CN117715886A - 用于rna递送的可电离阳离子脂质 - Google Patents

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阿米特·萨吉
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Abstract

本公开描述了式(I)化合物或其药学上可接受的盐：其中：R1和R2各自独立地是(CH3(CH2)m)2CH‑、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m‑1)CH、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m‑2)CH、(CH3(CH2)m)2CHCH2‑或(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m‑1)CHCH2‑，其中m是4‑11；L1和L2各自独立地不存在，是直链C1‑5亚烷基或(CH2)p‑O‑(CH2)q，其中p和q各自独立地是1‑3；R3是任选地被一个或两个甲基基团取代的直链C2‑5亚烷基；R4和R5各自独立地是H或C1‑6烷基；X是O或S；并且n是0‑2。

Description

用于RNA递送的可电离阳离子脂质
技术领域
本文的实施例总体上涉及脂质。具体地，本文的实施例涉及促进生物活性和治疗性分子的细胞内递送的新脂质和脂质组合物。
背景技术
用于靶向递送的各种基于核酸的治疗剂给基于脂质的递送媒剂带来了挑战。例如，核酸的大小和类型在结构上是不同的。实例包含用于基因疗法的DNA、质粒、小干扰核酸(siNA)和用于RNA干扰(RNAi)的微小RNA(miRNA)、反义分子、核酶、antagomir和适体。
用于包含在此类基于脂质的递送媒剂中的阳离子脂质和可电离阳离子脂质的设计和使用已显示出很大的优势。然而，当体内施用时，使用这些脂质可以有助于显著的副作用。已经观察到的一个问题包含低生物降解性和从靶组织的清除，由此产生脂质的体内积聚。另一个问题是，大量的脂质可能导致不良免疫原性效应，这可能导致受试者的不适和活性成分的治疗效果降低。与许多阳离子脂质相关的第三问题是有效递送至靶标的百分比较低，因此导致相对较低的治疗效果或低效力。最后，重要的是递送媒剂中的阳离子脂质具有特别调节的pH，使得其可以与活性物一起调配并且在施用期间保护其免受降解，但是一旦媒剂达到其目标就能够释放活性物质。因此，本领域需要开发能够满足脂质-核酸递送系统的特殊需要的新脂质。
发明内容
本公开提供了可用于基于脂质的递送核酸的如本文所描述的式(I)的脂质和用于治疗疾病的其它治疗剂。这些和其它用途对于本领域技术人员将是显而易见的。本发明技术的另外的特征和优点将在下文的说明中予以阐明，并且部分地根据描述将是显而易见的，或者可以通过主题技术的实践来了解。本主题技术的优点将通过书面描述及其实施例以及附图中特别指出的结构来实现和获得。
应当理解，上述总体描述以及以下详细描述两者均是示例性的和解释性的，并且旨在提供对本主题技术的进一步解释。
在一些实施例中，本公开提供了式I化合物或其药学上可接受的盐：
其中：R1和R2独立地是(CH3(CH2)m)2CH-、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CH、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-2)CH、(CH3(CH2)m)2CHCH2-或(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CHCH2-，其中m是4-11；L1和L2各自独立地不存在，是直链C1-5亚烷基或(CH2)p-O-(CH2)q，其中p和q各自独立地是1-3；R3是任选地被一个或两个甲基基团取代的直链C2-5亚烷基；R4和R5各自独立地是H或C1-6烷基；X是O或S；并且n是0-2。
在一些实施例中，本公开提供了一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包括多个配体，其中每个配体独立地是本文所描述的化合物，其中所述多个配体自组装以形成包括内部和外部的所述脂质纳米颗粒。
在一些实施例中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所描述的化合物或本文所描述的脂质纳米颗粒，以及药学上可接受的赋形剂。
在一些实施例中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的化合物、本文所描述的脂质纳米颗粒或本文所描述的药物组合物。
在一些实施例中，本公开提供了一种将核酸递送至有需要的受试者的方法，所述方法包括：将治疗有效量的所述核酸包封在本文所描述的脂质纳米颗粒中；以及将所述脂质纳米颗粒施用于所述受试者。
具体实施方式
I.概述
应当理解，本领域技术人员将容易根据本公开明白本发明技术的各种配置，其中通过图示的方式示出并描述本发明技术的各种配置。如将认识到的，本主题技术能够具有其它和不同的配置，并且其若干细节能够在各种其它方面进行修改，所有这些都不脱离本主题技术的范围。因此，发明内容和具体实施方式应在性质上被视为说明性的而非限制性的。
下文阐述的详细描述旨在作为对本主题技术的各种配置的描述，并且不旨在表示可以实践本主题技术的唯一配置。附图并入本文并构成详细描述的一部分。出于提供对本主题技术的透彻理解的目的，详细描述包含具体细节。然而，对于本领域的技术人员来说显而易见的是，可以在没有这些具体细节的情况下实践本主题技术。在一些实例中，以框图形式示出了众所周知的结构和组分以避免模糊本主题技术的概念。为了便于理解，相同的组分标有相同的元件编号。
II.定义
在本说明书的各个地方，本公开的化合物的取代基以组或范围公开。其具体意图是，本公开包含此类组和范围的成员的每一个单独的子组合。例如，术语“C1-6烷基”具体旨在单独地公开甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
短语“组合施用(administered in combination/combined administration)”意指在同一时间或间隔内向受试者施用两种或更多种药剂，使得每种药剂对患者的作用可以重叠。在一些实施例中，所述药剂在彼此间隔约60分钟、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟或1分钟内施用。在一些实施例中，药剂的施用间隔得足够紧密，使得实现组合(例如，协同)效果。
当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指类似于所述参考值的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”指在所述参考值的任一方向(大于或小于)上落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的一系列值，除非另有说明或从上下文另外显而易见(除非其中此类数目超过可能值的100％)。
在权利要求中，冠词如“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”可以意指一个或多个，除非指明与上下文相反或另外根据上下文是显而易见的。在组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或描述应当被视为是满足以下情况，即组成员中的一个、多于一个或全部存在于、被应用于给定的产品或方法中，或以其它方式与给定的产品或方法相关，除非指出相反或根据上下文明显不同。本公开包含组中的恰好一个成员存在于、使用于或以其它方式相关于给定的产品或过程的实施例。本公开包含其中所述基团成员中的多于一个或所有存在于、使用于或以其它方式相关于给出的产品或流程的实施例。
如本文所使用的，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基可以具有1个至20个碳原子(当本文中出现时，如“1至20”的数值范围是指给定范围内的每个整数；例如，“1个至20个碳原子”是指烷基可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等组成，至多并包含20个碳原子，但是本定义也涵盖未指定数字范围的术语“烷基”的出现。烷基还可以是具有1到9个碳原子的中等大小烷基。烷基还可以是具有1到6个碳原子的低级烷基。烷基可以命名为“C1-4烷基”或类似名称。仅以举例的方式，“C1-4烷基”指示烷基链中存在一个至四个碳原子，即，烷基链选自由以下组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包含但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
“亚烷基”是指具有所指示的碳原子数并与至少两个其它基团连接的直链或支链饱和脂肪族基团，即二价烃基。与亚烷基连接的两个部分可以与亚烷基的相同原子或不同原子连接。例如，直链亚烷基可以是-(CH2)n-的二价基团，其中n是1、2、3、4、5或6。代表性亚烷基基团包含但不限于亚甲基、乙烯、丙烯、亚异丙基、亚丁基、异丁烯、亚仲丁基、戊烯和亚己基。亚烷基基团可以是经取代的或未经取代的。
术语“低级烷基”意指在链中具有一个至六个碳的基团，该链可以是直链或支链的。合适的烷基的非限制性实例包含甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正戊基和己基。
如本文所使用的，术语“氨基”表示-N(RN1)2，其中每个RN1独立地是H、OH、NO2、N(RN2)2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、N-保护基团、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、烷芳基、环烷基、烷基环烷基、羧基烷基(例如，任选地被O-保护基团取代，如任选地经取代的芳基烷氧羰基或本文所描述的任何基团)、磺基烷基、酰基(例如，乙酰基、三氟乙酰基或本文所描述的其它酰基)、烷氧羰基烷基(例如，任选地被O-保护基团取代，如任选地经取代的芳基烷氧羰基或本文所描述的任何烷氧羰基烷基)、杂环基(例如，杂芳基)或烷基杂环基(例如，烷基杂芳基)，其中这些所述RN1基团中的每一个可以任选地被取代，如本文中对每个基团所定义的；或者两个RN1组合形成杂环基或N-保护基团，并且其中每个RN2独立地是H、烷基或芳基。本公开的氨基可以是未经取代的氨基(即，-NH2)或经取代的氨基(即，-N(R')2)。在优选实施例中，氨基是-NH2或-NHRN1，其中RN1独立地是OH、NO2、NH2、NRN2 2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、烷基、羰基烷基、磺基烷基、酰基(例如，乙酰基、三氟乙酰基或本文所描述的其它酰基)、烷氧基羰基烷基(例如，叔丁氧基羰基烷基)或芳基，并且每个RN2可以是H、C1-20烷基(例如，C1-6烷基)或C1-10芳基。
术语“阴离子脂质”意指在生理pH下带负电的脂质。这些脂质包含但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)和加入其它阴离子改性基团的中性脂质。
在一系列项目之前的短语“…的至少一个”，用术语“和”或“或”分隔任何项目，修改列表作为一个整体，而不是列表的每个成员(即，每个项目)。短语“…的至少一个”不需要选择列出的每个项目中的至少一个；相反，所述短语允许的含义包含任何一个中的至少一个，和/或项的任意组合中的至少一个，和/或每个中的至少一个。例如，短语“A、B和C中的至少一个”或“A、B或C中的至少一个”各自仅指A、仅B或仅C；A、B和C的任意组合；和/或A、B和C中的至少一个。
说明书或权利要求中使用术语“包含”、“具有”等，此类术语旨在以类似于术语“包括”的方式包含在内，因为“包括”在权利要求中在被采用时被解释为作为过渡词。
除非特别说明，否则对单数元素的引用并不意味着“一个且只有一个”，而是“一个或多个”。男性代词(例如，他的(his))包含女性和中性性别(例如，她的(her)和它的(it))，反之亦然。术语“一些”是指一个或多个。带下划线和/或斜体的标题和副标题仅为方便起见，不限制主题技术，并且不与主题技术描述的解释相关联。贯穿本公开所描述的各种配置的元件的所有结构和功能等效物，其为本领域普通技术人员已知的或以后将知晓的，均通过引用明确地并入本文并且旨在被本主题技术所涵盖。此外，本文所公开的任何内容均不旨在为公众提供，无论该公开内容是否在上述描述中明确记载。
术语“阳离子脂质”意指具有正亲水性头部基团的两亲性脂质及其盐；一个、两个、三个或更多个疏水性脂肪酸或脂肪烷基链；以及这两个结构域之间的连接器。可电离或可质子化的阳离子脂质通常在低于其pKa的pH下被质子化(即，带正电)，并且在高于所述pKa的pH下基本上是中性的。优选的可电离阳离子脂质是那些pKa小于生理pH(通常为约7.4)的脂质。本公开的阳离子脂质也可以称为可滴定的阳离子脂质。阳离子脂质可以是具有可质子化叔胺(例如，pH可滴定)头部基团的“氨基脂质”。一些氨基示例性氨基脂质可以包含C18烷基链，其中每个烷基链独立地具有0个至3个(例如，0个、1个、2个或3个)双键；以及头部基团和烷基链之间的醚、酯或缩酮键。此类阳离子脂质包含但不限于：DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA(也称为DLin-C2K-DMA、XTC2和C2K)、DLin-K-C3-DM A、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、y-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA(也称为MC2)、DLin-M-C3-DMA(也称为MC3)和(DLin-MP-DMA)(也称为1-Bl 1)。
术语“包括(comprising)”旨在是开放式的，并且允许但不需要包含另外的元素或步骤。因此，当在本文中使用术语“包括”时，还涵盖并且公开了术语“由…组成(consistingof)”。
术语“与…组合”意指在本公开的治疗方法中将本公开的脂质调配的mRNA与其它药物一起施用，意指本公开的脂质调配的mRNA和其它药物以单独的剂型顺序或同时施用，或者以相同的剂型同时施用。
术语“可商购获得的化学品”和本文所示的实例中使用的化学品可以从标准商业来源获得，其中此类来源包含，例如，阿克洛斯有机公司(Acros Organics)(宾夕法尼亚州匹兹堡(Pittsburgh,Pa.))、西格玛-奥德里奇化学公司(Sigma-Adrich Chemical)(威斯康星州密尔沃基(Milwaukee,Wis.))、阿沃卡多研究公司(Avocado Research)(英国兰开夏郡(Lancashire,U.K.))、佰能公司(Bionet)(英国康沃尔(Cornwall,U.K.))、Boron分子公司(Boron Molecular)(北卡罗来纳州三角研究园(Research Triangle Park,N.C))、Combi-Blocks公司(Combi-Blocks)(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,Calif.))、伊士曼有机化学品公司(Eastman Organic Chemicals)、伊士曼柯达公司(Eastman Kodak Company)(纽约州罗彻斯特(Rochester,N.Y.))、飞世尔科技公司(Fisher Scientific Co.)(宾夕法尼亚州匹兹堡)、Frontier科学公司(Frontier Scientific)(犹他州洛根(Logan,Utah))、ICN生物化学公司(ICN Biomedicals,Inc.)(加利福尼亚州科斯塔梅萨市(Costa Mesa,Calif.))、兰开斯特合成公司(Lancaster Synthesis)(新罕布什尔州温德姆(Windham,N.H.))、美布里奇化学公司(Maybridge Chemical Co.)(英国康沃尔)、皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.)(伊利诺伊州罗克福德市(Rockford,Ill.))、Riedel de Haen公司(Riedel de Haen)(德国汉诺威市(Hannover,Germany))、频谱质量产品公司(SpectrumQuality Product,Inc.)(新泽西州新布朗斯维克(New Brunswick,N.J.))、TCI美国公司(TCI America)(俄勒冈州波特兰(Portland,Or.))和光化学品美国公司(Wako ChemicalsUSA,Inc)(弗吉尼亚州里士满(Richmond,Va.))。
如本领域普通技术人员所知，短语“化学文献中描述的化合物”可以通过针对化合物和化学反应的参考书和数据库来鉴定。详述可用于制备本文公开的化合物的反应物的合成或向描述所述制备的本文公开的合成化合物的文章提供参考的合适的参考书和论文包含例如《合成有机化学(Synthetic Organic Chemistry)》,纽约约翰威利父子公司(JohnWiley and Sons,Inc.New York)；S.R.Sandler等人,“有机官能团制备(OrganicFunctional Group Preparations)”,第2版,纽约学术出版社(Academic Press),1983；H.O.House,《当代合成反应(Modern Synthetic Reactions)》,第2版,加利福尼亚州门洛帕克W.A.本杰明公司(W.A.Benjamin,Inc.),1972；T.L.Gilchrist,《杂环化学(HeterocyclicChemistry)》,第2版纽约约翰威利父子公司1992；J.March,“高等有机化学：反应、机理和结构(Advanced Organic Chemistry:reactions,Mechanisms and Structure)”,第5版,纽约威利国际科学出版公司(Wiley-Interscience),2001；特定和类似的反应物也可以通过美国化学学会(American Chemical Society)化学摘要服务所制备的已知化学物质的索引以及在线数据库来鉴定，这些索引可在大多数公共和大学图书馆中获得(可以联系华盛顿哥伦比亚特区(Washington,D.C.)美国化学学会获取更多细节)。可以通过定制化学合成公司来制备目录中已知但不可商购获得的化学品，其中许多标准化学品供应公司(如上文列出的那些)提供定制合成服务。
如本文使用的，药剂的术语“有效量”是足以产生有益或期望结果的量，例如临床结果，并且因此，“有效量”取决于其应用的环境。例如，在施用治疗癌症的药剂的情况下，与未施用药剂获得的反应相比，药剂的有效量例如是足以实现本文定义的癌症治疗的量。
术语“完全包封的”意指核酸-脂质颗粒中的核酸(例如，mRNA)在暴露于血清或核酸酶测定之后不会显著降解，所述核酸酶测定将显著降解游离RNA。当完全包封时，颗粒中优选地小于25％的核酸在通常降解100％的游离核酸、更优选地小于10％、并且最优选地小于5％的核酸的处理中降解。“完全包封的”还意指核酸-脂质颗粒在体内施用时不会快速分解成其组分部分。
术语“化合物”旨在包含所描绘结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。
术语“递送”是指递送化合物、物质、实体、部分、货物或有效载荷的行为或方式。
术语“特征”是指特征、特性或独特元件。
如本文所使用的，术语“片段”是指一部分。例如，蛋白质片段可以包括通过消化从培养的细胞分离的全长蛋白质获得的多肽。
术语“疏水性脂质”意指具有非极性基团的化合物，所述非极性基团包含但不限于长链饱和和不饱和脂肪族烃基以及任选地被一个或多个芳香族、环脂族或杂环基取代的此类基团。合适的实例包含但不限于二酰基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1,2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1,2-二烷基-3-氨基丙烷。
术语“脂质”意指有机化合物，其包括脂肪酸酯并且特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。脂质通常分为至少三类：(1)“简单脂质”，其包含脂肪和油以及蜡；(2)“化合物脂质”，其包含磷脂和糖脂；以及(3)“衍生脂质”，如类固醇。
术语“脂质递送媒剂”意指脂质调配物，所述脂质调配物可以用于将治疗性核酸(例如，mRNA)递送到所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。脂质递送媒剂可以是核酸-脂质颗粒，其可以由阳离子脂质、非阳离子脂质(例如，磷脂)、防止颗粒聚集的缀合脂质(例如，PEG-脂质)和任选地胆固醇形成。通常，治疗性核酸(例如，mRNA)可以包封在颗粒的脂质部分中，从而保护其免受酶降解。
术语“包封的脂质”意指脂质颗粒，其提供治疗性核酸，如具有完全包封、部分包封或两者的mRNA。在优选实施例中，核酸(例如，mRNA)完全包封在脂质颗粒中。
术语“两亲性脂质(amphipathic lipid/amphiphilic lipid)”意指脂质材料的疏水性部分定向成疏水相而亲水性部分朝向水相的材料。亲水特性来源于极性或带电基团的存在，如碳水化合物、磷酸盐、羰基、硫酸根合、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团。疏水性可以通过包含极性基团来赋予，所述极性基团包含但不限于长链饱和和不饱和脂肪族烃基以及被一个或多个(多个)芳香族、脂环族或杂环基基团取代的此类基团。两亲性化合物的实例包含但不限于磷脂、氨基脂质和鞘脂。
术语“接头”或“连接部分”是指原子基团，例如10个至100个原子，并且可以由一个或多个原子或基团构成，如但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺。接头可以具有足以不干扰掺入氨基酸序列中的长度。可以掺入接头中的化学基团的实例包含但不限于烷基、烯基、炔基、酰胺基、氨基、醚、硫醚、酯、烷基、杂烷基、芳基或杂环基，其各自可任选地被取代，如本文所述。接头的实例包含但不限于：不饱和烷烃、聚乙二醇(例如，乙烯或丙二醇单体单元，例如，二乙二醇、二丙二醇、三乙二醇、三丙二醇、四乙二醇或四乙二醇)和葡聚糖聚合物。其它示例包含但不限于：所述接头内的可切割部分，例如，二硫键(—S—S—)或偶氮键(—N═N—)，其可以使用还原剂或光解切割。选择性可切割键的非限制性实例包含酰胺键，其可以例如通过使用三(2-羰基乙基)膦(TCEP)或其它还原剂和/或光解切割，以及酯键，其可以例如通过酸性或碱性水解切割。
术语“哺乳动物”意指人或其它哺乳动物或意指人。
术语“信使RNA”(mRNA)是指编码所关注的蛋白质或多肽并且能够被翻译以在体外、体内、原位或离体产生所关注的编码的蛋白质或多肽的任何多核苷酸。
术语“经修饰的”是指本公开的分子的改变状态或结构。可以以许多方式，包含化学上、结构上、和/或功能上对分子进行修饰。在一个实施例中，核酸活性成分通过引入非天然核苷和/或核苷酸来修饰，例如，因为其涉及天然核糖核苷酸A、U、G和C。非规范核苷酸如帽结构不被视为“经修饰的”，但其可以不同于A、C、G、U核糖核苷酸的化学结构。
术语“天然存在的”意指在没有人为帮助的情况下存在于自然界。
术语“非人脊椎动物”包含除智人之外的所有脊椎动物，包含野生型和驯养物种。非人脊椎动物的实例包含但不限于哺乳动物，如羊驼、白臂野牛、野牛、骆驼、猫、牛、鹿、狗、驴、大额牛、山羊、豚鼠、马、美洲驼、骡子、猪、兔、驯鹿、绵羊、水牛和牦牛。
术语“患者”是指可能寻求或需要治疗、需要治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或由训练有素的专业人员护理特定疾病或病状的受试者。
短语“任选地经取代的X”(例如，任选地经取代的烷基)旨在等同于“X，其中X是任选地经取代的”(例如，“烷基，其中所述烷基是任选地经取代的”)。这并不意味着特征“X”(例如烷基)本身是任选的。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏性应答或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所使用的，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物之外的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒剂)并且具有对患者基本上无毒和无炎症的性质。赋形剂可以包含例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(着色剂)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包含但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二元)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羰基乙酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、硬脂酸、蔗糖、滑石粉、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
短语“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过将现存的酸或碱部分转化为其盐形式(例如，通过使游离碱基与合适的有机酸反应)而对母体化合物进行修饰。药学上可接受的盐的实例包含但不限于：如胺等碱性残基的矿物盐或有机酸盐；如羧酸等酸性残基的碱盐或有机盐；等等。代表性的酸加成盐包含：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包含钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包含但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包含例如由无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，优选非水性介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。适合的盐的列表可以见于以下：《雷明顿药物科学》,第17版,宾夕法尼亚州伊斯顿市的马克出版公司,1985,第1418页,《药用盐：性质、选择和用途(Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,andUse)》,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编辑),Wiley-VCH出版社(Wiley-VCH),2008；以及B等人,《药物科学杂志(Journal of Pharmaceutical Science)》,66,1-19(1977)，所述文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。
术语“药代动力学”是指分子或化合物的任何一种或多种性质，因为其涉及施用于活生物体的物质的命运的确定。药代动力学被分成若干领域，包含吸收、分布、代谢和排泄的程度和速率。这通常被称为ADME，其中：(A)吸收是物质进入血液循环的过程；(D)分布是物质在整个身体的流体和组织中的分散或分布；(M)代谢(或生物转化)是母体化合物不可逆地转化为子代谢物；以及(E)排泄(或消除)是指物质从身体中消除。在罕见情况下，一些药物不可逆地累积在身体组织中。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的溶剂化物”意指本公开的化合物，其中合适的溶剂分子并入晶格中。合适的溶剂在所施用的剂量下是生理学上可耐受的。例如，溶剂化物可以通过从包含有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀来制备。合适的溶剂的实例是乙醇、水(例如，单水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N'-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苄醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂化物被称为“水合物”。
术语“物理化学”意指物理和/或化学性质或与物理和/或化学性质有关。
术语“磷酸酯”以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包含其质子化形式，例如
如本文所使用的，术语“单磷酸”、“二磷酸”和“三磷酸”以本领域技术人员所理解的其普通含义使用，并且包含质子化形式。
术语“预防”是指部分或完全延迟感染、疾病、病症和/或病状的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟感染、特定疾病、病症和/或病状的进展；和/或降低发展与感染、疾病、病症和/或病状相关的病理学的风险。
术语“RNA”意指包括至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”意指在β-D-核糖-呋喃糖部分的2'位置处具有羟基的核苷酸。术语包含双链RNA、单链RNA、分离的RNA，如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及改变的RNA，所述RNA通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同。此类改变可以包含添加非核苷酸材料，如添加到干扰RNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。本公开的RNA分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称作类似物或天然存在的RNA的类似物。如本文所使用的，术语“核糖核酸”和“RNA”是指含有至少一个核糖核苷酸残基的分子，包含siRNA、反义RNA、单链RNA、微小RNA、mRNA、非编码RNA和多价RNA。
术语“样品”或“生物样品”是指其组织、细胞或组分部分(例如，体液，包含但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)的子集。样品可以进一步包含由整个生物体或其组织、细胞或组分部分的子集或其级分或部分制备的均质物、裂解物或提取物，包含但不限于例如，血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤的外部切片、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官。样品进一步指可以含有细胞组分如蛋白质或核酸分子的培养基，如营养肉汤或凝胶。
术语“显著的”或“显著地”与术语“基本上”同义使用。
短语“单个单位剂量”是以一个剂量/一次/单个途径/单个接触点即单一施用事件施用的任何治疗剂的剂量。
术语“siRNA”或小干扰RNA，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是指一类双链RNA非编码RNA分子，长度通常为18个至27个碱基对，类似于miRNA，并且在RNA干扰(RNAi)途径内操作。siRNA通过在转录后降解mRNA来干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达，由此阻止翻译。
术语“溶剂化物”意指本公开的化合物与一种或多种溶剂分子的物理缔合。这种物理结合涉及不同程度的离子键合，包含氢键合。在某些情况下，溶剂化物将能够例如当一种或多种溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时分离。“溶剂化物”涵盖溶液相和可分离的溶剂化物两者。合适的溶剂化物的非限制性实例包含乙醇盐、甲醇盐等。
术语“分剂量”是将单个单位剂量或总日剂量分成两个或更多个剂量。
术语“稳定”是指足够稳健以经受来自反应混合物的可用纯度程度的隔离并且优选地能够调配成有效治疗剂的化合物。
术语“稳定”、“稳定化的”、“稳定区域”意指使或变得稳定。
术语“经取代的”意指用除氢以外的指定基团或用一个或多个基团、部分或自由基取代，所述基团、部分或自由基可以相同或不同，其中每个基团例如独立地选择。
术语“基本上”是指表现出所关注的特征或性质的全部或接近全部的范围或程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行至完成或达到或避免绝对结果。术语“基本上”因此在本文中用于捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在的完全性缺失。
短语“基本上相等”涉及剂量之间的时间差，术语意指加/减2％。
短语“基本上同时”涉及多个剂量，术语意指在2秒内。
短语“患有”涉及“患有”疾病、病症和/或病状的个体已经被诊断为患有或表现出疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。
短语“易感”涉及“易感”疾病、病症和/或病状尚未被诊断患有疾病、病症和/或病状和/或可能未表现出疾病、病症和/或病状的症状但具有发展疾病或其症状的倾向的个体。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状(例如，癌症)的个体可以通过以下中的一种或多种来表征：(1)与疾病、病症和/或病状的发展相关联的基因突变；(2)与疾病、病症和/或病状的发展相关联的基因多态性；(3)与疾病、病症和/或病状相关联的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性增加和/或降低；(4)与疾病、病症和/或病状的发展相关联的习惯和/或生活方式；(5)疾病、病症和/或病状的家族史；以及(6)暴露于和/或感染有与疾病、病症和/或病状的发展相关联的微生物。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体将患上疾病、病症和/或病状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体将不会患上疾病、病症和/或病状。
术语“合成”意指由人工生产、制备和/或制造。本公开的多核苷酸或多肽或其它分子的合成可以是化学的或酶的。
术语“治疗剂”是指在施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发期望的生物作用和/或药理作用的任何药剂。
术语“治疗有效量”意指当施用于患有或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者时足以治疗、改善感染、疾病、病症和/或病状的症状、诊断、预防和/或延迟感染、疾病、病症和/或病状的发作的待递送药剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量。
术语“治疗有效结果”意指在患有或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者中足以治疗、改善感染、疾病、病症和/或病状的症状、诊断、预防和/或延迟感染、疾病、病症和/或病状的发作的结果。
术语“总日剂量”是在24小时时间段内给予或规定的量。其可以作为单个单位剂量施用。
术语“治疗”是指特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的部分或完全缓解、改善(ameliorating)、改善(improving)、减轻、延缓发作、抑制进展、降低严重程度和/或降低发病率。例如，“治疗”癌症可以指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。出于降低发展与疾病、病症和/或状况相关的病理的风险的目的，可以将治疗施用于未展现出疾病、病症和/或病状的迹象的受试者和/或仅展现出疾病、病症和/或病状的早期迹象的受试者。
术语“未经修饰的”是指以任何方式改变之前的任何物质、化合物或分子。未经修饰的可以但并不总是指生物分子的野生型或天然形式。分子可以经历一系列修饰，由此每个经修饰的分子可以充当用于后续修饰的“未经修饰的”起始分子。
本文所描述的化合物可以是不对称的(例如，具有一个或多个立体中心)。除非另外指示，否则意指所有立体异构体(如对映异构体和非对映异构体)。含有不对称取代的碳原子的本公开的化合物可以以光学活性形式或外消旋形式被分离。关于如何由光学活性起始材料制备光学活性形式的方法在本领域是已知的，如通过外消旋混合物拆分或通过对映选择性和/或立体选择性合成。烯烃的许多几何异构体、C═N双键等也可以存在于本文所描述的化合物中，并且在本公开中考虑了所有此类稳定的异构体。描述了本公开的化合物的顺式和反式几何异构体，并且可以将其分离为异构体的混合物或单独的异构体形式。
本公开的化合物还包含互变异构形式。互变异构形式起因于单键与相邻双键的交换和质子的伴随迁移。互变异构形式包含质子移变互变异构体，它们是具有相同经验式和总电荷的同分异构质子化态。示例质子互变异构体包含酮-烯醇对、酰胺-亚氨酸对、内酰胺-内酰亚胺对、烯胺-亚胺对以及质子可以占据杂环系统的两个或更多个位置的环状形式，如1H-和3H-咪唑、1H-、2H-和4H-1,2,4-三唑、1H-和2H-异吲哚以及1H-和2H-吡唑。互变异构体形式可以处于平衡状态，或者通过适当的取代，在空间上锁定为一种形式。
本公开的化合物还包含存在于中间体或最终化合物中的原子的所有同位素。“同位素”是指原子序数相同但质量数不同的原子，由原子核中不同数量的中子引起。例如，氢的同位素包含氚和氘。
本公开的化合物和盐可以通过常规方法与溶剂或水分子组合以形成溶剂化物和水合物。
术语“半衰期”是如核酸或蛋白质的浓度或活性的量下降到在一个时间段开始时测量的其值的一半所需的时间。
术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在培养皿中等而不是在生物体(例如，动物、植物或微生物)内发生的事件。
术语“体内”是指在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
术语“单体”是指可以与相同或不同类型的另一种分子连接以形成低聚物的单个单元，例如单个核酸。在一些实施例中，单体可以是解锁核酸，即UNA单体。
术语“中性脂质”意指在选定的pH下以不带电或中性两性离子形式存在的脂质物种。在生理pH下，此类脂质包含例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
术语“非阳离子脂质”意指两亲性脂质或中性脂质或阴离子脂质，并且在本文中描述。
术语“受试者”或“患者”是指可以施用根据本公开的组合物的任何生物体，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包含动物(例如，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人等哺乳动物)和/或植物。
术语“可翻译”可以与术语“可表达”可互换地使用并且是指多核苷酸或其一部分能够被宿主细胞转化为多肽。如本领域所理解的，翻译是细胞的细胞质中的核糖体产生多肽的过程。在翻译中，由核糖体复合物中的tRNA对信使RNA(mRNA)进行解码以产生特异性氨基酸链或多肽。此外，当在本说明书中关于低聚物使用时，术语“翻译”意指低聚物的至少一部分，例如，低聚物序列的编码区(也称为编码序列或CDS)能够转化为蛋白质或其片段。
治疗有效结果：如本文所使用的，术语“治疗有效结果”意指在患有或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者中足以治疗、改善感染、疾病、病症和/或病状的症状、诊断、预防和/或延迟感染、疾病、病症和/或病状的发作的结果。
术语“单位剂量”是指包括预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常可以等于将被施用于受试者的活性成分的剂量和/或此类剂量的合宜部分包含但不限于此类剂量的一半或三分之一。
虽然已经关于某些实施例描述了本公开，并且出于说明的目的阐述了许多细节，但对于本领域技术人员将显而易见的是，本公开包含另外的实施例，并且在不脱离本公开的情况下，本文所述的一些细节可以显著变化。本公开包含此类另外的实施例、修饰和等效物。特别地，本公开包含各种说明性组分和实例的特征、术语或元件的任何组合。
III.化合物
在一些实施例中，本公开提供了式I化合物或其药学上可接受的盐：
其中：R1和R2独立地是(CH3(CH2)m)2CH-、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CH、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-2)CH、(CH3(CH2)m)2CHCH2-或(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CHCH2-，其中m是4-11；L1和L2各自独立地不存在，是直链C1-5亚烷基或(CH2)p-O-(CH2)q，其中p和q各自独立地是1-3；R3是任选地被一个或两个甲基基团取代的直链C2-5亚烷基；R4和R5各自独立地是H或C1-6烷基；X是O或S；并且n是0-2。
在一些实施例中，R1和R2各自独立地是(CH3(CH2)m)2CH-、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CH、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-2)CH、(CH3(CH2)m)2CHCH2-或(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CHCH2-。在一些实施例中，R1和R2各自独立地是(CH3(CH2)m)2CH-、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CH、(CH3(CH2)m)2CHCH2-或(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CHCH2-。在一些实施例中，R1和R2各自独立地选自(CH3(CH2)m)2CH-和(CH3(CH2)m)2CHCH2-。在一些实施例中，R1和R2各自独立地是(CH3(CH2)m)2CH-。在一些实施例中，R1和R2各自独立地是(CH3(CH2)m)2CHCH2-。在一些实施例中，R1和R2各自独立地选自(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CH、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-2)CH和(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CHCH2-。在一些实施例中，R1是(CH3(CH2)m)2CH-或(CH3(CH2)m)2CHCH2-，并且R2选自(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CH、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-2)CH和(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CHCH2-。
在一些实施例中，m是4至11。在一些实施例中，m是4至9。在一些实施例中，m是4至8。在一些实施例中，m是5至7。在一些实施例中，m是5。在一些实施例中，m是6。在一些实施例中，m是7。
在一些实施例中，L1和L2各自独立地不存在，是直链C1-5亚烷基或(CH2)p-O-(CH2)q。在一些实施例中，L1和L2各自独立地是C1-5亚烷基或(CH2)p-O-(CH2)q。在一些实施例中，L1和L2各自独立地是C2-5亚烷基或(CH2)p-O-(CH2)q。在一些实施例中，L1和L2各自独立地是C2-5亚烷基。在一些实施例中，L1和L2各自独立地是丙烯。在一些实施例中，L1和L2各自独立地是C2-5亚烷基。在一些实施例中，L1和L2各自独立地是(CH2)p-O-(CH2)q。在一些实施例中，L1和L2各自独立地不存在。
在一些实施例中，p和q各自独立地是1-3。在一些实施例中，p和q各自独立地是1-2。在一些实施例中，p和q各自独立地是1。在一些实施例中，p和q各自独立地是2。在一些实施例中，p和q各自独立地是3。
在一些实施例中，R3是任选地被一个或两个甲基基团取代的直链C2-5亚烷基。在一些实施例中，R3是直链C2-5亚烷基。在一些实施例中，R3是C3-5亚烷基。在一些实施例中，R3是C1-3亚烷基。在一些实施例中，R3是丙烯。
在一些实施例中，R4和R5各自独立地是H或C1-6烷基。在一些实施例中，R4和R5各自独立地是C1-6烷基。在一些实施例中，R4和R5各自独立地是C1-3烷基。在一些实施例中，R4和R5各自独立地是甲基。在一些实施例中，R4和R5各自独立地是H。
在一些实施例中，X是O或S。在一些实施例中，X是O。在一些实施例中，X是S。
在一些实施例中，n是0-2。在一些实施例中，n是0-1。在一些实施例中，n是0。在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是2。
在一些实施例中，所述化合物选自由以下组成的组：
/>
/>
以及
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述化合物是ATX-193。在一些实施例中，所述化合物是ATX-200。在一些实施例中，所述化合物是ATX-201。在一些实施例中，所述化合物是ATX-202。在一些实施例中，所述化合物是ATX-209。在一些实施例中，所述化合物是ATX-210。在一些实施例中，所述化合物是ATX-230。在一些实施例中，所述化合物是ATX-231。在一些实施例中，所述化合物是ATX-232。
在一些实施例中，本发明提供了一种脂质组合物，所述脂质组合物包括核酸和本发明的化合物。在一些实施例中，所述核酸选自siRNA、mRNA、自我复制RNA、DNA质粒和反义寡核苷酸。在一些实施例中，所述核酸是包括编码所关注的治疗性蛋白的编码区的mRNA或自我复制RNA。在一些实施例中，所述所关注的治疗性蛋白是酶和抗体、抗原、受体或转运蛋白。在一些实施例中，所述所关注的治疗性蛋白是基因编辑酶。在一些实施例中，所述基因编辑酶选自TALEN、CRISPR、大范围核酸酶或锌指核酸酶。在一些实施例中，所述脂质组合物包括脂质体、脂质体复合物或脂质纳米颗粒。
IV.脂质调配物和纳米颗粒
基于脂质的调配物
基于核酸向靶细胞的细胞内递送的疗法面临细胞外和细胞内屏障两者。事实上，裸核酸材料由于其毒性、在血清中的低稳定性、快速肾脏清除、靶细胞摄取减少、吞噬细胞摄取及其激活免疫反应的能力而不能容易地全身施用，所有这些特征都阻碍了其临床发展。当外源性核酸材料(例如，mRNA)进入人类生物系统时，其被网状内皮系统(RES)识别为外来病原体，并在有机会遇到血管系统内或外的靶细胞之前从血液循环中清除。据报道，裸核酸在血流中的半衰期大约为若干分钟(Kawabata K,Takakura Y,Hashida M《药学研究(Pharm Res.)》1995年6月；12(6):825-30)。化学修饰和适当的递送方法可以减少RES的摄取，并保护核酸不被普遍存在的核酸酶降解，这提高了基于核酸的疗法的稳定性和功效。此外，RNA或DNA是不利于细胞摄取的阴离子亲水性聚合物，其在表面也是阴离子的。因此，基于核酸的疗法的成功在很大程度上取决于媒剂或载体的开发，所述媒剂或载体可以高效地将遗传物质递送到靶细胞，并在体内获得足够水平的表达和最小的毒性。
此外，在内化到靶细胞中时，核酸递送载体受到细胞内屏障的挑战，包含内体包埋、溶酶体降解、核酸从载体上拆包、跨核膜的易位(对于DNA)和在细胞质处释放(对于RNA)。因此，成功的基于核酸的疗法取决于载体将核酸递送到细胞内的靶位点以获得足够水平的所需活性(如基因表达)的能力。
虽然若干种基因疗法已经能够成功利用病毒递送载体(例如，AAV)，但基于脂质的调配物由于其生物相容性和易于大规模生产而越来越被认为是RNA和其它核酸化合物最有前途的递送系统之一。基于脂质的核酸疗法最重要的进展之一发生在2018年8月，当时Patisiran(ALN-TTR02)是美国食品药品监督管理局(FDA)和欧盟委员会(EC)批准的第一种siRNA治疗剂。ALN-TTR02是基于所谓的稳定核酸脂质颗粒(SNALP)转染技术的siRNA调配物。尽管Patisiran取得了成功，但通过脂质调配物递送核酸治疗剂(包含mRNA)仍在发展中。由于COVID-19大流行，脂质递送媒剂中mRNA的使用迅速上升到突出，其中递送编码COVID-19的刺突蛋白的mRNA的几种疫苗显示出强大的保护能力。此类基于脂质的mRNA疫苗包含已在世界各地获得紧急使用授权的辉瑞和德国生物新技术公司(Pfizer andBioNtech)的BNT162b2和莫德纳公司(Moderna)的mRNA-1273。
根据各个实施例，一些本领域公认的用于核酸治疗剂的脂质调配的递送媒剂包含基于聚合物的载剂，如聚乙烯亚胺(PEI)；脂质纳米颗粒和脂质体；纳米脂质体；含神经酰胺纳米脂质体；多囊泡脂质体；蛋白脂质体；天然和合成源性的外泌体两者；天然、合成和半合成板层体；纳米颗粒；胶束；和乳液。这些脂质调配物的结构和组成可以变化，并且正如在快速发展的领域中可以预期的那样，本领域中已经使用了若干个不同的术语来描述单一类型的递送媒剂。与此同时，在整个科学文献中，脂质调配物的术语在其预期含义方面各不相同，并且这种不一致的使用导致了对脂质调配物的几个术语的确切含义的混淆。出于本公开的目的，在若干种潜在的脂质调配物中，脂质体、阳离子脂质体和脂质纳米颗粒在本文中被特异性地详细描述和定义。
脂质体
传统脂质体是由至少一个双层和内部含水性隔室组成的囊泡。脂质体的双层膜通常由两亲性分子形成，如包含空间上分开的亲水性和疏水性结构域的合成或天然来源的脂质(Lasic,《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性物质(例如，聚合物囊泡、类脂质体等)形成。脂质体通常呈现为球形囊泡，并且大小范围为20nm至几微米。脂质体调配物可以制备为胶体分散体，或其可以冻干以降低稳定性风险并改善基于脂质体的药物的保质期。制备脂质体组合物的方法是本领域已知的，并且在普通技术人员的技术范围内。
只有一个双层的脂质体被称为单层的，并且具有一个以上双层的脂质体被称为多层的。最常见的脂质体类型是小的单层囊泡(SUV)、大的单层囊泡(LUV)和多层囊泡(MLV)。与脂质体相反，溶酶体、胶束和反胶束由脂质的单层构成。通常，脂质体被认为具有单个内部隔室，然而，一些调配物可以是多囊泡脂质体(MVL)，其由由若干个非中心脂质双层分隔的许多不连续的内部水性隔室组成。
因为脂质体基本上是生物膜的类似物且可以由天然和合成的磷脂制备，所以脂质体因其优越的生物相容性而长期以来被视为药物递送媒剂(《国际纳米医学杂志(Int.J.Nanomedicine.)》2014；9:1833-1843)。在用作药物递送媒剂时，由于脂质体具有被疏水性膜包围的水溶液核心，溶解在所述核心中的亲水性溶质不能轻易穿过双层，并且疏水性化合物将与所述双层结合。因此，脂质体可以负载疏水性和/或亲水性分子。当脂质体用于携带核酸如RNA时，所述核酸以水相形式包含在脂质体隔室中。
阳离子脂质体
脂质体可以由阳离子、阴离子和/或中性脂质构成。作为脂质体的一个重要亚类，阳离子脂质体是全部或部分由带正电的脂质制备的脂质体，或者更具体地说，是包括阳离子基团和亲脂性部分两者的脂质。除了上述脂质体的一般特征外，阳离子脂质体中使用的阳离子脂质的带正电荷部分提供了若干个优点和一些独特的结构特征。例如，阳离子脂质的亲脂性部分是疏水性的，并且因此将其自身引导远离脂质体的含水内部，并与其它非极性和疏水性物质缔合。相反，阳离子部分将与水性介质缔合，并且更重要的是与极性分子和物种缔合，所述阳离子部分可以与其在阳离子脂质体的水性内部络合。由于这些原因，阳离子脂质体越来越多地被研究用于基因疗法，因为其通过静电相互作用对带负电的核酸有利，从而产生具有生物相容性、低毒性和体内临床应用所需大规模生产的可能性的复合物。下文列出了适用于阳离子脂质体的阳离子脂质。
脂质纳米颗粒
与脂质体和阳离子脂质体相比，脂质纳米颗粒(LNP)具有包含将化合物包封在固相中的单一单层或双层脂质的结构。因此，与脂质体不同，脂质纳米颗粒在其内部不具有水相或其它液相，而是来自双层或单层外壳的脂质直接与内部化合物络合，从而将其包封在固体核心中。脂质纳米颗粒通常是具有相对均匀分散的形状和大小的球形囊泡。虽然来源因脂质颗粒的大小可以作为脂质纳米颗粒而不同，但在脂质纳米颗粒的直径可以在10nm至1000nm的范围内这一点上存在一些重叠。然而，更常见的是，其被认为小于120nm或甚至100nm。
对于脂质纳米颗粒核酸递送系统，脂质壳可以调配成包含可电离阳离子脂质，其可以与核酸核心的带负电荷的主链络合并缔合。表观pKa值低于约7的可电离阳离子脂质具有提供阳离子脂质用于与核酸的带负电荷的主链络合并在低于可电离脂质的pKa的pH值下装载到脂质纳米颗粒中的益处，其中所述可电离脂质带正电荷。然后，在生理pH值下，脂质纳米颗粒可以采用相对中性的外部，从而允许在静脉施用后显著增加所述颗粒的循环半衰期。在核酸递送的上下文中，脂质纳米颗粒与其它基于脂质的核酸递送系统相比具有许多优点，包含高核酸包封效率、有效转染、改善对组织的渗透以递送治疗剂以及低水平的细胞毒性和免疫原性。
在开发用于核酸的脂质纳米颗粒递送系统之前，阳离子脂质作为递送核酸药物的合成材料被广泛研究。在这些早期工作中，在生理pH下混合在一起后，核酸被阳离子脂质缩合，形成称为脂质体复合物的脂质-核酸复合物。然而，脂质体复合物被证明是不稳定的，并且其特征在于从亚微米量级到几微米的宽尺寸分布。脂质体复合物，如试剂，已发现在体外转染中具有相当大的实用性。然而，这些第一代脂质体复合物尚未被证明在体内有用。大粒径和正电荷(由阳离子脂质赋予)导致血浆快速清除、溶血和其它毒性，以及免疫系统激活。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括式I的脂质：
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：R1和R2独立地是(CH3(CH2)m)2CH-、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CH、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-2)CH、(CH3(CH2)m)2CHCH2-或(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CHCH2-，其中m是4-11；L1和L2各自独立地不存在，是直链C1-5亚烷基或(CH2)p-O-(CH2)q，其中p和q各自独立地是1-3；R3是任选地被一个或两个甲基基团取代的直链C2-5亚烷基；R4和R5各自独立地是H或C1-6烷基；X是O或S；并且n是0-2。
在一些实施例中，可以明确排除本文所述的任何一种或多种脂质。
在一些实施例中，本公开提供了一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包括多个配体，其中每个配体独立地是本文所描述的化合物，其中所述多个配体自组装以形成包括内部和外部的所述脂质纳米颗粒。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的平均大小为约100nm。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的平均大小小于约100nm。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为约40nm至约100nm。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为约50nm至约90nm。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为约55nm至约85nm。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒进一步包括所述内部中的核酸。在一些实施例中，所述核酸选自siRNA、mRNA、自我复制RNA、DNA质粒和反义寡核苷酸。在一些实施例中，所述核酸是包括编码所关注的治疗性蛋白的编码区的mRNA或自我复制RNA。在一些实施例中，所述所关注的治疗性蛋白是酶和抗体、抗原、受体或转运蛋白。在一些实施例中，所述所关注的治疗性蛋白是基因编辑酶。在一些实施例中，所述基因编辑酶选自TALEN、CRISPR、大范围核酸酶或锌指核酸酶。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒进一步包括所述内部中的siRNA或mRNA。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒进一步包括所述内部中的mRNA。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒进一步包括如下文所描述的辅助脂质。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒进一步包括如本文所描述的PEG-脂质缀合物。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括约45mol％至65mol％的本发明的化合物、约2mol％至约15mol％的辅助脂质、约20mol％至约42mol％的胆固醇以及约0.5mol％至约3mol％的PEG-脂质缀合物。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括约50mol％至约61mol％的本发明的化合物、约5mol％至约9mol％的所述辅助脂质、约29mol％至约38mol％的胆固醇以及约1mol％至约2mol％的所述PEG-脂质缀合物。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括约56mol％至约58mol％的本发明的化合物、约6mol％至约8mol％的DSPC、约31mol％至约34mol％的胆固醇以及约1.25mol％至约1.75mol％的所述PEG-脂质缀合物。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括约50mol％至61mol％的本发明的化合物、约2mol％至约12mol％的DSPC、约25mol％至约42mol％的胆固醇以及约0.5mol％至约3mol％的PEG2000-DMG。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括约50mol％至约61mol％的本发明的化合物、约5mol％至约9mol％的DSPC、约29mol％至约38mol％的胆固醇以及约1mol％至约2mol％的PEG2000-DMG。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括约56mol％至约58mol％的本发明的化合物、约6mol％至约8mol％的DSPC、约31mol％至约34mol％的胆固醇以及约1.25mol％至约1.75mol％的PEG2000-DMG。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的总脂质:核酸重量比为约50:1至约10:1。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的总脂质:核酸重量比为约40:1至约20:1。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的总脂质:核酸重量比为约35:1至约25:1。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的总脂质:核酸重量比为约32:1至约28:1。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的总脂质:核酸重量比为约31:1至约29:1。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的总脂质:mRNA重量比为约50:1至约10:1。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的总脂质:mRNA重量比为约40:1至约20:1。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的总脂质:mRNA重量比为约35:1至约25:1。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的总脂质:mRNA重量比为约32:1至约28:1。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的总脂质:mRNA重量比为约31:1至约29:1。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒纳米颗粒包括pH为约7.4的HEPES缓冲液。在一些实施例中，所述HEPES缓冲液的浓度为约7mg/mL至约15mg/mL。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒进一步包括约2.0mg/mL至约4.0mg/mL的NaCl。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒进一步包括一种或多种冷冻保护剂。在一些实施例中，所述一种或多种冷冻保护剂选自蔗糖、甘油或蔗糖和甘油的组合。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括浓度为约70mg/mL至约110mg/mL的蔗糖和浓度为约50mg/mL至约70mg/mL的甘油的组合。
脂质-核酸调配物
核酸或其药学上可接受的盐可以掺入脂质调配物(即，基于脂质的递送媒剂)中。
在本公开的上下文中，基于脂质的递送媒剂通常用于将所需核酸(siRNA、质粒DNA、mRNA、自我复制RNA等)运输到靶细胞或组织。基于脂质的递送媒剂可以是本领域已知的任何合适的基于脂质的递送媒剂。在一些实施例中，所述基于脂质的递送媒剂是脂质体、阳离子脂质体或含有核酸的脂质纳米颗粒。在一些实施例中，所述基于脂质的递送媒剂包括脂质分子和核酸的纳米颗粒或双层。在一些实施例中，优选地，所述脂质双层进一步包括中性脂质或聚合物。在一些实施例中，优选地，所述脂质调配物包括液体培养基。在一些实施例中，优选地，所述调配物进一步包封核酸。在一些实施例中，优选地，所述脂质调配物进一步包括核酸和中性脂质或聚合物。在一些实施例中，优选地，所述脂质调配物包封核酸。
本说明书提供了脂质调配物，所述脂质调配物包括包封在脂质调配物内的一种或多种治疗性核酸分子。在一些实施例中，所述脂质调配物包括脂质体。在一些实施例中，所述脂质调配物包括阳离子脂质体。在一些实施例中，所述脂质调配物包括脂质纳米颗粒。
在一些实施例中，所述核酸被完全包封在脂质调配物的脂质部分内，使得所述脂质调配物中的核酸在水溶液中抵抗核酸酶降解。在其它实施例中，本文所述的脂质调配物对哺乳动物如人类基本上无毒性。
本公开的脂质调配物通常还具有以下总脂质:核酸比(质量/质量比)：约1:1至约100:1、约1:1至约50:1、约2:1至约45:1、约3:1至约40:1、约5:1至约38:1、或约6:1至约40:1、或约7:1至约35:1、或约8:1至约30:1；或约10:1至约25:1；或约8:1至约12:1；或约13:1至约17:1；或约18:1至约24:1；或约20:1至约30:1。在一些优选实施例中，所述总脂质:核酸比(质量/质量比)为约10:1至约25:1。所述比率可以是所叙述范围内的任何值或子值，包含端点。
本公开的脂质调配物通常具有约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm或约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm、约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约105nm、约110nm、约115nm、约120nm、约125nm、约130nm、约135nm、约140nm、约145nm或约150nm的平均直径，并且基本上是无毒性的。所述直径可以是所叙述范围内的任何值或子值，包含端点。另外，核酸当存在于本公开的脂质纳米颗粒中时在水溶液中抵抗核酸酶的降解。
在优选实施例中，所述脂质调配物包括核酸、阳离子脂质(例如，本文所述的一种或多种阳离子脂质或其盐)、磷脂和抑制颗粒聚集的缀合脂质(例如，本公开的一种或多种PEG-脂质缀合物和/或其它脂质缀合物)。所述脂质调配物还可以包含胆固醇。
在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒进一步包括PEG-脂质缀合物。在一些实施例中，所述PEG-脂质缀合物是PEG-DMG。在一些实施例中，所述PEG-DMG是PEG2000-DMG。
在所述核酸-脂质调配物中，所述核酸可以完全包封在所述调配物的脂质部分内，由此保护所述核酸免于核酸酶降解。在优选实施例中，脂质调配物包括完全包封在所述脂质调配物的脂质部分内的核酸，由此保护所述核酸免于核酸酶降解。在某些实例中，在颗粒暴露于37℃的核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后，脂质调配物中的核酸基本上没有降解。在某些其它实例中，在将调配物在血清中于37℃下温育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时后，脂质调配物中的核酸基本上没有降解。在其它实施例中，核酸与调配物的脂质部分络合。
在核酸的上下文中，可以通过进行不可渗透膜荧光染料排除测定来确定完全包封，该测定使用与核酸缔合时具有增强荧光的染料。通过将染料添加到脂质调配物中，测量所得的荧光，并与添加少量非离子清洁剂后观察到的荧光进行比较来确定包封。清洁剂介导的对脂质层的破坏释放了封装的核酸，使其与不可渗透膜的染料相互作用。核酸包封可以计算为E＝(I0-I)/I0，其中I和I0是指添加清洁剂前后的荧光强度。
在其它实施例中，本公开提供了一种核酸脂质组合物，其包括多种核酸-脂质体、核酸-阳离子脂质体或核酸-脂质纳米颗粒。在一些实施例中，核酸-脂质组合物包括多种核酸-脂质体。在一些实施例中，核酸-脂质组合物包括多种核酸-阳离子脂质体。在一些实施例中，核酸-脂质组合物包括多种核酸-脂质纳米颗粒。
在一些实施例中，脂质调配物包括完全包封在调配物的脂质部分内的核酸，使得约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约30％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约80％至约90％，或至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％(或其中的任何部分或范围)的颗粒具有包封在其中的核酸。所述量可以是所叙述范围内的任何值或子值，包含端点。
根据脂质调配物的预期用途，可以改变组分的比例，并且可以使用本领域已知的测定法来测量特定调配物的递送效率。
根据一些实施例，可表达的多核苷酸、核酸活性剂和mRNA构建体可以是脂质调配的。脂质调配物优选地选自但不限于脂质体、阳离子脂质体和脂质纳米颗粒。在一个优选实施例中，脂质调配物是阳离子脂质体或脂质纳米颗粒(LNP)，其包括：
(a)核酸(mRNA、siRNA等)；
(b)本公开的脂质，其可以是阳离子的；
(c)任选地，非阳离子脂质(如中性脂质)；以及
(d)任选地，固醇。
阳离子脂质
脂质调配物优选地包含适于形成阳离子脂质体或脂质纳米颗粒的阳离子脂质。阳离子脂质被广泛研究用于核酸递送，因为其可以与带负电的膜结合并诱导摄取。通常，阳离子脂质是含有正亲水性头部基团、两个(或更多个)亲脂性尾部或类固醇部分和这两个结构域之间的连接体的两亲物。优选地，所述阳离子脂质在接近生理pH值下携带净正电荷。阳离子脂质体传统上是寡核苷酸最常用的非病毒递送系统，包含质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNA/小发夹RNA-shRNA。阳离子脂质，如DOTAP(l,2-二烯酰-3-三甲基丙烷)和DOTMA(N-[l-(2,3-二烯酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基-甲基硫酸铵)可以通过静电相互作用与带负电荷的核酸形成复合物或脂质体复合物，从而提供较高的体外转染效率。
在当前公开的脂质调配物中，例如，所述阳离子脂质可以包含N,N-二甲基-N,N-二-9-顺式-十八烷基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、1,2-二油基三甲基氯化铵(DOTAP)(也被称为N-(2,3-二油基氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵和1,2-二油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷氯盐)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-(二甲基-2,3-二油酰氧基)丙基胺(DODMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二氢亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二氢亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、1,2-二烷基氨基甲酰氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二烷基氨基甲酰氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二烷基氨基甲酰氧基-3-吗啉丙烷(DLin-MA)、1,2-二氢油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二氢油酰基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二氢油酰氧基-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二氢油酰-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二氢油酰氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、2,2-二苯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊烷(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊烯[d][1,3]二噁醇-5-胺、(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三烯-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸甲酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮杂二基)二十二烷-2-醇(C12-200)、2,2-二氢吲哚基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二氢吲哚基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-七三烯-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(MC3醚)、4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-七三烯-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丁-1-胺(MC4醚)或其任何组合。其它阳离子脂质包含但不限于N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、3P-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(l-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N-2-(精胺)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、二十八烷基酰胺基糖基羧精胺(DOGS)、1,2-二油酰-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰-3-二甲基氨丙烷(DODAP)、N-(1,2-二异丙基-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)和2,2-二苯基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(XTC)。此外，还可以使用阳离子脂质的商业制剂，例如脂质体(LIPOFECTIN)(包含DOTMA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)和脂质体(Lipofectamine)(包括DOSPA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)。
其它合适的阳离子脂质公开于以下文献中：国际出版物第WO 09/086558、WO 09/127060、WO 10/048536、WO 10/054406、WO 10/088537、WO 10/129709和WO 2011/153493号；美国专利出版物第2011/0256175、2012/0128760和2012/0027803号；美国专利第8,158,601号；以及Love等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》,107(5),1864-69,2010，所述参考文献的内容通过引用并入本文。
其它合适的阳离子脂质包含具有替代脂肪酸基团和其它二烷基氨基的脂质，包含烷基取代基不同的脂质(例如，N-乙基-N-甲基氨基和N-丙基-N-乙基氨基)。这些脂质是被称为氨基脂质的阳离子脂质的一个子类别的一部分。在本文所述的脂质调配物的一些实施例中，所述阳离子脂质为氨基脂质。通常，具有较少饱和烷基链的氨基脂质更易于调整大小，尤其是当出于过滤灭菌的目的，复合物的大小必须小于约0.3微米时。可以使用含有碳链长度在C14至C22范围内的不饱和脂肪酸的氨基脂质。也可以使用其它支架来分离氨基脂质的氨基和脂肪酸或脂肪烷基部分。
在一些实施例中，本公开的阳离子脂质是可电离的并且具有至少一个可质子化或可去质子化基团，使得脂质在等于或低于生理pH值(例如，pH 7.4)的pH值下带正电荷，并且在第二pH值下为中性，所述第二pH值优选地等于或高于生理pH值。当然，应当理解的是，作为pH的函数的质子的添加或去除是平衡过程，并且对带电或中性脂质的提及是指占优势物种的性质，而不要求所有的脂质都以带电或中性形式存在。不排除在本公开中使用具有多个可质子化或可去质子化基团的脂质或两性离子脂质。在某些实施例中，可质子化脂质的可质子化基团的pKa在约4至约11的范围内。在一些实施例中，可电离阳离子脂质的pKa为约5至约7。在一些实施例中，可电离阳离子脂质的pKa为约6至约7。
在一些实施例中，所述脂质调配物包括式I的脂质：
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：R1和R2独立地是(CH3(CH2)m)2CH-、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CH、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-2)CH、(CH3(CH2)m)2CHCH2-或(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CHCH2-，其中m是4-11；L1和L2各自独立地不存在，是直链C1-5亚烷基或(CH2)p-O-(CH2)q，其中p和q各自独立地是1-3；R3是任选地被一个或两个甲基基团取代的直链C2-5亚烷基；R4和R5各自独立地是H或C1-6烷基；X是O或S；并且n是0-2。
在一些实施例中，可以明确排除本文所述的任何一种或多种脂质。
辅助脂质和固醇
本公开的mRNA-脂质调配物可以包括辅助脂质，其可称为中性脂质、中性辅助脂质、非阳离子脂质、非阳离子辅助脂质、阴离子脂质、阴离子辅助脂质或两性离子脂质。已经发现，如果辅助脂质存在于调配物中，则脂质调配物，特别是阳离子脂质体和脂质纳米颗粒具有增加的细胞摄取。(《当前药物代谢(Curr.Drug Metab.)》2014；15(9):882-92)。例如，一些研究已经指示中性和两性脂质，如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、二-油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3--磷酸胆碱(DSPC)，比阳离子脂质更具有融合性(即，促进融合)可以影响脂质-核酸复合物的多态性特征，促进从层状向六方相的转变，并且因此诱导细胞膜的融合和破坏。(《纳米医学》(伦敦).2014年1月；9(1):105-20)。此外，辅助脂质的使用有助于减少使用许多流行的阳离子脂质的任何潜在有害影响，如毒性和免疫原性。
适用于本公开的脂质调配物的非阳离子脂质的非限制性实例包含磷脂，如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌糖、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二十六烷基磷酸酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基磷脂酰乙醇胺、二甲基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DEPE)、硬脂酰油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱及其混合物。也可以使用其它二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选地为源自具C10-C24碳链的脂肪酸的酰基，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。
在一些实施例中，所述辅助脂质选自：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和磷脂酰胆碱(PC)。在一些实施例中，所述辅助脂质是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
非阳离子脂质的另外的实例包含固醇如胆固醇及其衍生物。一项研究得出结论，作为辅助脂质，胆固醇增加了与核酸交界的脂质层的电荷间距，使得电荷分布与核酸的电荷分布更紧密地匹配。《皇家学会期刊(J.R.Soc.Interface.)》2012年3月7日；9(68):548-561)。非限制性胆固醇衍生物的实施例包含：极性类似物，如5α-胆甾烷醇、5α-粪醇、胆固醇基-(2'-羟基)-乙基醚、胆固醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾酮、5α-胆甾酮和胆固醇癸酸酯；以及其混合物。在优选实施例中，胆固醇衍生物是极性类似物，如胆固醇基-(4'-羟基)-丁醚。
在一些实施例中，存在于脂质调配物中的辅助脂质包括或由一种或多种磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物组成。在其它实施例中，存在于脂质调配物中的辅助脂质包括或由一种或多种磷脂(例如，无胆固醇脂质调配物)组成。在又其它实施例中，存在于脂质调配物中的辅助脂质包括或由胆固醇或其衍生物(例如，无磷脂脂质调配物)组成。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒进一步包括胆固醇。
辅助脂质的其它实例包含不含磷的脂质，例如，硬脂胺、十二烷胺、十六烷胺、乙酰棕榈酸酯、甘油蓖麻酸酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸盐、烷基-芳基硫酸盐聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺和鞘磷脂。
在一些实施例中，辅助脂质包括脂质调配物中存在的总脂质(或其任何部分或其范围)的约1mol％至约50mol％、约5mol％至约48mol％、约5mol％至约46mol％、约25mol％至约44mol％、约26mol％至约42mol％、约27mol％至约41mol％、约28mol％至约40mol％，或约29mol％、约30mol％、约31mol％、约32mol％、约33mol％、约34mol％、约35mol％、约36mol％、约37mol％、约38mol％或约39mol％。在一些实施例中，辅助脂质包括约1mol％至约20mol％、约2mol％至约12mol％、约5mol％至约9mol％或约6mol％至约8mol％。
在一些实施例中，调配物中的总辅助脂质包括两种或更多种辅助脂质，并且辅助脂质的总数量包括脂质调配物中存在的总脂质(或其任何部分或其范围)的约20mol％至约50mol％、约22mol％至约48mol％、约24mol％至约46mol％、约25mol％至约44mol％、约26mol％至约42mol％、约27mol％至约41mol％、约28mol％至约40mol％，或约29mol％、约30mol％、约31mol％、约32mol％、约33mol％、约34mol％、约35mol％、约36mol％、约37mol％、约38mol％或约39mol％。在一些实施例中，辅助脂质是DSPC和DOTAP的组合。在一些实施例中，辅助脂质是DSPC和DOTMA的组合。
脂质调配物中的胆固醇或胆固醇衍生物可以包括脂质调配物中存在的总脂质的至多约40mol％、约45mol％、约50mol％、约55mol％或约60mol％。在一些实施例中，胆固醇或胆固醇衍生物包括脂质调配物中存在的总脂质的约15mol％至约45mol％、约20mol％至约40mol％、约30mol％至约40mol％，或约35mol％、约36mol％、约37mol％、约38mol％、约39mol％或约40mol％。
存在于脂质调配物中的辅助脂质的百分比是目标量，并且存在于调配物中的辅助脂质的实际量可以变化，例如，±5mol％。
用于脂质调配物的细胞摄取的作用机制
用于细胞内递送核酸的脂质调配物，特别是脂质体、阳离子脂质体和脂质纳米颗粒，设计用于通过利用靶细胞的内吞机制穿透靶细胞进行细胞摄取，其中脂质递送媒剂的内容物被递送到靶细胞的胞质溶胶。(《核酸治疗剂(Nucleic Acid Therapeutics)》,28(3):146-157,2018)。具体而言，在本文所述的核酸-脂质调配物的情况下，所述脂质调配物通过受体介导的内吞作用进入细胞。在内吞作用之前，脂质递送媒剂表面的功能化配体如本公开的脂质缀合物可以从表面脱落，这触发到靶细胞的内化。在内吞作用期间中，细胞的质膜的某些部分包围载体，并将其吞噬成囊泡，然后囊泡从细胞膜上脱落，进入胞质溶胶，并最终经历内溶酶体途径。对于可电离的含阳离子脂质的递送媒剂，随着内体老化，酸度增加，导致媒剂表面带强正电荷。递送媒剂和内体膜之间的相互作用导致膜融合事件，从而导致有效载荷的胞质递送。对于mRNA或自我复制RNA有效载荷，细胞自身的内部翻译过程然后将RNA翻译成编码的蛋白质。编码的蛋白质可以进一步进行翻译后处理，包含运输到细胞内的靶细胞器或位置。
通过控制脂质调配物的组成和浓度，可以控制脂质缀合物交换出脂质调配物的速率，并且进而控制脂质调配物融合的速率。另外，包含例如pH、温度或离子强度的其它变量可用于改变和/或控制脂质调配物融合的速率。可以用于控制脂质调配物融合的速率的其它方法对于本领域技术人员在阅读本公开后将变得显而易见。同样，通过控制脂质缀合物的组成和浓度，可以控制脂质体或脂质颗粒的大小。
脂质调配物制造
有许多不同的方法用于制备包括核酸的脂质调配物。(《当前药物代谢》2014,15,882-892；《脂质化学与物理学(Chem.Phys.Lipids)》2014,177,8-18；《国际药学研究杂志(Int.J.Pharm.Stud.Res.)》2012,3,14-20)。本文简要描述了薄膜水合、双乳液、反相蒸发、微流体制备、双不对称离心、乙醇注射、洗涤剂透析、通过乙醇稀释自发形成囊泡和预成型脂质体包封的技术。
薄膜水合
在薄膜水合(TFH)或Bangham方法中，将脂质溶解在有机溶剂中，然后通过使用旋转蒸发器蒸发，从而形成薄的脂质层。在通过含有待负载化合物的水性缓冲液进行层水合之后，形成多层囊泡(MLV)，其可通过膜挤出或通过起始MLV的超声处理而减小尺寸以产生小型或大型单层囊泡(LUV和SUV)。
双乳液
脂质调配物也可以通过双乳液技术制备，该技术涉及在水/有机溶剂混合物中的脂质溶解。将含有水滴的有机溶液与过量的水性介质混合，形成水包油包水(W/O/W)双乳液。在机械剧烈摇晃后，部分水滴坍塌，形成大的单层囊泡(LUV)。
反相蒸发
反相蒸发(REV)方法还允许实现负载有核酸的LUV。在该技术中，磷脂在有机溶剂和水性缓冲液中溶解形成两相系统。然后对所得悬浮液进行短暂的超声处理，直到混合物变成透明的单相分散体。脂质调配物是在减压下在有机溶剂蒸发后获得的。该技术已被用于封装包含核酸的不同大和小亲水性分子。
微流体制备
与其它本体技术不同，微流体方法提供了控制脂质水合过程的可能性。根据操纵流动的方式，该方法可以分为连续流动微流体和基于液滴的微流体。在以连续流模式操作的微流体流体动力学聚焦(MHF)方法中，脂质溶解在异丙醇中，所述异丙醇在两个水性缓冲液流之间的微通道交叉处进行流体动力学聚焦。囊泡大小可以通过调节流速来控制，从而控制脂质溶液/缓冲液稀释过程。该方法可以用于通过使用由三个入口和一个出口端口组成的微流体装置来生产寡核苷酸(ON)脂质调配物。
双不对称离心
双不对称离心(DAC)不同于更常见的离心，因为其使用绕其自身垂直轴的另外的旋转。由于产生了两个重叠的运动，实现了有效的均匀化：样品被向外推动，就像在普通离心机中一样，并且然后由于另外的旋转，其被推向小瓶的中心。通过将脂质和NaCl溶液混合，获得粘性囊泡磷脂凝胶(VPC)，然后将其稀释以获得脂质调配物分散体。可以通过优化DAC速度、脂质浓度和均化时间来调节脂质调配物的大小。
乙醇注射
乙醇注射(EI)方法可以用于核酸包封。该方法提供了通过使用针头将溶解有脂质的乙醇溶液快速注射到含有待封装核酸的水性介质中。当磷脂分散在整个培养基中时，囊泡是自发形成的。
洗涤剂透析
洗涤剂透析方法可以用于包封核酸。简言之，将脂质和质粒溶解在具有适当离子强度的洗涤剂溶液中，在通过透析去除洗涤剂后，形成稳定的脂质调配物。然后通过离子交换色谱法去除未包封的核酸，并通过蔗糖密度梯度离心法清空囊泡。该技术对阳离子脂质含量和透析缓冲液的盐浓度高度敏感，并且该方法也难以规模化。
通过乙醇稀释自发形成囊泡
稳定的脂质调配物也可以通过乙醇稀释自发囊泡形成法生产，其中通过将溶解在乙醇中的脂质受控添加到含有核酸的快速混合的水性缓冲液中，逐步或逐滴的乙醇稀释提供了负载有核酸的囊泡的瞬时形成。
V.药物组合物和递送方法
为了促进体内核酸活性(例如，mRNA表达，或通过ASO或siRNA敲低)，本文所述的脂质调配物递送媒剂可以与一种或多种另外的核酸、载剂、靶向配体或稳定试剂组合，或在与合适的赋形剂混合的药理学组合物中组合。用于调配和施用药物的技术可见于“《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,”宾夕法尼亚州伊斯顿马克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.),最新版。
本公开的脂质调配物和药物组合物可以根据当前的医学实践进行施用和给药，考虑受试者的临床病状、施用部位和方法、施用时间安排、受试者年龄、性别、体重和与本领域普通技术的临床医生相关的其它因素。出于本文目的的“有效量”可以通过实验临床研究、药理学、临床和医学领域的普通技术人员已知的相关考虑因素来确定。在一些实施例中，所施用的量对于实现症状和其它指标的至少一些稳定、改善或消除是有效的，这些指标被本领域技术人员选择为疾病进展、消退或改善的适当量度。例如，合适的量和给药方案是至少引起瞬时蛋白质(例如，酶)产生的方案。
本文所述的药物组合物可以是可吸入组合物。合适的施用途径包含，例如，气管内、吸入或鼻内。在一些实施例中，施用导致核酸递送至肺上皮细胞。在一些实施例中，与其它类型的肺细胞和气道细胞相比，施用示出对肺上皮细胞的选择性。
本文公开的药物组合物可以使用一种或多种赋形剂调配，以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，来自核酸的储库调配物)；(4)改变生物分布(例如，将核酸靶向特定的组织或细胞类型)；(5)增加核酸或其在体内表达的蛋白质的活性；和/或(6)改变核酸或编码蛋白在体内的释放特性。
优选地，脂质调配物可以以局部方式而不是全身方式施用。根据待靶向组织，可以各种方式影响局部递送。例如，含有本公开的组合物的气溶胶可以被吸入(用于鼻腔、气管或支气管递送)。
药物组合物可以施用于任何期望的组织。在一些实施例中，由本公开的脂质调配物或组合物递送的核酸在施用脂质调配物和/或组合物的组织中具有活性。在一些实施例中，核酸在不同于施用脂质调配物和/或组合物的组织的组织中具有活性。可以在其中递送核酸的示例性组织包含但不限于肺、气管和/或鼻腔、肌肉、肝脏、眼睛或中枢神经系统。
本文描述的药物组合物可以通过药理学领域已知的或今后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包含将活性成分(即，核酸)与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分缔合的步骤。根据本公开的药物组合物可以作为单次单位剂量和/或作为多个单次单位剂量批量制备、包装和/或出售。
药物组合物可以另外地包括药学上可接受的赋形剂，如本文所使用的，所述赋形剂包含但不限于如适用于期望的特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等等。
除了传统赋形剂如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散体或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂之外，本公开的赋形剂可以包含但不限于脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质体复合物、核壳纳米颗粒，肽、蛋白质、用原代DNA构建体或mRNA转染的细胞(例如，用于移植到受试者体内)、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物及其组合。
因此，本文所述的调配物可以包含一种或多种赋形剂，每种赋形剂的量共同增加脂质调配物中核酸的稳定性，增加核酸(例如，mRNA或siRNA)的细胞转染，增加编码蛋白的表达，和/或改变编码蛋白的释放谱，或增加靶天然核酸的敲低。另外，可以使用自组装核酸纳米颗粒来调配核酸。
用于调配药物组合物的各种赋形剂和用于制备该组合物的技术是本领域已知的(参见《雷明顿：药物科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第21版,A.R.Gennaro,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins),马里兰州巴尔的摩(Baltimore,Md.),2006；所述文献通过引用以其整体并入本文)。除了任何常规赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容之外，常规赋形剂介质的使用也在本公开实施例的范围内，如通过产生任何不期望的生物效应或以有害方式与药物组合物的任何其它组分相互作用。
本公开的组合物的剂型可以是固体，其可以在施用前在液体中重构。该固体可以以粉末的形式施用。在一些实施例中，药物组合物包括已冻干的核酸脂质调配物。
在优选实施例中，本文所述的药物组合物的剂型可以是本文所述是核酸-脂质纳米颗粒的液体悬浮液。在一些实施例中，液体悬浮液处于缓冲溶液中。在一些实施例中，缓冲溶液包括选自由以下组成的组的缓冲液：HEPES、MOPS、TES和TRIS。在一些实施例中，缓冲液的pH为约7.4。在一些优选实施例中，缓冲液是HEPES。在一些另外的实施例中，缓冲溶液进一步包括冷冻保护剂。在一些实施例中，冷冻保护剂选自糖和甘油或糖和甘油的组合。在一些实施例中，所述糖是二聚糖。在一些实施例中，所述糖是蔗糖。在一些优选实施例中，缓冲液包括HEPES、蔗糖和pH为7.4的甘油。在一些实施例中，悬浮液在储存期间冷冻，并且在施用之前解冻。在一些实施例中，悬浮液在低于约-70℃的温度下冷冻。在一些实施例中，悬浮液在可吸入施用之前用无菌水稀释。在一些实施例中，可吸入施用包括用约1体积至约4体积的无菌水稀释悬浮液。在一些实施例中，冻干的核酸-脂质纳米颗粒调配物可以重新悬浮于本文所述的缓冲液中。
本公开的组合物和方法可以通过多种粘膜施用模式(包含鼻内和/或肺内)施用于受试者。在本公开的一些方面，粘膜组织层包含上皮细胞层。上皮细胞可以是肺、气管、支气管、肺泡、鼻腔和/或口腔。本公开的组合物可以使用如机械喷雾装置的常规致动器以及加压的、电激活的或其它类型的致动器来施用。
本公开的组合物可以在水溶液中以鼻喷雾剂或肺喷雾剂的形式施用，并且可以通过本领域技术人员已知的各种方法以喷雾形式分配。本公开的组合物的肺递送是通过以滴、颗粒或喷雾的形式施用组合物来实现的，所述滴、颗粒或喷雾是可以例如气溶胶化的(aerosolized)、雾化的(atomized)或雾化的(nebulized)。组合物、喷雾或气溶胶的颗粒可以是液体或固体形式，例如，冻干的脂质调配物。用于分配液体作为鼻喷雾剂的优选系统公开于美国专利第4,511,069号中。此类调配物可以通过将根据本公开的组合物溶解在水中以产生水溶液并使所述溶液无菌来方便地制备。调配物可以存在于多剂量容器中，例如在美国专利第4,511,069号中公开的密封分配系统中。其它合适的鼻喷雾递送系统描述于以下中：《透皮全身用药(TRANSDERMAL SYSTEMIC MEDICATION)》,Y.W.Chien编辑,纽约的爱思唯尔出版社(Elsevier Publishers,New York),1985；以及美国专利第4,778,810号。另外的气溶胶递送形式可以包含例如压缩空气、喷射、超声和压电喷雾器，其递送核酸-脂质调配物或悬浮在药物溶剂，例如水、乙醇或其混合物中。
本公开的鼻腔和肺部喷雾溶液通常包括核酸，任选地用表面活性剂如非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯-80)和一种或多种缓冲液调配，条件是表面活性剂的包含不破坏脂质调配物的结构。在本公开的一些实施例中，鼻喷雾剂溶液进一步包括推进剂。鼻喷雾溶液的pH可以为pH 6.8至7.2。所使用的药物溶剂也可以是pH为4至6的微酸性水性缓冲液。可以添加其它组分，包含防腐剂、表面活性剂、分散剂或气体来增强或保持化学稳定性。
在一些实施例中，本公开提供了一种药物产品，其包含含有本公开的组合物和用于肺、粘膜或鼻内喷雾或气雾剂的致动器的溶液。
本公开的组合物的剂型可以是液体，以液滴或乳液的形式，或以气溶胶的形式。
本公开的组合物的剂型可以是固体，其可以在施用前在液体中重构。该固体可以以粉末的形式施用。固体可以是胶囊、片剂或凝胶的形式。
为了在本公开中调配用于肺部递送的组合物，核酸-脂质调配物可以与各种药学上可接受的添加剂以及用于分散核酸-脂质调配物的碱或载剂组合。添加剂的实例包含pH控制剂，如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸及其混合物。其它添加剂包含局部麻醉剂(例如，苄醇)、等渗剂(例如，氯化钠、甘露醇、山梨醇)、吸附抑制剂(例如，Tween 80)、溶解度增强剂(例如，环糊精及其衍生物)、稳定剂(例如，血清白蛋白)和还原剂(例如，谷胱甘肽)。当用于粘膜递送的组合物是液体时，调配物的张力(如参考0.9％(w/v)生理盐水溶液的张力作为整体测量的)通常被调整到将不在施用部位处的粘膜中诱导显著的、不可逆的组织损伤的值。通常，溶液的张力被调整到1/3至3的值，更典型地1/2至2，并且最通常地3/4至1.7。
核酸-脂质调配物可以分散在碱或媒剂中，所述碱或媒剂可以包括具有分散核酸-脂质调配物的能力的亲水性化合物和任何期望的添加剂。碱可以选自多种合适的载剂，包含但不限于聚羧酸或其盐的共聚物、羧酸酐(例如马来酸酐)与其它单体(例如，甲基(甲)丙烯酸酯、丙烯酸等)的共聚物、亲水性乙烯基聚合物如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素衍生物如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等，以及天然聚合物如壳聚糖、胶原蛋白、藻酸钠、明胶、透明质酸及其无毒金属盐。通常，可生物降解的聚合物被选择作为碱或载剂，例如，聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-羟基乙醇酸)共聚物及其混合物。可替代地或另外地，合成脂肪酸酯如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等可以用作载剂。亲水性聚合物和其它载剂可以单独使用或组合使用，并且可以通过部分结晶、离子键合、交联等将增强的结构完整性赋予载剂。可以以多种形式提供载剂，包含流体或粘性溶液、凝胶、糊剂、粉末、微球和膜以直接应用于鼻粘膜。在这种情况下使用所选择的载剂可以促进核酸-脂质调配物的吸收。
本公开的组合物可替代地可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的载剂物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂和润湿剂，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺及其混合物。对于固体组合物，可以使用常规无毒药学上可接受的载剂，所述载剂包含例如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
在本公开的某些实施例中，核酸-脂质调配物可以以延时释放调配物的形式施用，例如，以包含缓释聚合物的组合物的形式施用。核酸-脂质调配物可以用防止快速释放的载剂制备，例如控释媒剂，如聚合物、微胶囊化递送系统或生物粘附凝胶。在本公开的各种组合物中，核酸-脂质调配物的延长递送可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂来实现，例如，单硬脂酸铝水凝胶和明胶。
已经证明，可以通过气管内施用核酸组合物液体悬浮液和吸入由液体喷雾器产生的气溶胶雾或使用干粉设备(如美国专利第5,780,014号中所描述的设备，所述美国专利通过引用并入本文)将核酸递送到肺。
在某些实施例中，可以调配本公开的组合物，使得其可以在向受试者施用之前或之后作为颗粒液体或固体被雾化或以其它方式递送。此类组合物可以在用于施用此类固体或液体颗粒组合物(例如，雾化水性溶液或悬浮液)的一种或多种适合的装置的帮助下施用，以产生易于被受试者呼吸或吸入的颗粒。在一些实施例中，此类装置(例如，定量剂量吸入器、喷射雾化器、超声雾化器、干粉吸入器、基于推进剂的吸入器或吹入器)有助于向受试者施用预定质量、体积或剂量的组合物(例如，每剂量约0.010mg/kg至约0.5mg/kg的核酸)。例如，在某些实施例中，使用定量吸入器向受试者施用本公开的组合物，所述吸入器含有包括所述化合物和适合的推进剂的悬浮液或溶液。在某些实施例中，本公开的组合物可以调配成用于吸入的颗粒粉末(例如，可吸入的干颗粒)。在某些实例中，调配为可吸入的颗粒的本公开的组合物具有适当的尺寸，使得其可以由受试者呼吸或使用合适的装置递送(例如，平均D50或D90粒径小于约500μm、400μm、300μm、250μm、200μm、150μm、100μm、75μm、50μm、25μm、20μm、15μm、12.5μm、10μm、5μm、2.5μm或更小)。在又其它实施例中，本公开的组合物被调配成包含一种或多种肺部表面活性剂(例如，板层体)。在一些实施例中，向受试者施用本公开的组合物，使得在单剂量中施用的浓度为至少0.010mg/kg、至少0.015mg/kg、至少0.020mg/kg、至少0.025mg/kg、至少0.030mg/kg、至少0.035mg/kg、至少0.040mg/kg、至少0.045mg/kg、至少0.05mg/kg、至少0.1mg/kg、至少0.5mg/kg、至少1.0mg/kg、至少2.0mg/kg、至少3.0mg/kg、至少4.0mg/kg、至少5.0mg/kg、至少6.0mg/kg、至少7.0mg/kg、至少8.0mg/kg、至少9.0mg/kg、至少10mg/kg、至少15mg/kg、至少20mg/kg、至少25mg/kg、至少30mg/kg、至少35mg/kg、至少40mg/kg、至少45mg/kg、至少50mg/kg、至少55mg/kg、至少60mg/kg、至少65mg/kg、至少70mg/kg、至少75mg/kg、至少80mg/kg、至少85mg/kg、至少90mg/kg、至少95mg/kg或至少100mg/kg体重。在一些实施例中，向受试者施用本公开的组合物，使得在一个或多个剂量中施用总量至少0.1mg、至少0.5mg、至少1.0mg、至少2.0mg、至少3.0mg、至少4.0mg、至少5.0mg、至少6.0mg、至少7.0mg、至少8.0mg、至少9.0mg、至少10mg、至少15mg、至少20mg、至少25mg、至少30mg、至少35mg、至少40mg、至少45mg、至少50mg、至少55mg、至少60mg、至少65mg、至少70mg、至少75mg、至少80mg、至少85mg、至少90mg、至少95mg或至少100mg的核酸。
在一些实施例中，本公开的药物组合物每月向受试者施用一次。在一些实施例中，本公开的药物组合物每月向受试者施用两次。在一些实施例中，本公开的药物组合物每月向受试者施用三次。在一些实施例中，本公开的药物组合物每月对受试者施用四次。
根据本公开，当定期施用时，所提供的组合物的治疗有效剂量导致受试者的核酸活性水平与治疗前的基线活性水平相比增加。通常，在从受试者获得的生物样品中测量活性水平，如血液、血浆或血清、尿液或固体组织提取物。基线水平可以在治疗前立即测量。在一些实施例中，施用本文所述的药物组合物导致生物样品(例如，血浆/血清或肺上皮拭子)中的核酸活性水平与治疗前的基线水平相比增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，施用所提供的组合物导致生物样品(例如，血浆/血清或肺上皮拭子)中的核酸活性水平与治疗前的基线水平相比增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，持续至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天或至少约15天。
在一些实施例中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所描述的化合物或本文所描述的脂质纳米颗粒，以及药学上可接受的赋形剂。
在一些实施例中，本公开提供了一种将核酸递送至有需要的受试者的方法，所述方法包括：将治疗有效量的所述核酸包封在本文所描述的脂质纳米颗粒中；以及将所述脂质纳米颗粒施用于所述受试者。
在一些实施例中，本公开提供了一种将mRNA递送至有需要的受试者的方法，所述方法包括：将治疗有效量的所述mRNA包封在本文所描述的脂质纳米颗粒中；以及将所述脂质纳米颗粒施用于所述受试者。
VI.治疗方法
在一些实施例中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的化合物、本文所描述的脂质纳米颗粒或本文所描述的药物组合物。在一些实施例中，所述化合物或所述脂质纳米颗粒是静脉内或肌内施用的。在一些实施例中，所述化合物或所述脂质纳米颗粒是静脉内施用的。在一些实施例中，所述化合物或所述脂质纳米颗粒是肌内施用的。
在一些实施例中，提供了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所描述的脂质组合物。在一些实施例中，所述脂质组合物静脉内或肌内施用。在一些实施例中，所述脂质组合物静脉内施用。在一些实施例中，所述脂质组合物肌内施用。
在一些实施例中，提供了一种治疗哺乳动物受试者的疾病或病症的方法。可以将治疗有效量的包括如本文所公开的脂质，特别是阳离子脂质、核酸、两亲物、磷脂、胆固醇和PEG连接的胆固醇的组合物施用于患有与基因的表达或过表达相关的疾病或病症的受试者，所述基因的表达或过表达可以被所述组合物降低、减少、下调或沉默。本文所描述的组合物可以在用于治疗癌症或炎性疾病的方法中使用。所述疾病可以是选自由以下各项组成的组的疾病：中枢神经系统病症、外周神经系统病症、肌肉萎缩、肌肉营养不良、免疫病症、癌症、肾脏疾病、纤维化疾病、遗传异常、炎症和心血管病症。
在一些实施例中，本公开提供了一种在靶细胞中表达蛋白质或多肽的方法，所述方法包括使所述靶细胞与本文所描述的脂质纳米颗粒或本文所描述的药物组合物接触。在一些实施例中，所述蛋白质或多肽是抗原，并且所述抗原的表达提供体内免疫原性应答。
VII.实例
实例1.ATX-193的合成
通用方案：
ATX-193-1的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的1-L 3颈圆底烧瓶中放入1,3环己二酮(20g，1.00当量)和二甲基甲酰胺(200mL)。添加丙烯酸乙酯(21.45g，1.20当量)和Cs2CO3(35.00g，0.60当量)并且将所得溶液在80℃下搅拌16小时。然后通过添加600mL的水/冰来淬灭反应。用HCl(1mol/L)将溶液的pH值调节至6。将所得溶液用2×1L的乙酸乙酯萃取并且将有机层合并。将合并的有机层用2×1L的盐水洗涤。将有机层经无水MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩。这产生29g(78％)呈黄色固体的3-(2,6-二氧环己基)丙酸乙酯。LCMS(Schimadzu 2020；ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％TFA95:5至5:95A/B，2.00分钟，保持0.7分钟)：RT1.01分钟，m/z(计算值)212.10，(实验值)213.10(M+H)。
ATX-193-2的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的1-L 3颈圆底烧瓶中放入3-(2,6-二氧环己基)丙酸乙酯(29g，1.00当量)和HCl(1mol/L，300mL水溶液)。将所得溶液在95℃下搅拌16小时。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物溶解于1L的EtOAc中。将未溶解的固体滤出。将所得EA相在真空下浓缩至干燥。这产生23克(粗)呈黄色固体的5-氧代壬二酸。
ATX-193-3的合成
在室温下向用氮气惰性气氛吹扫并维持的1-L 3颈圆底烧瓶中放入5-氧代壬二酸(23g，1.00当量)和DCM(345mL)。随后在室温下添加十五烷-8-醇(62g，2.2当量)和DMAP(13g，1.00当量)，然后在0℃下添加EDCI(52g，2.20当量)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。然后通过添加75mL的HCl水溶液(1mol/L)来淬灭反应。将所得溶液用2×1L的DCM萃取并且将有机层合并。将有机层用2×1L盐水洗涤并且用MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩至约500mL。向其中添加100g硅胶(类型：ZCX-2，100-200目)并将混合物在真空下浓缩。将该硅胶施加到硅胶柱(1Kg，类型：ZCX-2，100-200目)上并将产物用PE/EA洗脱，梯度为1/0至80/1。收集级分并将产物级分在真空下浓缩。这产生26g(38％)呈黄色油的1,9-双(十五烷-8-基)5-氧代壬二酸酯。LCMS(Schimadzu 2020；ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA95:5至5:95A/B，2.00分钟，保持0.7分钟)：RT 2.99分钟，m/z(计算值)623.02，(实验值)645.35(M+Na)。
ATX-193-4的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的500-mL 3颈圆底烧瓶中添加1,9-双(十五烷-8-基)5-氧代壬二酸酯(18g，1.00当量)和THF/H2O(10:1，180mL)。随后在0℃下添加NaBH4(1.08g，1.00当量)。将所得溶液在室温下搅拌4小时。然后通过添加200mL的水/冰来淬灭反应。将所得溶液用3×300mL的乙酸乙酯萃取并且将有机层合并。将有机层经无水MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩。这产生17.3g(95％)呈浅黄色油的1,9-双(十五烷-8-基)5-羟基壬二酸酯。
ATX-193-6的合成
在25℃下向在N2下机械搅拌的1-L四颈圆底烧瓶中装入486mL的于THF(180mL)中的溴(庚基)镁(1mol/L)。在0℃下在30分钟内在搅拌下逐滴装入甲酸乙酯(18.00g，1.00当量)。将所得溶液在室温下搅拌15小时。然后通过添加500mL饱和NH4Cl水溶液来淬灭反应。将各相分离，并且将水层用2×500mL的乙酸乙酯萃取。然后将合并的有机层经无水MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩。使固体残余物在60mL的CH3CN中浆化。将固体通过过滤收集并真空干燥。这产生50g(78％)呈白色粉末的十五烷-8-醇。这因此用于下一反应步骤。
ATX-193的合成
在室温下向用氮气惰性气氛吹扫并维持的250-mL 3颈圆底烧瓶中放入1,9-双(十五烷-8-基)5-羟基壬二酸酯(17.3g，1.00当量)于DCM(180mL)中的溶液。在室温下添加4-(二甲基氨基)丁酸(5.58g，1.20当量)和DMAP(0.69g，0.20当量)，随后在0℃下分批添加EDCI(6.39g，1.20当量)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。然后通过添加300mL的HCl(1mol/L)来淬灭反应。将所得溶液用2×500mL的DCM萃取并且将有机层合并。将有机层用2×500mL盐水洗涤。将所得有机层在真空下浓缩并且将获得的40g粗产物吸附在80g硅胶上。将残余物在硅胶柱(800g，类型：ZCX-2，100-200目)上用DCM/ME纯化，梯度为100:0至90:10。将含有级分的产物在真空下浓缩。然后将产物溶解于庚烷(300mL，20V)中，然后将有机层用MeOH/H2O(3:1)300mL(20V)洗涤。将庚烷相在真空下浓缩。这产生10.5g(49％)呈无色油的1,9-双(十五烷-8-基)5-[[4-(二甲基氨基)丁酰基]氧基]壬二酸酯。ELSD A：水/0.05％TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，2.00分钟，保持0.7分钟)：RT 2.76分钟，m/z(计算值)737.6，(实验值)738.5(M+H)；H-NMR：(300MHz，氯仿-d，ppm)：δ4.881(h,3H),2.332(dt,8H),2.241(s,6H),1.812(m,2H),1.710–1.413(m,16H),1.282(s,40H),0.952–0.844(m,12H)。
实例2.ATX-200的合成
通用方案：
ATX-200-4的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的500-mL 4颈圆底烧瓶中放入甲基三苯基溴化鏻(4540.31mg，12.456mmol，1.60当量，98％)、THF(150.00mL，99％)。随后在0℃下在10分钟内分若干批次添加t-BuOK(1323.54mg，11.677mmol，1.50当量，99％)。在0℃下在20分钟内向其中添加于THF(25ml)中的1,9-双(十五烷-8-基)5-氧代壬二酸酯(5.00g，7.785mmol，1.00当量，97％)。将所得溶液在25℃下搅拌18小时。将所得混合物浓缩。将残余物施加到具有乙酸乙酯/石油醚(1:50)的硅胶柱上。这产生3.7g(75.00％)呈无色油的1,9-双(十五烷-8-基)5-亚甲基壬二酸酯。
ATX-200-5的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的100-mL 4颈圆底烧瓶中放入1,9-双(十五烷-8-基)5-亚甲基壬二酸酯(3.7g，5.779mmol，1.00当量，97％)、THF(3.70mL)。随后在18℃下在20分钟内在搅拌下滴加9-BBN(14.90mL，NaN mmol，1.25当量)。在将混合物在18℃下搅拌18小时之后，连续添加水(1mL)和3N NaOH(5mL)。然后，滴加30％ H2O2(10mL)，同时将温度维持在50℃以下。在室温下搅拌18小时之后，将所得溶液用2×50mL的乙酸乙酯萃取。将所得混合物用3×50mL的盐水洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥并浓缩。将残余物施加到具有乙酸乙酯/石油醚(1:20)的硅胶柱上。这产生2.6g(68.29％)呈白色油的1,9-双(十五烷-8-基)5-(羟基甲基)壬二酸酯。LCMS(Schimadzu 2020；ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％TFA95:5至5:95A/B，2.00分钟，保持0.7分钟)：RT 3.19分钟，m/z(计算值)638.5，(实验值)661.5(M+Na)。
ATX-200的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的100-mL 4颈圆底烧瓶中放入1,9-双(十五烷-8-基)5-(羟基甲基)壬二酸酯(2.60g，3.946mmol，1.00当量，97％)、THF(15.00mL)。随后在0℃下在10分钟内分若干批次添加4-(二甲基氨基)丁酸(633.88mg，4.736mmol，1.20当量，98％)。在0℃下在10分钟内向其中分若干批次添加EDCI(926.37mg，4.736mmol，1.20当量，98％)。在0℃下在10分钟内向混合物中分若干批次添加DMAP(98.39mg，0.789mmol，0.20当量，98％)。将所得溶液在18℃下搅拌18小时。将所得混合物浓缩。将残余物施加到具有乙基DCM:MeOH(30:1)的硅胶柱上。将粗产物通过快速-制备型HPLC在以下条件(IntelFlash-1)下纯化：柱，C18硅胶；流动相，2-丙醇:H2O＝60:40增加至2-丙醇:H2O＝80:20，在30内；蒸发光检测器，获得产物。然后将产物溶解于庚烷(30mL，20V)中，然后将有机层用MeOH/H2O(3:1)(20V)洗涤。将庚烷相在真空下浓缩。这产生1.5g(50.02％)浅黄色油的1,9-双(十五烷-8-基)5-([[4-(二甲基氨基)丁酰基]氧基]甲基)壬二酸酯。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，2.00分钟，保持0.7分钟)：RT 3.19分钟，m/z(计算值)751.67，(实验值)752.50(M+H)；H-NMR：(400MHz，氯仿-d，ppm)：4.847-4.909(m,2H),4.001-4.015(m,2H),2.241-2.380(m,14H),1.392–1.845(m,69H)。
实例3.ATX-201的合成
通用方案：
ATX-201-1的合成
在室温下向三颈圆底烧瓶中添加EtOH(25mL，5V)和ATX-201-SM(5g，1当量)并搅拌。在0℃下将6N NaOH(25mL，5V)缓慢添加到混合物中。将所得溶液在60℃下搅拌2小时，TLC指示ATX-201-SM的完全消耗。将盐水(10wt.％，50mL，10V)和DCM(50mL，10V)添加到混合物中并搅拌10分钟并进行相切，收集水相并用3N HCl将pH调节至3至4。将混合物用DCM(100mL，20V)萃取。将有机相用无水MgSO4干燥并且然后过滤。浓缩并在真空下干燥，得到呈浅黄色固体的ATX-205-1(3.2g，84.6％产率)。
ATX-201-2的合成
在室温下向三颈圆底烧瓶中添加DCM(100mL，10V)、ATX-201-1(3.2g，1当量)和乙烷-1,2-二硫醇(2.1g，1.2当量)。在0℃下将BF3·Et2O(2.5当量)缓慢添加到混合物中。将所得溶液在20℃下搅拌16小时，TLC指示ATX-201-1的完全消耗。将固体通过过滤收集。将固体在真空下干燥，得到呈浅黄色固体的ATX-201-2(4g，88％产率)。这因此用于下一反应。
ATX-201-3的合成
向三颈圆底烧瓶中连续添加DCM(80mL，20V)、ATX-201-2(4g，1.0当量)、ATX-193-6(8g，2.2当量)和DMAP(2g，1当量)。在0℃下将EDCI(6.7g，2.2当量)分批添加到反应混合物中。将所得溶液在20℃下搅拌16小时，TLC指示ATX-201-2的完全消耗。将反应系统用10％柠檬酸溶液(40mL，10V)淬灭。收集有机相，将有机相用10％柠檬酸溶液(40mL，10V)洗涤，并用盐水(40mL，10V)洗涤。将有机相用无水MgSO4干燥，并且然后过滤。将粗产物吸附在20g的硅胶上，并在100g硅胶柱(类型：ZCX-2，100-200目，8.00w./w.)上纯化，用PE/EA洗脱，梯度为100:0至99:1。将合格的级分合并，浓缩并在真空下干燥，得到呈无色油的ATX-201-3(8g，75％产率)。1H NMR(300MHz，氯仿-d)δ4.86(p,J＝6.2Hz,2H),3.26(s,4H),2.67–2.56(m,4H),2.30–2.15(m,4H),1.50(t,J＝6.3Hz,8H),1.28(d,J＝11.2Hz,41H),0.88(d,J＝6.3Hz,12H)。
ATX-201-4的合成
向三颈圆底烧瓶中连续添加丙酮(160mL，20V)、ATX-201-3(8g，1.0当量)。在0℃下将NBS(4.25g，2当量)分批添加到反应混合物中。将所得溶液在室温下搅拌2小时，TLC指示ATX-201-3的完全消耗。将溶剂在减压下去除。将粗产物吸附在20g硅胶上，并使用combi-flash系统在100g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，8.00w./w.)柱上纯化。将产物用PE/EA洗脱，梯度为100:0至97:3。将合格的产物合并并在真空下浓度，得到呈无色油的ATX-201-4(2.5g，35％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ4.84(p,J＝6.3Hz,2H),2.76(t,J＝6.7Hz,4H),2.59(t,J＝6.7Hz,4H),1.50(q,J＝6.4,6.0Hz,8H),1.31–1.21(m,40H),0.91–0.84(m,12H)。
ATX-201-5的合成
/>
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的500-mL 4颈圆底烧瓶中放入甲基三苯基溴化鏻(1.9g，1.6当量)、THF(75mL，30V)。随后在0℃下在10分钟内分若干批次添加t-BuOK(0.7g，1.5当量)。在0℃下在20分钟内向其中添加于THF(25ml)中的ATX-201-4(2.5g，1当量)。将所得溶液在25℃下搅拌18小时。将所得混合物浓缩。将产物吸附在5g的硅胶上，并通过用PE/EA洗脱，在Combi-Flash系统上的25g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，8.00w./w.)柱上纯化，梯度为100:0至99:1。将合格的产物合并，浓缩并在真空下干燥，得到呈无色油的ATX-201-5(1.9g，76％产率)。1H NMR(300MHz，氯仿-d)δ4.88(p,J＝6.2Hz,2H),4.78(s,2H),2.47(ddd,J＝8.5,6.2,1.8Hz,4H),2.37(dd,J＝8.6,5.9Hz,4H),1.53(s,8H),1.27(,40H),0.88(m,12H)。
ATX-201-6的合成
向三颈圆底烧瓶中连续添加ATX-201-5(1.9g，1当量)、THF(3.70mL)。随后在18℃下在20分钟内在搅拌下滴加0.5mol于THF(8mL，1.25当量)中的9-BBN。在将混合物在18℃下搅拌18小时之后，连续添加水(0.47mL，0.25V)和3N NaOH(2.8mL，1.5V)。然后，滴加30％H2O2(4.75ml，2.5V)，同时将温度维持在50℃以下。在室温下搅拌18小时之后，将所得溶液用2×20mL的乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用3×20mL的盐水洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥并过滤。将产物吸附在5g的硅胶上，并通过用PE洗脱，在Combi-Flash系统上的25g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，8.00w./w.)柱上纯化。将合格的产物合并，浓缩并在真空下干燥，得到呈无色油的ATX-201-6(1.4g，76％产率)。1H NMR(300MHz，氯仿-d)δ4.87(p,J＝6.3Hz,2H),4.12(q,J＝7.1Hz,1H),3.52(d,J＝4.8Hz,2H),2.40–2.27(m,4H),1.75–1.61(m,3H),1.51(d,J＝6.4Hz,9H),1.27(t,J＝3.7Hz,40H),1.23(m,40H),0.87(m,12H)。
ATX-201的合成
向三颈圆底烧瓶中连续添加DCM(28mL，20V)、ATX-201-6(1.4g，1.0当量)、4-(二甲基氨基)丁酸(380mg，1当量)和DMAP(168mg，0.6当量)。在0℃下将EDCI(526mg，1.2当量)分批添加到反应混合物中。将所得溶液在20℃下搅拌16小时，TLC指示4-(二甲基氨基)丁酸的完全消耗。将反应混合物用10％柠檬酸溶液(14mL，10V)淬灭。收集有机相并用10％柠檬酸溶液(14mL，10V)洗涤，并用盐水(14mL，10V)洗涤。将有机相用无水MgSO4干燥，并且然后过滤。将产物吸附在5g的硅胶上，并通过用DCM/MeOH洗脱，在Combi-Flash系统上的25g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，8.00w./w.)柱上纯化，梯度为100:0至95:5。将合格的产物合并，浓缩并在真空下干燥，得到呈浅黄色油的ATX-201(1.3g，78％产率)。ELSD A：水/0.05％TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，2.00分钟，保持0.7分钟)：RT 3.19分钟，m/z(计算值)723.6，(实验值)724.7 1H NMR(300MHz，氯仿-d)δ4.831(p,J＝6.2Hz,2H),4.013(d,J＝4.5Hz,2H),3.000–2.881(m,2H),2.70(s,6H),2.464(t,J＝6.7Hz,2H),2.310(t,J＝7.5Hz,4H),2.112(dq,J＝13.7,6.8Hz,2H),1.653(t,J＝7.2Hz,5H),1.492(d,J＝6.3Hz,8H),1.242(m,40H),0.910–0.762(m,12H)。
实例4.ATX-202的合成
通用方案：
ATX-202-5的合成
在0℃下向在N2下机械搅拌的250-mL四颈圆底烧瓶中装入5g于DCM(50mL)中的1,9-双(十五烷-8-基)5-羟基壬二酸酯。随后在0℃下在搅拌下滴加TEA(1.6g，2当量)和MsCl(1.35g，1.5当量)。将所得溶液在室温下搅拌5小时。然后通过添加100mL的H2O来淬灭反应。将各相分离，并且将水层用1×100mL的DCM萃取。然后将有机层合并；将溶剂经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。这产生4.8g(85％)二(十五烷-8-基)5-((甲基磺酰基)氧基)壬二酸酯。LCMS(Schimadzu 2020；ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，2.00分钟，保持0.7分钟)：RT 4.76分钟，m/z(计算值)703.12，(实验值)725.3(M+Na)。
ATX-202-6的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的100-mL 3颈圆底烧瓶中放入于DMF(48mL)中的1,9-双(十五烷-8-基)5-氧代壬二酸酯(4.8g，1.00当量)。随后在0℃下添加NaHS(2g，5.00当量)。将所得溶液在室温下搅拌5小时。然后通过添加200mL的水/冰来淬灭反应。将所得溶液用3×100mL的乙酸乙酯萃取并且将有机层合并。将混合物经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。这产生2.8g(64％)呈浅黄色油的二(十五烷-8-基)5-巯基壬二酸酯。LCMS(Schimadzu2020；ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，2.00分钟，保持0.7分钟)：RT 4.84分钟，m/z(计算值)640.5，(实验值)663.4(M+Na+H)。
ATX-202的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的100-mL 3颈圆底烧瓶中放入二(十五烷-8-基)5-巯基壬二酸酯(2.8g，1.00当量)于DCM(28mL)中的溶液。添加4-(二甲基氨基)丁酸(0.87g，1.20当量)、DMAP(0.1g，0.20当量)，随后在0℃下分批添加EDCI(0.95g，1.20当量)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。然后通过添加100mL的HCl(1mol/L)来淬灭反应。将所得溶液用2×100mL的DCM萃取并且将有机层合并。将所得混合物用2×100mL的盐水洗涤。将所得混合物在真空下浓缩并且获得6g粗产物。将产物溶解于30mL DCM中并且添加10g硅胶(类型：ZCX-2，100-200目)。将混合物在真空下浓缩。将残余物施加到具有DCM/ME的大气压硅胶柱(800g，类型：ZCX-2，100-200目)上，梯度为1/0至30/1，并且收集产物洗脱液(50/1-30/1)。将收集的产物相在真空下浓缩。然后将产物溶解于庚烷(30mL，20V)中，然后将有机层用MeOH/H2O(3:1)30mL(20V)洗涤。将庚烷相在真空下浓缩。这产生1.3g(45％)呈无色油的1,9-双(十五烷-8-基)5-[[4-(二甲基氨基)丁酰基]氧基]壬二酸酯。LCMS(Schimadzu 2020；ELSD A：水/0.05％TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA95:5至5:95A/B，2.00分钟，保持0.7分钟)：RT2.83分钟，m/z(计算值)754.25，(实验值)754.45(M)；1H-NMR(300MHz，氯仿-d，ppm)：δ4.83-4.87(m,2H),3.51-3.54(s,1H),2.55-2.60(m,2H),2.21-2.30(m,12H),1.40-1.91(m,19H),1.11-1.30(m,41H),1.28(s,40H),0.82–0.91(m,12H)。
实例5.ATX-209的合成
通用方案：
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ATX-209-1的合成
在室温下向三颈圆底烧瓶中添加DMSO(38mL，15V)、ATX-209-SM1(2.5g，1当量)和1((异氰甲基)磺酰基)-4-甲基苯(1g，0.5当量)。在0℃下向混合物中连续缓慢添加NaH(0.30g，1.2当量)和四丁基碘化铵(0.37g，0.1当量)。将所得溶液在60℃下搅拌2小时，TLC指示ATX-209-SM1的完全消耗。然后通过添加25mL的水来淬灭反应。将溶液用DCM(3×25mL)萃取。将有机相用2×25mL的饱和盐水洗涤。将有机相经无水硫酸镁干燥。将有机相用无水MgSO4干燥，并且然后过滤，浓缩并在真空下干燥，得到呈无色油的ATX-209-1(3.2g，60％产率)。LCMS(Schimadzu 2020；ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，2.00分钟，保持0.7分钟)：RT 0.84分钟，m/z(计算值)535.30，(实验值)558.20(M+Na)。
ATX-209-2的合成
在室温下向三颈圆底烧瓶中一次性添加DCM(30mL，10V)、ATX-209-1(3g，1当量)。在0℃下将HCl(6ml，2V)缓慢添加到混合物中。将所得溶液在0℃下搅拌2小时，TLC指示ATX-209-1的完全消耗。然后通过添加30mL的碳酸氢钠来淬灭反应。将有机相用2×30mL的饱和盐水洗涤。将有机相用无水MgSO4干燥，并且然后过滤。向滤液中添加5g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，2.00w./w.)，在真空下浓缩至无级分，同时将温度维持在35℃以下。向柱中装入25g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，8.00w./w.)，随后最后一步制备吸收反应混合物的干燥硅胶。使用combi-flash纯化产物。用DCM/MeOH(体积比)洗脱。(梯度为100:0至20:1，并且每100±50mL收集一次)。取样品进行TLC分析。将合格的产物合并。在真空下浓缩至干燥，得到呈白色固体的ATX-209-2(1.15g，80％产率)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ2.36(t,J＝7.2Hz,4H),2.16(t,J＝7.3Hz,4H),1.43(,8H),1.21–1.12(m,4H)。
ATX-209-3的合成
向三颈圆底烧瓶中连续添加DCM(20mL，20V)、ATX-209-2(1g，1.0当量)、ATX-209-5(1.71g，2.2当量)和DMAP(0.47g，1当量)。在0℃下将EDCI(1.63g，2.2当量)分批添加到反应混合物中。将所得溶液在20℃下搅拌16小时，TLC指示ATX-209-2的完全消耗。将反应系统用10％柠檬酸溶液(10mL，10V)淬灭。收集有机相，将有机相用10％柠檬酸溶液(10mL，10V)洗涤，并用盐水(10mL，10V)洗涤。将有机相用无水MgSO4干燥，并且然后过滤。向滤液中添加5g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，2.00w./w.)，在真空下浓缩至无级分，同时将温度维持在35℃以下。向柱中装入25g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，8.00w./w.)，随后最后一步制备吸收反应混合物的干燥硅胶。使用combi-flash纯化产物。用PE/EA(体积比)洗脱。(梯度为100:0至50:1，每20±10ml收集一次)。取样品进行TLC分析。将合格的产物合并。在真空下浓缩至干燥，得到呈无色油的ATX-209-3(1.68g，70％产率)。LCMS(Schimadzu 2020；ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，5.00分钟，保持0.7分钟)：RT 4.83分钟，m/z(计算值)622.55，(实验值)645.3(M+Na)。
ATX-209-4的合成
在室温下向100ml三颈烧瓶中添加MeOH(20ml，10V)、ATX-209-3(2g，1当量)。在0℃下将NaBH4(0.18g，1.5当量)分批添加到反应混合物中。将所得溶液在0℃下搅拌2小时，TLC指示ATX-209-3的完全消耗。然后通过添加20mL的水来淬灭反应。将系统用METB(2×10ml，10V)再次萃取。将有机相用无水MgSO4干燥，并且然后过滤。在真空下浓缩至干燥，得到呈无色油的ATX-209-3(1.5g，75％产率)。LCMS(Schimadzu 2020；ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，5.50分钟，保持0.7分钟)：RT 4.83分钟，m/z(计算值)624.57，(实验值)647.35(M+Na)。
ATX-209-5的合成
在25℃下向在N2下机械搅拌的100ml四颈圆底烧瓶中添加于THF(10mL)中的ATX-209-SM2(1mol/L，31ml)。在0℃下在搅拌下滴加甲酸乙酯(1g，1.00当量)。将所得溶液在室温下搅拌15小时。然后通过添加NH4Cl溶液(20mL，20V)来淬灭反应。将各相分离，并且将水层用乙酸乙酯(2×20mL)萃取。然后将有机层合并。将溶剂经无水硫酸钠干燥。过滤并在真空下浓缩。将残余物用6mL的ACN浆化。将固体通过过滤收集。这产生呈白色粉末的ATX-209-5(2g，74％产率)。
ATX-209的合成
向三颈圆底烧瓶中连续添加DCM(30mL，20V)、4-(二甲基氨基)丁酸(0.45g，1.1当量)、ATX-209-4(1.5g，1当量)和DMAP(0.29g，1当量)。在0℃下将EDCI(0.60g，1.3当量)分批添加到反应混合物中。将所得溶液在20℃下搅拌16小时，TLC指示ATX-209-4的完全消耗。将反应系统用10％柠檬酸溶液(15mL，10V)淬灭。收集有机相，将有机相用10％柠檬酸溶液(15mL，10V)洗涤，并用盐水(15mL，10V)洗涤。将有机相用无水MgSO4干燥，并且然后过滤。向滤液中添加5g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，2.00w./w.)，在真空下浓缩至无级分，同时将温度维持在35℃以下。向柱中装入25g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，8.00w./w.)，随后最后一步制备吸收反应混合物的干燥硅胶。使用combi-flash纯化产物。用PE/EA(体积比)洗脱。(梯度为100:0至50:1，每20±10ml收集一次)。取样品进行TLC分析。将合格的产物合并。在真空下浓缩至干燥，得到呈无色油的ATX-209(1.2g，75％产率)。ELSD A：水/0.05％TFA:B：CH3CN/0.05％TFA95:5至5:95A/B，5.50分钟，保持0.7分钟)：RT 4.83分钟，m/z(计算值)737.5，(实验值)738.3(M+H)；1H NMR(300MHz，氯仿-d)δ4.860(t,J＝6.2Hz,3H),2.370–2.201(m,14H),1.801(q,J＝7.4Hz,2H),1.611–1.470(m,16H),1.272(m,40H),0.920–0.821(m,12H)。
实例6.ATX-210的合成
通用方案：
ATX-210-4的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的1-L 3颈圆底烧瓶中放入5-氧代壬二酸(6g，1.00当量)、DCM(90mL)。随后添加十五烷-8-醇(6.77g，.0当量)、DMAP(0.72g，0.2当量)，在0℃下向其中添加EDCI(6.84g，1.2当量)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。然后通过添加75mL的HCl(1mol/L)来淬灭反应。将所得溶液用2×100ml的DCM萃取并且将有机层合并。将所得混合物用2×100ml的NaCl洗涤。将有机层在真空下浓缩。将产物溶解于60mL DCM中并且添加40g硅胶(类型：ZCX-2，100-200目)。将混合物在真空下浓缩。将残余物施加到具有MeOH/DCM的大气压硅胶柱(400g，类型：ZCX-2，100-200目)上，梯度为0/1至1/10，并且收集产物洗脱液(1/20-1/10)。将收集的产物相在真空下浓缩。这产生7.2g(58.8％)呈黄色油的ATX-210-4。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，2分钟，保持0.7分钟)：RT1.60分钟，m/z(计算值)412.32，(实验值)435.15(M+Na)。
ATX-210-5的合成
在25℃下向在N2下机械搅拌的1-L四颈圆底烧瓶中装入540mL的于THF(200mL)中的戊基溴化镁(1mol/L)。在0℃下在搅拌下逐滴装入甲酸乙酯(20.0g，1.0当量)。将所得溶液在室温下搅拌15小时。然后通过添加500mL的NH4Cl来淬灭反应。将各相分离，并且将水层用2×500mL的乙酸乙酯萃取。然后将有机层合并；将溶剂经无水硫酸钠干燥。过滤并在真空下浓缩。这产生38.9g(83.6％)呈黄色油的十一烷-6-醇。
ATX-210-6的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的1-L 3颈圆底烧瓶中放入ATX-210-4(7.2g，1.00当量)、DCM(108mL)。随后添加十一烷-6-醇(3.0g，1.0当量)、DMAP(0.43g，0.2当量)，在0℃下向其中添加EDCI(4.1g，1.2当量)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。然后通过添加75mL的HCl(1mol/L)来淬灭反应。将所得溶液用2×100ml的DCM萃取并且将有机层合并。将所得混合物用2×100ml的NaCl洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。这产生10g(99.9％)呈黄色油的ATX-210-6，并且无需进一步纯化直接用于下一步骤。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％TFA 95:5至5:95A/B，5分钟，保持0.7分钟)：RT 3.62分钟，m/z(计算值)566.49，(实验值)589.40(M+Na)。
ATX-210-7的合成
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向用氮气惰性气氛吹扫并维持的250-mL 3颈圆底烧瓶中放入ATX-210-6(10g，1.0当量)、THF/H2O(10:1，100mL)。随后在0℃下添加NaBH4(1.34g，2.0当量)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。然后通过添加100mL的水/冰来淬灭反应。将所得溶液用3×100mL的乙酸乙酯萃取并且将有机层合并。将所得混合物用2×100ml的NaCl洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥并且将有机层在真空下浓缩。将产物溶解于10mL DCM中并且添加40g硅胶(类型：ZCX-2，100-200目)。将混合物在真空下浓缩。将残余物施加到具有PE/EA的大气压硅胶柱(400g，类型：ZCX-2，100-200目)上，梯度为1/0至10/1，并且收集产物洗脱液(20/1-10/1)。将收集的产物相在真空下浓缩。这产生7.1g(70.7％)呈黄色油的ATX-210-7，并且无需进一步纯化直接用于下一步骤。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，5分钟，保持0.7分钟)：RT 3.64分钟，m/z(计算值)568.50，(实验值)591.35(M+Na)。
ATX-210的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的100-mL 3颈圆底烧瓶中放入ATX-210-7(3.3g，1.00当量)于DCM(50mL)中的溶液。添加4-(二甲基氨基)丁酸(1.16g，1.20当量)、DMAP(0.14g，0.20当量)，随后在0℃下分批添加EDCI(1.34g，1.20当量)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。然后通过添加50mL的NaHCO3(1mol/L)来淬灭反应。将所得溶液用3×50mL的DCM萃取并且将有机层合并。将所得混合物用2×50mL的盐水洗涤。将有机层在真空下浓缩。将产物溶解于5mL DCM中并且添加15g硅胶(类型：ZCX-2，100-200目)。将混合物在真空下浓缩。将残余物施加到具有PE/EA的大气压硅胶柱(150g，类型：ZCX-2，100-200目)上，梯度为1/0至10/1，并且收集产物洗脱液(20/1-10/1)。将收集的产物相在真空下浓缩。将产物溶解于庚烷(60mL，20V)中并且将庚烷相在真空下浓缩。这产生2.3g(60.0％)呈黄色油的ATX-210。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，2分钟，保持0.7分钟)：RT 1.84分钟，m/z(计算值)681.59，(实验值)682.40(M+H)；H-NMR-PH-ARC-LIPID-210-0：(300MHz，氯仿-d)：δ4.821-4.904(3H,m),2.235-2.357(8H,m),2.187-2.204(6H,s),1.571-1.831(16H,m),1.261(32H,s),0.855-0.899(12H,m)。
实例7.ATX-230的合成
通用方案：
ATX-230-1的合成
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向100mL三颈圆底烧瓶中添加于THF(50mL，20V)中的ATX-230-SM(2.5g，1.0当量)。在0℃下将NaH(560mg，60％于矿物油中，1.2当量)分若干份添加到反应混合物中并搅拌30分钟。在0℃下将苄基溴(2.4g，1.0当量)和碘化四正丁基铵(TBAI)(1.5g，0.1当量)添加到反应混合物中。将所得溶液在室温下搅拌2小时，HPLC指示ATX-230-SM的完全消耗。通过将冰水小心地添加到系统中并搅拌10分钟来淬灭反应。将有机溶剂在真空中蒸发并且将水相用DCM(2×25mL，20V)萃取。将有机溶剂在真空下浓缩。将残余物溶解于THF(25mL，10V)中，并且在室温下添加6mol/L HCl水溶液(25mL，10V)。将所得溶液在室温下搅拌30分钟。将溶液的pH值用NaHCO3水溶液调节至7至8。将所得溶液用乙基醚(2×25mL，20V)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥并且然后过滤。向滤液中装入8g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，3.20w./w.)，在真空下浓缩至无级分，同时将温度维持在20℃以下。向柱中装入40g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，16.00w./w.)，随后最后一步制备吸收反应混合物的干燥硅胶。使用combi-flash纯化产物。用PE/EA洗脱(体积比，梯度为100/0至95:5)。将产物级分在真空下浓缩，得到呈白色固体的ATX-230-1(1.5g，60％产率)。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 95:5至5:95A/B，2分钟，保持0.7分钟)：RT 0.79分钟，m/z(计算值)182.09，(实验值)205.10(M+Na)；H-NMR-PH-ARC-LIPID-230-1：(300MHz，氯仿-d)：δ7.40-7.29(5H,m),4.66(2H,s),3.83-3.71(4H,m),3.64-3.58(1H,m)。
ATX-230-2的合成
步骤1：在含有N2的干燥三颈烧瓶中，并且然后向十五烷-8-醇(150.0g，1.0当量)于DCM(3L，20V)中的溶液中一次性添加TEA(266.0g，4.0当量)，然后在0℃下添加溴乙酰溴(526.0g，4.0当量)。将反应在室温下搅拌3天并且通过在0℃下添加饱和NH4Cl水溶液(10L，66.7V)来淬灭。将粗化合物用DCM(10L*3，200V)萃取。将合并的有机级分用盐水(10L，66.7V)洗涤并且经无水MgSO4干燥并过滤。向滤液中添加500g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，3.33w./w.)，在真空下浓缩至无级分，同时将温度维持在35℃以下。向柱中装入2.5kg的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，16.67w./w.)，随后最后一步制备吸收反应混合物的干燥硅胶。使用combi-flash纯化产物。用PE/EA(体积比)洗脱。(梯度为100:0，每3±0.5L收集一次)。取样品进行TLC(PE:EA ＝8:1，Rf＝0.2)分析。将合格的级分合并并浓缩至干燥。ELSDA：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 80:20至20:80A/B，3分钟，保持0.98分钟)：RT0.98分钟，m/z(计算值)348.17，(实验值)390.30(M+Na+H2O)；H-NMR-PH-ARC-LIPID-230-4：(300MHz，氯仿-d)：δ5.01-4.87(1H,m),3.81(2H,s),1.57(4H,m),1.34(22H,m),0.88(6H,t)。
步骤2：向100mL三颈圆底烧瓶中添加于THF(30mL，20V)中的ATX-230-1(1.5g，1.0当量)。在0℃下将t-BuOK(1.38g，1.5当量)分批加入到反应混合物中并搅拌30分钟。在0℃下将ATX-230-4(4.3g，1.5当量)分批添加到反应混合物中。将所得溶液在室温下搅拌16小时。在室温下将另外的t-BuOK(1.38g，1.5当量)和ATX-230-4(4.3g，1.5当量)添加到反应混合物。将所得溶液在室温下搅拌16小时。LCMS指示ATX-230-1的完全消耗。然后通过添加氯化铵溶液(15mL，10V)来淬灭反应。将所得溶液用Et2O(2*30mL，40V)萃取。将有机层合并，用无水MgSO4干燥并且然后过滤。向滤液中装入3g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，2.00w./w.)，在真空下浓缩，同时将温度维持在20℃以下以吸附化合物。将材料使用PE/EA(体积比，梯度为100/0至95:5)在20g的Combi-flash硅胶柱上纯化以洗脱产物。将级分合并并在真空下干燥，得到呈黄色固体的ATX-230-2(2.1g，35.5％产率)。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 80:20至20:80A/B，3分钟，保持2.6分钟)：RT 2.62分钟，m/z(计算值)718.57，(实验值)741.50(M+Na)；H-NMR-PH-ARC-LIPID-230-2：(300MHz，氯仿-d)：δ7.39-7.27(5H,m),4.99-4.93(2H,m),4.52(2H,s),4.10(4H,s),3.99-3.68(m,5H),1.53(9H,m),1.49(42H,m),1.26-1.24(12H,t)。
ATX-230-3的合成
在室温下将于EA(21mL，10V)中的ATX-230-2(2.1g，1.0当量)和20％ Pd(OH)2/C(0.63g，30％wt)装入高压釜中。在氢气气氛(50atm)下在35℃下搅拌16小时。TLC显示ATX-230-2完全转化。将反应混合物过滤并在40℃下在真空下浓缩，得到呈白色固体的ATX-230-3(1.7g，95％产率)。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 80:20至20:80A/B，3分钟，保持2.6分钟)：RT 1.90分钟，m/z(计算值)628.53，(实验值)651.50(M+Na)；H-NMR-PH-ARC-LIPID-230-3：(300MHz，氯仿-d)：δ4.99-4.91(2H,dd),4.03(4H,s),3.67-3.37(4H,m),1.56-1.49(9H,m),1.29-1.25(40H,m),0.97-0.85(12H,t)。
ATX-230的合成
向100mL三颈圆底烧瓶中添加于DCM(34mL，20V)中的ATX-230-3(1.7g，1.0当量)、4(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(450mg，1.0当量)和DMAP(198mg，0.6当量)。在0℃下将EDCI(620mg，1.2当量)分若干批添加到反应混合物中。将所得溶液在20℃下搅拌16小时。将反应系统用10％柠檬酸水溶液(17mL，10V)淬灭并且收集有机相。将有机溶液用10％柠檬酸水溶液(17mL，10V)洗涤，随后用盐水(17mL，10V)洗涤。将有机相用无水MgSO4干燥并过滤。将混合物吸附在5g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，2.94w/w)上，并通过用DCM/MeOH洗脱，在combi-flash硅胶柱(40g)上纯化，梯度为100:0至98:2。将含有产物的级分合并并在真空下浓缩，得到1.2g(65％产率)呈浅黄色油的ATX-230。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 80:20至20:80A/B，3分钟，保持2.6分钟)：RT 0.96分钟，m/z(计算值)741.62，(实验值)742.6[M+1]+；H-NMR-PH-ARC-ATX-230-0：(400MHz,CDCl3,ppm)δ5.181(五重峰,J＝5.0Hz,1H),4.931(五重峰,J＝6.3Hz,2H),4.081(s,4H),3.830-3.700(m,4H),2.341(dt,J＝41.4,7.4Hz,4H),2.212(s,6H),1.800(五重峰,J＝7.4Hz,2H),1.530(d,J＝3.9Hz,8H),1.25(m,40H),0.900-0.830(m,12H)。
实例8.ATX-231的合成
通用方案：
ATX-231-1的合成
向1L三颈圆底烧瓶中添加于丙酮(500mL，10V)中的乙基ATX-231-SM1(50.0g，1.0当量)和碘化钠(180g，4.4当量)。将反应在室温下搅拌过夜。将反应混合物用水(400mL，8V)稀释并用乙醚(400mL，8V)萃取。将有机级分用水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤并将溶剂去除。将乙醇钠(10.8g，2.1当量)溶解于无水乙醇(90mL，2V)中。添加二羧酸二乙基丙酮酯(36.0g，1.12当量)并将溶液加热至回流。然后缓慢添加6-碘代己酸乙酯(24.0g，1.0当量)并将溶液回流一小时。添加乙醇钠(10.8g，2.1当量)于乙醇(90mL，2V)中的溶液，随后添加6-碘戊酸乙酯(24.0g，1.0当量)。将溶液回流过夜。将反应混合物冷却，用水(400mL，8V)稀释并用乙醚(400mL，8V)萃取。在真空下浓缩，得到47.5g(粗)呈黄色油的ATX-231-1。
ATX-231-2的合成
向100mL三颈圆底烧瓶中添加于柠檬酸(40mL，1V)和HCl(80mL，2V，12mol/L)中的ATX-231-1(40.0g，1.0当量)。将反应溶液回流过夜。将溶液冷却，用水稀释并用二氯甲烷萃取。将溶剂去除，并将残余物从丙酮重结晶并在真空下干燥，得到4g(14％)呈白色固体的ATX-231-2。ELSD A：水/5mM NH4HCO3：B：CH3CN 80:20至90:10A/B，2分钟：RT 0.16分钟，m/z(计算值)258.15，(实验值)257.30[M+1]+；H-NMR-PH-ARC-ATX-231-1：(400MHz,CDCl3,ppm)δ2.5-2.49(m,2H),2.42-2.32(m,2H),2.19-2.15(m,4H),2.00-1.98(m,8H),1.51-1.47(m,4H)。
ATX-231-3的合成
步骤1：
将DCM(300 ml，20 V)、ATX-209-5(15 g，1当量)和氯铬酸吡啶(PCC，40 g，2.5当量)添加到500 ml三颈烧瓶中。将所得溶液在室温下搅拌5小时。TLC观察指示ATX-209-5的完全转化。将溶剂通过在真空下蒸馏去除。将粗产物施加到硅胶柱上，并将产物用乙酸乙酯/石油醚(1:10)梯度洗脱，得到呈无色澄清油的ATX-231-8(13 g，88％产率)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ2.38(t,J＝7.3 Hz,4H),1.53–1.36(m,4H),1.34–1.15(m,12H),0.89–0.80(m,6H)。
步骤2：
在0℃下将THF(260 ml，20 V)和(甲氧基甲基)三苯基氯化磷(32 g，1.6当量)分批添加到500 ml三颈烧瓶中，随后将t-BuOK(11.8，1.6当量)添加到混合物中。在0℃下搅拌1小时。将ATX-231-8(13 g，1当量)添加到反应混合物中。在室温下搅拌15小时。将氯化铵水溶液(10wt％，260ml，20V)添加到系统中以淬灭。将MTBE(260ml，20V)添加到反应混合物中并进行萃取并且收集有机相。在浓缩有机相之后，将混合物施加到具有乙酸乙酯/石油醚(2:98)的硅胶柱上。得到呈油的ATX-231-7(10g，70％产率)。1H NMR(300MHz，氯仿-d)δ5.74(s,1H),3.51(s,3H),2.03(t,J＝7.3Hz,2H),1.88–1.81(m,2H),1.42–1.20(m,16H),0.93–0.83(m,6H)。
步骤3：
在室温下将THF(50ml，5V)、ATX-231-7(10g，1当量)和6N HCl(20ml，2V)添加到250ml三颈烧瓶中。在50℃下搅拌5小时。将3N NaOH(40ml，4V)和MTBE(100ml，10V)添加到反应混合物中并且将产物萃取到醚相中。收集醚相并在真空下浓缩，得到呈油的ATX-231-6(6.57g，71％产率)。1H NMR(300MHz，氯仿-d)δ9.49(d,J＝3.1Hz,1H),3.62(m,1H),1.22(m,20H),0.88–0.78(m,6H)。
步骤4：
在室温下将MeOH(65ml，10V)和ATX-231-6(6.57g，1当量)添加到100ml三颈烧瓶中。在0℃下将NaBH4(1.76，1.5当量)分批添加反应混合物中并在0℃下搅拌2小时。在0℃下将柠檬酸溶液(10wt％，65.7ml，10V)添加到反应混合物中。将产物萃取到甲基叔丁基醚(MTBE，65ml，10V)中，收集有机相并在真空下浓缩，得到呈油的ATX-231-5(5.2g，79％产率)。1H NMR(300MHz，氯仿-d)δ3.53(d,J＝5.4Hz,2H),3.48(s,1H),1.28(m,20H),0.93–0.83(m,6H)。
步骤5：向250mL三颈圆底烧瓶中添加于DCM(60mL，20V)中的ATX-231-2(3.0g，1.0当量)、ATX-231-5(4.97g，2.0当量)和DMAP(1.42g，1.0当量)。然后，在0℃下将EDCI(4.9g，2.2当量)分若干批添加到反应混合物中。将所得溶液在20℃下搅拌16小时，TLC指示ATX-231-2的完全消耗。将反应用10％柠檬酸水溶液(30mL，10V)淬灭。将分离的有机相用10％柠檬酸水溶液(30mL，10V)再洗涤一次，随后用盐水(30mL，10V)洗涤。将有机相用无水MgSO4干燥，并且然后过滤。将粗产物吸附在6g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，2.00w./w)上，并且使用石油醚/乙酸乙酯在30g的硅胶柱上纯化，梯度为100:0至98:2。将TLC分析后(10:1PE:EA)的合格的级分合并并在真空下浓缩至干燥，得到4g(53％产率)呈无色油的ATX-231-3。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 80:20至20:80A/B，3.5分钟)：RT 2.89分钟，m/z(计算值)650.58，(实验值)673.50(M+Na)；H-NMR-PH-ARC-LIPID-230-2：(300MHz，氯仿-d)：δ3.97-3.96(d,J＝2.4Hz,4H),2.45-2.43(m,4H),2.38-2.28(m,4H),1.66-1.60(9H,m),1.49(48H,m),0.86-0.88(12H,t)。
ATX-231-4的合成
在室温下向100mL三颈烧瓶中添加于MeOH(40mL，10V)中的ATX-231-3(4.0g，1当量)。然后，在0℃下将NaBH4(0.34g，1.5当量)分若干批添加到反应混合物中。将所得溶液在0℃下搅拌2小时。TLC分析指示ATX-231-3的完全消耗。通过加入水(40mL，10V)来淬灭反应。将产物用MTBE萃取两次(2×20ml，10V)。将有机相用无水MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩至干燥，得到3.4g(85％产率)呈无色油的ATX-231-4。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 80:20至20:80A/B，3.5分钟)：RT 3.03分钟，m/z(计算值)652.60，(实验值)675.50(M+Na)；H-NMR-PH-ARC-LIPID-230-2：(300MHz，氯仿-d)：δ4.00-3.98(d,J＝7.6Hz,4H),3.59-3.51(m,1H),2.35-2.30(m,4H),1.68-1.63(m,6H),1.55-1.29(m,55H),0.92-0.88(12H,t)。
ATX-231的合成
向100mL三颈圆底烧瓶中添加于DCM(60mL，30V)中的ATX-231-4(2.0g，1.0当量)、4-(二甲基-氨基)丁酸盐酸盐(0.81g，1.6当量)和DMAP(0.4g，1.1当量)。然后，在0℃下将EDCI(1.0g，1.7当量)分若干批添加到反应混合物中。将所得溶液在室温下搅拌16小时，TLC指示ATX-231-4的完全消耗。将反应用10％柠檬酸水溶液(20mL，10V)淬灭并且将有机相分离。将有机相用10％另外的柠檬酸水溶液(20mL，10V)洗涤，随后用盐水(20mL，10V)洗涤，用无水MgSO4干燥并过滤。将粗产物吸附在6g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，3.00w./w.)上，并且使用30g的硅胶柱在Combi-flash系统上纯化。将产物用100:0至98:2的石油醚乙酸乙酯梯度洗脱。分析级分(TLC，EA:PE＝1:10)，在真空下合并浓缩至干燥，得到1.5g(75％产率)呈浅黄色油的ATX-231。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 80:20至20:80A/B，3.5分钟)：RT 1.90分钟，m/z(计算值)766.25，实验值767.23(M+H)。1H-NMR-PH-ARC-ATX-231-0：(300MHz,CDCl3,ppm)δ4.892-4.851(m,1H),3.988-3.969(d,J＝5.8Hz,4H),2.957-2.905(t,J＝8.2Hz,2H),2.713(s,6H),2.445(t,J＝6.8Hz,2H),2.308(t,J＝7.4Hz,4H),2.117(五重峰,J＝6.9Hz,2H),1.650-1.521(m,10H),1.288(bs,48H),0.921-0.900(m,12H)。
实例9.ATX-232的合成
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通用方案：
ATX-232-4的合成：
步骤1：
在室温下向用氮气惰性气氛吹扫并维持的250mL 3颈圆底烧瓶中放入于Et2O(100mL，10V)中的ATX-232-SM3(10.0g，1.0当量)。随后在0℃下放入LiAlH4(1.48g，1.0当量)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。然后通过添加冰水(50mL，5V)来淬灭反应。将所得溶液用EA(3*200mL，60V)萃取并且将有机层合并。将有机层用盐水(2*100mL，20V)洗涤，并且用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。这产生7.0g(75％产率)呈黄色油的ATX-232-10。1HNMR(300MHz，氯仿-d)δ4.18-4.11(m,1H),3.57-3.55(d,J＝8Hz,2H),1.44-1.28(m,25H),0.93–0.85(m,6H)。
步骤2：
在室温下向用氮气惰性气氛吹扫并维持的250mL 3颈圆底烧瓶中放入ATX-210-4(5.0g，1.0当量)和DCM(75mL，15V)。随后在室温下添加ATX-232-10(2.91g，1.0当量)和DMAP(0.3g，0.2当量)，然后在0℃下添加EDCI(2.74g，1.2当量)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。然后通过添加1mol/L HCl水溶液(25mL，5V)来淬灭反应。将所得溶液用DCM(3*165mL，100V)萃取并且将有机层合并。将有机层用盐水(2*150mL，60V)洗涤，并且用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将粗混合物吸附在10g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，2.00w./w.)上，并通过用DCM/MeOH洗脱，在100g硅胶柱上纯化，梯度为100:0至90:10。在TLC分析后将级分合并(DCM:MeOH＝10:1)并在减压下浓缩，得到5.5g(72％产率)呈黄色油的ATX-232-4。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％ TFA 80:20至20:80A/B，3.5分钟)：RT 2.81分钟，m/z(计算值)636.57，(实验值)659.55(M+Na)；H-NMR-PH-ARC-LIPID-230-2：(300MHz，氯仿-d)：δ4.89-4.85(m,1H),3.99-3.97(d,J＝8Hz,2H),2.50-2.46(m,4H),2.36-2.29(m,4H),1.95-1.85(m,4H),1.52-1.51(6H,m),1.28(48H,m),0.91-0.84(m,12H)。
ATX-232-5的合成
在室温下向用氮气惰性气氛吹扫并维持的100mL 3颈圆底烧瓶中放入于THF/H2O(10/1，55mL，10V)中的ATX-232-4(5.5g，1.0当量)。随后在0℃下分若干批次添加NaBH4(0.88g，2.0当量)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。然后通过添加冰水(27.5mL，5V)来淬灭反应。将所得溶液用乙酸乙酯(3*90mL，50V)萃取并且将有机层合并。将有机层用盐水(2*110mL，40V)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将粗混合物吸附在11g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，2.00w./w.)上，并通过用DCM/MeOH洗脱，在60g硅胶柱上纯化，梯度为100:0至90:10。在TLC分析后将级分合并(DCM:MeOH＝10:1)并在减压下浓缩，得到5.1g(93％产率)呈黄色油的ATX-232-5。ELSD A：水/0.05％ TFA:B：CH3CN/0.05％TFA 80:20至20:80A/B，3.5分钟)：RT 2.81分钟，m/z(计算值)638.58，(实验值)661.55(M+Na)；H-NMR-PH-ARC-LIPID-230-2：(300MHz，氯仿-d)：δ4.93-4.83(m,1H),4.00-3.98(d,J＝8Hz,2H),3.66-3.62(m,12H),2.50-2.46(m,4H),2.64-2.69(m,4H),1.88-1.85(m,6H),1.95-1.85(m,4H),1.58-1.52(m,7H),1.47-1.44(m,44H),0.96-0.88(m,12H)。
ATX-232的合成
在室温下向用氮气惰性气氛吹扫并维持的100mL 3颈圆底烧瓶中放入于DCM(80mL，15V)中的ATX-232-5(5.1g，1.0当量)。随后在室温下添加ATX-232-7(1.6g，1.2当量)和DMAP(0.21g，0.2当量)，然后在0℃下添加EDCI(1.92g，1.2当量)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。然后通过添加冰水(25mL，5V)来淬灭反应。将所得溶液用DCM(3*80mL，50V)萃取并且将有机层合并。将有机层用盐水(2*100mL，40V)洗涤，并且用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将粗混合物吸附在11g的硅胶(类型：ZCX-2，100-200目，2.00w./w.)上，并通过用DCM/MeOH洗脱，在60g硅胶柱上纯化，梯度为100:0至90:10。在TLC分析后将级分合并(DCM:MeOH＝10:1)并在减压下浓缩，得到1.1g(18.3％产率)呈黄色油的ATX-232。LC-MS-PH-ARC-ATX-232-0：(ES,m/z):752[M+1]+；H-NMR-PH-ARC-ATX-232-0：(300MHz,CDCl3,ppm):δ4.997-4.858(m,2H),3.983(d,J＝5.7Hz,2H),2.386-2.261(m,6H),2.261(s,6H),1.823(五重峰,J＝7.2Hz,2H),1.799-1.512(m,13H),1.289(s,46H),0.922-0.882(m,12H)。
实例10.本发明的化合物的生物数据
进行各种测定以评估本公开的脂质的功效。以下是这些测定的描述。
因子VII敲低评估的方案
使用本实例的方案评价包括下文进一步描述的FVII siRNA的脂质调配物的敲低活性。在FVII评估中，七至八周龄的雌性Balb/C小鼠购自查尔斯河实验室(Charles RiverLaboratories)(加利福尼亚州霍利斯特(Hollister,CA))。将小鼠保持在无病原体的环境中，并且涉及小鼠的所有程序均根据机构动物护理和使用委员会(IACUC)建立的指南进行。含有因子VII siRNA的脂质纳米颗粒以10mL/kg和两个剂量水平(0.03mg/kg和0.01mg/kg)的给药体积静脉内施用。48小时后，用异氟烷麻醉小鼠，并且将血液逆轨道收集到涂覆有0.109M柠檬酸钠缓冲液(加利福尼亚州圣地亚哥的BD生物科学公司(BD Biosciences,SanDiego,CA))的管中并处理成血浆。立即测试血浆样本的因子VII水平或储存在-80℃下以供稍后分析。使用比色Biophen VII测定试剂盒(美国Aniara Diagnostica公司(Aniara Diagnostica，USA))测定血浆中FVII蛋白的测量。在405nm下测量吸光度，并且使用连续稀释的对照血浆生成校准曲线，以确定相对于盐水处理的对照动物，来自经处理的动物的血浆中因子VII的水平。
hEPO mRNA表达评估的方案
根据本实例的方案，评估包括以下hEPO mRNA的脂质调配物在体内表达hEPO的能力。所有动物实验均使用机构批准的方案(IACUC)进行。在本方案中，至少6至8周龄的雌性Balb/c小鼠购自查尔斯河实验室。通过尾静脉向小鼠静脉内注射具有两个剂量水平的hEPO(0.1mg/kg和0.03mg/kg)之一的hEPO-LNP。6小时后，用血清分离管收集血液，并通过离心分离血清。然后使用ELISA测定法(马里兰州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D Systems,Minneapolis,MD)人红细胞生成素Quantikine IVD ELISA试剂盒)测量血清hEPO水平。
小鼠血浆稳定性
通过将脂质溶解于浓度为5mg/mL的异丙醇中来制备脂质储备溶液。然后将所需体积的脂质-异丙醇溶液用50:50(v/v)乙醇/水稀释至100μM浓度，总体积为1.0mL。将十微升的这种100μM溶液掺入1.0mL的小鼠血浆(BioIVT公司(BioIVT)，目录号：MSE00PLNHUNN，CD-1小鼠，抗凝血剂:肝素钠，未过滤)中，将所述小鼠血浆预热至37℃并用磁力搅拌棒以50rpm搅拌。血浆中脂质的起始浓度因此为1μM。在时间点0、15、30、45、60和120分钟，从反应混合物中抽出0.1mL血浆，并且通过添加0.9mL的冰冷的4:1(v/v)乙腈/甲醇和添加的1μg/mL的选定的内标脂质来沉淀蛋白质。在通过0.45微米96孔过滤板过滤之后，通过LC-MS(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)的Vanquish UHPLC-LTQ XL线性离子阱质谱仪)；沃特世公司(Waters)XBridge BEH Shield RP18 2.5μm(2.1×100mm)柱和其匹配的保护柱分析滤液。流动相A是含0.1％甲酸的水，并且流动相B是含0.1％甲酸的1:1(v/v)乙腈/甲醇。流速为0.5分钟/分钟。洗脱梯度为：时间0-1分钟：10％ B；1-6分钟：10％-95％ B；6-8.5分钟：95％B；8.5-9分钟：95％-10％ B；9-10分钟：10％ B。质谱法处于600-1100m/z的正扫描模式。使用Xcalibur软件(赛默飞世尔公司)将脂质的分子离子的峰整合到萃取离子色谱法(XIC)中。在通过内标的峰面积归一化之后，与T＝0相比的相对峰面积用作每个时间点剩余的脂质的百分比。使用一阶衰减模型计算T1/2值。
体内可生物降解性测定
进行体内可生物降解性测定以评估LNP中脂质的可生物降解性。简而言之，向小鼠注射0.1或0.03mg/Kg剂量，并且在24或48小时之后收集小鼠肝脏。为了测量小鼠肝脏中脂质的浓度，将肝脏样品在适当缓冲液中以1-10稀释度均质化并与相同量的稳定血浆混合。然后将样品与掺入内标的有机溶剂混合以沉淀蛋白质。在离心之后，在通过LC-MS进行样品分析之前，用有机溶剂进一步稀释上清液。在LC-MS分析中，使用正电喷雾电离，并且设置多反应监测(MRM)参数以特异性地靶向脂质分析物和内标。在稳定血浆中制备校准标准品，并且在蛋白质沉淀之前与相同量的均质化缓冲液混合。在空白肝脏匀浆中制备具有已知量的脂质的质量控制样品，以监测测定的精度和准确度。
表1.生物测定数据
表2.半衰期和可降解性数据
化合物-10111如下所示，并且在WO 2021/030701的第243页中列出：
下表3示出了计算的LogD(cLogD)和计算的pKa(cpKa)，以及ATX化合物的括号值中测量的pKa。cLogD和cpKa值由ACD Labs公司(ACD Labs)结构设计器v12.0生成。
表3.cLogD和cpKa值
尽管为了清楚理解起见，已经通过图解和实例的方式对前述发明进行了一些详细的描述，但本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。另外，本文提供的每个参考文献均以全文引用的方式并入本文中，其程度与每个参考文献单独通过引用并入的程度相同。如果本申请与本文所提供的参考文献之间存在冲突，则应以本申请为准。

Claims (75)

1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1和R2各自独立地是(CH3(CH2)m)2CH-、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CH、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-2)CH、(CH3(CH2)m)2CHCH2-或(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CHCH2-，其中m是4-11；
L1和L2各自独立地不存在，是直链C1-5亚烷基或(CH2)p-O-(CH2)q，其中p和q各自独立地是1-3；
R3是任选地被一个或两个甲基基团取代的直链C2-5亚烷基；
R4和R5各自独立地是H或C1-6烷基；
X是O或S；并且
n是0-2。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1和R2各自独立地选自(CH3(CH2)m)2CH-和(CH3(CH2)m)2CHCH2-。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R1和R2各自独立地是(CH3(CH2)m)2CH-。
4.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R1和R2各自独立地是(CH3(CH2)m)2CHCH2-。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中R1和R2各自独立地选自(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CH、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-2)CH和(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CHCH2-。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是(CH3(CH2)m)2CH-或(CH3(CH2)m)2CHCH2-，并且R2选自(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CH、(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-2)CH和(CH3(CH2)m)(CH3(CH2)m-1)CHCH2-。
7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中m是4至8。
8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中m是5至7。
9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中m是5。
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中m是6。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中m是7。
12.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中L1和L2各自独立地是C2-5亚烷基或(CH2)p-O-(CH2)q。
13.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中L1和L2各自独立地是C2-5亚烷基。
14.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中L1和L2各自是丙烯。
15.根据权利要求1至11中任一项所述的化合物，其中L1和L2各自不存在。
16.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R3是C3-5亚烷基。
17.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R3是丙烯。
18.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R4和R5各自独立地是C1-6烷基。
19.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R4和R5各自是甲基。
20.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中n是0-1。
21.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中n是0。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的化合物，其中n是1。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的化合物，其选自由以下组成的组：
以及
或其药学上可接受的盐。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中所述化合物是ATX-193：
25.根据权利要求23所述的化合物，其中所述化合物是：
ATX-200：
26.根据权利要求23所述的化合物，其中所述化合物是ATX-201：
27.根据权利要求23所述的化合物，其中所述化合物是ATX-202：
28.根据权利要求23所述的化合物，其中所述化合物是ATX-209：
29.根据权利要求23所述的化合物，其中所述化合物是ATX-210：
30.根据权利要求23所述的化合物，其中所述化合物是ATX-230：
31.根据权利要求23所述的化合物，其中所述化合物是ATX-231：
32.根据权利要求23所述的化合物，其中所述化合物是ATX-232：
33.一种脂质组合物，其包括核酸和根据前述权利要求中任一项所述的化合物。
34.根据权利要求33所述的脂质组合物，其中所述核酸选自siRNA、mRNA、自我复制RNA、DNA质粒和反义寡核苷酸。
35.根据权利要求33或34所述的脂质组合物，其中所述核酸是包括编码所关注的治疗性蛋白的编码区的mRNA或自我复制RNA。
36.根据权利要求35所述的脂质组合物，其中所述所关注的治疗性蛋白是酶和抗体、抗原、受体或转运蛋白。
37.根据权利要求35或36所述的脂质组合物，其中所述所关注的治疗性蛋白是基因编辑酶。
38.根据权利要求37所述的脂质组合物，其中所述基因编辑酶选自TALEN、CRISPR、大范围核酸酶或锌指核酸酶。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的脂质组合物，其中所述脂质组合物包括脂质体、脂质体复合物或脂质纳米颗粒。
40.一种脂质纳米颗粒，其包括多个配体，其中每个配体独立地是根据权利要求1至32中任一项所述的化合物，其中所述多个配体自组装以形成包括内部和外部的所述脂质纳米颗粒。
41.根据权利要求40所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒的平均粒径小于约100nm。
42.根据权利要求40或41所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒的平均粒径是约55nm至约85nm。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒进一步包括包封在所述内部的核酸。
44.根据权利要求43所述的脂质纳米颗粒，其中所述核酸选自siRNA、mRNA、自我复制RNA、DNA质粒和反义寡核苷酸。
45.根据权利要求43或44所述的脂质纳米颗粒，其中所述核酸是包括编码所关注的治疗性蛋白的编码区的mRNA或自我复制RNA。
46.根据权利要求45所述的脂质纳米颗粒，其中所述所关注的治疗性蛋白是酶和抗体、抗原、受体或转运蛋白。
47.根据权利要求45或46所述的脂质纳米颗粒，其中所述所关注的治疗性蛋白是基因编辑酶。
48.根据权利要求47所述的脂质纳米颗粒，其中所述基因编辑酶选自TALEN、CRISPR、大范围核酸酶或锌指核酸酶。
49.根据权利要求40至48中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒进一步包括辅助脂质，所述辅助脂质选自：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和磷脂酰胆碱(PC)。
50.根据权利要求49所述的脂质纳米颗粒，其中所述辅助脂质是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
51.根据权利要求40至50中任一项所述的脂质纳米颗粒，其进一步包括胆固醇。
52.根据权利要求40至51中任一项所述的脂质纳米颗粒，其进一步包括聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
53.根据权利要求52所述的脂质纳米颗粒，其中PEG-脂质缀合物是PEG-DMG。
54.根据权利要求53所述的脂质纳米颗粒，其中所述PEG-DMG是PEG2000-DMG。
55.根据权利要求40至54中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包括约45mol％至65mol％的根据权利要求1至32中任一项所述的化合物、约2mol％至约15mol％的辅助脂质、约20mol％至约42mol％的胆固醇以及约0.5mol％至约3mol％的PEG-脂质缀合物。
56.根据权利要求55所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包括约50mol％至约61mol％的根据权利要求1至32中任一项所述的化合物、约5mol％至约9mol％的所述辅助脂质、约29mol％至约38mol％的胆固醇以及约1mol％至约2mol％的所述PEG-脂质缀合物。
57.根据权利要求55所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包括约56mol％至约58mol％的根据权利要求1至32中任一项所述的化合物、约6mol％至约8mol％的DSPC、约31mol％至约34mol％的胆固醇以及约1.25mol％至约1.75mol％的所述PEG-脂质缀合物。
58.根据权利要求43至48中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒的总脂质:核酸重量比为约50:1至约10:1。
59.根据权利要求58所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒的总脂质:核酸重量比为约40:1至约20:1。
60.根据权利要求58所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒的总脂质:核酸重量比为约35:1至约25:1。
61.根据权利要求58所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒的总脂质:核酸重量比为约32:1至约28:1。
62.根据权利要求58所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒的总脂质:核酸重量比为约31:1至约29:1。
63.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至32中任一项所述的化合物或根据权利要求40至62中任一项所述的脂质纳米颗粒，以及药学上可接受的赋形剂。
64.根据权利要求63所述的药物组合物，其中药物是冻干组合物。
65.根据权利要求63或64所述的药物组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括pH为约7.4的HEPES缓冲液。
66.根据权利要求65所述的药物组合物，其中所述HEPES缓冲液的浓度为约7mg/mL至约15mg/mL。
67.根据权利要求63至66中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质纳米颗粒进一步包括约2.0mg/mL至约4.0mg/mL的NaCl。
68.根据权利要求63至67中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒进一步包括一种或多种冷冻保护剂。
69.根据权利要求68所述的脂质纳米颗粒，其中所述一种或多种冷冻保护剂选自蔗糖、甘油或蔗糖和甘油的组合。
70.根据权利要求69所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包括浓度为约70mg/mL至约110mg/mL的蔗糖和浓度为约50mg/mL至约70mg/mL的甘油的组合。
71.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求40至62中任一项所述的脂质纳米颗粒或根据权利要求63所述的药物组合物。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述化合物或所述脂质纳米颗粒是静脉内或肌内施用的。
73.一种在靶细胞中表达蛋白质或多肽的方法，所述方法包括使所述靶细胞与根据权利要求40至62中任一项所述的脂质纳米颗粒或根据权利要求63所述的药物组合物接触。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是抗原，并且所述抗原的表达提供体内免疫原性应答。
75.一种将核酸递送至有需要的受试者的方法，所述方法包括：将治疗有效量的所述核酸包封在根据40至62中任一项所述的脂质纳米颗粒中；以及将所述脂质纳米颗粒施用于所述受试者。
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