硅胶；100-200)色谱(2％EtOAc/己烷)纯化残余物料。产量，700mg；收率，47％；通过质谱进行确认。
ATX-61：步骤7
Figure GDA0002984631940000871
在10分钟内分批向冷却至5℃以下的有溶于15ml DCM的700mg十七烷-9-基(Z)-(2-(壬-2-烯-1-基氧基)-2-氧代乙基)甘氨酸酯)(1当量)的溶液中加入0.4ml Et3N(3当量)，然后加入209mg三光气(0.5当量)。
通过TLC监测反应混合物的进程，反应在0.5小时内完成，将反应物料在减压下浓缩。
在氮气氛下于0℃搅拌，向423mg N,N-二甲基乙硫醇盐酸盐(3当量)溶于干燥THF(10ml)和DMF(3ml)溶液中加入144mg氢化钠(6当量)。10分钟后，通过溶解于THF(15ml)中，向该反应物料加入上述溶液。将所得溶液在室温下搅拌1小时。
1小时后，通过TLC(10％MeOH/CHCl3；Rf：0.5)观察到反应完成。
将反应物料用饱和NH4Cl溶液(20ml)猝灭，加入水(20ml)和EtOAc(30ml)。用EtOAc(2×20ml)洗涤水层，并用盐水溶液(20ml)洗涤合并的有机层。将有机层经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。
使用具有15％EtOAC/己烷的硅胶(100-200)对粗品进行柱层析，然后使用中性氧化铝和15％EtOAc/己烷，得到纯化合物。产量，520mg；收率，58％；通过1H-NMR、HPLC和质谱进行确认。
ATX-61/RL-42D：1H-NMR(PPM,400MHz,CDCl3):δ＝5.67(m,1),5.51(m,1),4.92(m,1),4.70(m,2),4.16-4.27(4),3.07(m,2),2.53(m,2),2.27(s,6),2.10(m,2),1-47-1.57(4),1.19-1.40(32),0.83-0.92(9)。
实例13：ATX-63的合成
图12示出了如下进一步描述的ATX-63(RL-42A)的合成途径。
ATX-63：步骤1
Figure GDA0002984631940000881
将12g甘氨酸酯(1当量)溶于THF(100ml)中并冷却至0℃以下。通过另外的漏斗向该溶液中相继加入24.2ml三乙胺(1.5当量)和38.11g Boc酸酐(1.5当量)。
通过TLC使用50％EtOAc/己烷；Rf：0.4监测反应进程。
用水猝灭反应物料，16小时后加入EtOAc(100ml)。分离有机层，用EtOAc(2×40ml)洗涤水层，并且将合并的有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。
将粗产物用60-120硅胶(25％EtOAc/己烷)处理。产量，20.8；收率，88％。
ATX-63：步骤2
Figure GDA0002984631940000882
向溶于THF(130ml)的18.9g N-Boc甘氨酸酯(1当量)的溶液中加入5.85g LiOH(1.5当量)的水溶液，并将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(60％EtOAc/己烷；Rf：0.3)监测反应，反应产物中不存在原料。
浓缩反应物料，将粗物料用5％HCl(pH 3)猝灭，然后用EtOAc(4×80ml)萃取，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩得到化合物。产量，15g；收率，92％；通过质谱进行确认。
ATX-63：步骤3
Figure GDA0002984631940000883
向冷却至0℃以下的有溶于DCM(50ml)的5g N-Boc-甘氨酸酯(中间体1，1当量)的溶液中加入4.5ml Et3N(1.2当量)和6.4g EDC.HCl(1.2当量)。向该反应溶液中加入有3.4g十一烷-6-醇(0.7当量)的20ml DCM溶液并在室温下搅拌过夜。
通过TLC(15％EtOAc/己烷；Rf：0.6)观察到原料不存在。用饱和NaHCO3溶液(20ml)稀释反应物料，分离有机层，用DCM(2×40ml)洗涤水层，以及经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。柱过滤后，用粗品(5.5g；产物和醇的混合物)进行下一步。
ATX-63：步骤4
Figure GDA0002984631940000891
将3.3g粗十一烷-6-基(叔丁氧基羰基)甘氨酸盐(中间体2，1当量)溶于DCM(20ml)中并冷却至0℃，加入7.6ml TFA(10当量)并在室温下搅拌1小时。
通过TLC(10％MeOH/DCM；Rf：0.5)在2小时内检查反应完成。在减压下浓缩反应物料，将残余物料用饱和碳酸氢钠溶液(50ml)洗涤并用EtOAc(3×25ml)萃取，将有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩，得到中间体3。
使用1-3％MeOH/CHCl3和2ml Et3N对粗产物进行柱层析(硅胶，60-120)。产量，1.2g；收率，40％；通过1H NMR和质谱进行确认。
ATX-63：步骤5
Figure GDA0002984631940000892
向冷却至0℃以下的有溶于DCM(35ml)的4g溴乙酸(1当量)的溶液中加入4.7mlEt3N(1.2当量)，之后加入13.23g HATU(1.2当量)和354mg DMAP(0.1当量)。向该反应溶液中加入有2.88g(Z)-壬-2-烯-1-醇(0.7当量)的20mL DCM溶液，并在室温下搅拌过夜。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.7)监测反应。
用饱和NaHCO3溶液(80ml)稀释反应物料，分离有机层，用DCM(40ml)洗涤水层，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。通过硅胶(60-120)柱色谱(1.5％EtOAc/己烷)纯化残余物料。产量，4g；收率，52％。
ATX-63：步骤6
Figure GDA0002984631940000901
将1.2g十一烷-6-基甘氨酸盐(中间体3，1当量)溶于25ml THF中，加入0.9ml TEA(1.3当量)和1.37g(Z)-壬-2-烯-1-基2-溴乙酸盐(中间体4，1当量)，并在室温下搅拌过夜。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。将反应混合物用水(30ml)稀释并用EtOAc(20ml×2)萃取，将合并的有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。
通过柱(硅胶；100-200)色谱(3％EtOAc/己烷)纯化残余物料。产量，800mg；收率，37％；通过质谱进行确认。
ATX-63：步骤7
Figure GDA0002984631940000902
在10分钟内分批向冷却至5℃以下的有溶于DCM的800mg(Z)-壬-2-烯-1-基(2-氧代-2-(十一烷-6-基氧基)乙基)甘氨酸盐(1当量)的溶液中加入0.4ml Et3N(3当量)，之后加入209mg三光气(0.5当量)。
通过TLC监测反应混合物的进程，反应在1小时内完成，将反应物料在减压下浓缩。
在氮气氛下于0℃搅拌，向423mg N,N-二甲基乙硫醇盐酸盐(3当量)溶于干燥THF和DMF(分别为10ml和5ml)的溶液中加入144mg氢化钠(6当量)。10分钟后，通过溶于THF中，向该反应物料加入上述溶液。将所得溶液在室温下搅拌1小时。
1小时后，通过TLC(70％EtOAc/己烷；Rf：0.4)观察到反应完成。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(25ml)猝灭，加入水(20ml)和EtOAc(20ml)。用EtOAc(2×20ml)洗涤水层，并用盐水溶液(20ml)洗涤合并的有机层。将有机层经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。
使用具有20％EtOAc/己烷的硅胶(100-200)对粗品进行柱层析，然后使用中性氧化铝和5％EtOAc/己烷，得到纯化合物。产量，510mg；收率，48％；通过1H-NMR、HPLC和质谱进行确认。
ATX-63/RL-42A：1H-NMR(PPM,400MHz,CDCl3):δ＝5.67(m,1),5.52(m,1),4.92(m,1),4.70(m,2),4.15-4.27(4),3.06(m,2),2.53(m,2),2.27(s,6),2.09(m,2),1.47-1.57(4),1.20-1.41(20),0.82-0.92(9)。
实例14：ATX-64的合成
图13示出了如下进一步描述的ATX-64(RL-42C)的合成途径。
ATX-64：步骤1
Figure GDA0002984631940000911
将12g甘氨酸乙酯(1当量)溶于THF(100ml)中并冷却至0℃以下。向该所得溶液中，通过另外的漏斗相继加入24.2ml三乙胺(1.5当量)和38.11g Boc酸酐(1.5当量)。
通过TLC使用50％EtOAc/己烷；Rf：0.4监测反应进程。
16小时后，用水猝灭反应物料并加入EtOAc(100ml)。分离有机层，用EtOAc(2×40ml)洗涤水层，并且将合并的有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。
将粗产物用60-120硅胶(25％EtOAc/己烷)处理。产量，20.8；收率，88％。
ATX-64：步骤2
Figure GDA0002984631940000921
向有溶于THF(130ml)的18.9g N-Boc甘氨酸酯(1当量)的溶液中加入有5.85gLiOH(1.5当量)的水溶液，并将所得溶液在室温下搅拌4小时。
通过TLC(60％EtOAc/己烷；Rf：0.3)监测反应，反应产物中不存在原料。
浓缩反应物料，将粗物质用5％HCl(pH 3)猝灭，然后用EtOAc(4×80ml)萃取，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩得到化合物。产量，15g；收率，92％；通过质谱进行确认。
ATX-64：步骤3
Figure GDA0002984631940000922
向冷却至0℃以下的有溶于DCM(50ml)的5g N-Boc-甘氨酸酯(中间体1，1当量)的溶液中加入4.5ml Et3N(1.2当量)和6.4g EDC.HCl(1.2当量)。向该反应溶液中加入有4.84g十六烷-10-醇(0.7当量)的15ml DCM溶液，并在室温下搅拌过夜。
通过TLC(15％EtOAc/己烷；Rf：0.6)观察到原料不存在。用饱和NaHCO3溶液稀释反应物料，分离有机层，用DCM(2×30ml)洗涤水层，以及经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。
柱过滤后，用粗品(5.5g；产物和醇的混合物)进行下一步。
ATX-64：步骤4
Figure GDA0002984631940000931
将3.85g粗十七烷-9-基(叔丁氧基羰基)甘氨酸盐(中间体2，1当量)溶于30ml DCM中并冷却至0℃，加入7.4ml TFA(10当量)，并在室温下搅拌1小时。
通过TLC(2 10％MeOH/DCM；Rf：0.5)在2小时内检查反应完成。
在减压下浓缩反应物料，将残余物料用饱和碳酸氢钠溶液(30ml)洗涤并用EtOAc(3×30ml)萃取，将有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩，获得中间体3。
使用1-3％MeOH/CHCl3和2mL Et3N对粗产物进行柱层析(硅胶，60-120)。产量，2.2g；通过1H NMR和质谱进行确认。
ATX-64：步骤5
Figure GDA0002984631940000932
向冷却至0℃以下的有溶于DCM(35ml)的4g溴乙酸(1当量)的溶液中加入4.7mlEt3N(1.2当量)，之后加入13.23g HATU(1.2当量)和354mg DMAP(0.1当量)。向该反应溶液中加入有2.88g(Z)-壬-2-烯-1-醇(0.7当量)的20ml DCM溶液并在室温下搅拌过夜。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.7)监测反应。
用饱和NaHCO3溶液(80ml)稀释反应物料，分离有机层，用DCM(40ml)洗涤水层，经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。
通过硅胶(60-120)柱色谱(1.5％EtOAc/己烷)纯化残余物料。产量，4g；收率，52％。
ATX-64：步骤6
Figure GDA0002984631940000941
将2.1g十六烷-8-基甘氨酸盐(中间体3，1当量)溶于50ml THF中，加入1.2ml TEA(1.3当量)和2.39g(Z)-壬-2-烯-1-基2-溴乙酸盐(中间体4，1.3当量)，并在室温下搅拌过夜。
通过TLC(10％EtOAc/己烷；Rf：0.5)监测反应进程。将反应混合物用水(30ml)稀释并用EtOAc(2×30ml)萃取，将合并的有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。
通过柱(硅胶；100-200)色谱(3％EtOAc/己烷)纯化残余物料。产量，2.2g；收率，65％；通过质谱进行确认。
ATX-64：步骤7
Figure GDA0002984631940000942
在10分钟内分批向冷却至5℃以下的有溶于15ml DCM的2.2g十七烷-9-基(Z)-(2-(壬-2-烯-1-基氧基)-2-氧代乙基)甘氨酸盐(1当量)的溶液中加入1.6ml Et3N(3当量)，之后加入678mg三光气(0.5当量)。
通过TLC监测反应混合物的进程，反应在1小时内完成，将反应物料在减压下浓缩。
在氮气氛下于0℃搅拌，向3.94g N,N-二甲基乙硫醇盐酸盐(7当量)在干燥THF和DMF(分别为35ml和15ml)中的溶液中加入672mg氢化钠(7当量)。10分钟后，通过溶于THF中，向该反应物料加入上述溶液。将所得溶液在室温下搅拌1小时。
1h后，通过TLC(70％EtOAc/己烷；Rf：0.4)观察到反应完成。将反应物料用饱和NH4Cl溶液(25ml)猝灭，加入水(20ml)和EtOAc(20ml)。用EtOAc(20ml×2)洗涤水层，并且用盐水溶液(20ml)洗涤合并的有机层。将有机层经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。
使用硅胶(100-200)，用25％EtOAc/己烷然后用中性氧化铝和15-20％EtOAc/己烷对粗品进行柱层析，得到纯化合物。产量，1.0mg；收率，40％；通过1H-NMR、HPLC和质谱进行确认。
ATX-64/RL-42C：1H-NMR(PPM,400MHz,CDCl3):δ＝5.67(m,1),5.50(m,1),4.92(m,1),4.70(t,J＝7.0,2),3.06(,m,2),2.53(m,2),2.27(s,6),1.47-1.57(4),1.17-1.40(30),0.82-0.93(9)。
实例15：pKa值
滴定脂质以测量其pKa值。结果如下表所示。
脂质 pKa
ATX_0057 6.0
ATX_0058 6.1
ATX_0061 5.1
ATX_0063 5.4
ATX_0064 5.1
ATX_0081 5.9
ATX_0082 5.8
ATX_0083 6.0
ATX_0084 6.1
ATX_0086 6.1
ATX_0087 6.1
实例16：体内EPO mRNA稳定性
测量血浆中mRNA的水平，并在注射包含不同阳离子脂质的纳米颗粒后进行比较。在注射脂质包封的小鼠epo mRNA之后，将雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)用于评估体内血浆促红细胞生成素(epo)水平。所有制剂通过尾静脉注射以0.03mg/kg和0.1mg/kg的剂量、5ml/kg的剂量体积静脉内施用。在制剂注射后6小时，经由心脏穿刺在2％异氟烷下进行终端采血。将血液收集到0.109M柠檬酸盐缓冲管中，并通过以5000rpm离心10分钟进行处理。收集血清并分析epo mRNA水平。结果示于图14中。结果显示ATX-57、ATX-81、ATX-82、ATX-83、ATX-84、ATX-85、ATX-86和ATX-87比ATX-2显著改善。
实例17：体内小鼠因子VII沉默和EPO表达
使用脂质体文库的肝脏导向的体内筛选，测试了一系列化合物，所述化合物促进肝细胞中高水平的siRNA介导的基因沉默，所述细胞包含肝实质。因子VII(凝血因子)是用于试验向肝脏递送功能性siRNA的合适靶基因。因为该因子是在肝细胞中特异性产生的，所以基因沉默表明成功递送至实质，而不是递送至网状内皮系统的细胞(例如Kupffer细胞)。此外，因子VII是可容易地在血清中测量的分泌蛋白，不需要对动物实施安乐死。通过测量蛋白质水平可容易地确定mRNA水平的沉默。这是因为蛋白质的半衰期较短(2-5小时)。用ATX-ATX-002、ATX-57和ATX-58配制具有针对因子VIII的siRNA的组合物，比较样本为磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)。将雌性C57BL/6小鼠(6-8周龄)用于FVIIsiRNA敲除(knockdown，KD)实验。
所有制剂通过尾静脉注射以0.03mg/kg和0.1mg/kg的剂量、5mg/kg的剂量体积静脉内施用。在制剂注射后48小时，经由心脏穿刺在2％异氟烷下进行终端采血。将血液收集到0.109M柠檬酸盐缓冲管中，并通过在1200G下离心10分钟进行处理。收集血浆并通过显色测定(Biophen FVII,Aniara Corporation)分析因子VII蛋白质水平。使用来自注射PBS的小鼠的样本构建标准曲线，并通过将处理组与未处理的PBS对照进行比较来确定相对的因子VII表达。结果表明，ATX-57和ATX-58在0.03和0.1mg/kg下均比ATX-002显著更有效(图15)。
在递送脂质包封的小鼠epo mRNA之后，将雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)用于评估体内epo蛋白表达。所有制剂通过尾静脉注射以0.03mg/kg和0.1mg/kg的剂量、5mL/kg的剂量体积静脉内施用。在制剂注射后6小时，经由心脏穿刺在2％异氟烷下进行终端采血。将血液收集到0.109M柠檬酸盐缓冲管中，并通过以5000rpm离心10分钟进行处理。收集血清并通过epo ELISA测定法(R&D systems)分析epo蛋白水平。使用来自注射PBS的小鼠的样本构建标准曲线，并通过将处理组与未处理的PBS对照进行比较来确定相对的因子VII表达。结果表明，在0.1mg/ml下，ATX-57纳米颗粒中epo mRNA的表达量显著高于ATX-2(图16)。

Claims (14)

1.一种式I的化合物
Figure FDA0003257363420000011
其中，
R1是10至17个碳组成的支链烷基，
R2是由9个碳组成的直链烯基，
R3由亚乙基或亚丙基组成，
R4和R5是相同或不同的，各自是甲基或乙基，
L1和L2是相同或不同的，各自是1至5个碳的直链亚烷基，以及
X1是S；
或者，式I的化合物的盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中L2是由1、3或5个碳组成的亚烷基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中L1是由2、3或5个碳组成的亚烷基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中R1由–CH((CH2)nCH3)2组成，其中n是4、5、6或7。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中n是5，并且L1是由3个碳组成的亚烷基。
6.根据权利要求4所述的化合物，其中n是6，并且L1是由3或5个碳组成的亚烷基。
7.根据权利要求4所述的化合物，其中n是7，并且L1是由2或3个碳组成的亚烷基。
8.根据权利要求1所述的化合物，其选自式ATX-43、ATX-57、ATX-58、ATX-61、ATX-63、ATX-64、ATX-81、ATX-82、ATX-83、ATX-84、ATX-86、ATX-87和ATX-88的化合物构成的组
Figure FDA0003257363420000021
Figure FDA0003257363420000031
Figure FDA0003257363420000041
9.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的化合物。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的化合物，所述化合物在脂质纳米颗粒中。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述脂质纳米颗粒还包含中性脂质和缀合脂质。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述脂质纳米颗粒包封mRNA。
13.根据权利要求10所述的药物组合物，所述药物组合物还包含编码生物活性蛋白质的mRNA。
14.根据权利要求10所述的药物组合物，所述药物组合物还包含：包含与靶细胞中mRNA同源的核苷酸序列的RNA。
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