KR102236926B1 - 안구 운반을 위한 키메릭 사이토카인 제제 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 예를 들면, 안구 운반(ocular delivery)을 위해 디자인된 키메릭 사이토카인을 포함하는 비히클 제제 및 제제를 특징으로 한다.

Description

안구 운반을 위한 키메릭 사이토카인 제제{CHIMERIC CYTOKINE FORMULATIONS FOR OCULAR DELIVERY}
본 발명은 치료 조성물 및 제제(formulation), 예를 들면, IL-1 억제제에 관한 것이다.
인터루킨-1 알파 (IL-1α) 및 베타 (IL-1β)는 면역조절 사이토카인의 구성요소이다. 인터루킨-1 사이토카인 페밀리의 적어도 11개 인간 구성요소는 9개 추정 또는 입증된 작용제 (IL-1α, IL-1β, IL-18, IL-36α(IL-1F6), IL-36β (IL 1F8), IL-36γ (IL-1F9), IL-33, IL-1F7 및 IL-1F10) 및 개 천연 길항제(IL-1Ra 및 IL36Ra (IL-1F5))로 확인되었다.
IL-1α 및 IL-1β는 면역 시스템을 조절하는 역할을 가지고, 현저한 염증성 안구 장애(ocular disorders)을 포함하는, 염증성 안과질환에 관련되어 왔다. 따라서, IL-1 억제제의 안구 투여를 위한 더 나은 방법 및 물질에 필요하다. 아나키느라(anakinra) (Kineret®, Amgen, Thousand Oaks, CA), a 재조합 IL1-Ra 분자는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 및 Neonatal-시작 다중시스템 염증성 질병(NOMID)으로 불리는 크리오피린-관련 주기적 증후군(Cryopyrin-Associated Periodic Syndromes (CAPS)) 치료에 사용을 위해 승인되었다. 매일 피하 투여를 위해 살균, 투명, 무색-내지-흰색, 방부제-없는 용액으로서 27 측정 바늘(gauge needles)을 가지는 단일 용도, 유리 주사기로서 공급되었다. Kineret®은 주사를 위하여 물에 100 mg 아나키느라(anakinra), 1.29 mg 소듐 시트레이트(sodium citrate), 5.48 mg 소듐 클로라이드(sodium chloride), 0.12 mg 디소듐(disodium) EDTA, 및 0.70 mg 폴리소르베이트(polysorbate) 80를 포함하는, pH 6.5를 가지는 0.67 ㎖ 용액으로 제조되었다. 2-8℃의 저장이 충고된다. Kineret®은 안구 투여를 위해 승인되지 않는다.
도1은 수용체 결합제를 발현하는 E. coli로부터 정제된 단백질의 시료 예를 나타내는 SDS-PAGE 젤의 재생산이다. 5 및 20 kDa 분자량 마커는 왼쪽에 나타낸다. 레인(lane)은 하기와 같다: 분자량 마커 (레인 1 및 6), 추출물(레인 2 및 7), 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된 물질(레인 3 및 8), 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가적으로 정제된 물질(레인 4 및 9), 및 상기 물질의 감소된 시료(레인 5 및 10). 레인 2 - 5는 05 정제, 및 레인 6-10은 P04 정제이다. 실시예 2를 참조하시오.
도 2A는 표이고 IL-1β 및 음성 대조군, β-glucuronidase (GUS) 단백질에 비례하여 신호를 작요하기 위하여 P06, P07, 및 P01 단백질의 능력을 테스팅하는 실험의 결과를 나타내는 바 그래프를 수반한다.
도 2B는 다양한 IL-1β 농도에서 IL-1β 활성을 반대하는 P01의 능력을 테스트하는 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3A는 P03(헥사-히스티딘(histidine) 태그된(서열번호 23)), P04 (헥사-히스티딘 태그된 (서열번호 23)), P05 (헥사-히스티딘 태그된 (서열번호 23)), 및 0.1 ng/ml IL-1β (인간)의 존재에서 IL-1Ra에 의한 IL-1의 길항작용(antagonism) 을 테스팅된 실험 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 3B는 각각의 용해물에서 단백질의 농도의 추정을 사용하여 0.1 ng/ml IL-1β (인간)의 존재에서 P01, P02, P03, P04, 및 P05, 및 IL-1Ra의 태그되지 않은 형태를 포함하는 용해물에 의해 IL-1β의 길항작용(antagonism)을 테스팅된 실험 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 4A는 포스페이트 제제(20 mg/ml에서 PO5, 10 mM 포스페이트, 5% w/v 소르비톨(sorbitol), 0.1% w/v 폴록사머 188(poloxamer 188), pH 6.5)에서 P05을 위한 역동적 빛 분산(dynamic light scattering(DLS)) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4B는 시트레이트(citrate) 제제 (20 mg/ml에서 P05, 10 mM 시트레이트(citrate), 5% w/v 소르비톨(sorbitol), 0.1% w/v 폴록사머 188, pH 6.0)에서 P05을 위한 DLS 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5A는 실시예 8에서 설명된 바와 같이 IL-1Ra, IL-1β, P03, P04, 및 P05의 열 변성(theraml denaturation)을 나타내는 그래프이다.
도 5B는 도 5A (음성 첫번째 유도체는 녹는점의 개선된 시각을 제공한다)에서 그래프의 음성 첫번째 유도체를 나타내는 그래프이다.
도 6A는 건조 안구 모델에서 마우스를 위한 0, 3, 7, 9, 및 11일에, 2개 독립적 연구의 안구 당 각막(cornea)의 플루오레세인(fluorescein) 염색에 의해 의테스트된 것처럼 평균 각막 염색 점수 ± SEM을 나타내는 바 그래프이다. 마우스는 치료 없음(n = 18), 10 mg/ml P05 (n=19), 또는 1.25× PBS, 비히클 (n = 20)를 받는다. Asterisks는 하기: * (P < 0.05) 및 ** (P < 0.005)에서 처럼 비히클에 비례하여 P05의 통계 유효성(statistical significance)을 나타낸다.
도 6B는 건조 안구 모델에서 마우스에 대하여 0, 3, 7, 9, 및 11일에, 안구 당 각막(cornea)의 평균 각막 염색 점수 ± SEM을 나타내는 데이타를 니타내는 비 그래프이다. 마우스는 치료 없음 (n = 8), 1.25× PBS 비히클 (n =8), 10 mg/ml 마우스 혈청 알부민 (MSA) (n = 8), 또는 10 mg/ml P05 (n=9)를 받는다. Asterisks는 하기: * (P < 0.05) 및 *** (P < 0.0005)와 같이 마우스 혈청 알부민에 비례하여 P05의 통계 유효성(statistical significance)을 나타낸다.
도 6C는 도 6B에서와 같이 동일한 실험에서 Restasis® (0.05% 사이클로스포린(cyclosporine) emulsion) (n = 8)으로 처리된 마우스에 대하여 데이타를 나타내는 바 그래프이다. Asterisks는 하기: ** (P < 0.005) 및 *** (P < 0.0005)에서 처럼 사이클로스포린(cyclosporine) (Restasis®)에 비례하여 P05의 통계 유효성(statistical significance)을 나타낸다.
도 7은 실시예 16에서 설명된 임상시도의 디자인을 묘사한다.
도 8은 EBI-005 제제 (5 mg/ml 및 20 mg/ml 치료를 받은 군에 대한 혼합된 데이타) 및 비히클 제제를 받은 개체의 군에 대해 OSDI 점수에서 기저선으로부터 평균 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 EBI-005 제제 (5 mg/ml 및 20 mg/ml 치료를 받은 군에 대하여 혼합 데이타) 및 비히클 제제를 받은 개체의 군에 대하여 통증에서 기저선으로부터 평균변화를 나타내는 그래프이다.
도 10은 EBI-005 제제(5 mg/ml 및 20 mg/ml 치료를 받은 군에 대하여 혼합 데이타) 및 비히클 제제를 받은 개체의 군에 대하여 각막 플루오레신 염색 (CFS) 점수에서 기저선으로부터 평균변화를 나타내는 그래프이다.
관련 출원
본 출원은 2013년 3월 13일에 출원된, 미국 가출원 제61/779,974호를 청구하고, 상기 내용의 전체는 자체 전문으로서 본 명세서에 통합된다.
서열목록
즉시 출원(instant appliction)은 ASCII 포맷으로 전자형태로 제출된 서열목록을 포함하고 전체적으로 참조에 의해 통합된다. 2014년 3월 12일에 만들어진, 상기 ASCII 복사본은 D2046-7050WO_SL.txt으로 명칭되고 크기에서 28,329 바이트(bytes)이다.
요약
특징된 본 명세서는 다른 제제뿐만 아니라 그 중에서도 IL-1 페밀리 사이토카인 및 그들의 각각의 수용체에 반응하는 세포내 신호를 조절하고(modulate), 장애를 치료하고, 세포내 수용체를 검출 및/또는 결합하기 위하여 사용될 수 있는 키메릭 사이토카인 (예를 들면, WO2012/016203 또는 in WO 2012/103240에서 설명된 바와 같은 키메릭 사이토카인 또는 키메릭 사이토카인 도메인)을 포함하는 안정제제 (예를 들면, 안정한 수용성 제제)이다. 본 명세서에는 L-1β/IL-1R키메릭 사이토카인 단백질의 1 mg/ml 내지 50 mg/ml을 포함하는 약학적 제제를 설명한다. 실시형태에서, 약학적 제제는 1 mg/ml 내지 50 mg/ml의 IL-1β/IL-1R키메릭 사이토카인 단백질을 포함한다; 계면활성제; 탄력성 제제(tonicity agent); 및 완충제.
일부 측면에서, 키메릭 사이토카인 단백질은 P05 또는 예를 들면 WO2012/016203 또는 WO 2012/103240에서 설명되 것과 같은, 다른 키메릭 사이토카인이다. 실시형태에서, 제제는 국소 투여를 위한 것이다. 실시형태에서, 제제는 안구에 투여를 위한 것이다. 실시형태에서, 제제는 안구에 국소 투여를 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 제제는 5.5 내지 7.5의 pH, 예를 들면 6.0 내지 7.0의 pH를 가진다. 실시형태에서, 제제는 점도제(viscosity agent)를 포함하지 않는다. 특정실시형태는 또한 점도제를 포함하는 제제와 관련한다. 실시형태에서, 점도제(viscosity agent)는 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose); 하이드록시 에틸 셀루로오스(hydroxy ethyl cellulose); 하이드록시프로필 메틸셀루로오스(hydroxypropyl methylcellulose); 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol); 및/또는 글리세린(glycerin)이다. 실시형태에서, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose)은 0.1-6% w/v의 농도의 제제로 포함하된다.
제제는 통상적으로 25℃에서 적어도 60 일 동안 저장(storage) 후에 적어도 90%, 93%, 95%, 또는 98%의 순도를 가진다. 일부 측면에서, 제제는 25℃에서 적어도 4 개월 동안 저장 후에 적어도 90%, 93%, 95%, 또는 98%의 순도를 가진다. 다른 측면에서, 제제는 40℃에서 적어도 2 주 기간 동안 저장 후에 적어도 90%의 순도를 가진다. 일부 경우에서, 제제는 2℃ 내지 8℃에서 저장될 때 적어도 2 년 동안 안정된다. 일부 경우에서 제제는 25℃에서 저장될 때 적어도 6 개월 동안 안정된다. 일부 경우에서 제제는 25℃에서 저장될 때 적어도 8 개월 동안 안정된다. 일부 실시형태에서, 계면활성제는 비-이온(non-ionic) 계면활성제, 예를 들면, 플루론산 F-68(pluronic acid F-68) (폴록사머 188(poloxamer 188)), 폴리소르베이트-20(polysorbate-20), 또는 폴리소르베이트-80(polysorbate-80)이다. 실시형태에서, 계면활성제는 플루론산F-68(pluronic acid F-68) (폴록사머 188)이고, 계면활성제는 0.1% w/v의 농도로 존재한다. 제제에 있는 탄력성 제제(tonicity agent)는 예를 들면, 소듐 클로라이드(sodium chloride), 소르비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 수크로오스(sucrose), 또는 트레할로오스(trehalose)일 수 있다. 실시형태에서, 탄력성 제제(tonicity agent)는 소르비톨(sorbitol)이고, 소르비톨은 약 5% w/v의 농도로 존재한다. 특정실시형태에서, 탄력성 제제(tonicity agent)는 소르비톨(sorbitol)이고, 소르비톨은 5% w/v의 농도로 존재한다.
제제(formulation)에 있는 완충제는 일반적으로 약한 완충제이다. 실시형태에서, 완충제는 포스페이트, 시트레이트(citrate), 아세테이트(acetate), 보레이트(borate), 및/또는 숙시네이트(succinate)이다. 완충제는 포스페이트, 시트레이트(citrate), 아세테이트(acetate), 보레이트(borate), 또는 숙시네이트(succinate)의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다. 일부 실시형태에서, 완충제는 약 10 mM부터 약 50 mM까지의 양으로 존재된다. 실시형태에서, 완충제는 20 mM 또는 미만의 농도에서 존재한다. 실시형태에서 완충제, 예를 들면, 소듐 시트레이트(sodium citrate) 및/또는 소듐 포스페이트는 5-15 mM의 총 농도에서 존재한다. 일부 실시형태에서, 완충제, 예를 들면, 소듐 시트레이트(sodium citrate)는 5-15 mM, 7-13 mM, 8-12 mM, 또는 9-11 mM의 농도에서 존재한다.
일부 경우에서, 완충제(buffering agent)는 소듐 시트레이트(sodium citrate)이고, 약 10 mM의 농도의 제제로 존재한다. 일부 경우에서, 완충제는 소듐 시트레이트이고 10 mM의 농도의 제제로 존재한다.
특정실시형태에서, 제제는 P05; 10 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate); 5% w/v 소르비톨(sorbitol); 및 0.1% w/v 폴록사머(poloxamer) 188 (폴록사머(poloxamer) F-68)와 같은 IL-1β/IL-1R키메릭 사이토카인 단백질을 포함하고, 제제의 pH는 6.0이다.
일부 실시형태에서, 제제는 추가적으로 아미노산을 포함한다. 예를 들면, 아미노산은 아르기닌(arginine), 글루타민산(glutamic acid), 히스티딘(histidine), 또는 메티오닌(methionine)이다.
일실시예에서, 키메릭 사이토카인 (예를 들면, 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드), 예를 들면, Il-1β 및 IL-1Ra로부터 유래된 서열을 포함하는 키메릭 사이토카인은 5% w/v 소르비톨(sorbitol) 및 0.1% w/v 폴록사머(poloxamer), 예를 들면, 폴록사머(poloxamer) 188 (또한, 예를 들면, Lutrol® F-68로 언급됨 (본 명세서에서 Lutrol®로 언급됨), Kolliphor® P 188, 및 poly(ethylene)-block-poly(ethylene glycol))을 포함하는 10 mM 소듐 시트레이트, pH 6.0에서 5 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도(예를 들면, 1 mg/ml, 5 mg/ml, 또는 20 mg/ml의 농도) 에서 제조된다. 실시형태에서, 키메릭 사이토카인은 P01, P02, P03, P04, P05, P06, 및 P07의 하나 이상으로부터 선택된다. 실시형태에서, 키메릭 사이토카인은 P05이다.
실시형태에서, 본 명세서에서 설명된 제제의 구성요소는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50%까지 본 명세서에서 제공되는 값 주변에 다양할 수 있는 양으로 존재된다. 실시형태에서, 제제의 구성요소는 10%에 의해 본 명세서에서 제공되는 값 주변에 다양한 양으로 존재된다. 실시형태에서, 제제는 9.5-10.5 mM, 9-11 mM, 8.5-11.5 mM, 8-12 mM, 7.5-12.5 mM, 7-13 mM, 6-14 mM, 또는 5-15 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate)를 포함한다. 실시형태에서, 제제는 4.75-5.25%, 4.5-5.5%, 4.25-5.75%, 4-6%, 3.75-6.25%, 3.5-6.5%, 3-7%, 또는 2.5-7.5% w/v 소르비톨을 포함한다. 실시형태에서, 제제는 0.095-0.105%, 0.09-0.11%, 0.085-0.115%, 0.08-0.12%, 0.075-0.125%, 0.07-0.13%, 0.06-0.14%, 또는 0.05-0.15% w/v 폴록사머 188(poloxamer 188)을 포함한다. 실시형태에서, 제제에 있는 치료 단백질 (예를 들면, 키메릭 사이토카인, 예를 들면, P05)의 농도는 1-50 mg/ml, 1-25 mg/ml, 또는 1-20 mg/ml이다. 실시형태에서, 치료 단백질의 농도는 4.75-5.25 mg/ml, 4.5-5.5 mg/ml, 4.25-5.75 mg/ml, 4-6 mg/ml, 3.75-6.25 mg/ml, 3.5-6.5 mg/ml, 3-7 mg/ml, 또는 2.5-7.5 mg/ml이다. 실시형태에서, 제제의 pH는 5.5 내지 7.5, 또는 5.5 내지 6.5이다.
실시형태에서, 제제는 8-12 mM 소듐 시트레이트, 4-6% w/v 소르비톨, 0.08-0.12% w/v 폴록사머 188, 및 4-6 mg/ml P05을 포함한다. 실시형태에서, 제제의 pH 는 5.5 내지 7.5이다. 실시형태에서, pH는 5.5 내지 6.5이다. 실시형태에서, pH는 6 내지 7이다.
실시형태에서, 제제는 9-11 mM 소듐 시트레이트, 4.5-5.5% w/v 소르비톨, 0.09-0.11% w/v 폴록사머 188, 및 4.5-5.5 mg/ml P05을 포함한다. 실시형태에서, 제제의 pH는 5.5 내지 7.5이다. 실시형태에서, pH는 5.5 내지 6.5이다. 실시형태에서, pH는 6 내지 7이다.
실시형태에서, IL-1 억제제, 예를 들면, 아나키느라(anakinra)는 5% w/v 소르비톨 및 0.1% w/v 폴록사머, 예를 들면, 폴록사머 188을 포함하는 10 mM 소듐 시트레이트, pH 6.0에서 적절한 농도 (예를 들면, 5 mg/ml 내지 100의 농도, 예를 들면, 5 내지 50 mg/ml, 예를 들면, 5 내지 20 mg/ml)에서 제조된다. 실시형태에서, 제제의 구성요소의 양은 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50%까지 본 명세서에서 제공되는 값 주위에 다양할 수 있다. 실시형태에서, pH는 5.5 내지 7.5이다. 실시형태에서, pH는 5.5 내지 6.5이다. 실시형태에서, pH는 6 내지 7이다. 실시형태에서, 본 명세서에서 설명된 제제는 점도제(viscosity agent), 예를 들면, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose) (CMC)를 추가적으로 포함한다. 실시형태에서, 제제는 CMC, 예를 들면, 0.1-1% w/v, 0.1-0.5% w/v, 또는 0.2-0.3 w/v%의 농도의 CMC를 포함한다.
또한 본 명세서는 IL-1-관련 장애를 가지는 개체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 명세서에 설명된 제제를 포함하는 조성물의 치료적으로 효과적인 양을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 방법은 예를 들면, 건조 안구 장애와 같은 IL-1-관련 장애를 가지는 개체를 확인하고; 본 명세서에서 설명된 바와 같이 제제를 포함하는 조성물의 치료적으로 효과적인 양을 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
또한 본 명세서는 개체에서 IL-1 활성을 억제하는 방법을 설명한다. 상기 방법은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 제제를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 상기 개체는 IL-1-관련 장애, 예를 들면, 건조 안구 장애를 가진다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 제제를 포함하는 약물 운반 장치와 관련한다.
또한 본 명세서는 개체에서 IL-1-관련 장애를 치료 또는 방지하기 위한 의약 제작에서, 예를 들면, 개체에서 IL-1 관련 장애를 치료 또는 방지하기 위하여 개체에게 국소 투여를 위한 의약 제작에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 조성물의 사용을 개시한다. 실시형태에서, 의약은 안구에 투여, 예를 들면, 안구에 국소 투여를 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 의약은 비히클 제제, 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 소르비톨, 소듐 시트레이트, 및 폴록사머 188을 포함하거나 또는 구성되는 수용성 제제이다. 실시형태에서, 상기 비히클 제제는 실질적으로 치료 단백질이 없다(예를 들면, 포함하지 않는다). 일반적으로, 본 명세서에서 설명된 바와 같이 치료된 개체는 인간 또는 개 또는 고양이와 같은 다른 포유류이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 제제를 포함하는 용기 또는 장치에 관한 것이다. 실시형태에서, 용기는 불어서 채우는 밀봉 용기(blow fill seal container)이다.
출원인은 건조 안구를 치료하는데 유용할 수 있는 계면활성제, 탄력성 제제(tonicity agent), 및 완충제를 포함하는 약학적 제제 (예를 들면, 비히클 제제)를 발견하였다. 일부 실시형태에서, 제제는 단백질 또는 펩타이드를 포함하지 않는다, 예를 들면, 제제는 치료 단백질 또는 펩타이드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 계면활성제는 플루로닉 F68(Pluronic F68) (폴록사머 188)이고, 완충제는 시트레이트(citrate)이고, 탄력성 제제는 소르비톨이다. 일부 실시형태에서, 제제는 키메릭 사이토카인 단백질, 예를 들면, 본 명세서 또는 WO 2012/103240에서 설명된 바와 같이 키메릭 사이토카인 단백질, 예를 들면, P05를 포함한다. 일부 실시형태에서, 또한 약학적 제제는 점도제(viscocity agent), 예를 들면, CMC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약학적 제제는 안구 사용에(즉, 안구 운반에 적합한), 예를 들면, 건조 안구의 징후 및/또는 증상과 같은 치료 안구에 적합하다.
본 명세서에 참조된 자연적으로 발생하는 단백질은 다른 포유동물 종으로부터 뿐만 아니라, 상기 단백질의 인간 형태를 포함한다.
본 명세서에 설명된 실시형태는 하기를 포함한다:
실시형태 1. 8 내지 12 mM의 농도에서 소듐 시트레이트(sodium citrate) 또는 소듐 포스페이트; 4% 내지 6% (w/v)의 소르비톨(sorbitol); 0.08% 내지 0.12% (w/v)의 농도의 폴록사머 188; 및 선택적으로 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose)를 포함하는 수용성 제제, 여기서 제제는 5.5 내지 7.5의 pH를 가지고 및 여기서 제제는 안구 장애 치료에 효과적이다.
실시형태 2. 실시형태 1의 제제, 여기서 제제는 5.5 내지 6.5의 pH를 가진다.
실시형태 3. 실시형태 1 또는 실시형태 2의 제제, 여기서 제제는 실질적으로 치료 단백질이 없다.
실시형태 4. 실시형태 1 내지 3의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 8 내지 11 mM의 농도의 소듐 시트레이트; 4.5 내지 5.5% (w/v)의 소르비톨; 및 0.09 내지 0.11%의 농도의 폴록사머 188을 포함한다.
실시형태 5. 실시형태 4의 제제, 여기서 제제는 9 내지 11 mM의 농도의 소듐 시트레이트; 4.5 내지 5.5% (w/v)의 소르비톨; 및 0.09 내지 0.11%의 농도의 폴록사머 188로 구성된다.
실시형태 6. 실시형태 5의 제제, 여기서 제제는 9 내지 11 mM의 농도의 소듐 시트레이트; 4.5 내지 5.5% (w/v)의 소르비톨; 및 0.09 내지 0.11%의 농도의 폴록사머 188로 구성된다.
실시형태 7. 0.1-1% (w/v)의 농도의 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose)을 포함하는, 실시형태 1 내지 6의 어느 하나의 제제.
실시형태 8. 9-11 mM의 농도의 소듐 시트레이트; 4.5-5.5% (w/v)의 소르비톨; 및 0.09-0.11%의 농도의 폴록사머(poloxamer) 188를 포함하는 수용성 제제, 여기서 제제는 5.7 내지 6.3의 pH를 가지고, 여기서 제제는 실질적으로 치료 단백질이 없고, 및 여기서 제제는 안구 장애를 치료하는데 효과적이다(예를 들면, 본 명세서 설명된 안구 장애).
실시형태 9. 실시형태 1 내지 8의 어느 하나의 제제, 여기서 안구 장애는 건조 안구 질병이다.
실시형태 10. 실시형태 1 내지 9의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 안구 통증 또는 아픔, OSDI 점수, 및/또는 각막 플루오레신 염색 점수(corneal fluorescein staining (CFS) score)를 감소시키는데 효과적이다.
실시형태 11. 실시형태 10의 제제, 여기서 안구 통증 또는 아픔은 OSDI로부터 시각 아날로그 규모(visual analog 스케일) 또는 문제를 사용하여 평가된다.
실시형태 12. 1-50 mg/ml의 IL-1β/IL-1R키메릭 사이토카인 단백질 (예를 들면, P01, P02, P03, P04, P05, P06, 또는 P07)을 포함하는 수용성 제제; 소듐 시트레이트 및 소듐 포스페이트로부터 선택되는 완충제; 소르비톨, 예를 들면, 3.5-6.5% (w/v) 농도에서; 폴록사머 188, 예를 들면, 0.07-0.13% (w/v) 농도에서; 및 선택적으로 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose) (CMC)을 포함하는 수용성 제제, 여기서 제제는 5.5 내지 7.5의 pH를 가진다.
실시형태 13. 실시형태 12의 제제, 여기서 키메릭 사이토카인 단백질은 P05이다.
실시형태 14. 실시형태 13의 제제, 여기서 제제는 1-20 mg/ml P05을 포함한다.
실시형태 15. 실시형태 13의 제제, 여기서 제제는 3-7 mg/ml P05을 포함한다.
실시형태 16. 실시형태 13의 제제, 여기서 제제는 4-6 mg/ml P05을 포함한다.
실시형태 17. 5 mM 내지 15 mM의 총 농도에서 소듐 시트레이트(sodium citrate) 및/또는소듐 포스페이트를 포함하는, 실시형태 13의 제제.
실시형태 18. 실시형태 12 내지 17의 어느 하나의 제제, 여기서 소듐 시트레이트는 5 mM 내지 15 mM의 농도에서 존재한다.
실시형태 19. 실시형태 18의 제제, 여기서 소듐 시트레이트는 8 mM 내지 12 mM의 농도에서 존재한다.
실시형태 20. 실시형태 18의 제제, 여기서 소듐 시트레이트는 9mM 내지 11 mM의 농도에서 존재한다.
실시형태 21. 실시형태 12 내지 20의 어느 하나의 제제, 여기서 폴록사머 188은 0.05% 내지 0.15% w/v의 농도에서 존재한다.
실시형태 22. 실시형태 20의 제제, 여기서 폴록사머 188은 0.08 % 내지 0.12% w/v의 농도에서 존재한다.
실시형태 23. 실시형태 20의 제제, 여기서 폴록사머 188은 0.09 % 내지 0.11% w/v의 농도에서 존재한다.
실시형태 24. 실시형태 12 내지 23의 제제, 여기서 소르비톨은 2.5% 내지 7.5% w/v의 농도에서 존재한다.
실시형태 25. 실시형태 24의 제제, 여기서 소르비톨은 4% 내지 6% w/v의 농도에서 존재한다.
실시형태 26. 실시형태 24의 제제, 여기서 소르비톨은 4.5% 내지 5.5% w/v의 농도에서 존재한다.
실시형태 27. 1-25 mg/ml P05; 8 mM 내지 12 mM의 농도의 소듐 시트레이트(sodium citrate) 또는 소듐 포스페이트; 4% 내지 6% (w/v)의 소르비톨; 0.08% 내지 0.12% (w/v)의 농도의 폴록사머 188; 및 선택적으로, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose)을 포함하는 수용성 제제, 여기서 제제는 5.5 내지 7.5의 pH를 가진다.
실시형태 28. 1mg/ml 내지 25 mg/ml P05; 8-12 mM의 농도의 소듐 시트레이트; 4% 내지 6% (w/v)의 소르비톨; 및 0.08% 내지 0.12% (w/v)의 농도의 폴록사머(poloxamer) 188를 포함하거나 또는 구성하는 수용성 제제, 여기서 제제는 5.5 내지 7.5의 pH를 가진다.
실시형태 29. 1 mg/ml 내지 25 mg/ml P05; 9 mM 내지 11 mM의 농도의 소듐 시트레이트; 4.5% 내지 5.5% (w/v)의 소르비톨; 및 0.09% to 0.11% (w/v)의 농도의 폴록사머 188를 포함하거나 또는 구성하는 수용성 제제, 여기서 제제는 5.7 내지 6.3의 pH를 가진다.
실시형태 30. 4-6 mg/ml P05; 9-11 mM의 농도의 소듐 시트레이트; 4.5-5.5% (w/v)의 소르비톨; 및 0.09-0.11% (w/v)의 농도의 폴록사머(poloxamer) 188를 포함하거나 또는 구성하는 수용성 제제, 여기서 제제는 5.7-6.3의 pH를 가진다.
실시형태 31. 실시형태 12 내지 30의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 270-370 mOsm/kg의 삼투압을 가진다.
실시형태 32. 실시형태 1 내지 31의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 안구에 투여에 적합하다.
실시형태 33. 실시형태 30의 제제, 여기서 제제는 안구에 국소투여하는데 적합하다.
실시형태 34. 실시형태 1 내지 4 및 8 내지 33의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 점도제(viscosity agent)를 포함하지 않고, 예를 들면, CMC를 포함하지 않는다.
실시형태 35. 실시형태 12 내지 34의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 아미노산, 예를 들면, 아르기닌(arginine), 글루타민산(glutamic acid), 히스티딘(histidine), 또는 메티오닌(methionine)을 추가적으로 포함한다 .
실시형태 36. 실시형태 12 내지 34의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 메티오닌(methionine)을 추가적으로 포함한다.
실시형태 37. 실시형태 36의 제제, 여기서 메티오닌은 1 내지 20 mM 농도의 제제로 존재한다.
실시형태 38. 실시형태 36 또는 37의 제제, 여기서 제제는 제제가 저장, (예를 들면, 25℃에서 적어도 4 주 동안)될 때, 메티오닌(methionine)을 포함하지 않는 해당 제제와 비교하여, 감소된 산화를 가진다.
실시형태 39. 실시형태 38의 제제, 여기서 제제는 제제가 다용도 용기에서 저장될 때, 메티오닌(methionine)을 포함하지 않는 해당 제제와 비교하여, 감소된 산화를 가지다.
실시형태 40. 실시형태 38 또는 39의 제제, 여기서 제제의 산화는 RP-HPLC를 사용하여 평가된다.
실시형태 41. 실시형태 12 내지 40의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 빛 차광 입자 계수 시험(light obscuration particle count test)을 사용하여 평가된 바와 같이, 입자 ≥10 ㎛에 대하여 ㎖ 당 50 입자에 미만(less than) 또는 동등하거나 또는 입자 ≥25 ㎛에 대하여 ㎖ 당 5 입자에 미만 또는 동등함을 가진다.
실시형태 42. 실시형태 12 내지 41의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 상온, 예를 들면, 25℃에서 4시간 동안 단백질 용액을 볼텍싱한 후에 응집된(aggregated) 형태에 비례하여 단백질의 단량체 형태의 > 90%의 존재에 의해 나타낸 바와 같이 안정된다.
실시형태 43. 실시형태 42의 제제, 여기서 응집된(aggregated) 형태에 비례하여 단백질의 단량체 형태의 퍼센트는 SEC-HPLC를 사용하여 평가된다.
실시형태 44. 실시형태 12 내지 43의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 2-8 ℃ 및 60% 상대 습도에서 적어도 5 개월 동안 저장 후에 안정된다.
실시형태 45. 실시형태 12 내지 44의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 주위 조건하에서, 예를 들면, 상온에서, 예를 들면, 25℃에서 저장 후에 안정된다.
실시형태 46. 실시형태 12 내지 45의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 2-8 ℃ 및 60% 상대 습도에서 적어도 4 개월 동안 저장 후에 안정된다.
실시형태 47. 실시형태 12 내지 46의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 주위 조건하에서, 예를 들면, 상온에서, 예를 들면, 25℃에서 적어도 4 개월 동안 저장 후에 안정된다.
실시형태 48. 실시형태 12 내지 47의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 2℃ 내지 8℃ 및 60% 상대 습도에서 적어도 3 개월 동안 저장 후에 안정된다.
실시형태 49. 실시형태 12 내지 48의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 주위 조건하에서, 예를 들면, 상온에서, 예를 들면, 25℃에서 적어도 3 개월 동안 저장 후에 안정된다.
실시형태 50. 실시형태 12 내지 49의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 2-8 ℃ 및 60% 상대 습도에서 적어도 2 개월 동안 저장 후에 안정된다.
실시형태 51. 실시형태 12 내지 50의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 주위 조건하에서, 예를 들면, 상온에서, 예를 들면, 25℃에서 적어도 2개월 동안 저장 후에 안정된다.
실시형태 52. 실시형태 12 내지 51의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 2-8 ℃ 및 60% 상대 습도에서 적어도 1개월 동안 저장 후에 안정된다.
실시형태 53. 실시형태 12 내지 52의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 주위 조건하에서, 예를 들면, 상온에서, 예를 들면, 25℃에서 적어도 1 개월 동안 저장 후에 안정된다.
실시형태 54. 실시형태 12 내지 53의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 미세 입자 계수 시험(microscopic particle count test)를 사용하여 평가된 바와 같이, 입자 ≥10 ㎛에 대하여 ㎖ 당 50 입자에 대하여 미만(less than) 또는 동등, 입자 ≥25 ㎛에 대하여 ㎖ 당 5 입자에 대하여 미만(less than) 또는 동등, 및 입자 ≥50 ㎛에 대하여 ㎖ 당 2 입자에 대하여 미만(less than) 또는 동등하여 나타낸 바와 같이 안정된다.
실시형태 55. 실시형태 12 내지 54의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 SEC-HPLC를 사용하여 평가된 바와 같이 응집된(aggregated) 형태에 비례하여 단백질의 단량체 형태의 > 90% 의 존재하여 나타낸 바와 같이 안정된다.
실시형태 56. 실시형태 12 내지 55의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 환원된 SDS-PAGE에서 참조 표준에 주요 밴드의 일치(conformity)하여 나타낸 바와 같이 안정된다.
실시형태 57. 실시형태 12 내지 56의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 비환원된 SDS-PAGE에서 참조 표준에 주요 밴드의 일치(conformity)하여 나타낸 바와 같이 안정된다.
실시형태 58. 실시형태 12 내지 57의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 제제가 약한 양이온 교환 HPLC (WCEX-HPLC)을 사용하여 평가될 때 85%에 이상(greater than) 또는 동등한 주요 피크에 의해 나타낸 바와 같이 안정된다.
실시형태 59. 실시형태 58의 제제, 여기서 제제는 WCEX-HPLC를 사용하여 평가되는 것처럼 P05의 des-Ala 형태의 10% 미만의 존재에 의해 나타낸 바와 같이 안정된다.
실시형태 60. 실시형태 12 내지 59의 어느 하나의 제제, 여기서 제제는 불어서 채우는밀봉 용기에서 포장된다.
실시형태 61. 실시형태 44 내지 53의 어느 하나의 제제, 여기서 상기 저장은 불어서 채우는밀봉 용기에서 저장된다.
실시형태 62. 치료의 방법, 실시형태 1 내지 61의 어느 하나에 따른 제제를 IL-1-관련 장애를 가지는 개체에 투여하여, 따라서 IL-1 관련 장애를 치료하는 것을 포함하는 방법.
실시형태 63. 실시형태 62의 방법, 여기서 IL-1 관련 장애는 건조 안구 장애이다.
실시형태 64. 안구 장애, 예를 들면, 건조 안구 장애 치료 방법, 하기를 포함하는 수용성 제제를 안구 장애, 예를 들면, 건조 안구 장애를 가지는 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법,
8 mM 내지 12 mM의 농도의 소듐 시트레이트(sodium citrate) 또는 소듐 포스페이트; 4% 내지 6% (w/v)의 소르비톨; 0.08% 내지 0.12% (w/v)의 농도에서 폴록사머 188; 및 선택적으로 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose); 여기서 제제는 5.5 to 7.5의 pH를 가지고 실질적으로 치료 단백질이 없고, 따라서 건조 안구 장애를 치료한다.
실시형태 65. 실시형태 64의 방법, 여기서 수용성 제제는 8 mM 내지 11 mM의 농도의 소듐 시트레이트(sodium citrate), 4.5% 내지 -5.5% (w/v)의 소르비톨(sorbitol) 및 0.09% 내지 0.11% 농도의 폴록사머(poloxamer) 188를 포함한다.
실시형태 66. 실시형태 64의 방법, 여기서 수용성 제제는 8-11 mM의 농도의 소듐 시트레이트(sodium citrate), 4.5-5.5% (w/v)의 소르비톨 및 0.09-0.11%의 농도의 폴록사머 188을 구성한다.
실시형태 67. 1 내지 25 mg/ml P05; 8 mM 내지 12 mM 농도의 소듐 시트레이트(sodium citrate) 또는 소듐 포스페이트; 4% 내지 6% (w/v)의 소르비톨; 0.08% 내지 0.12% (w/v)의 농도의 폴록사머 188; 및 선택적으로 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose)를 포함하는 수용성 제제를 건조 안구 장애를 가지는 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법, 여기서 제제는 5.5 내지 7.5를 가지고, 따라서 건조 안구 장애를 치료한다.
실시형태 68. 건조 안구 장애 치료 방법, 1mg/ml 내지 25 mg/ml P05; 8 mM 내지 12 mM의 농도의 소듐 시트레이트; 4% 내지 6% (w/v)의 소르비톨; 0.08% 내지 0.12% (w/v)의 농도의 폴록사머 188으로 구성되는 수용성 제제를 건조 안구 장애를 가지는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법, 여기서 제제는 5.5 내지 7.5의 pH를 가지고, 따라서 건조 안구 장애를 치료한다.
실시형태 69. 건조 안구 장애 치료 방법, 1mg/ml 내지 25 mg/ml P05; 9 mM 내지 11 mM 농도의 소듐 시트레이트; 4.5% 내지 5.5% (w/v)의 소르비톨(sorbitol); 및 0.09% 내지 0.11% (w/v)의 농도의 폴록사머 188을 포함하거나 또는 구성되는수용성 제제를 건조 안구 장애를 가지는 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법, 여기서 제제는 5.7 내지 6.3의 pH를 가지고, 따라서 건조 안구 장애를 치료한다.
실시형태 70. 실시형태 62 내지 69의 어느 하나의 방법, 여기서 방법은 안구 통증 또는 아픔, OSDI 점수, 및/또는 각막 플루오레신염색 (CFS) 점수를 감소시키는데 효과적이다.
실시형태 71. 실시형태 70의 방법, 여기서 안구 통증 또는 아픔은 OSDI로부터 시각 아날로그 규모 또는 문제를 사용하여 평가된다.
실시형태 72. 실시형태 62 내지 70의 어느 하나의 방법, 여기서 제제는 하루 당 1회 내지 5회 투여된다.
실시형태 73. 실시형태 62 내지 72의 어느 하나의 방법, 여기서 제제는 국소적으로 투여된다.
실시형태 74. 실시형태 73의 방법, 여기서 제제는 안구에 국소적으로 투여된다.
실시형태 75. 실시형태 62 to 74의 어느 하나의 방법, 여기서 제제는 하루 당 3회 투여된다.
실시형태 76. 실시형태 62 내지 71 또는 73 내지 74의 어느 하나의 방법, 여기서 제제는 임의로 투여된다.
실시형태 77. 실시형태 1 내지 61의 어느 하나의 제제를 포함하는 용기 또는 장치.
실시형태 78. 실시형태 77의 용기 또는 장치, 여기서 용기 또는 장치는 적어도 2 주 동안, 예를 들면, 적어도 4 주 동안 25℃에서 저장되었고, 실질적으로 미립자(particulates)가 없다.
실시형태 79. 실시형태 1 내지 61의 어느 하나의 제제를 포함하는 불어서 채우는 밀봉 용기.
실시형태 80. 실시형태 1 내지 61의 어느 하나의 제제를 포함하는 다용도 용기.
실시형태 81. 실시형태 35 내지 40의 제제를 포함하는 다용도 용기.
실시형태 82. 실시형태 1 내지 61의 어느 하나의 제제를 포함하는 약물 운반 장치.
실시형태 83. 실시형태 82의 약물 운반 장치, 여기서 약물 운반 장치는 불어서 채우는밀봉 용기이다.
실시형태 84. 실시형태 77 내지 83의 어느 하나의 용기 또는 장치, 여기서 용기 또는 장치는 선택적으로 불활성 기체, 예를 들면, 질소 또는 아르곤을 포함하는, 작은 주머니(pouch)에 밀봉된다.
실시형태 85. IL-1 관련 장애, 예를 들면, 건조 안구 장애를 치료에 사용을 위한, 실시형태 1 내지 61의 어느 하나의 제제.
실시형태 86. 개체에서 IL-1-관련 장애를 치료하기 위한 의약 제작에서 실시형태 1 내지 61의 어느 하나의 제제의 사용.
실시형태 87. 실시형태 1 내지 61의 어느 하나의 제제, 및 선택적으로, 사용을 위한 지침을 포함하는 용기 또는 장치를 포함하는 키트.
전술한 실시형태는 별도의 실시형태를 필요로 하지 않는다. 일부 경우에서, 이들은 서로 및/또는 본 명세서에 개시된 다른 측면 및 실시형태와 혼헙되지 않는다.
모든 원출원, 출원된 특허출원, 및 본 명세서에 인용된 발행된 참조는 모든 목적을 위하여 참조에 의해 통합된다.
상세 설명
출원인은 상기 제제로 치료를 필요로 하는 개체에 IL-1β/IL-1Ra 키메라와 같은 단백질, 예를 들면, 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드를 제공하는데 유용한 제제를 얻을 수 있다. 제제는 예를 들면, 교반에 민감하고, 메티오닌(methionine) 잔기에 기인한 산화에 민감하거나, 또는 예를 들면, 아스파라기닌(asparagine) 또는 아르기닌(arginine) 잔기에 기이한 탈아미노화에 민감한 단백질의 안정성을 요구하는 단백질 조성물의 제제에 일반적으로 유용하다. 또한 본 명세서는 상기 제제의 제조 및 투여의 방법을 개시한다.
일부 실시형태에서, 제제는 IL-1-관련 장애에 대하여 효과적 국소 치료를 포함하는, 안과 사용을 위한 약학적 용도에 적합한, IL-1β 및 IL-1Ra 서열로부터 유래된 선택된 서열을 포함하는 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드, 예를 들면, 키메릭 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에서 설명된 제제는 폴리펩타이드의 상대적 높은 농도에서 조차, 예를 들면, 개체에서 치료를 위해 적합한 농도뿐만 아니라 대량 약물 물질의 저장에 적합한 농도에서 놀랍게도 안정적이다. 상기 특징의 장점은
본 발명의 장점은 환자 사용을 위하여 약물을 제조하기 위하여 대량 약물 물질로부터 바람직하지 못한 제제를 제거하는 것이 필수적이지 않다.
특히, 출원인은, 예를 들면, 안구에, 예를 들면, 안구의 앞쪽 또는 각막 표면에 국소 투여에 적합한 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드의 효과적 수용성 제제를 성공적으로 얻었다.
출원인’의 지식으로 아는 한, 본 출원으로서 FDA에 의해 승인된 국소 안구 투여를 위해 승인된 생물 약물은 없다. 추가적으로, 출원인은 안구투여에 양립하는 pH(예를 들면, 4.5 내지 7.0, 5.5 내지 7.0, 5.5 내지 6.5, 또는 6.0 내지 7.0의 pH)에서 상기 폴리펩타이드를 제조할 수 있고, 폴리펩타이드로 처리되는 개체에 대해 편안한 제제를 빌려주는 구성요소를 포함한다. 환자는 만약 제제가 편안한, 예를 들면, 자극(irritation)의 원인이 되지 않는다면, 치료에 더 순응할 것 같다. 실시형태에서, 제제는 예를 들면, 안구 발적(redness), 찢김(tearing), 점막 분비물(mucous discharge), 또는 개체의 불쾌와 같은, 자극(irritation)의 하나 이상의 증상을 일으키지 않는다.
안정성
국소 안구(topical ophthalmic))약물은 환자에 일반적으로 자가-투여된다. 환자는 상대적으로 긴 기간동안 약물을 저장할 수 있고, 제제는 투여 전에 의사 또는 약사에 의해 통상적으로 단지 저장되는 제제보다 높은 온도 및 교반 스트레스의 큰 수준에 받을 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 단백질은 작은 분자보다 교반 및 온도에 다 민감할 수 있다. 교반 스트레스는 침전을 유도할 수 있고 열 스트레스는 침전 및 화학분해를 유도할 수 있다. 추가적으로, 운반 장치로 화합물을 부하하는 동안에, 열 스트레스에 노출될 수 있다. 출원인은 교반 스트레스및 열에 노출될 때 우수한 안정성을 성공적으로 제공하는 제제를 얻을 수 있다.
일부 제작 과정은 상대적 높은 온도로 제제의 적어도 ??은 노출을 요구한다. 예를 들면, 채우는 과정과 연관된 교반 이외에, 불어서 채우는 밀봉 (BFS) 용기로 부하하는 제제는 상승된 온도로 제제의 노출을 초래할 수 있다. 출원인은 하기의 부하 및 연장된 기간에 걸쳐 즉시 장치 (BFS 용기) 및 제제의 입증된 안정성으로 제제를 부하(부하하)하였다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같이 제제는 BFS로 사용하는데 적합하다. 실시형태에서, BFS로 사용하는데 적합한 제제는 명세서에 설명된 조건 하에서 BFS 용기 및/또는 BFS 용기에서 저장 후에, 예를 들면, 기간동안 저장 후로 하기를 부하한 즉시 안정성을 나타낸다.
실시형태에서, 본 명세서에서 설명된 제제는 안정하다. 실시형태에서, 제제는 본 명세서에서 설명된 조건(예를 들면, 저장에서 특정 온도, 또는 교반 스트레스) 하에서 안정성을 나타낸다. 실시형태에서, 안정성은 본 명세서에 설명된 하나 이상의 방법(예를 들면, 시각 용모, 분광강도법 (A280)에 의한 내용, 비-환원 SDS-PAGE, 환원 SDS-PAGE에 기반하여); 크기 배제 HPLC (SE HPLC); 역상(reverse phase) HPLC (RP-HPLC); 약한 양이온 교환 HPLC (WCEX-HPLC); 전위차(potency); 빛 차광 입자 계수 시험(light obscuration particle count test) (예를 들면, USP<788>에 설명된 바와 같이 빛 차광 입자 계수 시험(light obscuration particle count test)); 또는 미세 입자 계수 시험(microscopic particle count test) (예를 들면, USP <788>에 설명된 바와 같이 미세 입자 계수 시험(microscopic particle count test)) 및/또는 당업계에 알려진 방법에 의해 평가된다.
안정성은 시각 모습에 기반하여 평가될 수 있다. 실시형태에서, 제제는 시각 미립자로부터 필수적으로 자유로운 약하게 오팔색 무색 용액에 투명하다면 안정하다.
실시형태에서, 제제는 적어도 2일; 3일; 5일; 1주; 10일, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주, 16 주, 20 주, 25 주, 30 주, 35 주, 40 주, 45 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 또는 그 이상 동안 약 25℃ 내지 약 40℃, 예를 들면, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 또는 약 40℃에서 안정적이다.
실시형태에서, 제제는 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 2℃부터 8℃까지, 4℃에서, 5℃에서, 또는 6℃에서와 같이 약 2℃부터 약 8℃의 온도에서 저장 동안에 긴 기간 동안 안정적이다. 예를 들면, 제제는 적어도 2 주; 4 주; 6 주; 2 개월; 3 개월; 6 개월, 1 년, 2 년, 3 년, 또는 4 년 동안 상기 저장 온도에서 안정적이다.
제제의 안정성은 예를 들면, 2-8℃에서 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 또는 18 개월 동안 저장 후에, 또는 예를 들면, 예를 들면, 적어도 2 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 5 개월, 6 개월, 12 개월, 또는 18 개월동안 주위 조건하에서, 예를 들면, 상온에서 (RT), 예를 들면 약 25℃에서 저장 후에 평가될 수 있다. 실시형태에서, 제제는 적어도 5 개월 동안 상온에 노출 후에 안정적이다. 일부 실시형태에서, 제제는 BFS 용기에서 적어도 5 개월 동안 저장 후에 안정적이다.
안정성은 본 명세서에서 설명된 또는 당업계에 알려진 방법 및 기준(criteria)에 기반하여 평가될 수 있다. 예를 들면, 안정성은 물리적 순도(예를 들면, 크기 배제 HPLC를 사용하여 평가된 바와 같이, 또한 크기 배제, SE HPLC, 또는 SEC HPLC처럼 본 명세서에서 언급된 바와 같이 예를 들면, 응집 부족), 화학 순도 (예를 들면, 약한 양이온 교환 HPLC, 역상 HPLC, 및/또는 SDS PAGE (예를 들면, 환원되거나 또는 비환원된 SDS PAGE)를 사용하여 평가되는 것처럼), 및/또는 미립자 수준(예를 들면, 시각적으로 또는 HIAC 액체 입자 계산기 (Beckman Coulter, Brea, CA)를 사용하여 입자 계산하여 평가되는)에 기반하여 평가될 수 있다.
실시형태에서, 안정성은 USP <789> (미국 Pharmacopeia, Particulate Matter in Opthalmic Solution)에서 제시한 바와 같이, 안약에 있는 특정 물질에 대하여 준수에 기반하여 입증된다.
실시형태에서, 제제는 빛 차광 입자 계수 시험(light obscuration particle count test) (예를 들면, USP <788>에서 설명된 바와 같이 빛 차광 입자 계수 시험(light obscuration particle count test))에서 설명된 바와 같이, 입자 ≥10 ㎛에 대하여 ㎖ 당 50 입자에 미만(less than) 또는 동등 및/또는 입자 ≥25 ㎛에 대하여 ㎖ 당 5 입자에 미만(less than) 또는 동등을 가진다.
실시형태에서, 제제는 미세 입자 계수 시험(microscopic particle count test) (예를 들면, USP <788>에서 설명된 바와 같이, 미세 입자 계수 시험(microscopic particle count test))에서 설명된 바와 같이, 입자 ≥10 ㎛를 위하여 ㎖ 당 50 입자에 미만(less than) 또는 동등, 입자 ≥25 ㎛를 위하여 ㎖ 당 5 입자에 미만(less than) 또는 동등, 및/또는 입자 ≥50 ㎛를 위하여 ㎖ 당 2 입자에 미만 또는 동등을 가진다.
실시형태에서, 안정성은 주사, 예를 들면, USP <788>에서 제시된 바와 같이 (미국 Pharmacopeia, Particulate Matter in Injection), 주사에서 미립자 문제(particulate matter)에 대하여 지침으로 준수에 기반하여 입증된다. 실시형태에서, 제제는 예를 들면 빛 차광 입자 계수 시험(light obscuration particle count test) (예를 들면, USP <788>)에서 설명된 바와 같이 빛 차광 입자 계수 시험)을 사용하여 평가된 바와 같이, 입자 ≥10 ㎛에 대하여 용기 당 (100 ㎖ 또는 미만의 부피를 가지는 용기에 대하여) 6000 입자에 미만(less than) 또는 동등, 및/또는 입자 ≥25 ㎛에 대하여 용기 당(100 ㎖ 또는 낮은 부피를 가지는 용기) 600 입자에 미만 또는 동등을 가진다.
실시형태에서, 제제는 미세 입자 계수 시험(microscopic particle count test) (예를 들면, USP <788>에서 설명된 바와 같이 미세 입자 계수 시험(microscopic particle count test))을 사용하여 평가된 바와 같이, 입자 ≥10 ㎛에 대하여 5 ㎖ 당 3000 입자에 미만 또는 동등 및/또는 입자 ≥25 ㎛에 대하여 5 ㎖ 당 300 입자에 미만 또는 동등함을 가진다.
실시형태에서, 제제에서 단백질은 상온에서 (RT) 1-8 시간 동안, 예를 들면, RT에서 4 시간 동안 단백질 용액을 볼텍싱 후에 예를 들면, 응집 부족으로 (응집 부족은 만약 제제가 응집된(aggregated) 형태에 비례하여 단백질의 단량체 형태의 > 90%, > 91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, 또는 >99%를 포함한다면, 입증될 수 있다)입증된 것처럼 교반 스트레스로부터 보호된다. 응집은 본 명세서에서 설명된 방법 또는 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 평가될 수 있다. 예를 들면, 응집은 초원심 분리(ultracentrifugation), 크기-배제 크로마토그래피, 젤 전기영동(gel electrophoresis), 동적 광산란(dynamic light scattering), 및/또는 혼탁(turbidity) 측정을 사용하여 평가될 수 있다.
일부 측면에서, 안정성은 당업계에 알려진 물리적 또는 화학 방법으로 평가된다. 예를 들면, 물리적 순도 또는 응집 부족은 제제에서 단량체 폴리펩타이드의 상대적 양을 결정하는 크기 배제 HPLC 또는 다른 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 통상적으로, 허용가능한 안정성을 제제를 단백질의 응집된(aggregated) 형태에 비례하여 치료 단백질의 단량체 형태(예를 들면, 키메릭 사이토카인, 예를 들면, P05)의 > 90%를 포함한다. 실시형태에서, 제제는 단백질의 응집된(aggregated) 형태에 비례하여 치료 단백질의 단량체 형태(예를 들면, 키메릭 사이토카인, 예를 들면, P05)의 > 90% (예를 들면, > 91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, 또는 >99%)을 포함한다.
화학 순도는 약한 양이온 교환 HPLC 또는 역상(reverse phase) HPLC를 사용하여 결정될 수 있다. 통상적으로, 허용가능한 안정성을 가지는 제제는 약한 양이온 교환 HPLC를 사용하여 평가된 바와 같이, 분자의 화학적으로 변형된 형태에 비례하여, 자연 분자의 > 80%를 포함한다. 실시형태에서, 제제는 화학적으로 변형된 형태의 분자 (예를 들면, 산화되거나 또는 아세틸화된 형태(acetylated forms))에 비례하여, 자연 분자의 > 80% (예를 들면, > 85%, > 87%, > 90%, 또는 >95%)를 포함한다.
미립자는 시각적으로 확인될 수 있다. 실시형태에서, 제제는 시각적으로 확인될 수 있는 필수적으로 미립자가 없는 것이다.
출원인은 주사에 의한 운반을 위해 제조된, 아나키느라(anakinra), IL-1Ra 상의 정보는 생성물이 3 년의 자가 수명을 가지고, 3-8℃에서 저장되고, "이동(ambulatory) 사용의 목적을 위해 Kineret®은 유효기간을 넘지 않고, 25 ℃가 넘지 않는 온도에서 12 시간 동안 냉장고로부터 제거될 수 있다는 것을 서술한다는 것을 주목한다. 상기 기간 말기에, 생성물은 냉장고에 다시 넣지 말아야 하고 처분되어야만 한다(참고: medicines.org.uk/EMC/medicine/23104/SPC/Kineret+100+mg+용액+for+주사+in+a+pre-filled+syringe#SHELF_LIFE). 상기는 예를 들면, 본 명세서에서 제공된 P05 제제의 놀라운 안정성과의 대조를 제공한다.
생물학적 치료는 생물의 출분한 공급을 보증 할뿐만 아니라 저장, 운반, 및 환자를 위한 장애물을 만들 수 있는 특별한 저장 조건으 요구하거나 또는 상대적으로 짧은 자가 수명을 가질 수 있가 때문에 투여하는데 문제가 될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 특정 제제의 장점은 제제가 냉장고 조건하 뿐만아니라, 상온 (예를 들면, 25℃) 및 이상 (예를 들면, 40℃)과 일치하는 온도에서 놀랍게 안정된다는 것이다. 따라서, 사이토카인 단백질 또는 폴리펩타이드 제제 (예를 들면 이종기원의 사이토카인 단백질 또는 폴리펩타이드 제제), 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 제제는, 일부 실시형태에서, 적어도 3일, 5일, 1주, 10일, 2 주, 3 주, 6 주, 8 주, 16 주, 20 주, 25 주, 30 주, 35 주, 40 주, 45 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 12 개월, 또는 이상의 기간 동안 RT (예를 들면, 25℃에서)에서 안정적인 액체형태로 제공된다. 실시형태에서, 1 개월은 지금까지 기초, 예를 들면, 개월의 첫번째로부터 두번째 개월의 첫번째까지 날짜 상에 결정된다.
다른 측면에서 제제는 적어도 2 일; 3일; 5일; 1주; 10일, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주, 16 주, 20 주, 25 주, 30 주, 35 주, 40 주, 45 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 또는 이상의 기간동안 약 25℃ 내지 약 40℃에서, 예를 들면, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ , 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 또는 약 40℃에서 안정적이다.
일실시예에서, 제제는 단백질이 제제의 구성요소, 예를 들면, P05가 20 mg/ml일 때, 25℃에서 1 개월 및 40℃에서 1 주 동안 안정적이다. 다른 특정 실시형태에서, 불어서 채우는 밀봉 바이알 또는 불어서 채우는 운반 장치로 부하된, 제제는 1 mg/ml, 5 mg/ml, 또는 10 mg/ml의 농도의 단백질, 예를 들면, P05를 포함하는 제제에 대하여 적어도 3 개월 동안 25℃에서 안정적이다. 일부 실시형태에서, 상기 제제는 적어도 8 개월 동안 안정적이다.
실시형태에서, 4.5-5.5 mg/ml P05, 9-11 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate); 4.5-5.5% w/v 소르비톨(sorbitol), 및 0.09-0.11% w/v 폴록사머 188을 포함하는 제제는 2℃ 내지 8℃ 및/또는 상온에서, 예를 들면, 25℃에서 적어도 5 개월 동안 안정적이다. 일부 실시형태에서, 10 mM Na 시트레이트(citrate), pH 6.0, 5% 소르비톨(sorbitol), 0.1% 폴록사머(poloxamer), 및 5 mg/ml 또는 20 mg/ml P05로 구성되는 제제는 2℃ 내지 8℃에서 적어도 5 개월 동안, 예를 들면, 적어도 5 개월 동안 상온에서, 25℃에서 안정적이다.
농도
생물에 투여에서 추가적 문제는 생물의 충분한 농도를 제공한다. 이것은 용량의 최소 수로 효과를 얻기 위하여 생물의 상대적 높은 농도를 제공하는데 바람직한 안과(ophthalmic) 출원에 특정 문제이다. 출원인은 본 명세서 내에 이전 및 다른 곳에서 설명된 것과 같은 조건하에서 저장될 때 눈에 띄게 응집, 침전, 또는 화학 순도 상실하지 않는 폴리펩타이드의 높은 농도, 또는 치료적으로 효과적 농도를 포함하는 키메릭 사이토카인 제제의 효과적 용량을 운반할 수 있는 제제를 얻을 수 있었다. 추가적으로, 출원인은 탄력성 제제(tonicity agent), 계면활성제, 및 완충제를 포함하는 제제에서 최대 80 mg/ml까지, 예를 들면, 50 mg/ml의 단백질 농도의 사이토카인 제제의 안정성을 입증하였다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명에서 특징된 제제는 0.1 mg/ml부터 100 mg/ml까지, 0.1-80 mg/ml, 0.1 내지 50 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 1 mg/ml, 1 mg/ml 내지 100 mg/ml; 5 mg/ml 내지 100 mg/ml; 5 mg/ml 내지 30 mg/ml; 10 mg/ml 내지 100 mg/ml; 10 mg/ml 내지 30 mg/ml; 20 mg/ml 내지 100 mg/ml; 30 mg/ml 내지 100 mg/ml; 40 mg/ml 내지 100 mg/ml; 50 mg/ml 내지 100 mg/ml; 60 mg/ml 내지 100 mg/ml; 1 mg/ml 내지 80 mg/ml; 5 mg/ml 내지 80 mg/ml; 10 mg/ml 내지 80 mg/ml; 20 mg/ml 내지 80 mg/ml; 40 mg/ml 내지 80 mg/ml; 50 mg/ml 내지 80 mg/ml; 60 mg/ml 내지 80 mg/ml; 1 mg/ml 내지 60 mg/ml; 5 mg/ml 내지 60 mg/ml; 10 mg/ml 내지 60 mg/ml; 20 mg/ml 내지 60 mg/ml; 30 mg/ml 내지 60 mg/ml; 40 mg/ml 내지 60 mg/ml; 또는 50 mg/l 내지 60 mg/ml의 농도의 제제에 안정적으로 존재하는 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들면, 제제는 0.1 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 5 mg/ml 내지 20 mg/ml, 예를 들면, 5 mg/ml 또는 20 mg/ml를 포함한다.
점도제(Viscocity agent)는 제제, 예를 들면, 안과 사용을 위하여 빈번히 사용된다. 상기 제제는 결막낭(결막 sac)를 통하여 깜빡임(blinking) 및 배수(drainage)로 빠르게 깨끗(cleared)해지는 안과 치료의 거주 시간을 증가시키는 것을 포함한다. 그러나, 상기 제제는 해로운 효과, 예를 들면, 알레르기 증상, 제제의 손상 단백질 구성요소, 또는 흐릿한 시각의 원인을 가질 수 있다. 상기 제제가 본 명세서에서 설명된 특정 제제에서 사용될 수 있는 반면에, 일부 실시형태에서 출원인은 효과적 치료제로서 사용되는, 활성 구성요소, 즉, 키메릭 사이토카인을 위한 점도제(Viscocity agent)를 요구하지 않는 제제를 얻었다. 다른 측면에서 본 발명에서 특징된 제제는 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 비록 계면활성제의 사용이 용기로 분자의 부착을 감소시키고, 교반 조건하에서 특히 단백질의 응집을 감소시키는데 유용할 수 있지만, 계면활성제의 첨가는 거품, 천연 멤브린의 파괴 및 다른 장벽 및 치료에 의한 원인이 되는 비허용가능한 불쾌때문에 사용하지 않는 치료 제제를 줄 수 있다. 출원인은 계면활성제를 포함하나, 상기 단점을 초래하지 않는 제제를 계속 제공했다. 통상적으로, 계면활성제는 비-이온(non-ionic) 계면활성제이다. 개시된 제제에서 사용에 적합한 계면활성제는 하기를 포함하나, 제한하지 않는다: 폴록사머 188과 같은 폴록사머(poloxamers). 일부 실시형태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트-20(polysorbate-20) 및 폴리소르베이트-80과 같은, 폴리소르베이트(polysorbate)이다. 유용한 다른 계면활성제는 Cremophor® EL, tyloxapol, octoxynol 40 (트리톤® X405), 및 풀리옥실 40 스테아레이트(polyoxyl 40 stearate)를 포함한다. 특정실시형태에서, 제제는 약 0.05%, 0.06%, 0.1% 내지 1.0%, 0.1% 내지 0.5%, 0.2% 내지 0.5%, 또는 0.1% 내지 0.2% w/v, 예를 들면, 0.1% w/v 폴록사머(poloxamer) 188의 농도의 계면활성제 (예를 들면, 폴록사머 188)를 포함한다. 상기 계면활성제의 적합한 계면활성제 및 농도는 계면활성제가 교반 연구에서 응집을 방지하는지 안하는지 테스팅에 의해 결정될 수 있다. 상기 연구를 수행하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 계면활성제가 교반 스트레스로부터 침전을 방지하는데 필요한지 안하는지 결정될 수 있다. 상기 실험에서, 통상적으로, 스크린은 교반 및 분석을 수행하여 수행된다. 상기 연구를 위해 사용되는 농도의 실시예는 0.01%, 0.02%, 0.06%, 및 0.1% w/v 계면활성제, 예를 들면, 폴록사머 188이다. 실시형태에서, 응집 및/또는 침전은 분광강도법 (A280), 시각 검사, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 빛 차광(light obscuration) (예를 들면, HIAC 장치를 사용하여), 또는 Micro-Flow Imaging ™ (MFI, ProteinSimple, Santa Clara, CA)에 의한 분석을 수행하여 평가된다. 계면활성제는 주사에서 미립자 문제에 대한 지침서(예를 들면, USP <788>를 참조) 또는 안과용액제(ophthalmic 용액)에서 미립자 문제에 대한 지침서(예를 들면, USP<789>를 참조)를 만나는 침전의 가장 적은 양, 예를 들면, 보이지 않는 침전, 또는 입자 수와 연관된 제제에서 사용을 위해 일반적으로 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명에서 특징된 제제는 하나 이상의 탄력성 제제(tonicity agents)를 포함한다. 적합한 탄력성 제제는 하기를 포함하나, 제한하지 않는다: 소듐 클로라이드(sodium chloride), 소르비톨(sorbitol); 만니톨(mannitol), 수크로오스(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 또는 다른 슈가(sugars). 임의의 이론에 투입없이, 상기 제제는 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드의 놀라운 안정성에 기여할 수 있다. 실시형태에서, 탄력성 제제(tonicity agent), 예를 들면, 예를 들면, 소르비톨과 같은 슈가(sugar)는 열 안정성으 ㄹ제공하거나 기여할 수 있다. 특정실시형태에서, 본 발명에서 특징된 제제는 안구에 대하여 등장성(isotonic)이다(예를 들면, 약 270-330 mOsm 당 kg의 삼투압을 가지는). 일부 실시형태에서, 제제는 kg 당 약 250부터 약 450 mOsm까지의 삼투압, kg 당 300 내지 400 mOsm, kg 당 350 내지 400 mOsm, kg 당 200 내지 375 mOsm, 또는 kg 당 350 내지 375의 삼투압을 가진다. 실시형태에서, 제제는 kg 당 270-330 mOsm, 예를 들면, kg 당 약 320 mOsm의 삼투압을 가진다. 탄력성 제제(tonicity agent)에 의존하여, 본 발명에서 특징된 특정실시형태는 약 1%부터 약 15% w/v까지; 2% 내지 12% w/v; 5% 내지 12% w/v; 또는 5% 내지 10% w/v를 포함한다. 소르비톨 또는 만니톨(mannitol)에 대하여, 농도 실시예는 약 5% w/v이고, 예를 들면, 농도는 5% w/v이다. 수크로오스(sucrose) 또는 트레할로오스(trehalose)를 위하여, 농도 실시예는 약 9% w/v이다.
완충제
다른 측면에서, 본 명세서에 특징된 제제는 하나 이상의 완충제를 포함한다. 적합한 완충제는 포함한다. 적절한 완충제는 포스페이트; 시트레이트(citrates); 아세테이트(acetates); 보레이트(borates); 숙시네이트(succinates); 및 트리스를 포함하나, 제한하지 않는다. 일부 경우에서 완충제의 염은 소듐 염 또는 포타슘 염이다. 본 명세서에 특징된 특정실시형태에서, 완충제는 약한 완충 효과를 제공하기 위하여 약 10 mM부터 약 50 mM까지, 예를 들면 약 20 mM부터 약 40 mM까지의 양에서 존재된다. 이것은 찌르거나(stinging) 또는 불쾌한 사건에서, 예를 들면, 안구의 표면에 투여 위치에서 빠르게 중화되는 제제를 허용한다. 일부 실시형태에서, 완충제는 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM 또는 약 50 mM의 양으로 존재된다. 일부 제제에서, 완충제는 시트레이트(citrate), 예를 들면, 소듐 시트레이트(sodium citrate)이다. 다른 제제에서, 완충제는 10 mM의 존재하는 시트레이트이다. 일반적으로, 완충제는 약한 완충제이다.
일반적으로, 적합한 완충액은 관심있는 폴리펩타이드가 다양한 pH’s, 농도, 온도에서, 및 다양한 시간 동안 다양한 완충액에 노출된 안정성 연구 수행에 의해 선택된다. 완충액은 상승된 온도(가속화된 안정성 테스트)로 완충액에 있는 관심의 폴리펩타이드를 넣고 시료를 수행한 후 물리적안정성 (시각 검사에 의해 침전) 또는 화학 안정성을 위하여 테스트, 예를 들면, 약한 양이온 교환 크로마토그래피로 탈아미드화(deamidation)를 모니터링하거나 또는 역상 크로마토그래피에 의해 산화하여 선택될 수 있다. 추가 분석은 A280, SDS-PAGE, pH, 및 삼투압의 모니터링을 포함할 수 있다. 최상의 물리적 및 화학 안정성을 제공하는 완충액은 선택된다.
아미노산
다른 측면에서, 본 발명에서 특징된 제제는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 적합한 아미노산은 하기를 포함하나 , 제한하지 않는다: 아르기닌(arginine), 글루타민산(glutamic acid), 히스티딘(histidine), 또는 메티오닌(methionine). 아미노산은 단백질의 안정성 및/또는 용해도를 증강시키기 위해서 선택된다. 상기 아미노산을 확인하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, P05 제제와 같은 제제는 히스티딘(histidine) 또는 메티오닌(methionine)을 포함한다. 일부 실시형태에서 제제는 산소제거제(oxygen scavenger), 예를 들면, 메티오닌(methionine)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제제는 플라스틱 용기 안에 있다. 실시형태에서, 플라스틱 용기는 자유 래디컬을 생성하는 방법을 사용하여 살균되고, 예를 들면, 용기는 감마선(gamma radiation) 또는 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide)를 사용하여 살균된다. 일부 상기 실시형태에서, 제제는 메티오닌(methionine), 예를 들면, 1-20 mM의 농도의 메티오닌을 포함한다. 실시형태에서, 메티오닌은 1-5 mM, 5-10 mM, 10-15 mM, 15-20mM, 또는 5-15 mM의 농도에서 존재한다. 실시형태에서, 메티오닌은 약 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15, mM, 또는 20 mM에서 존재한다. 실시형태에서, 제제는 약 5 mM의 농도, 예를 들면, 2.5-7.5 mM, 3-7 mM, 또는 4-6 mM의 농도에서 메티오닌을 포함한다. 일부 실시형태에서 살균된 플라스틱 용기에서 메티오닌을 포함하는 제제 및 산화의 양은 메티오닌을 포함하지 않는 해당 제제의 것보더 적다.
점도제 ( Viscocity agents)
다른 측면에서, 본 발명에서 특징된 제제는 하나 이상의 점도제를 포함할 수 있다. 적합한 점도제는 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose) (also referred to 본 명세서as carboxymethyl cellulose 또는 CMC)를 포함하는, 메틸셀룰로오스(methylcelluloses); 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose)를 포함하는, 하이드록시 셀룰로오스(hydroxy celluloses); 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose (hypromellose)); 934P, 971P 및 974P와 같은 카르보머(carbomers); 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol); 크산탄 검(xanthan gum); 구아 검(guar gum); 젤란 검(gellan gum); 및 글리세린(glycerin)을 포함하나, 제한하지 않는다.
본 발명에서 특징된 제제는 다른 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들면, Gennaro (ed.), Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage 형태 and Drug delivery Systems, 7th Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X); Protein Formulation and Delivery, McNally 및 Hastedt (eds.), Informa Health Care (ISBN: 0849379490) (2007)을 참조하시오. 부형제 중에서 첨가될 수 있는 것은 방부제, 관통 증강제(penetration enhancers) 및 접착제(bioadhesives)이다. 관통 증강제(penetration enhancers) 및 접착제(bioadhesives)는 예를 들면, 키토산(chitosan), 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 아미드하된 젤라틴(aminated gelatin), 폴리-L-카프롤렉톤(poly-L-caprolectone (carbopol 941P)); 폴리(부틸시아노아크릴레이트(poly(butylcyanoacrylate)); 폴리-L-아르기닌; 사이클로덱스트린(cyclodextrins); 겔란(gellan); 폴리(아크릴산)(poly(acrylic acid)); 히알루론산(hyaluronic acid); 무신(mucin); 알지네이트(alginate); 카르보필(carbophil), 및 폴록사머(poloxamer)(예를 들면, Nagarwal et al., J 조절된 Release, 136:2-13 (2009); Ding, PSTT 1:328-35 (1998); 및 Sahoo et al., Drug Discovery Today, 13:144-51(2008)을 참조하시오)을 포함할 수 있다. 다른 부형제는 안정제(stabilizers)로서 유용할 수 있고, 예를 들면, 글리세린(glycerin), 포타슘 클로라이드, 포타슘포스페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 아세테이트(acetate), 소듐 비스설피트(sodium bisulfite), 소듐 보레이트(sodium borate), 소듐 보레이트 십수화물(sodium borate decahydrate), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 소듐 시트레이트(sodium citrate), 소듐 포스페이트, 소듐 포스페이트 (포함하는 소듐 포스페이트 monobasic 및 dibasic); 아연 클로라이드(zinc chloride), 페놀(phenol), 벤조에이트(benzoate), 유도체 of 피마자유(castor oil) 및 에틸렌 옥사이드(ethylene oxides), 및 Cremophor® (BASF Corp., Germany)을 포함할 수 있다. 본 발명에서 특징된 약학적 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 상기는 나노입자 및 리포좀을 포함하는, 액체용액 (예를 들면, 주사 및 불용해성 용액s), 분산제 또는 현탁제와 같은 액체, 반-고체, 및 고체 용량 형태를 포함한다. 상기 형태는 투여 및 치료 출원의 의도된 모드에 알반적으로 의존된다. 본 명세서에 설명된 제제를 위한 조성물은 통상적으로 주사 또는 불용해성 용액의 형태로 있거나, 또는 국소 운반, 예를 들면, 국소 안구 운반을 위해 제조된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 설명된 약학적 조성물은 제작 및 저장의 조건하에서 살균 및 안정된다. 또한 약학적 조성물은 투여를 위하여 조절(regulatory) 및 산업 표준을 맞추도록 보장하도록 테스트될 수 있다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼(microemulsion), 분산제, 리포좀, 또는 높은 약물 (예를 들면, 생물) 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제조될 수 있다. 살균 주사 용액은 요구되는 바와 같이 상기 하나하나 열거된 하나 또는 성분의 조합으로 적절한 용매에서 요구되는 양으로 명세서에서 설명된 제제를 포함하여, 이어서 살균을 여과하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산제는 상기 하나하나 열거된 것으로부터 기본 분산제 배지 및 요구되는 다른 성분을 포함하는 살균 비히클로 본 명세서에 설명된 제제를 포함하여 제조될 수 있다. 살균 주사 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경에 있어서, 제조의 실시예 방법은 본 명세에서 설명된 제제의 분말에 더하여 이의 기존에 살균-여과된 용액으로부터 임의의 추가 원하는 성분을 수확하는 진공 건조 및 냉동-건조를 포함한다. 용액의 적당한 유동질은 렉틴(lecithin)과 같은 코팅의 사용, 분산제 경우에서 요구되는 입자 크기 유지 및 계면활성제의 사용에 의해, 유지될 수 있다. 주사 조성물의 연장된 흡수는 흡수, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 지연하는 제제의 포함에 의해 제작될 수 있다. 상기 제제는 저-용량 제제로 특히 유용할 수 있다. 실시형태에서, 제제는 치료 단백질 (예를 들면, 키메릭 사이토카인, 예를 들면, P05)의 ≤ 1 mg/ml을 포함하고 젤라틴은 제제에 포함된다.
특정실시형태에서, 제제는 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들면, 신체에서 자체의 반감기에 기반하여 평가되는 바와 같이, 예를 들면, 안구에서, 예를 들면, 각막(cornea) 상에서)의 예를 들면, 약물동력학(pharmaco동역학 (PK))를 연장하기 위해 담체로 제조된다. 상기 실시형태에서, 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드는, 예를 들면, 조절되는 방출(조절된 release) 제제로서, 운반될 수 있고, 이식 또는 미세피막(microencapsulated) 운반 시스템에 의해 운반될 수 있다. 생물분해, 생체에 적합한 폴리머, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트(acetate), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 콜라겐(collagen), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoesters), 및 폴리락트산(polylactic acid))는 사용될 수 있다. 예를 들면, Sustained and 조절된 Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조하시오.
본 명세서에 설명된 제제의 특징은 그들이 방부제를 포함하지 않는 것이다. 일반적으로, 방부제는 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드에 영향을 줄 수 있고, 예를 들면, 폴리펩타이드의 구조를 야기시킨다. 추가적으로, 방부제는 개체에서 원하는 치료 효과에 상반되는 염증성 반응의 원인이 될 수 있다. 제제는 살균 조건 하에서 최종 용기로 살균, 저장, 및 채워질 수 있다.
비히클 제제
출원인은 치료 단백질 (예를 들면, 비히클 단독 제제)을 포함하지 않는 본 명세서에 설명된 바와 같이 제제는 안구 질병, 예를 들면, 건조 안구 질병의 하나 이상의 징후 또는 증상, 예를 들면, 본 명세서에 설명된 건조 안구 질병의 징후 또는 증상을 위하여 유용하다는 것을 우연히 발견하였다. 일부 실시형태에서, 비히클 제제는 계면활성제, 탄력성 제제(tonicity agent), 및 완충제를 포함한다. 일부 상기 실시형태에서, 제제는 통증(예를 들면, 통증 문제 점수 또는 시각 아날로그 규모를 사용하여 평가되는 통증)), OSDI, 또는 OSDI의 서브스케일(subscale)을 감소시키는데 효과적이다. 일부 상기 실시형태에서, 제제는 각막 플루오레신(corneal fluorescein)염색 (CFS)을 감소시킨다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “비히클 단독 제제”는 실질적으로 단백질 또는 펩타이드 구성요소가없는, 예를 들면, 치료 단백질을 포함하지 않는 본 명세서에 설명된 제제를 언급한다. 본 명세서에서 설명된 비히클 제제는 임의의 치료 단백질, 예를 들면, 치료 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 비히클 제제, 예를 들면, 비히클 단독 제제는 계면활성제 (예를 들면, 폴록사머 188), 탄력성 제제(tonicity agent) (예를 들면, 소르비톨(sorbitol)), 및 완충제 (예를 들면, 소듐 시트레이트(sodium citrate))를 실질적으로 포함한다. 실시형태에서, 비히클 제제는 실질적으로 단백질이 없다. 실시형태에서, 비히클 제제는 치료 단백질 또는 펩타이드가 실질적으로 없다. 실시형태에서, 비히클 제제는 점도제(viscosity agent)를 포함하지 않는다. 유용한 계면활성제, 탄력성 제제(tonicity agent), 및 완충제는 본 명세서에 개시된 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 계면활성제는 폴록사머 188이고, 탄력성 제제(tonicity agent)는 소르비톨이고, 완충제는 듐 시트레이트(sodium citrate) 및/또는 소듐 포스페이트이다.
실시형태에서, 완충제는 20 mM 또는 미만의 농도로 존재란다.
일부 실시형태에서, 비히클 제제는 약 0.1% w/v 폴록사머(poloxamer) 188, 약 5% w/v 소르비톨(sorbitol), 및 약 10mM w/v 소듐 시트레이트(sodium citrate)를 포함한다. 실시형태에서, 본 명세서에서 설명된 비히클 제제의 구성요소는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50%까지에 의해 본 명세서에 제공된 값 주위에 다양할 수 있는 양으로 존재된다. 실시형태에서, 비히클 제제의 구성요소는 10%까지 본 명세서에 제공된 값 주위에 다양한 양으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 비히클 제제는 10 mM 소듐 시트레이트, pH 6.0, 5% 소르비톨 (w/v), 및 0.1% 폴록사머 188로 구성되는 수용성 제제이다.
실시형태에서, 비히클 제제는 9.5-10.5 mM, 9-11 mM, 8.5-11.5 mM, 8-12 mM, 7.5-12.5 mM, 7-13 mM, 6-14 mM, 또는 5-15 mM 소듐 포스페이트 또는 소듐 시트레이트(sodium citrate)를 포함한다. 실시형태에서, 비히클 제제는 9.5-10.5 mM, 9-11 mM, 8.5-11.5 mM, 8-12 mM, 7.5-12.5 mM, 7-13 mM, 6-14 mM, 또는 5-15 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate)를 포함한다. 실시형태에서, 비히클 제제는 4.75-5.25%, 4.5-5.5%, 4.25-5.75%, 4-6%, 3.75-6.25%, 3.5-6.5%, 3-7%, 또는 2.5-7.5% w/v 소르비톨(sorbitol)를 포함한다. 실시형태에서, 비히클 제제는 0.095-0.105%, 0.09-0.11%, 0.085-0.115%, 0.08-0.12%, 0.075-0.125%, 0.07-0.13%, 0.06-0.14%, 또는 0.05-0.15% w/v 폴록사머 188을 포함한다.
실시형태에서, 비히클 제제의 pH는 5.5 내지 7.5이다. 실시형태에서, pH는 5.5 내지 6.5이다. 실시형태에서, pH는 6 내지 7이다. 실시형태에서, 제제는 8-12 mM 소듐 시트레이트, 4-6% w/v 소르비톨, 0.08-0.12% w/v 폴록사머 188을 포함하고, 5.5. 내지 7.5의 pH, 예를 들면, 5.5 내지 6.5의 pH를 가진다. 실시형태에서, 비히클 제제는 7-13 mM 소듐 시트레이트, 3.5-5.5 w/v % 소르비톨, 0.07-0.13% w/v 폴록사머 188을 포함하고, 5.5. 내지 7.5의 pH, 예를 들면, 5.5 내지 6.5의 pH를 가진다.
실시형태에서, 비히클 제제는 점도제(viscosity agent)를 포함하지 않는다.
실시형태에서, 비히클 제제는 점도제, 예를 들면, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose) (CMC)를 포함한다. 실시형태에서, 비히클 제제는 CMC, 예를 들면, 0.1-1% w/v, 0.1-0.5% w/v, 또는 0.2-0.3 w/v%의 농도의 CMC를 포함한다.
일부 실시형태에서, 비히클 제제는 0.1% w/v 폴록사머 188, 5% w/v 소르비톨, 0.25% w/v 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose) 및 10 mM 소듐 포스페이트를 포함한다. 실시형태에서, 비히클 제제는 약 6.5의 pH를 가진다. 실시형태에서, 제제의 구성요소는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30%까지 제공된 값 주변에 다양할 수 있는 양으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 비히클 제제는 0.1% w/v 폴록사머 188, 5% w/v 소르비톨, 0.25% w/v 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose) 및 10 mM 소듐 포스페이트로 구성된다.
실시형태에서, 제제는 0.08-0.12% w/v 폴록사머 188, 4-6% w/v 소르비톨, 0.2-0.3% w/v 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose) 및 8-10 mM 소듐 포스페이트를 포함한다. 실시형태에서, 제제는 5.5-7.5, 예를 들면, 5.5-6.5의 pH를 가진다.
투여
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 특징된 제제는, 예를 들면, 키메릭 IL-1 억제제 또는 비히클 제제와 같은 치료 단백질을 포함하는 제제는 개체, 예를 들면, 인간 또는 개, 고양이, 또는 말과 같은 다른 포유류에 국소적으로 투여, 예를 들면, 안구에 투여된다. 일반적으로, 본 명세서에 설명된 제제는 약덩이(bolus)로서 정맥내(intravenous) 투여와 같은 임의의 적합한 방법으로 또는 근육내(intramuscular), 근육내(intramuscular), 동맥내(intraarterial), 수막공간내(intrathecal), 포내의(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내(intracardiac), 진피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 윤활내(intrasynovial), 기관내(transtracheal), 표피밑(subcuticular), 피하(subcuticular), 관절내의(intraarticular), 피막하(subcapsular), 거미막밑(subarachnoid), 척추내(intraspinal), 경막외(epidural) 주사, 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입(infusion)으로 기간에 걸쳐 지속주입으로, 개체에 투여될 수 있다. 투여의 다른 적합한 모드는 국소 (예를 들면, 피부(dermal) 또는 점막(mucosal)) 또는 흡입(inhalation) (예를 들면, 비강내(intranasal) 또는 폐내(intrapulmonary)) 경로를 포함한다. 특정 출원에 대하여, 투여의 경로는 하기의 하나이다: 정맥내(intravenous) 주사 또는 주입(infusion), 피하 주사, 또는 근육내(intramuscular) 주사. 안구에 투여를 위하여, 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 특징된 제제를 위한 투여 모드는(예를 들면, 본 명세서에 설명된 키메릭 사이토카인 제제) 안구에 국소 투여, 예를 들면, 안약(drops) 형태이다. 제제를 투여할 수 있거나 및/또는 제제 투여를 위해 사용될 수 있는 장치의 실시예는 간단한 안약, 측정기가 있거나 없는 병을 짜내기(squeeze bottles with 또는 without metering function), 및 예를 들면 팁-실 기술(tip-seal technology), 은/미량유효 기술(silver/oligodynamic technology), 살균 필터, 붕괴 주요 용기(collapsing primary containers), 등을 사용하여 Catalent (Somerset, NJ), 다용도 장치에 의해 제작된 것과 같은 blow/fill/seal (BFS) 장치를 포함한다.
제제를 위한 다른 고려는 운반 장치 또는 용기에 들러붙는 것(sticking)을 최소화하는 것이다. 예를 들면, 계면활성제, 예를 들면, 폴록사머 188의 첨가는 용기에 P05의 들러붙는 것(sticking)을 최소화할 수 있다. 용기를 위한 추가 고려는 그것이 일단 예를 들면, 증발의 허용가능한 낮은 수준 및/또는 제제는 명세서의 배출 분석 설명, 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 설명으로 채워지면 허용가능한 자가-수명을 제공한다는 것이다. 실시형태에서, 용기는 예를 들면, 5℃에서 적어도 2 년, 예를 들면, 적어도 3 년, 적어도 4 년, 또는 적어도 5 년의 자가 수명(shelf-life)을 제공하는데 적합하다. 실시형태에서, 용기는 5℃에서 적어도 3 년의 자가 수명을 제공하는데 적합하다. 실시형태에서, 용기는 RT에서 적어도 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 8 개월, 10 개월, 또는 12 개월의 자가 수명을 제공하는데 적합하다. 실시형태에서, 용기는 RT에서 적어도 5 개월의 자가 수명을 제공하는데 적합하다. 다양한 적합한 용기 물질은, 예를 들면 특정 플라스틱, 예를 들면, 저밀도 폴리에틸렌(low density polyethylene (LDPE)), 저밀도 폴리에틸렌(high density polyethylene (HDPE)), 또는 프로필렌(polypropylene)으로 당업계에 알려져 있다. 제제는 용기에서 단일 사용 적용을 위해 제조될 수 있고 다용도 용기에서 사용을 위하여 제조될 수 있다.
본 명세서에서 특징된 제제는 안구의 후분절(뒤쪽에 있는(Posterior) segment)과 연관된 장애를 치료하기 위하여, 유리 체강내(intravitreally)로 운반될 수 있다. 유리체내(intravitreal) 투여의 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들면, 안구내(intraocular) 주사, 이식가능(implantable) 장치를 포함한다. 실시형태에서, 제제는 이식가능(implantable) 장치를 사용하여 유리 체강내(intravitreally) 투여된다. 실시형태에서, 제제는 열 안정기(thermal stabilizer), 예를 들면, 소르비톨을 포함한다. 실시형태에서, 소르비톨은 ≥5% w/v의 농도에서 존재된다. 이식가능한 장치는 예를 들면, 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol)-에틸렌 비닐 아세테이트 폴리머 및 폴리설폰 모세혈과 섬유(polysulfone capillary fibers)와 같은 비생물분해 장치, 및 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid) 및 폴리락트-공동-글리코산과 같은 생물분해 장치, 폴리카프로락톤(polycaprolactones), 및 폴리안하드라이드(polyanhydrides)일 수 있다. 장치는 나노입자, 리포좀, 또는 마이크로스피어와 같은 형태로 운반될 수 있다. 본 발명에서 특징된 제제는 고정된 용량(fixed dose), 체중 결정된 용량(weight determined dose) (예를 들면, mg/kg), 또는 연령 결정된 용량(age determined dose)로서, 투여될 수 있다. 제제, 예를 들면, 비히클 제제 또는 치료 제제 (치료 단백질과 같은 치료를 포함하는 제제)는 예를 들면, 하루에 4회; 하루에 3회; 하루에 2회; 하루에 1회; 하루에 3회; 하루걸러(every other day), 이틀간격으로(every third), 4 또는 5번째 일(fourth 또는 fifth day); 매 주; 매 2 주; 매 3 주; 매 4 주; 매 5 주; 개월마다; 매 2 개월; 매 3 개월; 매 4 개월; 매 6 개월; 또는 필요에 따라(임의로) 투여될 수 있다. 실시형태에서, 제제는 하루에 1회, 2회 또는 3회 투여된다. 일부 상기 실시형태에서, 제제는 국소적으로, 예를 들면, 안구 표면에 투여된다. 약학적 조성물은 본 명세서에 설명된 제제의 “치료적으로 효과적인 양”을 포함할 수 있다. 제제의 치료적으로 효과적인 양은 개인의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 요인, 및 개인에서 원하는 반응을 유도하는 화합물의 능력, 예를 들면, 적어도 하나의 장애 파라미터 (예를 들면, 징후)의 완화, 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 완화(및 선택적으로 투여되는 임의의 추가 제제의 효과)에 따라 다양할 수 있다. 치료적으로 효과적인 양은 임의의 독성 또는 조성물의 해로운 영향이 치료적으로 혜택 효과에 의해 더 우세한 것이다. 일부 실시형태에서, “치료적으로 효과적인 양”은 각각의 수로 결정되고 양은 사이토카인-관련 장애, 예를 들면, 영향받은 수(affected population)의 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%에서 IL-1-관련 장애의 적어도 하나의 증상 또는 조짐(indication)을 완화하는데 효과적인 것으로 결정된다. 제제는 통상적으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 일부 경우에서, 치료적으로 효과적인 제제는 비히클 제제이다. 일부 경우에서, 치료적으로 효과적인 제제는 치료 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제제는 IL-1-관련 장애 및 the 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드를 가지는 개체에 투여되고 L-1β 및 Il-1Ra 서열의 단편을 포함한다. 상기 제제는 폴리펩타이드의 예를 들면, 5 mg/ml 내지 20 mg/ml, 5 mg/ml 또는 20 mg/ml을 포함한다. 실시형태에서, 제제는 하루 당 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 6회 안구에 국소적으로 투여된다. 약학적 조성물은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 의약 장치 및 당업계에 알려진 것, 예를 들면, 이식, 주입 펌프(infusion pumps), 피하주사(hypodermic needles), 및 주사 없는 피하(needleless hypodermic)주사 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 장치는 약학적 조성물을 예를 들면, 저장하기 위한 하나 이상의 하우징(housings), 및 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드의 유닛 용량, 및 선택적으로 두번째 제제를 운반하는 것을 구성할수 있다. 용량은 고정된 용량, 즉, 치료되고자 하는 개체를 위한 일원화된 용량으로서 적합한 물리적 별개의 유닛일 수 있고; 각각의 유닛은 약학적 담체와 연합하고 및 다른 제제 예를 들면, Restasis® 또는 반대 또는 처방된 생성물에 걸쳐 활용가능한 것과 같은 인공 눈물(artificial tears)과 선택적으로 연합하여 원하는 치료 효과를 생산하기 위해 계산된 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드의 미리 결정된 양을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, Il-1-관련 장애와 같은 본 명세서에 설명된 장애를 cfy하기 위하여, 제제는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상에서 지연된 개선을 유도하기 위해 충분한 양과 시간 동안 장애를 가지는 개체에 투여된다. 개선은 개체가 연장된 기간, 예를 들면, 1 내지 4 주에 의해 분리된 적어도 2개 경우 상에, 연장된 기간에 걸쳐 개선을 나타낸다면 “지연된”으로 간주된다. 개선의 정도는 징후 또는 증상에 기반하여 결정될 수 있고, 삶의 질(quality-of-life) 문제와 같이, 개체에 투여되는 문제를 고용할 수 있다. 하나의 비-제한 실시예에서, 키메릭 사이토카인 폴리펩타이드는 IL-1β 및 IL-1Ra의 단편을 포함하고 주 당 1회. 예를 들면, 적어도 하루 당 1회, 적어도 하루 당 2회, 또는 적어도 하루 당 3회 국소적으로 투여된다. 개선은 개체가 선택되는 징후 및/또는 증상에 대하여 기저선에 걸쳐 개선이 분명해질 때까지 제제의 용량을 반복적으로 투여하여 유도될 수 있다. 만성 조건을 치료하는 것에서, 개선의 양은 적어도 1 개월 또는 이상, 예를 들면, 1게월, 2개월, 또는 3 개월 또는 더 길게, 또는 무한정(indefinitely) 동안의 기간에 걸쳐 반복적으로 투여하여 평가될 수 있다. 급성 조건 치료에서, 제제는 1주 내지 6 주 기간동안 또는 단일 용량으로서 투여될 수 있다. 비록 초기 또는 간헐적 치료 후에 장애의 연장은 하나 이상의 징후 또는 증상에 따라 개선을 나타낼 수 있지만, 치료는 동일한 수준 또는 감소된 용량 또는 빈번도(frequency)에서 무기한 계속될 수 있다. 치료는 징후 또는 증상의 개선 또는 사라짐(disappearance)에 따라, 또한 중단될 수 있다. 일단 치료가 감소되거나 또는 중단되면, 증상이 다시 나타나는지를 재개되 수 있다.
치료
일부 본 명세서에서 특징된 제제는 치료 단백질을 포함한다. 실시형태에서, 제제는 IL-1 신호에 반대할 수 있고 IL-1R에 결합할 수 있는 것과 같은 키메릭 수용체 결합 제제 (예를 들면, 키메릭 사이토카인)을 포함하고, 따라서 임의의 질병 또는 의약 조건, 즉 (i) IL-1 작용(agonism)에 의해 적어도 부분적으로 원인이 되는, (ii) IL-1 신호 구성요소 (IL-1α, IL-1β, 또는 IL-1RI와 같은)의 상승된 수준 또는 활성 또는 상승된 IL-1 신호와 연관된, 및/또는 (iii) IL-1 활성을 감소시켜 완화되는 것을 포함하는, "IL-1 관련 장애”를 치료하기 위하여 사용될수 있다. IL-1 관련 장애는 자가면역(autoimmune) 장애 및 염증성 장애를 포함하는, 급성 및 만성 장애를 포함한다. IL-1 관련 장애는 시스템 및 비-시스템 장애를 포함한다. IL-1α및 IL-1β는 예를 들면, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)을 포함하는, 염증성 질병뿐만 아니라 감염 반응에 관련되는 강력한 전-염증성 사이토카인것을 잘 설명했다. 증가된 IL-1 생성물은 특정자가면역(autoimmune) 장애, 국소빈혈(ischemia), 및 다양한 암을 가진 환자에서 관찰되었고, 따라서 이들과 관련 질병에서 IL-1을 의미한다(예를 들면, Sims 및 Smith, Nature Rev Immunol, 10:89-102 (2010)를 참조하시오).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “치료(treat)”는 개체, 예를 들면, 환자에게 조건, 증상, 또는 장애, 예를 들면, 본 명세서에 설명된 장애를 개선하기 위하여, 또는 장애의 시작 또는 진행을 방지하기 위하여, 통계적으로 현저한 정도 또는 당업계에 숙련된 자에게 검출가능한 정도로 양, 방식, 및/또는 모드로 명세서에 설명된 제제의 투여를 언급한다. 치료는 돌봄, 치유, 완화, 경감, 변경, 처방, 완화, 일시적 완화(palliate), 개선 또는 장애에 영향, 장애의 증상 또는 장애의 경향일 수 있다.
효과적 양, 방식, 또는 모드는 개체에 의존하여 다양할 수 있고 개체에 맞추게 될 수 있다. 실시예 개체는 인간, 영장류(primates), 및 다른 비인간 포유류를 포함한다. 본 발명에서 특징된 제제는 또한 장애 또는 이의 증상 또는 징후의 발생 위험을 줄이기 위해 예방(prophylactically)이 주어질 수 있다. IL-1-관련 장애는 자가면역(autoimmune) 장애일 수 있다. IL-1-관련 자가면역(autoimmune) 장애의 실시예는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 강직척추염(ankylosing spondylitis), 베흐세트 신드롬(Behcet’s syndrome), 염증성 장질환(크론병(Crohn’s disease) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 포함하는), 천식(asthma), 건선(psoriasis), 제1형 당뇨병, 여드름(acne)의 일부 형태, 및 본 명세서에서 확인된 다른 장애를 포함한다. 본 명세서에 설명된 제제는 IL-1 매개된 자가면역(autoimmune) 장애에 대하여 위험을 가지거나 또는 에서 개체에 투여될 수 있다. IL-1 매개된 장애는 하기에 설명된 것과 같은 염증성 장애일 수 있다. 본 발명에서 특징된 제제는 안구 장애(ocular disorder), 예를 들면 안구에 직접적으로 또는 안구 주위에 국소적으로 키메릭 사이토카인 수용체를 관리하는 것을 원하는 안구 장애에 사용하는 것에 특히 적합하다. IL-1-관련 안구 장애의 실시예는 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome) (예를 들면, 쇼그렌증후군과 연결된 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca)), 건성각결막염을 포함하는 건조 안구 장애 (Sjogren's-associated 또는 non- Sjogren's-associated), 각막염(keratitis sicca), 시카 증후군(sicca syndrome), 안구건조증(xerophthalmia), 눈물막 장애(tear film disorder), 감소된 눈물 생성물, 수용성 눈물 결핍, 건조 안구 연관된 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease), 및 마이봄샘 기능 장애 (Meibomian gland dysfunction)을 포함한다. 건조 안구 장애를 가지는 개체는 안구의 염증을 나타낼 수 있고, 가려운(scratchy), 쏘는(stingy), 가려운(itchy), 화상(burning) 또는 압각(pressured sensations), 자극(irritation), 통증, 및 발적(redness)를 경험할 수 있다. 건조 안구 장애는 초과 안구 물 및 불충분한 눈물 생성물과 연관될 수 있다. 본 발명에서 특징된 제제는 하나 이상의 상기 증상의 시작 또는 악화를 완화 또는 방지하기 위하여 상기 개체에게 투여될 수 있다. 본 발명에서 특징된 제제는 개체에서 를 들면, 신경세포염증에 기인한 통증과 같은 안구 통증을 완화하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 설명된 실시형태는 IL-1-관련 장애, 예를 들면, 건조 안구 장애를 가지는 동물 치료의 방법을 포함한다. 건조 안구는, 예를 들면 개(canines)에서 심각한 장애일수 있다. 건조 안구와 연관된 개에서 장애의 비제한적 실시예는 선천적 장애(congenital disorder), 감염(infections) (예를 들면, 개홍역바이러스(canine distemper virus)), 약물 유도 (예를 들면, 설파(sulfa) 항생제에 의해), 및 세번째 눈꺼풀("cherry eye")의 눈물샘의 제거를 포함한다. 건조 안구 장애는 또한 특정 개 새끼, 예를 들면, Cocker Spaniel, Shih Tzu, Lhasa Apso, Bulldog, Schnauzer, 및 West Highland White Terrier에서 일반적으로 나타난다. 치료될 수 있는 동물의 다른 비-제한 실시예는 고양이 및 말을 포함한다.
본 명세서에서 특징된 제제는 각막(cornea)과 같은, 안구의 표면에 영향을 미치는 다른 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 장애는 주변 궤양성 각막염(peripheral ulcerative keratitis) 및 미생물 각막염(microbial keratitis)를 포함하는, 각막 안구 표면 염증성 조건, 각막 신혈관형성(corneal 신혈관신생(neovascularization)), 각막염(keratitis)을 포함한다. 제제는 각막 부상 치유 (예를 들면, 각막(cornea)l 부상을 가지는 개체)를 치료하는데 사용될 수 있다. 제제는 안구, 예를 들면, 각막이식(corneal transplantation)/ 각막 형성술(keratoplasty), 인공각막이식수술(keratoprosthesis surgery), 라멜라 이식(lamellar transplantation), 선택적 내피이식(selective endothelial transplantation)를 포함하는 절차로부터 받고(receive), 수행되고(undergoing), 또는 회복되는(recovering) 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43; Dekaris et al. (1999) Curr Eye Res 19(5): 456-9; and Dana et al. (1997) Transplantation 63:1501-7를 참조하시오.
제제는 결막성 흉터(결막 scarring) 장애 및 결막염(conjunctivitis), 예를 들면, 알레르기 결막염(conjunctivitis), 예를 들면, 심한 알레르기 결막염(conjunctivitis)을 포함하는, 결막에 영향을 미치는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 제제는 유천포창 증후군(pemphigoid syndrome)및 스티븐스-존슨증후군(Stevens-Johnson syndrome)와 같은 더 다른 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서 특징된 제제는 안구에서 또는 주위의 신혈관신생(neovascularization)을 조절하는데 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43를 참조하시오.
본 발명의 제제는 안구에 영향을 미치는 알레르기 반응을 가지는 개체, 예를 들면, 예를 들면, 알레르기 결막염(conjunctivitis)와 같은 심한 알레르기 (atopic) 안구 질병을 나타내는 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 제제는 국소적으로 투여될 수 있다. 또한, 예를 들면, Keane-Myers et al. (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(12): 3041-6을 참조하시오.
본 발명의 특징된 제제는 안구에 영향을 미치는 자가면역(autoimmune) 장애를 가지는 개체에 투여될 수 있다. 자가면역(autoimmune) 안구 장애 예는 교감성 안염(sympathetic ophthalmia), 보크트-고야나기-하라다 증후군(Vogt-Koyanagi Harada (VKH) syndrome), birdshot retinochoriodopathy, 눈에 의한 반흔성유천포창(ocular cicatricial pemphigoid), 퓨큐스 이종만성 홍채 모양체염(Fuchs’ heterochronic iridocyclitis), 및 다양한 포도막염(포도막염(Uveitis))의 형태를 포함한다. 제제는 임의의 전술한 장애를 치료하기 위해 개체에 투여될 수 있다. 본 발명에 특징된 제제는 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy)를 위한 위험을 가지거나 또는 에서 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, Demircan et al. (2006) Eye 20:1366-1369 및 Doganay et al. (2006) Eye, 16:163-170를 참조하시오.
포도막염( Uveitis ). 포도막염(Uveitis)은 급성 및 만성 형태를 포함하고 하나 이상의 홍채(iris), 모양체(ciliary body), 및 맥락막(choroid)의 염증( inflammation)을 포함한다. 만성 형태는 시스템 자가면역(autoimmune) 질병, 예를 들면, 베흐세트 신드롬(Behcet’s syndrome), 강직척추염(ankylosing spondylitis), 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 라이터 증후군(Reiter’s syndrome), 및 염증성 창자 질병과 연관될 수 있다. 앞쪽에 있는 포도막염(anterior Uveitis)에서, 염증은 홍채(iris) (또한 홍채염(iritis))에서 중요하다. 앞쪽에 있는(anterior) 포도막염(Uveitis)은 시스템 자가면역(autoimmune) 질병을 가지는 개체뿐만 아니라, 또한 시스템 자가면역(autoimmune) 질병을 가지지 않는 개체에 영향을 줄수 있다. 중간 포도막염(Inter배지te Uveitis)은 작은 앞쪽에 있는(anterior) 또는 맥락망막의 염증(chorioretinal inflammation)을 종종 가지는, 앞쪽에 있는(anterior) 유리체(vitreous), 주변 망막(peripheral retina), 및 모양체(ciliary body)의 염증을 포함한다. 팬 포도막염(Pan planitis)은 홍채(iris) 및 맥락막(choroid) 사이에 평면 부분(pars plana)의 염증으로부터 결과된다. 뒤쪽에 있는(Posterior) 포도막염(Uveitis)은 포도막(uveal tract) 및 주요하게 맥락막(choroid)을 포함하고, 맥락막염(choroiditis)으로서 언급된다. 뒤쪽에 있는(Posterior) 포도막염(Uveitis)은 시스템 감염 또는 자가면역(autoimmune) 질병과 연관될 수 있다. 이것은 개월 및 심지어 년 동안 지속할 수 있다. 본 발명에서 특징된 제제는 포도막염(Uveitis)의 임의의 전술한 형태 를 치료하기 위하여 개체에 투여될 수 있다. 또한 예를 들면, Tsai et al. (2009) Mol Vis 15:1542-1552 및 Trittibach et al. (2008) Gene Ther. 15(22): 1478-88를 참조하시오.
일부 실시형태에서, 본 발명에 특징된 제제는 연령-관련 시력감퇴(macular degeneration) (AMD)를 위한 위험을 가지거나 또는 에서 개체를 치료하기 위하여 사용된다. 제제는 안구에 국소적으로 적용되고, 주사되고(예를 들면, 유리 체강내(intravitreally)) 또는 시스템적으로 제공될 수 있다. 예를 들면, Olson et al. (2009) Ocul Immunol Inflamm 17(3):195-200을 참조하시오.
본 명세서에 설명된 제제는 안구 질병을 치료하기 위한 임의의 모드에 의해 투여될 수 있다. 제제는 비경구적 모드로 운반될 수 있다. 변경적으로 또는 추가로, 제제는 안구에 직접적으로 운반될 수 있고 또는 안구에 근접으로 운반될 수 있다. 예를 들면, 제제는 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 국소적으로 또는 안구내(intraocularly)로 투여될 수 있다.
안구 운반을 위한 제제 및 방법
본 발명에 특징된 안구 제제는 국소 투여, 예를 들면, 액적(liquid drop), ointment(연고), 또는 젤(gel), 또는 이식을 위하여, 예를 들면, 안구 또는 결막주머니(결막 sac)의 앞쪽에 있는(anterior) 챔버로 운반될 수 있다. 안구 운반을 위해 제조될 때, 활성 제제 (예를 들면, 키메릭 사이토카인 단백질 또는 수용체 결합제)는 0.0001% 내지 0.1%, 0.001% 내지 5%, 예를 들면, 0.005% 내지 0.5%, 0.05% 내지 0.5%, 0.01% 내지 5%, 0.1% 내지 2% 또는 1% 내지 5% 농도에서 존재될 수 있다. 일부 실시형태에서, 농도는 예를 들면, P05의 2%이다. 다른 실시형태에서, 농도는 예를 들면, P05의 0.5%이다.
일부 실시형태에서, 수용체 결합제는 예를 들면, P05는 예를 들면, 상기에서 설명된 바와 같이, mg/ml 기초에서 제조된다. 예를 들면, 활성제, 예를 들면, 수용체 결합제는 IL-1 억제제이고 1-50 mg/ml, 1-25 mg/ml, 1-20 mg/ml, 1-10 mg/ml, 2-8 mg/ml, 3-7 mg/ml, 또는 4-6 mg/ml의 농도에서 존재된다. 실시형태에서, 활성제는 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 8 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 또는 50 mg/ml의 농도에서 존재된다. 실시형태에서, 활성제, 예를 들면, the IL-1 억제제는 최대 100 mg/ml까지 농도에서 존재된다.
통상적으로, 안약(ophthalmic agent)은 각막(cornea), 눈꺼풀 또는 안구볼 및 눈꺼풀 사이에 공간(cul-de-sac)으로 설비(instillation)응 포함하는 안구에 직접적으로 적용된다. 안약(ophthalmic agent)은 눈물의(lacrimal) 유동첼로 쉽게 혼합하거나 또는 각막(cornea) 및 결막의 표면에 걸쳐 퍼지도록 디자인될 수 있다. 투여의 보통 기술로, 약물의 주요 일부(일부)는 통상적으로 낮은 천장(fornix)에 착수된다(deposited). 투여의 모세관 현상(Capillarity), 발산력(diffusional forces) 및 깜빡임 반사(blinking reflex)은 각막(cornea)으로 및 통하여 관통하는 것으로부터 각막 앞 막 (precorneal film)에 약물의 혼합을 운전한다. 본 발명에 특징된 안약(ophthalmic agent)은 하나 이상의 다른 제제, 예를 들면, 리멕졸론(rimexolone), 로테프레드놀(loteprednol), 메드리존(medrysone) 및 하이드로코르티존(hydrocortisone)와 같은 항-염증성 스테로이드, 또는 비스테로이드(non-steroidal) 항-염증성을 포함할 수 있다. 예를 들면, 스테로이드는 0.001% 내지 1%의 농도에서 존재될 수 있다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 존재하지 않는다. 예를 들면, 수용체 결합제는 제제에서 단지 활성제이다.
제제는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 하기의 구성요소의 하나 이상을 포함할 수 있다: 계면활성제, 탄력성 제제(tonicity agent)s, 완충액, 방부제, 공동-용매 및 점도구성제(viscosity building agents)를 포함할 수 있다. 탄력성 제제(tonicity agents)는 조성물, 예를 들면, 천연 눈물의 탄력성(tonicity)을 맞추는데 사용될 수 있다. 탄력성 제제는 특히 슈가는 열 안정제로서 또한 기능할 수 있다. 실시형태에서, 포타슘 클로라이드, 소듐 클로라이드(sodium chloride), 마그네슘 클로라이드(Magnesium chloride), 칼슘 클로아드(calcium chloride), 덱스트로오스(dextrose) 및/또는 만니톨(mannitol)은 적절한 탄력성, 예를 들면, 물리적 탄력성을 얻는데 첨가될 수 있다. 탄력성 제제는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 적절한 삼투압을 제공하는데 충분한 양으로 첨가될 수 있다. 실시형태에서, 탄력성 제제(tonicity agent)는 kg 당 약 150 mOsm 내지 kg 당 450 mOsm 또는 kg 당 250 mOsm 내지 kg 당 350 mOsm의 삼투압을 제공한다. 실시형태에서, 탄력성 제제는 안구에서 등장성(isotonic)인 삼투압을 제공하기 위하여 첨가된다. 실시형태에서, 탄력성 제제는 예를 들면, 소르비톨은 kg 당 270-330 mOsm의 삼투압을 제공하기 위하여 첨가된다.
제제는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 안구 운반을 위하여 적합한 완충액 을 포함한다. 완충액은 pH를 변화하기 위하여 시트레이트(citrate), 포스페이트, 보레이트(borate), 붕산(boric acid), 숙시네이트(succinate), 아세테이트(acetate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 (예를 들면, 소듐 포스페이트, 소듐 아세테이트, 소듐 시트레이트(sodium citrate), 소듐 보레이트, 소듐 숙시네이트(sodium succinate), 또는 소듐 아세테이트)와 같은 하나 이상의 완충액 구성요소를 포함할 수 있다. 완충액 구성요소는 예를 들면, 제제가 연장된 저장을 줄 때, 저장 조건 하에서 특히 사용될 수 있다. 예를 들면, 완충액은 pH 5.5-6.5, pH 5.5-6.0, pH 6.0 to 7.5, 또는 pH 6.5 to 7.5의 범위 내에서 표적 pH를 제공하도록 선택될 수 있다. 통상적으로, 완충제는 약한 완충제이고, 여기서 완충액 구성요소의 농도는 하기 20 mM이다. 실시형태에서, 완충액 구성요소의 농도는 약 5 내지 20 mM, 예를 들면, 5 내지 15 mM, 예를 들면, 5 내지 10 mM사이에 있다.
치료 단백질을 포함하는 제제는 수용성 또는 인지질(phospholipid) 담체를 포함할 수 있다. 특히, 건조 안구 장애의 치료를 위하여, 제제는 단기간 구제(short-term relief)를 제공하는 제제, 예를 들면, 안구를 윤활하고 눈물 형성을 보조하는 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 인지질 담체(하나 이상의 인지질을 포함하는)는 Tears Naturale® (Alcon Labs, Inc., TX USA)와 같은 상업용 생성물을 포함한다. 예를 들면, 인지질 담체는 단기간 구제(short-term relief)를 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 인공 눈물 담체로서 유용한 실시예 또는 인공 눈물 조성물은 Tears Naturale® (Alcon Labs, Inc., TX USA)와 같은 상업용 생성물을 포함한다. 예를 들면, ml 당, 제제는 하기를 포함할 수 있다: 1 mg 덱스트란(dextran), 70 및 3 mg 하이드록시프로필 메틸세룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose), 및 POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% (m/v)와 같은 선택적 방부제. 인지질 담체 제제의 실시예는 미국 4,804,539, 미국 4,883,658, 미국 5,075,104, 미국 5,278,151, 및 미국 5,578,586에 개시된 것을 포함한다.
또한 제제는 윤활제 또는 습윤제로서 행동하는 다른 화합물을 포함할 수 있다. 상기는 하기와 같은 점도제를 포함한다: 글리세롤(glycerol), 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)와 같은 단량체 폴리올(polyols); 폴리에틸렌 글리콜와 같은 중합 폴리올(polyols), 셀룰로오스 페밀리의 다양한 폴리머:
하이드록시프로필메틸 셀룰로오스(hydroxypropylmethyl cellulose (“HPMC”)), 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 하이드록시프로필세룰로오스(hydroxy propylcellulose (“HPC”)), 덱스트란 70과 같은 덱스트란(dextrans); 젤라틴과 같은 물 수용성 단백질; 및 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol)와 같은 비닐 폴리머, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 포비돈(povidone) 및 카보머(carbomer) 934P, 카보머(carbomer) 941와 같은 카보머(carbomers). 더욱 추가된 실시예는 히알루론산(hyaluronic acid) 및 이의 염 및 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate) 및 이의 염과 같은 폴리사카라이드(polysaccharides), 및 아크릴산 폴리머를 포함한다. 특정실시형태에서, 제제는 1 cP 내지 400 cP사이에 점성(viscosity)를 가진다.
제제, 예를 들면, 비히클 제제는 단일 또는 다수 용량-용도(multi-dose use)를 위하여, 예를 들면, 점적기(dropper)와 관련된 병 또는 단일-사용 점적기의 세트로서 포장될 수 있다.
제제는 사용 중에 미생물(microbial) 및 균오염(fungal contamination)을 방지하기 위하여, 하나 이상의 방부제, 및/또는 예를 들면, 단백질을 용해하기 위하여 하나 이상의 세정제(detergents), 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 실시예 방부제는 하기를 포함하고: 벤잘코니윰 클로라이드(benzalkonium chloride), 클로로부탄올(chlorobutanol), 벤조 도데시니움 브로마이드(benzo dodecinium bromide), 메틸 파라벤(methyl paraben), 프로필 파라벤(propyl paraben), 페닐에틸 알코올(phenylethyl alcohol), 에데테이트 디소듐(edetate disodium), 소르브산(sorbic acid), 및 폴리콰테리니윰-1(polyquaternium-1), 및 0.001 w/v부터 1.0% w/v까지의 농도에서 포함될 수 있다. 통상적으로, 본 명세서에서 설명된 바와 같이 치료 단백질을 포함하는 제제는 방부제 없는 살균이다.
세정제(detergents)/계면활성제의 실시예는 tyloxapol, octoxynol 40 및 풀리옥실 40 스테아레이트(polyoxyl 40 stearate)뿐만 아니라 F-68와 같은 Pluronics®; 트리톤 X-100와 같은 트리톤® 계면활성제, 트윈-20 및 트윈-80와 같은 폴리소르베이트(polysorbates), ElugentTM, 및 Cremophor® polyethoxylated 피마자유(castor oil)을 포함한다.
일반적으로, 세정제(detergents) 및/또는 계면활성제는 0.001% w/v부터 1.0% w/v까지의 농도에서 포함될 수 있다. 일부 측면에서, 제제는 세정제(detergents)가 없다.
안구 팩은 안구와 같이 안약(ophthalmic agent)의 연장된 접촉을 주는데 사용될 수 있다. 면가제(cotton pledget)는 제제로 포화되고 우수한(superior) 또는 낮은(inferior) 천장(fornix)으로 주입된다. 제제는 이온토포레시스(iontophoresis)의 방법으로 투여될 수 있다. 상기 절차는 전극(electrode)을 가지는 세안컵(eyecup)에 있는 각막(cornea)으로 접촉하여 용액을 보존한다. 약물의 확산(Diffusion)은 전기 전위차의 차이에 의해 영향이 미친다. 사용된 이온토포레틱 시스템은 Ocuphor®1 (Iomed Inc., USA); 안구gate® II 운반 시스템1 (EyeGate Pharma, USA); 및 Visulex®1 (Aciont Inc., USA)을 포함한다. Amo 및 Urtti, Drug Discovery Today, 13:143 (2008)을 참조하시오.
지연된 안구 운반의 다른 전략은 젤화제(gelifying agents)의 사용이다. 상기 물질은 안약 또는 안구내(intraocular)주사로서, 액체 형태로 운반될 수 있다. 설치 후에 폴리머는 연장된 기간에 걸쳐 약물을 배출하는 층(phase) 변화 및 반-고체 또는 고체 매트릭스로 진행한다. 단계 전이(phase transition)는 온도, 이온 농도, 또는 pH에서 변화에 의해 유도될 수 있다.
국소 안구 사용을 위하여, Gelrite® (정제되 음이온 이종폴리사카라이드(anionic heteropolysaccharide)로부터 젤란 검(gellan gum))을 포함하는 Timoptic®-XE1 (Merck 및 Co. Inc., USA)와 같은 젤 형성 용액; 폴리(아크릴산)을포함하는 Pilogel®1 (Alcon, Inc., Switzerland) 안약; 및 zasite®1 (Insite Vision, USA)은 임상적으로 테스트되었다. 상기 물질은 통상의 안약(eye drops)에 비례하여 약물 보유(retention)를 증강시키고 안구로 증가된 약물 흡수를 유도하고 용량 빈번도를 감소시킨다. Amo 및 Urtti, Drug Discovery Today, 13:135-143 (2008)을 참조하시오.
본 발명에서 특징된 제제는 주사, 예를 들면, 유리체 내(intravitreal), 눈 주위(periocular), 또는 결막 밑(sub결막) 주사에 의해 운반될 수 있다. 제제는 간단한 확산에 의해 공막(sclera)을 통하고 안구로 지나가는 것을 용이하게하는 결막 하부에 주사될 수 있다. 또한 제제는 결막 하부 및 모양체(ciliary body), 맥락막(choroid), 및 망막(retina)에 제제를 운반하기 위하여 안구 뒤쪽에 있는(Posterior) 일부에 Tenon's 캡슐 하부에 주사될 수 있다. 제제는 안구뒤쪽(retrobulbar) 주사로 투여될 수 있다.
실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 제제는 유리 체강내(intravitreally)로 투여된다. 실시형태에서, 제제는 CMC를 포함하지 않는다.
평가(Evaluation)
건조 안구 및 다른 표면 장애에 관하여, 개체는 당업계에 알려진 하나 이상의 접근, 예를 들면, 안구 표면 질병 지수 (OSDI), 각막 및 결막 염색, 및 스키르머 테스트(Schirmer test)를 사용하여 평가될 수 있다. OSDI가 사용될 때, 기저선으로부터 음성 변화는 시각-관련 기능 및 안구 염증성 장애에서 개선을 나타낸다.
각막 플루오레신(corneal 플루오레세인(fluorescein))염색을 위하여, 염분-수분이 있는 플루오레세인(fluorescein) 스트립 또는 1% 소듐 플루오레세인(fluorescein) 용액은 눈물 필름을 염색하기 위하여 사용된다. 통상적으로, 전체 각막은 노란색 장벽 필터(yellow barrier 필터) (#12 Wratten) 및 코발트 블루 조명(illumination)으로 슬릿-램프 평가(slit-lamp evaluation)를 사용하여 조사되었다. 염색은 NEI 스케일, 옥스포드 개요(Oxford Schema), 또는 변형된 옥스포드 개요에 따라, 등급될 수 있다. 통상적으로, 염색은 각막이 5 섹션(중심 원 섹션, 및 하위(inferior), 우수한(superior), 코의(nasal) 및 일시적 4분원(temporal quadrants)로 언급되는 중심 각막 섹션 주위의 4 4분원(quadrants)d으로 나뉘어지는 각막인 경우에 15 포인트 스케일인, NEI 스케일에 따라 등급되고 상기 각각은 최대 가능 점수 15를 수확하기 위한 반점 염색에 대해 0 - 3으로부터 점수된다.
결막 염색은 상피 질병의 측정 또는 안구 표면의 상피 장벽의 침입과 마찬가지이다. 결막 염색은 리싸민(lissamine) 녹색을 사용하여 슬릿-렘프(slit-lamp) 하에서 수행되었다.
염분-물에 젖은 스트립(Saline-moistened strip) 또는 1% 리싸민(lissamine) 녹색 용액은 눈물 필름(tear film)을 염색하기 위해 사용되었고, 눈꺼풀 사이(interpalpebral) 결막염색은 30 초 이상 2 분 미만 평가되었다. 보통 강도의 흰 불빛을 사용하여, 단지 코 부위 눈꺼풀 사이(interpalpebral) 및 일시적 결막염색이 예를 들면, 옥스포드 개요(Oxford Schema)를 사용하여 등급되었다.
스키르머 테스트(Schirmer test)는 하위(inferior) 컬드삭(cul-de-sac)에서 좁은 필터-종이 스트립(narrow 필터-paper strip) (Whatman #41 필터 종이의 5 x 3 5mm 스트립)을 놓아서 마취의 존재 또는 부재에서 수행되었다. 상기 테스트는 희미한 불이 있는 방에서 수행되었다. 환자는 5분이 경과되고 스트립이 제거될 때까지 그의/그녀의 안구를 부드럽게 닫는다. 눈물 앞쪽(tear front)은 안구로부터 제거된 후에 몇 밀리미터 앞서 지속될 것이기 때문에, 눈물 앞쪽은 정확하게 5분에서 볼-포인트 펜(ball-point pen)으로 마크되었다. 수용성 눈물 생성물은 스트립이 5 분 동안에 젖는 밀리미터 길이로 측정된다. 마취없이 스키르머 테스트를 위하여 10 mm 또는 미만 또는 마취가 있는 스키르머 테스트를 위한 5 mm 또는 미만의 결과는 비정상으로 간주된다. 기저선으로부터 양성 변화는 본 명세서에서 설명된 안구 염증성 장애의 하나 이상의 증상의 개선을 나타낸다.
건조 안구 질병 모드. 본 발명의 특징된 제제의 효능은 건조 안구 질병(dry eye disease)을 위한 마우스 모델에서 평가될 수 있다. 건조 안구는 스코폴라민(scopolamine)의 피하 주사한 후 조절된-환경 챔버에 마우스를 놓아서 유도될 수 있다. 특정 실시예의 경우에, 정상적 건강한 6 내지 10 주령 암컷 C57BL/6 마우스는 조절된 환경 챔버에서 건조 환경에 지속적 노출로 건조 안구를 가지도록 유도될 수 있다. 챔버는 30% 미만(less than)(일반적으로 약 19%), 높은 공기흐름 (15 리터/분) 및 불변 온도 (약 22℃)의 낮은 상대 습도를 가진다. 챔버에 위치된 마우스는 눈물 분비를 억제하기 위하여 스코폴라민(scopolamine)으로 치료된다. 지연된-배출 경피 스코폴라민(scopolamine)패치는 노바티스(Novartis) (Summit, N.J.)로부터 얻을 수 있다. 패치(patch)의 1/4는 매 48 시간마다 마우스의 털 뽑힌 중간 -꼬리에 적용된다. 조절된 환경 챔버 및스코폴라민(scopolamine)의 조합은 시간 (약 2-4 일)의 상대적 짧은 기간에 심한 건조 안구를 생성한다. 조절된 환경 챔버는 Barbino et al. (Invest Ophthal Vis Sci, 46: 2766-2711 (2005))에서 설명된 것처럼 제조될 수 있고 공기 흐름(air flow), 습도, 및 온도의 조절을 가능하게 한다. 마우스는 예를 들면, 하기의 수행에 의해 건조 안구의 징후에 대하여 모니터되될 수 있다: a) 건조 안구를 가지는 환자에서 일반적으로 감소되는, 수용성 눈물 생성물을 측정하기 위하여 면 쓰레드 테스트(Thread Test); b) 각막 표면 손상의 마커인 각막 플루오레신 염색; 및 일반 안과 검사.
면 쓰레드 테스트(cotton Thread Test): 눈물 생성물은 페놀 레드(phenol red) (Zone-Quick, Lacrimedics, Eastsound, Wash.)로 함침된, 면 쓰레드 테스트(Thread Test)로 측정될 수 있다. 형광램프 확대하에서 쓰레드는 보석 겸자(jeweler forceps)로 잡게되고 30 또는 60 초동안 오른쪽 안구의 결막천장(fornix)의 측면 캔터스(lateral cantus)에 놓았다. mm에 있는 눈물 거리는 헤마사이토미터(hemacytometer)의 스케일을 사용하여 현미경 하에서 읽었다.
각막 플루오레신 염색(corneal fluorescein staining): 각막 플루오레신 염색은 안구의 하위(inferior) 결막주머니(conjunctival sac)로 마이크로파이펫(micropipette)하여 5% 플루오레세인(fluorescein)의 1.0 ㎖를 적용하여 평가될 수 있다. 각막(cornea)은 플루오레세인(fluorescein) 침투 후 3 분에 코발트 블루 빛(cobalt blue light)을 사용하여 슬릿 램프 생물현미경(slit lamp biomicroscope)로 조사되었다. 강조 염색은 각막 표면이 나뉜 5개 면적의 각각에 대하여 0-3의 표준된 National Eye Institute (NEI) 등급 시스템을 사용하여 엄폐된 방식으로 기록된다.
동등(EQUIVALENTS)
모든 기술적 특징은 상기 특징의 모든 가능한 조합으로 각각 혼합된다.
본 발명은 정신 또는 이의 필수 특성으로부터 출발없이 다른 특정 형태로 구체화될 수 있다. 따라서 전술한 실시형태는 본 명세서 설명된 본 발명에서 제한보다 모든 관련된 설명에서 고려된다.
본 명세서에 인용된 모든 참조의 전체 내용은 자체의 전문으로 본 명세서에 통합된다.
The 하기의 비-제한 실시예는 추가적으로 본 명세서에 설명된 본 발명의 실시형태를 설명한다.
실시예
실시예 1: 치료 단백질의 실시예 , 예를 들면, 키메릭 단백질
표 1 (하기)에 열거된 미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 핵산은 T7 프로모터 및 앰피실린 (pET31 series) 또는 카나마이신 저항 유전자 (pET28 series) (EMD 화학 , Gibbstown, NJ, USA)를 포함하는 pET 벡터에서 구성될 수 있고, 발현된다. 발현을 위해 사용될 수 있는 코딩 서열의 실시에는 표 2에 제공된다.
실시예 키메릭 단백질 서열번호
P01
 APVRSLAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVSFVQGEESNDKIPVALGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVDPKNYPKKKMDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS 1
P02
 APVRSLAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVSFVQGEESNDKIPVALGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS 2
P03
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P04
 apvrslafriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfnkieinnklefesaacpgwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkftmqfvss 4
P05
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P06 APVRSLNCTLWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSMEADQPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS 6
P07
 APVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGQDITDFTMQFVSS 7
상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열 실시예는 표 2에 열거되었다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 하기에 열거된 첫번째 뉴클레오티드 이전에 ATG를 추가적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 하기에 열거된 마지막 뉴클레오티드 후에 스탑 코돈(stop codon) (TAA, TAG, 또는 TGA와 같은)을 추가적으로 포함한다.
키메릭 단백질 예를 암호화하는 핵산 서열번호
P01
 GcacctgtacgatcactggccttcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagatagatgtgTcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcatccatggagggaagatgtgcctgtcctgtgtcaagtctggtgatgagaccagactccagctggaggcagttGatcccaaaaattacccaaagaagaagatggacaagcgcttcgccttcatccgctcagacagcggccccaccaccagttttgagtctgccgcctgccccggttggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattctacAtgcaatttgtgtcttcc 8
P02
 gcacctgtacgatcactggccttcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagatagatgtgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcatccatggagggaagatgtgcctgtcctgtgtcaagtctggtgatgagaccagactccagctggaggcagttgatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcaacaagatagaaatcaataacaagctgagttttgagtctgccgcctgccccggttggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattctacatgcaatttgtgtcttcc 9
P03
 gcacctgtacgatcactggccttcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagttctccatgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaggaaaagaatctgtacctgtcctgcgtgttgaaagatgataagcccactctacagctggagagtgtagatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcatccgctcagacagcggccccaccaccagttttgagtctgccgcctgccccggttggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattcaccatgcaatttgtgtcttcc 10
P04
 gcacctgtacgatcactggccttcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagTtctccatgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaggaaaagaatctgtacctgtcctgcgtgttgaaagatgataagcccactctacagctggagagtgtagatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcaacaagatagaaatcaataacaagctggaatttgagtctgccgcctgccccggttggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattcaccatgcaatttgtgtcttcc 11
P05
 gcacctgtacgatcactgaactgcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagttctccatgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaggaaaagaatctgtacctgtcctgcgtgttgaaagatgataagcccactctacagctggagagtgtagatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcaacaagatagaaatcaataacaagctggaatttgagtctgcccagttccccaactggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattctacatgcaatttgtgtcttcc 12
P06 gcacctgtacgatcactgaactgcacgctctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcgagcaacaagtggtgttctccatgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaggaaaagaatctgtacctgtcctgcgtgttgaaagatgataagcccactctacagctggagagtgtagatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcaacaagatagaaatcaataacaagctggaatttgagtctgcccagttccccaactggtacatcagcacctctatggaagctgaccagcccgtcttcctgggagggaccaaaggcggccaggatataactgacttcaccatgcaatttgtgtcttcc 13
P07
 GcacctgtacgatcactgaactgcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagTtctccatgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaggaaaagaatctgtacctgtcctgcgtgttgaaagatgataagcccactctacagctggagagtgtagatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcaacaagatagaaatcaataacaagctggaatttgagtctgcccagttccccaactggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcCaggatataactgacttcaccatgcaatttgtgtcttcc 14
단백질은 하기에 설명된 바와 같이 IL-1β 및 IL-1Ra로부터 상이한 잔기의 범위를 포함할 수 있다. P01, P02, P03, P04, 및 P05 예 중에서, 사이토카인 도메인은 IL-1β로부터 48-70% 잔기 및 IL-1Ra로부터 55-78%를 가질 수 있다. 아미노산 잔기의 수는 2개 단백질 사이에 보존되기 때문에 IL-1β 및 to IL-1Ra에 대한 퍼센트 일치의 합계는 100%이상(greater than)이 될 수 있다.
IL-1b
잔기		 IL-1RA 잔기 총 잔기 % IL-1b % IL-1RA
P06 130 62 152 85.5 40.8
P07 113 80 153 73.9 52.3
P05 108 85 153 70.6 55.6
P04 104 89 153 68.0 58.2
P03 94 99 153 61.4 64.7
P02 85 108 153 55.6 70.6
P01 74 119 153 48.4 77.8
치료 단백질의 다른 실시예는 IL-1Ra (예를 들면, 아나키느라(anakinra)), 카나키누맵(canakinumab), 게보키주맵(gevokizumab), 릴라나셉트(rilanacept), 또는 항-IL-1R 항체 (예를 들면, Amgen에 의해 생산된)를 포함한다.
실시예 2: 키메릭 단백질의 발현 및 정제
헥사-히스티딘(histidine) 태그 (서열번호 23)을 포함하는 단백질은 LB 액체배지에서 3 시간 동안 37℃에서 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)로 유도하여 E. coli 세포 BL21(DES) 종(strain)에서 발현되었다. 세포는 20-50 mM 트리스, 0.5 M NaCl, 2.5 mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100, pH 8.0에서 용해되었다. 용해물을 0.1% 폴리소르베이트(polysorbate) 80를 포함하는 1.25x PBS에 대하여 투석한 후, HisTrap HP® pre-packed 컬럼 (GE 치유thcare, Piscataway NJ, USA)를 사용하여 고정된 이온 친화도 크로마토그래피 (IMAC)에 주기 전에 0.8/0.2 ㎛ 필터를 통하여 살균 여과하였다. 컬럼은 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, pH 7.1에서 균형되고, 부하되고(부하하), 동일한 완충액으로 세척되었다. 25 mM 이미다졸로 미리-용리되었다. 용리된 단백질은 1.25x PBS, 0.1% 폴리소르베이트(polysorbate) 80, pH 7.4에 대하여 광범위하게 투석되었다. 단백질은 20 mM 소듐 포스페이트, 0.5 M NaCl 10 mM 이미다졸(imidazole), pH 7.4 완충액에서 부하되었다. 이것은 200 mM 이미다졸(imidazole), 20 mM 소듐 포스페이트, 0.5 M NaCl pH 7.4 완충액으로 용리되었다. 용리된 단백질은 Amicon Ultra® (10K) 필터를 사용하여 농축된, PBS, 0.1% 폴리소르베이트(polysorbate) 80, pH 7.4에 대하여 광범위하게 투석되고, 4℃ 또는 -80℃에서 저장되었다. 헥사-히스티딘(histidine) 태그 (서열번호 23)이 부족한 단백질은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다. P05 단백질은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 발현하는 세포로부터 용해물을 염의 부재 (전도율 대략 1 mS/cm)에서 낮은 pH (대략 pH 5.5)에서 GigaCapS™ 컬럼 (Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia, PA, USA)으로 적용하였다. 컬럼을 pH 변화도(gradient) (완충액 A = 10 mM 아세트산, pH 5.5; 완충액 B = 20 mM 트리스 pH 8)에 의해 용리되었다. 용리된 단백질을 포함하는 5 ㎖ 분획은 5 ㎖의 H2O 및 5 ㎖의 20 mM 트리스 pH 8로 희석한 후 CaptoTM Q 레진 (GE Healthcare, Piscataway NJ, USA)에 적용되고 20 mM 트리스 pH 8.0에서 0 mM 내지 250 mM NaCl 변화도로 용리되었다. 용리된 단백질은 1.25 X PBS 0.1% 트윈® 80 또는 트윈®이 결여된 1.25X PBS에 대하여 광범위하게 투석되었고 저장되었다. 도 1을 참조하시오. P03 및 P04 단백질은 유사한 방법을 사용하여 정제되었다.
P05를 발현하는 세포를 10 g/L 글루코오스, 10 mM MgSO4, 미량원소 (1 mg/ml TEKNOVA™ 1000X 미량원소, #T1001)가 보충된 동물없는 서이톤(animal free soytone)(# T7660), 및 Sartorius 2L BIOSTAT™ A+에 있는 항생제로 TEKNOVA™ Terrific Broth에서 또한 성장시켰고, 약 6 시간 동안 1 mM IPTG로 OD 35-40에서 배양되었다. 세포는 pH 7.0의 산소가 30% 용해된 37℃에서 성장시키고, 2L/분에서 산소 살포(oxygen sparge)로 200-800 rpm에서 교반하였다. 글루코오스가 pH 증가에 의해 검출되는 것으로서 결핍될 때 9 g 글루코오스/L/시간을 공급되었다. 공급(Feed)은 pH가 감소될 때(유도 후에 약 2.5 시간) 6 g 글루코오스/L/시간으로 감소되었다.
세포를 수득하였고 용해(lysis) 완충액 (20 mM 트리스, 10 mM EDTA, 0.1% 트리톤, pH 8.0; 20 mM 트리스, 10 mM EDTA, 0.1% 트리톤, pH 7.0; 50 mM MOPS, 10 mM EDTA, 0.1% 트리톤, pH 6.5; 또는 50 mM MOPS, 10 mM EDTA, 0.1% 트리톤, pH 6.0)에서 용해하였다. 용해물을 pH 5.3 및 3 mS/cm (㎖ 컬럼 레진 당 35 mg 생성물)에서 Poros® XS 양이온 이온 교환 배지 (Life Technologies Corp., Carlsbad CA USA)상으로 부하하였다.
절차예에서, P05 단백질은 100 mM MOPS 25 mM NaCl pH 7.0을 포함하는 완충액을 사용하여 pH 7.0으로 단계하여 용리된다. 첫번째 용리 피크는 버리고, 두번째 용리 피크는 풀(pools)에서 수득되고 P05 단백질을 포함하였다. 초기 풀(pools)은 des-Ala 종에 비례하여 온전한 P05 단백질에 대하여 풍부하다. 상기 용리 물질은 Capto®Q 음이온 교환 레진에 걸쳐 흐르게 되었다(flowed). 온전한 P05 단백질을 포함하는, 통과액(flow through)은 수득되었다.
다른 절차예에서, 배지는 100 mM MOPS 20 mM NaCl pH 6.0로 세척되었다. P05 단백질은 100 mM MOPS 50-58 mM NaCl pH 6.0을 포함하는 완충액을 사용하여 pH 6.0으로 단계하여 용리되었다. 첫번째 용리 피크는 그 다음의 피크로부터 분리되고 온전한 P05 단백질을 포함한다. 상기 용리된 물질은 Capto®Q 음이온 교환 레진에 걸쳐 흐르게 되었다. 온전한 P05 단백질을 포함하는, 통과액(flow through)을 수득하였다.
실시예 3: 세포 -기반 분석
단백질을 포함하는 단백질 또는 상등액은 IL-1 활성을 위하여 세포 기반 분석(cell-based 분석)으로 평가되었다. HEK-Blue™ IL-1β 반응 세포를 IL-1β 활성 (InvivoGen Inc., San Diego CA, USA로부터 활용가능)를 모니터하기 위하여 사용하였다. 상기 세포는 5개 NF kB 및 5개 AP-1 결합 부위에 융합된 IFN-β 최소 프로모터의 조절하에서 분비된 배아 알칼린 포스파타아제(embryonic alkaline phosphatase (SEAP)) 리포터 유전자(reporter gene)를 포함한다. 세포 표면 상의 IL-1 수용체의 IL-1β 진입(engagement)은 NF-kB 활성 및 SEAP 생성물을 이끈다. SEAP 리포트는 QU항-Blue™ (InvivoGen Inc., San Diego CA, USA) 및 분광광도법적(spectrophotometric) 분석을 사용하여, 검출될 수 있다. HEK-Blue IL-1β 세포 현탁액은 70-80% 융합(confluence)에 배양된 세포로부터 제조된다. 재현탁된 세포는 신선한 성장 배지 (DMEM, 4.5 g/l 글루코오스, 2 mM L-글루타민, 10% (v/v) 열-비활성된 소태아 혈청(30 분에서 56℃), 50 U/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 100 mg/ml Normocin®T)에서 ~330,000 세포/ml로 맞추었다. 시약을 바닥-편평 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰에 첨가하였다: 20 ng/ml에서 IL-1β의 10 ㎕, 관심있는 제제의 10 ㎕, 및 최종 부피 50 ㎕로 세포 배양 배지의 30 ㎕. 양성 및 음성 대조군 시료는 평행하게 제조되었다. 이후 HEK-Blue IL-1β 세포 현탁액 (~50,000 세포)의 150 ㎕는 각각의 웰에 첨가되었고 플레이트는 5% CO2 조직 배양 배양기에서 37℃에서 밤사이 배양되었다. 일반적으로, 최종 IL-1β 농도 (200 ㎕ 최종 부피에서)는 0.1 ng/ml이었다. IL-1β 활성은 그 다음 날(12-15 시간 후) 평가되었다. 정량화 전에, QU항-Blue™ 시약은 제작사의 지침에 따라 제조되었다. 편평 바닥 96-웰 분석플레이트는 150 ㎕의 QU항-Blue™ 용액이 각각의 웰에 첨가된 것에서 제조되었다. 96 웰 조직 배양 플레이트의 웰로부터 조건 배지의 50 ㎕를 분석 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 대략 15-20 분 동안 37℃에서 배양하였다. SEAP 수준은 620-655 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 측정되었다.
결과. 도 2A에 나타낸 바와 같이, 상기 분석에서, P06 단백질은 IL 1RI 작용제로서 행동되었고, P07 단백질은 부분 작용제로서 행동되었고, P01 단백질은 고민하는데 실페하였다. 사실상, P01 단백질은 IL-1β의 존재에서 분석될 때 길항제로서 행동하였다. 도 2B는 본 명세서에서 설명된 HEKBlue™ 세포 분석을 사용하여 IL-1β 단백질 농도의 범위에서 P01에 의한 IL-1β 활성의 길항작용(antagonism)을 나타낸다. 길항작용(antagonism)은 P01 (x-축은 P01을 포함하는 상등액의 마이크로리터를 표시한다)의 증가하는 양으로 증가된다.
단백질 P01, P02, P03, P04, 및 P05 각각은 IL-1β 활성을 반대한다. 예를 들면, 도 3A 및 도 3B를 참조하시오. P05의 IC50는 약 5 ng/ml 미만(less than)이었다. P05는 상기 분석에서 IL-1RI를 작용하는 능력에 대하여 테스트하였고 테스트된 가장 높은 농도, 1 mg/ml에서 조차 임의의 검출가능한 작용제 활성을 가지는 것이 관찰되지 않았다. 또한 P01, P02, P03, P04, 및 P05는 IL-1β에 반응하는 인간 골육종(osteosarcoma) 세포주, MG-63 세포에서 IL-6 발현이 유도된 IL-1β을 억제하였다. 건조 안구 질병의 마우스 모델에서, 헥사-히스티딘(histidine) 태그된 (서열번호 23) P05에서 생물 활성을 가지는 것이 관찰되었다. 하기 태그되지 않은 P05에 관한 실시예 9을 참조하시오.
실시예 4: 키메릭 단백질의 결합 성질
수용성 재조합 인간 IL 1RI (IL-1RI의 세포 밖 도메인에 해당)을 위한 단백질의 결합 성질은 Reichert SR7000DC Dual Channel SPR 시스템으로 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)을 사용하여 평가되었다. 결합은 0.005% 트윈 20이 있는 포스페이트 완충된 염에서 평가되었다. IL-1β는 8-9 nM 사이의 KD 및 2-3 × 10-3 s- 1사이의 해리 불변 (Kd), 및 다른 실험에서 약 2 nM의 KD, 1.3-1.5 × 106 M-1s-1의 연합 불변, 및 약 2.9-3.0 × 10-3 s-1의 해리 불변 (Kd)을 가지는 것으로 관찰되었다. P01 단백질은 IL-1β로서 유사한 연합 동역학과 결합하였으나, 결합 실험 (약 180 초)의 해리 층(phase) 동안에 해리(dissociate)되지 않았다. 따라서, P01 단백질은 유사한 조건하에서 IL 1β가 했던 것보다 더 큰 친화도로 IL-1RI에 결합된다.
IL-1Ra의 결합은 약 0.33 nM의 KD, 약 2 × 105 M-1s-1의 연합 불변 (Ka), 및 약 6.6× 10-5 s-1의 해리 불변 (Kd)를 가지는 것으로 관찰되었다. 키메릭 사이토카인 도메인 P01, P02, P03, P04, 및 P05는 약 12-1700 pM로부터 KD 범위, 약 3 × 104 M-1s-1 내지 3 × 106 M-1s-1로부터 연합 불변 (Ka) 범위, 및 약 2 × 10-5 내지 1× 10-3 s-1로부터 해리 불변 (Kd) 범위를 가지는 것으로 관찰되었다. 하기의 표 3을 참조하시오.
단백질 ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD (pM)
IL-1β 1.47 ×106 M-1s-1 2.95 ×10-3 s-1 2010
IL-1Ra 2.01 ×105 M-1s-1 6.58 ×10-5 s-1 326
P01 4.93 ×104 M-1s-1 2.32 ×10-5 s-1 470
P02 3.39 ×104 M-1s-1 2.16 × 10-5 s-1 636
P03 4.1 ×106 M-1s-1 1.2 × 10-3 s-1 290
P04 3.00 × 104 M-1s-1 5.14 × 10-4 s-1 1714
P05 3.47 ×106 M-1s-1 4.15 × 10-5 s-1 12
P06 4.8 ×106 M-1s-1 1.7 ×10-3 s-1 410
P07 1.58 ×104 M-1s-1 1.46 × 10-3 s-1 92553
실시예 5: 키메릭 단백질의 추가 실시예
추가 실시예 키메릭 IL-1 페밀리 단백질은 하기를 또한 포함한다:
Figure 112015098304453-pct00001
하기의 폴리펩타이드는 IL 1α로부터 적어도 2개 세그멘트 및 IL-1Ra로부터 적어도 2개 세그멘트를 포함하는 키메릭 도메인이다.
Figure 112015098304453-pct00002
실시예 6: 제제예
본 발명에 따른 제제예는 하기로서 설명된다:
25 g/l의 농도로 존재하는 P05 단백질을 가지는 제제; 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose)는 0.25% w/v의 농도로 존재한다; 폴록사머(poloxamer) 188은 0.1% w/v의 농도로 존재한다; 소르비톨은 5% w/v의 농도로 존재한다; 소듐 포스페이트는 10 mM의 농도로 존재한다; 아르기닌(arginine) 및/또는 글루타민산(glutamic acid)은 100 mM의 농도에서 존재한다. 제제는 pH6.5를가진다. 제제는 하나 이상의 역상(reverse phase) HPLC (RP-HPLC); 약한 양이온 교환 HPLC (WCEX-HPLC); 분광강도법 (A280); 및 시각 분석을 사용하여 측정된 바와 같이 상온에서 2 주에서 안정성 및 2-8℃에서 최대 적어도 12 개월까지 저장 안정성에 대하여 테스트되었다.
실시예 7: 제제예 및 안정성 연구
층(phase) 1 임상 연구에서 활용된 P05(또한 EBI-005로서 알려진)의 제제는 0.25% w/v 농도에서 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose); 0.1% w/v 농도에서 폴록사머(poloxamer) 188; 5% w/v 농도에서 소르비톨; 10 mM 농도에서 소듐 포스페이트, 및 5 또는 20 mg/mL 농도에서 P05를 포함하는 수용성 제제이었다. 제제는 약 6.5의 pH를 가진다. 상기 제제는 하기의 측정으로 안정성에 대하여 테스트되었다: 모습(appearance), pH, 삼투압, 분광강도법 (A280)에 의한 내용, SDS-PAGE 비-환원, 환원된 SDS-PAGE; 크기 배제 HPLC (SE HPLC); 역상(reverse phase) HPLC (RP-HPLC); WCEX-HPLC; 가능성(potency); 및 용기 온전함(CIT). 상기 테스트는 (1)배출(release) (0 개월)에서; (2) 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 및 6 개월 동안 5 ± 3 ℃에서 저장 후 ; (3) 1 개월 또는 3 개월 동안 25℃에서 및 60% 상대 습도 (상온 실험)에서 저장 후 수행되었다. 5 mg/ml 및 20 mg/ml 제제의 대표 베치로부터 상기 측정 및 결과에 대한 명세서는 하기 표 14A-E에서 나타낸다. 상기 결과는 제제가 우수한 안정성을 가진다는 것을 나타낸다; 제제는 2-8 ℃에서 6 개월 동안 저장 후 및 3 개월 동안 상온에서 저장 후 설명서를 만족하는 것을 계속했다.
[표 14A] 5 ± 3 ℃에서 EBI-005 층(phase) 1 GMP 약물 생성물 (20 mg/mL, Batch X1)
Figure 112015098304453-pct00003
Figure 112015098304453-pct00004
[표 14B] 25 ℃ / 60 % 상대 습도에서 EBI-005 층(phase) 1 GMP 약물 생성물 (20 mg/mL, Batch X1)
Figure 112015098304453-pct00005
Figure 112015098304453-pct00006
[표 14C] 5 ± 3 ℃에서 EBI-005 층(phase) 1 GMP 약물 생성물 (20 mg/mL, Batch X2)
Figure 112015098304453-pct00007
Figure 112015098304453-pct00008
[표 14D]: 5 ± 3 ℃에서 EBI-005 층(phase) 1 GMP 약물 생성물 (5 mg/mL, Batch X3)
Figure 112015098304453-pct00009
Figure 112015098304453-pct00010
[표 14E] 25 ℃ / 60 % 상대 습도에서 EBI-005 층(phase) 1 GMP 약물 생성물 (5 mg/mL, X3)
Figure 112015098304453-pct00011
Figure 112015098304453-pct00012
실시예 8: 녹는점 프로파일(Melting profiles)
단백질 P03, P04, P05, mIL-1Ra (methionyl IL-1Ra), 및 IL-1β은 0.5 mg/ml에서 포스페이트-완충된 염 (PBS), pH 7.4에서 제조된다. 단백질은 원액(stock) 농도의 1:500 희석에서 YPRO® 오렌지 염료 (Invitrogen, CA)와 혼합하였고 차 주사 형광 측정(differential scanning fluorimetry)을 하게 하였다. 예를 들면, He et al. (2010) J Pharm Sciences, 99 1707-1720를 참조하시오. 형광 측정은 온도가 분 당 1℃ 비율에서 25℃부터 95℃까지 증가되는 것처럼 Agilent Mx3005 QPCR 기계를 사용하여 모니터하였다. 녹는점 (Tm) 값은 형광 전이(fluorescence transition)의 첫번째 유도체 최대 값으로부터 유래된다. 단백질 P03, P04, 및 P05는 50℃ 이상 및 59℃ 만큼 높은 펼쳐진 시작(onset of unfolding), 및 59, 60, 62, 및 64℃ 이상(greater than)의 Tm을 가지는 것으로 관찰되었다. 결과를 하기 표 4 및 도 5A 및 도 5B에서 나타낸다:
[표 4]
Figure 112015098304453-pct00013
P04는 mIL-1Ra 및 IL-1β 보다 약 4 배 더 높은 Tm을 가지고 mIL-1Ra 보다 약 3 정도 더 높고 및 IL-1β 보다 약 10 정도 더 높은 펼쳐진 시작(onset of unfolding)을 나타낸다. P03 및 P05는 mIL-1Ra 및 IL 1β보다 약 9 정도 높은 Tm을 가지고 있고 mIL-1Ra 보다 약 11 정도 높고 및 IL-1β 보다 약 18 정도 높은 펼쳐진 시작(onset of unfolding)을 나타낸다. 상기 데이타는 예를 들면, in 본 명세서에 설명된 제제에서, IL-1 억제제 녹는점을 결정하는 방법을 나타낸다.
실시예 9: 동물 모델에서 건조 안구 치료
정제된 P05 (헥사-히스티딘(hexa-histidine) 태그 (서열번호23)이 결여된)는 1.25 × PBS로 제조되었고 건조 안구 질병 마우스 모델에서 테스트되었다. 상기 모델에서, 잭슨 실험실(Jackson Laboratories)(상대적 습도 ≥30%, 하이드로겔 먹이 공급(hydrogel food supplement), 및 Enviro-dri™ 환경 풍부가 된 동물 유지 방에서 1 to 2 주 동안 익숙해진)로부터 6 내지 10 주령 암컷 C57BL/6 마우스를 0 일에 플루오레신 염색(fluorescein staining)을 위하여 미리 스크린 하였다. 플루오레신 염색을 위하여, 10 mg/mL의 WFI H2O에서 희석된 신선하게 만들어진 플루오레신은 각각의 안구로 0.4 ㎕로 투여되었다. 투여 후, 대략 8-13 분에, 안구는
올림푸스 형광 해부 현미경(Olympus fluorescent dissecting microscope)을 사용하여 점수되었다. 강조 염색(Punctuate staining)은 각막 표면이 나뉜(0-15/안구 점수 범위) 것으로 각각의 5 면적에 대하여 0-3의 표준화된 National Eye Institute (NEI) grading 시스템을 사용하여 기록되었다. 티칭 브리지(teaching bridge)를 사용하여, 2명의 마스크한 기록자가 각각의 안구에 대하여 단일 수거 점수를 주기 위하여 동일한 시간에서 마우스를 평가하였다. 각각의 안구(15 최대 점수 밖)에 대한 점수 ≤ 7을 가지는 마우스를 1일에 건조 안구 챔버 (20%± 2% 습도 및 불변 공기 흐름 ~21 L/분/케이지)에 놓고 실험 과정(검사를 제외한)동안에 상기 챔버에서 유지하였다.
3일에, 마우스를 다시 점수하고 8 내지 10 마우스/군을 가지는 치료 군으로 무작위(randomized)하였다. 마우스를 4 내지 5 마우스의 각각의 케이지가 대략적으로 동일한 평균질병 점수를 가지는 것과 같이 무작위하였다. 3일에 시작하고 무작위 후에, 마우스를 3 ㎕/eye BID의 안약에서 P05 또는 비히클 (1.25X PBS)을 국소적으로 투여하였다. 마우스를 상기 설명된 바와 같이 조사하고 각막 플루오레신염색을 위하여 7, 9, 및 11일에 점수화하였다. 점수는 실험 과정 동안에 치료 군으로서 블라인드(blinded) 되었다.
도 6A는 하기의 bid 치료하에서 2개 동일한 실험으로부터 마우스에 대하여 0, 3, 7, 9, 및 11일에서 평균 각막 염색 점수 ± SEM의 바 그래프이다: 치료 안함, 비히클 (1.25X PBS), 및 10 mg/ml (1%) P05. 10 mg/ml P05는 실험의 7, 9, 및 11일에 각막(corneal) 염색을 현저하게 감소시켰다. 각막 염색에서 감소에 의해 평가된 것 같은 효능은 또한 0.1 mg/ml P05 만큼 낮은 용량으로 관찰되었다. E. coli에서 생산된 재조합 IL-1Ra는 동물 모델에서 각막염색을 적당히 감소시켰다.
도 6B에 나타낸 바와 같이, 10 mg/ml P05의 효과는 동일한 비히클에서 10 mg/ml 마우스 혈청 알부민(murine serum albumin)과 비교하여 특정적으로 기반되었다. 비히클에 비례하여 10 mg/ml 마우스 혈청 알부민 (MSA) 효과는 보이지 않았고, 10 mg/ml P05의 효과는 10 mg/ml 마우스 혈청 알부민에 비례하여 통계적으로 현저하였다. 도 6C에 나타낸 바와 같이, 10 mg/ml P05는 안구 에멀젼 (Restasis®)으로 0.05% 사이클로스포린(cyclosporine)과 비교되었다. P05는 각막 염색을 감소시키는 반면, b.i.d. 용량의 약 1 주 후에 0.05% 사이클로스포린(cyclosporine) 안구 에멀젼에 대하여 효과가 관찰되지 않았다. 상기 실험은 본 명세서에 설명된 제제에서 IL-1 억제제의 테스트 효능의 방법을 나타낸다.
실시예 10: 교반 연구
사용을 위해 적합한 계면활성제를 확인하기 위하여, 1 mg/ml 및 50 mg/ml에서 P05는 (i) PBS, 0.5% w/v CMC, pH 7.4 또는 (ii) 다양한 계면활성제를 포함하는, 10 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate), pH 6.0의 용액에서 제조되었다. 교반은 4시간 동안 상온에서 단백질을 불텍싱하여 수행되었다. 시료는 micro-fluid imaging (MGI), SEC, A280, 및 시각 검사로 분석되었다. 다른 계면활성제 (예를 들면, 폴리소르베이트(polysorbate) 20, 폴리소르베이트(polysorbate) 80, 또는 계면활성제가 아닌 것을 포함하는)와 비교하여, 0.1% w/v 폴록사머(poloxamer) 188의 사용은 침전 (시각 검사를 사용하여 평가되는) 및 교반 동안에 현저하게 현미경을 쓰지 않으면 안 보이는 입자 축적(subvisible particle accumulation)으로부터 단백질을 보호하였다. 예를 들면, 0.1% w/v 폴록사머는 입자 ≥ 10 마이크론(microns) 및 입자 ≥25 마이크론에 대하여 입자 수를 감소시켰다. 상기 결과는 폴록사머 188이 P05와 같은 폴리펩타이드를 제제하는데 적합한 계면활성제인 것을 나타낸다. 추가적으로, 0.1% w/v 계면활성제 만큼 적은 것은 제한 및 침전 양을 감소하는데 효과적일 수 있다. 상기 실험은 본 명세서에 설명된 제제의 적합성을 결정하는 방법을 또한 나타낸다.
실시예 11: 제제의 제조
P05의 제제는 제조되었다. 간단하게, P05는 1X PBS, pH 6.5에서 52.8 mg/mL P05를 포함하는냉동 액체로서 제공되었다. 폴리펩타이드는 2-8℃에서 약 24 시간 이상 대략 10,000-배 교환으로 3500 분자량 잘라내기(cutoff) 투석 카세트를 사용하여 pH 6.0에서 10 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate) 및 5% w/v 소르비톨을 포함하는 완충액에 대하여 투석되었다. 툭석에 이어서, 농도를 A280/A320 측정하여 결정하였다. 투석후에, 제제는 하기와 같이 P05의 다양한 농도로 제조되었고, 100x 폴록사머 188 계면활성제는 투석된 P05의 원액 용액으로 1x 농도에 첨가되었다. 단백질 농도는 제제 완충액 (10 mM Na 시트레이트, 5% w/v 소르비톨, pH 6.0)을 첨가함으로써 대략 1mg/mL, 5 mg/mL 및 20 mg/mL로 맞추었다. 제제 구성요소의 최종 농도는 약 10 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate), 5% w/v 소르비톨(sorbitol), 및 0.1% w/v 폴록사머 188이었다. 시료는 이후 혼합되었고 무균성 조건하에서 살균 여과된 것은 무균성 조건하에서 2cc 유리 바이알로 채워졌다(250 ㎕). 제조 후에, 시료를 전술한 조건하에서 제조된 제제의 안정성을 확인하기 위하여 안정성 연구에 놓았다. 상기는 IL-1 억제제, 예를 들면, IL-1beta/IL-1R 키메릭 단백질 제제를 제조하는 방법을 나타낸다.
실시예 12: 포스페이트에서 P05의 안정성 대 시트레이트 (citrate) 완충액
역동적 빛 스캐터링(Dynamic light scattering) 또는 DLS (또한 quasi elastic light scattering 또는 QELS로서 알려진)은 시료상의 레이저 빛을 촛점하여 웰 플레이트에서 분석체(예, PO5)의 확산을 측정하고 빠른 광자수 측정기(fast photon counter)에 의해 측정된 바와 같이 산란된 빛(scattered light)의 변동율(rate of fluctuation) 모니터링 한다. 상관관계 함수(correlation function)로 알려진 수학 기술은 확산계수를 결정하기 위하여 변동율을 정량화하는데 사용된다. 확산계수(diffusion coefficient)는 스토크-아이슈타인 방정식(Stokes-Einstein equation)에 의해 수화 반경(radius of hydration(Rh))을 얻기 위하여 사용된다.
P05의 반경은 DLS 플레이트 리더(Wyatt DynaPro™, Wyatt Technologies, Santa Barbara, CA)에서 온도를 증가시키는 기능으로서 측정된다. 습득 시간(acquisition time)은 5 초이었고 5 개의 스캔은 각각의 측정에 대하여 수행되었다. 램프 속도(ramp rate)는 0.17 ℃/ 분이었다. 단백질은 펴졌기(unfolded)때문에, 반경(radius)는 증가된다. 반경이 증가된 온도는 Ton (펼쳐짐(unfolding)에 대한 시작 온도)으로서 언급된다.
상기 실험은 2개 제제에서 20 mg/mL의 P05에 대해서 수행되었다: (i) 10 mM 포스페이트, 5% w/v 소르비톨, 0.1% w/v 폴록사머 188, pH 6.5 및 (ii) 10 mM 소듐 시트레이트, 5% w/v 소르비톨, 0.1% w/v 폴록사머(poloxamer) 188, pH 6.0. 도 4A 및 도 4B에 묘사된, 결과는 Ton이 포스페이트 완충액에 비례하여 시트레이트 완충액에서 더 높은 온도에서 발생된다는 것을 나타낸다. Ton은 시트레이트 완충액에서 P05에 대하여 48.2 ℃, 및 포스페이트 완충액에서 P05에 대하여 35.2 ℃ 였다. Ton에서 상기 큰 차이는 P05가 포스페이트 완충액과 비교하여 시트레이트 완충액에서 더욱 안정적인 것을 나타낸다. 따라서, 일부 실시형태에서, IL-1 억제제, 예를 들면, P05를 포함하는 제제는 시트레이트(citrate) 완충액을 포함한다.
실시예 13: 안정성 연구
실시예 11에서 설명된 제제의 안정성을 테스트하기 위하여, P05의 다양한 농도를 가지는 제제는 제조되었고(상기 실시예 11에서 설명된 바와 같이), 기저선 측정을 위하여 분석되었다. 제조된 폴리펩타이드의 바이알은 0일, 3 days, 1 주, 2 주, 및 4 주 동안 25℃ 및 3 일, 1 주, 및 2 주 동안 40℃에서 배양되었다. 적어도 2개 바이알은 시간 포인트 당 제조된다. 배양에 이어서, 시료는 크기 배제 HPLC (SE-HPLC), 약한 양이온 교환 HPLC (WCX-HPLC), 역상 HPLC (RP-HPLC), 농도 (A280 - A320), 시각적 모습, 사진(photographs)으로 수행된 공식(formal) 검사를 사용하여 분석되었다. pH는 T=0 및 T= 4 주에서 분석되었다. 삼투압은 T=0에서 단지 분석되었다. 시각 검사 및 농도는 25℃ 및 40℃ 모두에서 2 주 및 4 주에서 평가되었다. 모든 제제는 2 주 후에 시각적 입자없이 투명하고 무색(colorless)이었다. 25℃ 시료는 4 주 후에 투명하고 무색(colorless)이었다. 상기 농도 연구에 대한 결과는 표 5에 설명되었다.
시료 초기 농도 (T=0) mg/ml T=0에서
삼투압		 T =25℃에서 농도 T=40℃에서 농도
2 주 4 주 2 주 4 주
C1 1.08 306 mOsm/kg 1.04 1.04 1.04 NA
C2 5.27 305 mOsm/kg 5.25 5.23 5.20 NA
C3 21.0 315 mOsm/kg 21.2 21.0 21.2 NA
25℃ 시료의 pH는 4 주에서 결정되었다. 모든 경우에서, T=0에서 pH는 6.00-6.01이었고 4 주에서 pH는 6.03-6.07이었다. 상기 데이타는 제제의 안정성은 적어도 4 주 동안 25℃에서 및 적어도 2 주 동안 40℃에서 제제에서 농도 범위를 가로지른다(across)는 것을 나타낸다.
SEC- HPLC
순도는 흡광도 및 형광 검출을 사용하여 크기 배제 HPLC 방법을 사용하여 평가되었다. 간단히, Sepax Zenix® SEC-150 7.8 mm x 20 cm (PN 213150-7820) 컬럼이 사용되었다. 이동 층(mobile phase)은 1x PBS였다. 평가는 주위 온도에서, 18 분의 총 수행시간, 1 mL/분의 유동율(변동율(flow rate))로 등용매(isocratic) 모드에서 Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 흡광도 검출은 280 nm의 여기 파장 및 350 nm의 방출(emission) 검출 파장에서 형광 검출을 가지는 280 nm에서 였다. 1 및 5 mg/ml 시료의 형광 검출을 수행하는 실험을 위하여, 폴리펩타이드 제제의 20 mg/ml 시료의 흡광도 검출을 위하여 부하하였고, 50 ㎍의 폴리펩타이드 제제를 부하하였다.
저장의 2 주 후에, 25℃ 또는 40℃에서 저장되는지 아닌지에 상관없이, 1 mg/ml 및 5 mg/ml P05 제제를 위한 참조 표준은 99.1%의 순도를 분석되었고, P05 제제의 1 mg/ml 및 5 mg/ml 시료의 순도는 각각 99.1% - 99.2%이었다. 20 mg/ml 시료를 위하여, 참조는 99.2%의 순도를 가졌다. 저장 2 주 후에, 20 mg/ml 시료는 25℃에서 또는 40℃에서 저장되던지 아니던지 간에, 99.2%의 순도를 가졌다. 25℃에서 저장 4 주 후에, 20 mg/ml P05 제제는 99.2%의 순도를 가졌다.
wCEX - HPLC
추가 연구에서, 약한 양이온 교환 HPLC 방법은 제제를 평가하는데 사용되었다. 상기 방법에서, Dionex ProPac® WCX-10, 4 x 250 mm (PN 054993) 컬럼이 사용되었다. 이동 층(phase) A은 10mM 소듐 아세테이트(Na acetate)이었고, pH 5.5 및 이동 층(phase) B은 이동 A + 0.25 M NaCl이었다. 분석은 1.2 mL/분의 변동율(flow rate) 및 주위 온도에서 35분의 총 수행시간을 가지는 Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 검출은 214 nm 및 280 nm에서 분석에 의해 수행되었다. 시료 크기는 25㎍/주사이었다. 25℃에서 2 주 동안 저장 후의 결과의 요약은 표 6에 나타내고, 표 7에는 40℃에서 2 주 동안 저장 후 결과를 나타내고, 및 표 8에는 25℃에서 4 주 동안 결과를 나타냈다.
약한 양이온 교환 분석은 전하 이질성(charge heterogeneity)을 모니터링하여 순도를 평가하는 다른 방법이다. P05 제제 시료의 분석은 전하에 기반하여 몇가지 생성물 관련 불순물로부터 주요 생성물 피크를 해결한다. P05의 통상적 제조는 대략 > 85% 주요 피크 및 몇가지 전(pre)- 및 후(post)- 피크로 구성된다. 전-피크 1은 알려지지 않고, 전-피크 2는 탈아미드화된 P05의 형태이고, 전-피크 3은 N-말단메티오닌(methionine)을 가지는 P05의 형태이다. 후(Post)-피크 1은 N-말단 알라닌이 없는 P05 형태이고, 후-피크-2는 N-말단 알라닌 및 프롤린 모두가 없는 P05 형태이고, 후-피크 3은 알려져 있지 않다.
[표 6] 25℃ 저장/2 주
Figure 112015098304453-pct00014
[표 7] 40℃ 저장/2 주
Figure 112015098304453-pct00015
[표 8] 25℃ 저장/4 주
Figure 112015098304453-pct00016
25℃에서 2 주의 저장 후에, 퍼센트 주요 피크는 5 mg/ml 제제 (C2), 약 91% 순도를 위한 참조에 대하여 유사성을 남긴 반면에, 상기 방법을 사용하여 결정된 바와 같이 C3 (20 mg/ml) 및 C1 (1 mg/ml)을 위한 순도에서 약한 감소가 있었다. 주요 피크에서 감소 및 전-피크 2, 후-피크 1, 및 후-피크 2에서 증가는 40℃에서 저장에 이어서 모든 시료에 대해 관찰되었다. 4 주 동안 저장 후에, 감소는 주요 피크 순도에서 관찰되었고 전-피크 2 및 후-피크 1에서 증가가 있었다.
역상 HPLC (RP- HPLC )
제제는 RP-HPLC을 사용하여 평가되었다. RP-HPLC 분석은 소수성(hydrophobicity)에 기반하여 생성물 이종(heterogeneity)을 모니터링하여 순도를 평가하는 다른 방법이다. 방법은 산화된 메티오닌(methionines)을 포함하는 생성물 관련 불순물로부터 천연 분자를 분리할 수 있다. 전-피크 2 및 3는 P05의 산화된 형태이고, 후-피크 1 및 2는 분자의 아세틸화된 형태이다.
상기 방법에서, Waters Symmetry® C4 (4.6 x 150 mm; 3.5 ㎛; PN 186000283)은 물에서 0.05% 트리풀루오로아세트산(trifluoroacetic acid (TFA))의 이동 층(phase) A으로 사용되고 이동 층(phase) B는 95% 아세토니트릴(acetonitrile) (ACN)에서 0.05% TFA이었다. 분석은 35 분의 총 수행시간 동안 1 mL/분의 변동율(flow rate) 및 55℃의 컬럼 온도를 가지는 Agilent 1200 HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다. 검출은 280 nm에서 수행되었다. 시료의 양은 1 mg/ml에 대하여 부하하였고 5 mg/ml 시료는 5 ㎍이었고 부하된 시료의 양은 50 ㎍이었다. 1 mg/ml 및 5 mg/ml 제제에 대하여, 25℃에서 2 주 동안 저장 후의 결과의 요약은 표 9에, 40℃에서 2 주 동안 저장 후는 표 10, 및 25℃에서 4 주에서 저장 후는 표 11에 나타냈다. 저장의 2 주 후 및 25℃ 및 40℃에서 20 mg/ml 제제의 데이타는 각각 표 12 및 13에 나타냈다.
[표 9] 2 주 동안 25℃ 저장
Figure 112015098304453-pct00017
[표 10] 2 주 동안 40℃ 저장, 1 mg/ml 및 5 mg/ml 제제
Figure 112015098304453-pct00018
[표 11] 4 주 동안 25℃ 저장, mg/ml 및 5 mg/ml 제제
Figure 112015098304453-pct00019
[표 12] 2 주 동안 25℃ 저장, 20 mg/ml 제제
Figure 112015098304453-pct00020
[표 13] 2 주 동안 40℃, 20 mg/ml 제제
Figure 112015098304453-pct00021
25℃ 또는 40℃에서 2 주 저장 후에, 주요 피크 순도의 감소가 관찰되었고 전-피크 3 (산화되 P05)에서 증가는 1 mg/ml 및 5 mg/ml 제제 동안 관찰되었다. 상기 효과는 높은 온도에서 1 mg/ml 시료 (C1)에 대하여 가장 두드러진다. 관심있게도, 25℃에서 2 주 저장 후에, 20 mg/ml 제제는 T=0 (96.1% 순도)에 대하여 유사한 주요 피크 퍼센트를 가졌다. 퍼센트 주요 피크에서 감소 및 전-피크 3 (산화된 P05) 증가는 40℃에서 2 주 저장 후에 상기 시료에 대하여 관찰하였다. 퍼센트 주요 피크에서 감소 및 전-피크 3 (산화되 P05) 에서 증가는 40℃에서 2 주 저장 후에 상기 시료에 대하여 관찰되었다. 25℃에서 4 주 저장 후에, 20 mg/ml 제제는 주요 피크 순도에서 약한 감소 및 전-피크 3 (산화된 P05)에서 증가를 나타냈다.
상기 분석 데이타는 키메릭 사이토카인 제제의 안정성을 분석하는 방법을 나타내고 특히 P05 폴리펩타이드를 포함하는 키메릭 사이토카인 제조의 놀라운 안정성을 나타낸다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 적어도 1 mg/ml, 적어도 5 mg/ml, 또는 적어도 20 mg/ml의 농도에서 25℃에서, 예를 들면, 40℃ 에서 적어도 2 주, 예를 들면, 적어도 4 주 동안 저장된 제제에 관한 것이고, 적어도 92%, 예를 들면, 적어도 94%, 또는 적어도 96%의 순도를 가진다.
실시예 14: 불어서 채우는 밀봉 용기에서 제제의 안정성
불어서 채우는 밀봉 (BFS) 용기로 패키징 제제의 진행은 플라스틱 분출(extrusion), 주형(molding), 무균성 채움(aseptic filling), 및 밀봉 순서를 포함한다. 예를 들면, Liu, W. et al. 2011 Biopharm International, 24(7): 22-29를 참조하시오. 분출 단계에서, 플라스틱 과립제는 160℃ 이상 온도에서 녹는다. 그 다음으로, 플라스틱은 원하는 용기 모양으로 주형하고(molded), 제제 용액으로 채우고, 및 밀봉한다(hermetically sealed).
용기를 형성하기 위하여 사용된 플라스틱 물질은 어느 정도 가스 투과가 있기 때문에, 제제의 안정성은 긴 저장 기간 동안에 악화될 수 있다(예를 들면, 용기 및/또는 단백질 산화로부터 물의 증발에 기인하여). 알루미늄 호일 작은 주머니(aluminum foil pouch) 또는 다른 적합한 패키지에서 상가 용기를 밀봉하는 것은 빛-유도된 분해로부터 제제를 보호할 수 있다. 불활성 기체, 예를 들면, 질소 또는 아르곤(argon)을 가지는 알루미늄 호일 주머니에서 용기를 밀봉하는 것은 산화에 대하여 보호할 수 있다. 따라서, 실험은 덮힌 불활성 기체(inert gas overlay)로 알루미늄 호일 주머니가 있거나 또는 없는, 불어서 채우는밀봉 (BFS) 용기에서 P05의 패키징 및 저장의 효과를 조사하는 것을 수행되었다. 테스트는 활성 약학적, P05를 포함하는 제제에 대하여 수행되었다. 대량 약물 물질은 불어서 채우는 과정 동안에 pH 6.0에서 10 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate), 5% w/v 소르비톨(sorbitol), 0.1 % w/v 폴록사머(poloxamer) 188을 포함하는 수용성 용액으로 제조되었다. P05를 위한 표적 농도는 5.0 mg/mL이었다.
제제는 약 2℃-8℃로 냉각되었고 용기에 채웠다. 대략 1000 용기가 채워졌고 용기의 표적 충전 부피는 0.32 mL이었다. 용기의 일부는 질소로 가득차게 호일 패키지로 주머니화되었다(pouched). 초기 특성은 BFS 용기로 패키징을 수행하였고 추가적 안정성 평가는 주머지가 있거나 없이, 2개 온도 (2℃ 내지 8℃ 및 25℃)에서 저장에서 수행되었다.
초기 특성 분석은 하기를 포함한다: A280에 의한 농도, SDS-PAGE, SEC-HPLC, wCEX-HPLC, RP-HPLC, 삼투압 및 빛 차광(light obscuration)에 위한 입자 분석. P05의 안정성은 4 및 5 개월에서 수행된 A280, 및 5개월에서 pH 및 삼투압으로, SEC-HPLC, wCEX-HPLC 및 RP-HPLC에 의해 매월 모니터되었다.
P05 제제의 초기 특성에 이은 불어서 채우는 과정은 안정성의 보유(retention)를 나타냈다.
P05의 초기 분석에 이어서 불어서 채우는 과정은 단백질이 자체의 불어서 채우는 과정에도 불구하고 자체의 화학 및 물리적 안정성을 보유한다는 것을 나타낸다. BFS 진행에 노출되지 않은 P05 제제(50 mg/mL 농도, 0.01% w/v 폴록사머 188, 5% w/v 소르비톨, pH 6.5에서 10 mM 소듐 포스페이트의 P05를 포함하는 수용성 제제)로부터 결과는 불어서 채우는 진행 (5mg/mL의 농도, 0.1% w/v 폴록사머(poloxamer) 188; 5% w/v 소르비톨; pH 6.0에서 10 mM 소듐 시트레이트의 P05를 포함하는 수용성 제제)에 수행된 P05 제제와 비교되었다. 상기 제제는 동일한 생성물 배치로부터 P05로 만들어졌다.
상기 결과는 크기 배제 크로마토그래피, RP-HPLC, wCEX, 및 SDS-PAGE를 사용하여 분석에 의해 나타낸 바와 같이, 0시간 이후 불어서 채우는 패키징, 불어서 채워진 제제가 잠재적으로 해로운 불어서 채우는 과정에 노출된 후에 조차 우수한 안정성을 보유한다는 것을 나타낸다(표 15를 참조하시오).
[표 15] 안정성 비교
분석 BFS 과정에 노출되지 않은 PO5 제제 BFS 용기에서 패키징 후에 PO5 제제
크기 배제 99% 주요 피크 100% 주요 피크
RP-HPLC 97% 주요 피크 97.6% 주요 피크
wCEX 94% 주요 피크
5% des-ala
0.2% +메티오닌(methionine) 종		 95.3% 주요 피크
4.2% des-ala
+ 주요 피크로부터 미해결된
메티오닌(methionine) 종
SDS-PAGE 참조에 일치 참조에 일치
*측정은 충전/끝(fill/finish)의 후자의 절반으로부터 3개 바이알(무작위로 잡아당김)로부터 평균된다.
상기 분석에 추가로, 입자 분석은 방법 USP <789>에 따라 빛 차광을 사용하여, BFS 용기에 패키지된 제제에서 수행되었다. 현미경을 쓰지 않으면 안 보이는 입자 수는 BFS 용기에서 보이는 침전의 부족과 일치하는, 국소 안구(입자 ≥10 ㎛를 위하여 ㎖ 당 50 입자에 미만 또는 동등 및 입자 ≥25 ㎛를 위하여 ㎖ 당 5 입자에 미만 또는 동등)를 위한 USP 명세서 내에 있다(데이타를 나타내지 않음).
상기 데이타는 P05가 물리적 안정(SEC-HPLC, light obscuration, 및 visible observation로부터 측정에 따라) 및 화학적 안정(wCEX-HPLC, RP-HPLC, SDS-PAGE로부터 측정에 따라) 모두에 즉시 이어서 불어서 채우는 과정이었다는 것을 나타낸다.
초기 특성의 일부로서, A280에 의한 삼투압 및 농도가 측정되었다. 평균 삼투압 측정은 317 mOsm이었고, A280에 의한 평균 농도는 5.0 mg/mL이었다.
불어서 채우는용기에 저정된 P05 제제는 안정성을 보유한다
BFS 용기에 있는 P05 제제는 60% 상대 습도를 가지는 25 ℃ 또는 2 내지 8 ℃에서 배양기 에서 저장된다. 메월 간격에서(monthly intervals), 시료는 SEC, RP-HPLC, 및 wCEX-HPLC에 의해 분석되었다. 4 및 5 개월에서, 농도는 A280으로 측정되었다.
[표 16] BFS 용기에 저장된 P05 제제를 위한 SEC-HPLC 안정성 결과 (% 주요 피크)
개월 25 ℃ / 60% RH 2 내지 8 ℃
주머니화됨
(Pouched)		 주머니화되지
않음(Not Pouched)		 주머니화됨
(Pouched)		 주머니화되지
않음
(Not Pouched)
0 100 100 100 100
2 99.0 99.0 99.2 99.3
3 99.7 99.8 99.8 99.8
4 99.3 99.4 99.5 99.5
5 99.6 99.7 99.8 99.9
EC-HPLC 결과 (표 16을 참조)는 BFS 용기에 저장된 P05 제제는 적어도 5 개월 동안 상온에서 또는 2 내지 8 ℃에서 응집체(aggregates)를 형성하지 않았다는 것을 나타낸다. 질소 플러싱( flushing ) 후에 바이알의 주머니화는 양쪽 온도에서 생성물의 물리적 안정성에 영향을 주지 않는다. P05 제제에 대한 wCEX-HPLC 안정성 결과는 표 17 및 표 18 (각각, % 주요 피크 및 % 탈아미드화된 피크)에 나타낸다.
[표 17] BFS 용기에 저장된 P05 제제를 위한 wCEX-HPLC 안정성 결과 (% 주요 피크)
개월 25 ℃ / 60% RH 2 내지 8 ℃
주머니화됨
(Pouched)		 주머니화되지
않음(Not Pouched)		 주머니화됨
(Pouched)		 주머니화되지
않음
(Not Pouched)
0 95.3 95.3 95.3 95.3
1 94.1 93.9 95.0 95.0
2 92.7 92.7 95.8 95.8
3 90.0 90.0 95.5 95.5
4 87.4 88.3 95.4 95.5
5 85.8 86.1 95.7 95.7
[표 18] BFS 용기에 저장된 P05 제제를 위한 wCEX-HPLC 안정성 결과 (% 탈아미드화된 피크)
개월 25 ℃ / 60% RH 2 내지 8 ℃
주머니화됨
(Pouched)		 주머니화되지
않음
(Not Pouched)		 주머니화됨
(Pouched)		 주머니화되지
않음
(Not Pouched)
0 0.8 0.8 0.8 0.8
1 1.6 1.8 1.2 1.2
2 2.7 2.7 0.12 0.50
3 4.7 4.8 0.42 0.41
4 6.7 7.0 0.60 0.51
5 9.5 8.5 0.34 0.33
wCEX-HPLC 결과는 불어서-채우는 밀봉 용기에 있는 P05 제제가 최대 지5 개월까지 상온에서 안정함을 유지한다는 것을 나타낸다. 또한 P05는 2 내지 8 ℃에서 적어도 5 개월 동안 안정성을 보유한다. 질소 플러싱(flushing )후에 용기의 주머니화는 양쪽 온도에서 생성물의 안정성에 영향을 주지 않는다.
P05 제작 수행(run) 약물 생성물에 대한 RP-HPLC 안정성 결과는 표 19 및 표 20 (각각, % 주요 피크 및 % 산화된 단백질 피크)에서 나타낸다.
[표 19] BFS 용기에 저장된 P05 제제를 위한 RP-HPLC 안정성 결과 (% 주요 피크)
개월 25 ℃ / 60% RH 2 내지 8 ℃
주머니화됨
(Pouched)		 주머니화되지
않음
(Not Pouched)		 주머니화됨
(Pouched)		 주머니화되지
않음
(Not Pouched)
0 97.6 97.6 97.6 97.6
1 96.2 96.3 97.3 97.1
2 96.0 96.0 97.3 97.1
3 94.9 93.5 97.2 97.0
4 94.1 92.6 96.7 96.5
5 91.6 91.3 96.2 96.0
[표 20] BFS 용기에서 저장된 P05 제제를 위한 RP-HPLC 안정성 결과 (% 산화된 피크)
개월 25 ℃ / 60% RH 2 내지 8 ℃
주머니화됨
(Pouched)		 주머니화되지
않음
(Not Pouched)		 주머니화됨
(Pouched)		 주머니화되지
않음
(Not Pouched)
0 2.2 2.2 2.2 2.2
1 3.3 3.7 2.4 2.5
2 3.6 4.1 2.4 2.6
3 4.6 5.1 2.5 2.7
4 5.4 6.4 2.9 3.1
5 8.4 7.4 3.6 3.5
RP-HPLC 결과는 BFS 용기에서 저장된 P05 제제가 적어도 5 개월 동안 상온 및 2 내지 8 ℃에서 안정한 것을 나타낸다.
추가적으로, 삼투압 및 pH 측정은 예를 들면, 25 ℃에서 시간에 걸쳐 발생된 삼투압 또는 pH에서 현저한 변화가 엇다는 것을 나타낸다(표를 참조). 상기는 증발이 거의 내지 전혀 발생하지 않고, 용액의 pH는 안정을 유지하였다. A280을 사용하여 평가된 것처럼 단백질 농도는 기존 측정과 일치한다(표 21을 참조). 전체적으로, EBI-005는 2 내지 8℃ 및 주위 온도 (RT)에서 불어서 채우는밀봉 바이알에서 연장된 저장 후에 우수한 물리적 안정성을 나타낸다.
[표 21] BFS 용기에서 5 개월 저장 후에 P05 제제를 위한 삼투압, pH, 및 농도
설명 온도 패키징 삼투압 pH A 280
활성 약학적
5 mg/mL		 25℃ 주머니화됨
(Pouched)		 318 6.06 4.89
활성 약학적
5 mg/mL		 25℃ 주머니화되지 않음
(Not Pouched)		 325 6.05 4.94
활성 약학적
5 mg/mL		 4℃ 주머니화됨
(Pouched)		 320 6.11 4.87
활성 약학적
5 mg/mL		 4℃ 주머니화되지 않음(Not Pouched) 319 6.07 4.87
비히클 25℃ 주머니화되지 않음
(Not Pouched)		 328 6.02 0.00*
비히클 4℃ 주머니화되지 않음
(Not Pouched)		 322 6.06 -0.02*
*Milli-Q™ 물로 공백(Blanked)
실시예 15: 제제를 포함하는 메티오닌( methionine )
일부 실시형태에서, 본 발명은 메티오닌(methionine)을 포함하는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 제제에 관한 것이다.
10 mM 소듐 시트레이트, 5% w/v 소르비톨, 0.1% w/v 폴록사머 188, pH 6.0에서 제조된 P05를 위한 항산화제의 사용은 2개 상이한 스트레스 조건을 사용하여 연구된다: 온도 (40℃에서 저장) 및 과산화수소(hydrogen peroxide)를 사용하여 강제 산화시킴. 과산화수소(hydrogen peroxide)는 자유 래디컬에 의해 산화를 일으키는 스트레스 요인이고 따라서 감마 조사된 다용도 용기에서 저장 후에 일어날 수 있는 산화 효과를 모방하는데 사용되었다(하기를 참조). P05는 연장된 기간동안 높은 온도에서 저장될 때 산화 수준에서 증가를 나타낸다. 제제에 첨가된 10 mM 메티오닌(methionine) 또는 7 mM 비스설페이트(bisulfate)의 사용은 3 주 에서 40℃에서 저장된 P05 제제에 대하여 테스트되었다. 추가적으로, 동일한 제제는 0.02% 과산화수소의 10% v/v가 시료에 첨가된 경우에, 강요된 산화를 사용하여 테스트되었다. 시료는 산화 수준을 평가하는 RP-HPLC에 의해 테스트되었다. 표 22는 데이타 요약을 제공하였다.
[표 22] 항-산화가 있고 없이 스트레스된 시료의 RP-HPLC 분석
농도 가변(Variable) 테스트된 조건 % 주요
피크		 % 산화됨
1 mg/mL NA 대조군
(스트레스 되지 않음)		 99 1
1 mg/mL 무첨가물
(no additive)		 3 주 에서 40℃ 90 10
1 mg/mL +10 mM 메티오닌
(methionine)		 3 주 에서 40℃ 98 2
1 mg/mL + 7 mM 비스설페이트(Bisulfate) 3 주 에서 40℃ 88 12
20 mg/mL 무첨가물
(no additive)		 3 주 에서 40℃ 97 3
20 mg/mL + 10 mM 메티오닌
(methionine)		 3 주 에서 40℃ 98 2
20 mg/mL + 7 mM 비스설페이트(Bisulfate) 3 주 에서 40℃ 96 4
1 mg/mL 무첨가물
(no additive)		 0.002%에 첨가된 과산화수소수 (peroxide) 38 62
1 mg/mL + 10 mM 메티오닌
(methionine)		 0.002%에 첨가된 과산화수소수 (peroxide) 73 27
1 mg/mL +7 mM 비스설페이트
(Bisulfate)		 0.002%에 첨가된 과산화수소수 (peroxide) 38 62
상기 데이타는 비스설페이트가 아닌, 메티오닌(methionine)이 특히 높은 온도에서 또는 과산화수소수 첨가가 있는 저장된 단백질을 위하여 낮은 농도에서, 산화되 단백질의 수준을 감소시키다는 것을 나타낸다.
용기 밀폐 시스템 (불어서 채우는 및 다용량), 및 다용도 바이알을 위한 제제에서 항-산화의 사용 모두의 효과는, P05의 산화 수준 상의 효과에 대하여 연구되었다. 다용량 용기(vials)은 감마선 조사로 살균되었다. 감마선 조사는 특정적으로 분자 상에서 메티오닌(methionine) 잔기를 산화하여, 단백질의 화학 안정성에 해로울 수 있는, 용기에서 자유 래디컬(free radicals)의 생성을 초래할 수 있다. 따라서, 본 실험은 10 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate), 5% w/v 소르비톨(sorbitol), 0.1% w/v 폴록사머(poloxamer) 188, pH 6.0로 제조된 P05에 메티오닌(methionine)의 첨가가 P05 산화를 개선(ameliorate)시켰는지를 조사하였다. 10 mM 메티오닌(methionine)은 다용량 또는 불어서 채우는 바이알에서 1 mg/mL의 P05를 위하여 사용되었다. 단백질은 최대 4 주까지 2-8 ℃ 또는 주위 온도에서 저장되었다. 단백질은 산화된 P05의 수준을 결정하기 위하여 RP-HPLC에 의해 분석되었다. 표 23은 결과 요약을 나타낸다.
[표 23] 불어서 채우는 또는 다용량(multi-dose) 용기 ±메티오닌(methionine)에서 저장된 P05의 RP-HPLC 분석
용기 첨가물(Additive) 온도 시간
(주)		 % 주요
피크		 % 산화된
피크

불어서 채우기
(blow fill)		 없음
(none)		 2 내지 8 ℃ 0 98.6 1.4
1 98 2
2 97.9 2.1
3 97.6 2.4
4 97.6 2.4
다용도
없음(none)		 2 내지 8 ℃ 0 98.2 1.7
1 98.2 1.8
2 97.9 2.1
3 97.3 2.7
4 97.3 2.7
다용도 10 mM 메티오닌(methionine) 2 to 8 ℃ 0 98.2 1.7
1 98.2 1.8
2 98.1 1.9
3 97.7 2.3
4 97.6 2.4
불어서 채우기
(blow fill)		 none 주위 0 98.6 1.4
1 97.3 2.7
2 96.6 3.4
3 96.5 3.5
4 ND* ND*
다용도 none 주위 0 98.2 1.7
1 96.4 3.6
2 95.2 4.8
3 93.8 6.2
4 92.5 7.5
다용도 10 mM 메티오닌(methionine) 주위 0 98.2 1.7
1 96.9 3.1
2 96.2 3.8
3 95.3 4.7
4 95.3 4.7
*ND: 시료 오염에 기인하여 결정되지 않음
제제에 메티오닌(methionine)의 첨가는 다용도 용기에서 산화를 감소시켰다. 예를 들면, 주위 온도(ambient temperature)에서 다용도 용기에서 저장의 4 주 후에, 메티오닌(methionine)이 없이 제제에서 % 산화된 피크는 7.5%이었고 메티오닌을 가진 제제에서 % 산화된 피크는 단지 4.7%이었다.
실시예 16: EBI -005 제제 및 비히클 제제의 치료 효과
다중심(multicenter), 이중 마스크(double masked), 무작위(randomized), ㅍ플라시보(placebo) 조절된 임상시도는 중간 내지 심한 건조 안구 질병을 가지는 환자에 EBI-005의 수용성 제제의 안전성 및 생물 활성을 평가하는 것을 완성하였다. 본 연구에서 수행된 제제는 20 mg/ml 또는 5 mg/ml (하기를 참조)의 농도의 EBI-005(P05로서 본 명세서에서 언급됨), 0.25% w/v의 농도에서 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose); 0.1% w/v의 농도에서 폴록사머(poloxamer) 188; 5% w/v 농도의 소르비톨; 및 10 mM 농도의 소듐 포스페이트를 포함한다. 시도는 미국에서 8개 센터에서 74명의 환자에게 수행되었다. 시도는 천연 환경 (a 조절된 불리한 환경 챔버 was not 사용되)에서 수행되었다(조절된 불리한 환경 챔버가 사용되지 않음)
환자는 첫번째 방문에서 적격 기준에 대해서 스크린되었다. 등록이 주어진 환자는 1주 동안 하루 당 3회 각각의 안구에서 비히클의 국소 투여를 받았다. 1주 수행기간 동안의 결론에서, 환자는 적격 기준에 대해 재평가되었다. 상기 추가 기준하에서 자격이 주어진 환자는 3개의 치료 군의 하나로 무작위되었다. 각막 플루오레신(corneal 플루오레세인(fluorescein))염색 (CFS) 점수, 안구 표면 질병 지수 (OSDI) 점수 및 무작위에서 얻은 다른 측정은 기저선 계량기(baseline measures)로서 본 명세서에서 언급되었다. 8명의 개체는 중간 내지 심한 건조 안구 질병을 가지는, 적어도 18세였다. 추가 적격 기준은 하기를 포함한다: (i) 스크리닝 시간에서 23에 이상(greater than) 또는 동등 및 90 미만의 OSDI 점수; (ii) 무작위에서 19에 이상(greater than) 또는 동등한 OSDI 점수; (iii) 스크리닝 시간에서 NEI 스케일에 6에 이상(greater than) 또는 동등 및 15 미만의 CFS 점수; 및 (iv) 무작위에서 5에 이상(greater than) 또는 동등한 CFS 점수. 치료 군에서 무작위된 환자는 무작위에서 6 주 시작 동안 하루 당 3회 모든 안구에 치료되었다. 상기 시도에서 3개의 군에 대한 치료는 하기와 같다: (i) 첫 번째 군에서, 20 mg/ml의 농도에서 EBI-005를 포함하는 EBI-005 제제의 하루 당 3회 각각의 안구로 국소투여 받은 22명의 환자, (ii) 두 번째 군에서, 5 mg/ml의 농도에서 EBI-005를 포함하는, EBI-005 제제의 하루 당 3회 각각의 안구로 국소 투여 받은 22명의 환자, 세 번째 군에서, 비히클 제제의 하루 당 3회 각각의 안구로 국소투여 받은 30명의 환자(EBI-005가 비히클 제제에 없다는 것을 제외하고, 비히클 제제는 EBI-005 제제로서 동일한 구성요소를 포함하는 수용성 제제였다).
환자는 스크리닝; 무작위에서; 2, 4 및 6주 방문에 이어서 무작위를 평가; 및 치료 완성 후에 방문 1주를 따르는 것에서 평가되었다. 상기 임상시도를 위한 시각표(timeline) 및 EBI-005 치료 및 비히클 대조군 군으로 무작위된 환자 수는 도7에 묘사되었다. 통증은 고통스럽거나 아픈 안구에 대하여 환자에게 물은 OSDI의 12문제로부터 단일문제의 분석에 기반되어 평가되었다.
결과는 도 8 내지 10에 나타낸다. 상기 결과는 EBI-005 제제를 가지는 치료 과정 동안에 개선된, OSDI 점수 (도 8), 통증 (도 9), 및 각막 플루오레신(corneal 플루오레세인(fluorescein))염색 (CFS) 점수 (도 10)을 사용하여 평가된 바와 같이, 건조 안구 질병의 징후 및 증상을 나타낸다. 놀랍게도, 비히클 단독 제제를 가지는 치료는 OSDI 점수, 통증, 및 CFS 점수에서 주목할 만한 개선을 나타냈다.
실시예 17: 중간 내지 심한 건조 안구 질병 ( DED )을 가지는 개체에서 EBI -005 ( 5 mg /ml) 국소 안구(국소 ophthalmicc ))용액 및 비히클의 이중 마스 크(Double-Masked), 무작위(Randomized), 조절 연구
연구는 12 주 동안 매일 3회 중간 내지 심한 건조 안구 질병 (DED)을 가지는 개체에 각각의 안구로 국소 안구 용액으로서 주어진 비히클 제제 (10 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate), pH 6.0, 5% 소르비톨 (w/v), 및 0.1% 폴록사머 188 (w/v)) 및 a 치료 제제 (10 mM 소듐 시트레이트, pH 6.0, 5% 소르비톨 (w/v), 및 0.1% 폴록사머 188 (w/v) 포함하는 5 mg/ml P05)의 효능을 결정하는 것을 수행하였다.
개체는 DED에 대하여 평가되고 포함 기준은 방문 1에서 하기의 기준에 의해 정의된 바와 같이, 기존 임상 진단에 의해 지지된 모든 안구에서 건조 안구 질병 (DED)의 역사를 가지거나 또는 동일한 안구 또는 모든 안구에서, 진행하는 DED를 가지는, 스크리닝 (방문 1) 이전에 적어도 6 개월 동안 주관적 순응의 자가 기록된 역사를 가지는 것을 포함한다: ≥23 및 ≤75의 OSDI 점수는 OSDI의 고통스럽거나 또는 아픈 안구 문제 및 ≥6 (NEI 스케일) 및 <15의 총 각막 플루오레신 염색 점수되었다. 스크린된 개체는 마스크된 비히클 제제로 5 내지 8일 치료가 진행한 후, 상기 방문에서 무작위 기준을 만나는 것을 확인하기 위하여 재스크린(방문 2)되었다. 무작위 기준은 적어도 하나의 안구에서 방문 1 및 CFS < 15로서 동일한 자격을 주는 안구에서 ≥5 (NEI 스케일)의 총 각막 플루오레신 염색 점수를 가지는, ≥19 및 <50의 총 OSDI 점수를 가지는 것, 및 8일 미스크된 비히클 제제 기간에 5개에 순응하는 것을 가지는 것을 포함한다. 준수는 적어도 80%의 용량을 투여로서 정의된다.
개체는 비히클 제제 또는 치료 제제로 치료에 무작위되고 방문 4를 통하여 매일 3회 각각의 안구에 하나의 안약을 투여하기 위해 충분한 비히클 제제 또는 치료 제제로 제공된다(주 3/주 숫자는 개체가 무작위되고 비히클 또는 치료 제제를 받는데 할당된 후에 시작하는 것을 주목하시오). 추가 약물은 방문 6(주 9)을 통하여 각각의 그 다음의 방문에서 나누어 준다. 개체는 방문 3 (주 1), 방문 4 (주 3), 방문 5 (주 6), 방문 6 (주 9), 방문 7 (주 12) 및 방문 8 (주 15)에서 평가되었다. 연구 약물 및 최종 치료 방문의 마지막 용량은 방문 7 (주 12)에서 완성된다. 최조 평가는 방문 8 (follow-up, 주 15)에서 3 주 후이다.
제제는 낮은-밀도 폴리에틸렌(low-density polyethylene (LDPE)) 불어서 채우는 유닛에서 2 내지 8℃ 용액으로서 제공된다. 개체는 최종 평가 이전에 21일 기간에 걸쳐, 만약 요구된다면 사용되는 ReFresh Plus® tears로 제공된다. 개체는 본 연구의 다른 부분 동안에 임의의 인공 눈물을 사용하지 않는다. 추가 연구 정보는 임상시도 제 NCT01998802호에서 활용가능하다. 본 연구 동안에 개체의 평가는 총 각막 플루오레신염색 (징후), OSDI 문제의 고통스러움 또는 아픈 안구 문제(증상), OSDI의 총 OSDI 및 각각의 문제 및 도메인, 하위(inferior) 및 중심 영역 CFS, 세계 평가 (조사자 및 개체), 건조 안구의 각각의 증상의 개체-비율된 심각도, 및 마취 없이 스키르머 테스트(Schirmer test)를 포함한다. 첫번째 주 말기 (즉, 미스크된 비히클 수행(run-in) 3일 내지 8일 후에) 및/또는 초기 평가와 비교하여 비히클 제제 군에 할당된 상기 개체에 대한 그 다음의 연구 방문 동안에, 비히클 제제의 효능능 추가적으로 나타냈다. 초기 평가 또는 마스크된 비히클 수행 3 내지 8일 후의 평가와 비교하여 치료 제제 군에 할당된 상기 개체를 위한 후속의 연구 방문 동안에 상기 기준의 적어도 하나에서 개선은, 치료 제제, 예를 들면, P05를 포함하는 제제의 효능을 추가적으로 나타낸다.
다른 실시형태는 하기의 청구항의 범위 내에 있다.
<110> ELEVEN BIOTHERAPEUTICS <120> CHIMERIC CYTOKINE FORMULATIONS FOR OCULAR DELIVERY <130> 15fpi-08-023 <150> US 61-779974 <151> 2013-03-13 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Ala Pro Val Arg Ser Leu Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys 1 5 10 15 Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly 20 25 30 Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Ser Phe Val Gln Gly 35 40 45 Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Ile His Gly Gly 50 55 60 Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln 65 70 75 80 Leu Glu Ala Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Asp Lys 85 90 95 Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu 100 105 110 Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp 115 120 125 Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr 130 135 140 Lys Phe Tyr Met Gln 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Leu Gln Gly 20 25 30 Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly 35 40 45 Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys 50 55 60 Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln 65 70 75 80 Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys 85 90 95 Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu 100 105 110 Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp 115 120 125 Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr 130 135 140 Lys Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 <210> 5 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 5 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys 1 5 10 15 Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly 20 25 30 Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly 35 40 45 Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu 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cttcagaatc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60 aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag 120 atagatgtgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180 atccatggag ggaagatgtg cctgtcctgt gtcaagtctg gtgatgagac cagactccag 240 ctggaggcag ttgatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300 aacaagatag aaatcaataa caagctgagt tttgagtctg ccgcctgccc cggttggttc 360 ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc 420 gtcatggtca ccaaattcta catgcaattt gtgtcttcc 459 <210> 10 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 10 gcacctgtac gatcactggc cttcagaatc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60 aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag 120 ttctccatgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180 ctcaaggaaa agaatctgta cctgtcctgc gtgttgaaag atgataagcc cactctacag 240 ctggagagtg tagatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300 atccgctcag acagcggccc caccaccagt tttgagtctg ccgcctgccc cggttggttc 360 ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc 420 gtcatggtca ccaaattcac catgcaattt gtgtcttcc 459 <210> 11 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 11 gcacctgtac gatcactggc cttcagaatc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60 aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag 120 ttctccatgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180 ctcaaggaaa agaatctgta cctgtcctgc gtgttgaaag atgataagcc cactctacag 240 ctggagagtg tagatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300 aacaagatag aaatcaataa caagctggaa tttgagtctg ccgcctgccc cggttggttc 360 ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc 420 gtcatggtca ccaaattcac catgcaattt gtgtcttcc 459 <210> 12 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 12 gcacctgtac gatcactgaa ctgcagaatc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60 aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag 120 ttctccatgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180 ctcaaggaaa agaatctgta cctgtcctgc gtgttgaaag atgataagcc cactctacag 240 ctggagagtg tagatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300 aacaagatag aaatcaataa caagctggaa tttgagtctg cccagttccc caactggttc 360 ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc 420 gtcatggtca ccaaattcta catgcaattt gtgtcttcc 459 <210> 13 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 13 gcacctgtac gatcactgaa ctgcacgctc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60 aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcgagca acaagtggtg 120 ttctccatgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180 ctcaaggaaa agaatctgta cctgtcctgc gtgttgaaag atgataagcc cactctacag 240 ctggagagtg tagatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300 aacaagatag aaatcaataa caagctggaa tttgagtctg cccagttccc caactggtac 360 atcagcacct ctatggaagc tgaccagccc gtcttcctgg gagggaccaa aggcggccag 420 gatataactg acttcaccat gcaatttgtg tcttcc 456 <210> 14 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 14 gcacctgtac gatcactgaa ctgcagaatc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60 aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag 120 ttctccatgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180 ctcaaggaaa agaatctgta cctgtcctgc gtgttgaaag atgataagcc cactctacag 240 ctggagagtg tagatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300 aacaagatag aaatcaataa caagctggaa tttgagtctg cccagttccc caactggttc 360 ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc 420 caggatataa ctgacttcac catgcaattt gtgtcttcc 459 <210> 15 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Gly Val Met Val Thr 130 135 140 Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp 145 150 <210> 21 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 21 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys 1 5 10 15 Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly 20 25 30 Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly 35 40 45 Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys 50 55 60 Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln 65 70 75 80 Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys 85 90 95 Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu 100 105 110 Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp 115 120 125 Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr 130 135 140 Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp 145 150 <210> 22 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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His His His 1 5

Claims (87)

  1. 하기를 포함하는 수용성 제제
    P01, P02, P03, P04, P05, P06, 및 P07로 구성되는 군으로부터 선택되는 1-100 mg/ml의 IL-1β/IL-1Ra 키메릭 사이토카인 단백질이되, 상기 P01은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 P02는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고, 상기 P03은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고, 상기 P04는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 P05는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, 상기 P06은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖고, 및 상기 P07은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 IL-1β/IL-1Ra 키메릭 사이토카인 단백질;
    소듐 시트레이트(sodium citrate) 및 소듐 포스페이트로부터 선택되는 완충제;
    소르비톨(sorbitol);
    폴록사머 188;
    여기서 상기 제제는 5.5 내지 7.5의 pH를 가진다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 키메릭 사이토카인 단백질은 P05인 것을 특징으로 하는 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    5 mM 내지 15 mM의 총 농도의 소듐 시트레이트(sodium citrate) 또는 소듐 포스페이트,
    3.5 내지 6.5% (w/v) 농도의 소르비톨, 및
    0.07 내지 0.13% (w/v) 농도의 폴록사머 188을 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 소듐 시트레이트(sodium citrate)는 5 mM 내지 15 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제제.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 폴록사머 188은 0.08 % 내지 0.12% w/v의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제제.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 소르비톨은 4% 내지 6% w/v의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제제.
  7. 하기를 포함하는 수용성 제제
    1-50 mg/ml의 P05;
    8 mM 내지 12 mM 농도의 소듐 시트레이트 또는 소듐 포스페이트;
    4% 내지 6% (w/v) 농도의 소르비톨;
    0.08% 내지 0.12% (w/v) 농도의 폴록사머 188;
    여기서 상기 제제는 5.5 내지 7의 pH를 가진다.
  8. 하기를 포함하는 수용성 제제
    1-50 mg/ml P05;
    9-11 mM 농도의 소듐 시트레이트(sodium citrate);
    4.5-5.5% (w/v)의 소르비톨(sorbitol); 및
    0.09-0.11% (w/v)의 농도의 폴록사머 188;
    여기서 상기 제제는 5.7-6.3의 pH를 가진다.
  9. 제1항, 제7항, 또는 제8항에 있어서,
    상기 제제는 270-370 mOsm/kg의 삼투압을 가지는 것을 특징으로 하는 제제.
  10. 제1항, 제7항, 또는 제8항에 있어서,
    상기 제제는 점도제(viscosity agent)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 제제.
  11. 제1항, 제7항, 또는 제8항에 있어서,
    상기 제제는 아미노산을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제제는 1 내지 20 mM 농도의 메티오닌(methionine)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제제는 제제가 25℃에서 4 주 동안 저장될 때, 메티오닌을 포함하지 않는 해당 제제와 비교하여, 감소된 산화를 가지는 것을 특징으로 하는 제제.
  14. 제1항, 제7항, 또는 제8항에 있어서,
    상기 제제는 빛 차광 입자 계수 시험(light obscuration particle count test)을 사용하여 평가된 바와 같이, 입자 ≥10 ㎛에 대하여 ㎖ 당 50 입자에 미만(less than) 또는 동등하고 입자 ≥25 ㎛에 대하여 ㎖ 당 5 입자에 미만(less than) 또는 동등함을 가지는 것을 특징으로 하는 제제.
  15. 제1항, 제7항, 또는 제8항에 있어서,
    상기 제제는 25℃에서, 4시간 동안 단백질 용액을 볼텍싱(vortexing)한 후에 응집된 형태(aggregated form)에 비례하여 단백질의 단량체 형태의 > 90%의 존재에 의해 나타낸 바와 같이 안정적이고, 여기서 응집된 형태에 비례하여 단백질의 단량체 형태의 퍼센트는 SEC-HPLC를 사용하여 평가되는 것을 특징으로 하는 제제.
  16. 제1항, 제7항, 또는 제8항에 있어서,
    상기 제제는 2-8 ℃ 및 60% 상대 습도에서 1 개월 동안 저장 후에 안정적인 것을 특징으로 하는 제제.
  17. 제1항, 제7항, 또는 제8항에 있어서,
    상기 제제는 상온에서 1 개월 동안 저장 후에 안정적인 것을 특징으로 하는 제제.
  18. 제1항, 제7항, 또는 제8항에 있어서,
    상기 제제는 미세 입자 계수 시험(microscopic particle count test)을 사용하여 평가된 바와 같이, 입자 ≥10 ㎛에 대하여 ㎖ 당 50 입자에 미만(less than) 또는 동등하고 입자 ≥25 ㎛에 대하여 ㎖ 당 5 입자에 미만(less than) 또는 동등하고, 및 입자 ≥50 ㎛에 대하여 ㎖ 당 2 입자에 미만(less than) 또는 동등한 존재에 의해 나타낸 바와 같이 안정적인 것을 특징으로 하는 제제.
  19. 제1항, 제7항, 또는 제8항에 있어서,
    상기 제제는 SEC-HPLC을 사용하여 평가된 바와 같이 응집된(aggregated) 형태와 비례하여 단백질의 단량체 형태의 > 90%의 존재에 의해 나타낸 것처럼 안정적인 것을 특징으로 하는 제제.
  20. 제1항, 제7항, 또는 제8항에 있어서,
    상기 제제는 환원된 SDS-PAGE 또는 비환원된 SDS-PAGE에서 참조 표준에 대해 주요 밴드의 일치에 의해 나타낸 것처럼 안정적인 것을 특징으로 하는 제제.
  21. 제1항, 제7항, 또는 제8항에 있어서,
    상기 제제는 약한 양이온 교환 HPLC (WCEX-HPLC)을 사용하여 평가될 때 85%에 이상(greater than) 또는 동등한 주요 피크에 의해 지시되는 것으로서 안정적인 것을 특징으로 하는 제제.
  22. 제1항, 제7항, 또는 제8항의 수용성 제제를 포함하는, IL-1-관련 장애 치료용 약학적 조성물이되, 상기 IL-1-관련 장애는 건조 안구 장애(dry eye disorder), 자가면역 장애(autoimmune disorder), 염증성 장애(inflammatory disorder), 또는 암(cancer)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  23. 수용성 제제를 포함하는, IL-1-관련 장애 치료용 약학적 조성물이되,
    상기 IL-1-관련 장애는 건조 안구 장애(dry eye disorder), 자가면역 장애(autoimmune disorder), 염증성 장애(inflammatory disorder), 또는 암(cancer)이고,

    여기서, 상기 수용성 제제는,
    1 내지 50 mg/ml P05;
    8 mM 내지 12 mM 농도의 소듐 시트레이트 또는 소듐 포스페이트;
    4% 내지 6% (w/v)의 소르비톨(sorbitol); 및
    0.08% 내지 0.12% (w/v) 농도의 폴록사머 188;를 포함하고,
    상기 수용성 제제는 5.5 내지 7.5의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 수용성 제제는,
    1 내지 50 mg/ml P05;
    9 mM 내지 11 mM 농도의 소듐 시트레이트;
    4.5% 내지 5.5% (w/v)의 소르비톨(sorbitol); 및
    0.09% 내지 0.11% (w/v) 농도의 폴록사머 188;를 포함하고,
    상기 수용성 제제는 5.7 내지 6.3의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 제제는 피하 투여를 위한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  26. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 제제는 임의로 투여를 위한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  27. 제1항, 제7항, 또는 제8항의 제제를 포함하는 용기.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 용기는 불어서 채우는 밀봉 용기(blow fill seal container)인 것을 특징으로 하는 용기.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 용기는 다용량 용기(multidose container)인 것을 특징으로 하는 용기.
  30. 제1항, 제7항, 또는 제8항의 제제를 포함하는 약물 운반 장치.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 약물 운반 장치는 불어서 채우는 밀봉 용기(blow fill seal container)인 것을 특징으로 하는 약물 운반 장치.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 약물 운반 장치는 다용량 용기(multidose container)인 것을 특징으로 하는 약물 운반 장치.
  33. 제27항에 따른 용기를 포함하는 키트.
  34. 제33항에 있어서,
    사용을 위한 지침을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  35. 제30항에 따른 약물 운반 장치를 포함하는 키트.
  36. 제35항에 있어서,
    사용을 위한 지침을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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