KR101854943B1 - 소수성 부분을 통해 변형된 펩티드를 포함하는 리포솜 기반 구조체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리포솜 내에서 재구성된 소수성 부분을 통해 변형된 관심의 펩티드, 특히 항원성 펩티드를 포함하는 리포솜 기반 구조체의 제조 방법 및 상기 방법으로 수득된 항원성 구조체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알츠하이머병과 같은 단백질병증과 연관되거나 또는 그로부터 유발된 질환 및 장애의 처치에서 치료용 및 진단용으로 사용하기 위한 상기 구조체의 용도에 관한 것이다.

Description

소수성 부분을 통해 변형된 펩티드를 포함하는 리포솜 기반 구조체{LIPOSOME-BASED CONSTRUCT COMPRISING A PEPTIDE MODIFIED THROUGH HYDROPHOBIC MOIETIES}
본 발명은 리포솜 내에서 재구성된(reconstituted) 소수성 부분을 통해 변형된, 관심의 펩티드, 특히 관심의 항원성 펩티드를 포함하는 리포솜 기반 구조체(liposome-based constructs)의 개선된 제조 방법 및 상기 방법으로 수득된 항원성 구조체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 치료 및 진단 목적을 위한 상기 구조체의 용도, 특히 알츠하이머병과 같은 단백질병증(proteopathy)과 연관되거나 그로부터 유발된 질환 및 장애를 치료하는 용도에 관한 것이다.
리포솜은 단지 생물리학 연구의 또 다른 외부 객체(exotic object)로부터 다수의 실체적 적용을 위한 약제학적 캐리어의 선택이 되는 먼길을 이동해 왔다(Torchilin, Nature Reviews, 2005, 4, 145-160). 리포솜은 대부분이 (인)지질로 만들어진 인조 베시클(artificial vesicles)이며, 그의 내부의 수성 체적 내에 약물 또는 가용성 항원, 또는 이중층에 혼입된 막 단백질과 같은 양친매성 항원을 함유할 수 있다. 많은 미생물로부터의 항원 및 종양 세포는 상세한 특징을 갖는 이러한 리포솜으로 혼입되고 생체 내 시험 되어 왔다. 리포솜을 함유하는 항원의 임상 연구는 이들이 안전하고 일반적으로 심한 역효과를 유도하지 않는다는 것을 나타내고 있다(Kersten and Crommelin, Biochimica et Biophysica Acta 1995, 1241, 117-138).
항원의 제시를 위한 비히클로서의 리포솜의 사용에 대한 아이디어는 30년 넘게 시험되었다(Allison and Gregoriadis, Nature, 1974, 252, 252). 예를 들어, 리포솜 내에 혼입된 디프테리아 톡소이드는 그의 유리 형태보다 더 면역원성이 있음을 나타내었다. 리포솜을 통해 존재하는 항원은 세포뿐만 아니라 체액의 면역 반응을 유도할 수 있다. 지금까지 개발된 리포솜 백신의 대부분은 리포솜의 수성 세포내강(lumen) 내에서 항원 포획(entrapment)에 의해 제조되어 왔다. 또한, 최근 그의 표면상에서 랜덤하게 분포된 소수성 또는 양친매성 항원(즉, 내부 또는 외부 수용액에 무작위로 직면하는 항원)을 운반하는 리포솜의 용도가 문헌에 보고되어 있다(Muhs et al., PNAS, 2007, 104, 9810-9810; Nicolau et al., PNAS, 2002, 99, 2332-2337; WO2007/068411호). 프리슈(Frisch) 등은 피포된(encapsulated) 펩티드와는 대조적으로, 애쥬번트(adjuvant)로서 모노포스포릴 지질 A(MPLA)를 함유하는 베시클의 표면에서 작은 B 세포 에피토프(small B cell epitopes)의 발현이 강하고 특이적인 체액 반응을 유도할 수 있음을 관측하였다(항체의 제조)(Frisch, Eur J Immunol 1991;21:185; Alving et al., Immunol Rev 1995; 145:5). 따라서, 리포솜의 표면상에 존재하는 항원은 아마도 비염증성 반응이 요구되는, 치료백신에 대하여 더 바람직하다는 것을 나타낸다. 그러므로, 리포솜 형성 후 항원의 첨가, 이어서 리포솜 내에서 그의 통합은 외부 리포솜 지질층에서 항원의 단일 분포를 제공하여야 한다. 실질적으로, 후-삽입 방법이 개발되어 왔고 문헌에 널리 보고되어 있으며, 이것은, 리포솜의 외부 지질 표면상에서 항원과 반응물 간의 커플링으로서 또는 페길화된(pegylated) 펩티드의 사용으로서 요약될 수 있다(Allen et al., Cellular & Molecular Biology Letters, 2002, 7, 217-219; Guan et al., Bioconjugate Chem, 1998, 9, 451-458; Moreira et al., Pharmaceutical Research, 2002, 19, 265-269). 그러나, 그 기술에서 서술된 화학 컨주게이션(예컨대 안정한 티오에테르 결합 또는 생환원성(bioreducible) 다이설피드 연결(linkages))을 사용한 후-삽입 방법의 주요 제한 점은 리포솜 내에서 반응기의 삽입 및 추가의 다운-스트림(down-stream) 공정에 필요한 위치특이성(regiospecificity)의 결여이다. 이와 같이 하여 제조된 리포솜 기반 구조체는 무균 여과할 수 없다. 또한, 외부(external) 리포솜 층으로의 펩티드의 공유 컨주게이션은 소수성 펩티드와 같은 상이한 종류의 항원에 여전히 적용할 수 없다.
일반적으로 사용된 한 방법은 펩티드-PEG-인지질 컨주게이트에 의한(때때로, 추가의 계면활성제의 도움으로) 미셀의 형성을 기초로 하는 페길화된 펩티드의 사용에 관한 것이다. 예비 형성된(preformed) 리포솜으로 배양시, 이 방법은 최적화된 상태 하에 리포솜의 외막 리플렛(outer membrane leaflet)으로의 펩티드 컨주게이트의 자발적인 이동(분자 전좌(molecular translocation))을 초래한다. 그러나, 이 방법은 베시클 불안정화(이 경우 추가의 계면활성제가 필요)가 되기 쉽고 및 (PEG가 면역원성이 될 수 있으므로) 부 면역 반응을 유도할 수 있다.
따라서, 선행 기술의 방법이 갖는 단점을 거의 또는 모두 극복하도록 하며 하기의 원하는 성질을 나타내는 개선된 항원성 구조체를 제공하는 리포솜 기반 구조체를 제공하는 방법에 대한 충족되지 않은 요구가 있다:
ㆍ 수율,
ㆍ 베시클 안정성,
ㆍ 균질성,
ㆍ 부위 특이성(토폴로지, 펩티드의 외부(outer) 및 내부(inner) 분포),
ㆍ 여과성,
ㆍ 리포솜 표면상의 다수의 항원의 제시(presentation), 등.
이 충족되지 않은 요구는 독립 청구항의 특징에 의해 정의된 바의 방법 및 구조체를 제공함으로써 본 발명에 의해 다루어지고 해결된다. 바람직한 실시 양태는 종속 청구항의 대상이다.
본 발명에 따른 방법은 현재 상이한 농도로 예비 형성된 리포솜의 외층에 상이한 펩티드(예컨대 항원) 타입 및/또는 애쥬번트 타입을 후 삽입하는 것이 가능하게 한다. 본 발명에 따른 방법은 용액 내에서 리포솜의 예비 형성화 및 변형된 펩티드가 미셀 형태로 이용할 수 있도록 소수성 부분을 통한 펩티드 특히 항원성 펩티드의 변형을 포함한다. 그 방법은 미셀 분해(micellar breakdown)의 유도에 의한 미셀로부터 펩티드의 방출에 이어 예비 형성된 리포솜으로 통합하는 것을 더 포함한다. 이러한 통합 공정은 리포솜의 (인)지질 이중층과 변형된 펩티드, 항원 및/또는 애쥬번트의 소수성 상호 작용에 의해 구동된다. 특히, 리포솜의 외층으로의 변형된 펩티드, 특히 변형된 항원성 펩티드 및/또는 애쥬번트의 가용화는, 계면활성제의 임계 미셀 농도 미만에서, 가용화된 펩티드, 특히 가용화된 항원성 펩티드 또는 애쥬번트(초기에 미셀 형태로 존재)의 희석에 의해 화학 반응 또는 추가의 분자 변형의 도움 없이 성취된다. 유리 형태의 펩티드, 특히 유리 형태의 항원성 펩티드 및/또는 애쥬번트는, 그후 인지질의 아실 부분에서 그들의 소수성 도메인의 가용화로 인해 리포솜의 외층에서 통합된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 각각의 필요에 따라 로딩을 위해 디스포저블한 "엠프티 리포솜"의 스톡을 제공한다.
유리하게, 여기에서 개시되고 청구된 방법 및 구조체는 리포솜 이중층의 외층에 직면하는 리포솜 상에서 특유의 분자 디스플레이로 높은 수율의 펩티드 및/또는 애쥬번트 혼입을 초래한다. 본 발명의 방법은 또한 0.2 내지 0.6 범위, 특히 0.22 내지 0.35, 특히 0.25의 다분산 지수를 갖는 균일한 크기 분포를 나타내는 리포솜 제제를 초래한다. 또한, 그 방법 및 구조체는 면역 시스템에 대한 펩티드 및/또는 애쥬번트의 높은 생물학적 이용 가능성을 허용하며, 그 결과, 개선된 면역반응을 초래한다. 본 발명에 따른 방법 내에서, 애쥬번트 감성(degradation), 예컨대 MPLA 감성이 일어나지 않으며, 따라서, 증진된 배치(batch) 재현성이 제공된다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 구조체는 안정하고, 무균 여과할 수 있으며(입자 크기 < 200 nm) 및 부 면역 반응을 유도하지 않는다.
특히, 본 발명의 방법에 의해 제조된 구조체는 0℃ 내지 10℃, 특히 2℃ 내지 6℃, 그러나 특히 5℃에서 저장될 수 있으며 1 개월 내지 6 개월 이상, 특히 2 개월 내지 4 개월, 그러나 특히 3 개월 동안 안정하게 잔류한다.
또한, 본 발명의 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 방법은 제조시 비용 감소를 초래하는 제조 프로세스 도중 펩티드(< 25%) 및 애쥬번트(< 25%)의 손실 감소와 함께 신속 및 산업적 규모의 구조체를 제조할 수 있게 한다.
특히, 펩티드 및/또는 애쥬번트의 손실은 30% 미만, 특히 25% 미만, 그러나 특히 20% 미만, 또는 그 아래이다.
특히, 본 발명은, 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의, 관심의 펩티드, 특히 관심의 항원성 펩티드를 포함하는 리포솜 기반 구조체의 제조 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 펩티드는 소수성 부분을 통해 변형되고, 리포솜 내에서 재구성되며, 하기 단계 i) 용액 내에서 리포솜을 제조하는 단계; ii) 하나 이상의 소수성 부분을 펩티드 분자의 N- 및/또는 C-말단에 첨가하여 변형된 펩티드, 특히 변형된 항원성 펩티드를 제조하는 단계; iii) 계면활성제의 존재하에 변형된 펩티드 또는 항원성 펩티드를 가용화 하는 단계; iv) 계면활성제의 임계 미셀 농도(CMC) 미만으로 가용화된 펩티드, 및 임의로, 애쥬번트를 희석하는 단계; 및 v) 상기 펩티드, 및 임의로 상기 애쥬번트를 예비 형성된 리포솜 제제에 첨가하고 첨가된 펩티드 및 임의로 첨가된 애쥬번트를 리포솜의 외층으로 가용화하여 희석된 가용화된 펩티드 및 임의로 애쥬번트를 예비 형성된 리포솜에 로딩(loading)하는 단계를 포함하며, 특히, 예를 들어, 리포솜의 외부 지질 표면상에서 반응물을 커플링하거나 페길화된 펩티드를 사용함에 의해 화학 반응 또는 추가의 분자 변형의 도움 없이 수행된다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 방법에 관한 것이며, 여기에서 가용화된 펩티드, 특히 가용화된 항원성 펩티드, 및, 임의로, 가용화된 애쥬번트의 희석은 펩티드 및, 임의로, 애쥬번트를 예비 형성된 리포솜을 함유하는 리포솜 용액에 첨가하는 공정에서 일어난다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 방법에 관한 것이며, 여기에서 가용화된 펩티드, 특히 가용화된 항원성 펩티드, 및, 임의로, 가용화된 애쥬번트를 함유하는 용액은 50% 미만, 특히 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%의 임계 미셀 농도(CMC)의 계면활성제가 되도록 희석된다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체의 제조 방법에 관한 것이며, 여기에서 단계 v)의 예비 형성된 리포솜은 본 명세서에서 기술된 바의 하나 이상의 상이한 희석된 가용화된 펩티드, 특히 가용화된 항원성 펩티드 및/또는 애쥬번트로 로딩된다.
한 실시 양태에서, 본 발명은, 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체의 제조 방법에 관한 것이며, 여기에서 펩티드는 예를 들어 옥틸-베타-D-글루코피라노시드(B-OG) 또는 트윈(Tween)-20과 같은 음이온, 양이온, 비이온 및 쯔비터이온 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 세제(detergent)를 제제에 첨가함으로써 예비 형성된 리포솜에 첨가하기 전 가용화된다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 예비 형성된 리포솜이 애쥬번트로 로딩된, 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 방법에 관한 것이다. 한 실시 양태에서, 애쥬번트는 리포솜의 형성 후에 예비 형성된 리포솜에 첨가될 수 있으며, 즉, 우선 희석된 가용화된 항원성 펩티드가 예비 형성된 리포솜 제제에 첨가되고, 이어서 애쥬번트, 특히 가용화된 애쥬번트가 첨가된다. 대안적으로, 우선 애쥬번트, 특히 가용화된 애쥬번트가 예비 형성된 리포솜 제제에 첨가될 수 있고, 이어서, 또는 함께, 희석된 가용화된 항원성 펩티드가 첨가될 수 있다.
본 발명은 희석된 가용화된 항원성 펩티드를 리포솜에 로딩 (a) 전; (b) 함께; 또는 (c) 후에 애쥬번트 로딩이 수행되는, 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
본 발명의 한 실시 양태에서, 2 이상의 타입의 리포솜이 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 방법 내에서 조합 및 사용될 수 있다. 비제한적 실시예로서, 리포솜의 두 개체군(population), 즉 항원성 펩티드를 함유하는 리포솜을 포함하는 한 개체군 및 애쥬번트 만을 함유하는 리포솜을 포함하는 또 다른 개체군이 포유동물의 면역 반응 유도를 위해 혼합될 수 있다.
한 대안적 실시 양태에서, 상이한 항원성 펩티드 및/또는 애쥬번트를 포함하는 리포솜의 상이한 개체군이 혼합될 수 있다. 예를 들어, 리포솜의 한 개체군은 예를 들어, 애쥬번트가 있거나 없는 타우 단백질 단편과 같은 제1 항원성 펩티드를 그의 외부 표면상에서 함유하는 리포솜을 포함할 수 있고, 한편 리포솜의 제2 개체군은 예를 들어, 애쥬번트가 있거나 없는 베타-아밀로이드 펩티드 단편과 같은 제2의 상이한 항원성 펩티드를 함유하는 리포솜을 포함할 수 있다. 리포솜의 제3 개체군은 애쥬번트 만을 함유하는 리포솜을 포함할 수 있다.
한 실시 양태에서, 본 방법은 사이징(sizing) 단계, 특히 균질화(homogenisation), 압출, 미세유체역학(microfluidics) 및 초음파(sonification)로 이루어진 군으로부터 선택된 방법; 또는 이들 방법의 조합을 포함하는 사이징 단계를 포함한다.
본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 방법 내에서 제조한 리포솜 입자의 사이징은 균질화 및 압출을 포함하며, 이것은 상기 사이징 방법 내에서 서로 독립적으로 수행되거나 또는 한 단계로 재개될 수 있다. 더욱이, 리포솜 입자의 사이징은 또한 미세유체역학 및 초음파를 포함할 수 있으며, 이것은 독립적으로 또는 또 다른 입자 사이징 방법과 조합하여 사용될 수 있다.
리포솜은 300nm 미만, 특히 250nm 미만, 특히 200nm 미만의 크기이다.
특히, 리포솜은 20nm 내지 300nm의 크기 범위, 특히 40nm 내지 250nm의 크기 범위, 특히 50nm 내지 200nm의 크기 범위, 특히 100nm 내지 200nm의 크기 범위이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 애쥬번트가 지질 A, 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A와 같은 해독된(detoxified) 지질 A, 알룸, Pam2CSK4, Pam3CSK4, Pam3CAG, 사포닌, CpG, 지질화된(lipidated) CpG, 양이온성 지질, 지질화된 CpG, 포스포로티오에이트화된(phosphorothioated) PS-CpG-ODNs, CpG-A, CpG-B 또는 CpG-C와 같은 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG-ODN)로 이루어진 군으로부터 선택된 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 추가의 애쥬번트는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 인산 알루미늄 또는 수산화 알루미늄(Al(OH)3, AlPO4), 칼슘, 철 또는 지르코늄 염, QuilA, QS-21, 트레할로스 디마이콜레이트(TDM), 리포테이코산(황색포도상구균(Staphylococcus aureus)으로부터 정제됨), DDAB(디메틸디옥타데실암모늄(브롬화물염)), MF59, L18-MDP 및 B30-MDP(소수성 무라밀-디펩티드 유도체), C12-iE-DAP(디아미노-피멜산)이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 재구성된 펩티드, 특히 그의 소수성 부분을 통해 지질 이중층에 삽입된 재구성된 항원성 펩티드가 리포솜의 외부 표면상에 존재하는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 방법에 관한 것이다.
특히, 그의 소수성 부분을 통해 지질 이중층에 삽입된 100%의 재구성된 펩티드, 특히 재구성된 항원성 펩티드가 리포솜의 표면상에 존재한다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 펩티드, 특히 항원성 펩티드가 지방산, 트리글리세리드, 디글리세리드, 스테로이드, 스핑고지질, 당지질 또는 인지질의 첨가에 의해 변형된 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 방법에 관한 것이다.
특히, 펩티드, 특히 항원성 펩티드는 지방산, 특히 탄소수 6이상의 탄소 주쇄(back bone)를 갖는 지방산의 첨가에 의해 변형된다.
특정 실시 양태에서, 소수성 부분은 팔미트산이다.
여전히 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 펩티드, 특히 항원성 펩티드가 지질화된 폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 지질화된 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 페길화(pegylation)를 통해 더 변형된 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 방법에 관한 것이다.
특히, 폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 폴리에틸렌 글리콜은 8 내지 150,000, 특히 10 내지 80,000, 특히 10 내지 10,000 또는 8 내지 5000, 특히 2-1000, 특히 5-500, 특히 10-200의 에틸렌 옥사이드 부분을 포함한다.
특히, PEG 사슬은 n = 45 이하의 에틸렌 옥사이드 부분, 특히 n = 5 내지 n = 40, 특히 더 n = 10 내지 n = 30, 및 더욱더 특히 n = 10 에틸렌 옥사이드 부분을 함유한다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 펩티드, 특히 항원성 펩티드가 공유 결합된 팔미토일화된 아미노산 잔기, 특히 펩티드의 N- 또는 C-말단, 특히 펩티드의 N- 및 C-말단에 공유 결합된 2 내지 4, 보다 특히 4개의 잔기에 의해 변형되는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 방법에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 펩티드, 특히 항원성 펩티드는, 4의 팔미토일화된 아미노산 잔기에 의해 변형되며, 이들 중 둘은 각각 펩티드의 N- 및 C-말단에 공유 결합된다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 70% 이상의 재구성된 항원성 펩티드가 리포솜의 외부 표면상에 존재하며, 상기 펩티드가 예를 들어 리포솜의 외부 지질 표면상에서 반응물을 커플링하여, 또는 페길화된 펩티드의 사용에 의해 임의의 화학 반응 또는 추가의 분자 변형의 도움 없이 그의 소수성 부분을 통해 지질 이중층으로 삽입되는 전술한 실시 양태에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 리포솜 내에서 재구성된 소수성 부분을 통해 변형된 관심의 펩티드, 특히 관심의 항원성 펩티드를 포함하는 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체에 관한 것이다.
펩티드, 특히 항원성 펩티드는, 리포솜 이중층의 (인)지질과의 약한 상호 작용으로 진입하지만, 리포솜 이중층의 임의의 구성성분과 강한 공유 화학 결합은 형성 하지 않는 그의 소수성 또는 친유성 신장(extension)을 통해 리포솜의 지질 이중층 내에서 고정화(anchored) 및 안정화된다.
특히, 본 발명은 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 재구성된 펩티드, 특히 재구성된 항원성 펩티드가 리포솜의 표면상에 존재하는 전술한 실시 양태의 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 적어도 80%의 재구성된 펩티드, 특히 재구성된 항원성 펩티드가 리포솜의 외부 표면상에 존재하는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 적어도 85%의 재구성된 펩티드, 특히 재구성된 항원성 펩티드가 리포솜의 외부 표면상에 존재하는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 적어도 90%의 재구성된 펩티드, 특히 재구성된 항원성 펩티드가 리포솜의 외부 표면상에 존재하는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 적어도 100%의 재구성된 펩티드, 특히 재구성된 항원성 펩티드가 리포솜의 외부 표면상에 존재하는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 상기 항원성 구조체가 리포솜 내에서 재구성된 애쥬번트를 포함하는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 리포솜 기반 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 재구성된 애쥬번트가 리포솜의 외부 표면상에 존재하는 전술한 실시 양태의 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 적어도 80%의 재구성된 애쥬번트가 리포솜의 외부 표면상에 존재하는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 적어도 85%의 재구성된 애쥬번트가 리포솜의 외부 표면상에 존재하는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 적어도 90%의 재구성된 애쥬번트가 리포솜의 외부 표면상에 존재하는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 적어도 100%의 재구성된 애쥬번트가 리포솜의 외부 표면상에 존재하는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 애쥬번트가 지질 A, 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A와 같은 해독된 지질 A, 알룸, Pam3CSK4, Pam3CAG 또는 CpG, 지질화된 CpG, 포스포로티오에이트화된 PS-CpG-ODNs, CpG-A, CpG-B 또는 CpG-C와 같은 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG-ODN)로 이루어진 군으로부터 선택된 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 항원성 구조체에 관한 것이다. 또한 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 애쥬번트는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 인산 알루미늄 또는 수산화 알루미늄(Al(OH)3, AlPO4), 칼슘, 철 또는 지르코늄 염, QuilA, QS-21, 트레할로스 디마이콜레이트(TDM), 리포테이코산(황색포도상구균(Staphylococcus aureas)으로부터 정제됨), DDAB(디메틸디옥타데실암모늄(브롬화물염)), MF59, L18-MDP 및 B30-MDP(소수성 무라밀-디펩티드 유도체), C12-iE-DAP(디아미노-피멜산)이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 펩티드, 특히 항원성 펩티드가 지방산, 트리글리세리드, 디글리세리드, 스테로이드, 스핑고지질, 당지질 또는 인지질, 특히 탄소 원자 6 이상의 탄소 주쇄를 갖는 지방산, 그러나 특히 팔미트산의 첨가에 의해 변형된 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 펩티드, 특히 항원성 펩티드가 지질화된 폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 지질화된 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 페길화를 통해 변형된 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체에 관한 것이다.
특히, 폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 폴리에틸렌 글리콜은 8 내지 150,000, 특히 10 내지 80,000, 특히 더 10 내지 10,000 또는 8 내지 5000, 특히 2-1000, 특히 5-500, 특히 10-200의 에틸렌 옥사이드 부분을 포함한다. 특히, PEG 사슬의 길이는 n = 45 이하, 특히 n = 5 내지 n = 40, 특히 더 n = 10 내지 n = 30, 및 더욱더 특히 n = 10 에틸렌 옥사이드 부분이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 펩티드, 특히 항원성 펩티드가 공유 결합된 팔미토일화된 아미노산 잔기, 특히 펩티드의 N- 또는 C-말단, 특히 펩티드의 N- 및 C-말단에 공유 결합된 2 내지 4, 보다 특히 4개의 잔기에 의해 변형되는 전술한 실시 양태 중 어느 하나의 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 전술한 실시 양태 중 어느 하나에 따른 펩티드, 특히 항원성 펩티드는, 4의 팔미토일화된 아미노산 잔기에 의해 변형되며, 이들 중 둘은 각각 펩티드의 N- 및 C-말단에 공유 결합된다.
여전히 본 발명의 또 다른 실시 양태에서 조성물은 전술한 실시 양태 중 어느 하나에 따른 구조체, 특히 항원성 구조체를 포함하는 조성물이 제공된다.
한 실시 양태에서, 전술한 실시 양태의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 캐리어와 함께 치료적 유효량의 본 발명의 구조체, 특히 항원성 구조체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
리포솜은 종양 또는 염증이 생긴 조직과 같은 질환 부위에서 "활성(active)" 약물의 선택적 표적화를 성취하기 위한 목적을 갖는 약물의 전달 시스템으로 사용될 수 있다. 리포솜이 선택적으로 이들에 결합하는 표적 세포를 인식할 수 있고, 및 이들 세포에 의해 내재화(internalized) 되거나 또는 효소 가수분해 또는 초음파 조사와 같은 공정에 의해 분해(broken down)되어 표적 세포에 의해 흡수될 수 있도록 세포 표면 근처에 약물을 방출하기 위해 선택적 표적화는 리포솜 표면상에 표적화 디바이스(항체, 수용체 리간드, 등)가 필요하다
본 발명의 한 실시 양태에서, 약제학적 조성물은 펩티드가 표적화 기능을 가지며 항체 또는 그의 기능 부분, 수용체 리간드, 또는 항원, 수용체, 특정 조직 또는 특정 세포 타입을 인식 및 결합할 수 있는 다른 펩티드에 의해 나타낼 수 있는 전술한 실시 양태 중 어느 하나에 따른 구조체를 포함한다.
본 발명의 한 양상에서, 본 발명에 따라 및 본 명세서에서 기술된 바의 리포솜 기반 구조체 내에서 피포되어 제공된 활성 약물은 예를 들어, 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 또는 룰토테칸(lurtotecan)과 같은 세포독성 약물, 암포테리신 B와 같은 항진균 약물, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 전신 적용을 위한 플라스미드 DNA(pDNA), RNA와 같은 핵산 기반(nucleic acid-based) 약물, 또는 예를 들어, 라파마이신(rapamycin), 파클리탁셀, 악티노마이신 D(actinomycin D), C-Myc 안티센스, 덱사메타손(dexamethasone), 또는 매트릭스 메탈로프로테이나제 저해제와 같은 염증 또는 혈관재협착(restenosis)의 예방에 적당한 약물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 본 발명에 따라 및 본 명세서에서 기술된 바의 리포솜 기반 구조체 내에서 피포되어 제공된 활성 약물은 피포된 헤모글로빈과 같은 인조 산소 캐리어일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 전술한 실시 양태에 따른 구조체 또는 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 포유 동물의 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다.
여전히 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 전술한 실시 양태에 따른 항원성 구조체 또는 조성물을 포유동물에게 투여하고 상기 포유동물에 의해 생성된 항체를 단리하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 이 방법은 면역화된 포유동물로부터 수득된 비장 세포로부터 하이브리도마 세포를 제조하는 단계 및 상기 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체를 단리하는 단계를 더 포함한다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 전술한 실시 양태 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조된 항체, 특히 다중 클론 또는 단일 클론 항체에 관한 것이다.
대안적 실시 양태에서, 본 발명은 포유동물, 특히 인간의 치료적 또는 예방적 처치를 위해, 특히 포유동물, 특히 인간의 치료적 또는 예방적 백신 접종(vaccination)을 위한 전술한 실시 양태 중 어느 하나에 따른 구조체, 특히 항원성 구조체, 조성물 또는 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 특정 실시 양태에서, 전술한 실시 양태에 따른 구조체, 특히 항원성 구조체, 조성물 또는 항체는 감염 질환, CNS-관련 질환, 종양학 또는 알레르기 분야의 질환 및 장애, 또는 염증과 관련된 질환, 장애 또는 상태, 특히 단백질병증(proteopathy), 단백질 미스폴딩을 포함하는 질환 및/또는 단백질 축적 또는 응집을 포함하는 질환과 관련된 질환, 장애 또는 상태를 앓고 있는 포유동물, 특히 인간, 특히 포유동물 또는 인간의 치료적 또는 예방적 처치, 특히 치료적 또는 예방적 백신 접종에 사용될 수 있다.
여전히 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 질환, 장애 또는 상태, 특히 감염 질환, CNS-관련 질환, 또는 종양학 또는 알레르기 분야의 질환 및 장애, 또는 염증, 특히 단백질병증과 관련된 질환 또는 장애, 단백질 미스폴딩을 포함하는 질환 및/또는 단백질 축적 또는 응집을 포함하는 질환과 관련된 질환, 장애 또는 상태의 탐지 또는 진단을 위한 방법에서 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 질환 또는 장애, 특히 감염 질환, CNS-관련 질환, 또는 종양학 또는 알레르기 분야의 질환 및 장애, 또는 염증, 특히 단백질병증과 관련된 질환 또는 장애, 단백질 미스폴딩을 포함하는 질환 및/또는 단백질 축적 또는 응집을 포함하는 질환과 관련된 질환, 장애 또는 상태의 탐지 또는 진단을 위한 방법에 사용되는 본 발명의 항체를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 캐리어와 함께 치료적 유효량의 본 발명의 리포솜 기반 구조체, 특히 리포솜 기반 항원성 구조체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
적당한 약제학적 캐리어, 희석제 및/또는 부형제는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어, 인산염 완충 염수 용액, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 타입의 습윤제, 무균 용액, 등을 포함한다.
그와 함께 생성된 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체는 공지 기술을 사용하여 생리학적으로 허용 가능한 제형 내에서 제조될 수 있으며 약제학적으로 허용 가능한 캐리어, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기능적으로 동등한 항체 또는 그의 기능 부분을 포함하는 그와 함께 생성된 항체들, 특히 본 발명의 단일 클론 항체들을 포함하는 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체는 약제학적으로 허용 가능한 캐리어, 희석제 및/또는 부형제와 조합되어 치료 조성물을 형성한다. 적당한 약제학적 캐리어, 희석제 및/또는 부형제는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 인산염 완충 염수 용액, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 타입의 습윤제, 무균 용액, 등을 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제형(formulation)은 당업자에게 알려진 표준 방법론에 따라 성취될 수 있다.
본 발명의 조성물은 적당한, 약제학적 유효량(effective dose)으로 고체, 액체 또는 에어로졸의 형태로 대상에 투여될 수 있다. 고체 조성물의 예는 환제(pill), 크림, 및 이식형 (implantable) 투약 단위(dosage units)를 포함한다. 환제는 경구 투여될 수 있다. 치료 크림은 국소적으로 투여될 수 있다. 이식형 투약 단위는 예를 들어, 종양 부위에 국부적으로 투여될 수 있거나, 또는 치료 조성물의 체계적 방출을 위해, 예를 들어, 피하로 이식될 수 있다. 액체 조성물의 예는 근육내, 피하, 정맥내, 동맥내 주사에 적합한 제형 및 국소 및 안내(intraocular) 투여용 제형을 포함한다. 에어로졸 제형의 예는 폐 투여용 흡입 제형을 포함한다.
조성물은 표준 투여 경로로 투여될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 국소, 경구, 직장, 코, 피내(interdermal), 복막내, 또는 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하(subcutaneous), 또는 근육내) 경로로 투여될 수 있다.
또한, 조성물은 생분해성 중합체와 같은 서방성(sustained release) 매트릭스로 혼입될 수 있으며, 중합체는 전달이 요구되는 근처에, 예를 들어, 종양 부위에 이식된다. 그 방법은 일회량(single dose)의 투여, 소정 시간 간격에서 반복량(repeated doses)의 투여, 및 소정 시간 동안 지속적인 투여를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바의 서방성 매트릭스는 효소 또는 산/염기 가수분해에 의해 또는 용해에 의해 분해될 수 있는 물질, 일반적으로 중합체로 만들어진 매트릭스이다. 일단 체내에 삽입되면, 매트릭스는 효소 및 체액(body fluids)에 의해 작용 된다. 서방성 매트릭스는 바람직하게는 생체 적합성 물질 예컨대 리포솜, 폴리락타이드(폴리락타이드산), 폴리글리콜라이드(글리콜산의 중합체), 폴리락타이드 코-글리콜라이드(락트산 및 글리콜산의 공중합체), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 술페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 이소로이신, 폴리뉴클레오타이드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘에 의해 선택된다. 바람직한 생분해성 매트릭스는 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 또는 폴리락타이드 코-글리콜라이드(락트산 및 글리콜산의 공중합체)중 하나의 매트릭스이다.
조성물의 투약은 예를 들어, 치료될 상태, 사용된 특정 조성물, 및 기타 임상 요인 예컨대 환자의 체중, 크기, 성별 및 일반적 건강 상태, 체표면적(body surface area), 투여될 특정 화합물 또는 조성물, 동시에 투여되는 기타 약물, 및 투여 경로와 같은 다양한 요인에 의존될 것이다 라는 것은 당업자에게 공지되어 있는 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 예를 들어, 단백질병증, 단백질 미스폴딩을 포함하는 질환 및 단백질 축적 또는 응집을 포함하는 질환, 타우증(tauopathies) 및/또는 아밀로이드증(amyloidoses), 알츠하이머병을 포함하는 아밀로이드 β 단백질과 같은 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 연관된 질환 및 장애의 군의 약물 치료에 사용되는 공지 화합물과 같은 생물학적 활성 물질 또는 화합물을 포함하는 기타 조성물과 조합하여 투여될 수 있다.
기타 생물학적 활성 물질 또는 화합물은 본 발명에 따른 치료 조성물과 동일하거나 또는 유사한 메카니즘에 의해 또는 관련되지 않은 작용 메카니즘에 의해 또는 다수의 관련된 및/또는 관련되지 않은 작용 메카니즘에 의해 그의 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 기타 생물학적 활성 물질 또는 물질들과 동시에, 간헐적으로 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 첫 번째 부가적인 생물학적 활성 물질과 동시에 투여될 수 있거나 또는 약제학적 조성물의 투여 전 또는 후에 연속적으로 투여될 수 있다. 적용 계획(application scheme)이 하나 이상의 본 발명에 따른 약제학적 조성물과 함께 하나 이상의 추가의 생물학적 활성 물질이 투여되도록 선택된다면, 화합물 또는 물질은 다양한 조합으로 동시에, 부분적으로 연속적으로 부분적으로 투여될 수 있다.
일반적으로, 기타 생물학적 활성 화합물은 중성자-전송 증강제(neutron-transmission enhancers), 정신치료 약물, 아세틸콜린 에스테라아제 저해제, 칼슘-채널 차단제, 생체 아민, 벤조디아제핀 신경안정제(tranquillizers), 아세틸콜린 합성, 저장 또는 방출 증강제, 아세틸콜린 시냅스 후 수용체 작용제(acetylcholine postsynaptic receptor agonist), 모노아민 옥시다아제-A 또는 -B 저해제, N-메틸-D-아스파테이트 글루타메이트 수용체 길항제, 비스테로이드 항염증 약물, 항산화제, 및 세로토닌성 수용체 길항제를 포함할 수 있다.
특히, 생물학적 활성제 또는 화합물은 그와 함께 생성된 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편, 및, 임의로, 약제학적으로 허용 가능한 캐리어 및/또는 희석제 및/또는 부형제 및 질환의 치료를 위한 설명서를 포함하는 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체와 함께, 산화 스트레스에 대한 화합물, 항세포사멸(anti-apoptotic) 화합물, 금속 킬레이트제, 피렌제핀 및 대사산물과 같은 DNA 복구 저해제, 3-아미노-1-프로판술폰산(3APS), 1,3-프로판디술포네이트(1,3PDS), 세크레타아제 활성제, [베타]- 및 7-세크레타아제 저해제, 타우 단백질, 신경 전달 물질(neurotransmitter), β-시트 파괴제(β-sheet breakers), 항염증 분자(antiinflammatory molecules), 예컨대, 클로자핀(clozapine), 지프라시돈(ziprasidone), 리스페리돈(risperidone), 아리피프라졸(aripiprazole) 또는 올란자핀(olanzapine)과 같은 "비정형 항정신병제(atypical antipsychotics)" 또는 타크린, 리바스티그민(rivastigmine), 도네페질(donepezil), 및/또는 갈란타민(galantamine)과 같은 콜린에스테라아제 저해제(ChEls) 및 예컨대 비타민 B12, 시스테인, 아세틸콜린의 전구체, 레시틴, 콜린, 징코 빌로바(Ginkgo biloba), 아세틸-L-카르니틴, 이데베논(idebenone), 프로펜토파일린(propentofylline), 또는 크산틴 유도체와 같은 기타 약물 및 영양 보조제(nutritive supplement)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
추가의 실시 양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 그와 함께 생성된 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편, 및, 임의로, 약제학적으로 허용 가능한 캐리어 및/또는 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체와 함께, 니아신(niacin) 또는 메만틴(memantine)을 포함할 수 있다.
여전히 본 발명의 또 다른 실시 양태에서 조성물은 그와 함께 생성된 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편, 및, 임의로, 약제학적으로 허용 가능한 캐리어 및/또는 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체와 함께, 환각(hallucinations), 망상(delusions), 사고 장애(thought disorders)(뚜렷한 모순(incoherence), 탈선(derailment), 탈선사고(tangentiality)에 의해 명백해진), 및 기괴한(bizarre) 또는 문란한 (disorganized) 행위, 뿐만 아니라 무쾌감증(anhedonia), 침체된 정동(flattened affect), 무감동(apathy), 및 사회적 위축(social withdrawal)을 포함하는 양성 및 음성 정신병 증상(positive and negative psychotic symptoms)의 치료를 위한 클로자핀(clozapine), 지프라시돈(ziprasidone), 리스페리돈(risperidone), 아리피프라졸(aripiprazole) 또는 올란자핀(olanzapine)과 같은 "비정형 항정신병제(atypical antipsychotics)" 를 포함하는 것이 제공된다.
본 발명에 따른 결합 펩티드 이외에 조성물에 적당히 사용될 수 있는 기타 화합물은, 예를 들어, 치료 약물 표적(36-39쪽), 알칸술폰산 및 알칸올황산(39-51쪽), 콜린에스테라아제 저해제(51-56쪽), NMDA 수용체 길항제(56-58쪽), 에스트로겐(58-59쪽), 비스테로이드 항염증 약물(60-61쪽), 항산화제(61-62쪽), 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체(peroxisome proliferators-activated receptor)(PPAR) 작용제(63-67쪽), 콜레스테롤 저하제(68-75쪽); 아밀로이드 저해제(75-77쪽), 아밀로이드 형성 저해제(77-78쪽), 금속 킬레이트제(78-79 쪽), 항정신병제 및 항우울제(80-82쪽), 영양 보조제(83-89쪽) 및 뇌(89-93쪽 참조) 및 프로드러그(93 및 94 쪽)에서 생물학적 활성 물질의 유용성을 향상시키는 화합물을 포함하는 WO 2004/058258호(특히 16 및 17쪽 참조)에 개시된 것이며, 본 명세서에서 이 문헌을 참고로, 그러나 특히 상기 지시된 쪽에서 언급된 화합물을 혼입하였다.
조성물의 투약은 치료될 상태, 사용된 특정 조성물, 및 기타 임상 요인 예컨대 환자의 체중, 크기 및 상태, 체표면적, 투여될 특정 화합물 또는 조성물, 동시에 투여될 기타 약물, 및 투여 경로에 의존될 것이다.
단백질성 약제학적 활성 물질은 복용량 당 1ng내지 10mg의 양으로 존재할 수 있다. 일반적으로, 투여 요법은 0.1㎍ 내지 10mg의 본 발명에 따른 항체, 특히 1.0㎍ 내지 1.0mg 범위, 및 특히 더 1.0㎍ 내지 100㎍ 범위이어야 하며, 이들 범위에 포함되는 모든 개별 숫자도 또한 본 발명의 부분이다. 투여가 연속 주입(infusion)을 통해 일어난다면, 더 적절한 투약은 시간당 kg 체중당 0.01㎍ 내지 10mg 단위의 범위일 수 있으며, 이들 범위에 포함되는 모든 개별 숫자도 또한 본 발명의 부분이다.
본 발명의 특정 실시 양태에서, 치료적 유효량의 전술한 실시 양태에 따른 항원성 구조체 또는 상기 항원성 구조체를 포함하는 조성물은, 반복량으로, 특히 1 내지 15의 반복량, 특히 더 2 내지 10의 반복량, 특히 더 3 내지 5의 반복량 및 더욱더 특히 3의 반복량으로, 1주 내지 20주의 시간 간격, 특히 1 내지 10주의 시간 간격, 특히 1 내지 6주의 시간 간격, 특히 더 1 내지 4주의 시간 간격, 및 더욱더 특히 2 내지 3주의 시간 간격에서 투여된다. 면역 반응은 부스팅(boosting)후 적당한 시간에서, 특히 부스팅 후 3 내지 10일, 특히 더 부스팅 후 4 내지 8일 및 특히 더 부스팅 후 7일에 혈청/혈장 샘플을 취하고 및 특히 예를 들어, ELISA 분석과 같은 일반적으로 사용되는 면역학적 분석(immunoassay)중 하나인 공지의 방법론을 사용하여 항원성 구조체의 면역원성을 측정하여 모니터할 수 있다.
투여는 일반적으로 비경구, 예컨대 정맥 내일 것이다. 비경구 투여를 위한 제제는 무균 수성 또는 비수성 용액을 포함한다. 조성물의 투약은 치료될 상태, 사용된 특정 조성물, 및 환자의 체중, 크기 및 상태와 같은 기타 임상 요인, 체표면적, 투여될 특정 화합물 또는 조성물, 동시에 투여될 기타 약물, 및 투여 경로 에 의존될 것이다.
비수성 용매는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성유, 및 올레산에틸(ethyl oleate)과 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 수성 용매는 물, 알콜/수성 용액, 에멀젼 또는 염수 및 완충 매질을 포함하는 현탁액으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 비경구 비히클은 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트 링거(lactated Ringer's), 또는 고정유(fixed oils)를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체(fluid) 및 영양소 보충물, 전해질 보충물(예컨대, 링거 덱스트로스 기반의 것) 등을 포함한다. 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스, 등과 같은 보존제(preservatives)도 또한 존재할 수 있다.
약제학적 조성물은 예를 들어, 특히 인간 기원의 혈청 알부민 또는 면역글로불린과 같은 단백질성 캐리어를 더 포함할 수 있다. 또한 생물학적 활성제는 의도하는 용도에 따라 본 발명의 약제학적 조성물에 존재할 수 있다.
결합 표적이 뇌에 위치할 때, 본 발명의 특정 실시 양태는 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 횡단하는 그와 함께 생성된 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체를 제공한다. 특정 신경 퇴행성(neurodegenerative) 질환은 그와 함께 생성된 항체들, 특히 단일 클론 항체들 또는 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체가 뇌에 용이하게 도입될 수 있도록, 혈액-뇌 장벽의 투과성 증진과 연관된다. 혈액-뇌 장벽이 무손상으로 남아 있을 때, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 물리적 방법, 지질-기반 방법(lipid-based methods), 및 수용체 및 채널-기반(receptor and channel-based) 방법을 포함하는 그것을 횡단하는 분자를 운반하기 위한 몇몇 당업계의 공지 접근법이 존재한다.
혈액-뇌 장벽을 횡단하는 그와 함께 생성된 항체들, 특히 단일 클론 항체들 또는 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체를 운반하는 물리적 방법은 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 혈액-뇌 장벽을 완전히 포위하거나, 또는 혈액-뇌 장벽에 개구부를 만드는 것을 포함한다. 포위(circumvention) 방법은, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 뇌에 직접 주사하는 것(예컨대, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406(2002) 참조) 및 뇌에 전달 디바이스를 이식하는 것(예컨대, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595(2003); 및 Gliadel Wafers(TM), Guildford Pharmaceutical)을 포함한다. 장벽에 개구부를 만드는 방법은, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 초음파(예컨대, 미국 특허 공보 제2002/0038086호 참조), 삼투압(예컨대, 고장성 만니톨(hypertonic mannitol)의 투여에 의함(Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y.(1989))), 예컨대, 브래드키닌(bradykinin)에 의한 투과화(permeabilization) 또는 투과제(permeabilizer) A-7(예컨대, 미국 특허 제 5,112,596호, 제5,268,164호, 제5,506,206호, 및 제5,686,416호 참조), 및 결합 펩티드 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터로 혈액-뇌 장벽을 스트래들(straddle)하는 뉴런의 트랜스펙션(transfection)(예컨대, 미국 특허 제2003/0083299호 참조)을 포함한다.
혈액-뇌 장벽을 횡단하는, 그와 함께 생성된 항체들, 특히 단일 클론 항체들 또는 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체를 운반하는 지질 기반 방법은, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 혈액-뇌 장벽의 맥관 내피 상에서 수용체에 결합하는 활성 단편에 커플링되는 리포솜 내의 상기 분자의 피포화(encapsulating)(예컨대, 미국 특허 출원 공보 제20020025313호 참조), 및 저밀도 리포단백질 입자(예컨대, 미국 특허 출원 공보 제20040204354호 참조) 또는 아포리포 단백질 E(예컨대, 미국 특허 출원 공보 제20040131692호 참조)에서 그와 함께 생성된 항체들, 특히 단일 클론 항체들 또는 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체의 코팅을 포함한다.
혈액-뇌 장벽을 횡단하는 그와 함께 생성된 항체들, 특히 단일 클론 항체들 또는 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체를 운반하는 수용체 및 채널-기반 방법은, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증진하기 위한 글루코코르티코이드 차단제의 사용(예컨대, 미국 특허 출원 공보 제2002/0065259호, 제2003/0162695호, 및 제2005/0124533호 참조); 칼륨 채널의 활성화(예컨대, 미국 특허 출원 공보 제2005/0089473호 참조), ABC 약물 운반체의 저해화(예컨대, 미국 특허 출원 공보 제2003/0073713호 참조), 트랜스페린을 사용한 항체의 코팅 및 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성 조절(예컨대, 미국 특허 출원 공보 제2003/0129186호 참조), 및 항체의 양이온화(예컨대, 미국 특허 제5,004,697호 참조)를 포함한다.
추가의 실시 양태에서 본 발명은 질환, 장애 또는 상태, 특히 감염 질환, CNS-관련 질환, 또는 종양학 또는 알레르기 분야의 질환 및 장애와 관련된 질환, 장애 또는 상태, 특히 단백질병증, 단백질 미스폴딩을 포함하는 질환 및/또는 단백질 축적 또는 응집을 포함하는 질환과 관련된 질환, 장애 또는 상태의 탐지 및 진단을 위한 방법 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명에 따른 리포솜 기반 항원성 구조체 또는 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 조성물로 처치하는, 질환, 장애 또는 상태, 특히 감염 질환, CNS-관련 질환, 또는 종양학 또는 알레르기 분야의 질환 및 장애와 관련된 질환, 장애 또는 상태, 특히 단백질병증, 단백질 미스폴딩을 포함하는 질환 및/또는 단백질 축적 또는 응집을 포함하는 질환과 관련된 질환, 장애 또는 상태의 소인(predisposition)을 진단하기 위한, 또는 환자의 최소 잔류 질환(minimal residual disease)을 모니터링하기 위한 또는 환자의 반응성(responsiveness)을 예측하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 이들 방법은 생물학적 샘플 또는 원위치(in situ) 상태에서 물질을 탐지(detecting) 또는 정량화(quantifying) 하기 위해 일반적으로 사용되는 공지의 면역학적 방법을 포함한다.
질환, 장애 또는 병태의 진단, 특히 감염 질환, CNS-관련 질환, 또는 종양학 또는 알레르기 분야의 질환 및 장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태의 진단, 특히 단백질병증, 단백질 미스폴딩을 포함하는 질환 및/또는 단백질 축적 또는 응집을 포함하는 질환과 관련된 질환, 장애 또는 병태의 진단 또는 대상, 특히 포유동물, 특히 더 인간에서 이러한 질환 또는 상태에 대한 소인의 진단은, 샘플 또는 원위치에서 질환의 원인이 되는 단백질 부위의 에피토프로의 본 발명에 따른 항체들, 특히 단일 클론 항체들 또는 그의 활성 단편의 면역특이적(immunospecific) 결합의 탐지에 의해 성취될 수 있으며, 이것은 샘플 또는 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체를 함유하는 것이 의심되는 특정 체 기관(specific body part) 또는 신체 영역(body area)을 상기 단백질 질환의 원인이 되는 부위의 에피토프에 결합하는 항체와 접촉하게 하고, 항체를 단백질에 결합하게 하여 면역학적 복합체를 형성하며, 면역학적 복합체의 형성을 탐지하고 및 샘플 또는 특정 체 기관 또는 면적에서 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체의 존재 또는 부재로 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 상호비교하며, 임의로 정상 대조 값에 대한 면역학적 복합체의 양을 비교하는 것을 포함하며, 여기에서 정상 대조 값과 비교된 면역학적 복합체의 양의 증진은 대상이 단백질병증, 단백질 미스폴딩을 포함하는 질환 및/또는 단백질 축적 또는 응집을 포함하는 질환과 관련된 질환 또는 상태를 앓고 있거나 또는 전개될 위험이 있다는 것을 나타낸다.
대상, 특히 포유동물, 특히 더 인간에서 최소 잔류 질환의 모니터링 후, 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명에 따른 리포솜 기반 항원성 구조체 또는 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 조성물을 사용한 치료는 본 발명에 따른 항체, 특히 단일 클론 항체 또는 그의 활성 단편의 샘플 또는 원위치에서 질환의 원인이 되는 단백질 부위의 에피토프로의 면역특이적 결합을 탐지하여 성취될 수 있으며, 이것은 샘플 또는 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체를 함유하는 것이 의심되는 특정 체 기관(body part) 또는 신체 영역(body area)을 질환의 원인이 되는 상기 단백질 부위의 에피토프에 결합하는 항체와 접촉하게 하고, 항체를 단백질에 결합하게 하여 면역학적 복합체를 형성하며, 면역학적 복합체의 형성을 탐지하고 및 샘플 또는 특정 체 기관 또는 면적에서 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체의 존재 또는 부재로 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 상호비교하며, 임의로 상기 면역학적 복합체의 양과 정상 대조 값을 비교하는 것을 포함하며, 여기에서 정상 대조 값과 비교된 상기 면역학적 복합체의 양의 증가는 대상이 여전히 최소 잔류 질환을 앓을 수 있다는 것을 나타낸다.
항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명에 따른 리포솜 기반 항원성 구조체 또는 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 조성물을 사용하여 치료한 대상, 특히 포유동물, 특히 더 인간의 반응성 예측은 결합 펩티드, 특히 단일 클론 항체 또는 그의 활성 단편의 샘플 또는 원위치에서 질환의 원인이 되는 단백질 부위의 에피토프로의 면역특이적 결합을 탐지하여 성취될 수 있으며, 이것은 샘플 또는 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체를 함유하는 것이 의심되는 특정 체 기관 또는 신체 영역을 질환의 원인이 되는 상기 단백질 부위의 에피토프에 결합하는 항체와 접촉하게 하고, 항체를 단백질에 결합하게 하여 면역학적 복합체를 형성하며, 면역학적 복합체의 형성을 탐지하고 및 샘플 또는 특정 체 기관 또는 면적에서 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체의 존재 또는 부재로 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 상호비교하며, 임의로 치료 시작 전 후의 상기 면역학적 복합체의 양을 비교하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 면역학적 복합체의 양의 감소는 상기 환자가 치료에 대한 반응성에 대하여 높은 잠재력을 갖는다는 것을 나타낸다.
특히, 앞서 본 명세서에서 보고된 진단 방법으로 탐지된 질환 또는 상태 및/또는 앞서 본 명세서에서 보고된 항원성 구조체 및/또는 항체를 사용하여 치료적 또는 예방적으로 처치된 질환 또는 상태는 특히 AA 아밀로이드증(amyloidosis), AH(중쇄(heavy chain)) 아밀로이드증, AL(경쇄(light chain)) 아밀로이드증, 알렉산더병, 알츠하이머병, 근육위축 가쪽 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 대동맥 내측(aortic medial)아밀로이드증, apoA1 아밀로이드증, apoA2 아밀로이드증, apoA4 아밀로이드증, 대동맥 내측 아밀로이드증, 카다실(CADASIL), 심장 심방 아밀로이드증(cardiac atrial amyloidosis), 백내장, 뇌 아밀로이드 혈관병증(cerebral amyloid angiopathy), 각막 락토페린 아밀로이드증(cardial lactoferrin amyloidosis), 중환자 근육병증(critical illness myopathy), 피부 태선 아밀로이드증(cutaneous lichen amyloidosis), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 투석 아밀로이드증(dialysis amyloidosis), 가족성 아밀로이드 신경병증(Familial amyloidotic neuropathy), 가족성 영국 치매(familial British dementia), 가족성 덴마크 치매(familial Danish dementia), 가족성 내장 아밀로이드증(familial visceral amyloidosis), 섬유소 아밀로이드증(fibrinogen amyloidosis), 핀란드 유전성 아밀로이드증(Finnish hereditary amyloidosis), 전측두엽 치매(frontotempporal lobar dementia), 녹내장, 아밀로이드증이 있는 유전성 뇌출혈 - 네덜란드 타입(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis-Dutch type), 아밀로이드증이 있는 유전성 뇌출혈 -아이슬란드 타입(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis-Icelandic type), 헌팅턴병 및 기타 트리플렛(triplet) 장애, 유전성 격자 각막 이영양증(hereditary lattice corneal dystrophy), 봉입체(inclusion body) 근육염 (myositis)/근육병증(myopathy), 리소자임 아밀로이드증, 말로리 바디(Mallory bodies), 갑상샘 속질 암종(medullary thyroid carcinoma), 치원(핀드보그) 종양 아밀로이드(Odontogenic(Pindborg) tumor amyloid), 파킨슨병, 뇌하수체 프로락틴분비종양(pituitary prolactinoma), 원발성 전신 아밀로이드증(primary systemic amyloidosis), 원발성 피부 아밀로이드증(primary cutaneous amyloidosis), 프리온 질환, 폐포 단백증(pulmonary alveolar proteinosis), 녹내장에서 망막 신경절 세포 변성(retinal ganglion cell degeneration in glaucoma), 프리온 질환(prion disease), 정낭 아밀로이드(seminal vesicle amyloid), 세이핀병증(seipinopathy), 노인 전신 아밀로이드증(senile systemic amyloidosis), 세르핀병증(serpinopathy), 겸상 적혈구 질환(sickle cell disease), 시누클레인병증(synucleinopathy), 타우병증(tauopathy), 및 제2형 당뇨병, 또는 염증으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 상태이다.
이러한 질환 또는 병태의 진단에, 이러한 질환 또는 상태의 소인 진단을 위해, 또는 환자의 최소 잔류 질환을 모니터링 하기 위해 또는 환자의 반응성을 예측하기 위해 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명에 따른 리포솜 기반 항원성 구조체, 또는 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 조성물로 치료하기 위해 사용될 수 있는 생물학적 샘플은, 예를 들어, 혈청, 혈장, 침(saliva), 위 분비액, 점액, 뇌척유체, 림프관 유체(lymphatic fluid) 등과 같은 유체 또는 신경(neural), 뇌, 심장 또는 맥관(vascular) 조직과 같은 유기체로부터 수득된 조직 또는 세포 샘플이다. 샘플 내에서 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체의 존재 또는 부재를 측정하기 위하여, 예를 들어, 측정을 위해 2차 시약을 사용한 간접 측정 방법을 이용한 분석, ELISA's 및 면역침전 및 응집(agglutination) 분석과 같은 당업자에게 알려진 임의의 면역학적 분석이 사용될 수 있다. 이들 분석의 상세한 기술은, 예를 들어 문헌「Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612, WO96/13590 to Maertens 및 Stuyver, Zrein et al.(1998) 및 WO96/29605」에 주어져 있다.
원위치(in situ) 진단을 위해, 본 발명의 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편 또는 그의 활성 및 기능 부분을 포함하는 본 발명에 따른 결합 펩티드는 본 발명에 따른 항체와 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체 상의 에피토프 부위와 특이적 결합이 일어날 수 있도록 예를 들어, 정맥내, 비강내, 복막내, 뇌내(intracerebral), 동맥내 주사와 같은 당업계의 공지 방법에 의해 진단될 유기체에 투여될 수 있다. 결합 펩티드/항원 복합체는 항체들, 특히 단일 클론 항체들, 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 본 발명에 따른 결합 펩티드에 부착된 표지를 통해 또는 기타 공지의 탐지 방법에 의해 편리하게 탐지될 수 있다.
항체들 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편을 포함하는 본 발명에 따른 리포솜 기반 항원성 구조체, 또는 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 조성물로 치료된 진단 적용에 또는 단백질병증, 단백질 미스폴딩을 포함하는 질환 및/또는 단백질 축적 또는 응집을 포함하는 질환을 비롯한 단백질 연관 질환 또는 상태에 대한 소인을 진단하기 위해, 또는 환자의 최소 잔류 질환을 모니터링하기 위해 또는 환자의 반응성을 예측하기 위한 적용에 사용된 면역학적 분석은 전형적으로 탐지하기 위한 표지된 항원, 결합 펩티드, 또는 2차 시약에 의존한다. 이들 단백질 또는 시약은 효소, 방사성 동위원소, 및 형광체(fluorescent), 발광체(luminescent) 및 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 콜로이드 금(colloidal gold) 및 라텍스 비드(latex beads)와 같은 착색입자를 포함하는 발색(chromogenic) 물질을 포함하여 당업자에게 일반적으로 알려진 화합물로 표지될 수 있다. 이들 중, 방사성 표지화가 거의 모든 타입의 분석 및 대부분의 변형에 사용될 수 있다. 효소-컨주게이트된 표지는 방사능을 회피하여야할 때 또는 신속한 결과가 필요할 때 특히 유용하다. 형광색소(fluorochromes)는 이들의 사용을 위해 고가의 장치가 필요하지만, 매우 정밀한 탐지 방법을 제공한다. 이들 분석에서 유용한 결합 펩티드는 항체들, 특히 단일 클론 항체들, 다중클론 항체들, 및 친화성의 정제된 다중클론 항체들을 포함하는 것으로 본 명세서에서 개시되고 청구된 것이다.
대안적으로, 본 발명의 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편은, 단백질 A 또는 G 와 같은 면역글로불린 또는 제2 항체들에 대한 친화성을 갖는 표지화된 물질과의 반응에 의해 간접적으로 표지화될 수 있다. 본 발명에 따른 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편은, 제2 물질과 컨주게이트될 수 있고 항체에 컨주게이트된 제2 물질에 대한 친화성을 갖는 표지화된 제3 물질로 탐지될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체들, 특히 단일 클론 항체들 및 그의 활성 단편은 비오틴에 컨주게이트될 수 있고 및 결합 펩티드/비오틴 컨주게이트는 표지화된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 사용하여 탐지될 수 있다. 유사하게, 결합 펩티드는 합텐에 컨주게이트될 수 있고 및 결합 펩티드/합텐 컨주게이트는 표지화된 항-합텐 결합 펩티드를 사용하여 탐지될 수 있다.
당업자는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 이들 및 기타 적당한 표지(labels)를 알 것이다. 항체 또는 그의 단편으로의 이들 표지의 결합은 당업자에게 통상적으로 알려진 표준 기술을 사용하여 성취될 수 있다. 전형적인 기술이 케네디,제이. 에이치(Kennedy,J.H.) 등에 의한 문헌 「1976(Clin. Chim. Acta 70:1-31)」, 및 슈어, 에이.에이치.더블유.엠.(Schurs, A.H.W.M.) 등에 의한 문헌「1977(Clin. Chim Acta 57:1-40)」에 기술되어 있다. 후자에서 언급된 커플링 기술은 글루타르알데히드 방법, 과요오드산염 방법, 디말레이미드 방법, 및 기타 방법이 있으며, 이들 모두는 본 명세서에서 참고로 혼입된다.
현재의 면역학적 분석은 분석물의 존재를 탐지하기 위한 이중 항체 방법을 이용하고 있으며, 항체는 탐지할 수 있는 표지로 표지화된 제2 항체와의 반응성에 의해 간접적으로 표지화된다. 제2 항체는 단일 클론 항체가 유도된 동물의 항체에 결합하는 것이 바람직하다. 다시 말해, 단일 클론 항체가 마우스 항체이면, 표지화된, 제2 항체는 항-마우스 항체이다. 본 명세서에서 기술된 분석에 사용된 항체에 대하여, 이 표지는 바람직하게는 항체-피복된 비드, 특히 자성 비드이다. 본 명세서에서 기술된 면역학적 분석에 사용된 항체에 대하여, 표지는 바람직하게는 방사성, 형광체 또는 전기화학발광체 물질과 같은 탐지할 수 있는 분자이다.
분석물의 존재를 신속하게 측정하도록 적합하게 되었기 때문에 종종 급속 포맷 시스템으로 언급되는, 대안적인 이중 항체 시스템도 또한 본 발명의 범주 내에서 사용될 수 있다. 이 시스템은 항체와 분석물 사이에 높은 친화성이 필요하다. 본 발명의 한 실시 양태에 따라, 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체의 존재는 각각 상기 단백질에 대하여 특이성을 갖는 한 쌍의 항체들을 사용하여 결정된다. 상기 항체들의 쌍 중 하나는 본 명세서에서 "탐지 항체(detector antibody)"를 나타내며 상기 항체들의 쌍 중 다른 것은 "포획 항체(capture antibody)"를 나타낸다. 본 발명의 단일 클론 항체는 포획 항체 또는 탐지 항체 중 어느 하나로서 사용될 수 있다. 본 발명의 단일 클론 항체도 또한 포획 및 탐지 항체 양자로, 단일 분석에서 함께 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명의 한 실시 양태는 생물학적 유체의 샘플 내에서 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체를 탐지하기 위한 이중 항체 샌드위치 방법을 사용한다. 이 방법에서, 분석물(아밀로이드 단백질)은 탐지 항체와 포획 항체 사이에서 샌드위치화되고, 포획 항체는 고체 지지체 상에서 비가역적으로 고정화된다. 탐지 항체는 항체-분석물 샌드위치의 존재 및 이에 따라 분석물의 존재를 확인하기 위한 탐지할 수 있는 표지를 함유할 것이다.
대표적인 고체상 물질은, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 방사면역학적 분석 및 효소 면역학적 분석 분야에서 공지된 미량역가 플레이트(microtiter plates), 폴리스티렌의 시험관, 자성, 플라스틱 또는 유리 비드 및 슬라이드를 포함한다. 고체상에서 항체들을 커플링하는 방법도 또한 당업자에게 공지되어 있다. 더 최근에, 다수의 다공성 물질 예컨대 나일론, 니트로셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 유리 섬유 및 기타 다공성 중합체가 고체 지지체로 사용되어 왔다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바의 조성물을 포함하는 생물학적 샘플 내에서 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체의 탐지용 진단 키트에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 정의된 바의 조성물 이외에, 상기 정의된 바의 탐지 시약을 더 포함하는 후자의 진단 키트에 관한 것이다. 용어 "진단 키트(diagnostic kit)"는 일반적으로 당업계에 공지된 임의의 진단 키트를 나타낸다. 더 구체적으로, 후자의 용어는 즈레인(Zrein) 등(1998)에서 기술된 바의 진단 키트를 나타낸다.
본 발명의 여전히 또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체들을 포함하는 단백질병증, 단백질 미스폴딩을 포함하는 질환 및/또는 단백질 축적 또는 응집을 포함하는 질환과 관련된 질환 및 상태의 탐지 및 진단을 위한 신규 면역프로브(immunoprobe) 및 시험 키트를 제공하는 것이 이다. 면역프로브에 대하여, 항체들은 적당한 리포터 분자 예컨대, 효소 또는 방사성핵종(radionuclide)에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 시험 키트는 본 발명에 따른 하나 이상 항체들을 보유하는 용기 및 질환을 야기하는 항원에 결합하여 면역학적 복합체를 형성하고 면역학적 복합체의 존재 또는 부재가 질환을 야기하는 단백질 또는 단백질 응집체의 존재 또는 부재와 상관 관계가 있도록 면역학적 복합체의 형성을 탐지하는 목적을 위한 항체의 사용 설명서를 포함한다.
정의
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 단수 형태는 문맥상 명백히 구술하지 않는다면 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "펩티드"는 하나 이상 펩티드를 언급하는 것이다.
특히 속성 또는 값과 관련하여 용어 "본질적으로(essentially)", "약(about)", "대략(approximately)" 등은 각각 정확한 속성 또는 정확한 값도 또한 정의하는 것이다.
뿐만 아니라, 특허청구범위에서 단어 "포함하는(comprising)"은 기타의 요소 또는 단계를 제외하는 것은 아니다. 단일 단계는 특허청구범위에서 인용된 몇몇 특징의 기능들을 수행할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 서로 교체할 수 있는 것이며 펩티드 결합에 의해 연결된(linked) 2이상의 아미노산으로 구성된 생체 분자를 의미하는 것으로 정의된다.
용어 "펩티드"는 한 아미노산의 알파 탄소의 카르복실기와 다른 아미노산의 알파 탄소의 아미노기가 축합반응에 의해 형성된 펩티드 결합을 통해 알파 탄소가 연결된 아미노산(전형적으로 L-아미노산)의 사슬이다. 사슬의 한 끝에서 말단 아미노산(즉, 아미노 말단)은 유리 아미노기를 가지며, 한편 사슬의 다른 끝에서 말단 아미노산(즉, 카르복시 말단)은 유리 카르복실기를 갖는다. 그러므로, 용어 "아미노 말단(amino terminus)"(N-말단으로 축약함)은 펩티드의 아미노 말단에서 아미노산 상의 유리 알파-아미노기, 또는 펩티드 내의 다른 위치에서 아미노산의 알파- 아미노기(펩티드 결합에 참여할 때 이미노기)를 나타낸다. 유사하게, 용어 "카르복시 말단(carboxy terminus)"(C-말단으로 축약함)은 펩티드의 카르복시 말단에서 아미노산 상의 유리 카르복실기, 또는 펩티드 내의 다른 위치에서 아미노산의 카르복실기를 나타낸다.
전형적으로, 펩티드를 만드는 아미노산은 아미노 말단에서 시작하여 펩티드의 카르복시 말단 쪽 방향 순으로 증가하는 번호를 매긴다. 따라서, 한 아미노산이 다른 것을 "이어서(follow)"라고 말하여 질 때, 그 아미노산은 전술한 아미노산보다 펩티드의 카르복시 말단에 더 가까운 위치이다.
용어 "잔기(residue)"는 아미드 결합에 의해 펩티드에 혼입된 아미노산을 나타내는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 이에 따라, 아미노산은 천연적으로 발생하는 아미노산 일 수 있으며, 또는 제한되지 않는다면, 천연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능 하는 공지의 천연 아미노산의 유사체(즉, 아미노산 모사체(mimetics))를 포함할 수 있다. 더욱이, 아미드 결합 모사체는 당업자에게 잘 알려진 펩티드 주쇄 변형(backbone modifications)을 포함한다.
용어 "변형된 펩티드(modified peptide)"는 변형된 펩티드가 미셀형태로 이용할 수 있도록 소수성 부분의 첨가를 통해 변형된 펩티드를 나타내는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 펩티드는 표적화 기능을 가질 수 있으며 따라서 항체 또는 항체의 결합 단편, 리간드, 항원, 수용체, 캐리어 단백질 또는 항원, 수용체, 조직 또는 섬유모세포(fibroblasts), 상피 세포(epithelial cells), 내피 세포(endothelial cells), 혈구(blood cells), 종양 세포, 등을 포함하는 세포 타입을 인식하고 결합할 수 있는 기타 단백질 또는 펩티드를 나타낼 수 있다. 특히, 변형된 펩티드는 종양 조직 또는 종양 세포에 리포솜을 표적화할 수 있다. 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 본 발명의 리포솜 구조체에 사용하기 위한 변형된 펩티드는 또한 고체 종양의 맥관 구조(vasculature)를 표적화 하는 펩티드일 수 있다.
한 양상에서, 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 본 발명의 리포솜 구조체에 사용하기 위한 변형된 펩티드는 수용체-리간드 상호 작용과 같은 단백질-단백질 상호작용에서 인식 성분으로서 작용하는 표적화 펩티드이다.
한 양상에서, 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 본 발명의 리포솜 구조체에 사용하기 위한 변형된 펩티드는 하기 본 명세서에서 기술되는 바의 항원성 펩티드이다.
또 다른 양상에서, 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 본 발명의 리포솜 구조체에 사용하기 위한 변형된 펩티드는 RGD-펩티드, 소마토스타틴(somatostatin), 주화성 펩티드(chemotactic peptide)), 혈관활성 장 펩티드(vasoactive intestinal peptide), 뿐만 아니라 그의 모사체이다. 일반적으로, 이들 펩티드는 높은 친화성에서 리간드-수용체 회합으로 표적 세포에 결합하고 수용체-중재된 엔도시토시스를 통해 세포간 구획으로 진입한다(추가 정보에 대하여는 US20030229013호 참조).
여전히 또 다른 양상에서, 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 본 발명의 리포솜 구조체에 사용하기 위한 변형된 펩티드는 미국 특허 제5,620,689호에 기술된 바와 같은, 예를 들어, B-세포 또는 T-세포 에피토프에 대하여 특이적 인식을 갖는 항체 또는 항체 단편과 같은 항체, 특히 단일 클론 항체 또는 항체 단편이다. 예를 들어, 항체는 B-세포 에피토프 CD19, CD20, CD22 또는 CD77을 인식하는 것 일 수 있다. 항체는 T-세포 에피토프 CD4, CD7 또는 CD8을 인식하는 것 일 수 있다.
리포솜의 외부 표면상에 삽입된(embedded) 펩티드의 표적화 기능성은 치료제 및/또는 올리고뉴클레오타이드와 같은 작은 생물학적 활성 분자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 전달 특이성은 제한된 세포 타입으로의 리포솜 펩티드 결합능에 의해 한정된다.
치료제는 천연 및 합성 화합물, 특히 항관절염(anik-arthritic), 항부정맥 (anti-arrhythmic), 항균(anti-bacterial), 항콜린(anticholinergic), 항응고(anticoagulant), 항이뇨(antidiuretic), 해독(antidote), 항간질(antiepileptic), 항진균(antifungal), 항염증, 항대사(antimetabolic), 항편두통(antimigraine), 항신생물(antineoplastic), 구충(antiparasitic), 해열(antipyretic), 항발작(antiseizure), 항혈청(antisera), 항경련(antispasmodic), 진통(analgesic), 마취(anesthetic), 베타-차단(beta-blocking), 생물학적 반응 조절(biological response modifying), 골 대사 조정( bone metabolism regulating), 심혈관(cardiovascula), 이뇨(diuretic), 효소( enzymatic), 임신 증강(fertility enhancing), 성장 촉진(growth-promoting), 지혈(hemostatic), 호르몬(hormonal), 호르몬 억제(hormonal suppressing), 고칼슘혈증 완화(hypercalcemic alleviating), 고혈당증 완화(hyperglycemic alleviating), 면역억제(immunosuppressive), 면역 증강(immunoenhancing), 근육 이완(muscle relaxing), 신경 전달(neurotransmitting), 부교감 신경 흥분(parasympathomimetic), 교감신경유사 혈장 연장(sympathominetric plasma extending), 혈장 연장, 향정신(psychotropic), 혈전용해(thrombolytic) 또는 혈관확장(vasodilating) 활성을 갖는 화합물이다.
특히, 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 리포솜 상에 사용된 변형된 펩티드는 치료 조성물을 형성하기 위해 그 안에 항-종양 화합물이 포획되는 것을 포함하는 리포솜의 외부 표면상에 삽입된 종양-표적화 펩티드일 수 있다. 항-종양 화합물은 화학요법 및/또는 세포독성제 예컨대 DNA 빌딩 블록 합성을 정지시키는 화합물(예를 들어, 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 히드록시우레아, 및 머캅토퓨린), DNA를 직접적으로 손상하는 화합물(예를 들어, 안트라사이클린 항생제 예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신 및 이다루비신, 및 그의 유사체 예컨대 에피루비딘 및 미톡산트론, 또는 에토포시드 및 플라티늄 화합물 예컨대 시스플라틴, 카르보플라틴, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 제니플라틴, 엔로플라틴(enloplatin), 로바플라틴, 스피로플라틴,((-)-(R)-2-아미노메틸피롤리딘(1,1-시클로부탄 디카르복실레이토)플라티늄)(DWA2114R), (SP-4-3(R)-1,1-시클로부탄-디카르복실레이토(2-)-(2-메틸-1,4-부탄디아민-N,N')플라티늄)(Cl-973), 네다플라틴(254-S) 및 (비스-아세테이토-아민-디클로로-시클로헥실아민-플라티늄(IV))(J -2 6)(Weiss, R. B., et al., Drugs, 46(3): 360-377(1993)), 유사분열 방추(mitotic spindle) 합성 또는 분해에 영향을 주는 화합물(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈레우로신, 빈로디신, 비노렐빈(vinorelbine) 및 빈데신으로 이루어진 군에서 선택된 빈카 알카로이드(vinca alkaloid) 또는 파시탁셀(pacitaxel)), 또는 혈관신생(angiogenesis)을 방해하는 화합물(예를 들어, 항-VEGF 항체, 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 툼스타틴(tumstatin), 및 TNF[알파])일 수 있다. 대안적으로, 항종양 약물은 토포아이소머라제 I 저해제, 예컨대 캄프토테신 및 그의 유사체 또는 방사선요법제(radiotherapy agent)(예를 들어, <90>Y, <125>l, <188>Re, <111>ln DTPA, 또는 <131>l 요오드화 나트륨)일 수 있다.
포획된 생물학적 활성 분자는 또한, 예를 들어 낭포성 섬유증, 아데노신 데아미나제 결핍증(adenosine deaminase deficiency) 및 AIDS와 같은 바이러스, 악성(malignant) 및 염증성 질환 및 상태의 치료를 위한 치료 유전자 생성물을 생성하기 위해 치료 유전자의 발현이 표적 세포에 의해 내재화될 때 달성하는 치료 유전자를 함유하는 핵산 예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 라이보자임, siRNA 또는 플라스미드일 수 있다. 한 양상에서 올리고뉴클레오타이드는 암의 치료에 사용될 수 있는 종양 억제 유전자 예컨대 APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1 , RB, p53, WT1 , BRCA , BRCA2 및 VHL일 수 있다(추가의 정보는 US 2010119444호 참조).
본 발명의 한 양상에서, 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 리포솜 상에 사용된 펩티드는 고체 종양의 맥관 구조를 표적화하는 펩티드 일 수 있다. 대표적인 맥관 표적화제(VTAs)는 미국 특허 제 5,855,866호, 제5,965,132호, 제6,261,535호, 제6,051,230호 및 제6,451,312호에 기술되어 있으며, 여기에서 종양 맥관 구조를 마커하는 항세포제(anti-cellular agents) 및 독소(toxins)의 표적화된 전달을 기술한다.
다른 맥관 표적화 접근의 효과적인 설명은 종양 맥관 구조 또는 기질(stroma) 내에서 발현 또는 흡착된 마커에 응집 인자(coagulation factor)를 표적화한다(Huang et al., 1997; 미국 특허 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5877,289호, 및 제6,036,955호).
본 발명의 또 다른 양상에서, 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 리포솜 상에 사용된 펩티드는 항체, 특히 단일 클론 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, B-세포 또는 T-세포 에피토프에 대하여 특이적 인식을 갖는 항체 또는 항체 단편일 수 있으며 포획된 생물학적 활성 분자는 혈액학적 장애(hematological disorder)의 치료를 위한 독소루비신, 빈크리스틴, 로무스틴(lomustine), 인터페론, 멜팔란(melphalan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 프레드니손(prednisone), 클로람부실(chlorambucil), 카무스틴(carmustin) 및 덱사메타손일 수 있다.
용어 "항원성 펩티드(antigenic peptide)" 또는 "관심의 항원성 펩티드(antigenic peptide of interest)"는 포유동물, 특히 인간에게 투여했을 때, 상기 포유동물 또는 인간의 면역 반응이 발생할 수 있는 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양상에서, 항원성 펩티드는 예를 들어 프리온 단백질, 타우 단백질, 알파-시누클레인(alpha-synuclein), 헌팅틴(huntingtin), 아밀린(amylin) 또는 아밀로이드-β와 같은 아밀로이드 단백질 또는 아밀로이드-유사 단백질로부터 유도된 펩티드 또는 하나 이상의 상기 펩티드의 조합에 관한 것이다.
Aβ 항원성 펩티드 단편은 Aβ 펩티드의 N-말단부, 특히 적어도 5, 특히 적어도 6, 특히 적어도 7, 특히 적어도 8, 특히 적어도 9, 특히 적어도 10, 특히 적어도 11 , 특히 적어도 12, 특히 적어도 13, 특히 적어도 14, 특히 모든, Aβ1-15 단편 또는 Aβ1-16 단편으로부터의 모든 아미노산 잔기를 포함하는 N-말단부에 상응할 수 있다.
Aβ 항원성 펩티드 단편은 또한 적어도 5, 특히 적어도 6, 특히 적어도 7, 특히 적어도 8, 특히 적어도 9, 특히 적어도 10, 특히 적어도 11 , 특히 적어도 12, 특히 적어도 13, 특히 적어도 14, 특히 적어도 15, 특히 모든, Aβ1-16 단편, Aβ1-17 단편, Aβ1-18 단편, Aβ1-19 단편, Aβ1-20 단편, Aβ1-22 단편, Aβ1-23 단편, Aβ1-24 단편, Aβ1-25 단편 또는, Aβ1-26 단편, 또는 3-15Aβ 단편으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 Aβ 펩티드의 N-말단부에 상응할 수 있다.
Aβ 항원성 펩티드 단편은 또한 적어도 5, 특히 적어도 6, 특히 적어도 7, 특히 적어도 8, 특히 적어도 9, 특히 적어도 10, 특히 적어도 11, 특히 적어도 12, 특히 적어도 13, 특히 적어도 14, 특히 적어도 15, 특히 모든 Aβ20-40 또는 Aβ20-42 단편, Aβ21-40 또는 Aβ21-42 단편, Aβ22-40 또는 Aβ22-42 단편, Aβ23-40 또는 Aβ23-42 단편, Aβ24-40 또는 Aβ24-42 단편, Aβ25-40 또는 Aβ25-42 단편, Aβ26-46 또는 Aβ27-42 단편, 또는 Aβ27-40 또는 Aβ27-42 단편, 또는 Aβ29-40으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 Aβ 펩티드의 C-말단부에 상응할 수 있다.
한 양상에서, Aβ 항원성 펩티드 단편은 적어도 5, 특히 적어도 6, 특히 적어도 7, 특히 적어도 8, 특히 적어도 9, 특히 적어도 10, 특히 적어도 11, 특히 적어도 12, 특히 적어도 13, 특히 적어도 14, 특히 적어도 15, 특히 모든 Aβ15-35, 특히 Aβ20-35 단편으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 Aβ 펩티드의 중간부에 상응할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 전체 길이 Aβ1-39, Aβ1-40, 또는 Aβ1-42 단편은 본 발명에 따라 본 명세서에서 기술되는 바의 구조체 내에서 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 양상에서, 본 명세서에서 개시된 바의 Aβ 항원성 펩티드 단편은 하나 이상의 변형된(modified) 또는 비천연(non-natural) 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.
본 발명의 특정 실시 양태에서, Aβ 항원성 펩티드 단편의 용도는 Aβ 펩티드, 특히 단편의 N-말단부로부터의 13 내지 15 인접 아미노산 잔기의 단일 또는 반복 신장으로 이루어진 것이 고려되며, 여기에서 상기 13 내지 15 아미노산 잔기의 인접 신장은 Aβ 펩티드의 N-말단 단편 1-16 또는 1-17로부터, 특히 잔기 1-15, 1-14, 및 1-13으로 이루어진, 특히 WO 2007/068411호에 개시된 서열 번호:1로 주어진 Aβ1-15 펩티드 항원 및 서열 번호:3으로 주어진 Aβ1-16(Δ14) 로 이루어진 군으로부터 선택된 Aβ 펩티드의 N-말단부로부터 수득된다.
특히, 아밀로이드 단백질 또는 아밀로이드-유사 단백질로부터 유도된 항원성 펩티드는 펩티드 예컨대 Aβ 펩티드, 구체적으로 Aβ 펩티드의 N-말단부로부터의 Aβ 펩티드 단편, 그러나 특히 1-15, 2-15, 3-15, 1-14, 2-14, 1-13; 1-16(Δ2), 1-16(Δ4), 1-16(Δ5), 1-16(Δ6), 1-16(Δ8), 1-16(Δ9), 1-16(Δ10); 1-16(Δ12), 16(Δ13), 16(Δ14), 1-16(Δ15), 1-15(Δ2), 1-15(Δ4), 1-15(Δ5), 1-15(Δ6), 1-15(Δ8), 1-15(Δ9), 1-15(Δ10); 1-15(Δ12), 15(Δ13), 15(Δ14)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기로 이루어진 Aβ 펩티드 단편, 특히 Aβ1-16(Δ15) 펩티드 항원, 특히 더 Aβ1-16(Δ14) 또는 Aβ1-16(Δ13) 펩티드 항원, 더욱더 특히 Aβ1-14 펩티드 항원, 구체적으로 Aβ1-15 펩티드 항원, 그러나 특히 항원성 펩티드가 예를 들어, 베시클, 미립자 (particulate) 체(body) 또는 분자와 같은 캐리어 그러나, 특히, 리포솜에 부착되거나, 또는 혼입되거나 또는 재구성되어 존재하는 것으로 주어진 바의 아미노산 잔기 1-15로 이루어진 Aβ 펩티드 단편일 수 있다.
Figure 112013045622142-pct00001
대안적으로, "관심의 항원성 펩티드(antigenic peptide of interest)"는 또한 백신 개발을 위한 항원으로서 고안된 포스포(phosphor)-타우 단백질 또는 상기 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 Aβ 펩티드 항원과 필요에 무관한 포스포-타우 단백질과의 혼합물일 수 있다. 이러한 포스포-타우 단백질은 하기표에 묘사된 하나 이상의 하기 서열(T5 내지 T11)에 의해 표시될 수 있다. 이전에 사용된 면역원성의 펩티드는 대조로서 사용될 수 있다(Asuni 등, 2007).
Figure 112013045622142-pct00002
본 발명에 따른 펩티드 또는 항원성 펩티드는 리포솜 캐리어/면역 애쥬번트의 지질 이중층으로의 삽입을 용이하게 하는 친유성 또는 소수성 부분을 통해, 특히, 제한되는 것은 아니지만, 지방산, 트리글리세리드, 디글리세리드, 스테로이드, 스핑고지질, 당지질 또는 인지질, 그러나 특히 지방산, 트리글리세리드 또는 인지질을 포함하는 친유성 또는 소수성 부분에 의해 변형되며, 여기에서, 예를 들어, 지방산 탄소 주쇄는 리포솜 이중 층 내의 펩티드에 대한 앵커(anchor)로서의 기능을 하는 적어도 6의 탄소 원자를 가지며 및 리포솜 표면에 근접하여 위치하고 안정화된 펩티드를 유도하는 특징을 갖는다. 특히, 친유성 또는 소수성 부분은 적어도 대략 14의 탄소 원자 및 대략 24 이하의 탄소 원자의 탄소 주쇄를 갖는 지방산이며, 이 범위 내에서 떨어지는 탄소 원자의 각각의 개별 수도 또한 본 발명의 일부이다. 특히 더, 친유성 또는 소수성 부분은 적어도 14의 탄소 원자의 탄소 주쇄, 그러나 특히 16 탄소 원자를 갖는다. 소수성 부분의 예는, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산, 콜레스테롤 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(DSPE)을 포함한다.
여전히 본 발명의 추가의 실시 양태에서 소수성 부분은 팔미트산이다. 리포솜 제제는 예를 들어, 지질 A, 알룸, 인산 칼슘, 인터루킨 1, 및/또는 다당류 또는 단백질의 마이크로캡슐, 그러나 특히 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A와 같은 해독된 지질 A, 알룸, Pam3CSK4, Pam3CAG, CpG, 지질화된 CpG, 포스포로티오에이트화된 PS-CpG-ODNs, 또는 CpG-A, CpG-B 또는 CpG-C와 같은 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG-ODN)와 같은 애쥬번트를 더 함유할 수 있다.
따라서, 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바와 같은 본 발명의 리포솜 구조체에 사용하기 위한 애쥬번트는 CpG-A, CpG-B 또는 CpG-C와 같은 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG-ODN)이다. 올리고뉴클레오타이드-변형된 CpG는 바이러스 감염시 다량의 항-바이러스 사이토카인 타입 I 인터페론을 유도하거나 또는 톨-유사 수용체(Toll-like receptors)(TLRs) 과-발현을 유도하는 합성 자극제(synthetic stimulus)로서 작용할 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드, 특히 항원성 펩티드의 변형은 펩티드 분자의 N-말단 및/또는 C-말단 끝에 또는, 대안적으로, 펩티드 분자의 N-또는 C-말단 끝에 첨가된 아미노산 잔기에 위치한 아미노산 잔기의 지질화를 통해서 일어날 수 있다. 아미노산 잔기의 첨가는 천연 펩티드 서열이 지질화를 통한 변형에 적당한 N- 및/또는 C- 말단 아미노산을 제공하지 않는다면, 필요해 질 수 있다. 대안적으로, 펩티드 단편의 N- 및/또는 C- 말단 끝에서 제2 또는 제3 아미노산 잔기는 변형 공정의 일 부분으로서 지질화 될 수 있다.
예비 형성된, 엠프티 리포솜이 사용될 때, 본 발명에 따른 펩티드, 특히 항원성 펩티드는 변형되어 그것이 형성되는 리포솜 막으로 삽입되는 소수성 테일(들)(tail(s))이 제공된다. 추가로, 펩티드는 리포솜으로 삽입될 수 있도록 소수성 테일을 함유할 수 있게 변형될 수 있다.
본 발명의 항원성 구조체는 일반적으로 항원 효과를 향상시키도록 변형된 펩티드를 포함하며, 여기에서, 이러한 펩티드는 다양한 실시 양태로 이전에 본 명세서에서 기술된 바의 팔미트산, 폴리-아미노산(예컨대 폴리-글리신, 폴리-히스티딘), 다당류(예컨대 폴리갈락투론산, 폴리락트산, 폴리글리콜라이드, 키틴, 키토산), 합성 중합체(폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리에스테르) 또는 공중합체(예컨대, 폴리(메타크릴산) 및 N-(2-히드록시) 프로필 메타크릴아미드) 등에 의해 변형될 수 있거나, 또는 페길화(폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 폴리에틸렌 글리콜을 사용)를 통해 더 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 "리포솜 기반 구조체"에서, 리포솜은 다양한 실시 양태로 이전에 본 명세서에서 기술된 바의 본 발명의 변형된 펩티드를 지질 이중층에서 재구성시키는 것을 포함하는 캐리어로서 사용될 수 있는 기능 및 동시에 활성 약물 또는 화합물을 위한 전달 시스템으로서 기능인 이중 기능을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 "리포솜 기반 항원성 구조체(liposome-based antigenic construct)"의 경우, 리포솜은 치료 백신으로 치료될 표적 동물 또는 인간 내에서 면역 반응을 증진 또는 자극하는 애쥬번트로서의 기능을 더 가질 수 있다. 본 발명의 리포솜 기반 항원성 구조체 조성물은 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 및 기타 애쥬번트 예를 들어, 지질 A, 알룸, 인산칼슘, 인터루킨 1, 및/또는 다당류 및 단백질의 마이크로캡슐, 그러나 특히 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A와 같은 해독된 지질 A, 또는 알룸, Pam3CSK4, Pam3CAG, CpG, 지질화된 CpG, 포스포로티오에이트화된 PS-CpG-ODNs 또는 CpG-A, CpG-B 또는 CpG-C와 같은 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG-ODN)를 포함하는 추가의 애쥬번트, 추가의 보존제, 희석제, 유화제, 안정제, 및 당업계의 백신에 사용되는 공지의 기타 성분을 더 포함할 수 있다는 것도 또한 이해되어 진다. 더욱이, 당업계에 공지된 임의의 애쥬번트 시스템은 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 애쥬번트는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 프로인트 불완전 애쥬번트(Freund's incomplete adjuvant), 프로인트 완전 애쥬번트, 다분산 β-(1,4) 연결된 아세틸화 만난("아세만난(Acemannan)"), Titermax
Figure 112013045622142-pct00003
(CytRx사의 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 애쥬번트), 키론사(Chiron Corporation)로부터의 변형된 지질 애쥬번트, 캠브리지 바이오텍(Cambridge Biotech)으로부터의 사포닌 유도체 애쥬번트, 사멸 백일해균(killed Bordetella pertussis), 그람-음성균(gram-negative bacteria)의 리포다당류(LPS), 덱스트란 술페이트와 같은 큰 고분자 음이온 및 알룸, 수산화알루미늄, 또는 인산알루미늄과 같은 무기 겔을 포함한다.
용어 "면역학적 유효량(immunogenically effective amount)"은 인간 또는 동물에게 투여될 때 면역 반응을 유발하는 항원/면역원성의 조성물의 양을 나타낸다. 유효량은 하기의 통상적인 절차로 당업자에 의해 용이하게 측정된다.
용어 "치료적 유효량(therapeutically efective amount)" 또는 "약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount)" 은 인간 또는 동물에게 투여될 때 상기 인간 또는 동물의 치료 효과를 충분히 초래할 수 있는 변형된 펩티드, 특히 변형된 항원성 펩티드를 포함하는 본 발명에 따라 및 본 명세서에서 기술된 바의 구조체, 특히 항원성 구조체의 양을 나타낸다. 유효량은 하기의 통상적인 절차로 당업자에 의해 용이하게 측정된다.
본 명세서에서 사용된 바의, CMC로도 알려져 있는 용어 "임계 미셀 농도(critical micellar concentration)"는 또한 미셀이 자발적으로 형성되는 상기 계면활성제의 농도로 정의된다. 시스템으로의 계면활성제(또는 임의의 표면 활성 물질)의 도입시 계면활성제는 초기에 계면(interface)으로 분할(partition)할 것이고, 따라서 a) 계면의 에너지 저하시킴(면적 x 표면 장력으로 계산됨) 및 b) 물과의 접촉으로부터 계면활성제의 소수성 부분을 제거함에 의해 시스템의 자유 에너지가 감소한다. 그 후, 계면활성제에 의한 표면 커버리지(coverage)가 증진하고 표면 자유 에너지(표면 장력)가 감소할 때 계면활성제는 미셀로 응집(aggregating)하고, 이에 따라 물과 계면활성제의 소수성 부분의 접촉 면적 감소에 의한 시스템의 자유에너지가 다시 감소한다. CMC 도달 시, 계면활성제의 추가의 첨가는 단지 미셀수를 증진시킬 것이다.(IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. Blackwell Scientific Publications, Oxford(1997).)
문구 "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 문구에서 언급하는 펩티드의 본질적인 성질을 실질적으로 변경할 수 있는 요소를 배제하는 것으로서 본 명세서에서 사용된다. 따라서, 펩티드의 기술 "본질적으로 이루어진"은 펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하는 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실(deletions)을 제외한다.
더욱이, 당업자는 상술한 바와 같이 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 백분율의 아미노산(전형적으로 5% 미만, 더 전형적으로 1% 미만)을 변경, 첨가 또는 결실하는 개별적인 치환, 결실 또는 첨가는 변경이 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 치환을 초래하는 보존적으로 변형된 정도의 변화라는 것을 인식할 것이다. 유사 아미노산의 기능성을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 알려져 있다. 하기 6군은 서로 보전적 치환인 아미노산을 각각 함유한다 :
1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소로이신(I), 로이신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).
문구 "단리된(isolated)" 또는 "생물학적으로 순수한(biologically pure)"은 그의 천연 상태에서 발견할 수 있는 것으로서 일반적으로 수반하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 것을 나타낸다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 펩티드는 일반적으로 자신의 원위치(in situ) 환경과 연관된 물질을 함유하지 않는다. 전형적으로, 본 명세서에서 기술된 단리된, 면역원성 펩티드 및/또는 항체는 실버 염색 겔(silver stained gel) 상에서 밴드 강도에 의해 측정된 바로 적어도 약 80%, 일반적으로 적어도 약 90%, 및 바람직하게는 적어도 약 95%가 순수하다.
본 명세서에서 사용된 바의 용어 "용액(solution)"은 본 발명에 따른 방법 내에서 리포솜을 제조하기 위해 사용되는 용액을 나타낸다. 예를 들어, 용액은 에탄올, 인산염 완충액(PBS), 또는 양자로 이루어진다. 리포솜은 디미리스토일 포스파티딜 콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPEA), 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤(DMPG) 및 콜레스테롤로 만들어 진다.
특히, 리포솜은 DMPC, DMPG 및 콜레스테롤로, 특히 9.0:1.0:7.0의 몰비로 혼합되어, 예를 들어, 에탄올 중에서 만들어진다. 대안적으로, 리포솜은 디미리스토일 포스파티딜 콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPEA), 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤(DMPG) 및 콜레스테롤로, 특히 몰비 9.0:1.0:1.0:7.0몰의 몰비에서 각각 혼합되어, 예를 들어, 에탄올 중에서 만들어진다.
본 명세서에서 사용된 바의 용어 "리포솜(liposome)"은 전형적으로 인지질 및 스테롤로 구성된 지질 이중 층에 의해 둘러싸인 내부 수성 구획을 함유하는 자기 조립 구형 구조체(self-assembled spherical structures)를 의미한다. 리포솜은 세포막에 대한 모델 시스템으로서 및 약물 전달 시스템에서 약물 캐리어로서 광범위하게 사용된다.
본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 리포솜은 당업자에게 알려진 것을 포함한다. 리포솜의 제조를 위해 유용한 임의의 표준 지질이 사용될 수 있다. 표준 이중층 및 다층 리포솜은 본 발명의 조성물의 제조를 위해 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 리포솜의 제조 방법이 사용될 수 있지만, 가장 바람직한 리포솜은 본 명세서에서 참고로 혼입된 알빙(Alving)등의 문헌「Infect . Immun. 60:2438-2444, 1992」의 방법에 따라 제조된다.
리포솜은 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 리포솜 외부 표면상에 변형된 펩티드를 제시(presenting)하기 위한 플랫폼으로서 및, 동시에, 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 본 발명에 따른 항원성 구조체로 치료시 표적 동물 또는 인간의 면역 반응을 증진 또는 자극하기 위한 애쥬번트로서의 기능으로 사용될 수 있는 이중 기능을 가질 수 있다.
리포솜은 친수성 헤드기 및 소수성 테일을 포함하는 (인)지질 분자로 구성된다. (인)지질 분자는 소수성 부분이 서로 수성 상과의 접촉을 피하도록 배향되며, 반면 친수성 헤드기는 주변의 수성상과 최대 접촉하도록 배향되는 방식으로 수용액에서 모인다. 이것은 지질 이중 층에 의해 둘러싸인 내부 수성 구획을 함유하는 구형 구조체로 자발적인 자기 조립을 초래한다.
따라서 리포솜은 리포솜을 둘러싸는 수용액 쪽으로 배향된 외부 표면 및 내부 수성 구획을 라이닝하는 내부 표현을 함유한다.
본 명세서에서 사용된 바의 용어 리포솜의 "외부 표면(outer surface)"은 리포솜을 둘러싸는 수성상 쪽으로 배향된 리포솜의 표면을 의미한다.
리포솜은 애쥬번트 또는 면역조절제 또는 양자를 함유할 수 있다. 바람직한 애쥬번트는 알룸, Pam3CSK4, Pam3CAG, CpG, 지질 A, 특히 예를 들어 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A와 같은 해독된 지질 A이다. 모노포스포릴 지질 A(MPLA)는 적당한 농도, 특히 1 내지 10mg/mmol의 농도 특히 더 5mg/mmol의 인지질로 첨가될 수 있다.
MPLA는 옥틸-베타-D-글루코피라노시드(B-OG)와 혼합될 수 있으며 상기 혼합물은 리포솜 제제에 첨가될 수 있다. 대안적으로 본 발명에 따른 방법 내의 단계에서, 애쥬번트는 다른 지질(DMPC; DMPG 및 콜레스테롤)과 함께 에탄올과 같은 용액 내에서 혼입될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바의, 용어 "가용성(soluble)" 또는 "가용화된(solubilized)"은 수용액 내에서 부분적으로 또는 완전히 용해된 것을 의미한다. 특히, 발명의 방법 내에서, 변형된 펩티드는 B-OG, PBS 또는 그의 혼합물과 같은 계면 활성제의 존재하에 가용화될 수 있다. 특정 가용화 상태는 pH, 완충액, 계면활성제, 농도 및 온도와 같은 상이한 파라미터에 의존한다.
본 명세서에서 사용된 바의 용어 "탐지(detecting)" 또는 "탐지된(detected)"은 면역화학적 또는 조직학적 방법과 같은 생물학적 분자의 탐지에 대한 공지 기술의 사용을 의미하며 조사하에 생체 분자의 농도 또는 존재를 정성적 또는 정량적 측정하는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바의 용어 "항체(antibody)", "항체들(antibodies)" 또는 "그의 기능 부분(functional parts thereof)"은 당업계에서 인지되는 용어이며 공지 항원에, 특히 면역글로불린 분자에 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분에, 즉 면역특이적으로 항원을 결합하는 결합 부위를 함유하는 분자에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편을 나타내는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 면역글로불린은 임의의 타입(IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY) 또는 클래스(lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 및 lgA2) 또는 면역글로불린 분자의 서브클래스이다.
본 발명의 범주 내에서 "항체들"은 단일 클론 항체들, 다중클론, 키메릭, 단일 사슬, 이특이적(bispecific), 시미안화된(simianized), 인간 및 인간화된 항체들 뿐만 아니라 그의 활성 단편들을 포함하고자 한다. 공지의 항원에 결합하는 분자의 활성 단편의 예는 Fab 면역글로불린 발현 라이브러리와 상술한 항체들 및 단편중 어느 하나의 에피토프-결합 단편의 생성물을 포함하는, Fab 및 F(ab')2 단편을 포함한다.
이들 활성 단편은 다수의 기술에 의한 본 발명의 항체로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 정제된 단일 클론 항체들은 펩신과 같은 효소로 절단될 수 있으며, 및 HPLC 겔 여과가 수행될 수 있다. Fab 단편을 함유하는 적절한 분획은 그후 막 여과 등에 의하여 수집 및 농축될 수 있다. 항체들의 활성 단편의 단리를 위한 일반적 기술의 추가적인 기술은 예를 들어, 카우, 비.에이.(Khaw, B.A.) 등의 문헌「J. Nucl. Med. 23:1011-1019(1982)」; 루소(Rousseaux) 등의 문헌 「Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986」 을 참조한다.
"인간화된 항체(humanized antibody)"는 비-인간 도너(donor) 면역글로불린으로부터 유도된 그의 CDRs를 갖는 엔지니어드 항체의 타입을 나타내며 잔존하는 분자의 면역글로불린 유도 부분은 하나의(또는 그 이상의) 인간 면역글로불린(들)로부터 유도된다.
인간화된 항체는 또한 하나 이상의 그의 프레임워크(framework) 부위가 인간 또는 영장류 아미노산을 갖는 가변성 부위를 갖는 항체를 나타낼 수 있다. 또한, 프레임워크 지지체 잔기는 결합 친화성을 보존하기 위해 변경될 수 있다. "인간화된 항체들(humanized antibodies)"을 수득하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.(예컨대, 퀸(Queen)등의 문헌 「Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032(1989)」, 호지슨(Hodgson)등의 문헌「Bio/Technoloy, 9:421(1991))」참조).
"인간화된 항체(humanized antibody)"는 또한 예를 들어, 토끼와 같은 큰 동물에서 친화성-증강된 인간유사 다중클론 항체들(affinity-matured humanlike polyclonal antibodies)을 제조할 수 있는 신규 유전 공학 접근에 의해 수득될 수 있다(http://www. rctech.com/bioventures/ therapeutic. php).
용어 "단일 클론 항체(monoclonal antibody)"도 또한 당업계에서 잘 인지되고 있는 것이며 단지 하나의 항원만을 인식하고 단일 클론으로부터 라이브러리 내에서 제조된 매스(mass)인 항체를 의미한다. 단일 클론 항체들은 정상적으로 짧은 수명을 갖는, 항체-생성 B 세포를 예컨대 암 세포와 같은 급속-성장 세포(때때로 "불멸(immortal)" 세포로 언급됨)로 퓨징(fusing) 하여 전형적으로 만들어진다. 결과의 하이브리드 세포, 또는 하이브리도마는 신속하게 증식되어 다량의 항체를 생산하는 클론을 생성한다.
용어 "항원(antigen)"은 유기체, 특히 동물, 특히 더 인간을 포함하는 포유동물 내의 면역 반응을 유도할 수 있는 실체 또는 그의 단편을 나타낸다. 용어는 면역원 및 항원성 또는 항원 결정인자(determinant)에 책임이 있는 부위를 포함한다.
또한 본 명세서에서 사용된 바의, 용어 "면역원성(immunologenic)"은 면역원성제에 대하여 지정된 항체들, T-세포들 및 기타 반응성 면역 세포들을 유발 또는 증강시키고 인간 또는 동물의 면역 반응에 기여하는 물질을 나타낸다.
면역 반응은 개인이 치료될 장애를 경감 또는 완화하기 위해 투여된 본 발명의 면역원성 조성물에 대하여 충분한 항체들, T-세포들 및 기타 반응성 면역 세포들을 생성할 때 일어난다.
용어 "하이브리도마(hybridoma)" 또는 "하이브리도마 세포(hybridoma cell)"는 항체 생성 세포의 융합(fusion)에 의해 제조된 세포 및 예컨대 다발 골수종 세포인 불멸 세포를 나타내는 것으로 당업자에 의해 인식되고 이해되어 지는 것이다. 이러한 하이브리드 세포는 항체의 연속적인 공급을 생성할 수 있다. 융합 방법의 보다 상세한 기술에 대하여는 상기 "단일 클론 항체"의 정의를 참고한다.
본 발명의 또 다른 특정 실시 양태에서 본 발명에 따른 및 다양 한 실시 양태로 이전에 본 명세서에서 기술된 바의 변형된 항원성 펩티드는 캐리어/애쥬번트에 삽입할 수 있는 앵커 타입 분자에 공유적으로 결합되어 제공되며, 이와 같이 하여 펩티드는 캐리어/애쥬번트에 고정되고 이전에 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바와 같이 소수성 상호 작용이 효과적이 되도록 캐리어/애쥬번트 분자의 표면상에 또는 근접하여 그것을 제시한다.
본 명세서에서 사용된 바의, 용어 "질환 또는 장애(disease or disorder)"는 기본적으로 본 발명에 따라 및 다양한 실시 양태로 본 명세서에서 기술된 바의 리포솜 기반 구조에 의해 치료될 수 있는 모든 질환에 관한 것이다.
특히 용어 "질환 또는 장애"는 치료가 필요한 동물 또는 환자의, 예를 들어, AA 아밀로이드증, AH(중쇄) 아밀로이드증, AL(경쇄) 아밀로이드증, 알렉산더병, 알츠하이머병, 근육위축 가쪽 경화증, 대동맥 내측 아밀로이드증, apoA1 아밀로이드증, apoA2 아밀로이드증, apoA4 아밀로이드증, 대동맥 내측 아밀로이드증, 카다실(CADASIL), 심장 심방 아밀로이드증, 백내장, 뇌 아밀로이드 혈관병증, 각막 락토페린 아밀로이드증, 중환자 근육병증, 피부 태선 아밀로이드증, 낭포성 섬유증, 투석 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 신경병증, 가족성 영국 치매, 가족성 덴마크 치매, 가족성 내장 아밀로이드증, 섬유소 아밀로이드증, 핀란드 유전성 아밀로이드증, 전측두엽 치매, 녹내장(Glaucoma), 아밀로이드증이 있는 유전성 뇌출혈- 네덜란드 타입, 아밀로이드증이 있는 유전성 뇌출혈-아이슬란드 타입, 헌팅턴병 및 기타 트리플렛 장애, 유전성 격자 각막 이영양증, 봉입체 근육염/근육병증, 리소자임 아밀로이드증, 말로리 바디, 갑상샘 속질 암종, 치원(핀드보그) 종양 아밀로이드(Odontogenic(Pindborg) tumor amyloid), 파킨슨병, 뇌하수체 프로락틴분비종양, 원발성 전신 아밀로이드증, 원발성 피부 아밀로이드증, 프리온 질환, 폐포 단백증, 녹내장에서 망막 신경절 세포 변성, 프리온 질환, 정낭 아밀로이드, 세이핀병증, 노인 전신 아밀로이드증, 세르핀병증, 겸상 적혈구 질환, 시누클레인병증, 타우병증, 및 제2형 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 질환 또는 장애와 같은 단백질병증, 단백질 미스폴딩을 포함하는 질환 및/또는 단백질 축적 또는 응집을 포함하는 질환, 진균 감염(예컨대 미코스(mycose), 칸디디아제(candidiase), 백선(tinea), 레슈마니아 감염증(leishmaniose)), 또는 염증에 관한 것이다.
용어 "질환 또는 장애"는 또한 다발 골수종(multiple myeloma) 및 기타 암 예컨대 결장 암종, 흑색종(melanoma); IL-2, 암, 특히 유방암, 폐암, 간암, 위 및 비장 암, 및 종양; IL-4, 암; TNF, 암; IGF-1 안티센스, 뇌종양; IFN, 신경모세포종(neuroblastoma); GM-CSF, 신장 세포 암종(renal cell carcinoma); MDR-1, 암, 특히 진행암(advanced cancer), 유방암 및 난소암; 및 HSV 티미딘 키나제, 뇌종양, 두경부 종양(head and neck tumors), 중피종(mesothelioma), 난소암, 백혈병을 포함하는 세포 증식성 질환 및 장애에 관한 것이다. 용어 "질환 또는 장애"는 또한 미코스, 칸디디아제, 백선, 및 레슈마니아 감염증과 같은 진균 감염에 관한 것이다.
도 1은 L16 공정의 플로우 챠트를 나타낸다.
도 2는 박막(thin film) 방법(공정 A) 또는 공정 L15로 제조된 ACl-33 백신 수령 후 C5BL/6 마우스의 혈장 내에서 항-TAU5-20 [pY18] IgG 항체들의 분석을 나타낸다. 예비 출혈(pre-bleeding)은 -7일에 수행하였고 이어서 제1면역화 후 7일, 21일 및 35일에 수행하였다. 결과는 10 마우스의 군에서 수득된 평균 + 표준 편차로 표시한다.
도 3은 박막 방법(공정 A) 또는 공정 L15로 제조된 ACl-35 백신 수령 후 C5BL/6 마우스의 혈장 내에서 항-TAU396-408 [pS396/pS404]IgG 항체들의 분석을 나타낸다. 예비 출혈은 -7일에 수행하였고 이어서 제1면역화 후 7일, 21일 및 35일에 수행하였다. 결과는 10 마우스의 군에서 수득된 평균 + 표준 편차로 표시한다.
도 4는 공정 D(ACl-24 공정 D#2) 또는 공정 L15로 제조된 Pal 1-15 백신 수령 후 C5BL/6 마우스의 혈장 내에서 항-Aβ IgG 항체들의 분석을 나타낸다. 예비 출혈은 -7일에 수행하였고 이어서 제1면역화 후 7일, 21일 및 35일에 수행하였다. 결과는 10 마우스의 군에서 수득된 평균 + 표준 편차로 표시한다.
도 5는 공정 D(ACl-24 공정 D#1) 또는 공정 L15(ACl-24 공정 L15A; L15B 및 L15C) 또는 ACl-24 공정 L16으로 제조된 Pal 1-15 백신 수령 후 C5BL/6 마우스의 혈장 내에서 항-Aβ IgG 항체들의 분석을 나타낸다. 예비 출혈은 -7일에 수행하였고 이어서 제1면역화 후 7일, 21일 및 35일에 수행하였다. 결과는 10 마우스의 군에서 수득된 평균 + 표준 편차로 표시한다.
도 6a는 L15공정으로 제조된 ACl-41(펩티드 T8 및 T9) 백신 수령 후 C5BL/6 마우스의 혈장 내에서 항-T8 IgG 항체 역가(titer)의 분석을 나타낸다. 예비 출혈은 -7일에 수행하였고 이어서 제1면역화 후 7일, 21일 및 35일에 수행하였다. 결과는 10 마우스의 군에서 수득된 평균 + 표준 편차로 표시한다.
도 6b는 ACl-41(펩티드 T8 및 T9) 백신 수령 후 C5BL/6 마우스의 혈장 내에서 항-T9 IgG 항체 역가의 분석을 나타낸다. 예비 출혈은 -7일에 수행하였고 이어서 제1면역화 후 7일, 21일 및 35일에 수행하였다. 결과는 10 마우스의 군에서 수득된 평균 + 표준 편차로 표시한다.
도 7은 PBS 또는 2.25% SDS에서 가용화 후 Ac1-15 펩티드의 비신코닌산(bicinchoninic acid) 단백질 정량 분석(BCA) 표준 곡선을 나타낸다.
도 8은 PBS 또는 SDS의 존재하에 BCA 시약과 함께 또는 없이 ACl-24의 흡광도 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 BCA 시약으로 처치시 ACl-24 흡광도 스펙트럼 및 고유 리포솜 흡광도에 대한 보정의 비교를 나타낸다.
도 10은 펩티드가 결핍된 리포솜(엠프티 리포솜, ACl-24E)의 흡광도 스펙트럼을 나타낸다.
도 11은 단지 피포된 Ac1-15 펩티드(백신 ACl-16)을 함유하는 리포솜의 흡광도 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 공정 D(ACl240908-A) 또는 공정 L15(ACl-24-100316-A)로 제조된 ACl-24의 배치에 대한 흡광도 스펙트럼의 비교를 나타낸다.
도 13은 공정 L15 또는 L20으로 생성된 ACl-35 백신으로 면역화 후 -7일; 7일; 21일 및 35일 에서의 IgG 역가를 나타낸다.
도 14는 마우스에 백신 ACl-17(MPLA가 지질화된 CpG 애쥬번트로 대체된 공정 L15) 또는 백신 ACl-18(MPLA가 Pam2CSK4 애쥬번트에 의해 대체된 공정 L15)로 주사 후 7일, 21일 또는 35일에 수득된 총 항-AB 역가를 나타낸다.
표 1 내지 3은 Pal 1-15 백신을 생산하는 L15 공정의 배치를 기술한다. 배치는 공정 L15로 생성된 ACl-24 백신의 물리화학적 및 생체 내 재현성을 평가하기 위해 만들었다::ACl-24-100316-A; ACl-24-100316-B 및 ACl-24-100316-C. 세개의 백신은 독립적으로 생성되었다.
표 4는 Pal 1-15 백신을 생산하는 정상(normal) MPLA 농도로 L16 공정의 배치를 기술한다. 배치는 공정 L16(리포솜 형성 후 애쥬번트 및 항원 첨가)로 제조되었다-ACl-24-091127-A.
표 5는 Pal 1-15 백신을 생산하는 높은(high) MPLA 농도의 L16 공정의 배치를 기술한다. 배치는 공정 L16(리포솜 형성 후 애쥬번트 및 항원 첨가)로 제조되었다-ACl-24-091127-B.
표 6은 T1 백신을 생산하는 L15 공정의 배치를 기술한다-ACl-33-091127.
표 7은 T1 백신을 생산하는 박막 공정의 배치를 기술한다-ACl-33-091808-A.
표 8은 T3 백신을 생산하는 L15 공정의 배치를 기술한다-ACl-35-091127.
표 9는 T3 백신을 생산하는 박막 공정의 배치를 기술한다-ACl-35-0910820-A.
표 10은 T8/T9 백신을 생산하는 L15 공정의 배치를 기술한다-ACl-41-100531.
표 11 및 12는 각각 Pal 1-15 백신을 생산하기 위한 십자 흐름(cross flow) 에탄올 주사 방법(공정 D)에 의해 생성된 두 독립적인 배치-각각 ACl-24 공정 D#1 및 D#2를 기술한다.
표 13은 BCA 분석을 사용한 ACl-24-100316-A의 삼중 분석에 대한 흡광도 값을 나타낸다.
표 14는 상이한 ACl-24 공정 및 배치의 분석 결과의 요약을 나타낸다.
전술한 기술은 하기 실시예를 참고로 하여 더 완전히 이해되어질 것이다. 이러한 실시예는 그러나 본 발명을 실행하기 위한 대표적인 방법이며 본 발명의 범주를 한정하려는 것은 아니다.
하기 실시예는 본 발명을 설명한다.
실시예
실시예 1 리포솜 기반 항원성 구조체의 제조(공정 L15 ; L16 및 L20 )
1.1. 공정 L16
1.1.1 리포솜 제조: 인지질 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜-글리세롤(DMPG) 및 콜레스테롤(Avanti Polar Lipids. 앨러바스터(Alabaster), 앨러배마(Alabama))을 각각 9.0; 1.0 및 7.0의 몰비로 에탄올(100ml) 내에서 혼합하였다. 완전하게 투명한 용액이 60℃에서 15분간 연속 교반 후 형성되었다(도 1 참조 ). 이 지질 혼합물은 그후 다층 소포체(다층 소포체(Multilayer Vesicles)-스테이지 1)의 형성을 허용하는 pH7.4의 1600ml 인산염 완충액(PBS)내의 용액(100ml)를 주사하여 희석(17x) 하였다. 수득한 제형은 그후 초여과(ultrafiltration)(200ml/분의 흐름으로 Vivaflow 200-100,000 MWCO 폴리에테르술폰)로 농축하고 반응 체적 1700ml 내지 250ml로 감소시켰다(초여과 단계). 농축 용액은 pH7.4의 PBS로 10x 체적 교환이 수행되는 비바플로우(Vivaflow) 200 디바이스 내에서 더 투석시켰다(투석여과 단계 (Diafiltraion step)). 투석 용액(다층 소포체-스테이지 2)은 그후 아베스틴(Avestin)으로부터의 에멀시플렉스(Emulsiflex) C5 디바이스 내에서 균질화되고(15,000-20,000 Psi에서 7회전)(균질화 단계), 이어서 47mm의 직경을 갖는 0.2㎛ 폴리카보네이트 막을 통해 3회전 압출(동일한 에멀시플렉스 기기를 사용)하였다(압출 단계). 후속하는 마지막 두 사이징 단계에서, 항원 및 애쥬번트가 없는 단층(unilamelar) 리포솜을 형성하였다(엠프티 리포솜 제조).
1.1.2 애쥬번트 용액의 제조:
MPLA의 765ug/ml 용액은 1.6%(wt/v) 옥틸-베타-D-글루코피라노시드(B-OG)를 사용하여 pH7.4의 PBS 20ml에서 제조하였다. 수득한 용액은 0.73%(wt/v)의 그의 임계 미셀 농도(CMC) 위의 농도로 세제(B-OG)를 함유한다. 이 용액은 그후 60℃에서 30분간 가열하고 및 250ml의 엠프티 리포솜 제제에 수동으로 주입하였다. 이러한 희석 단계 동안, 세제 농도는 13.5x 아래로 희석되어, 최종 농도 0.12%(wt/v)를 초래하며, B-OG의 농도는 그의 CMC 미만이다(제1 희석 단계). 애쥬번트를 함유하는 리포솜 용액(MPLA)은 그후 pH7.4의 PBS 1450ml를 주입하여 희석(7x) 시켰다(제2 희석 단계).
1.1.3 펩티드 용액의 제조: 1.33mg/ml의 펩티드 Aβ-Pal 1-15는 2.0%(wt/v) B-OG를 사용하여 pH11.8의 PBS(총 체적 45ml)에서 제조하였다. 수득한 용액은 0.73%(wt/v)의 그의 임계 미셀 농도(CMC) 초과의 세제 농도를 포함한다. 이 용액은 60℃에서 가열 교반 하고 및 투명한 용액이 형성될 때까지 15분 동안 교반 하였다. 펩티드 용액(45ml)은 그후 애쥬번트(1700ml)와 함께 리포솜 용액에 첨가하고 60℃에서 1시간 동안 교반하여 세제의 CMC(0.73%)보다 훨씬 아래인 최종 B-OG 농도(0.05%)를 갖는 용액을 초래한다(희석 단계). 수득한 용액은 그 후 초여과(상술한 것과 동일한 상태)로 농축하였고 최종 백신 체적은 100 m로 맞추었다. 농축 용액은 투석여과로 투석되었으며, 10x 체적 교환은 pH 7.4의 PBS로 수행되었다.
최종 단계에서, 백신 용액은 0.2㎛ 폴리에테르술폰 막 여과기(Sartorius 16541-K)를 통해 무균 여과하였다. 각각의 여과기는 15ml 팰콘 관(Falcon tubes)으로 5ml 백신 용액을 무균 여과하기 위해 사용하였다. 이 마지막 공정 단계는 무균 환경(층류 후드(laminar flow hood))에서 수행하였다.
1.2. 공정 L15
공정 L15는 애쥬번트(예컨대 MPLA)가 리포솜 형성 및 사이징(sizing) 단계 전에 에탄올 용액 내에서 지질과 함께 첨가되었다는 것만이 공정 L16과의 차이이다. 따라서, 리포솜 형성에 이은 애쥬번트의 첨가 공정은 억제된다.
1.3. 공정 L20
1.3.1 리포솜 제조: 인지질 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜-글리세롤(DMPG) 및 콜레스테롤(Avanti Polar Lipids. 앨러바스터, 앨러배마)을 각각 9.0; 1.0 및 7.0의 몰비로 에탄올(8.55ml) 내에서 혼합하였다. 완전하게 투명한 용액이 60℃에서 15분간 연속 교반 후 형성되었다. MPLA(7.5mg)은 60℃의 0.45ml t-부탄올 내에서 가용화 하고 및 에탄올 용액에 첨가하였다. 지질 혼합물은 그후 다층 소포체의 형성을 허용하는 pH7.4의 인산염 완충액(PBS) 90ml 내의 용액(9.0ml)를 주사하여 희석(10x)하였다. 수득한 제제는 그후 아베스틴사(Avestin)로부터의 에멀시플렉스(Emulsiflex) C5 디바이스 또는 노던 리피드사(Northern Lipids)로부터의 리펙스 압출기(Lipex Extruder)를 사용하여 0.08㎛의 기공 크기를 갖는 한 팩의 3 폴리카보네이트 막을 통해 압출되며 425ml의 최종 체적이 되도록 pH 7.4의 PBS로 희석하였다.
1.3.2 펩티드 용액의 제조: 1.33mg/ml의 타우(TAU) 펩티드 T3은 5.0%(wt/v) B-OG를 사용하여 pH11.8의 PBS(총 체적 22.5ml)에서 제조하였다. 수득한 용액은 0.73%(wt/v)의 그의 임계 미셀 농도(CMC) 초과의 세제 농도를 포함한다. 이 용액은 60℃에서 가열 교반하고 투명한 용액이 형성될 때까지 15분 동안 교반하였다. 펩티드 용액(22.5ml)은 그후 애쥬번트(425ml)와 함께 리포솜 용액에 첨가하고 60℃에서 30분 동안 교반하여 세제의 CMC(0.73%)보다 훨씬 아래인 최종 B-OG 농도(0.20%)를 갖는 용액을 초래한다(희석 단계). 수득한 용액은 그후 초여과(상술한 것과 동일한 상태)로 농축하였고 및 최종 백신 체적은 50 m로 맞추었다. 농축 용액은 투석여과로 투석되었으며, 10x 체적 교환은 pH 7.4의 PBS로 수행되었다.
최종 단계에서, 백신 용액은 0.2㎛ 아세테이트 셀룰로스 여과기(Minisart 16534)를 통해 무균 여과하였다. 각각의 여과기는 15ml 팰콘관으로 5ml 백신 용액을 무균 여과하기 위해 사용하였다. 이 마지막 공정 단계는 무균 환경(층류 후드)에서 수행하였다.
공정 L20의 확장성(scalability)은 상이한 체적(50 및 150ml) 및 동일한 생물리학 및 면역학적 성질을 갖는 배치를 생성함에 의해 입증되었다.
1.4 결과
표 4는 Pal 1-15 백신을 생성하는 정상 MPLA 농도를 갖는 L16 공정의 배치(ACl-24-091127-A)를 기술한다. 배치는 실시예 1에서 기술된 바와 같은 공정 L16(리포솜 형성 후 항원 및 애쥬번트 첨가)로 제조하였다-ACl-24-091127-A. 정상 MPLA 농도는 상기 단락에서 기술된 공정 L15에 대하여 채택된 동일한 MPLA 혼입을 의미한다.
표 5는 Pal 1-15 백신을 생성하는 높은 MPLA 농도를 갖는 L16 공정의 배치(ACl-24-091127-B)를 기술한다. 배치는 실시예 1에서 기술된 바와 같은 공정 L16(리포솜 형성 후 항원 및 애쥬번트 첨가)로 제조하였다. 높은 MPLA 농도는 공정 L15에서보다 대략 8배 이상인 최종 백신 제제에 로딩된 MPA를 의미한다. 이러한 높은 MPLA 수율은 십자 흐름 에탄올 주사 방법(공정 D)으로 수득될 수 없다.
Pal 1-15 백신을 생성하기 위한 L16/L15 공정의 장점은 공정 D의 결과를 비교할 때 명백하다(각각 표 1 내지 3, 11 및 12, 참조). 표에서 알 수 있는 바와 같이, MPLA 가수분해(동종체(congener) B의 형성에 의해 보고된)는 공정 D와 비교하여 공정 L15/L16에서 상당히 감소하였다. 더욱이, 보고된 공정 L15/L16의 펩티드 분포는 공정 D와 비교하여 외부 수성 표면쪽으로의 항원 노출(exposure)의 증진을 보고하였다(표 14).
도 13은 공정 L15 또는 L20으로 생성된 타우 백신으로 면역화된 마우스의 IgG 역가를 나타낸다. 관측된 바와 같이, 동일한 역가 수율이 두 공정에 대하여 수득된다.
공정 L20의 확장성(scalability)은 상이한 체적(50 및 150ml) 및 동일한 생물리학 및 면역학적 성질을 갖는 배치의 생성에 의해 입증되었다.
L20 공정에 대한 자료만을 가졌지만 연구된 모든 공정은 이론적으로 안정하다.
실시예 2: ACl -33 백신을 제조하는 L15 방법과 박막 방법의 비교
표 6 및 7은 ACl-33 백신을 제조하기 위한 각각 L15 공정 및 박막 공정( WO2007/068411호에서 기술된 바의 공정 A)의 배치를 기술한다. 도 2에서, 박막 방법(공정 A) 또는 공정 L15로 제조된 ACl-33 백신의 수령 후 C5BL/6 마우스의 혈장에서의 항-Tau5-20[pY18]IgG 항체 역가를 나타낸다. 공정 L15로 제조된 ACl-33 백신으로 챌린지된 마우스는 공정 A 백신으로 챌린지된 마우스보다 더 높은 항체 역가를 주었다. 이 효과는 독점적인 펩티드 분포를 갖는 높은 펩티드 로딩을 나타내는 L15 백신 성질뿐만 아니라 L15 공정이 박막 방법에 의해 제조된 것보다 더 작은 리포솜(< 200 nm)을 생성한다는 사실에 기인하는 것일 것이다.
실시예 3: ACl -35 백신을 제조하는 L15 방법과 박막 방법의 비교
표 8 및 9는 ACl-35 백신을 생성하기 위한 각각 L15 공정 및 박막 공정( WO2007/068411에서 기술된 바의 공정 A)의 배치를 기술한다. 도 3에서, 박막 공정(공정 A) 또는 공정 L15에서 제조된 ACl-35 백신의 수령 후 C5BL/6 마우스의 혈장에서의 항-TAU396-408[pS396/pS404]IgG 항체 역가를 나타낸다. 공정 L15로 제조된 ACl-35 백신으로 챌린지된 마우스는 공정 A 백신으로 챌린지된 마우스보다 더 높은 항체 역가를 얻는다. 이 효과는 독점적인 펩티드 분포를 갖는 높은 펩티드 로딩을 나타내는 L15 백신 성질 뿐만 아니라 L15 공정이 박막 방법에 의해 제조된 것보다 더 작은 리포솜(< 200 nm)을 생성한다는 사실에 기인하는 것일 것이다.
실시예 4: T1 백신을 제조하는 L15 방법과 십자 흐름 에탄올 주사 방법(공정 D)의 비교
도 4는 공정 D(ACl-24 공정 D #2) 또는 공정 L15로 제조된 Pal 1-15 백신 수령 후 C5BL/6 마우스의 혈장에서의 항-Aβ IgG 항체 역가를 나타낸다. 결과는 두 백신에 대하여 동일한 항체 역가를 강조하고 있다. 그러나, L15 공정은 MPLA 가수분해가 비 제어적인 방식으로 매우 광범위한 범위에서 일어나는 기타 방법(공정 D)과 비교하여 단지 무시해도 될 만큼의 양의 MPLA 가수분해 생성물(예컨대 MPLA 동종체 B)을 함유한다. 상이한 MPLA 동종체(예컨대 그의 가수분해되지 않은 형태에 상응하는 동종체 A 및 동종체 A 가수분해된 생성물 중 하나인 동종체 B)의 면역원성은 알려져 있지 않다. MPLA 가수분해 생성물을 함유하지 않는 공정은 높은 배치 재현성의 장점을 가지며 이러한 공정에 의해 제조된 백신은 개선된 품질 및 안정성을 나타낸다.
실시예 5:방법 L15 와 L16 의 생체내 비교 및 공정 L15 의 면역 재현성
도 5는 공정 D(ACl-24 공정 D #1)로 제조된 Pal 1-15백신, L15로 독립적으로 생성된 3 백신 및 L16 공정으로 생성된 1 백신을 수령 후 C5BL/6 마우스의 혈장에서 항-Aβ IgG 항체 역가를 나타낸다. 결과는 생체내 면역학적 재현성을 강조하는 3의 개별 L15 백신에 대하여 동일한 항체 역가를 나타낸다. 면역화 후 35일에 L15 백신 및 공정 D 백신 사이의 항체 역가에서 중요한 상이점은 없었다. 그러나, MPLA는 L15 또는 L16 공정과 비교하여 에탄올 십자 흐름 주입 방법(공정 D) 에서 상당히 많은 양으로 가수분해되었다.
L16 공정으로 수득된 항체 역가는 L15 배치와 비교했을 때 35일에서 약간 낮았다. 이 결과는 공정 L15와 비교하여 외부 인지질 이중 층 상에 있는 과량의 MPLA 에 기인하는 것일 수 있다. 상이한 용량의 MPLA는 면역 반응에 대한 애쥬번트 농도의 효과에 대한 명확한 반응을 얻기 위해 양자의 방법으로 시험 되어야 한다. 그러나, 리포솜 형성 후 MPLA가 첨가될 수 있다는 사실은 필요할 때 스톡된 엠프티-리포솜으로 애쥬번트 만을 혼입하는 장점을 제공한다. 이러한 접근은 리포솜 제형의 저장 동안 MPLA 가수분해를 방지할 수 있을 것이다.
실시예 6: 두 항원( ACl -41 백신에 대한 T8 및 T9 항원)을 함유하는 L15 공정으로 리포솜을 생성함에 의한 두 상이한 항체들의 생체내 생성
표 10은 T8 및 T9 펩티드 서열의 혼합물을 함유하는 백신의 생성을 위한 L15공정의 배치를 기술한다. T8 및 T9 펩티드에서 용해도 및 순도의 상이점은 백신 제형 내의 최종 항원 수율에 영향을 줄 수 있다. 도 6a 및 6b에서 ACl-41 백신(두 상이한 항원 -T8 및 T9을 함유함)이 동일한 리포솜 상에 존재하는 두 에피토프에 대한 특이적 항체 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7: MPLA 이외의 상이한 애쥬번트 : 지질화된 CpG 애쥬번트 (백신 ACl -17) 또는 Pam2CSK4 (백신 ACl -18)를 함유하는 L15 공정으로 리포솜을 생성함에 의한 항체들의 생체내 생성
공정 L15에 의해 제조된 백신 ACl-17 및 ACl-18은 애쥬번트 선택만을 상이하게 하여 실시예 1.2에서 전술한 바와 같이 제조하였다.
백신 ACl-17 및 ACl-18에 사용된 애쥬번트는 각각 지질화된 CpG 및 Pam2CSK4이었다.
도 14는 MPLA가 지질화된 CpG 애쥬번트(백신 ACl-17) 또는 Pam2CSK4(백신 ACl-18)에 의해 대체된 공정 L15로 제조된, Pal 1-15 백신 수령 후 C5BL/6 마우스의 혈장에서의 항-Aβ IgG 항체 역가를 나타낸다. 결과는 MPLA와는 상이한 애쥬번트를 갖는 리포솜의 로딩시 및 Aβ에 결합하는 항체들을 생성하는 면역 반응을 여전히 유도하는 기술적 가변성(technology flexibility)을 강조한다.
실시예 8: BCA 비색 분석을 사용한 ACl -24에서 Pall -15의 막 토폴로지의 측정
비신코닌산 단백질 정량 분석(BCA)은 선형성, 특이성 및 정확성을 위해 전개 및 시험되었다. 최종적으로 분석은 상이한 공정에 의해 제조된 ACl-24의 상이한 배치에서 펩티드 토폴로지를 분석하기 위해 시행되었다. BCA 분석은 구리(II)가 염기성 상태 하에서 펩티드의 존재하에 구리(I)로 우선 환원되는 2 단계 반응을 근거로 한다(뷰렛 반응). 제2 단계에서, 구리(I)은 비신코닌산 시약과 킬레이트하여 흡광도로 측정될 수 있으며 펩티드 함량에 비례하는 자색 복합체를 생성한다. 구리(II) 및 비신코닌산의 하중(charge)으로 인하여, 이들 시약은 리포솜 이중층의 횡단을 기대할 수 없으며 따라서 외막 상에서 펩티드만이 정량화된다. 총 펩티드 함량을 정량화하기 위해, 리포솜은 세제의 존재하에 용해(lysed) 될수 있으며 그후 BCA 시약을 사용하여 정량화를 수행한다. 외부 표면상에서 Pall-15의 비율은 외부 표면상에서의 펩티드 및 총 펩티드의 비로부터 측정될 수 있다. 특이성을 위한 대조로서, 펩티드가 결핍된 리포솜(엠프티 리포솜)이 사용되었다. 마찬가지로, 외부 표면상의 펩티드가 정량화될 수 있으며 비신코닌산 및 구리가 리포솜 막을 가로지르지 않는다는 것을 확인하기 위하여 리포솜의 내부에서 완전히 피포된 수용성 펩티드 Ac1-15로 이루어진 대조 배치가 시험되었다.
표준 BCA 분석 상태는 반응 특이성 뿐만 아니라 신호/노이즈 비를 최적화하기 위해 변형되었다. 최적화된 파라미터는 i) 비신코닌산 및 구리(II)의 농도, ii) ACl-24의 농도, iii) 반응 온도 및 iv) 반응 시간(자료는 나타내지 않음)을 포함한다.
8.1 외부 리포솜 표면상에서 펩티드
리포솜은 PBS로 2배 희석하고 240μL는 96-웰 평저 투명판(96-well flat-bottom transparent plate)에 첨가하였다. 60μL의 4x 농축 BCA 시약(마이크로-BCA 단백질 분석 키트(micro-BCA Protein Assay Kit), 1.88mL 시약 A, 1.80mL 시약 B, 256μL 시약 C)을 첨가하고 샘플은 혼합하며 90분 동안 광의 부재하에 실온에서 방치하였다.
8.2 총 펩티드 함량
총 펩티드 함량을 정량화하는 리포솜을 용해(lyse)하기 위해, 리포솜은 SDS로 2배 희석하여 2.25%(v/v)의 최종 SDS 농도를 얻는다. SDS중 300μL의 리포솜은 그후 70 ℃에서 2시간 동안 밀봉된 플라스틱 에펜도르프(eppendorf) 내에서 가열하고 이어서 2시간에 걸쳐 실온으로 냉각하였다. 용해의 효율성은 320-600nm 범위에서 흡광도를 모니터링한 후 일 수 있다. 240μL의 이 투명한 용액은 그후 96-웰 평저 투명판에 첨가하였다. 60μL의 4x 농축 BCA 시약을 첨가하고 샘플은 혼합하며 90분 동안 광의 부재하에 실온에서 방치하였다.
8.3 흡광도 분석
흡광도 측정은 410-700nm 범위에서 수행되었으며 562nm에서 Abs는 외부 리포솜 표면상의 펩티드의 비율을 산출하기 위해 사용되었다. 리포솜은 그들의 큰 사이즈로 인하여 광을 산란하기 때문에, 이러한 백그라운드 흡광도는 하기식에 따른 BCA 분석으로 측정된 리포솜의 흡광도로부터 삭감하여 보정된다.
외막 상의 펩티드% = (Abs 리포솜 + BCA) - (Abs 리포솜)/(Abs 용해된 리포솜 + BCA) - (Abs 용해된 리포솜)
8.4 결과
8.4.1 선형성
분석의 선형 범위를 측정하기 위하여, 수용성 펩티드 Ac1-15(폴리펩티드(Polypeptides), 프랑스)의 표준을 6.25→ 100μM 범위의 최종 펩티드 농도에서 BCA 분석으로 PBS 내에서 가용화 하여 분석하였다. 양호한 선형성은 이 범위에서 발견되었다(R2 > 0.97)(도 7). ACl-24 샘플은 분석의 선형 범위 내에서 잘 존재하는 60μM의 이론적 펩티드 농도를 의미하는 2배 희석에서 분석된다.
8.4.2 특이성
8.4.2.1 SDS의 효과: 2.25% SDS 세제의 존재가 분석과 간섭하지 않는다는 것을 확인하기 위해, Ac1-15 펩티드의 표준이 리포솜 샘플에서와 같이 SDS에서 제조되었다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, SDS에서 가용화된 Ac1-15는 PBS에서 가용화된 것과 비교되는 유사한 표준 곡선을 제공하였다.
8.4.2.2 ACl-24 리포솜 샘플의 효과: ACl-24 배치(공정 L15)의 흡광도 스펙트럼은 도8에 나타낸다. PBS 또는 SDS의 존재하에 BCA 시약으로 처리된 양자의 ACl-24에 대하여 강한 흡광도가 BCA-Cu(I) 복합체의 특성인 562nm에서 볼 수 있다. BCA 시약으로 처리되지 않은 PBS 또는 SDS 내의 리포솜에 대하여는 피이크가 관측되지 않았다. 예상한 대로, PBS 단독에서 리포솜은 562nm에서 백그라운드 흡광도를 제공하며, 반면 SDS로 용해(lysed)된 리포솜은 410 → 700nm 범위에서 단지 마이너 흡광도를 나타내는 미셀을 제공한다. 백그라운드 흡광도가 보정될 때, PBS 또는 SDS내의 ACl-24의 흡광도 스펙트럼은 유사하였고 단지 562nm 근접에서의 신호 강도만이 상이하다(도 9).
8.4.2.3 리포솜 매트릭스의 효과: 리포솜 매트릭스가 BCA 분석과 간섭할 수 있는지의 여부를 측정하기 위해, ACl-24와 동일하지만 펩티드가 결핍된 리포솜의 배치(ACl-24E-100316)를 분석하였다. 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, ACl-24 리포솜에 대하여 관측된 562nm에서의 abs 피이크가 펩티드의 존재로 인한 것임을 입증하는 562nm에서 피이크는 관측되지 않았다.
8.4.2.4 외막 상에서 펩티드 만에 대한 특이성: PBS로 희석된 리포솜으로 수행된 BCA 분석이 외부 리포솜 막 상에 존재하는 펩티드 하고만 특이적으로 반응하는지의 여부를 시험하기 위해, 분석은 피포된 수용성 펩티드 Ac1-15(ACl-16)를 함유하는 리포솜의 배치로 수행되었다.
도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 본질적으로 562nm에서 피이크는 관측되지 않았으며, 따라서 이중 층 외부 표면상에 노출된 펩티드에 대하여서만 BCA 반응이 일어난다는 것이 확인된다.
8.4.3 정확성
분석 정확성을 평가하기 위해, 공정 L15로 제조된 ACl-24의 배치(ACl-24-100316-A)를 삼중 분석하였다. PBS 및 SDS 양자에서 판독한 흡광도는 각각 1.77% 및 0.57% 의 변형 상수(coefficient of variations)(CV's)를 갖는다(표 13).
8.4.4 배치 분석
상이한 공정으로 제조된 리포솜의 비교
상이한 배치의 ACl-24는 리포솜 내에서 펩티드의 막 토폴로지에 대한 상이한 리포솜 제조 공정의 효과를 측정하기 위하여 분석되었다. 선택된 배치의 흡광도 스펙트럼은 도 12에 나타내며 및 표 14에 요약한다.
표 14에 제공된 결과는 본 발명의 공정에 사용될 수 있는 하기 용어의 공정 가변성(flexibility)으로 입증된다:
ㆍ체적
ㆍ애쥬번트(하나 이상의 애쥬번트),
ㆍ항원(하나 이상의 항원),
ㆍ지질 조성물
배치 분석 연구를 위한 분석의 수행은 상이한 공정에 의해 제조된 리포솜이 외막 표면상에 존재하는 상이한 비율의 펩티드를 갖는 것으로 나타났다. 특히, 공정 L15로 제조된 리포솜은 박막 공정 A로 제조된 것보다 외부 표면상에서 30%이상 펩티드에 인접하게 나타난다는 것을 알아내었다.
본 발명이 도면 및 상술한 설명에서 묘사되고 서술되었지만, 이러한 묘사 및 서술은 설명적이거나 또는 대표적인 것으로 간주 되어야 하며 이것으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 하기 특허청구범위의 범주 및 정신 내에서 당업자에 의해 변화 및 변형을 할 수 있다는 것은 이해될 것이다. 특히, 본 발명은 상기 및 하기에서 기술된 상이한 실시 양태로부터 특징의 조합에 의한 추가의 실시 양태를 포함한다.
본 발명은 또한 이전 또는 이후의 기술에서 서술되지 않았을 수도 있지만 개별적으로 도면에 나타낸 모든 추가의 특징도 또한 포함한다.
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"공정 유연성"은, 공정이 다양한
ㆍ체적
ㆍ애쥬번트(하나 이상의 애쥬번트),
ㆍ항원(하나 이상의 항원),
ㆍ지질 조성물
에 대해 사용될 수 있음을 의미한다.
참조 리스트
Figure 112013045622142-pct00018
Figure 112013045622142-pct00019
SEQUENCE LISTING <110> AC Immune S.A. et al. <120> Preparation of an antigenic construct <130> S1914 PCT BS <150> EP 10 18 8832.9 <151> 2010-10-26 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> /replace="phosphorylated Serine" <220> <221> VARIANT <222> (26)..(26) <223> /replace="phosphorylated Serine" <400> 1 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 20 25 30 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> /replace="phosphorylated Tyrosin" <400> 2 Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="phosphorylated Threonine" <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /replace="phosphorylated Serine" <400> 3 Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="phosphorylated Serine" <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace="phosphorylated Threonine" <400> 4 Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="phosphorylated Serine" <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> /replace="phosphorylated Serine" <400> 5 Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="phosphorylated Serine" <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /replace="phosphorylated Serine" <400> 6 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 1 5 10 15 Ile Asp <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="phosphorylated Serine" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace="phosphorylated Threonine" <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> /replace="phosphorylated Threonine" <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> /replace="phosphorylated Serine" <400> 7 Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu 1 5 10 15 Pro <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="phosphorylated Serine" <400> 8 His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace="phosphorylated Serine" <400> 9 Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln 1 5 10 15 <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="acetylated Lysine" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="acetylated Lysine" <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> /replace="acetylated Lysine" <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> /replace="acetylated Lysine" <400> 11 Lys Lys Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His 1 5 10 15 His Gln Lys Lys <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="palmitoylated Lysine" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="palmitoylated Lysine" <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> /replace="palmitoylated Lysine" <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> /replace="palmitoylated Lysine" <400> 12 Lys Lys Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His 1 5 10 15 His Gln Lys Lys

Claims (46)

  1. 하기 단계:
    i. 용액 내에서, 디미리스토일 포스파티딜 콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤(DMPG), 및 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 리포솜을 제조하는 단계;
    ii. 하나 이상의 소수성 부분을 펩티드의 N-말단, 또는 C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단에 첨가하는 것에 의해 변형된 펩티드를 제조하는 단계;
    iii. 변형된 펩티드가 미셀 형태로 있도록 계면활성제의 존재하에 상기 변형된 펩티드를 가용화하는 단계;
    iv. 가용화된 변형된 펩티드를 상기 제조된 리포솜에 첨가하고, 가용화된 변형된 펩티드를 계면활성제의 임계 미셀 농도 미만으로 희석하여, 변형된 펩티드의 미셀 형태를 방해하도록 하여, 상기 변형된 펩티드의 소수성 부분을 예비 형성된 리포솜의 외층(external layer)으로의 통합을 추진시키는(driving) 것에 의해, 단계 (i)의 리포솜에 로딩(loading)하여, 상기 펩티드의 적어도 72%, 80%, 90%, 또는 100%가 리포솜의 외부 표면(outer surface) 상에 존재하도록 하는 단계; 및, 임의로, 애쥬번트를 예비 형성된 리포솜에 더 로딩하는 단계
    를 포함하는, 리포솜 내에서 재구성된, 지방산, 트리글리세리드, 디글리세리드, 스테로이드, 스핑고지질, 당지질 및 인지질로 이루어진 군에서 선택되는 소수성 부분을 통해 변형된, 아밀로이드 베타 단백질 또는 아밀로이드-유사 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하는 리포솜 기반 구조체의 제조 방법으로서,
    상기 애쥬번트는 지질 A, 알룸, Pam2CSK4, Pam3CSK4, Pam3CAG, 사포닌, CpG, 포스포로티오에이트화된 PS-CpG-ODNs, 지질화된 CpG, CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG-ODN), 및 양이온성 지질로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 리포솜 기반 구조체의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 지질 A는 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A이고, CpG는 CpG-A, CpG-B 또는 CpG-C인 것인, 리포솜 기반 구조체의 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드는
    (a) 공유 결합된 팔미토일화된 아미노산 잔기로서, 각각 펩티드의 N- 및 C-말단에 공유 결합된 것에 의해; 또는
    (b) 4개의 팔미토일화된 아미노산 잔기로서, 이들 중 둘은 각각 펩티드의 N- 및 C-말단에 공유 결합된 것에 의해
    변형되는 것인, 리포솜 기반 구조체의 제조 방법.
  4. 재구성된 펩티드 및, 임의로, 재구성된 애쥬번트의 72% 이상이 리포솜의 외부 표면 상에 존재하며, 상기 펩티드는 임의의 화학 반응 또는 추가의 분자 변형의 도움 없이 그의 소수성 부분을 통해 지질 이중 층으로 삽입되는, 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 수득 가능한 리포솜 내에서 재구성된 소수성 부분 및, 임의로, 애쥬번트를 통해 변형된 펩티드를 포함하는 리포솜 기반 구조체.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 펩티드는 항원성 펩티드인 것인, 리포솜 기반 구조체.
  6. 청구항 4에 있어서, 재구성된 펩티드의 80% 이상, 90% 이상, 또는 100%가 리포솜의 외부 표면 상에 존재하는 것인, 리포솜 기반 구조체.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 애쥬번트는 지질 A, 알룸, Pam2CSK4, Pam3CSK4, Pam3CAG, 사포닌, CpG, 지질화된 CpG, 양이온성 지질, 포스포로티오에이트화된 PS-CpG-ODNs, 또는 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG-ODN)인 것인, 리포솜 기반 구조체.
  8. 청구항 7에 있어서, 지질 A는 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A이고, CpG는 CpG-A, CpG-B 또는 CpG-C인 것인, 리포솜 기반 구조체.
  9. 청구항 4에 있어서, 상기 펩티드는
    (a) 지방산, 트리글리세리드, 디글리세리드, 스테로이드, 스핑고지질, 당지질 또는 인지질에 의해; 또는
    (b) 공유 결합된 팔미토일화된 아미노산 잔기로서, 각각 펩티드의 N- 및 C-말단에 공유 결합된 것에 의해; 또는
    (c) 4개의 팔미토일화된 아미노산 잔기로서, 이들 중 둘은 각각 펩티드의 N- 및 C-말단에 공유 결합된 것에 의해
    변형되는 것인, 리포솜 기반 구조체.
  10. 청구항 9에 있어서, Aβ1-15 단편, 타우 5-20 [pY18] 단편, 타우 393-408 [pS396, pS404] 단편, 타우 206-221 [pT212, pS214] 단편 또는 타우 196-211 [pS202, pT205] 단편을 포함하는 것인, 리포솜 기반 구조체.
  11. 청구항 10에 있어서, 지질 A, 알룸, Pam2CSK4, Pam3CSK4, Pam3CAG, 사포닌, CpG, 지질화된 CpG, 양이온성 지질, 포스포로티오에이트화된 PS-CpG-ODNs, 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG-ODN)로 이루어진 군에서 선택되는 애쥬번트를 더 포함하는 것인, 리포솜 기반 구조체.
  12. 청구항 10에 기재된 리포솜 기반 구조체, 또는 청구항 10에 기재된 리포솜 기반 구조체 및 임의로 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 조성물을 인간이 아닌 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간이 아닌 포유동물의 면역 반응 유도 방법.
  13. 청구항 10에 기재된 리포솜 기반 구조체, 또는 청구항 10에 기재된 리포솜 기반 구조체 및 임의로 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 조성물을 인간이 아닌 포유동물에게 투여하는 단계 및 상기 인간이 아닌 포유동물에 의해 생성된 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
  14. 알츠하이머병을 앓고 있는 포유동물의 치료적 또는 예방적 처치를 위한, 청구항 10에 기재된 리포솜 기반 구조체를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것인, 약제학적 조성물.
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