CN116171150A - 冻干脂质纳米颗粒的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了制备冻干脂质纳米颗粒‑核酸组合物的方法。所述方法包括制备脂质纳米颗粒与单糖以及一种或多种选自硫代硫酸盐、山梨酸钾、苯甲酸钠和碘克沙醇的赋形剂的悬浮液。还提供了冻干脂质纳米颗粒‑核酸组合物及复溶和施用所述冻干脂质纳米颗粒‑核酸组合物的方法。

Description

冻干脂质纳米颗粒的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年8月14日提交的美国临时申请号63/066,051和于2021年3月9日提交的美国临时申请号63/158,761的优先权权益，所述申请的内容以引用的方式并入本文。
背景技术
技术领域
本公开涉及药物制造和产品领域。更具体地，本公开涉及脂质纳米颗粒包封的核酸组合物和用于制备冻干脂质纳米颗粒核酸产品的方法。
背景技术
基于将核酸在细胞内递送至靶细胞的疗法面临细胞外和细胞内屏障。事实上，由于裸核酸材料的毒性、血清稳定性低、肾脏清除速度快、靶细胞摄取减少、吞噬细胞摄取及其引发免疫反应的倾向，很难全身施用裸核酸材料，所有这些特征都阻碍了它们的临床开发。当外源性核酸物质进入人体生物系统时，它会被网状内皮系统(RES)识别为外来病原体，并在有机会遇到血管系统内外的靶细胞之前从血液循环中清除。据报道，裸核酸在血流中的半衰期约为几分钟(Kawabata K,Takakura Y,Hashida MPharm Res.1995Jun；12(6):825-30)。化学修饰和适当的递送方法可以减少RES的摄取并保护核酸免受无处不在的核酸酶的降解，从而提高基于核酸的疗法的稳定性和功效。此外，RNA或DNA是阴离子亲水聚合物，这不利于细胞摄取，细胞表面也是阴离子的。因此，基于核酸的疗法的成功在很大程度上取决于能够高效且有效地将遗传物质递送至靶细胞并在体内获得足够的表达水平且毒性最小的媒介物或载体的开发。
虽然一些基因疗法已经能够成功地利用病毒递送载体(例如，AAV)，但基于脂质的制剂由于其生物相容性和大规模生产的便利而越来越被认为是最有前途的RNA和其他核酸化合物递送系统之一。基于脂质的核酸疗法最重要的进展之一发生在2018年8月，当时Patisiran(ALN-TTR02)是第一个获得美国食品药品监督管理局(FDA)和欧盟委员会(EC)批准的siRNA治疗剂。ALN-TTR02是一种基于所谓的稳定核酸脂质颗粒(SNALP)转染技术的siRNA制剂。尽管Patisiran取得了成功，但经由脂质纳米颗粒递送核酸治疗剂仍在开发中。
一些本领域公认的用于核酸治疗剂的脂质配制的递送媒介物包括基于聚合物的载剂，诸如聚乙烯亚胺(PEI)、脂质纳米颗粒和脂质体、纳米脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体、多泡脂质体、蛋白脂质体、天然和合成衍生的外来体、天然、合成和半合成层状体、纳米粒子、胶束和乳液。其中，脂质纳米颗粒已显示出作为RNA治疗剂的潜在递送媒介物的巨大前景，但是脂质纳米颗粒递送技术的使用面临其稳定性问题，并且在一些情况下需要将脂质纳米颗粒的悬浮液储存在约-70℃的低温下，而这是不切实际的，并且仅在预期施用之前不久解冻。这些要求可能会限制患者可在自己家中使用的药物的开发，以及脂质纳米颗粒治疗剂在世界偏远和欠发达区域运输和储存，所有这些地区都缺乏合适的脂质纳米颗粒悬浮液储存设备。
一种改善脂质纳米颗粒制剂储存能力的解决方案是将脂质纳米颗粒制剂制造为冻干产品，随后可以在施用之前复溶。冻干脂质纳米颗粒组合物可以在更切合实际的温度下储存，允许更方便的分配和施用方式。
尽管冻干技术已经存在了几十年，但这些技术的应用并不能很好地转化为脂质纳米颗粒制剂，在常规冻干技术之后复溶后它们失去了一些所需的性质，包括低多分散性、小粒径、高包封率和体内功效。因此，需要新的解决方案来提供在复溶后显示出保持的完整性和功效的冻干脂质纳米颗粒组合物。
发明内容
本公开提供了导致保存脂质纳米颗粒完整性、包封核酸的完整性、脂质纳米颗粒的粒径在冻干前粒径的可接受范围内以及纳米颗粒的良好多分散性的冻干方法。这些方法源于这样一个发现，即在使悬浮液经受冻干过程之前，可以将专门的赋形剂添加到预处理纳米颗粒悬浮液中。此外，冻干参数与这些赋形剂组合使用以获得高质量冻干脂质纳米颗粒产品。冻干产品易于复溶并容易作为药物制备剂施用。
在一些实施方案中，提供了一种冻干包含包封RNA的脂质纳米颗粒的组合物的方法，其包括以下步骤：提供脂质纳米颗粒在液体介质中的悬浮液，调节液体介质从而形成包含至少一种选自山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和碘克沙醇的赋形剂的预处理的悬浮液；以及使预处理的悬浮液经受冻干过程。
在另一个实施方案中，提供了一种冻干组合物，其包含包封核酸的脂质纳米颗粒以及一种或多种选自山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和碘克沙醇的赋形剂。
在另一个实施方案中，提供了一种保存本公开的冻干组合物的方法，其包括在约-20℃至约8℃的温度下储存冻干产品。在一些实施方案中，提供了一种保存本公开的冻干组合物的方法，其包括在约-20℃至约25℃的温度下储存冻干产品。在一些实施方案中，冻干产品在约-20℃下储存。在一些实施方案中，冻干产品在约2℃至约8℃储存。在一些实施方案中，冻干产品在约20℃至约25℃储存。
在另一个实施方案中，提供了一种复溶本公开的冻干组合物的方法，其包括将液体介质添加到冻干组合物中。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用在液体介质中复溶的本公开的冻干组合物。
主题技术的其他特征和优点将在下面的说明中阐述，并且部分将根据说明显而易见，或者可以通过实践主题技术获知。主题技术的优点将通过本文的书面说明和实施方案来实现和获得。
应当理解，以上概述和以下详述都是示例性和解释性的，并且意在提供主题技术的进一步解释。
附图说明
图1示出了根据实施例3中描述的实验制备的复溶脂质纳米颗粒的表征(粒径(PS)、多分散性(PDI)和包封百分比(Encap(％))，制剂以1mg RNA/mL的浓度制备。
图2A示出了如实施例3中所述使用P188泊洛沙姆制备的制剂的粒径测量值(条形图)和包封百分比(圆圈)，在冻干前将所述P188泊洛沙姆添加到悬浮液中。
图2B示出了如实施例3中所述使用P188泊洛沙姆制备的制剂的粒径测量值(条形图)和包封百分比(圆圈)，在冻干后将所述P188泊洛沙姆添加到制剂中。
图3示出了如实施例3中所述粒径(条形图)和包封百分比(圆圈)对脂质纳米颗粒浓度(0.25、0.5和1.0mg RNA/mL)的浓度依赖性，P188制剂以不同浓度的P188在冻干后处理。
图4示出了如实施例12中所述与冷冻-解冻对照和PBS阴性对照相比，所选复溶制剂的人促红细胞生成素(hEPO)表达水平。
具体实施方式
应了解，本领域的技术人员将从本公开容易明白主题技术的各种配置，其中通过图示示出且描述了主题技术的各种配置。如将认识到，主题技术可具有其它且不同配置的能力，且其若干细节可具有在各个其它方面的修改的能力，全部这些不脱离主题技术的范围。因此，发明内容、附图和具体实施方式应视为在本质上是说明性的且不应视为是限制性的。
下文阐述的具体实施方式旨在作为主题技术的各种配置的说明，且并非旨在表示可实行主题技术的唯一配置。具体实施方式包括用于提供对主题技术的全面了解目的的特定细节。然而，对本领域的技术人员将是显而易见的是，可在没有这些具体细节的情况下实践主题技术。
在一些实施方案中，提供了一种冻干包含包封RNA的脂质纳米颗粒的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：a.)提供脂质纳米颗粒在液体介质中的悬浮液，其中所述液体介质包含约4％w/v至约22％w/v的糖类；以及b.)调节液体介质从而形成包含至少一种选自山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和碘克沙醇的赋形剂的预处理的悬浮液。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤(c)：使预处理的悬浮液经受冻干过程，其包括：i.)在-48±8℃的温度和大气压下进行的初始冷冻步骤；ii.)在-20±2℃至-48±2℃范围内的温度和在约25毫托至约100毫托范围内的压力下进行的初次干燥步骤；iii.)在5±2℃至30±2℃范围内的温度和在约30毫托至约300毫托范围内的压力下进行的二次干燥步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤(c)：使预处理的悬浮液经受冻干过程，其包括：i.)在-48±8℃的温度和大气压下进行的初始冷冻步骤；ii.)在约0.03至约0.08毫巴的压力下进行并在-48±8℃的温度下开始并在约40至约75小时范围内的时间段内升温至0±2℃的温度的初次干燥步骤；以及iii.)在约0.03至约0.08毫巴的压力下进行并在0±2℃的温度下开始并在约30至约50小时范围内的时间段内升温至约25±3℃的温度的二次干燥步骤。
在一些实施方案中，液体介质是水性介质。
在一些实施方案中，悬浮液中的RNA具有在约0.05mg/mL至约2.0mg/mL范围内的浓度。在一些实施方案中，悬浮液中的RNA具有在约0.075mg/mL至约0.3mg/mL范围内的浓度。在一些实施方案中，悬浮液中的RNA具有在约0.1mg/mL至约1.5mg/mL范围内的浓度。在一些实施方案中，悬浮液中的RNA具有在约0.1mg/mL至约1.0mg/mL范围内的浓度。在一些实施方案中，悬浮液中的RNA具有在约0.1mg/mL至约0.5mg/mL范围内的浓度。
在一些实施方案中，悬浮液中总脂质与RNA的重量比为约50:1至约10:1。在一些实施方案中，悬浮液中总脂质与RNA的重量比为约40:1至约20:1。在一些实施方案中，悬浮液中总脂质与RNA的重量比为约35:1至约25:1。
在一些实施方案中，预处理的悬浮液包含硫代硫酸盐。在一些实施方案中，硫代硫酸盐是硫代硫酸钠或硫代硫酸钾。在一些实施方案中，硫代硫酸盐具有约0.025％w/v至约1.0％w/v的浓度。在一些实施方案中，硫代硫酸盐具有约0.025％w/v至约0.75％w/v的浓度。在一些实施方案中，硫代硫酸盐具有约0.025％w/v至约0.5％w/v的浓度。在一些实施方案中，硫代硫酸盐具有约0.05％w/v至约0.3％w/v的浓度。在一些实施方案中，硫代硫酸盐具有约0.05％w/v至约0.25％w/v的浓度。
在一些实施方案中，预处理的悬浮液包含山梨酸钾。在一些实施方案中，山梨酸钾具有约0.01M至约0.5M的浓度。在一些实施方案中，山梨酸钾具有约0.02M至约0.4M的浓度。在一些实施方案中，山梨酸钾具有约0.025M至约0.3M的浓度。在一些实施方案中，山梨酸钾具有约0.03M至约0.2M的浓度。在一些实施方案中，山梨酸钾具有约0.035M至约0.1M的浓度。在一些实施方案中，山梨酸钾具有约0.04M至约0.08M的浓度。在一些实施方案中，山梨酸钾具有约0.01M至约0.05M的浓度。在一些实施方案中，山梨酸钾具有约0.02M至约0.04M的浓度。
在一些实施方案中，预处理的悬浮液包含碘克沙醇。在一些实施方案中，碘克沙醇具有约5％w/v至约15％w/v的浓度。在一些实施方案中，碘克沙醇具有约6％w/v至约13％w/v的浓度。在一些实施方案中，碘克沙醇具有约7％w/v至约11％w/v的浓度。在一些实施方案中，碘克沙醇具有约8％w/v至约10％w/v的浓度。
在一些实施方案中，预处理的悬浮液包含苯甲酸钠。在一些实施方案中，苯甲酸钠具有约0.01M至约0.6M的浓度。在一些实施方案中，苯甲酸钠具有约0.02M至约0.5M的浓度。在一些实施方案中，苯甲酸钠具有约0.03M至约0.4M的浓度。在一些实施方案中，苯甲酸钠具有约0.04M至约0.3M的浓度。在一些实施方案中，苯甲酸钠具有约0.05M至约0.2M的浓度。
在上文实施方案中的任一者的一些方面，预处理的悬浮液还包含聚乙烯醇(PVA)。在一些实施方案中，PVA具有约0.01％w/v至约0.75％w/v的浓度。
在上文实施方案中的任一者的一些方面，预处理的悬浮液还包含NaCl。在一些实施方案中，NaCl具有约0.005M至约0.5M的浓度。在一些实施方案中，NaCl具有约0.01M至约0.4M的浓度。在一些实施方案中，NaCl具有约0.015M至约0.3M的浓度。在一些实施方案中，NaCl具有约0.015M至约0.2M的浓度。在一些实施方案中，NaCl具有约0.015M至约0.1M的浓度。在一些实施方案中，NaCl具有约0.02M至约0.05M的浓度。在一些实施方案中，NaCl具有约0.03M至约0.07M的浓度。
在上文实施方案中的任一者的一些方面，糖类是蔗糖。在一些实施方案中，糖类具有约8％w/v至约20％w/v的浓度。在一些实施方案中，糖类具有约7％w/v至约11％w/v的浓度。在一些实施方案中，糖类具有约8％w/v至约10％w/v的浓度。在一些实施方案中，糖类具有约16％w/v至约20％w/v的浓度。
在上文实施方案中的任一者的一些方面，液体介质或预处理的悬浮液包含缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液选自MOPS、HEPES、TRIS、MES、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些实施方案中，缓冲液是TRIS。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约10mM至约100mM。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约15mM至约75mM。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约10mM至约40mM。
在上文实施方案中的任一者的一些方面，液体介质或预处理的悬浮液具有约7.0至约8.5的pH。
在上文实施方案中的任一者的一些方面，所述方法还包括在步骤(b)之后，将预定冻干体积的预处理的悬浮液等分到单独的容器中。在一些实施方案中，预定冻干体积在约0.5mL至约10.0mL的范围内。在一些实施方案中，预定冻干体积在约1.0mL至约3.0mL的范围内。
在上文实施方案中的任一者的一些方面，预处理的悬浮液还包含泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些实施方案中，泊洛沙姆的浓度为约0.01％w/v至约0.10％w/v。在一些实施方案中，泊洛沙姆的浓度为约0.02％w/v至约0.8％w/v。在一些实施方案中，泊洛沙姆的浓度为约0.03％w/v至约0.7％w/v。在一些实施方案中，泊洛沙姆的浓度为约0.04％w/v至约0.06％w/v。
在一些实施方案中，提供了通过本文所述的方法制备的产品。
在一些实施方案中，提供了一种冻干组合物，其包含包封核酸的脂质纳米颗粒、单糖以及一种或多种选自山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和碘克沙醇的赋形剂。
在一些实施方案中，核酸是RNA。在一些实施方案中，RNA是自我复制RNA。在一些实施方案中，RNA是mRNA。在一些实施方案中，核酸的长度为约20个核苷酸至约13000个核苷酸。
在一些实施方案中，冻干组合物中总脂质与核酸的重量比为约50:1至约10:1。在一些实施方案中，冻干组合物中总脂质与RNA的重量比为约40:1至约20:1。在一些实施方案中，冻干组合物中总脂质与RNA的重量比为约35:1至约25:1。
在冻干组合物的上文实施方案中的任一者的一些方面，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与RNA的重量比为约30:1至约250:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与RNA的重量比为约40:1至约200:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与RNA的重量比为约50:1至约175:1。
在冻干组合物的上文实施方案中的任一者的一些方面，冻干组合物包含硫代硫酸钠，硫代硫酸钠与RNA的重量比为约0.25:1至约40:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含硫代硫酸钠，硫代硫酸钠与RNA的重量比为约2:1至约10:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含硫代硫酸钠，硫代硫酸钠与RNA的重量比为约3:1至约8:1。
在冻干组合物的上文实施方案中的任一者的一些方面，冻干组合物包含苯甲酸钠，苯甲酸钠与RNA的重量比为约1:1至约12:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含苯甲酸钠，苯甲酸钠与RNA的重量比为约2:1至约10:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含苯甲酸钠，苯甲酸钠与RNA的重量比为约3:1至约9:1。
在冻干组合物的上文实施方案中的任一者的一些方面，冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与RNA的重量比为约100:1至约800:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与RNA的重量比为约150:1至约750:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与RNA的重量比为约200:1至约700:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与RNA的重量比为约250:1至约650:1。
在冻干组合物的上文实施方案中的任一者的一些方面，冻干组合物还包含聚乙烯醇(PVA)，PVA与RNA的重量比为约1:1至约12:1。
在冻干组合物的上文实施方案中的任一者的一些方面，糖类是蔗糖，蔗糖与RNA的重量比为约100:1至约800:1。
在冻干组合物的上文实施方案中的任一者的一些方面，冻干组合物还包含选自HEPES、MOPS、TRIS、MERS、柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲液，缓冲液与RNA的重量比为约3:1至约150:1。
在另一个实施方案中，提供了一种冻干组合物，其包含包封RNA的脂质纳米颗粒、泊洛沙姆、山梨酸钾和糖。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.001至约1.0％w/w的RNA。在一些实施方案中，RNA是mRNA。在一些实施方案中，RNA是自我复制RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.005至约0.8％w/w的RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.01至约0.5％w/w的RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.02至约0.4％w/w的RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.03至约0.3％w/w的RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.04至约0.2％w/w的RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.5至约5.0％w/w的脂质。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.0至约4.0％w/w的脂质。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.25至约3.0％w/w的脂质。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.5至约2.5％w/w的TRIS缓冲液。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.75至约2.25％w/w的TRIS缓冲液。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.0至约2.0％w/w的TRIS缓冲液。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.75至约2.75％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.0至约2.5％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.25至约1.80％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约85至约96％w/w的糖。在一些实施方案中，冻干组合物包含约88至约95％w/w的糖。在一些实施方案中，冻干组合物包含约90至约95％w/w的糖。在一些实施方案中，糖是蔗糖。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.01至约1.0％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.02至约0.8％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.03至约0.7％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.04至约0.6％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.05至约0.5％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.06至约0.4％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.07至约0.3％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.09至约0.2％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.5至约5.0％w/w的山梨酸钾。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.75至约4.0％w/w的山梨酸钾。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.0至约3.0％w/w的山梨酸钾。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.25至约2.75％w/w的山梨酸钾。
在一些实施方案中，提供了一种保存冻干组合物的方法，其包括在约2℃至约8℃的温度下储存本文所述的冻干产品。在一些实施方案中，所述方法包括在约-20℃的温度下储存冻干产品。
在一些实施方案中，提供了一种复溶冻干组合物的方法，其包括将液体介质添加到本文所述的冻干组合物中。在一些实施方案中，液体介质是水性介质。在一些实施方案中，液体介质包含泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是P-188。在一些实施方案中，液体介质还包含具有约7.0至约8.5的pH的缓冲液。
在一些实施方案中，提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用在液体介质中复溶的本文所述的冻干组合物。在一些实施方案中，复溶冻干组合物是静脉内施用的。在一些实施方案中，复溶冻干组合物是肌内施用的。在一些实施方案中，复溶冻干组合物是经由吸入施用的。在一些实施方案中，复溶冻干组合物是粘膜施用的。在一些实施方案中，复溶冻干组合物是皮下施用的。
冻干
冻干技术也称为冷冻-干燥或冷冻干燥，它基于升华的物理原理，即固体材料直接转变为气态的过程。因此，冻干及其操作所依据的升华原理与更常见的直接蒸发干燥技术形成了直接对比，在直接蒸发干燥技术中，液体材料转变为气体。冻干中使用的基本步骤和技术在本领域中是众所周知的。(参见Rey,Louis,编辑Freeze-drying/lyophili zationof pharmaceutical and biological products.CRC Press,2016；和Nireesha,G.R.,等人Int.j.novel trends in pharm.sci.3.4(2013):87-98)。下面提供了简要概述。
冻干是一个多阶段操作，其中每个步骤都是关键的。影响此过程结果的主要参数对于被冻干材料的类型可能具有高度特异性，因此可能需要严格控制才能获得优质产品。必须考虑的一些参数包括：材料，例如，必须保持其所需性质和活性的被冻干的物质；周围介质及其组分，诸如填充剂、稳定剂、乳化剂、抗氧化剂、冷冻保护剂、冻干保护剂和水分缓冲剂；使用的设备，必须根据不同处理产品的具体要求和低温性状进行调整的过程；以及冷冻-干燥循环。
冷冻-干燥循环
关于冷冻-干燥循环，明确的是冷冻-干燥操作包括：i)材料的制备；ii)冷冻步骤；iii)升华阶段或初次干燥步骤；以及iv)解吸阶段或二次干燥步骤。在这些步骤之后，冻干产品通常会经历进一步加工以准备好储存。
材料的制备/预处理
待加工材料(固体、液体、糊状物、乳液)的制备包括调整材料存在于其中的基质(例如溶液或悬浮液)以及材料存在于其中的液体介质、pH、张力、其他根据需要添加的赋形剂，所有这些操作同时确保不妨碍材料的基本性质。然后将预处理的材料等分到预定体积中以供优化冻干。等分试样可以分配到单独的容器中，诸如小瓶。
在本文提供的冻干方法的一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(c)之前，将预定冻干体积的预处理的悬浮液等分到单独的容器中。在一些实施方案中，单独的容器是小瓶。在一些实施方案中，预定冻干体积在约0.5mL至约5.0mL的范围内。在一些实施方案中，预定冻干体积在约1.0mL至约4.0mL的范围内。
冷冻步骤
在冷冻步骤中，通过使材料经受低温而硬化。在这个非常关键的时期，所有存在的流体都会变成固体，无论是结晶体、无定形体还是玻璃。在水的情况下，这通常会产生复杂的冰网络，但它也可能嵌入玻璃状结构或者或多或少地牢牢固定在间隙结构内。其他液体和溶剂将具有特定的冷冻性质。溶质可能会浓缩甚至结晶出来。同时，水冷冻时系统的体积膨胀可能会引起强大的机械应力，机械应力与间质液浓度增加引起的渗透性冲击组合。
升华阶段/初次干燥
当置于真空下的冷冻材料逐渐加热以递送足够的能量供冰升华时，将进入升华阶段或初次干燥。在此关键时期，必须在热输入(传热)与水升华(传质)之间调整正确的平衡，以便干燥可以进行，而不会在冷冻材料中引起不良反应，诸如回熔、膨胀或塌陷。然后需要对操作压力进行连续且精确的调整，以将热输入与冷冻材料的蒸发可能性联系起来。
解吸阶段/二次干燥
当冰被蒸馏掉并且更高的真空允许在零温度以上逐步提取结合水时，解吸阶段或二次干燥开始。此操作必须小心进行，因为过度干燥可能与干燥不足一样糟糕，并导致不希望的干燥结构、变性或不适合复溶的产品。对于每种产品，必须在给定的温度和压力下达到适当的残留水分。
脂质纳米颗粒制剂的冻干
在一些实施方案中，提供了一种冻干包含包封RNA的脂质纳米颗粒的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：a.)提供脂质纳米颗粒在液体介质中的悬浮液；以及b.)调节液体介质从而形成包含至少一种选自山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和碘克沙醇的赋形剂的预处理的悬浮液。在一些实施方案中，所述方法还包括步骤c.)：使预处理的悬浮液经受冻干过程，其包括：i.)在-52±6℃的温度和大气压下进行的初始冷冻步骤；ii.)在-25±2℃至-48±2℃范围内的温度和在约25毫托至约75毫托范围内的压力下进行的初次干燥步骤；iii.)在5±2℃至10±2℃范围内的温度和在约85毫托至约200毫托范围内的压力下进行的二次干燥步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤c.)：使预处理的悬浮液经受冻干过程，其包括：i.)在-48±8℃的温度和大气压下进行的初始冷冻步骤；ii.)在约0.03至约0.08毫巴的压力下进行并在-48±8℃的温度下开始并在约40至约75小时范围内的时间段内升温至0±2℃的温度的初次干燥步骤；以及iii.)在约0.03至约0.08毫巴的压力下进行并在0±2℃的温度下开始并在约30至约50小时范围内的时间段内升温至约25±3℃的温度的二次干燥步骤。
在一些实施方案中，遵循如下所示的冻干循环：
Figure BDA0004121678290000151
脂质纳米颗粒
几种脂质配制的递送媒介物用于递送核酸药物的领域，包括脂质体、阳离子脂质体和脂质纳米颗粒。常规脂质体是由至少一个双层和内部水室组成的囊泡。脂质体的双层膜通常由两亲分子形成，诸如包含空间分离的亲水和疏水结构域的合成或天然来源的脂质(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可以由两亲聚合物和表面活性剂(例如，聚合物体(polymerosome)、类脂囊泡(niosome)等)形成。它们通常呈现为球形囊泡，并且大小范围从20nm到几微米不等。
脂质体可由阳离子、阴离子和/或中性脂质构成。作为脂质体的重要亚类，阳离子脂质体是全部或部分由带正电荷的脂质制成的脂质体，或者更具体地是包含阳离子基团和亲脂部分的脂质。除了上述脂质体的一般特性外，阳离子脂质体中使用的阳离子脂质的带正电荷的部分提供了几个优点和一些独特的结构特征。例如，阳离子脂质的亲脂部分是疏水性的，因此会直接使自身远离脂质体的水性内部，并与其他非极性和疏水性物质缔合。相反，阳离子部分将与水性介质缔合，并且更重要的是与极性分子和物质缔合，借此阳离子部分可以在阳离子脂质体的水性内部复合。由于这些原因，阳离子脂质体越来越多地被研究用于基因治疗，因为它们经由静电相互作用对带负电荷的核酸有好处，从而产生体内临床应用所需的提供生物相容性、低毒性和大规模生产的可能性的复合物。适用于阳离子脂质体的阳离子脂质列于下文。
与脂质体和阳离子脂质体相比，脂质纳米颗粒(LNP)的结构包括单个单层或双层脂质，所述结构将化合物包封在固相中。因此，与脂质体不同，脂质纳米颗粒在其内部没有水相或其他液相，而是来自双层或单层壳的脂质直接与内部化合物复合，从而将内部化合物包封在固体核中。脂质纳米颗粒通常是具有相对均匀分散的形状和大小的球形囊泡。虽然关于什么大小的脂质颗粒符合纳米颗粒的标准来源各不相同，但一致认为脂质纳米颗粒的直径可以在10nm至1000nm范围内。然而，更常见的是它们被认为小于120nm或甚至100nm。
对于脂质纳米颗粒核酸递送系统，脂质壳可以配制为包括可电离的阳离子脂质，其可以与核酸核的带负电荷的主链复合并与之缔合。表观pKa值低于约7的可电离阳离子脂质具有以下益处：提供阳离子脂质以供与核酸带负电荷的主链复合以及在低于带正电荷的可电离脂质pKa的pH值下加载到脂质纳米颗粒中。然后，在生理pH值下，脂质纳米颗粒可以采用相对中性的外部，从而使i.v.施用后颗粒的循环半衰期显著增加。在核酸递送的上下文中，脂质纳米颗粒与其他基于脂质的核酸递送系统相比提供许多优势，包括高核酸包封率、有效转染、改进的组织渗透以递送治疗剂，以及低水平的细胞毒性和免疫原性。
合适的脂质组分和制造脂质纳米颗粒的方法是本领域众所周知的，并且例如在PCT/US2020/023442、U.S.8,058,069、U.S.8,822,668、U.S.9,738,593、U.S.9,139,554、PCT/US2014/066242、PCT/US 2015/030218、PCT/2017/015886和PCT/US2017/067756中有所描述，其内容通过引用并入。
阳离子脂质
脂质纳米颗粒优选包括适合形成阳离子脂质体或脂质纳米颗粒的阳离子脂质。阳离子脂质被广泛研究用于核酸递送，因为它们可以结合带负电荷的膜并诱导摄取。通常，阳离子脂质是含有正亲水头基、两个(或更多个)亲脂尾或类固醇部分和这两个结构域之间的连接器的两亲物。优选地，阳离子脂质在约生理pH下携带净正电荷。传统上，阳离子脂质体是最常用的寡核苷酸非病毒递送系统，包括质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNA/小发夹RNA-shRNA)。阳离子脂质，诸如DOTAP、(1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷)和DOTMA(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基硫酸盐)可以通过静电相互作用与带负电荷的核酸形成复合物或脂质复合物(lipoplexes)，从而提供高体外转染率。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含两种或更多种阳离子脂质的组合。脂质纳米颗粒还可包含类脂(lipidoid)和/或聚合物组分。
在目前公开的脂质纳米颗粒中，阳离子脂质可以是例如N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、1,2-二油酰基三甲基丙烷氯化铵(DOTAP)(也称为N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵和1,2-二油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油氧基-3-吗啉基丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-胺、(6Z,9Z,28Z,31Z)-七碳六烯酸-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)双十二烷-2-醇(C12-200)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-七碳六烯酸-6,9,28 31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-七碳六烯酸-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙烷-1-胺(MC3 Ether)、4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-七碳六烯酸-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丁烷-1-胺(MC4 Ether)，或其任何组合。其他阳离子脂质包括但不限于N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、3P-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Choi)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基铵三氟乙酸盐(DOSPA)、二十八烷基酰胺基甘氨酰羧基精胺(DOGS)、1,2-二油酰-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、N-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)和2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(XTC)。另外，可以使用阳离子脂质的商业制备剂，例如像LIPOFECTIN(包括DOTMA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)和Lipofectamine(包括DOSPA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)。
其他合适的阳离子脂质公开于国际公开号WO 09/086558、WO 09/127060、WO 10/048536、WO 10/054406、WO 10/088537、WO 10/129709和WO 2011/153493；美国专利公开号2011/0256175、2012/0128760和2012/0027803；美国专利号8,158,601；以及Love等人,PNAS,107(5),1864-69,2010中，其内容通过引用并入本文。
其他合适的阳离子脂质包括具有替代脂肪酸基团和其他二烷基氨基基团的那些，包括其中烷基取代基不同的那些(例如，N-乙基-N-甲基氨基-和N-丙基-N-乙基氨基-)。这些脂质是称为氨基脂质的阳离子脂质亚类的一部分。在本文所述的脂质纳米颗粒的一些实施方案中，阳离子脂质是氨基脂质。通常，具有较少饱和酰基链的氨基脂质更容易确定大小(为了过滤灭菌的目的)，特别是当复合物的大小必须低于约0.3微米时。可以使用含有碳链长度在C14至C22范围内的不饱和脂肪酸的氨基脂质。其他支架也可用于分离氨基脂质的氨基和脂肪酸或脂肪烷基部分。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含根据专利申请PCT/EP2017/064066的式I的阳离子脂质。在此背景下，PCT/EP2017/064066的公开内容也通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开的氨基或阳离子脂质是可电离的并且具有至少一个可质子化或可去质子化的基团，使得脂质在等于或低于生理pH(例如，pH 7.4)的pH下带正电荷，并且在第二pH，优选等于或高于生理pH下为中性。当然，应当理解质子的添加或去除随pH变化是一个平衡过程，并且对带电或中性脂质的提及是指主要物质的性质并且不需要所有的脂质以带电或中性形式存在。具有多于一个可质子化或去质子化基团或者是两性离子的脂质不排除在本公开中使用。在某些实施方案中，可质子化脂质具有在约4至约11范围内的可质子化基团pKa。在一些实施方案中，可电离阳离子脂质具有约5至约7的pKa。在一些实施方案中，可电离阳离子脂质的pKa为约6至约7。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含式I可电离阳离子脂质：
Figure BDA0004121678290000201
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R5和R6各自独立地选自由直链或支链C1-C31烷基、C2-C31烯基或C2-C31炔基和胆甾醇基组成的组；L5和L6各自独立地选自由直链C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；X5是-C(O)O-，由此形成-C(O)O-R6、或-OC(O)-，由此形成-OC(O)-R6；X6是-C(O)O-，由此形成-C(O)O-R5、或-OC(O)-，由此形成-OC(O)-R5；X7为S或O；L7不存在或为低级烷基；R4为直链或支链C1-C6烷基；并且R7和R8各自独立地选自由氢和直链或支链C1-C6烷基组成的组。
在一些实施方案中，X7是S。
在一些实施方案中，X5是-C(O)O-，由此形成-C(O)O-R6并且X6是-C(O)O-，由此形成-C(O)O-R5。
在一些实施方案中，R7和R8各自独立地选自由甲基、乙基和异丙基组成的组。
在一些实施方案中，L5和L6各自独立地为C1-C10烷基。在一些实施方案中，L5是C1-C3烷基，并且L6是C1-C5烷基。在一些实施方案中，L6是C1-C2烷基。在一些实施方案中，L5和L6各自为直链C7烷基。在一些实施方案中，L5和L6各自为直链C9烷基。
在一些实施方案中，R5和R6各自独立地为烯基。在一些实施方案中，R6是烯基。在一些实施方案中，R6是C2-C9烯基。在一些实施方案中，烯基包含单个双键。在一些实施方案中，R5和R6各自为烷基。在一些实施方案中，R5是支链烷基。在一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自由C9烷基、C9烯基和C9炔基组成的组。在一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自由C11烷基、C11烯基和C11炔基组成的组。在一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自由C7烷基、C7烯基和C7炔基组成的组。在一些实施方案中，R5是–CH((CH2)pCH3)2或–CH((CH2)pCH3)((CH2)p-1CH3)，其中p是4-8。在一些实施方案中，p是5且L5是C1-C3烷基。在一些实施方案中，p是6且L5是C3烷基。在一些实施方案中，p是7。在一些实施方案中，p是8且L5是C1-C3烷基。在一些实施方案中，R5由
-CH((CH2)pCH3)((CH2)p-1CH3)组成，其中p是7或8。
在一些实施方案中，R4是亚乙基或亚丙基。在一些实施方案中，R4是正亚丙基或异亚丁基。
在一些实施方案中，L7不存在，R4是亚乙基，X7是S并且R7和R8各自为甲基。在一些实施方案中，L7不存在，R4是正亚丙基，X7是S并且R7和R8各自为甲基。在一些实施方案中，L7不存在，R4是亚乙基，X7是S并且R7和R8各自为乙基。
在一些实施方案中，X7是S，X5是-C(O)O-，由此形成-C(O)O-R6，X6是-C(O)O-，由此形成-C(O)O-R5，L5和L6各自独立为直链C3-C7烷基，L7不存在，R5为-CH((CH2)pCH3)2，并且R6为C7-C12烯基。在一些其他实施方案中，p是6并且R6是C9烯基。
辅助脂质和甾醇
本公开的RNA-脂质纳米颗粒可包含辅助脂质，其可称为中性辅助脂质、非阳离子脂质、非阳离子辅助脂质、阴离子脂质、阴离子辅助脂质或中性脂质。已经发现，如果制剂中存在辅助脂质，则脂质制剂，特别是阳离子脂质体和脂质纳米颗粒具有增加的细胞摄取。(Curr.Drug Metab.2014；15(9):882-92)。例如，一些研究表明，中性和两性离子脂质(诸如1,2-二油酰基sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、二-油酰-磷脂酰-乙醇胺(DOPE)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC))比阳离子脂质更具融合性(即促进融合)，可以影响脂质-核酸复合物的多态性特征，促进从层状相到六角相的转变，因此诱导细胞膜的融合和破坏。(Nanomedicine(Lond).2014年1月；9(1):105-20)。此外，使用辅助脂质可以帮助减少使用许多流行的阳离子脂质的任何潜在不利影响，诸如毒性和免疫原性。
适用于本公开的脂质纳米颗粒的非阳离子脂质的非限制性实例包括磷脂，诸如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰甘油(POPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二月桂酰-磷脂酰乙醇胺(dielaidoyl-phosphatidylethanolamine,DEPE)、硬脂酰油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱和它们的混合物。也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选为衍生自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基，例如，月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。
非阳离子脂质的其他实例包括甾醇，诸如胆固醇及其衍生物。一项研究得出结论，作为辅助脂质，胆固醇增加了与核酸接触的脂质层的电荷间距，使电荷分布与核酸的电荷分布更接近。(J.R.Soc.Interface.2012年3月7日；9(68):548–561)。胆固醇衍生物的非限制性实例包括极性类似物，诸如5α-胆甾烷醇、5α-粪甾烷醇、胆固醇基-(2'-羟基)-乙基醚、胆固醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，诸如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5α-胆甾烷酮和胆甾烯基癸酸酯等；以及它们的混合物。在优选的实施方案中，胆固醇衍生物是极性类似物，诸如胆固醇基-(4'-羟基)-丁基醚。
在一些实施方案中，存在于脂质纳米颗粒中的辅助脂质包含一种或多种磷脂和胆固醇或它们的衍生物的混合物或者由其组成。在其他实施方案中，脂质纳米颗粒中存在的中性脂质包含一种或多种磷脂或由其组成，例如，不含胆固醇的脂质纳米颗粒。在再其他实施方案中，脂质纳米颗粒中存在的中性脂质包含胆固醇或其衍生物或者由胆固醇或其衍生物组成，例如，不含磷脂的脂质纳米颗粒。
辅助脂质的其他实例包括不含磷的脂质，例如像，硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰棕榈酸酯、甘油蓖麻油酸酯、十六烷基硬脂酸酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸盐、烷基-芳基硫酸盐、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺和鞘磷脂。
在一些实施方案中，辅助脂质占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的约2mol％至约20mol％、约3mol％至约18mol％、约4mol％至约16mol％、约5mol％至约14mol％、约6mol％至约12mol％、约5mol％至约10mol％、约5mol％至约9mol％或约2mol％、约3mol％、约4mol％、约5mol％、约6mol％、约7mol％、约8mol％、约9mol％、约10mol％、约11mol％或约12mol％(或其任何分数或其中的范围)。
脂质纳米颗粒中的胆固醇或胆固醇衍生物可占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的至多约40mol％、约45mol％、约50mol％、约55mol％或约60mol％。在一些实施方案中，胆固醇或胆固醇衍生物占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的约15mol％至约45mol％、约20mol％至约40mol％、约25mol％至约35mol％或约28mol％至约35mol％；或约25mol％、约26mol％、约27mol％、约28mol％、约29mol％、约30mol％、约31mol％、约32mol％、约33mol％、约34mol％、约35mol％、约36mol％或约37mol％。
在一些实施方案中，混合物中的磷脂组分可占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的约2mol％至约20mol％、约3mol％至约18mol％、约4mol％至约16mol％、约5mol％至约14mol％、约6mol％至约12mol％、约5mol％至约10mol％、约5mol％至约9mol％或约2mol％、约3mol％、约4mol％、约5mol％、约6mol％、约7mol％、约8mol％、约9mol％、约10mol％、约11mol％或约12mol％(或其任何分数或其中的范围)。
脂质纳米颗粒中存在的辅助脂质的百分比是目标量，并且制剂中存在的辅助脂质的实际量可以变化，例如变化±5mol％。
含有阳离子脂质化合物或可电离阳离子脂质化合物(或2种阳离子脂质的组合)的脂质纳米颗粒可以以摩尔计含有约30-70％阳离子脂质化合物、约25-40％胆固醇、约2-15％的辅助脂质和约0.5-5％的聚乙二醇(PEG)脂质，其中所述百分比是占制剂中存在的总脂质的百分比。在一些实施方案中，组合物是含有约40-65％阳离子脂质化合物、约25-35％的胆固醇、约3-9％辅助脂质和约0.5-3％的PEG-脂质，其中所述百分比是占制剂中存在的总脂质的百分比。
制剂可以是脂质颗粒制剂，例如含有8-30％核酸化合物、5-30％的辅助脂质和0-20％胆固醇；4-25％阳离子脂质、4-25％辅助脂质、2-25％胆固醇、10-35％胆固醇-PEG和5％胆固醇-胺；或2-30％阳离子脂质、2-30％辅助脂质、1-15％胆固醇、2-35％胆固醇-PEG和1-20％胆固醇-胺；或高达90％阳离子脂质和2-10％辅助脂质；或甚至100％阳离子脂质。
脂质缀合物
本文所述的脂质纳米颗粒还可包含脂质缀合物。缀合的脂质是有用的，因为它防止颗粒聚集。合适的缀合的脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、阳离子-聚合物-脂质缀合物以及它们的混合物。此外，通过将配体(例如抗体、肽和碳水化合物)附着至脂质递送媒介物表面或附着至所附着的PEG链的末端，可将脂质递送媒介物用于特异性靶向(FrontPharmacol.2015年12月1日；6:286)。
在优选的实施方案中，脂质缀合物是PEG-脂质。将聚乙二醇(PEG)作为涂层或表面配体包含在脂质纳米颗粒中，这种技术称为聚乙二醇化，有助于保护纳米颗粒免受免疫系统的影响并使其避免RES摄取(Nanomedicine(Lond).2011年6月；6(4):715-28)。聚乙二醇化已被广泛用于通过物理、化学和生物机制稳定脂质纳米颗粒及其有效载荷。洗涤剂样PEG脂质(例如，PEG-DSPE)可以进入脂质纳米颗粒，以在表面形成水合层和空间屏障。根据聚乙二醇化程度，表面层一般可分为刷状层和蘑菇状层两种类型。对于PEG-DSPE稳定的制剂，PEG将在低聚乙二醇化程度(通常小于5mol％)下呈现蘑菇状构象，并随着PEG-DSPE含量增加超过一定水平而转变为刷状构象(Journal of Nanomaterials.2011；2011:12)。已经表明，聚乙二醇化的增加导致脂质纳米粒子的循环半衰期显著增加(Annu.Rev.Biomed.Eng.2011年8月15日；13():507-30；J.Control Release.2010年8月3日；145(3):178-81)。
PEG-脂质的合适实例包括但不限于与二烷氧基丙基偶联的PEG(PEG-DAA)、与甘油二酯偶联的PEG(PEG-DAG)、与诸如磷脂酰乙醇胺的磷脂偶联的PEG(PEG-PE)、与神经酰胺缀合的PEG、与胆固醇或其衍生物缀合的PEG，以及它们的混合物。
PEG是具有两个末端羟基的乙烯PEG重复单元的直链水溶性聚合物。PEG按其分子量分类，包括以下：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(monomethoxypolyethylene glycol-tresylate,MePEG-TRES)、单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)，以及含有末端羟基而不是末端甲氧基的此类化合物(例如，HO-PEG-S、HO-PEG-S-NHS、HO-PEG-NH2)。
本文所述的PEG-脂质缀合物的PEG部分可包含范围从约550道尔顿至约10,000道尔顿的平均分子量。在某些情况下，PEG部分的平均分子量为约750道尔顿至约5,000道尔顿(例如，约1,000道尔顿至约5,000道尔顿、约1,500道尔顿至约3,000道尔顿、约750道尔顿至约3,000道尔顿、约750道尔顿至约2,000道尔顿)。在优选的实施方案中，PEG部分具有约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。平均分子量可以是所述范围内的任何值或子值，包括端点。
在某些情况下，PEG可以任选地被烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。PEG可以直接与脂质缀合或者可以经由接头部分与脂质连接。可以使用适合于将PEG偶联至脂质的任何接头部分，包括例如不含酯的接头部分和含酯的接头部分。在优选的实施方案中，接头部分是不含酯的接头部分。合适的不含酯的接头部分包括但不限于酰氨基(-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)、脲(-NHC(O)NH-)、二硫键(-S-S-)、醚键(-O-)、琥珀酰基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、琥珀酰氨基(succinamidyl)(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚键以及它们的组合(诸如含有氨基甲酸酯接头部分和酰胺基接头部分的接头)。在一个优选的实施方案中，使用氨基甲酸酯接头将PEG偶联至脂质。
在其他实施方案中，使用含酯的接头部分将PEG偶联至脂质。合适的含酯接头部分包括例如碳酸酯基(-OC(O)O-)、琥珀酰基、磷酸酯基(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯基以及它们的组合。
具有不同链长和饱和度的各种酰基链基团的磷脂酰乙醇胺可以与PEG缀合以形成脂质缀合物。此类磷脂酰乙醇胺是可商购的或者可以使用本领域技术人员已知的常规技术分离或合成。优选含有碳链长度在C10至C20范围内的饱和或不饱和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺。也可以使用具有单或双不饱和脂肪酸以及饱和和不饱和脂肪酸混合物的磷脂酰乙醇胺。合适的磷脂酰乙醇胺包括但不限于二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
在一些实施方案中，PEG-DAA缀合物是PEG-二癸氧基丙基(C10)缀合物、PEG-二月桂氧基丙基(C12)缀合物、PEG-二肉豆蔻氧基丙基(C14)缀合物、PEG-二棕榈氧基丙基(C16)缀合物或PEG-二硬脂酰氧基丙基(C18)缀合物。在这些实施方案中，PEG优选具有约750或约2,000道尔顿的平均分子量。在具体实施方案中，PEG的末端羟基被甲基取代。
除了上述之外，其他亲水聚合物也可以用来代替PEG。可用于代替PEG的合适聚合物的实例包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基、甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸和衍生化纤维素诸如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。
在一些实施方案中，脂质缀合物(例如PEG-脂质)占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的约0.1mol％至约2mol％、约0.5mol％至约2mol％、约1mol％至约2mol％、约0.6mol％至约1.9mol％、约0.7mol％至约1.8mol％、约0.8mol％至约1.7mol％、约0.9mol％至约1.6mol％、约0.9mol％至约1.8mol％、约1mol％至约1.8mol％、约1mol％至约1.7mol％、约1.2mol％至约1.8mol％、约1.2mol％至约1.7mol％、约1.3mol％至约1.6mol％或者约1.4mol％至约1.6mol％(或其任何分数或其中的范围)。在其他实施方案中，脂质缀合物(例如，PEG-脂质)占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的约0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5％(或其任何分数或其中的范围)。所述量可以是所述范围内的任何值或子值，包括端点。
存在于本公开的脂质纳米颗粒中的脂质缀合物(例如，PEG-脂质)的百分比是目标量，并且制剂中存在的脂质缀合物的实际量可以变化，例如变化±0.5mol％。本领域的普通技术人员将理解，脂质缀合物的浓度可以根据所使用的脂质缀合物和脂质纳米颗粒变得具有融合性的速率而变化。
脂质纳米颗粒-核酸制剂
在本公开的上下文中，脂质纳米颗粒递送媒介物通常用于将核酸(例如，RNA)转运至靶细胞或组织。示例性核酸包括DNA和RNA两者。在优选的实施方案中，脂质纳米颗粒包含RNA、阳离子脂质(例如，一种或多种阳离子脂质或它们的盐)、磷脂和抑制颗粒聚集的缀合脂质(例如，一种或多种PEG-脂质缀合物)。脂质纳米颗粒还可以包含胆固醇。
在一些实施方案中，RNA被完全包封在脂质纳米颗粒的脂质部分内，使得RNA在水溶液中对核酸酶降解具有抗性。
术语“RNA”意指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”意指在β-D-核糖-呋喃糖部分的2'位置处具有羟基的核苷酸。这些术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA诸如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、删除、取代和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同的改变的RNA。此类改变可包括添加非核苷酸材料，诸如添加到干扰RNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。本公开的RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物或天然存在的RNA的类似物。如本文所用，术语“核糖核酸”和“RNA”是指含有至少一个核糖核苷酸残基的分子，包括siRNA、反义RNA、单链RNA、微小RNA、mRNA、非编码RNA和多价RNA。
在一些实施方案中，RNA是自我复制RNA。在一些实施方案中，RNA是mRNA。在一些实施方案中，RNA是siRNA。在一些实施方案中，核酸的长度为约1000个核苷酸至约13000个核苷酸。
本公开的脂质纳米颗粒通常还具有约1:1至约100:1、约1:1至约50:1、约2:1至约45:1、约3:1至约40:1、约5:1至约38:1、或约6:1至约40:1、或约7:1至约35:1、或约8:1至约30:1；或约10:1至约25:1；或约8:1至约12:1；或约13:1至约17:1；或约18:1至约24:1；或约20:1至约30:1的总脂质:RNA比(质量/质量比)。在一些优选的实施方案中，总脂质:RNA比(质量/质量比)为约10:1至约25:1。在一些实施方案中，悬浮液中总脂质与RNA的重量比为约50:1至约10:1。在一些实施方案中，悬浮液中总脂质与RNA的重量比为约40:1至约20:1。在一些实施方案中，悬浮液中总脂质与RNA的重量比为约35:1至约25:1。所述比率可以是所述范围内的任何值或子值，包括端点。
本公开的脂质纳米颗粒通常具有约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm或约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm、约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约105nm、约110nm、约115nm、约120nm、约125nm、约130nm、约135nm、约140nm、约145nm或约150nm的平均直径，并且基本上无毒。所述直径可以是所述范围内的任何值或子值，包括端点。
在核酸的上下文中，完全包封可以通过进行膜不可渗透荧光染料排除测定来确定，所述测定使用当与核酸缔合时具有增强的荧光的染料。包封是通过将染料添加到脂质纳米颗粒，测量产生的荧光，并将其与添加少量非离子洗涤剂时观察到的荧光进行比较来确定的。洗涤剂介导的脂质层破坏释放包封的核酸，使其与膜不可渗透染料相互作用。核酸包封可计算为E＝(I0-I)/I0，其中I和I0是指添加洗涤剂前后的荧光强度。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含完全包封在制剂脂质部分内的RNA，使得约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约30％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约80％至约90％或至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％(或其任何分数或其中的范围)的颗粒具有包封在其中的RNA。所述量可以是所述范围内的任何值或子值，包括端点。
悬浮液和液体介质
悬浮液是一种不均匀混合物，其中溶质颗粒不溶解，而是悬浮在大部分溶剂中，在介质中自由漂浮。内相(固体)分散在整个外相(流体)中，这可以通过使用某些赋形剂或悬浮剂来促进。用于悬浮脂质纳米颗粒的液体介质可以包括本领域已知的任何合适的液体介质。用于药物悬浮液的合适液体包括乙醇、甘油、聚乙二醇和聚丙二醇。这些液体提供润湿的机制是它们可与水混溶并降低液气界面张力。液体渗透单个颗粒并促进润湿。在一些实施方案中，液体介质是水性介质。
在本公开中，悬浮液中脂质纳米颗粒的浓度被公开为每mL悬浮液中包封的RNA的浓度。在一些实施方案中，悬浮液中的RNA具有在约0.1mg/mL至约2.0mg/mL范围内的浓度。在一些实施方案中，悬浮液中的RNA具有在约0.1mg/mL至约1.5mg/mL范围内的浓度。在一些实施方案中，悬浮液中的RNA具有在约0.1mg/mL至约1.0mg/mL范围内的浓度。在一些实施方案中，悬浮液中的RNA具有在约0.1mg/mL至约0.5mg/mL范围内的浓度。
赋形剂、冻干保护剂、冷冻保护剂和缓冲液
可以预处理脂质纳米颗粒-RNA制剂以促进冻干和复溶。通常，脂质纳米颗粒-RNA制剂的缓冲悬浮液与特殊赋形剂组合，所述特殊赋形剂中的一些用作冻干保护剂和/或冷冻保护剂。如本文所用，术语“冻干保护剂”是指添加到组合物中以在冻干干燥阶段保护活性成分、帮助保存或稳定冻干产品和/或帮助使冻干产品更容易复溶的物质、化合物或赋形剂。冻干保护剂也可用作填充剂。如本文所用，“冷冻保护剂”是指添加到生物或药物组合物中以保护其免受冻害的物质、化合物或赋形剂。
在一些实施方案中，预处理的悬浮液包含冻干保护剂。在一些实施方案中，预处理的悬浮液包含冷冻保护剂。
在冻干过程中用作冻干保护剂或冷冻保护剂的赋形剂的合适实例包括糖类化合物(例如，单糖、二糖等)。保护性糖化合物的实例包括单糖诸如C5-6醛糖和酮糖，以及二糖诸如蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、曲二糖、糖化曲二糖、异麦芽糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、龙胆二酮糖(gentiobiulose)、甘露二糖、蜜二糖、蜜二酮糖(melibiulose)和木二糖。
在一些实施方案中，预处理的悬浮液包含硫代硫酸盐。硫代硫酸盐可以是任何适合体内施用的硫代硫酸盐。在一些实施方案中，硫代硫酸盐是硫代硫酸钠或硫代硫酸钾。在一些实施方案中，硫代硫酸盐是硫代硫酸钠。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.025％w/v至约1.0％w/v的硫代硫酸盐浓度。在一些实施方案中，硫代硫酸盐是硫代硫酸钠。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.025％w/v至约0.75％w/v的硫代硫酸盐浓度。在一些实施方案中，硫代硫酸盐是硫代硫酸钠。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.025％w/v至约0.5％w/v的硫代硫酸盐浓度。在一些实施方案中，硫代硫酸盐是硫代硫酸钠。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.05％w/v至约0.3％w/v的硫代硫酸盐浓度。在一些实施方案中，硫代硫酸盐是硫代硫酸钠。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.05％w/v至约0.25％w/v的硫代硫酸盐浓度。
在一些实施方案中，预处理的悬浮液包含山梨酸钾。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.01M至约0.5M的山梨酸钾浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.02M至约0.4M的山梨酸钾浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.025M至约0.3M的山梨酸钾浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.03M至约0.2M的山梨酸钾浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.035M至约0.1M的山梨酸钾浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.04M至约0.08M的山梨酸钾浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.015M至约0.06M的山梨酸钾浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.02M至约0.04M的山梨酸钾浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.010、0.011、0.012、0.013、0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.020、0.021、0.022、0.023、0.024、0.025、0.026、0.027、0.028、0.029、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.055、0.060、0.070、0.080、0.090或0.10M的山梨酸钾浓度。
在一些实施方案中，预处理的悬浮液包含碘克沙醇。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约5％w/v至约15％w/v的碘克沙醇浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约6％w/v至约13％w/v的碘克沙醇浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约7％w/v至约11％w/v的碘克沙醇浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约8％w/v至约10％w/v的碘克沙醇浓度。
在一些实施方案中，预处理的悬浮液包含苯甲酸钠。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.01M至约0.6M的苯甲酸钠浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.02M至约0.5M的苯甲酸钠浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.03M至约0.4M的苯甲酸钠浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.04M至约0.3M的苯甲酸钠浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.05M至约0.2M的苯甲酸钠浓度。
在一些实施方案中，预处理的悬浮液以本文所述的浓度包含选自硫代硫酸盐、山梨酸钾、碘克沙醇和苯甲酸钠的赋形剂的组合。
在一些实施方案中，包含硫代硫酸盐、山梨酸钾、碘克沙醇和/或苯甲酸钠的预处理溶液还包含聚乙烯醇(PVA)。PVA是一种水溶性合成聚合物，具有理想的分子式[CH2CH(OH)]n。任何合适的PVA均可用于本公开的预处理的悬浮液。PVA类型在本领域中是已知的并且可从若干个来源(Sigma-Aldrich、TCI、Alfa Aesar、VWR)商购获得。在一些实施方案中，PVA具有约9kDa至约186kDa的平均分子量。在一些实施方案中，PVA是如本文所述的具有约27kDa的分子量的PVA3。在一些实施方案中，PVA是如本文所述的具有约13kDa至约23kDa的分子量的PVA10。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.01％w/v至约0.75％w/v的PVA浓度。
在一些实施方案中，包含硫代硫酸盐、山梨酸钾、碘克沙醇和/或苯甲酸钠的预处理的悬浮液还包含NaCl。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.005M至约0.5M的NaCl浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.01M至约0.4M的NaCl浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.015M至约0.3M的NaCl浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.015M至约0.2M的NaCl浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.015M至约0.1M的NaCl浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约0.02M至约0.05M的NaCl浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约1mM至约500mM、约2mM至约475mM、约3mM至约450mM、约4mM至约425mM、约5mM至约400mM、约6mM至约375mM、约7mM至约350mM、约8mM至约325mM、约9mM至约300mM、约10mM至约275mM、约15mM至约250mM、约20mM至约200mM、约25mM至约150mM、约30mM至约100mM、约35mM至约75mM、约40mM至约60mM、约45mM至约55mM或者约25mM至约75mM的NaCl浓度。
在一些实施方案中，包含硫代硫酸盐、山梨酸钾、碘克沙醇和/或苯甲酸钠的预处理的悬浮液还包含蔗糖。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约5％w/v至约15％w/v的蔗糖浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约7％w/v至约11％w/v的蔗糖浓度。在一些实施方案中，预处理的悬浮液具有约8％w/v至约10％w/v的蔗糖浓度。
在一些实施方案中，包含硫代硫酸盐、山梨酸钾、碘克沙醇和/或苯甲酸钠的液体介质或预处理的悬浮液还包含缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液选自MOPS、HEPES、TRIS、MES、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约7mg/mL至约15mg/mL。在一些实施方案中，液体介质或预处理的悬浮液具有约7.4的pH。在一些实施方案中，液体介质或预处理的悬浮液具有约7.0至约8.0的pH。
在一个实施方案中，提供了一种液体介质，其包含浓度为约0.005mg/mL至约2.0mg/mL的包封的RNA、浓度为约0.005M至约0.5M的山梨酸钾、浓度为约0.005至约0.5％w/v的泊洛沙姆、浓度为约4％至约22％w/v的糖、浓度为约5mM至约500mM的NaCl和浓度为约1mM至约300mM、pH为约7.4至约8.0的缓冲液。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188(又名，P188)。在一些实施方案中，糖是蔗糖。在一些实施方案中，RNA的浓度为约0.010至约1.5mg/mL。在一些实施方案中，RNA的浓度为约0.050至约0.8mg/mL。在一些实施方案中，山梨酸钾的浓度为约0.010M至约0.3M。在一些实施方案中，山梨酸钾的浓度为约0.015M至约0.1M。在一些实施方案中，泊洛沙姆的浓度为约0.10至约0.40％w/v。在一些实施方案中，泊洛沙姆的浓度为约0.015至约0.30％w/v。在一些实施方案中，泊洛沙姆的浓度为约0.020至约0.20％w/v。在一些实施方案中，泊洛沙姆的浓度为约0.030至约0.10％w/v。在一些实施方案中，糖的浓度为约8至约20％w/v。在一些实施方案中，糖的浓度为约12至约20％w/v。在一些实施方案中，糖的浓度为约16至约20％w/v。在一些实施方案中，缓冲液是Tris。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约2mM至约250mM。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约3mM至约200mM。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约4mM至约150mM。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约5mM至约100mM。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约8mM至约50mM。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约10mM至约40mM。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约12mM至约30mM。在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约15mM至约25mM。
冻干组合物
在另一个方面，提供了一种冻干组合物，其包含包封核酸的脂质纳米颗粒以及一种或多种选自山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和碘克沙醇的赋形剂。在一些实施方案中，核酸是RNA。在一些实施方案中，RNA是mRNA。在一些实施方案中，RNA是siRNA。在一些实施方案中，RNA是自我复制RNA。
在一些实施方案中，包含山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和/或碘克沙醇的冻干组合物在冻干组合物中具有约50:1至约10:1的总脂质与核酸重量比。在一些实施方案中，冻干组合物在冻干组合物中具有约40:1至约20:1的总脂质与核酸重量比。在一些实施方案中，冻干组合物在冻干组合物中具有约35:1至约25:1的总脂质与核酸重量比。在一些实施方案中，冻干组合物在冻干组合物中具有约45:1至约30:1的总脂质与核酸重量比。
山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和/或碘克沙醇可以按下文所述的所选赋形剂与核酸(例如，RNA)的重量比存在。
在一些实施方案中，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与核酸的重量比为约30:1至约250:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与核酸的重量比为约40:1至约200:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与核酸的重量比为约50:1至约175:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与核酸的重量比为约5:1至约150:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与核酸的重量比为约10:1至约125:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与核酸的重量比为约15:1至约100:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与核酸的重量比为约20:1至约80:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与核酸的重量比为约25:1至约60:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与核酸的重量比为约30:1至约50:1。
在一些实施方案中，冻干组合物包含硫代硫酸钠，硫代硫酸钠与核酸的重量比为约1:1至约12:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含硫代硫酸钠，硫代硫酸钠与核酸的重量比为约2:1至约10:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含硫代硫酸钠，硫代硫酸钠与核酸的重量比为约3:1至约8:1。
在一些实施方案中，冻干组合物包含苯甲酸钠，苯甲酸钠与核酸的重量比为约1:1至约12:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含苯甲酸钠，苯甲酸钠与核酸的重量比为约2:1至约10:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含苯甲酸钠，苯甲酸钠与核酸的重量比为约3:1至约9:1。
在一些实施方案中，冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与核酸的重量比为约100:1至约800:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与核酸的重量比为约150:1至约750:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与核酸的重量比为约200:1至约700:1。在一些实施方案中，冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与核酸的重量比为约250:1至约650:1。
在一些实施方案中，包含山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和/或碘克沙醇的冻干组合物还包含聚乙烯醇(PVA)，PVA与核酸的重量比为约1:1至约12:1。
在一些实施方案中，包含山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和/或碘克沙醇的冻干组合物还包含蔗糖，蔗糖与核酸的重量比为约100:1至约800:1。
在一些实施方案中，包含山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和/或碘克沙醇的冻干组合物还包含选自HEPES、MOPS、TRIS、MERS、柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲液，缓冲液与核酸的重量比为约3:1至约150:1。在一些实施方案中，缓冲液是TRIS。
在一些实施方案中，包含山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和/或碘克沙醇的冻干组合物还包含NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.5％w/w至约5.0％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.6％w/w至约4.5％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.7％w/w至约4.0％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.8％w/w至约3.5％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.9％w/w至约3.0％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.0％w/w至约2.5％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.1％w/w至约2.4％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.2％w/w至约2.3％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.3％w/w至约2.1％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.4％w/w至约2.0％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.4％w/w至约1.6％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.75％w/w至约2.25％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.0％w/w至约2.0％w/w的NaCl。
在一些实施方案中，冻干组合物包含约85至约96％w/w的糖。在一些实施方案中，糖是蔗糖。在一些实施方案中，冻干组合物包含约88至约95％w/w的糖。在一些实施方案中，冻干组合物包含约90至约95％w/w的糖。在一些实施方案中，冻干组合物包含约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％w/w的糖。对于糖的上述百分比，术语“约”应意在为±0.5％。
在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.01至约1.0％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.02至约0.8％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.03至约0.7％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.04至约0.6％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.05至约0.5％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.06至约0.4％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.07至约0.3％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.09至约0.2％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
在一个实施方案中，提供了一种冻干组合物，其包含包封RNA的脂质纳米颗粒、泊洛沙姆、山梨酸钾和糖。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.001至约1.0％w/w的RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.005至约0.8％w/w的RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.01至约0.5％w/w的RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.02至约0.4％w/w的RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.03至约0.3％w/w的RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.04至约0.2％w/w的RNA。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.5至约5.0％w/w的脂质。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.0至约4.0％w/w的脂质。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.25至约3.0％w/w的脂质。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.5至约2.5％w/w的TRIS缓冲液。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.75至约2.25％w/w的TRIS缓冲液。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.0至约2.0％w/w的TRIS缓冲液。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.75至约2.75％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.0至约2.5％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.25至约1.80％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干组合物包含约85至约96％w/w的糖。在一些实施方案中，冻干组合物包含约88至约95％w/w的糖。在一些实施方案中，冻干组合物包含约90至约95％w/w的糖。在一些实施方案中，糖是蔗糖。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.01至约1.0％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.02至约0.8％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.03至约0.7％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.04至约0.6％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.05至约0.5％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.06至约0.4％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.07至约0.3％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.09至约0.2％w/w的泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.5至约5.0％w/w的山梨酸钾。在一些实施方案中，冻干组合物包含约0.75至约4.0％w/w的山梨酸钾。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.0至约3.0％w/w的山梨酸钾。在一些实施方案中，冻干组合物包含约1.25至约2.75％w/w的山梨酸钾。
冻干组合物的保存、复溶和施用
通过本文所述的方法制备的冻干组合物或本文所述的冻干组合物可以在比脂质纳米颗粒悬浮液更高的温度下稳定储存。通常，脂质纳米颗粒悬浮液储存在-70℃，对于缺乏能够达到和维持此温度的设备的设施来说，此温度不适合运输和储存。冻干组合物可在高于70℃的温度下稳定储存。在一些实施方案中，本文提供了一种保存冻干组合物的方法，其包括在约-20℃至约8℃的温度下储存本公开的冻干产品。在一些实施方案中，所述方法包括在约-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7或8℃的温度下储存本公开的冻干产品。在一些实施方案中，所述方法包括在约-20℃至约8℃的温度下储存本公开的冻干产品。
在一些实施方案中，提供了一种复溶本公开的冻干组合物的方法，其包括将液体介质添加到冻干组合物中。
在一些实施方案中，提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用在液体介质中复溶的本公开的冻干组合物。在一些实施方案中，复溶冻干组合物是静脉内施用的。在一些实施方案中，复溶冻干组合物是肌内施用的。在一些实施方案中，复溶冻干组合物是经由吸入施用的。用于静脉内、肌内和可吸入施用的方法在本领域中是已知的并且容易适用于本文所述的复溶制剂。
定义
在本说明书的各处，本公开的化合物的取代基以组或范围的形式公开。本公开明确地旨在包括此类组成员和范围成员的各个和每个单独的子组合。例如，术语“C1-6烷基”具体旨在单独公开甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
术语“阴离子脂质”意指在生理pH下带负电荷的脂质。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)以及其他与中性脂质接合的阴离子修饰基团。
在一系列项目(用术语“和”或“或”来分隔项目中的任一者)之前的短语“中的至少一个”修饰整个列表，而不是列表的每个成员(即，每个项目)。短语“中的至少一个”并不要求选择所列每个项目的至少一个；相反，该短语允许的含义包括项目中任何一者的至少一个，和/或项目的任何组合的至少一个，和/或项目中每一者的至少一个。例如，短语“A、B和C中的至少一个”或“A、B或C中的至少一个”各自是指仅A、仅B或仅C；A、B和C的任何组合；和/或A、B和C中每一者的至少一个。
说明书或权利要求中使用了术语“包括(include)”、“具有(have)”等，此术语意在以与术语“包含(comprise)”在权利要求中用作过渡词时“包含(comprise)”被解释时类似的方式具有包括性。
术语“阳离子脂质”意指具有以下的两亲脂质及其盐：正电亲水头基；一个、两个、三个或更多个疏水性脂肪酸或脂肪烷基链；以及这两个结构域之间的连接头。可电离或可质子化的阳离子脂质通常在低于其pKa的pH下被质子化(即，带正电)并且在高于pKa的pH下基本上是中性的。优选的可电离阳离子脂质是具有低于生理pH的pKa的那些，生理pH通常为约7.4。本公开的阳离子脂质也可称为可滴定阳离子脂质。阳离子脂质可以是具有可质子化叔胺(例如，可pH-滴定)头基的“氨基脂质”。一些氨基示例性氨基脂质可包括C18烷基链，其中每个烷基链独立地具有0至3个(例如，0、1、2或3)双键；以及头基和烷基链之间的醚、酯或缩酮键联。此类阳离子脂质包括但不限于DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA(也称为DLin-C2K-DMA、XTC2和C2K)、DLin-K-C3-DM A、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、y-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA(也称为MC2)、DLin-M-C3-DMA(也称为MC3)和(DLin-MP-DMA)(也称为1-Bl 1)。
术语“包含”旨在为开放的并允许但不要求包含额外的元素或步骤。当本文使用术语“包含”时，术语“由……组成”也因此被涵盖和公开。
术语“组合物”意指包含指定量的指定成分的产品，以及直接或间接由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。
术语“可商购获得的化学品”和本文阐述的实施例中使用的化学品可从标准商业来源获得，其中此类来源包括例如Acros Organics(Pittsburgh,Pa.)、Sigma-AdrichChemical(Milwaukee,Wis.)、Avocado Research(Lancashire,U.K.)、Bionet(Cornwall,U.K.)、Boron Molecular(Research Triangle Park,N.C.)、Combi-Blocks(San Diego,Calif.)、Eastman Organic Chemicals,Eastman Kodak Company(Rochester,N.Y.)、Fisher Scientific Co.(Pittsburgh,Pa.)、Frontier Scientific(Logan,Utah)、ICNBiomedicals,Inc.(Costa Mesa,Calif.)、Lancaster Synthesis(Windham,N.H.)、Maybridge Chemical Co.(Cornwall,U.K.)、Pierce Chemical Co.(Rockford,Ill.)、Riedel de Haen(Hannover,Germany)、Spectrum Quality Product,Inc.(New Brunswick,N.J.)、TCI America(Portland,Oreg.)和Wako Chemicals USA,Inc.(Richmond,Va.)。
短语“化学文献中描述的化合物”可以通过针对化学化合物和化学反应的参考书和数据库来识别，如本领域普通技术人员所知。详细介绍可用于制备本文公开的化合物的反应物的合成，或者提供对描述本文公开的化合物的制备的文章的参考的合适的参考书和论文包括例如“Synthetic Organic Chemistry”,John Wiley and Sons,Inc.New York；S.R.Sandler等人,“Organic Functional Group Preparations,”第2版,Academic Press,New York,1983；H.O.House,“Modern Synthetic Reactions,”第2版,W.A.Benjamin,Inc.Menlo Park,Calif.,1972；T.L.Glichrist,“Heterocyclic Chemistry,”第2版JohnWiley and Sons,New York,1992；J.March,“Advanced Organic Chemistry:reactions,Mechanisms and Structure,”第5版,Wiley Interscience,New York,2001；特定的和类似的反应物也可以通过美国化学学会化学文摘社编制的已知化学品索引来识别，这些索引可在大多数公共和大学图书馆中获得，也可以通过在线数据库获得(可以联系美国化学学会,Washington,D.C.了解更多详情)。已知但未在目录中可商购获得的化学品可由定制化学合成公司制备，其中许多标准化学品供应公司(诸如上面列出的那些)提供定制合成服务。
如本文所用，术语剂的“有效量”是足以实现有益或期望的结果例如临床结果的量，并且因此，“有效量”取决于其正在应用的情况。例如，在施用治疗癌症的剂的情况下，剂的有效量是例如与不施用剂获得的反应相比足以实现如本文定义的癌症治疗的量。
术语“完全包封”意指核酸-脂质颗粒中的核酸(例如，mRNA)在暴露于血清或会显著降解游离RNA的核酸酶测定后没有显著降解。当完全包封时，在通常会降解100％游离核酸的处理中，优选地小于25％的颗粒中的核酸被降解，更优选地小于10％，并且最优选地小于5％的颗粒中的核酸被降解。“完全包封”也意指核酸-脂质颗粒在体内施用后不会迅速分解成它们的组成部分。
术语“核酸”意指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键联的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，它们具有与参考核酸相似的结合性质，并且以相似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酰胺、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。
术语“化合物”意在包括所示结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。
术语“递送”是指递送化合物、物质、实体、部分、货物或有效载荷的行为或方式。
术语“递送剂”或“递送媒介物”是指至少部分促进多核苷酸体内递送至靶细胞的任何物质。
术语核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录本的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端加工)；(3)RNA翻译为多肽或蛋白质；以及(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
术语“特征”是指特性、性质或独特元素。
术语“疏水性脂质”意指具有非极性基团的化合物，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基以及任选被一个或多个芳族、脂环族或杂环基团取代的此类基团。合适的实例包括但不限于二酰基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1,2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1,2-二烷基-3-氨基丙烷。
术语“脂质”意指包含脂肪酸酯的有机化合物，并且其特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。脂质通常至少分为三类：(1)“简单脂质”，包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，包括磷脂和糖脂；(3)“衍生脂质”，诸如类固醇。
术语“脂质递送媒介物”意指可用于将治疗性核酸(例如，mRNA)递送至感兴趣的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的脂质制剂。脂质递送媒介物可以是核酸-脂质颗粒，其可以由阳离子脂质、非阳离子脂质(例如，磷脂)、防止颗粒聚集的缀合脂质(例如，PEG-脂质)和任选胆固醇来形成。通常，治疗性核酸(例如，mRNA)可以被包封在颗粒的脂质部分中，从而保护它免于酶促降解。
术语“脂质包封”意指在脂质制剂中被完全包封、部分包封或两者的核酸诸如mRNA。在一个优选的实施方案中，核酸(例如，mRNA)被完全包封在脂质颗粒中。
术语“脂质缀合物”意指抑制脂质颗粒聚集的缀合脂质。此类脂质缀合物包括但不限于PEG-脂质缀合物，例如像与二烷氧基丙基偶联的PEG(例如，PEG-DAA缀合物)、与二酰基甘油偶联的PEG(例如，PEG-DAG缀合物)、与胆固醇偶联的PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG、和与神经酰胺缀合的PEG、阳离子PEG脂质、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺低聚物以及它们的混合物。PEG或POZ可以直接与脂质缀合或者可以经由接头部分与脂质连接。可以使用适合于将PEG或POZ偶联至脂质的任何接头部分，包括例如不含酯的接头部分和含酯的接头部分。在某些优选的实施方案中，使用不含酯的接头部分，诸如酰胺或氨基甲酸酯。
术语“两亲脂质(amphipathic lipid)”或“两亲脂质(amphiphilic lipid)”意指其中脂质材料的疏水部分朝向疏水相，而亲水部分朝向水相的材料。亲水特性源于极性或带电基团，诸如碳水化合物、磷酸根、羧酸根、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团的存在。可通过包含非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基和被一个或多个芳族、脂环族或杂环基团取代的此类基团。两亲化合物的实例包括但不限于磷脂、氨基脂和鞘脂。
术语“信使RNA”(mRNA)是指编码感兴趣的蛋白质或多肽并且能够被翻译以在体外、体内、原位或离体产生感兴趣的编码蛋白质或多肽的任何多核苷酸。
术语“核苷酸”意在包括具有本领域熟知的天然碱基(标准)或修饰碱基的核苷酸。此类碱基通常位于核苷酸糖部分的1'位置处。核苷酸通常包含碱基、糖和磷酸基团。核苷酸在糖、磷酸和/或碱基部分可以是未修饰的或修饰的(也可互换地称为核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等等；参见，例如，Usman and McSwiggen,同上；Eckstein,等人,International PCT Publication No.WO 92/07065；Usman,等人,International PCT Publication No.WO 93/15187；Uhlman&Peyman,同上，全部通过引用特此并入本文)。如Limbach,等人,Nucleic Acids Res.22:2183,1994所总结的，本领域已知有几个修饰的核酸碱基的实例。可引入核酸分子的碱基修饰的一些非限制性实例包括：肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔等等(Burgin,等人,Biochemistry 35:14090,1996；Uhlman&Peyman,同上)。在这方面，“修饰的碱基”意指在1'位置除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶外的核苷酸碱基或它们的等同物。
术语“患者”是指可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或因特定疾病或疾患而接受训练有素的专业人员护理的受试者。
如本文所用的短语“药学上可接受的”涉及在合理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应、或其它问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用的短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)外并且具有在患者中基本上无毒且无炎症性的性质的任何成分。赋形剂可能包括，例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣剂、压缩助剂、崩解剂、染料(色素)、软化剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣剂、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二元)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羧甲淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石粉、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
短语“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式(例如，通过使游离碱基与合适的有机酸反应)而被修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基诸如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基诸如羧酸的碱金属盐或有机盐；等等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡萄糖庚酸盐(lucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法自含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可通过将游离酸或游离碱形式的这些化合物与水中或有机溶剂中或者二者的混合物中的化学计量量的适当碱或酸反应来制备；通常优选非水性介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表见于Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,MackPublishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编辑),Wiley-VCH,2008,和Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)，其各自通过引用整体并入本文。
术语“纯化(purify/purified/purification)”意指使基本上纯或干净，不含不需要的组分、材料污染、添加物或瑕疵。
术语“显著的”或“显著地”与术语“实质上”同义使用。
术语“稳定的”是指这样一种化合物：足够稳健以从反应混合物中分离至有用的纯度，并且优选能够配制成有效的治疗剂。
术语“稳定化”、“稳定化的”、“稳定化的区域”意指使稳定或变得稳定。
术语“实质上”是指展示全部或接近全部范围或程度的感兴趣的特性或性质的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，本文使用术语“实质上”来捕捉许多生物和化学现象中固有的潜在的完整性不足。
术语“治疗”是指部分或完全减轻、缓解、改善、缓和特定感染、疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或降低其发生率。例如，“治疗”癌症可以指代抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。可以向没有表现出疾病、病症和/或疾患的迹象的受试者和/或向仅表现出疾病、病症和/或疾患的早期迹象的受试者施用治疗，以为了降低发展与疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险的目的。
术语“体外”是指发生在人工环境中，例如，在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在培养皿中等，而不是在生物体(例如，动物、植物或微生物)内的事件。
术语“体内”是指发生在生物体(例如，动物、植物或微生物或者它们的细胞或组织)内的事件。
术语“中性脂质”意指在选定pH下以不带电荷或中性两性离子形式存在的脂质种类。在生理pH下，此类脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
术语“非阳离子脂质”意指如本文所述的两亲脂质、中性脂质或阴离子脂质。
术语“低聚物”可以与“多核苷酸”互换使用并且是指包含至少两个单体的分子并且包括寡核苷酸诸如DNA和RNA。在低聚物含有RNA单体和/或解锁核酸(UNA)单体的情况下，本公开的低聚物可含有除编码序列(CDS)之外的序列。这些额外的序列可以是非翻译序列，即不被宿主细胞转化为蛋白质的序列。这些非翻译序列可包括5'帽、5'非翻译区(5’UTR)、3'非翻译区(3’UTR)和尾区，例如polyA尾区。如本文进一步详细描述的，这些非翻译序列中的任一者可含有一个或多个UNA单体-这些UNA单体不能被宿主细胞的机制翻译。在本公开的上下文中，“mRNA序列”、“mRNA序列”、“可翻译多核苷酸”或“可翻译化合物”是指包含区域，例如RNA的编码区(例如，人CFTR的编码序列或其密码子优化版本)的序列，所述区域能够被转化为蛋白质或其片段，例如，人CFTR蛋白质或其片段。
术语“受试者”是指根据本公开的组合物可以例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的向其施用的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人)和/或植物。
实施例
在以下实施例中更详细地说明了本公开的另外的实施方案，这些实施例不旨在以任何方式限制权利要求的范围。
实施例1：一般材料和方法
在本文所述的实施例中进行的实验是使用根据熟知的方法制造的脂质纳米颗粒组合物进行的，所述熟知的方法例如，美国申请号16/823,212中描述的那些，其内容出于教授脂质纳米颗粒制造方法的特定目的通过引用并入。脂质纳米颗粒组合物和冻干产品的特征在于若干性质。此实施例中提供了用于这些表征过程的材料和方法以及一种制造用于冻干实验的脂质纳米颗粒组合物的一般方法。
脂质纳米颗粒制造
实施例中使用的脂质纳米颗粒制剂是通过将乙醇中的脂质(阳离子脂质:辅助脂质:胆固醇:PEG-脂质)与溶解在柠檬酸盐缓冲液中的RNA混合来制造的。混合材料立即用磷酸盐缓冲液稀释。通过使用再生纤维素膜(100kD MWCO)对磷酸盐缓冲液进行透析或通过使用改性聚醚砜(mPES)中空纤维膜(100kD MWCO)进行切向流过滤(TFF)来去除乙醇。一旦完全去除乙醇，将缓冲液更换为含有10-300(例如，40-60)mM NaCl和5-15％蔗糖、pH 7.3的HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液。将制剂浓缩，随后使用PES过滤器进行0.2μm过滤。然后通过Ribogreen荧光测定法测量制剂中的RNA浓度，并通过用含有10-100(例如40-60)mM NaCl、0-15％蔗糖、pH 7.2-8.5且含有甘油的HEPES缓冲液稀释将浓度调节至最终所需浓度。如果不立即用于进一步研究，则将最终制剂通过0.2μm过滤器过滤并装入玻璃小瓶中，加塞，加盖并置于-70±5℃。脂质纳米颗粒制剂的特征在于它们的pH和渗透压。脂质含量和RNA含量通过高效液相色谱法(HPLC)测量，并且mRNA完整性通过片段分析仪测量。
动态光散射(DLS)
实施例中使用的脂质纳米颗粒制剂的平均粒径(z)和多分散指数(PDI)是通过在Malvern Zetasizer Nano ZS(United Kingdom)上的动态光散射测量的。
RiboGreen测定法
使用RiboGreen荧光测定法表征脂质纳米颗粒制剂的包封率。RiboGreen是一种专有荧光染料(Molecular Probes/Invitrogen是Life Technologies的一个部门，现在是Thermo Fisher Scientific of Eugene,Oregon,United States的一部分)，它用于检测和量化核酸(包括RNA和DNA两者)。在其游离形式下，RiboGreen几乎不表现出荧光并且具有可忽略的吸光度特征。当与核酸结合时，染料发出的荧光强度比未结合形式高几个数量级。然后可以通过传感器(荧光计)检测荧光，并可对核酸进行量化。
蛋白质印迹
通过使用蛋白质印迹测定法测量适用的蛋白质表达或敲低活性来测试脂质纳米颗粒制剂的体内功效。在所述测定中，使用96孔胶原蛋白板在杜氏改良Eagle培养基(DMEM)/胎牛血清(FBS)培养基中以适当的密度接种由适用的脂质纳米颗粒制剂转染的细胞。在最佳汇合度时，将细胞用脂质纳米颗粒制剂转染，并在转染试剂混合物(MessengerMax和Opti-MEM)中进行稀释。然后将细胞置于CO2培养箱中并使其生长。在所需时间点，去除培养基，并且将细胞在4％新鲜多聚甲醛(PFA)中固定20min。之后，去除固定剂，并且将细胞在含TWEEN的Tris缓冲盐水(TBST)中透化数次，每次5分钟。当透化洗涤完成时，将细胞与封闭缓冲液(
Figure BDA0004121678290000511
封闭缓冲液(PBS)(Li-Cor,Lincoln,NE))一起孵育45min。然后添加一抗并在室温下孵育1小时。然后将细胞在TBST中洗涤数次，并与在封闭缓冲液中稀释且含有CellTag 700染料的二抗一起孵育1小时。最后，将细胞在TBST中洗涤数次，随后在Tris缓冲盐水(TBS)中进行最后一次洗涤。使用Licor(Lincoln,Nebraska USA)检测系统对板进行成像，并将数据标准化为由CellTag 700标记的细胞总数。
实施例2：预处理的悬浮液中各种赋形剂(冻干保护剂)的评价
进行实验以评价各种赋形剂对如实施例1中所述制备的脂质纳米颗粒制剂的冻干产品质量的影响。冻干脂质纳米颗粒制剂的质量通过分析冻干后的制剂并将其与冻干之前以及常规冷冻/解冻循环(即，在约-70℃下冷冻，然后在室温下解冻)之后的脂质纳米颗粒制剂进行比较来评估。
脂质纳米颗粒制剂的分析包括粒径和多分散性(PDI)以及包封率(％包封)的分析。将冻干后的粒径与冻干前的粒径进行比较，并将差异报告为delta(δ)。就各种测试组合物是否满足性能阈值来进行筛选，所述性能阈值包括最小粒径增加(δ＜10nm)、PDI维持(＜0.2)和维持高包封率(＞85％)。
冻干脂质纳米颗粒制剂通过首先过滤后添加下面确定的赋形剂达到所列浓度来预处理根据实施例1制备的脂质纳米颗粒制剂的悬浮液来制备。采用缓慢冷冻梯度的冻干循环，在-20℃下进行初次干燥，随后在25℃下进行二次干燥。冻干循环在Millrock Revo冷冻干燥机(型号RV85S4)中进行，使用具有0.25mg RNA/mL脂质纳米颗粒浓度的2.0mL悬浮液的等分试样。冻干后，将冻干产品在2.0mL水中复溶并如上所述进行分析。
在目前公开的研究中调查的赋形剂列于下表1中。
表1：研究的赋形剂列表
Figure BDA0004121678290000531
Figure BDA0004121678290000541
上文赋形剂中的两种，人白蛋白(HA)和聚乙烯醇1(PVA1)用于初始评价，参数和结果列于下表2中。还研究了无赋形剂或具有甘油的比较制剂。
表2.研究条件和结果
Figure BDA0004121678290000542
如表2所示，所测试的冻干循环和赋形剂未产生具有足够性能的脂质纳米颗粒制剂。1.0％w/v的HA浓度和0.05％w/v的PVA1浓度提供了最好的结果。
实施例3：脂质纳米颗粒浓度影响的评价
进行了额外的实验以研究脂质纳米颗粒浓度(以悬浮液中RNA的浓度测量)、缓冲液浓度、盐浓度、冷冻保护剂浓度和冻干保护剂浓度(泊洛沙姆)对冻干产品的质量和性能的影响。
在下表3中列出的九种不同的冻干实验中对这些参数进行了研究。冻干脂质纳米颗粒制剂通过首先过滤后预处理根据实施例1制备的包含约21个核苷酸的siRNA的脂质纳米颗粒制剂的悬浮液成包含表3中所列的赋形剂和条件来制备。预处理之后，在与实施例2中描述的条件类似的条件下冻干预处理制剂。表3中列出的实验1-9中的每一者都在0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL和2.0mg/mL的脂质纳米颗粒浓度下进行。然后将所得冻干组合物复溶并表征其粒径、包封百分比和PDI。
表3.冻干实验条件
Figure BDA0004121678290000551
1mg脂质纳米颗粒/mL研究的结果示出在图1中。可以看出，对于粒径参数，A3、B2、C1/C3和D2显示的粒径最小，其中A3显示的总体粒径最佳。对于包封百分比，参数A3、B2、C1和D1显示其相应赋形剂组的最佳结果，其中D1显示的总体包封百分比最佳。最后，对于多分散性(PDI)，参数A3、B2、C3和D1显示其相应赋形剂组的最佳PDI，其中C3显示的总体PDI最佳。因此，这些实验确定对于给定的赋形剂，包含A3(15％甘油)、B2(10mM缓冲液)、C1(0mM盐)和D1/D2(0％-0.1％泊洛沙姆)的组合物将提供最佳结果。还对测试的脂质纳米颗粒浓度进行了相同的分析，并且所发现的每种浓度的最佳条件示于表4中。
表4.不同脂质纳米颗粒浓度的冻干研究结果
Figure BDA0004121678290000561
进行了进一步的研究，以确定在条件1-4中以0.1％和0.2％ P188的浓度在冻干前与冻干后添加泊洛沙姆(冻干保护剂)的影响。图2A示出了冻干前实验的结果，而图2B示出了冻干后实验的结果。可以看出，发现在冻干后添加泊洛沙姆(作为复溶的一部分)最能维持包封百分比(在图表中显示为圆圈)。
最后，图3示出了表征在不同浓度的脂质纳米颗粒下在冻干后用泊洛沙姆处理的脂质纳米颗粒制剂的结果。可以看出，在约0.25mg/mL的浓度下，观察到约85nm的粒径，而在更高浓度下观察到更大的粒径。包封百分比在此图中显示为条形曲线，并显示每种制剂的良好包封。
实施例4：两种额外PVA赋形剂的评价
在获得实施例2和实施例3的结果之后，进行进一步研究以比较其他PVA赋形剂对冻干产品的影响。所述两种PVA赋形剂是PVA2和PVA3，如上表1中所述。实验的条件和结果在下表5中提供。在这些实验中，重复实施例2的冻干循环，不同之处在于初次干燥温度变为-25℃。
表5：两种额外PVA赋形剂的评价条件和结果
Figure BDA0004121678290000571
一般而言，没有一个制剂同时显示出可接受的δ值和包封百分比值，但是第13组和第15组确实显示出优良的δ值。决定了用不同的冻干循环进行进一步研究，并且评估添加蔗糖的影响。
实施例5：关于使用不同冻干循环的PVA赋形剂的进一步研究
扩展实施例4的实验以研究冻干循环的影响和进一步添加蔗糖的影响。在此研究中，实施例2和实施例4的冻干循环被改变为将悬浮液装载到小瓶中并在
-48℃下冷冻，初次干燥温度为-35℃，二次干燥步骤为10℃，并且冻干悬浮液的体积减少到1.5mL。此研究的条件和结果在下表6中提供。
表6：冻干循环和添加蔗糖的研究条件和结果
Figure BDA0004121678290000581
Figure BDA0004121678290000591
在此进一步的研究中，较低的干燥温度导致脂质纳米颗粒制剂的质量较高，这在比较具有1.0％ HA的制剂(第4组)时最容易观察到。还可以看出，高蔗糖提高了粒径但降低了包封百分比。
实施例6：各种PVA赋形剂的评价
设计并进行了进一步的研究，以比较各种浓度下不同PVA赋形剂的效果。此研究中使用的PVA赋形剂为PVA1、PVA2、PVA3、PVA4、PVA5、PVA6和PVA7。冻干实验的条件和结果在下表7中提供。在此实验中使用实施例5的冻干循环。
表7：
Figure BDA0004121678290000601
Figure BDA0004121678290000611
PVA3制剂观察到最低的δ值以及可接受的包封百分比值和PDI值。第14组的结果也表明PVA3与人白蛋白(HA)的组合比仅使用PVA3(第9-12组)具有更好的效果。
实施例7：PVA赋形剂的额外一轮评价
进行进一步的研究以吸取实施例6的知识并将它们与其他PVA赋形剂，特别是PVA8、PVA9和PVA10进行比较。如先前实施例中所述制备脂质纳米颗粒制剂，并且在这些实验中应用实施例5的冻干循环，不同之处在于应用-25℃的初次干燥温度。具体条件和结果示出在表8中。
表8：进一步PVA研究的条件和结果
Figure BDA0004121678290000621
Figure BDA0004121678290000631
Figure BDA0004121678290000641
结果表明PVA10在第48、49和51组中示出很好的结果，示出良好的包封值和δ值。PVA3在第12-13和16-19组中也示出很好的值。
实施例8：PVA3和PVA10的直接比较研究
通过实施例7的研究知识，设计了进一步的实验以直接比较使用PVA3或PVA10的制剂。在此实验中，如实施例1中所述制备脂质纳米颗粒制剂，并应用实施例5的冻干循环。这些实验的条件和结果在表9中提供。
表9：PVA3和PVA10制剂的比较
Figure BDA0004121678290000651
Figure BDA0004121678290000661
Figure BDA0004121678290000671
Figure BDA0004121678290000681
Figure BDA0004121678290000691
在这些研究中，几个组的δ值较大，并且显示的δ值小于5的组具有低包封率。相反，其他组显示高于90％的良好包封率值，但δ值较高。PVA3和PVA10在所测试的条件下是可比的，并且此实验的最佳条件似乎是第33组和第63组的条件。
实施例9：使用山梨酸钾的研究
接下来设计实验以评估山梨酸钾(KS)对可能包含PVA的冻干脂质纳米颗粒的影响。如实施例1中所述制备脂质纳米颗粒制剂，并应用实施例5的冻干循环。具体条件和结果示出在表10中。
表10：山梨酸钾制剂的条件和结果
Figure BDA0004121678290000692
Figure BDA0004121678290000701
人白蛋白和PVA组合的组没有显示出可接受的结果。第12组和第13组显示出良好的δ值和良好的包封率。选择这些组的条件进行进一步研究。
实施例10：对山梨酸钾和苯甲酸钠的进一步研究
在此研究中，针对1.0mg/mL的RNA浓度进一步研究了实施例9的实验条件。还进行了包含PVA11和聚山梨醇酯20(PS20)的研究。如实施例1中所述制备脂质纳米颗粒制剂，并应用实施例5的冻干。条件和结果在下表11中提供(注意：F/T表示冷冻-解冻制剂，制剂在-70℃下冷冻，然后在表征之前解冻)。
表11：对山梨酸钾的进一步研究
Figure BDA0004121678290000711
Figure BDA0004121678290000721
Figure BDA0004121678290000731
Figure BDA0004121678290000741
结果表明，从实施例9中选择的制剂(0.05％PVA+0.05MNaCl+0.1M KS)是可重现的，并且即使在较高浓度的RNA下也提供了关于粒径保持(δ)、PDI和包封百分比的良好结果(参见第41组、第42组和第43组)。在一些条件下，苯甲酸钠(NaB)也显示出良好的结果(第44组和第55组)。聚山梨醇酯20也被证明是一种良好的冷冻保护剂，即使在0.05％w/v(第36组)下也能维持脂质颗粒的完整性，但不是作为冷冻保护剂。测试的其他盐和赋形剂未显示出与山梨酸钾相当的有效性。
实施例11：对不含PVA的制剂的研究
在此实验中，应用先前的知识来观察脂质纳米颗粒是否可以在不使用PVA，而是使用疏水盐与人白蛋白的组合的情况下冻干。如实施例1中所述制备脂质纳米颗粒制剂，并应用实施例5的冻干循环。具体条件和结果在下表12中提供。
表12：对去除PVA的研究
Figure BDA0004121678290000751
Figure BDA0004121678290000761
Figure BDA0004121678290000771
Figure BDA0004121678290000781
结果表明，用疏水盐与人白蛋白(HA)组合代替PVA不会产生足够的冻干脂质纳米颗粒制剂。
实施例12：关于替代赋形剂的研究
设计此研究以测试山梨酸钾是否可以被其他赋形剂代替。此研究还评价了这些赋形剂如何在降低的RNA浓度下发挥作用，并且在0.25mg RNA/mL的浓度下进行。测试的赋形剂包括碘克沙醇和L-脯氨酸(Pro)。如实施例1中所述制备脂质纳米颗粒制剂，并应用实施例5的冻干循环。表13中提供了预处理的悬浮液与冷冻-解冻制剂相比的具体条件和对应的结果。
表13：关于替代赋形剂和较低RNA浓度的研究
Figure BDA0004121678290000782
Figure BDA0004121678290000791
Figure BDA0004121678290000801
Figure BDA0004121678290000811
Figure BDA0004121678290000821
此研究的结果表明，只要使用相同比率的赋形剂与RNA，就可以降低预处理制剂中使用的赋形剂的浓度(参见第1-3组)。苯甲酸钠(NaB)在0.25mg RNA/mL时显示出与山梨酸钾(KS)相同水平的结果。L-脯氨酸的实验表明它不是山梨酸钾的有效替代品。相反，碘克沙醇被证明是一种有效的冻干保护剂，并甚至改进了具有PVA和脯氨酸的制剂(第22-26组)，但也可用于不包含PVA的制剂(第47组和第48组)。
实施例12：复溶制剂的体内测试
测试了从先前实施例的研究中选择的制剂的体内功效。包含0.25mg/mL编码人EPO蛋白(hEPO)的mRNA的脂质纳米颗粒，这是一种对成功转染样本的能力和测量mRNA体内翻译效率的常见测试。使用实施例5的冻干循环以经计算达到3.0mL的最终体积的量冻干制剂。实验还包括测量5％甘油中的对照冷冻-解冻制剂和阴性PBS对照。表14中提供了制剂的条件，表14还示出了这些制剂在体内研究之前的表征。
表14：在体内研究中使用的制剂的条件和表征
Figure BDA0004121678290000831
研究的结果示出在图4中。所有复溶制剂均显示出良好的hEPO表达，其中组合物3和组合物4显示出接近冷冻-解冻对照的表达。
实施例13：具有较大mRNA的不同制剂的测试
对先前实施例中开发的冻干组合物进行了测试，看它们是否可以应用于mRNA具有较大大小的mRNA-脂质纳米颗粒制剂。测试了两种mRNA：大小为约1332个核苷酸的mRNA1和大小为约4868个核苷酸的mRNA2。如实施例1中所述制备制剂，并应用实施例5的冻干循环。冻干研究的条件和结果在表15中提供。
表15：较大mRNA的冻干实验
Figure BDA0004121678290000841
Figure BDA0004121678290000851
Figure BDA0004121678290000861
结果表明冻干制剂适用于大小较大的mRNA构建体。特别是，第25组、第26组和第27组的制剂在复溶后显示出极好的结果。
实施例14：其他制剂
此实验使用mRNA2测试了P188和其他组合对冻干脂质纳米颗粒制剂的影响。如实施例1中所述制备脂质纳米颗粒制剂，并应用实施例5的冻干循环。表16中提供了制剂的具体条件以及冻干后和复溶制剂的结果。
表16：其他组合的冻干研究
Figure BDA0004121678290000862
Figure BDA0004121678290000871
结果表明，可以使用除包含碘克沙醇的制剂外的制剂，因为所有测试组均显示包封率高于99％。此外，第组和第7组显示出与使用碘克沙醇的第17组接近的δ值。
实施例15：自我复制RNA的冻干
自我复制RNA(又名复制子RNA)通常比普通mRNA大，并且设计了测试以确定自我复制RNA脂质纳米颗粒制剂是否可以成功冻干。
如实施例1中所述制备制剂，其中自我复制RNA浓度在0.10至2.0mg/mL范围内。使用以下冻干循环：
初始冷冻(搁板温度)：-52℃，30分钟
再冷冻5分钟，真空设定点300毫托
初次干燥：
1.-48℃，维持30分钟，真空设定点50毫托
2.-40℃持续15至60分钟，真空设定点50毫托
3.维持-40℃，真空设定点50毫托，直到达到4毫托的压差。(压差表示冻干室中相对湿度的变化)。
在5℃、真空设定点100毫托下进行二次干燥持续1200分钟。
测试了表17中所示的以下配制条件中的每一者：
表17：用于自我复制RNA冻干的制剂
Figure BDA0004121678290000881
发现上述条件的结果在复溶后产生具有足够大小、多分散性和δ值的冻干脂质纳米颗粒制剂。
实施例15：自我复制RNA-脂质纳米颗粒制剂的冻干
此实施例中进行的方法使用根据众所周知的方法制造的脂质纳米颗粒组合物来进行，所述众所周知的方法例如美国申请号16/823,212中所述的那些，其内容出于教导脂质纳米颗粒制造方法的具体目的通过引用并入。脂质纳米颗粒组合物和冻干产品的特征在于若干性质。此实施例中提供了用于这些表征过程的材料和方法以及一种制造用于冻干实验的脂质纳米颗粒组合物的一般方法。
脂质纳米颗粒制造
此实施例中使用的脂质纳米颗粒制剂是通过将乙醇中的脂质(可电离阳离子脂质(ATX-126):辅助脂质:胆固醇:PEG-脂质)与溶解在柠檬酸盐缓冲液中的RNA混合来制造的。混合材料立即用磷酸盐缓冲液稀释。通过使用再生纤维素膜(100kD MWCO)对磷酸盐缓冲液进行透析或通过使用改性聚醚砜(mPES)中空纤维膜(100kD MWCO)进行切向流过滤(TFF)来去除乙醇。一旦完全去除乙醇，将缓冲液更换为含有10-300(例如，40-60)mM NaCl和5-15％蔗糖、pH 7.3的HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液。将制剂浓缩，随后使用PES过滤器进行0.2μm过滤。然后通过RiboGreen荧光测定法测量制剂中的RNA浓度，并通过用含有10-100(例如40-60)mM NaCl、0-15％蔗糖、pH 7.2-8.5且含有甘油的HEPES缓冲液稀释将浓度调节至最终所需浓度。如果不立即用于进一步研究，则将最终制剂通过0.2μm过滤器过滤并装入玻璃小瓶中，加塞，加盖并置于-70±5℃。脂质纳米颗粒制剂的特征在于它们的pH和渗透压。脂质含量和RNA含量通过高效液相色谱法(HPLC)测量，并且mRNA完整性通过片段分析仪测量。
冻干过程
自我复制RNA(又名复制子RNA)通常比普通mRNA大，并且设计了测试以确定自我复制RNA脂质纳米颗粒制剂是否可以成功冻干。冻干脂质纳米颗粒制剂的质量通过分析冻干后的制剂并将其与冻干之前以及常规冷冻/解冻循环(即，在约-70℃下冷冻，然后在室温下解冻)之后的脂质纳米颗粒制剂进行比较来评估。
脂质纳米颗粒制剂的分析包括粒径和多分散性(PDI)以及包封率(％包封)的分析。将冻干后的粒径与冻干前的粒径进行比较，并可将差异报告为delta(δ)。就各种测试组合物是否满足性能阈值来进行筛选，所述性能阈值包括最小粒径增加(δ＜10nm)、PDI维持(＜0.2)和高包封率维持(＞85％)。
如上所述制备脂质纳米颗粒制剂，其中自我复制RNA的长度超过11,000个核苷酸。然后用缓冲液交换处理所得脂质纳米颗粒制剂以形成具有浓度为0.05至2.0mg/mL的自我复制RNA、0.01至0.05M山梨酸钾、0.01至0.10％w/v泊洛沙姆188
Figure BDA0004121678290000902
14至18％w/v蔗糖、25至75mM NaCl和15至25mM pH 8.0Tris缓冲液的冻干前悬浮液。然后使用2.0mL悬浮液的等分试样和下表18中提供的冻干循环将冻干前制剂在Millrock Revo冷冻干燥机(型号RV85S4)中冻干。
表18：自我复制RNA-脂质纳米颗粒制剂的冻干循环
Figure BDA0004121678290000901
将按照上述方法制备的冻干颗粒在2mL水中复溶，并使用DLS和RiboGreen进行表征。下表19中提供的结果表明，发现冻干组合物在复溶后产生具有足够大小、多分散性和δ值(约5.3nm)的冻干脂质纳米颗粒制剂。
表19：LYO前和LYO后的自我复制RNA-脂质纳米颗粒特性
平均粒径(nm) PDI 包封(％)
LYO前 76.3 0.129 97
LYO后 81.6 0.152 93
其他考虑
提供前述说明是为了使本领域技术人员能够实践本文所述的各种配置。虽然已经参考各个附图和配置具体描述了主题技术，但是应当理解，这些仅为了说明目的并且不应被视为限制主题技术的范围。
可能有许多其他方式来实现主题技术。在不脱离主题技术的范围的情况下，本文所述的各个功能和元素可以不同于所示的那些进行划分。对这些配置的各种修改对于本领域技术人员来说将容易是显而易见的，并且本文定义的一般原理可以应用于其他配置。因此，在不脱离主题技术的范围的情况下，本领域的普通技术人员可以对主题技术进行许多改变和修改。
应了解所公开的工艺的步骤的特定次序或层级是示例性方法的说明。基于设计偏好，应了解工艺的步骤的特定次序或层级可被重新配置。一些步骤可同时进行。所附的方法权利要求以样品次序呈现各个步骤的元素，并且不意在限于所呈现的特定次序或层级。
如本文所用，在一系列项目(用术语“和”或“或”来分隔项目中的任一者)之前的短语“中的至少一个”修饰整个列表，而不是列表的每个成员(即，每个项目)。短语“中的至少一个”并不要求选择所列每个项目的至少一个；相反，该短语允许的含义包括项目中任何一者的至少一个，和/或项目的任何组合的至少一个，和/或项目中每一者的至少一个。例如，短语“A、B和C中的至少一个”或“A、B或C中的至少一个”各自是指仅A、仅B或仅C；A、B和C的任何组合；和/或A、B和C中每一者的至少一个。
此外，就说明书或权利要求中使用术语“包括(include)”、“具有(have)”等而言，此术语意在以与术语“包含(comprise)”在权利要求中用作过渡词时“包含(comprise)”被解释时类似的方式具有包括性。
在一个或多个方面，术语“约”、“基本上”和“大约”可以为它们的对应项目和/或项目之间的相关性提供行业可接受的容许偏差，诸如从小于百分之一至百分之五。
除非特别说明，否则提及单数形式的元素不旨在意指“一个且仅一个”，而是意指“一个或多个”。男性代词(例如，他的)包括女性和中性(例如，她的和它的)且反之亦然。术语“一些”是指一个或多个。带下划线和/或斜体的标题和副标题仅为方便起见而使用，不限制主题技术，并且不与主题技术的说明的解释联系。本领域普通技术人员已知或日后将知晓的本公开中描述的各种配置的元素的所有结构和功能等同物通过引用明确并入本文，并且旨在涵盖在主题技术中。此外，本文所公开的任何内容均无意献给公众，无论此公开是否在以上说明中明确叙述。
尽管具体实施方式含有许多细节，但这些不应被解释为限制主题技术的范围，而仅应被解释为说明主题技术的不同实施例和方面。应当理解，主题技术的范围包括上面未详细讨论的其他实施方案。在不脱离本公开的范围的情况下，可以对本文公开的主题技术的方法和器具的布置、操作和细节进行各种其他修改、改变和变化。除非另有说明，除非明确说明，否则单数形式的元素的提及不旨在意指“一个且仅一个”，而是意在意指“一个或多个”。此外，装置或方法不必解决可由本公开的不同实施方案解决的每个问题(或具有可实现的每个优点)来涵盖在本公开的范围内。本文使用的“可以”及其派生词应在“可能”或“任选地”的意义上理解，而不是肯定的能力。

Claims (142)

1.一种冻干包含包封RNA的脂质纳米颗粒的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供所述脂质纳米颗粒在液体介质中的悬浮液，其中所述液体介质包含约4％w/v至约22％w/v的糖类；以及
b.调节所述液体介质从而形成包含至少一种选自山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和碘克沙醇的赋形剂的预处理的悬浮液。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括步骤(c)：
c.使所述预处理的悬浮液经受冻干过程，其包括：
i.在-48±8℃的温度和大气压力下进行的初始冷冻步骤；
ii.在-20±2℃至-48±2℃范围内的温度和约25毫托至约100毫托范围内的压力下进行的初次干燥步骤；以及
iii.在5±2℃至30±2℃范围内的温度和约30毫托至约300毫托范围内的压力下进行的二次干燥步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其还包括步骤(c)：
c.使所述预处理的悬浮液经受冻干过程，其包括：
i.在-48±8℃的温度和大气压力下进行的初始冷冻步骤；
ii.在约0.03至约0.08毫巴的压力下进行并在-48±8℃的温度下开始并在约40至约75小时范围内的时间段内升温至0±2℃的温度的初次干燥步骤；以及
iii.在约0.03至约0.08毫巴的压力下进行并在0±2℃的温度下开始并在约30至约50小时范围内的时间段内升温至约25±3℃的温度的二次干燥步骤。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述液体介质是水性介质。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述悬浮液中的所述RNA具有在约0.05mg/mL至约2.0mg/mL范围内的浓度。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述悬浮液中的所述RNA具有在约0.075mg/mL至约0.3mg/mL范围内的浓度。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述悬浮液中的所述RNA具有在约0.1mg/mL至约1.5mg/mL范围内的浓度。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述悬浮液中的所述RNA具有在约0.1mg/mL至约1.0mg/mL范围内的浓度。
9.如权利要求5所述的方法，所述悬浮液中的所述RNA具有在约0.1mg/mL至约0.5mg/mL范围内的浓度。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述悬浮液中总脂质与RNA的重量比为约50:1至约10:1。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述悬浮液中总脂质与RNA的重量比为约40:1至约20:1。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述悬浮液中总脂质与RNA的重量比为约35:1至约25:1。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预处理的悬浮液包含硫代硫酸盐。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述硫代硫酸盐为硫代硫酸钠或硫代硫酸钾。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述硫代硫酸盐具有约0.025％w/v至约1.0％w/v的浓度。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述硫代硫酸盐具有约0.025％w/v至约0.75％w/v的浓度。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述硫代硫酸盐具有约0.025％w/v至约0.5％w/v的浓度。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述硫代硫酸盐具有约0.05％w/v至约0.3％w/v的浓度。
19.如权利要求13所述的方法，其中所述硫代硫酸盐具有约0.05％w/v至约0.25％w/v的浓度。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预处理的悬浮液包含山梨酸钾。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述山梨酸钾具有约0.01M至约0.5M的浓度。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述山梨酸钾具有约0.02M至约0.4M的浓度。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述山梨酸钾具有约0.025M至约0.3M的浓度。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述山梨酸钾具有约0.03M至约0.2M的浓度。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述山梨酸钾具有约0.035M至约0.1M的浓度。
26.如权利要求20所述的方法，其中所述山梨酸钾具有约0.04M至约0.08M的浓度。
27.如权利要求20所述的方法，其中所述山梨酸钾具有约0.01M至约0.05M的浓度。
28.如权利要求20所述的方法，其中所述山梨酸钾具有约0.02M至约0.04M的浓度。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预处理的悬浮液包含碘克沙醇。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述碘克沙醇具有约5％w/v至约15％w/v的浓度。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述碘克沙醇具有约6％w/v至约13％w/v的浓度。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述碘克沙醇具有约7％w/v至约11％w/v的浓度。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述碘克沙醇具有约8％w/v至约10％w/v的浓度。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预处理的悬浮液包含苯甲酸钠。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述苯甲酸钠具有约0.01M至约0.6M的浓度。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述苯甲酸钠具有约0.02M至约0.5M的浓度。
37.如权利要求34所述的方法，其中所述苯甲酸钠具有约0.03M至约0.4M的浓度。
38.如权利要求34所述的方法，其中所述苯甲酸钠具有约0.04M至约0.3M的浓度。
39.如权利要求34所述的方法，其中所述苯甲酸钠具有约0.05M至约0.2M的浓度。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预处理的悬浮液还包含聚乙烯醇(PVA)。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述PVA具有约0.01％w/v至约0.75％w/v的浓度。
42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预处理的悬浮液还包含NaCl。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述NaCl具有约0.005M至约0.5M的浓度。
44.如权利要求42所述的方法，其中所述NaCl具有约0.01M至约0.4M的浓度。
45.如权利要求42所述的方法，其中所述NaCl具有约0.015M至约0.3M的浓度。
46.如权利要求42所述的方法，其中所述NaCl具有约0.015M至约0.2M的浓度。
47.如权利要求42所述的方法，其中所述NaCl具有约0.015M至约0.1M的浓度。
48.如权利要求42所述的方法，其中所述NaCl具有约0.02M至约0.05M的浓度。
49.如权利要求42所述的方法，其中所述NaCl具有约.03M至约0.07M的浓度。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述糖类是蔗糖。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述蔗糖具有约8％w/v至约20％w/v的浓度。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述蔗糖具有约7％w/v至约11％w/v的浓度。
53.如权利要求50所述的方法，其中所述蔗糖具有约8％w/v至约10％w/v的浓度。
54.如权利要求50所述的方法，其中所述蔗糖具有约16％w/v至约20％w/v的浓度。
55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体介质或预处理的悬浮液包含缓冲液。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述缓冲液选自MOPS、HEPES、TRIS、MES、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述缓冲液是TRIS。
58.如权利要求55至57中任一项所述的方法，其中所述缓冲液的浓度为约10mM至约100mM。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述缓冲液的浓度为约15mM至约75mM。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述缓冲液的浓度为约10mM至约40mM。
61.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体介质或所述预处理的悬浮液具有约7.0至约8.5的pH。
62.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在步骤(b)之后，将预定冻干体积的所述预处理的悬浮液等分到单独的容器中。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述预定冻干体积在约0.5mL至约10.0mL的范围内。
64.如权利要求62所述的方法，其中所述预定冻干体积在约1.0mL至约3.0mL的范围内。
65.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预处理的悬浮液还包含泊洛沙姆。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
67.如权利要求65或权利要求66所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为约0.01％w/v至约0.10％w/v。
68.如权利要求65或权利要求66所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为约0.02％w/v至约0.8％w/v。
69.如权利要求65或权利要求66所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为约0.03％w/v至约0.7％w/v。
70.如权利要求65或权利要求66所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为约0.04％w/v至约0.06％w/v。
71.一种通过如权利要求1至70中任一项所述的方法制备的产品。
72.一种冻干组合物，其包含包封核酸的脂质纳米颗粒、单糖以及一种或多种选自山梨酸钾、硫代硫酸盐、苯甲酸钠和碘克沙醇的赋形剂。
73.如权利要求72所述的冻干组合物，其中所述核酸是RNA。
74.如权利要求73所述的冻干组合物，其中所述RNA是自我复制RNA。
75.如权利要求73所述的冻干组合物，其中所述RNA是mRNA。
76.如权利要求73至75中任一项所述的冻干组合物，其中所述核酸的长度为约20个核苷酸至约13000个核苷酸。
77.如权利要求72至76中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物中总脂质与核酸的重量比为约50:1至约10:1。
78.如权利要求77所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物中总脂质与RNA的重量比为约40:1至约20:1。
79.如权利要求77所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物中总脂质与RNA的重量比为约35:1至约25:1。
80.如权利要求72至79中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与RNA的重量比为约30:1至约250:1。
81.如权利要求72至79中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与RNA的重量比为约40:1至约200:1。
82.如权利要求72至79中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含山梨酸钾，山梨酸钾与RNA的重量比为约50:1至约175:1。
83.如权利要求72至82中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含硫代硫酸钠，硫代硫酸钠与RNA的重量比为约0.25:1至约40:1。
84.如权利要求72至82中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含硫代硫酸钠，硫代硫酸钠与RNA的重量比为约2:1至约10:1。
85.如权利要求72至82中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含硫代硫酸钠，硫代硫酸钠与RNA的重量比为约3:1至约8:1。
86.如权利要求72至85中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含苯甲酸钠，苯甲酸钠与RNA的重量比为约1:1至约12:1。
87.如权利要求72至85中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含苯甲酸钠，苯甲酸钠与RNA的重量比为约2:1至约10:1。
88.如权利要求72至85中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含苯甲酸钠，苯甲酸钠与RNA的重量比为约3:1至约9:1。
89.如权利要求72至88中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与RNA的重量比为约100:1至约800:1。
90.如权利要求72至88中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与RNA的重量比为约150:1至约750:1。
91.如权利要求72至88中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与RNA的重量比为约200:1至约700:1。
92.如权利要求72至88中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物包含碘克沙醇，碘克沙醇与RNA的重量比为约250:1至约650:1。
93.如权利要求72至92中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物还包含聚乙烯醇(PVA)，PVA与RNA的重量比为约1:1至约12:1。
94.如权利要求72至93中任一项所述的冻干组合物，其中所述糖类是蔗糖，蔗糖与RNA的重量比为约100:1至约800:1。
95.如权利要求72至94中任一项所述的冻干组合物，其中所述冻干组合物还包含选自HEPES、MOPS、TRIS、MERS、柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲液，缓冲液与RNA的重量比为约3:1至约150:1。
96.一种冻干组合物，其包含包封RNA的脂质纳米颗粒、泊洛沙姆、山梨酸钾和糖。
97.如权利要求96所述的组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
98.如权利要求96或权利要求97所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.001至约1.0％w/w的所述RNA。
99.如权利要求98所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.005至约0.8％w/w的所述RNA。
100.如权利要求98所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.01至约0.5％w/w的所述RNA。
101.如权利要求98所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.02至约0.4％w/w的所述RNA。
102.如权利要求98所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.03至约0.3％w/w的所述RNA。
103.如权利要求98所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.04至约0.2％w/w的所述RNA。
104.如权利要求96至103中任一项所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.5至约5.0％w/w的脂质。
105.如权利要求104所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约1.0至约4.0％w/w的脂质。
106.如权利要求104所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约1.25至约3.0％w/w的脂质。
107.如权利要求96至106中任一项所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.5至约2.5％w/w的TRIS缓冲液。
108.如权利要求107所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.75至约2.25％w/w的TRIS缓冲液。
109.如权利要求107所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约1.0至约2.0％w/w的TRIS缓冲液。
110.如权利要求96至109中任一项所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.75至约2.75％w/w的NaCl。
111.如权利要求110所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约1.0至约2.5％w/w的NaCl。
112.如权利要求110所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约1.25至约1.80％w/w的NaCl。
113.如权利要求96至112中任一项所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约85至约96％w/w的所述糖。
114.如权利要求113所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约88至约95％w/w的所述糖。
115.如权利要求113所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约90至约95％w/w的所述糖。
116.如权利要求96至115中任一项所述的组合物，其中所述糖是蔗糖。
117.如权利要求96至116中任一项所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.01至约1.0％w/w的所述泊洛沙姆。
118.如权利要求117所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.02至约0.8％w/w的所述泊洛沙姆。
119.如权利要求117所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.03至约0.7％w/w的所述泊洛沙姆。
120.如权利要求117所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.04至约0.6％w/w的所述泊洛沙姆。
121.如权利要求117所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.05至约0.5％w/w的所述泊洛沙姆。
122.如权利要求117所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.06至约0.4％w/w的所述泊洛沙姆。
123.如权利要求117所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.07至约0.3％w/w的所述泊洛沙姆。
124.如权利要求117所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.09至约0.2％w/w的所述泊洛沙姆。
125.如权利要求96至124中任一项所述的组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
126.如权利要求96至125中任一项所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.5至约5.0％w/w的山梨酸钾。
127.如权利要求126所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约0.75至约4.0％w/w的山梨酸钾。
128.如权利要求126所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约1.0至约3.0％w/w的山梨酸钾。
129.如权利要求126所述的组合物，其中所述冻干组合物包含约1.25至约2.75％w/w的山梨酸钾。
130.一种保存如权利要求72至129中任一项所述的冻干组合物的方法，其包括在约2℃至约8℃的温度下储存所述冻干产品。
131.一种保存如权利要求72至129中任一项所述的冻干组合物的方法，其包括在约-20℃的温度下储存所述冻干产品。
132.一种复溶如权利要求72至129中任一项所述的冻干组合物的方法，其包括向所述冻干组合物中添加液体介质。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述液体介质是水性介质。
134.如权利要求132或权利要求133所述的方法，其中所述液体介质包含泊洛沙姆。
135.如权利要求134所述的方法，其中所述泊洛沙姆是P-188。
136.如权利要求132至135中任一项所述的方法，其中所述液体介质还包含具有约7.0至约8.5的pH的缓冲液。
137.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用在液体介质中复溶的如权利要求72至129中任一项所述的冻干组合物。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述复溶冻干组合物是静脉内施用的。
139.如权利要求137所述的方法，其中所述复溶冻干组合物是肌内施用的。
140.如权利要求137所述的方法，其中所述复溶冻干组合物是经由吸入施用的。
141.如权利要求137所述的方法，其中所述复溶冻干组合物是粘膜施用的。
142.如权利要求137所述的方法，其中所述复溶冻干组合物是皮下施用的。
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