KR101580938B1 - 면역글로불린 불변영역 Ｆｃ 수용체 결합제 - Google Patents

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Abstract

IVIG 치환 화합물들은 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스(들)의 재조합 및/또는 생화학적 생성으로부터 유도된다. 이런 치환 화합물들은 면역작용을 조절하는데 각각의 치환 화합물의 효과를 평가하기 위해 인비트로로 스크린된다. 구체적인 치환 화합물들은 인비보 증명 및 복용량/투여 최적화를 위해 선택된다. 마지막으로, 치환 화합물들은 염증 질환 및 자가면역질환을 포함하는 다양한 질환을 치료하는데 사용된다.

Description

면역글로불린 불변영역 Ｆｃ 수용체 결합제{Immunoglobulin constant region Fc receptor binding agents}
본 발명은 일반적으로 면역학, 염증 및 종양 면역학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 생물학적 활성 바이오미메틱 분자들, 이런 바이오미메틱스를 포함하는 조성물 및 이런 바이오미메틱스를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 단핵구-유도 세포들에 의해 매개된 병리학적 이상들의 치료 및 예방 및 특히 바람직하게는 이런 치료 및 예방에 대한 IgG Fc 단편들의 안정화된 기능성 부분들의 사용에 관한 것이다.
인간 혈장으로부터의 면역글로불린 생성물들은 1950년대 초부터 면역결핍질환 및 더욱 최근에 및 더욱 통상적으로, 자가면역 및 염증성 질환을 치료하기 위해 사용되었다.
최초, 면역글로불린 생성물들은 근육주사에 의해 투여되었다. 더욱 최근에는, 정맥용 면역글로불린(IVIG)이 사용되었고 특발성 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP))의 치료에 효과적이라는 것이 최초로 증명되었다(Imbach P, Barandun S, d'Apuzzo V, et al: High-dose intravenous gammaglobulin for idiopathic thrombocytopenic purpura in childhood. Lancet 1981 Jun 6; 1(8232): 1228-31). 인간 IVIG("hIVIG"로 불림)는 통상적으로 95% 이상의 변형되지 않은 IgG를 함유하는 혼주 인간 혈장(pooled human plasma)으로 제조된 살균되고, 정화된 면역글로불린 G, 단지 소량이고 변할 수 있는 양의 면역글로불린 A(IgA) 또는 면역글로불린 M(IgM)의 제제이다(예를 들어, Rutter A, Luger TA: High-dose intravenous immunoglobulins: an approach to treat severe immune-mediated and autoimmune diseases of the skin. J Am Acad Dermatol 2001 Jun; 44(6): 1010-24 참조). 오늘날 hIVIG의 유일하고 가장 일반적인 임상적 용도는 ITP의 치료이다.
hIVIG가 효과적인 임상 치료가 되어온 반면, 부적절한 살균에 대한 가능성, 불순물들의 존재, 이용가능성의 부족 및 로트간의 변이(lot-to-lot variation)를 포함하는 hIVIG 제제들에 대한 여러 단점이 있다. 특히 hIVIG 제제들은 IgA-결핍 수여자에게서 IgA가 알레르기 반응 및 아나필락시스 반응(Anaphylaxis reactions)을 일으킬 수 있기 때문에 중요할 수 있는 면역글로불린 A(IgA) 함량이 크게 변할 수 있다.
hIVIG의 부정적인 태양의 관점에서, 자가면역질환 및 염증성 질환을 치료하는 개량된 수단에 대한 요구가 존재한다.
또한, 매우 다양한 형태의 다중 병적 이상들은 단핵구들로부터 유도된 세포들에 의해 매개된다. 전체가 아닌 많은 이런 이상들에 사용하기 위한 간단한 치료제 및/또는 예방제는 헤아릴 수 없을 만큼 귀중할 것이다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하는 것을 그 과제로 한다.
IVIG의 면역제어 특성들은 IgG 분자들의 Fc 도메인에 존재한다. 예를 들어, ITP의 설치류 모델들에서, 변형되지 않은 IVIG 및 Fc 단편은 혈소판 수를 회복하는데 치료효과를 나타내는 반면, 부리된 IVIG Fab 단편들은 치료효과가 없다(Samuelsson, A., Towers, T.L. & Ravetch, J.V. Anti-inflammatory Activity of IVIG Mediated Through the Inhibitory Fc Receptor. Science 291, 484-486 (2001)). 또한 IVIG의 Fab 단편들이 아닌 Fc는 어린이 및 성인 특발성 혈소판감소성 자반증의 치료에 치료효과가 있다(Follea, G. et al. Intravenous plasmin-treated gammaglobulin therapy in idiopathic thrombocytopenic purpura. Nouv Rev Fr Hematol 27, 5-10 (1985); Solal-Celigny, P., Bernard, J., Herrera, A. & Biovin, P. Treatment of adult autoimmune thrombocytopenic purpura with high-dose intravenous plasmin-cleaved gammaglobulins. Scand J Haematol 31, 39-44 (1983); Debre, M. & Bonnet, M.-C. Infusion of Gcgamma fragments for treatment of children with acute immune thrombocytopenic purpura. Lancet 342, 945-49 (1993); Burdach, S.E., Evers, K. & Geurson, R. Treatment of acute idiopathic thrombocytopenic purpura of childhood with intravenous immunoglobulin G: Comparative efficacy of 7S and 5S preparations. J Pediatr 109, 770-775 (1986)).
IVIG의 치료효과는 Fc 감마 수용체(FcγR)를 통해 처음으로 매개되고 장기간의 관용유발효과(tolerogenic effects)를 위해 수지상 세포(DC)-대식세포 교차 대화에 의존한다. FcγRIIIa는 개시 단계에서 필요한 역할을 하며 FcγRIIIb는 ITP의 설치류 모델들에서 효과 단계에 필요하다(Samuelsson, A., Towers, T.L. & Ravetch, J.V. Anti-inflammatory Activity of IVIG Mediated Through the Inhibitory Fc Receptor. Science 291, 484-486 (2001); Siragam, V. et al. Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fc[gamma] receptors on dendritic cells. Nat Med 12, 688 (2006)). 유사하게, 인간 연구들은 안티-Fcγ 수용체 항체들은 난치성 ITP의 치료에 효과적이라는 것을 증명한다(Clarkson, S. et al. Treatment of refractory immune thrombocytopenic purpura with an anti-Fc gamma-receptor antibody. N Engl J Med 314, 1236-1239 (1986)). 중요한 것은, 장기간 관용 효과는 세포-세포 상호작용에 의해 매개되는데, IVIG-처리 DCs의 입양전달(adoptive transfer)은 ITP의 설치류 모델들을 치료하는데 효과적이기 때문이다(Siragam, V. et al. Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fc[gamma] receptors on dendritic cells. Nat Med 12, 688 (2006)).
IVIG의 면역조절효과는 FcγR의 응집을 필요로 한다. FcγR의 응집은 IVIG에 존재하는 IgG 다이머(전체 IVIG의 5-15%)에 의해 매개된다(Bleeker, W.K. et al. Vasoactive side effects of intravenous immunoglobulin preparations in a rat model and their treatment with recombinant platelet-activating factor acetylhydrolase. Blood 95, 1856-1861 (2000)). 예를 들어, ITP의 설치류 모델에서, 높은 함량의 "다이머"(전체 면역글로불린 분자들의 다이머)를 가진 IVIG에 의한 치료는 혈소판 수를 증가시키는 반면 IVIG "모노머들"(전체 면역글로불린 분자들)은 효과적이지 않았다(Teeling, J.L. et al. Therapeutic efficacy of intravenous immunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies in experimental immune thrombocytopenia. Blood 98, 1095-1099 (2001)). 게다가, 이온 교환 수지와 폴리에틸렌 글리콜 분리는 IgG 응집체를 제거하는 IVIG의 제조에 통상적으로 사용된다는 사실에도 불구하고, IVIG의 임상 효과는 환자의 혈청에 다이머들의 존재와 상관이 있다(Augener, W., Friedman, B. & Brittinger, G. Are aggregates of IgG the effective part of high-dose immunoglobulin therapy in adult idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP)? Blut 50, 249-252 (1985)). 중요한 것은, 다이머들의 백분율은 아세틸하이드롤라제로 처리할 수 있는 혈관작용 부작용들과 상관이 있다(Bleeker, W.K. et al. Vasoactive side effects of intravenous immunoglobulin preparations in a rat model and their treatment with recombinant platelet-activating factor acetylhydrolase. Blood 95, 1856-1861 (2000)).
본 발명은 생물학적으로 활성인 바이오미메틱 분자들, 이를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이런 바이오미메틱스들은 자가면역질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 면역학적 및 염증성 질환의 치료를 위한 넓은 응용분야를 가지며 암을 위한 바이오면역치료제로서의 용도를 갖는다. 또한, 이런 바이오미메틱스 중 어떤 것은 면역세포 기능을 검사하기 위한 면역학적 분석법에 사용하고 질병의 진단에 사용하는 것과 같은 시약들로서의 용도를 가진다. 또한, 바이모미매틱들 및 본 발명의 조성물들은 hIVIG의 상기 제한들을 극복하기 위한 장점을 가진다. 본 발명은 또한 단핵구-유도 세포들에 의해 매개된 병리학적 이상의 치료 및 예방에 관한 것이고 특히 이런 치료 및 예방을 위한 IgG Fc 단편들의 안정화된 기능성 부분들의 용도에 관한 것이다.
제 1 실시예에서, 본 발명은 둘 이상의 결합된 스트라도머 모노머들(stradomers monomers)을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머 모노머들에 관한 것이고, 스트라도머 모노머들의 각각은 둘 이상의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, 둘 이상의 스트라도머 모노머들의 결합은 둘 이상의 Fc 도메인들을 형성하고 시리얼 스트라도머는 둘 이상의 Fc 도메인들의 첫 번째를 통해 제 1 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하고 둘 이상의 Fc 도메인들의 두 번째를 통해 제 2 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 둘 이상의 스트라도머 모노머들은 공유결합, 이황화 결합 또는 화학적 가교를 통해 결합한다.
본 발명의 분리된 시리얼 스트라도머들의 한 바람직한 실시예에서, 분리된 시리얼 스트라도머들은 두 개의 결합된 스트라도머 모노머들로 구성된다. 한 동일한 바람직한 실시예에서, 분리된 시리얼 스트라도머들은 두 개의 결합된 스트라도머 모노머들로 구성되며 스트라도머 모노머들의 모두는 두 개의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, 두 개의 스트라도머 모노머들의 결합은 두 개의 Fc 도메인들을 형성한다. 분리된 시리얼 스트라도머들에 관한 이런 실시예들의 첫 번째 구체적인 실시예에서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 포함한다. 두 번째 구체적인 예에서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 독립적으로 포함한다. 세 번째 구체적인 예에서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 네 번째 구체적인 예에서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 다섯 번째 구체적인 예에서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 포함한다. 여섯 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지 및 IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인을 포함한다. 일곱 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 여덟 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 아홉 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG3 힌지, IgG3 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 열 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다.
또한 이 제 1 실시예에서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체들은 각각 독립적으로 Fcγ 수용체 I, Fcγ 수용체 II, Fcγ 수용체 III 또는 Fcγ 수용체 IV이다. 바람직하게는 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체는 각각 Fcγ 수용체 IIIa이다.
제 2 실시예에서 본 발명은 두 개의 결합된 스트라도머 모노머들을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머들에 관한 것이고, 스트라도머 모노머들의 각각은 두 개의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, 두 개의 스트라도머 모노머들의 결합은 두 개의 Fc 도메인들을 형성하고, 상기 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 독립적으로 포함하고, 시리얼 스트라도머는 두 개의 Fc 도메인들의 첫 번째를 통해 제 1 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하고 두 개의 Fc 도메인들의 두 번째를 통해 제 2 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 둘 이상의 스트라도머 모노머들은 공유결합, 이황화 결합 또는 화학적 가교를 통해 결합한다.
제 2 실시예의 첫 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들은 각각 동일한 면역글로불린 Fc 종류이고, 면역글로불린 Fc 종류는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 두 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들은 각각 다른 면역글로불린 Fc 종류이고, 상기 면역글로불린 Fc 종류는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 세 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지와 IgG CH2 도메인을 포함한다. 네 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 독립적으로 포함한다. 다섯 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 여섯 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 일곱 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 포함한다. 여덟 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인, 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 아홉 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인, 및 IgG1 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 열 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 각각은 IgG3 힌지, IgG3 CH2 도메인, 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 열 한번 째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다.
제 3 실시예에서, 본 발명은 Fab 도메인을 더 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머들에 관한 것이고, 스트라도머 모노머들의 각각은 Fab 단편 중사슬 및 두 개의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, Fab 단편 중사슬은 두 개의 Fc 도메인 모노머들에 대해 아미노 말단 또는 카복시 말단에 위치하고, Fab 단편 경사슬은 각각의 Fab 단편 중사슬과 독립적으로 결합되고 Fab 도메인은 항원-결합 활성을 가진다. 한 바람직한 실시예에서, 스트라도머 모노머들의 각각은 면역글로불린 힌지 모노머를 더 포함하고, 면역글로불린 힌지 모노머는 Fab 단편 중사슬과 두 개의 Fc 도메인 모노머들 사이에 위치한다.
제 4 실시예에서, 본 발명은 둘 이상의 코어 스트라도머 단위에 연결된 코어 모이어티를 포함하는 코어 스트라도머에 관한 것이고, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 각각은 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하고 코어 스트라도머 단위들의 각각은 다음을 포함하는 그룹으로부터 독립적으로 선택된다:
(a) Fc 단편, Fc 단편은 두 개의 결합된 Fc 단편 모노머들을 포함하고, 상기 Fc 단편 모노머들의 각각은 Fc 도메인 모노머를 포함하고, 두 개의 Fc 단편 모노머들의 결합은 Fc 도메인을 형성하고,
(b) Fc 부분 단편, Fc 부분 단편은 두 개의 결합된 Fc 부분 단편 모노머들을 포함하고, 상기 Fc 부분 단편 모노머들의 각각은 Fc 도메인 모노머를 포함하고, 두 개의 Fc 부분 단편 모노머들의 결합은 Fc 도메인을 형성하고,
(c) Fc 도메인, Fc 도메인은 두 개의 결합된 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, 두 개의 Fc 도메인 모노머들의 결합은 Fc 도메인을 형성하고,
(d) 시리얼 스트라도머, 시리얼 스트라도머는 둘 이상의 결합된 스트라도머 모노머들을 포함하고, 상기 스트라도머 모노머들의 각각은 둘 이상의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고 둘 이상의 스트라도머 모노머들의 결합은 둘 이상의 Fc 도메인을 형성하고,
(e) 클러스터 스트라도머, 클러스터 스트라도머는 둘 이상의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위를 포함하고, 상기 클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 다중화 부위 및 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하고, 상기 클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 두 개의 결합된 클러스터 스트라도머 단위 모노머들을 포함하고, 상기 클러스터 스트라도머 단위 모노머들의 각각은 다중화 부위 모노머 및 적어도 하나의 Fc 도메인 모노머를 포함하고, 두 개의 클러스터 스트라도머 단위 모노머들의 결합은 다중화 부위과 적어도 하나의 Fc 도메인을 형성하고 둘 이상의 클러스터 스트라도머 단위들의 다중화 부위는 클러스터 스트라도머를 형성하기 위해 다중화되고,
코어 스트라도머는 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 첫 번째를 통해 제 1 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하고 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 두 번째를 통해 제 2 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합한다.
바람직하게는 제 4 실시예에서, 코어 모이어티는 면역글로불린 J 사슬, 알부민, 리포솜, 비드, 펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
코어 스트라도머들에 관한 바람직한 실시예들에서 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들은 각각 독립적으로 Fc 단편이다. 선택적으로, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들은 각각 독립적으로 시리얼 스트라도머이다.
코어 스트라도머들에 관한 다른 바람직한 실시예들에서 코어 스트라도머는 두 개의 코어 스트라도머 단위들을 포함하고, 두 개의 코어 스트라도머 단위들의 각각은 독립적으로 시리얼 스트라도머이고, 시리얼 스트라도머는 두 개의 결합된 스트라도머 모노머들을 포함하고, 상기 스트라도머 모노머들 모두는 두 개의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, 두 개의 스트라도머 모노머들의 결합은 두 개의 Fc 도메인을 형성한다. 이 실시예의 첫 번째 구체적인 예에서, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인, 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 포함한다. 두 번째 구체적인 예에서 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지 및 IgG1 CH2 도메인을 포함한다. 세 번째 구체적인 예에서 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 네 번째 구체적인 예에서 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 포함한다. 다섯 번째 구체적인 예에서 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 독립적으로 포함한다. 여섯 번째 구체적인 예에서 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 각각은 IgG3 힌지, IgG3 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 일곱 번째 구체적인 예에서 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다.
이 실시예에서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체들은 독립적으로 Fcγ 수용체 I, Fcγ 수용체 II, Fcγ 수용체 III 또는 Fcγ 수용체 IV이다. 바람직하게는 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체는 각각 Fcγ 수용체 IIIa이다.
제 5 실시예에서 본 발명은 둘 이상의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하는 클러스터 스트라도머에 관한 것이고, 상기 클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 다중화 부위 및 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하고, 상기 클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 두 개의 결합된 클러스터 스트라도머 단위 모노머들을 포함하고, 상기 클러스터 스트라도머 단위 모노머들의 각각은 다중화 부위 모노머 및 적어도 하나의 Fc 도메인 모노머를 포함하고, 두 개의 클러스터 스트라도머 단위 모노머들의 결합은 다중화 부위과 적어도 하나의 Fc 도메인을 형성하고, 둘 이상의 클러스터 스트라도머 단위들의 다중화 부위는 클러스터 스트라도머를 형성하기 위해 다중화되고, 클러스터 스트라도머는 첫 번째 Fc 도메인을 통해 제 1 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하고 두 번째 Fc 도메인을 통해 제 2 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합한다.
바람직한 실시예들에서, 다중화 부위는 IgG2 힌지, IgE CH2 도메인, 루신, 아이소루신 지퍼 및 아연 핑거로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시예에서, 클러스터 스트라도머는 둘, 셋, 넷 또는 다섯의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함한다.
이 제 5 실시예의 첫 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인, IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 포함한다. 두 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인, 및 IgG1 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 세 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 포함한다. 네 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 독립적으로 포함한다. 다섯 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 각각은 IgG3 힌지, IgG3 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 여섯 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인, 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 일곱 번째 구체적인 예에서 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 여덟 번째 구체적인 예에서 클러스터 스트라도머 단위들의 적어도 하나는 둘 이상의 Fc 도메인을 포함한다. 아홉 번째 구체적인 예에서 클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 둘 이상의 Fc 도메인들을 포함한다.
이 실시예에서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체들은 독립적으로 Fcγ 수용체 I, Fcγ 수용체 II, Fcγ 수용체 III 또는 Fcγ 수용체 IV이다. 바람직하게는 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체는 각각 Fcγ 수용체 IIIa이다.
제 6 실시예에서 본 발명은 둘 이상의 결합된 스트라도머 모노머들과 Fab 도메인을 포함하는 스트라도바디에 관한 것이고, 스트라도머 모노머들의 각각은 Fab 단편 중사슬 및 둘 이상의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, Fab 단편 중사슬은 둘 이상의 Fc 도메인 모노머들에 대해 아미노 말단 또는 카복시 말단에 위치하고, 둘 이상의 스트라도머 모노머들의 결합은 둘 이상의 Fc 도메인들 형성하고, Fab 단편 경사슬은 각각의 스트라도머 모노머의 Fab 단편 중사슬과 독립적으로 결합되고, Fab 도메인은 항원-결합 활성을 가지며, 스트라도바디는 둘 이상의 Fc 도메인들의 첫 번째를 통해 제 1 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하고 둘 이상의 Fc 도메인들의 두 번째를 통해 제 2 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합한다.
바람직한 실시예들에서 둘 이상의 스트라도머 모노머들은 공유 결합, 이황화 결합 또는 화학적 가교를 통해 결합된다.
다른 바람직한 실시예에서, 스트라도바디의 상기 스트라도머 모노머들의 각각은 면역글로불린 힌지 모노머를 더 포함할 수 있고, 면역글로불린 힌지 모노머는 Fab 단편 중사슬과 두 개의 Fc 도메인 모노머들 사이에 위치한다.
한 구체적인 실시예에서 스트라도바디는 두 개의 결합된 스트라도머 모노머들을 포함하고, 상기 스트라도머 모노머들의 각각은 Fab 단편 중사슬과 두 개의 도메인 모노머들을 포함하고, 두 개의 스트라도머 모노머들의 결합은 Fc 도메인들을 형성한다. 이 실시예의 첫 번째 구체적인 예에서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 두 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 세 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 네 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지 및 IgG CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 다섯 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 포함한다. 여섯 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 일곱 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 여덟 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG3 힌지, IgG3 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 아홉 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함한다. 열 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지 및 IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인을 포함한다. 열한 번째 구체적인 예에서 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지 및 IgG1 CH2 도메인을 포함한다.
이 실시예에서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체들은 독립적으로 Fcγ 수용체 I, Fcγ 수용체 II, Fcγ 수용체 III 또는 Fcγ 수용체 IV이다. 바람직하게는 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체는 각각 Fcγ 수용체 IIIa이다.
제 7 실시예에서 본 발명은 치료적 유효량의 시리얼 스트라도머 및 운반체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 면역반응을 변화시키는 방법에 관한 것이다. 한 바람직한 실시예에서, 약학적 조성물은 치료적 유효량의 시리얼 스트라도머 및 운반체 또는 희석제의 불균질 혼합물을 포함한다.
제 8 실시예에서 본 발명은 치료적 유효량의 코어 스트라도머 및 운반체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 면역반응을 변화시키는 방법에 관한 것이다. 한 바람직한 실시예에서, 약학적 조성물은 치료적 유효량의 코어 스트라도머 및 운반체 또는 희석제의 불균질 혼합물을 포함한다.
제 9 실시예에서 본 발명은 치료적 유효량의 클러스터 스트라도머 및 운반체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 면역반응을 변화시키는 방법에 관한 것이다. 한 바람직한 실시예에서, 약학적 조성물은 치료적 유효량의 클러스터 스트라도머 및 운반체 또는 희석제의 불균질 혼합물을 포함한다.
제 10 실시예에서 본 발명은 치료적 유효량의 스트라바디(strabodies) 및 운반체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 면역반응을 변화시키는 방법에 관한 것이다. 한 바람직한 실시예에서, 약학적 조성물은 치료적 유효량의 스트라도바디들 및 운반체 또는 희석제의 불균질 혼합물을 포함한다.
제 11 실시예에서 본 발명은 다음을 포함하는 면역 시스템의 세포에 대한 특이적 활성을 위한 항체를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다: (a) 면역 시스템의 세포들의 균질 집단과 후보 항체를 접촉시키는 단계, (b) (a)의 세포들의 집단의 활성을 측정하는 단계, (c) (a)와 동일한 세포 타입 형태의 세포들의 균질 집단과 제 1 항의 시리얼 스트라도머를 접촉시키는 단계, (d) (c)의 세포들의 집단의 활성을 측정하는 단계 및 (e) (b)에서 측정한 활성을 (d)에서 측정된 활성과 비교하여, 면역 시스템의 세포에 대한 특이적 활성에 대한 항체를 스크리닝하는 단계. 한 바람직한 실시예에서, 후보 항체 및 시리얼 스트라도머는 종들이 일치하고 아이소타이프 일치한다. 다른 바람직한 실시예에서, (e)에서의 비교는 (d)에서 측정한 활성 대 (b)에서 측정한 활성의 비율이다.
제 12 실시예에서 본 발명은 단핵구-유도 세포(MDC)의 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 기질에 부착된 Fc 시약을 가진 기질을 포함하는 조성물과 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 접촉은 인비트로, 인비보 또는 엑스비보일 수 있다. 세포는, 예를 들어, 단핵구 유도 세포 매개 이상(MDCMC)을 갖거나 진행시킬 위험을 가진 동물 속에 있을 수 있다. 세포는, 예를 들어, 수지상 세포, 대식 세포, 단핵구 또는 파골 세포일 수 있다.
제 13 실시예에서 본 발명은 기질에 부착된 Fc 시약을 가진 기질을 포함하는 조성물을 단핵구 유도 세포 매개 이상(MDCMC)을 갖거나 진행시킬 위험을 가진 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
다음은 이 두 방법(제 12 및 제 13 실시예)에 일반적인 실시예들이다.
동물은, 예를 들어, 인간일 수 있다.
Fc 시약은, 예를 들어, 인간 IgG1 Fc 단편, 인간 IgG3 Fc 단편, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 Fc 단편과 같은 인간 Fc 단편의 기능성 부분이거나 포함할 수 있다. 또한 Fc 시약은 IgG 분자이거나 이를 포함할 수 있다. Fc 시약은 비인간 Fc 단편의 기능성 부분이거나 포함할 수 있다.
기질은 합성 폴리머, 예를 들어, 나일론, 테프론, 다크론, 폴리바이닐 클로라이드, PEU(폴리(에스터 우레탄)), PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 또는 PMMA(메틸메타크릴레이트)이거나 포함할 수 있다. 기질은 금속 또는 금속 합금, 예를 들어, 스테인리스 강, 백금, 이리듐, 티타늄, 탄탈륨, 니켈-티타늄 합금 또는 코발트-크롬 합금이거나 포함할 수 있다. 기질은 동물 조직 또는 동물 조직 생성물, 예를 들어, 조직 또는 기관 이식물, 뼈(예를 들어, 골형성 뼈) 또는 연골이거나 포함할 수 있다. 기질은 단백질, 예를 들어, 콜라겐 또는 케라틴이거나 포함할 수 있다. 기질은 폴리사카라이드, 예를 들어, 아가로스이거나 포함할 수 있다. 또한, 기질은 조직 매트릭스, 예를 들어, 무세포 조직 매트릭스이거나 포함할 수 있다. 기질은 동물 세포(예를 들어, 섬유아세포 또는 간엽 줄기세포와 같은 조직 치료 세포)이거나 포함할 수 있다. 기질은 염, 예를 들어, 황산칼슘이거나 포함할 수 있다. 또한 기질은 겔 또는 크림이거나 포함할 수 있다. 또한 기질은 실리콘 또는 실라스틱이거나 포함할 수 있다. 또한 기질은 천연 섬유, 예를 들어, 실크, 무명 또는 양모를 포함할 수 있다.
기질은 모발 이식 플러그 또는 이식형 의료 장치, 예를 들어, 스텐트(예를 들어, 관상동맥 스텐트와 같은 혈관 스텐트; 기관내 또는 비강 스텐트와 같은 공기통로 스텐트; 담즙 또는 췌장 스텐트와 같은 위장관 스텐트; 또는 요도 스텐트와 같은 비뇨기 스텐트)일 수 있다. 또한 기질은 외과 봉합사(예를 들어, 견제 봉합사, 크로믹 겉(chromic gut), 나일론, 플라스틱 또는 금속 봉합사 또는 외과용 클립(예를 들어, 동맥류 클립)일 수 있다. 또한, 기질은 인공 엉덩이, 인공 엉덩이 조인트, 인공 무릎, 인공 무릎 조인트, 인공 어깨, 인공 어깨 조인트, 인공 손가락 또는 발가락 조인트, 골판, 뼈 합정, 뼈 불유합 임플란트, 추간판 임플란트, 골 시멘트, 또는 골 시멘트 스페이서일 수 있다. 또한 기질은 동정맥루(arterial-venous shunt), 이식형 와이어, 페이스메이커, 인공심장, 심장 지원 장치, 인공귀, 이식형 제세동기, 척수 자극기, 중추신경계 자극기, 말초신경 임플란트, 치과 보철물 또는 덴탈 크라운일 수 있다. 게다가, 기질은 대형 혈관색전발생장치 또는 케이지(vessel embolic filtering device or cage), 경피적 장치, 피부 또는 점막하 패치 또는 이식형 약물전달장치일 수 있다.
기질은 대형 혈관 이식물일 수 있고, 혈관은, 예를 들어, 경동맥, 대퇴동맥, 대동맥이다. 기질은 피하 임플란트, 각막 임플란트, 안내 렌즈 또는 컨택트 렌즈일 수 있다.
기질은, 예를 들어, 시트, 비트, 메시, 분말 입자, 실, 비드 또는 섬유의 형태일 수 있다. 기질은 고체, 반고체 또는 젤라틴 물질이거나 포함할 수 있다. 따라서, 기질은 수용액에 실질적으로 불용성인 물질들, 예를 들어, 리포솜과 같은 지방-가용성 지질을 포함한다.
MDCMC는 염증성 이상, 자가면역질환, 암, 골밀도 질환, 급성 감염 또는 만성 감염일 수 있다.
MDCMC는 혈액면역학적 작용, 예를 들어, 특발성 혈소판감소성 자반증, 동종면역/자가면역 혈소판감소증, 후전성 면역 혈소판감소증, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 파르보바이러스 B 19-연관 적혈구무형성증, 후천성 항인자 VIII 자가면역, 후천성 폰빌레브란드병, 다발성 골수종 및 단클론감마글로불린병증, 패혈증, 재생불량빈혈, 진정 적혈구무형성증, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 신생아 용혈성 질환, 면역-매개 호중구감소증, 혈소판수혈불응화, 수혈후 자반증, 용혈성 요독 증후군, 전신성 맥관염, 혈전성 혈소판감소성 자반증 또는 이반 증후군일 수 있다.
선택적으로, MDCMC는 신경면역학적 작용, 예를 들어, 길란바레 증후군, 만성염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 중증근무력증, 다초점운동신경병증, 항-GM1 항체 관련 하위운동신경원증후군, 탈수초신경병증, 다발성 경화증 및 시신경염, 근강직 증후군, 항-Yo항체를 가진 부신생물 소뇌퇴행증, 신생물딸림뇌척수염, 항-Hu 항체를 가진 감각신경병증, 간질, 뇌염, 척수염, 인간 T-세포 림프종 바이러스-1 관련 척수증, 자가면역 당뇨성 신경병증 또는 급성 특발성 자율신경 신경병증일 수 있다.
MDCMC는 류마티스 질환 작용, 예를 들어, 가와사키병, 류마티스 관절염, 펠티증후군, ANCA 양성 혈관염, 자발 다발성근염, 피부근염, 항인지질 증후군, 자궁견관무력증, 전신홍반성루프스, 유아 특발성 관절염, 레이노 증후군, CREST 증후군 또는 포도막염일 수 있다.
또한, MDCMC는 피부면역질환 작용, 예를 들어, 표피 괴사융해증, 괴저, 육아종, 심상성천포창, 수포유천포창, 및 낙엽성천포창을 포함하는 자가면역 피부 수포성 질병, 백반증, 포도알균 독성 쇼크 증후군, 경피증, 미만성 및 제한성 전신 경화증을 포함하는 전신 경화증, 아토피 피부염, 또는 스테로이드 의존성 아토피 피부염일 수 있다.
또한, MDCMC는 근골격계 면역질환, 예를 들어, 봉입체 근염, 괴사성 근막염, 염증성 근병증, 근염, 항-데코린(BJ 항원) 근병증, 부신생물 괴사성 근병증, X-관련 액포형성 근병증, 페니실아민-유도 다발성근염, 죽경화증, 심장동맥병, 또는 심장근증일 수 있다.
MDCMC는 위장관 면역질환 작용, 예를 들어, 악성 빈혈, 자가면역성 만성 간염, 원발성 담즙성 경변, 만성소화장애증, 포진상 피부염, 잠복성 간경변증, 반응성 관절염, 크론병, 휘플병, 궤양성 대장염, 또는 경화성 담관염일 수 있다.
*MDCMC는, 예를 들어, 이식편대숙주병, 항체-매개 이식 거부반응, 골수이식 후 거부반응, 백혈병, 종양 형성, 천식, 항-베타 세포 항체들을 가진 제 1 형 당뇨병, 쇼그렌 증후군, 혼합결합조직병, 아디손병, 보크트-고야나기-하라다 증후군, 막증식성 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너육아종증, 현미경적 다발성 동맥염, 처그-스트라우스 증후군, 다발성 동맥염, 또는 다장기 기능부전일 수 있다.
MDCMC이 암인 경우, MDCMC는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피혈관육종, 림프관육종, 림프관 내피혈관육종, 활막종, 중피종, 유윙종양, 평활근육종, 횡문근육종, 대장암, 췌장암, 유방암, 자궁암, 전립선암, 편평상피세포암, 기저세포암, 샘암종, 한선암, 피지샘암, 유두상암, 유두상 선암, 낭선암, 수양암종, 기관지원성 암종, 신장세포암, 간종양, 담관암, 융모암, 정소상피종, 배아암종, 윌름즈 종양, 자궁경부암, 고환종양, 폐암, 소세포폐암, 방광암, 상피세포암, 신경교종, 신경교성상세포종, 수아세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경초증, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막아종, 백혈병, 림프종, 다발성골수종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 골수이형성병, 중쇄병, 신경내분비종양, 또는 신경초종일 수 있다.
MDCMC가 골밀도 질환인 경우, MDCMC는 골다공증, 골감소증, 골화석증, 특별성 저성선자극호르몬성저성선증, 거식증, 비치유성 골절, 폐경기골다공증, 비타민 D 결핍 또는 과다, 원발성 또는 속발성 부갑상선 기능항진증, 갑상선 질환 또는 비스포스포네이트 독성일 수 있다.
MDCMC이 급성 감염인 경우, MDCMC는 칸디다증, 칸디다혈증 또는 아스페르길루스증을 포함하는 진균성 질환; 메티실린내성 황색포도구균을 포함하는 포도구균, 연쇄상구균성 피부 및 중인두 이상 또는 그람 음성 패혈증을 포함하는 박테리아 질한; 폐결핵을 포함하는 미코박테륨 감염; 단핵구증, 호흡기 바이러스 감염 또는 대상포진 감염을 포함하는 바이러스 감염; 말라리아, 주혈흡충병 또는 트리파노소마증을 포함하는 기생충 감염일 수 있다.
MDCMC가 만성 감염인 경우, MDCMC는 조갑진균증; 헬리코박터 파일로리균을 포함하는 박테리아 질환; 폐결핵을 포함하는 미코박테륨 감염; 엡스타인-바르 바이러스 감염, 인간 파필로마 바이러스 감염 또는 헤르페스 바이러스 감염을 포함하는 바이러스 감염; 또는 말라리아 또는 트리파노소마증을 포함하는 기생충 감염일 수 있다.
제 14 실시예에서 본 발명은 이식용 또는 부착용 의료 장치 및 이에 부착된 Fc 시약이거나 포함하는 조성물에 관한 것이다.
제 15 실시예에서 본 발명은 이식용 또는 부착용 의료 장치 및 Fc 시약이거나 포함하는 키트에 관한 것이다. 두 실시예에서, 이식용 또는 부착용 의료 장치 및 Fc 시약은 본 발명에서 인용한 것 중 임의의 것일 수 있다. 키트는 적절한 용기를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 장점과 특징은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하는 다음 상세한 설명, 도면 및 예들로부터 명백해질 것이다.
상기는 이하의 본 발명의 상세한 설명을 잘 이해할 수 있도록 본 발명의 특징과 기술적 장점을 넓게 설명하기보다는 요약하였다. 본 발명의 추가 특징과 장점은 이후에서 기술될 것이고 본 발명의 청구항들의 주제를 형성한다. 당업자는 개시된 개념과 특정 실시예는 본 발명의 동일한 목적을 수행하기 위한 다른 구조들을 변형하거나 설계하기 위한 기초로 쉽게 사용될 수 있다는 것을 알아야 한다. 또한 당업자는 이런 균등한 구조는 첨부된 청구항에 설명한 본 발명의 취지와 범위로부터 벗어나지 않는다는 것을 쉽게 알아야 한다. 다른 목적과 장점과 함께 이의 구조와 작동 방법에 대한 본 발명의 특징으로 생각되는 새로운 특징들은 첨부된 도면들과 함께 고려될 때 다음 설명으로부터 더욱 잘 이해될 것이다. 그러나, 도면들의 각각은 예시와 설명 목적으로 제공되며 본 발명의 한계의 정의를 의도한 것이 아니라는 것은 명백하게 이해되어야 한다.
본 발명에 기술된 hIVIG 치환 화합물들에 대한 합리적인 분자 설계에 대한 방법은 면역학적으로 활성인 바이오미메틱(들)의 재조합 및/또는 생화학적 생성을 포함한다. 바람직한 방법들에서, 이런 치환 화합물들은 Fcγ 수용체에 결합하고 면역기능을 조절하는데 각 치환 화합물들의 효과를 평가하기 위해 인비트로로 선별된다. 구체적인 치환 화합물들은 추가 인비보 입증 및 복용/투여 최적화를 위해 선택된다. 치환 화합물들은, 예를 들어, 자가면역질환, 염증질환, 골다공증, 및 암을 치료하는데 효과가 있다. 각 상태는 구체적인 실시예와 함께 아래에 상세하게 기술된다.
본 발명에서 사용된 대로, 청구항 및/또는 상세한 설명에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 "하나"("a" 또는 "an")라는 단어는 "하나"("one")를 의미할 수 있으나, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"이라는 의미와 일치한다.
본 발명에서 사용된 대로, "바이오미메틱", "바이오미메틱 분자", "바이오미메틱 화합물"라는 용어 및 관련 용어는 혼주 hIVIG, 단클론 항체 또는 항체의 Fc 단편과 같은 다른 화합물의 기능을 모방하는 인간 제조 화합물을 의미한다. "생물학적으로 활성인" 바이오미메틱스는 항체, 사이토카인, 인터루킨 및 당업계에 공지된 다른 면역학적 분자들과 같은 자연적으로 발생한 면역학적으로 활성인 분자들과 동일하거나 실질적으로 유사한 면역학적 활성을 나타내는 바이오미메틱스이다. 바람직한 실시예들에서, 본 발명의 바이오미메틱스는 본 발명에서 정의한 대로, 스트라도머 및 스트라도바디이다.
본 발명의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스는 IgG Fc 도메인의 하나 이상의 면역조절 활성들을 보유하고 적어도 (i) FcγI, FcγII, FcγIII 및 FcγIV를 포함하는 FcγR와 결합할 수 있는 제 1 Fc 도메인 및 (ii) cγI, FcγII, FcγIII 및 FcγIV를 포함하는 FcγR와 결합할 수 있는 제 2 Fc 도메인을 갖도록 설계된다.
다음 단락은 본 발명의 바이오미메틱스의 빌딩 블럭을 구조적 및 기능적으로 정의하고 그런 후 바이오미메틱스 자체를 정의한다. 그러나, 상기한 대로, 본 발명의 바이오미메틱스의 각각은 적어도 두 개의 Fc 도메인을 갖는다는 것을 아는 것이 먼저 도움이 되다. 최소로, Fc 도메인은 기능성 Fcγ 수용체 결합 위치를 형성하기 위해 결합하는 두 개의 펩타이드 사슬 또는 팔(모노머들)을 포함하는 다이머 폴리펩타이드(또는 대형 폴리펩타이드의 다이머 부위)이다. 따라서, 본 발명에서 논의된 개별 단편 및 도메인의 기능성 형태는 일반적으로 다이머(또는 멀티머) 형태로 존재한다. 본 발명에서 논의된 개별 단편 및 도메인의 모노머들은 기능성 다이머 구조를 형성하기 위한 제 2 사슬 또는 팔과 결합해야 하는 단일사슬 또는 팔이다.
Fc 단편
"Fc 단편"은 면역글로불린의 카복시 말단에서 일상적으로 발견되는 단백질 부위 또는 단백질 접힌 구조를 기술하는데 사용된다(도 3a-3b 참조). Fc 단편은 불완전하고 불확실한 방법인 파파인 소화를 사용하여 단클론 항체의 Fab 단편으로부터 분리될 수 있다(Mihaesco C and Seligmann M. Papain Digestion Fragments Of Human IgM Globulins. Journal of Experimental Medicine, Vol 127, 431453 (1968)참조). Fab 단편(항체 결합 도메인 포함)과 함께 Fc 단편은 본 발명에서 완전한 항체를 의미하는 holo-항체를 구성한다. Fc 단편은 항체 중사슬들의 카복시 말단 부분으로 구성된다. Fc 단편에서 사슬들의 각각은 길이가 약 220-265 아미노산이고 사슬들은 이황화 결합을 통해 종종 연결된다. Fc 단편은 종종 하나 이상의 독립적인 구조적 접힘 또는 기능성 서브도메인을 포함한다. 특히, Fc 단편은 Fcγ 수용체와 결합하는 최소 구조로서 본 발명에서 정의된 Fc 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 1b 및 1d). 분리된 Fc 단편은 이중화되는 두 개의 Fc 단편 모노머(예를 들어, 항체 중사슬의 두 카복시 말단 부분; 추가로 본 발명에서 정의됨)로 구성된다. 두 개의 Fc 단편 모노머가 결합할 때, 얻어진 Fc 단편은 Fcγ 수용체 결합 활성을 가진다.
Fc 부분 단편
"Fc 부분 단편"은 항체의 전체 Fc 단편을 절대 포함하지 않으나, Fcγ 수용체 결합 활성을 포함하는 Fc 단편과 동일한 활성을 갖는데 충분한 구조를 보유하는 도메인이다. Fc 부분 단편은 Fc 부분 도메인이 유도되는 항체의 아이소타이프에 따라, 힌지 부분의 일부 또는 전부, CH2 도메인의 일부 또는 전부, CH3 도메인의 일부 또는 전부, 및/또는 CH4 도메인의 일부 또는 전부가 없을 수 있다. Fc 부분 단편의 예는 IgG3의 상부, 코어 및 하부 힌지 부위와 CH2 도메인을 포함하는 분자를 포함한다(Tan, LK, Shopes, RJ, 0i, VT and Morrison, SL, Influence of the hinge region on complement activation, C 1 q binding, and segmental flexibility in chimeric human immunoglobulins, Proc Natl Acad Sci USA. 1990 January; 87(1): 162-166). 따라서, 이 예에서, Fc 부분 단편은 IgG3의 Fc 단편에 존재하는 CH3 도메인이 없다. Fc 부분 단편들은 두 개의 부분 단편 모노머로 구성된다. 본 발명에서 추가로 정의한 대로, 두 개의 이런 Fc 부분 단편 모노머가 결합하는 경우, 얻어진 Fc 부분 단편은 Fcγ 수용체 결합 활성을 가진다.
Fc 도메인
본 발명에서 사용된 대로, "Fc 도메인"은 Fcγ 수용체에 결합하거나 Fcγ 수용체에 의해 결합된 최소 부위(대형 폴리펩타이드의 문맥에서) 또는 최소 단백질 접힌 구조(분리된 단백질의 문맥에서)를 기술한다. Fc 단편 및 Fc 부분 단편에서, Fc 도메인은 Fcγ 수용체에 분자가 결합하는 것을 허용하는 최소 결합 부위이다. Fc 도메인이 Fcγ 수용체에 의해 결합된 구별된 폴리펩타이드로 제한될 수 있는 반면에, Fc 도메인은 Fc 단편의 일부 또는 전부뿐만 아니라 Fc 부분 단편의 일부 또는 전부일 수 있다는 것이 명백해질 것이다. "Fc 도메인"이라는 용어가 본 발명에서 사용될 때, 당업자는 하나 이상의 Fc 도메인을 의미하는 것으로 이해할 것이다. Fc 도메인은 두 개의 Fc 도메인 모노머로 구성된다. 추가로 정의한 대로, 두 개의 이런 Fc 도메인 모노머가 결합하는 경우, 얻어진 Fc 도메인은 Fcγ 수용체 결합 활성을 가진다. 따라서 Fc 도메인은 Fcγ 수용체와 기능적으로 결합할 수 있는 다이머 구조이다.
Fc 부분 도메인
본 발명에서 사용된 대로, "Fc 부분 도메인"은 Fc 도메인의 일부를 나타낸다. Fc 부분 도메인은 개개의 중사슬 불변 부위 도메인(예를 들어, CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인) 및 다른 면역글로불린 종류 및 하부종류의 힌지 부위를 포함한다. 따라서, 본 발명의 Fc 부분 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 CH1 도메인, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 CH2 도메인, IgG1 , IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 CH3 도메인, IgM 및 IgE의 CH4 도메인, 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 힌지 부위를 포함한다. 본 발명의 Fc 부분 도메인은 이런 도메인들과 힌지들의 하나 이상의 조합을 더 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 개개의 Fc 부분 도메인들 및 이의 조합은 FcγR와 결합하는 능력이 없다. 따라서, Fc 부분 도메인 및 이의 조합은 Fc 도메인을 전혀 포함하지 않는다. Fc 부분 도메인은 Fcγ 수용체 결합 활성을 가진 펩타이드를 형성하기 위해 함께 연결되어, Fc 도메인을 형성한다. 본 발명에서, Fc 부분 도메인은 본 발명에서 정의한 대로, 본 발명의 바이오미메틱스를 만들기 위해 빌딩 블럭으로서 Fc 도메인과 함께 사용된다. 각각의 Fc 부분 도메인은 두 개의 Fc 부분 도메인 모노머로 구성된다. 두 개의 이런 Fc 부분 도메인 모노머가 결합할 때, Fc 부분 도메인이 형성된다.
상기한 대로, Fc 단편, Fc 부분 단편, Fc 도메인 및 Fc 부분 도메인의 각각은 다이머 단백질 또는 도메인이다. 따라서, 이런 분자들의 각각은 다이머 단백질 또는 도메인을 형성하기 위해 결합하는 두 개의 모노머로 구성된다. 다이머의 특징과 활성이 상기에서 논의된 반면 모노머 펩타이드는 이하에서 논의된다.
Fc 단편 모노머
본 발명에서 사용된 대로, "Fc 단편 모노머"는 다른 Fc 단편 모노머와 결합할 때, Fc 단편을 포함하는 단사슬 단백질이다. 따라서 Fc 단편 모노머는 holo-항체의 Fc 단편(예를 들어, IgG의 힌지 부위, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중사슬의 연속적인 부분)을 구성하는 항체 중사슬들 중 하나의 카복시 말단 부분이다(도 1a 및 도 1c 참조). 한 실시예에서, Fc 단편 모노머는, 최소로, 펩타이드를 형성하기 위해 연속적으로 연결된, 힌지 부위의 한 사슬(힌지 모노머), CH2 도메인의 한 사슬(CH2 도메인 모노머) 및 CH3 도메인의 한 사슬(CH3 도메인 모노머)을 포함한다. 다른 실시예에서, Fc 단편 모노머는 펩타이드를 형성하기 위해 연속적으로 연결된, 힌지 부위의 적어도 한 사슬, CH2 도메인의 한 사슬, CH3 도메인의 한 사슬 및 CH4 도메인의 한 사슬(CH4 도메인 모노머)을 포함한다.
Fc 도메인 모노머
본 발명에서 사용된 대로, "Fc 도메인 모노머"는 다른 Fc 도메인 모노머와 결합할 때, Fcγ 수용체와 결합할 수 있는 Fc 도메인을 의미한다. 두 개의 Fc 도메인 모노머의 결합은 하나의 Fc 도메인을 형성한다. Fc 도메인의 단지 한쪽을 포함하는 Fc 도메인 모노머만으로는 Fcγ 수용체와 결합하지 못한다.
Fc 부분 도메인 모노머
본 발명에서 사용된 대로, "Fc 부분 도메인 모노머"는 다른 Fc 부분 도메인 모노머와 결합할 때, Fc 부분 도메인을 포함하는 단사슬 단백질을 의미한다. Fc 부분 도메인 힌지, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 대한 CH2 및 CH3 모노머의 아미노산 서열들은 도 25에 도시된다. 두 개의 Fc 부분 도메인 모노머의 결합은 하나의 Fc 부분 도메인을 형성한다.
스트라도머
구체적인 실시예들에서, 본 발명의 바이오미메틱스는 스트라도머을 포함한다. 스트라도머는 둘 이상의 Fcγ 수용체와 결합하는 바이오미메틱 화합물들이다(예를 들어, 도 13b 참조). 한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 스트라도머는 NK 세포와 미성숙 수지상 세포 및 다른 단핵구-유도 세포와 같은 작동 세포에 Fcγ 수용체를 결합하는데 사용된다. 한 실시예에서, Fcγ 수용체는 낮은 친화성 Fcγ 수용체이다. 스트라도머는 4개의 다른 물리적 구조: 시리얼, 클러스터, 코어 또는 Fc 단편을 가질 수 있고, 이의 각각은 다음 단락에서 논의된다. 명백한 것과 같이, 상기한 Fc 단편, Fc 부분 단편, Fc 도메인 및 Fc 부분 도메인은 다양한 스트라도머 구조의 형성에 사용된다. 또한, 먼저 형성되고 그 후 본 발명의 스트라도머인 다이머 구조를 형성하기 위해 자가결합되는 것은 상기한 대로 개개의 Fc 도메인 모노머 및 Fc 부분 도메인 모노머이다.
시리얼 스트라도머
"시리얼 스트라도머"는 결합할 때, 둘 이상의 Fc 도메인을 형성하는 두 개의 직선형 스트라도머 모노머로 구성된 다이머 폴리펩타이드이다. 스트라도머의 Fc 도메인은 두 개의 펩타이드 사슬(스트라도머 모노머)이 결합할 때만 기능성이다(즉, 모노머 상태에서는 비 기능성이다). 따라서 시리얼 스트라도머는 둘 이상의 Fcγ 수용체와 결합할 수 있는 바이오미메틱 화합물이다. 다른 실시예들에서, 시리얼 스트라도머는 2, 3, 4, 5, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상의 Fc 도메인뿐만 아니라 Fc 부분 도메인을 가질 수 있다. 시리얼 스트라도머 내의 Fc 도메인과 Fc 부분 도메인은 본 발명에서 추가로 정의한 대로 도메인 결합에 의해 연결될 수 있다.
본 발명에서 사용된 대로, "스트라도머 다이머"는 두 개의 스트라도머로 구성된 스트라도머의 특정 형태이다. 한 실시예에서, 스트라도머 다이머들은 관련 스트라도머 모노머의 자가결합에 의해 형성된 분자들이다. 다른 실시예에서, 스트라도머 다이머들에 있는 스트라도머 모노머들은 본 발명에서 정의한 대로 상호-스트라도머 모노머 결합을 통해 물리적으로 연결된다. "멀티머 스트라도머"는 스트라도머 모노머들의 자가결합 또는 상호-스트라도머 모노머 결합에 의해 형성된 셋 이상의 스트라도머로 구성된다.
*스트라도머 모노머
본 발명에서 사용된 대로, "스트라도머 모노머"라는 용어는 적어도 하나의 제 2 스트라도머 모노머와 결합할 때, 적어도 두 개의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 형성하는 하나의 연속된 펩타이드 분자를 의미한다(예를 들어, 도 6a-6b, 도 12a 참조). 바람직한 실시예에서, 시리얼 스트라도머는 두 개의 결합된 스트라도머 모노머(예를 들어, 도 5a, 5b, 7a, 7b, 7c, 7d 참조)로 구성되는 반면에, 시리얼 스트라도머는 셋(도 11c 참조) 이상의 스트라도머 모노머를 포함할 수 있다. 스트라도머 모노머들은 상호-스트라도머 모노머 결합에 의해 스트라도머를 형성하도록 결합될 수 있거나 자가결합을 통해 스트라도머를 형성할 수 있다.
스트라도머 모노머는 다른 스트라도머 모노머와 결합할 때 스트라도머를 형성하는 1, 2, 3, 4, 5, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상의 Fc 도메인을 형성할 아미노산 서열을 가질 수 있다. 스트라도머 모노머는 다른 스트라도머 모노머와 결합할 때 스트라도머를 형성하는 1, 2, 3, 4, 5, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상의 Fc 부분 도메인을 형성할 아미노산 서열을 추가로 가질 수 있다.
스트라도머의 문맥에서 Fc 도메인과 Fc 부분 도메인을 형성할 스트라도머 모노머들의 부위들은 스트라도머 모노머 분자의 연속적인 부위의 카복시 말단으로부터 아미노 말단까지 간단히 배열될 수 있다(예를 들어, 도 4a-4b 참조). 선택적으로, 스트라도멍 모노머들의 연속적인 부위들은 "도메인 결합"로 불리는 펩타이드 서열을 통해 연결될 수 있다. 스트라도머 모노머를 포함하는 구체적인 Fc 도메인 모노머들과 Fc 부분 도메인 모노머들의 배열은 중요하지 않다. 그러나, 배열은 두 개의 스트라도머 모노머들의 결합에 의해 두 개의 기능성 Fc 도메인의 형성을 허용해야 한다.
본 발명의 스트라도머들의 한 실시예에서, Fc 도메인 또는 Fc 부분 도메인을 만들기 위해, 하나 또는 두 개의 말단 IgE CH2 도메인 모노머 또는 부분 IgG3 힌지 도메인 모노머와 같이 자신에게 강하게 결합하는 Fc 도메인 모노머 또는 Fc 부분 도메인 모노머를 펩타이드의 N-말단에 함유하는 스트라도머 모노머들이 생산된다. 이런 스트라도머 모노머들의 각각은 스트라도머의 형성에 의해 두 개의 Fc 감마 수용체와 결합하는 Fc 도메인 모노머들 및/또는 부분 Fc 도메인 모노머들의 필수 보체를 가진다. 이런 스트라도머 모노머들의 결합으로부터 발생한 스트라도머들은 둘 이상의 Fc 감마 수용체들과 결합할 수 있는 바이오미메틱스이다. 한 바람직한 실시예에서, N-말단 Fc 도메인 또는 Fc 부분 도메인은 IgE CH2 도메인 상에 존재하는 것과 같이 추가 글리코실화 부위를 포함한다.
명확한 예로서, 당업자는 본 발명의 스트라도머 분자들이 Fc 도메인 모노머들 및 Fc 부분 도메인 모노머들의 다양한 조합을 암호화하나, 최소 두 개의 Fc 도메인 모노머를 형성하는 조합을 가진 폴리뉴클레오티드 분자를 제조함으로써 만들어질 수 있다. 이런 폴리뉴클레오티드 분자는 박테리아의 집단을 변형시키는데 사용될 수 있는 발현 벡터 속에 삽입될 수 있다. 스트라도머 모노머들은 적절한 배양 조건하에서 변형된 박테리아를 배양함으로써 생산될 수 있다. 스트라도머 모노머들은 스트라도머 모노머들의 자가결합 또는 상호-스트라도머 모노머 결합을 사용하는 스트라도머 모노머들의 결합에 의해 기능성 스트라도머들을 형성할 수 있다. 본 발명은 동일한 아미노산 서열들을 갖는 스트라도머 모노머들, 실질적으로 유사한 아미노산 서열들을 가진 스트라도머 모노머들 또는 유사하지 않은 서열들을 가진 스트라도머 모노머들의 결합을 통해 형성된 스트라도머들을 포함한다. 후자 실시예에서, 스트라도머를 포함하는 스트라도머 모노머들의 아미노산 서열은 둘 이상의 기능성 Fcγ 수용체 결합 위치가 형성되는 유사성이 필요하다.
상기한 대로, Fc 도메인은 Fcγ 수용체와 결합하는 이의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. 그 결과로서, Fc 도메인의 특정 아미노산 서열은 Fc 도메인을 포함하는 Fc 부분 도메인들을 기초로 해서 변할 것이다. 그러나, 본 발명의 한 실시예에서, Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 힌지 영역과 CH2 도메인을 포함한다. 다른 실시예에서, Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 힌지 부위, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 면역글로불린 분자의 힌지 부위, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
도메인 결합
상기한 대로, "도메인 결합"은 본 발명의 시리얼 시트라도머 또는 스트라도바디의 개개의 스트라도머 모노머들의 각각을 포함하는 Fc 도메인 모노머들 및/또는 Fc 부분 도메인 사이의 펩타이드 결합이다. 도메인 결합은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 아미노산일 수 있다. 도메인 결합은 고유 서열에 있는 Fc 부분 도메인 모노머들 사이에서 발생하지 않는다. 즉, IgG의 힌지 부위, CH2 도메인 및 CH3 도메인과 같은 Fc 도메인 모노머들의 연결된 자연적으로 연속된 부분이 사용되는 경우, 이런 Fc 부분 도메인 모노머들은 연속된 서열을 포함하고 이런 원소들 사이에 도메인 결합은 필요하지 않다. 반대로, 예를 들어, 둘 이상의 Fc 도메인 모노머들 또는 부분 Fc 도메인 모노머들이 개개의 스트라도머 모노머를 형성하기 위해 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 연결될 때, 도메인 결합이 사용될 수 있다. 한 예는 두 개의 힌지/CH2/CH3 펩타이드 사이의 결합일 수 있고, 힌지/CH2/CH3L/힌지/CH2/CH3를 포함하는 스트라도머의 개개의 스트라도머 모노머를 형성하며, "L"은 도메인 결합이다(도메인 결합(도시되지 않음)이 IgG1 CH3 도메인과 IgG1 힌지 사이에 발생하는 도 4a 참조). 기술된 다양한 경우에, 도메인 결합은 항체의 Fc 도메인 모노머에 힌지와 CH 도메인을 결합하는 중사슬의 자연적으로 발생하는 부분들 중 하나일 수 있다. 선택적으로, 도메인 결합은 객개의 스트라도머 모노머들이 서로 쌍을 이루어 본 발명의 스트라도머들을 형성하는 개개의 스트라도머 모노머의 Fc 도메인 모노머들과 부분 Fc 도메인 모노머들 사이에 필요한 공간과 유연성을 제공하는 임의의 다른 아미노산 서열일 수 있다.
당업자는 도메인 결합의 정체는 둘 이상의 개개의 스트라도머 모노머들이 본 발명의 바이오미메틱 화합물들을 형성하게 하는 한 특히 중요하지 않고 결과로 얻은 화합물들은 하나 이상의 FcγR를 가교할 수 있는 능력을 갖는다는 것을 이해할 것이다. 각각의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 화합물은 제한된 공간 부위 내에 면역학적으로 활성인 바이오미메틱의 Fc 도메인들을 유지하도록 기능하고, 예를 들어, 공유결합을 통해 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 내의 Fc 도메인들에 FcγR를 결합함으로써 FcγR 활성화 활성을 용이하게 할 시리얼 스트라도머 또는 스트라도바디의 각각의 스트라도머 모노머에 적어도 하나의 도메인 결합을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 바람직하게는, 도메인 결합들은 IgG 분자들의 힌지 도메인에 의해 제공되는 것과 같이 동일하거나 더 큰 구조적 변화를 허용할 것이다. 모든 상기 결합들은 당업계에 주지되어 있다.
상호- 스트라도머 모노머 결합
본 발명의 바이오미메틱 화합물들에서 발견된 한 분리된 결합은 본 발명의 스트라도머들과 스트라도바디들 을 포함하는 둘 이상의 개개의 스트라도머 모노머들 사이에서 일어나는 "상호-스트라도머 모노머 결합"이다. 도메인 결합들은 바이오미메틱 화합물들의 개개의 스트라도머 모노머들을 포함하는 Fc 도메인 모노머들과 부분 Fc 도메인 모노머들을 서로 연결하는 역할을 하는 짧은 아미노산 서열들인 반면, 상호-스트라도머 모노머 결합들은 바이오미메틱 화합물들을 포함하는 둘 이상의 개개의 스트라도머 모노머들을 연결하는 역할을 한다. 상호-스트라도머 모노머 결합은 개개의 스트라도머 모노머들을 안정하게 결합할 수 있는 임의의 결합일 수 있다. 일부 실시예들에서, 상호-스트라도머 모노머 결합은 스트라도머 모노머들 사이의 공유 결합일 수 있다. 선택적으로, 스트라도머 모노머들 사이의 상호-스트라도머 모노머 결합은 직접적인 화학적 가교에 의할 수 있다. 바람직한 실시예들에서, 스트라도머 모노머 구조들은 자가-결합 스트라도머를 형성하기 위해 Fc 도메인 모노머들 사이의 자연적인 자가-결합 특성을 이용한다. 이런 실시예들에서, 이황화 결합은 스트라도머들을 형성하기 위해 개개의 스트라도머 모노머들 사이에 형성된다(상호-스트라도머 모노머 결합들(도시되지 않음)은 스트라도머의 두 개의 개개의 스트라도머 모노머들을 연결하는 역할을 하는 도 5a를 참조). 이황화 결합들은 바이오미메틱 분자들을 포함하는 Fc 도메인 모노머들의 시스테인 잔기들 사이에 형성되어, 자연적인 Fc 도메인 모노머 서열에서 발생하는 시스테인 잔기들 또는 자리 지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 의한 Fc 도메인 모노머 속에 합체된 시스테인 잔기들을 사용한다. 이런 자연적인 자가-결합 특성들은 스트라도머 멀티머들에 있는 개개의 스트라도머 모노머들 사이의 상호-스트라도머 모노머 결합을 형성하는데 사용될 수 있다. 다른 실시예들은 이황화 결합들이 개개의 스트라도머 모노머들을 포함하는 자리 지정 돌연변이유발을 통해 아미노산 서열 속으로 주입된 시스테인 잔기들 사이에 형성되는 상호-스트라도머 모노머 결합들을 포함한다.
상기한 대로, 한 바람직한 실시예에서, 스트라도머를 형성하는 상호-스트라도머 모노머 결합은 스트라도머 모노머들의 자가-결합에 의해 얻은 결합이다. 한 실시예에서, 스트라도머를 포함하는 두 개의 스트라도머 모노머들은 동일한 펩타이드이고, 스트라도머를 포함하는 두 개의 스트라도머 모노머들은 서열이 동일하다. 그러나, 당업자는 다른 실시예들은 스트라도머 모노머들이 아미노산 서열에서 서로 다른 스트라도머들을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
두 개의 스트라도머 모노머들은, 예를 들어, 평행하게 배열하여 스트라도머 모노머들에서 동일한 Fc 부분 도메인 모노머들 사이에 짝짓기가 일어나게 함으로써 스트라도머를 형성할 수 있다(예를 들어, 도 5a-5b 참조). 그러나, 본 발명은 동일하지 않은 Fc 부분 도메인 모노머들 사이에 짝짓기가 일어나는 실시예들과 스트라도머 모노머들에서 동일한 Fc 부분 도메인 모노머들 사이에 짝짓기가 발생하나 두 개의 스트라도머 모노머들의 배열은 상쇄되는 실시예들(도 11c 참조)을 포함한다.
스트라도머 모노머의 생산과 자가-이중화를 제어하기 위해서, "캡핑 부위(capping regions)"가 사용될 수 있다. 예를 들어, 스트라도머 모노머 서열은 다음 Fc 부분 도메인들: IgE CH2/IgG1 힌지/IgG1 CH2/IgG1 CH3/IgG1 힌지/IgG1 CH2/IgE CH4를 포함할 수 있고(도 13a 참조), IgE 도메인들은 "지퍼링 효과(zippering effect)"를 예방하는 캡으로 작용한다. 지퍼링 효과는 스트라도머 모노머(도 11a 참조)가 자동 이중화할 때 일어날 수 있거나(도 11b) 자동-이합체로서가 아닌 교대하는 모노머들로서 평행하게 배열할 수 있다(도 11c 참조). 당업자 중 하나는 임의의 면역글로불린의 힌지 또는 IgM 또는 IgE의 CH4 도메인과 같은 다양한 Fc 부분 도메인들은 원할 때 스트라도머가 자동 이중화하도록 유도하거나 지퍼링 효과를 억제하기 위해 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 다른 연속되지 않은 구조들은 가지형 분자들(도 12b 참조), 단순 공유결합, 펩타이드 링커, 또는 비-펩타이드 링커와 같은 링커에 의해 결합되어 평행하게 배열된 둘 이상의 스트라도머를 포함할 수 있다(도 14a 및 14b 참조).
코어 스트라도머
"코어 스트라도머"는 둘 이상의 코어 스트라도머 단위와 결합하는 코어 모이어티로 구성되며, 각각의 코어 스트라도머 단위는 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하여, 둘 이상의 Fcγ 수용체들과 결합할 수 있는 바이오미메틱 화합물을 형성한다. Fc 단편, Fc 부분 단편, 시리얼 스트라도머 또는 클러스터 스트라도머 단위는 이들 분자들의 각각은 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하기 때문에 코어 스트라도머에 코어 스트라도머 단위들의 하나 또는 모두(두 개의 Fc 도메인으로 구성되는 경우)로서 독립적으로 작용할 수 있다. 따라서, 코어 스트라도머는 적어도 하나의 시리얼 스트라도머와 결합하는 코어 모이어티를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 대로, 코어 스트라도머의 코어 모이어티는 코어 스트라도머가 연결되거나 공유결합될 수 있는 임의의 물리적 구조이다. 코어 모이어티로 작용할 수 있는 바람직한 폴리펩타이드는 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌, 소혈청 알부민 및 난백 알부민을 포함한다. 이런 코어 모이어티들과 코어 스트라도머 단위들(예를 들어, Fc 단편, Fc 부분 단편, Fc 도메인, 시리얼 스트라도머 및 클러스터 스트라도머 단위) 사이의 화학적 가교는 주지된 기술들을 사용하여 여러 화학물질을 사용하여 성취될 수 있다. 예시적 화학물질은 일반적으로 글루타르알데하이드, 카보다이이미드, 숙신이미드 에스터(예를 들어, MBS, SMCC), 벤디딘, 페리오데이트, 아이소티오시아네이트; Bis(NHS)PE05, DFDNB(1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)과 같은 PEO(폴리에틸렌)/PEG(폴리에틸렌 글리콜) 스페이서; 및 알데하이드-활성화 덱스트란, 비스(설포숙신이미딜)수버레이트, 비스[2-(숙신이미도옥시카보닐옥시)에틸]설폰, 다이메틸 아디피미데이트·2 HCl, 다이메틸 피멜리미데이트·2 HCl, 다이메틸 수베리미데이트·2 HCl, 다이숙신이미딜 글루타레이트, 다이티오비스(숙신이미딜)프로피오네이트, 다이숙신이미딜 수베레이트, 다이숙신이미딜 타르트레이트, 다이메틸 3,3'-다이티오비스프로피온이미데이트·2 HCl, 3,3'-다이티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트), 에틸렌 글리콜 비스[숙신이미딜숙시네이트], 에틸렌 글리콜 비스[설포숙신이미딜숙시네이트], 에틸렌 글리콜 비스[설포숙신이미딜숙시네이트], β-[트리스(하이드록시메틸)포스피노]프로피온산 및 트리스-숙신이미딜 아미노트라이세테이트를 포함하는 아민 반응성 동종이작용기성 교차제를 포함한다. 당업자 중 하나는 선택된 특정 코어 모이어티와 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스를 형성하기 위해 결합되는 Fc 도메인-함유 폴리펩타이드의 서열을 기초로 적절한 가교 화학물질과 조건들을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, Wong, Shan S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. Boca Raton: CRC Press, c1991 (ISBN 0849358868) 참조.
다른 바람직한 실시예에서, 연결 (J) 사슬 폴리펩타이드는 코어 모이어티로 사용될 수 있다. J 사슬이 코어 모이어티로 사용되는 경우, 시스테인 다리들은 코어 스트라도머를 형성하기 위해 개개의 코어 스트라도머 단위들을 연결하는데 사용될 수 있다(도 10a-10d 참조). 코어 스트라도머의 한 실시예에서, 터미널 IgM CH4 도메인을 포함하는 시리얼 스트라도머(코어 스트라도머 단위로 작용)는 코어 스트라도머를 형성하기 위해 J 사슬과 결합한다. IgM CH4 도메인의 삽입은 다중 Fc 감마 수용체들과 결합할 수 있는 바이오미메틱을 형성하기 위해 J 사슬을 가진 이 Fc 부분 도메인을 포함하는 스트라도머들의 자가 결합을 일으킨다. 다른 예시적 코어 스트라도머는 Fc 도메인들(코어 스트라도머 단위들로 작용)을 포함하는 것이고 Fc 도메인들은 구조 IgG3 힌지/IgG3 CH2/IgG3 CH2/IgG3 CH3/IgM CH4를 갖는다. 이 분자의 구성요소 Fc 도메인들은 하나 이상의 Fc 감마 수용체와 개별적으로 결합하지 못하나, 전체 구조는 구성요소 Fc 감마가 J 사슬과 결합할 때 5개의 Fc 감마 수용체들과 결합할 수 있다.
다른 실시예에서, 코어 모이어티는 비 폴리펩타이드일 수 있다. 다양한 적절한 조성물들은 면역학적으로 활성인 바이오미메틱을 생산하기 위해 코어 스트라도머 단위들과 물리적으로 결합할 수 있다.
비 독성 비드, 고차가지구조 폴리머 및 덴드리머, 나노입자들 및 FDA에 의해 일반적으로 안전하다고 분류되는 다양한 화합물들(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 리포솜 및 칼슘살리실산)이 사용될 수 있다. 예를 들어, Nanoparticulates as Drug Carriers by Vladimir P. Torchilin (Editor), Imperial College Press (Sept. 2006) ISBN: 1860946305/ISBN-13: 9781860946301 참조.
본 발명의 바람직한 코어 모이어티들은 비드, 알부민, 리포솜, 펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
클러스터 스트라도머
"클러스터 스트라도머"는 중앙 모이어티 "헤드" 및 둘 이상의 "레그"을 가진 문어형태를 가진 바이오미메틱이고, 각 레그는 적어도 하나의 Fc 감마 수용체와 결합할 수 있는 하나 이상의 Fc 도메인을 포함하여, 둘 이상의 Fc 감마 수용체와 결합할 수 있는 바이오미메틱을 형성한다. 각각의 클러스터 스트라도머는 각각 "클러스터 스트라도머 단위"로 불리는 하나 이상의 다이머 단백질로 구성된다. 각각의 클러스터 스트라도머 단위는 다중화하는 부위 및 적어도 하나의 기능성 Fc 도메인을 포함하는 "레그" 부위로 구성된다. 다중화 부위는 다른 클러스터 스트라도머 단위의 다중화 부위로 한 번 다중화된 클러스터 스트라도머 "헤드"를 형성한다. 레그 부위는 각각의 레그 부위에 Fc 도메인들이 있는 것 만큼의 Fcγ 수용체들과 결합할 수 있다. 따라서 클러스터 스트라도머는 둘 이상의 Fcγ 수용체와 결합할 수 있는 바이오미메틱 화합물이다.
다중화 부위는 다이머 단백질이 추가로 다중화하게 하는 펩타이드 서열일 수 있거나 선택적으로 다중화 부위는 다이머 단백질의 다중화를 강화하는 글리코실화일 수 있다. 펩타이드 다중화 부위의 예들은 IgG2 힌지, IgE CH2 도메인, 아이소루신 지퍼 및 아연 핑거를 포함한다. 펩타이드 다중화에 대한 글리코실화의 영향은 종래기술에 잘 기술된다(예를 들어, Role of Carbohydrate in Multimeric Structure of Factor VIII/V on Willebrand Factor Protein. Harvey R. Gralnick, Sybil B. Williams and Margaret E. Rick. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 80, No. 9, [Part 1: Biological Sciences] (May 1, 1983), pp. 2771-2774; Multimerization and collagen binding of vitronectin is modulated by its glycosylation. Kimie Asanuma, Fumio Arisaka and Haruko Ogawa. International Congress Series Volume 1223, December 2001, Pages 97-101).
당업자는 클러스터 스트라도머 단위는 다중화 부위와 함께 시리얼 스트라도머(둘 이상의 Fc 도메인 포함)를 포함할 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 클러스터 스트라도머의 "레그"는 상기한 시리얼 스트라도머의 임의의 형태 및/또는 하나 이상의 IgG1 Fc 단편 및/또는 IgG3 Fc 단편 및/또는 단일 Fc 도메인으로 구성될 수 있다. 당업자는 이런 바이오미메틱스에서 IgG1 Fc 단편들 및 IgG3 Fc 단편의 각각은 임의의 면역글로불린으로부터의 부분 Fc 단편을 포함하도록 변형될 수 있다는 것을 알 것이다. 상기한 클러스터 스트라도머 단위(상기한 대로, 두 펩타이드 다이머 결합형태로 존재)를 포함하는 모노머들은 "클러스터 스트라도머 단위 모노머들"이다. 제조된 클러스터 스트라도머 단위가 다중화 이전에 하나 이상의 낮은 친화성 Fc 감마 수용체와 결합하지 않는 예시적 클러스터 스트라도머는 IgE CH2 / IgG1 힌지 / IgG1 CH2 / IgG1 CH3이다.
당업자는 시리얼 스트라도머가 클러스터 스트라도머의 "레그"로 사용될 때, 각 "레그"는 하나 이상의 Fc 감마 수용체(적어도 두 개의 Fc 도메인은 시리얼 스트라도머로 존재)와 결합할 수 있어서 하나 이상의 Fc 감마 수용체와 결합할 수 있는 바이오미메틱스를 형성한다. Fc 부분 도메인, 다른 면역글로불린 서열들, 및 비-면여글로불린 서열들은 클러스터 스트라도머를 형성하기 위해 레그를 포함하는 개개의 클러스터 스트라도머 단위 모노머들의 밀단에 위치될 수 있고 각각의 레그는 하나 이상의 Fc 감마 수용체와 결합하는 이들의 능력을 증가시키도록 바람직한 공간 근접성을 가진다.
다중화 부위는 펩타이드가 이중화 또는 다중화되게 하고 IgG2 힌지, IgE CH2 도메인, 아이소루신 지퍼 및 아연 핑거를 포함하는 펩타이드 서열일 수 있다. 당업계에 공지된 대로, 인간 IgG2의 힌지 부위는 공유 결합 다이머를 형성할 수 있다(Yoo, E.M. et al. J. Immunol. 170, 3134-3138 (2003); Salfeld Nature Biotech. 25, 1369-1372 (2007)). IgG2의 다이어 형성은 C-C 결합에 의해 IgG2 힌지 구조를 통해 잠재적으로 매개되어(Yoo et al 2003), 힌지 구조는 다이머 형성을 단독으로 매개할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, IgG2 힌지(및 따라서 클러스터 스트라도머 단위로 작용)을 가진 시리얼 스트라도머는 두 개의 시리얼 스트라도머 또는 세 개의 시리얼 스트라도머를 포함할 수 있는 클러스터 스트라도머를 형성할 것이다.
인간 IgG2 힌지 모노머의 아미노산 서열은 다음과 같다: ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 36). 힌지의 코어 구조는 힌지 모노머의 C-X-X-C 부분이다. 따라서, 본 발명의 스트라도머 모노머들은 Fc 도메인 모노머들과 함께, IgG2 힌지 모노머의 완전한 12개 아미노산 서열 또는 4개의 아미노산 코어를 포함할 수 있다. 코어 구조의 X-X는 임의의 아미노산일 수 있는 반면에, 한 바람직한 실시예에서 X-X 서열은 V-E 또는 P-P이다. 당업자는 IgG2 힌지 모노머는 IgG2 힌지 서열의 전부 또는 IgG2 CH2 및 CH3 도메인 모노머 서열의 전부를 포함하는 코어 4개 아미노산 구조이외에 힌지 서열의 임의의 부분으로 구성된다. 가능한 IgG2 힌지 - IgG1 Fc 도메인 시리얼 스트라도머 구조체들의 구체적인 예들은 다음과 같다.
N-말단 H CH2 CH3 H CH2 CH3 H CH2 CH3 C-말단
CXXC 1 1 1
CXXC 1 1 1 1 1 1
2 2 2 1 1 1
2 2 2 1 1 1 1 1 1
2 1 1 1
2 1 1 1 1 1 1
2x 2 2 1 1 1
2x 2 2 1 1 1 1 1 1
2x 2 2 1 1 1 1 1 1 IgE 힌지
2x 1 1 1
명명법: H = 힌지, CH2 = 불변 중사슬 도메인 2, CH3 = 불변 중사슬 3, 1 = IgG1, 2 = IgG2, X = 임의의 아미노산; 2x = 연속적인 순서로 2개의 힌지
이들은 많은 실시예들 중 단지 일부이다. IgG1 Fc 도메인의 임의의 것은, 예를 들어, IgG3 Fc 도메인으로 대체될 수 있다. IgG2 이중화 도메인을 가진 추가 단백질들은 IgM 또는 IgE 도메인 모노머 서열들을 포함하는 N 및/또는 C 말단 서열들의 첨가에 의해 IgG2-IgG1 키메릭 단백질을 포함한다. 이런 N 및 C 말단 서열들은 힌지 부위, 상수 도메인 또는 둘 다일 수 있다.
상기한 대로, 루신 및 아이소루신 지퍼들은 다중화 부위로 사용될 수 있다. 루신 및 아이소루신 지퍼(코일드-코일 도메인들)는 단백질 다이머, 트라이머 및 테트라머의 형성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993); O'Shea et al. Science 243 :538 (1989)). 트라이머를 형성하는 아이소루신 지퍼의 자연적 경향의 장점을 이용함으로써, 클러스터 스트라도머들은 아이소루신 지퍼를 포함하는 시리얼 스트라도머들을 사용하여 생산될 수 있다. 아이소루신 지퍼들을 가진 셋 이상의 시리얼 스트라도머들(클러스터 스트라도머 단위로서)의 결합은 적어도 6개 Fc 감마 수용체 결합 부위들을 가진 클러스터 스트라도머들의 형성을 일으킨다.
당업자는 루신 및 아이소루신 지퍼들의 다른 형태가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이지만, 한 바람직한 실시예에서 (Morris et al., Mol. Immunol. 44:3112-3121 (2007); Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993))에 개시된 대로 변형된 GCN4 전사 조절자에 의한 아이소루신 지퍼가 사용된다: YTQKSLSL SPGKELLGGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERGHGGGSNSQVSHRYPRFQSIKVQFTEYKKEKGFILTS (SEQ ID NO:37). 이것은 아이소루신 지퍼 서열은 Fc 도메인 모노머들의 다중화를 위해 사용될 수 있는 여러 가능한 서열들 중 단지 하나이다. SEQ ID NO:37에 도시된 전체 서열이 사용될 수 있는 반면에, 서열의 밑줄친 부분은 본 발명의 클러스터 스트라도머들에 사용될 수 있는 아이소루신 지퍼의 코어 서열을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 스트라도머 모노머들은 하나 이상의 Fc 도메인 모노머들과 함께, 아이소루신 지퍼(ILZ)의 완전한 88개 아미노산 서열 또는 28개 아미노산 코어를 포함할 수 있다. 당업자는 아이소루신 지퍼는 코어 28개 아미노산 구조 이외에 지퍼의 임의의 부분으로 구성될 수 있고 아이소루신 지퍼의 28개 이상의 아미노산, 88개 미만의 아미노산로 구성될 수 있다. 가능한 ILZ-IgG1 Fc 도메인 구조체들의 구체적인 예들은 다음과 같이 도시된다.
H CH2 CH3 H CH2 CH3
ILZ 1 1 1
ILZ 1 1 1 1 1
ILZ 1 1 1 1 1 1
ILZ 1 1 1 3 3 3
명명법: H = 힌지, CH2 = 불변 중사슬 도메인 2, CH3 = 불변 중사슬 도메인 3, 1 = IgG1, 3 = IgG3, ILZ = 아이소루신 지퍼 도메인
이들은 여러 예들 중 일부이다. IgG1 도메인들 중 임의의 것은, 예를 들어, IgG3 도메인으로 대체될 수 있다. ILZ 도메인들을 가진 추가 단백질들은 IgM 또는 IgE와 같은 다른 Ig 분자들의 N 및/또는 C 말단 서열들의 첨가에 의해 IgG1 키메릭 단백질들을 포함한다. 이런 N 및 C 말단 서열들은 힌지 부위, 불변 도메인 또는 둘 다일 수 있다.
Fc 단편 스트라도머
"Fc 단편 스트라도머"는 하나 이상의 Fc 단편으로 구성된다. Fc 단편의 전사 후 변형에 영향을 받을 수 있는 특정 상황들하에서, Fc 단편은 하나 이상의 Fcγ 수용체에 결합하는 분자의 형성을 허용하기 위해 충분한 강도로 다른 Fc 단편에 결합한다. 이런 결합을 허용하는 전사 후 변형은 글리코실화 및 메틸화를 포함한다. 재조합 Fc 단편들이 생산되고 이들이 생산되는 조건에서 세포주의 정체가 Fc 단편들이 Fc 단편 스트라도머들을 형성할 것인지를 좌우한다. 예를 들어, 프리스타일맥스 CHO 일시적 트랜스펙션 세포에서 생산된 재조합 Fc 단편은 웨스턴 블럿에서 볼 수 있는 멀티머를 형성하고, 플라즈몬 공명 결합 분석법에 일치된 2가에 따라 결합되고 IVIG에 필적할 수 있는 수지상 세포 분석에서 생물학적 활성을 나타낸다. 반대로, 안정한 CHO 세포주에서 생산된 동일한 재조합 Fc 단편은 웨스턴 블럿에서 Fc 단편의 멀티머들을 형성하지 않고, 플라스몬 공명 결합 분석법에 일치된 1가에 따라 결합하고 필적할 수 있는 생물학적 활성을 나타내지 않는다. 따라서 Fc 단편 스트라도머는 둘 이상의 Fcγ 수용체들과 결합할 수 있는 바이오미메틱 화합물이다.
본 발명에서 사용된 대로, "Fc 다이머"라는 용어는 Fc 단편들의 다이머이고(도 2a 참조), "Fc 트라이머"는 Fc 단편들의 트라이머이고 "Fc 멀티머"는 Fc 단편들의 멀티머(도 2b 참조)이다.
스트라도바디
본 발명은 스트라도바이들을 포함한다. 본 발명에서 사용된 대로, "스트라도바디"는 바람직하게는 스트라도머(시리얼 스트라도머, 코어 스트라도머, 클러스터 스트라도머 및 Fc 단편 스트라도머를 포함)의 문맥에서, 둘 이상의 Fc 도메인을 포함하는 분자를 의미하고, 여기에 하나 이상의 Fab 도메인들이 부착된다(예를 들어, 도 8a-b 및 9a-b). 따라서, 이런 Fab 도메인들에 의해, 스트라도바디들은 스트라도머 Fcγ 수용체 결합 활성뿐만 아니라 항원 결합 능력을 가진다. 일부 실시예에서, Fcγ 수용체 결합 활성은 자연적 구조 holo-항체의 Fc 부분과 동일하거나 큰 FcγR과 결합하고 가교할 수 있는 능력 때문일 것이다. 바람직하게는 스트라도바디의 Fab 부분은 중사슬 및 경사슬을 포함한다. 가변성 중사슬 및 경사슬은 각각 IgA1, IgA2, IgM, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4와 같은 임의의 혼용가능한 면역글로불린으로 얻을 수 있고 동일하거나 바람직하게는 다른 Ig 아이소타이프로부터 얻을 수 있다. 경사슬 카파 및 람다는 다른 Ig 아이소타이프로부터 얻을 수 있다. 스트라도머들과 같이 스트라도바디들은 둘 이상의 FcγRs과 결합할 수 있고 면역기능을 조절할 수 있다.
한 실시예에서, 스트라도머들은 스트라도바디를 형성하기 위해 스트라도머의 Fc 힌지(H) 도메인에 연결된 Fab의 면역글로불린을 가질 수 있다(예를 들어, 도 8a 및 b). 다른 실시예에서, 스트라도바디는 IgG1 Fc - IgG1(힌지 - CH2)로 구성될 수 있다(예를 들어, 도 9a). 다른 실시예들에서, 스트라도바디는 IgG1 도메인 및 힌지, IgG3 도메인 및 힌지 및 IgGE 도메인 및 힌지로 구성될 수 있다(예를 들어, 도 9b). Fab는 고유 면역글로불린 구조들에 발견된 중사슬 및 경사슬를 포함한다(도 3a-b).
스트라도바디들은 Fab 부분의 항원 결합 특성들과 상기 스트라도머 특성들을 가질 것이다. 이런 조합은 특히 낮은 에피토프 발현의 환경(예를 들어, 90%의 유방암 환자들의 종양이 her/2-neu 고 발현자로 분류되지 않음)에서, holo-항체의 Fc 주쇄에 의해 성취될 수 있어서, 높은 퍼센트의 환자들에서 ADCC를 유도한다. 상기한 대로, 하나 이상의 항원-결합 Fab 단편들은 스트라도바디들을 형성하기위해 스트라도머들에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 스트라도머들에 첨가된 (본 발명에서 기술한 결합이 아닌) 폴리펩타이드들은 비-면역글로불린 폴리펩타이드의 전부 또는 부분이 아니다.
Fab는 생쥐, 쥐, 토끼, 원숭이 또는 염소 항체로부터 가변 부위와 같은 인간 불변 부위 및 비 인간 가변 부위로 구성된 키메릭 구조일 수 있다. 당업자는 이런 제조를 위해 현재 사용할 수 있고 과학 논문에 기술된 방법들을 사용하여 스트라도바디들 속에 포함시키기 위한 다양한 Fab 키메릭 구조들을 만들 수 있을 것이다. 따라서, "인간화된" 스트라도바디들은 "인간화된 단클론 항체들"과 유사하게 설계될 수 있다.
변이체 및 상동체
당업자는 본 발명의 스트라도머들 및 다른 바이오미메틱스들은 IgG1(즉, IgG1 힌지/IgG1 CH2/IgG1 CH3/IgG1 힌지/IgG1 CH2/IgG1 CH3)로부터의 두 개의 Fc 도메인과 같은 특이적 면역글로불린 Fc 도메인들을 포함하도록 설계될 수 있다. 이런 스트라도머는 두 개의 IgG1 Fc 도메인 모노머들(즉, IgG1 힌지 모노머/IgG1 CH2 모노머/IgG1 CH3 모노머/IgG1 힌지 모노머/IgG1 CH2 모노머/IgG1 CH3 모노머)을 암호화하는 폴리뉴클레티드를 먼저 제조하고 그로부터 스트라도머 모노머들을 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 두 개의 이런 스트라도머 모노머들의 결합에 의해 두 개의 IgG1 Fc 도메인들을 가진 시리얼 스트라도머는 생산될 수 있다.
본 발명의 스트라도머 및 다른 바이오미메틱스는 Fc 도메인들을 포함하는 특이적 면역글로불린 Fc 부분 도메인들의 정체를 기초로 하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 Fc 도메인들을 가진 시리얼 스트라도머가 생산될 수 있고, 제 1 Fc 도메인은 IgG1 힌지/IgG3 CH2/IgG1 CH3를 포함하고 제 2 Fc 도메인은 IgG3 힌지/IgG1 CH2/IgG3 CH3를 포함한다.
본 발명에 개시된 스트라도머들 및 다른 바이오미메틱 분자들은 다양한 종들 중 임의의 것으로부터 유도될 수 있다는 것으로 이해된다. 참으로, 본 발명의 임의의 하나의 바이오미메틱 분자들에서 Fc 도메인 또는 Fc 부분 도메인은 하나 이상 종들(예를 들어, 둘, 셋, 넷, 다섯 이상)로부터 면역글로불린으로부터 유도될 수 있다. 그러나, 이들은 통상적으로 하나 종들로부터 유도될 것이다. 또한, 본 발명에 개시된 방법들 중 임의의 것(예를 들어, 치료 방법)은 임의의 종들에 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 일반적으로, 관심 종에 사용된 바이오미메틱스의 구성요소들은 그 종들로부터 전부 유도될 것이다. 그러나, 모든 구성들이 다른 종들로부터 또는 하나 이상의 종들(관련 방법이 사용된 종들을 포함하거나 포함하지 않음)로부터 얻은 바이오미메틱스가 사용될 수 있다.
본 발명의 스트라도머 및 다른 바이오미메틱스의 Fc 도메인 및 Fc 부분 도메인을 포함하는 특이적 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인 및 힌지 부위는 면역글로불린 서브클래스뿐만 아니라 이들이 유도된 유기체의 면에서, 독립적으로 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 스트라도머들 및 다른 바이오미메틱스는 IgG1, Ig02, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM와 같은 다양한 면역글로불린 형태로부터 독립적으로 얻은 Fc 도메인들 및 부분 Fc 도메인들을 포함할 수 있다. 유사하게는 각각의 Fc 도메인과 부분 Fc 도메인은 종-특이적 또는 키레믹 스트라도머 분자들을 만들기 위해서 다양한 종들, 바람직하게는 비 인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지), 인간, 설치류, 쥐, 소, 말, 고양이, 개, 돼지, 토끼, 염소, 사슴, 양, 족제비, 게르빌루스쥐, 기니 피그, 햄스터, 박쥐, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 및 오리), 물고기 및 파충류를 포함하는 포유류 종들로부터 유도될 수 있다.
개개의 Fc 도메인들 및 부분 Fc 도메인들은 인간화될 수 있다. 당업자는 다른 Fc 도메인들 및 부분 Fc 도메인들은 다른 형태의 기능성들을 제공할 것이다. 예를 들어, FcγRs는 IgG 면역글로불린에 특이적으로 결합하고 다른 면역글로불린의 종류에는 결합하지 않는다. 따라서, 다중 Fcγ 수용체 결합 능력을 가진 스트라도머를 설계하기를 의도하는 당업자는 Ig 힌지 부위 및 IgG CH2 & CH3 도메인에 있는 것을 포함하는 IgG의 잘 특징화된 Fcγ 수용체 결합 서열들을 적어도 포함하는 스트라도머 Fc 도메인들을 설계할 것이다.당업자는 다양한 해로운 결과들은 IgA 주입과 관련된 아나필락시스와 같은 특정 Ig 도메인들의 사용과 관련될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명에서 개시된 바이오미메틱스는 비록 이런 효과들과 같은 특정 상황은 바람직할 수 있지만, 일반적으로 이런 효과들을 피하도록 설계되어야 한다.
본 발명은 Fc 도메인 또는 Fc 부분 도메인의 자연적으로 발생한 아미노산 서열과 다른 아미노산들을 가진 Fc 도메인들 및 Fc 부분 도메인을 포함하는 스트라도머들을 포함한다. 본 발명의 바이오미메틱 화합물들에 포함시키기 위해 바람직한 Fc 도메인들은 holo-Fcγ 수용체 또는 FcγR의 가용성 세포외 도메인 부분에 대한 측정가능한 특이적인 결합 친화도을 가진다. 여러 Fc 도메인들 및 Fc 도메인 모노머들의 1차 아미노산 서열들과 X-레이 결정학 구조는 당업계에서 이용할 수 있다. 예를 들어, Woof JM, Burton DR. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nat Rev Immunol. 2004 Feb;4(2):89-99 참조. Fcγ 수용체 결합 능력을 가진 대표적인 Fc 도메인들은 인간 면역글로불린 G 아이소타이프 1-4(hIgG1 -4)로부터의 Fc 도메인들을 포함한다(SEQ ID NOS: 1, 3, 5 and 7 respectively; see also Figure 15A-D).(Fig. 2 of Robert L. Shields, et al. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγI, FcγII, FcγIII, and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR. J. Biol. Chem., Feb 2001; 276: 6591 - 6604 참조). 이런 고유 서열들은 기능성 서열들14의 자리 지정 돌연변이유발 매핑을 포함하는 광범위한 구조-기능 분석을 거칠 수 있다. 종래의 구조-기능 연구들 및 이용가능한 결정학 데이터를 기초로, 당업자는 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합 능력을 보존하는 반면 (예를 들어, SEQ ID NOs: 1, 3, 5 및 7의) 기능성 Fc 도메인 서열 변이체일 수 있다.
아미노산 변화들은 Fc 도메인의 서열 전체에서 발견될 수 있고 Fc 도메인을 포함하는 특정 Fc 부분 도메인으로 분리될 수 있다. 본 발명의 스트라도머들 및 다른 바이오미메틱스들에 사용된 Fc 도메인들의 기능성 변이체들은 고유 Fc 도메인에 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 것이다. 유사하게, 본 발명의 스트라도머들 및 다른 바이오미메틱스들에 사용된 Fc 부분 도메인들의 기능성 변이체는 고유 Fc 부분 도메인에 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 것이다.
당업자는 본 발명의 Fc 단편 모노머들, Fc 부분 단편 모노머들, 스트라도머 모노머들 및 다른 모노머들의 제조에서 Fc 도메인 모노머들의 기능성 변이체들의 사용을 더 포함한다는 것을 알 것이다. Fc 도메인 모노머들의 기능성 변이체들은 고유 Fc 모노머 서열에 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 것이다.
유사하게, 본 발명은 본 발명의 Fc 단편 모노머들, Fc 부분 단편 모노머들, 스트라도머 모노머들 및 다른 모노머들의 제조에서 Fc 도메인 모노머들의 기능성 변이체들의 사용을 더 포함한다. Fc 부분 도메인 모노머들의 기능성 변이체는 고유 Fc 부분 도메인에 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 것이다.
아미노산 변화들은 Fcγ 수용체에 대한 스트라도머의 결합 친화성을 감소시키고, 증가시키거나 변하지 않게 할 수 있다. 바람직하게는 이런 아미노산 변화들은 보존적 아미노산 치환일 것이나, 이런 변화들은 결실, 첨가 및 다른 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 치환들은 통상적으로 다음 그룹: 글리신과 알라닌; 발린, 아이소루신 및 루신; 아스파라트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티틴 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 타이로신 내의 변화들을 포함한다.
본 발명에서 사용된 "기능성 변이체"라는 용어는 기준 서열(폴리펩타이드일 때)과 동일한 생물학적 효과들을 매개할 수 있거나 기준서열(폴리뉴클레오티드일 때)에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 효과들을 매개할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 기준 서열에 대한 상동성에 의해 관련된 서열을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에서 기술된 바이오미메틱스 중 임의의 기능성 변이체는 특이적 상동성 또는 동일성을 가질 수 있고 DCs의 면역 조절을 할 수 있을 것이다. 기능성 서열 변이체들은 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩타이들을 포함한다. 서열 동일성은 디폴트 변수들: 필터-온, 스코어링 매트릭스 - BLOSUM62, 워드 크기 - 3, E 값 - 10, 갭 코스트 - 11,1 및 얼라인먼트 - 50으로 작동하는 BLAST 2.0(Basic Local Alignment Search Tool)을 사용하여 일반적으로 평가된다.
상기로부터, 본 발명의 스트라도머들은 (a) 단지 자연적으로 발생하는 Fc 도메인들; (b) 자연적으로 발생하는 Fc 도메인들 및 Fc 도메인들과 변화된 아미노산 서열들의 혼합물 및 (c) 변화된 아미노산 서열들을 가진 단지 Fc 도메인들을 가진 스트라도머들을 포함한다. 필요한 모든 것은 둘 이상의 Fcγ 수용체들과 결합하는 자연적으로 발생하는 서열들을 가진 Fc 도메인들을 포함하는 상응하는 스트라도머의 능력의 적어도 25%; 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99%; 99.5%; 또는 100% 또는 그 이상을 갖는다.
본 발명의 스트라도머들 및 스트라도바디들에서 발생하는 상기한 Fcγ 수용체 결합 부위들은 고유 서열에 대한 변화된 결합 능력들 및 친화성들을 가진 위치들을 예측가능하게 유도하기 위해 유전 공학을 통해 서열이 변화될 수 있다. 예를 들어, 특이적 잔기들은 FcγRII에 바이오미메틱 화합물들을 결합하는 Fc 도메인을 감소시키는 반면 FcγRIIIa에 결합하는 것을 증가시키도록 변형될 수 있다. hIgG Fcγ 수용체 결합 서여들에 대한 구조-기능 분석을 기초로 한 광범위한 돌연변이유발의 한 예는 Robert L. Shields, et al. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII, and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR. J. Biol. Chem., Feb 2001; 276: 6591 - 6604이다. 유사한 연구들은 설치류 IgG Fc(mIgG Fc)에 대해 수행되었다. 종들에 걸쳐 고유 IgG Fc 도메인들의 구조적 및 1차 서열 상동성을 기초로, 당업자는 특정 Fcγ 수용체 특이성들 및 결합 친화성들을 가진 결합 부위들을 설계하기 위해 hIgG Fc 및 mIgG Fc의 광범위한 구조-기능 지식을 본 발명의 바이오미메틱 화합물들에서 모든 고유 Fcγ 수용체 결합 부위 서열들의 합리적인 돌연변이유발로 바꿀 수 있을 것이다.
고유 Fc 도메인들의 아미노산 서열 조성물 이외에, Fc 도메인의 탄수화물 함량은 Fc 도메인 구조 및 FcγR과의 결합 상호작용에 중요한 역할을 하는 것으로 알려지 있다. 예를 들어, Robert L. Shields, et al. Lack of Fucose on Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human Fc RIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. J. Biol. Chem., Jul 2002; 277: 26733 -26740 (doi:10.1074/jbc.M202069200); Ann Wright and Sherie L. Morrison. Effect of C2-Associated Carbohydrate Structure on Ig Effector Function: Studies with Chimeric Mouse-Human IgG1 Antibodies in Glycosylation Mutants of Chinese Hamster Ovary Cells. J. Immunol., Apr 1998; 160: 3393 - 3402 참조. 탄수화물 함량은, 예를 들어, 특정 세포주들을 포함하는 특정 단백질 발현 시스템 또는 인비트로 효소 변형을 사용하여 제어될 수 있다. 따라서, 본 발명은 holo-항체의 고유 탄수화물 함량을 가진 Fc 도메인들을 포함하는 스트라도머들 및 스트라도바디들을 포함하며 이로부터 도메인들을 얻을 뿐만 아니라 이런 바이오미메틱 화합물들은 변화된 탄수화물 함량을 가진다.
Fc 부분 도메인의 폴리펩타이드에 대한 첨가, 다중화 부위 또는 글리코실화 변화들은 Fc 도메인의 Fcγ 수용체에 대한 강화된 결합을 허용하는 Fc 도메인의 형태적 변화를 일으킬 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드에 대한 최소 변화들은 다중 Fcγ 수용체들과 결합할 수 있는 스트라도머를 형성할 수 있다.
부분 도메인들 및 부분 단편들
당업자는 본 발명의 실시예들에서 사용된 Fc 도메인들 및 Fc 부분 도메인들은 전장 버전일 필요가 없다는 것을 추가로 인식할 것이다. 즉, 본 발명은 본 발명의 스트라도머들 및 다른 바이오미메틱스를 포함하는 특정 Fc 도메인 모노머들 및 Fc 부분 도메인 모노머들의 아미노 말단, 카복시 말단 또는 중간으로부터 아미노산들이 없는 Fc 도메인 모노머들 및 Fc 부분 도메인 모노머들의 사용을 포함한다.
예를 들어, Fcγ 수용체들에 대한 인간 IgG 면역글로불린들에 대한 결합 부위는 기술되어 있다(Radaev, S., Sun, P., 2001. Recognition of Immunoglobulins by Fca Receptors. Molecular Immunology 38, 1073 - 1083; Shields, R.L. et. al., 2001. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII, and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR. J. Biol. Chem. 276 (9), 6591-6604). 그 지식을 기초로, 누구나 이런 면역글로불린들의 Fc 도메인으로부터 아미노산들을 제거할 수 있고 Fc 도메인과 수용체 사이의 결합 상호작용에 대한 효과들을 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 Radaev, S., Sun, P., 2001에 정의된 대로 적어도 약 90%의 아미노산들을 가진 IgG Fc 도메인들을 포함하고 하부 힌지 및 CH2의 위치 233 내지 338을 포함한다.
본 발명의 IgG 면역글로불린들의 Fc 부분 도메인들은 힌지 부위의 전부 또는 일부, CH2 도메인의 전부 또는 일부 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다.
힌지 부위의 단지 일부, CH2 도메인의 일부 또는 CH3 도메인의 일부를 가진 IgG Fc 부분 도메인들은 Fc 부분 도메인 모노머들로 만들어진다. 따라서, 본 발명은 힌지 부위의 N-말단 또는 힌지 부위의 C-말단으로부터 유도된 IgG 힌지 부위 모노머들을 포함한다. 따라서 이들은, 예를 들어, 힌지 부위의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 또는 62 (IgG1의 경우 15까지, IgG2의 경우 12까지, IgG3의 경우 62까지, IgG4의 경우 12까지)아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 CH2 도메인의 N-말단 또는 CH2 도메인의 C-말단으로부터 유도된 IgG CH2 도메인 모노머들을 포함한다. 따라서 이들은, 예를 들어, CH2 도메인의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 110 (IgG1 및 IgG3의 경우 110까지, IgG2 및 IgG4의 경우 109까지) 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명은 CH3 도메인의 N-말단 또는 CH3 도메인의 C-말단으로부터 유도된 IgG CH3 도메인 모노머들을 추가로 포함한다. 따라서 이들은, 예를 들어, CH3 도메인의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107 (IgG1 및 IgG3의 경우 106까지, IgG2 및 IgG4의 경우 107까지) 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 IgA1, IgA2 및 IgD 면역글로불린들의 Fc 부분 도메인들은 힌지 부위의 전부 또는 일부, CH2 도메인의 전부 또는 일부 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 또한 IgA1, IgA2 및 IgD 면역글로불린의 CH1 도메인의 전부 또는 일부는 Fc 부분 도메인들로 사용될 수 있다.
힌지 부위의 단지 일부, CH1 도메인의 일부 CH2 도메인의 일부 또는 CH3 도메인의 일부를 가진 IgA1, IgA2 및 IgD 부분 도메인들은 Fc 부분 도메인 모노머들로 만들어진다. 따라서, 본 발명은 IgA1, IgA2 또는 IgD의 힌지 부위의 N-말단 또는 힌지 부위의 C-말단으로부터 유도된 IgG 힌지 부위 모노머들을 포함한다. 따라서 이들은, 예를 들어, 힌지 부위의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 또는 64(IgA1의 경우 26까지, IgA2의 경우 13까지, IgD의 경우 64까지)아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명은 IgA1, IgA2 또는 IgD의 CH2 도메인들의 N-말단 또는 CH2 도메인들의 C-말단으로부터 유도된 IgG 힌지 부위 모노머들을 포함한다. 따라서 이들은, 예를 들어, CH2 도메인의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107 (IgA1의 경우 102까지, IgA2의 ruuddn 96까지, IgD의 경우 107까지) 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명은 IgA1, IgA2 또는 IgD의 CH3 도메인의 N-말단 또는 CH3 도메인의 C-말단으로부터 유도된 CH3 도메인들을 포함한다. 따라서 이들은, 예를 들어, CH3 도메인의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 또는 131 (IgA1의 경우 113까지, IgA2의 경우 131까지, IgD의 경우 110까지) 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 IgM 및 IgE 면역글로불린들의 Fc 부분 도메인들은 이런 분자들의 힌지/CH2 도메인의 전부 또는 일부, CH3 도메인의 전부 또는 일부 및 CH4 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 또한 IgM 및 IgE 면역글로불린들의 전부 또는 일부는 Fc 부분 도메인들로 사용될 수 있다.
힌지 CH2 도메인의 단지 일부, CH3 도메인의 일부 또는 CH4 도메인의 일부를 가진 IgM 및 IgE 부분 도메인들은 Fc 부분 도메인 모노머들로 만들어진다. 따라서, 본 발명은 IgM 또는 IgE의 힌지/CH2 도메인의 N-말단 또는 힌지/CH2 도메인의 C-말단으로부터 유도된 힌지/CH2 도메인 모노머들을 포함한다. 따라서, 이들은, 예를 들어, 힌지/CH2 도메인의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 또는 112 (IgM의 경우 112까지, IgE의 경우 109까지) 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명은 IgM 또는 IgE의 CH3 도메인의 N-말단 또는 CH3 도메인의 C-말단으로부터 유도된 IgM 및 IgE CH3 도메인 모노머들을 포함한다. 따라서 이들은, 예를 들어, CH3 도메인의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 또는 106 (IgM의 경우 106까지, IgE의경우 105까지) 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명은 IgM 또는 IgE의 CH4 도메인의 N-말단 또는 CH4 도메인의 C-말단으로부터 유도된 IgM 및 IgE CH4 도메인 모노머들을 포함한다. 따라서 이들은, 예를 들어, CH4 도메인의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 또는 130 (IgM의 경우 130까지, IgE의 경우 105까지) 아미노산을 포함할 수 있다. 그러나, CH4 도메인의 C-말단을 포함하는 IgM 또는 IgE의 CH4 도메인들의 일부는 길이가 18 아미노산 이상일 것이고, 더욱 바람직하게는 길이 30 아미노산 이상일 것이고, 가장 바람직하게는 길이가 50 아미노산일 것이다.
상기로부터, 본 발명의 다른 실시예들은 (a) 전장 Fc 도메인들; (b) 전장 Fc 도메인들 및 Fc 부분 도메인들의 혼합물; 및 (c) Fc 부분 도메인들을 함유하는 스트라도머들을 포함한다는 것을 알 것이다. 이런 실시예들의 각각에서, 스트라도머들은 CH1 도메인들을 더 포함할 수 있다. 상기한 대로, 본 발명의 스트라도머들의 각 실시예에서, 스트라도머들은 둘 이상의 Fcγ 수용체들과 결합할 수 있는 능력을 가진다.
스트라도머들 및 스트라도머 모노머들의 바람직한 실시예
다음은 본 발명의 스트라도머 모노머들의 예들이다:
1. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3
2. IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3
3. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG3 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3
4. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3
5. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG1 CH3
6. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG3 CH3
7. IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG1 CH3 - IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3
8. IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3
9. IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3
10. IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG3 CH3 -IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG3 CH3
11. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG3 hinge - IgG3 CH2 - IgG3 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3
12. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG3 hinge - IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG3 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3
13. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG3 hinge - IgG3 CH2 - IgG3 CH3 - IgG1 hinge - IgG2 CH2 - IgG3 CH3.
14. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG4 hinge - IgG4 CH2 - IgG4 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3
이런 실시예들 및 본 발명에 제공된 다른 실시예들의 각각에서, 도메인 결합들은 스트라도머 모노머들을 구성하는 개개의 Fc 부분 도메인 모노머들과 연결하는데 사용될 수 있다. 한 실시예에서, 상기한 대로 스트라도머 모노머들의 각각에 대해 도시된 Fc 부분 도메인 모노머들은 인간 Fc 부분 도메인 모노머들이다.
본 발명은 상기한 둘 이상의 스트라도머 모노머들을 포함하는 스트라도머들을 포함한다. 바람직한 실시예들에서, 본 발명은 상기에 제공된 두 개의 동일한 스트라도머 모노머들을 포함하는 시리얼 스트라도머들을 포함한다.
상기한 대로, 하나 이상의 Fcγ 수용체와 결합하는 스트라도머 기능성은 자연 IgM 또는 IgA 분자와 유사한, 코어 스트라도머에 코어 모이어티로서 J 사슬을 포함시킴으로써 성취될 수 있다. 고유 IgA 및 IgM 면역글로불린들에서, 연결 (J) 사슬은 IgA 및 IgM 항체들의 중사슬 및 경사슬을 이황화 다리를 통해 항체들의 Fc 부분들의 18개 아미노산 "분비성 꼬리 조각"과 연결하는 15 kDa 펩타이드이다. Braathen, R., et al., The Carboxyl-terminal Domains of IgA and IgM Direct Isotype-specific Polymerization and Interaction with the Polymeric Immunoglobulin Receptor, J. Bio . Chem . 277(45), 4275542762 (2002).
이런 코어 스트라도머들은 바람직하게는 IgM 면역글로불린들로부터 자연적으로 발생하는 CH4 Fc 도메인을 포함하는 스트라도머 모노머들로 구성될 수 있어서, 스트라도머 모노머들을 포함하는 스트라도머들이 J 사슬에 결합하게 한다(도 10a-10d 참조). 다음은 스트라도머를 형성하기 위해 자동 이중화할 수 있고 복수(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 20 이상)의 스트라도머들로 구성된 코어 스트라도머를 형성하기 위해 J 사슬과 결합할 수 있는 스트라도머 모노머드의 예들이다:
1. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgM CH4 (도 10c-10d 참조)
2. IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgM CH4
3. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG3 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgM CH4 (도 10a-10b 참조)
4. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 -IgM CH4
5. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG1 CH3 - IgM CH4
6. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgM CH4
7. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG3 CH3 - IgM CH4
8. IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG1 CH3 - IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 -IgM CH4
9. IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgM CH4
10. IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 -IgM CH4
11. IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG3 CH3 - IgM CH4
이런 실시예들 및 본 발명에 제공된 다른 실시예들의 각각에서, 도메인 결합들은 스트라도머 모노머들을 구성하는 개개의 Fc 부분 도메인 모노머들과 연결하는데 사용될 수 있다. 한 실시예에서, 상기한 대로 스트라도머 모노머들의 각각에 대해 도시된 Fc 부분 도메인 모노머들은 인간 Fc 부분 도메인 모노머들이다.
J 사슬을 기초로 한 코어 스트라도머들은 CH4 Fc 도메인을 가진 Fc 단편들, Fc 부분 단편들 및/또는 Fc 도메인들로 구성될 수 있다. 이 예에서, 코어 모이어티에 연결된 CH4 Fc 도메인을 가진 Fc 부분 단편들 및 Fc 도메인들은 단지 하나의 Fcγ 수용체 결합 부위를 포함할 수 있으나 이런 코어 스트라도머의 문맥에서, 하나 이상의 Fcγ 수용체 결합 부위를 포함하는 생물학적으로 활성인 바이오미메틱스를 형성한다. 당업자는 다른 고유 면역글로불린들로부터의 Fc 부분 도메인들은 이런 코어 스트라도머의 기능성 Fc 단편들, Fc 부분 단편들 및 Fc 도메인들을 형성하는데 사용될 수 있다. 다음은 코어 스트라도머를 형성하기 위해 자가 이중화하고 J 사슬과 결합할 수 있는 Fc 단편들, Fc 부분 단편들 및 Fc 도메인드의 모노머들의 예들이다:
1. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgM CH4
2. IgG3 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgM CH4
*3. IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG1 CH3 - IgM CH4
4. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG3 CH3 - IgM CH4
5. IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG3 CH3 - IgM CH4
6. IgG3 hinge - IgG3 CH2 - IgG1 CH3 - IgM CH4
7. IgG3 hinge - IgG3 CH2 - IgG1 CH3 - IgM CH4
8. IgG1 hinge - IgG3 CH2 - IgG2 CH3 - IgM CH4
9. IgG1 hinge - IgG3 hinge - IgG3 CH2 - IgG2 CH3 - IgM CH4
10. IgG1 hinge - IgG1 CH2 - IgG1 CH3 - IgE CH4 - IgM CH4
이런 실시예들 및 본 발명에 제공된 다른 실시예들의 각각에서, 도메인 결합들은 스트라도머 모노머들을 구성하는 개개의 Fc 부분 도메인 모노머들과 연결하는데 사용될 수 있다. 한 실시예에서, 상기한 대로 스트라도머 모노머들의 각각에 대해 도시된 Fc 부분 도메인 모노머들은 인간 Fc 부분 도메인 모노머들이다.
스트라도머 모노머들은 목표를 성취하기 위해서 길이와 조성물이 다를 수 있다는 것은 상기로부터 명백하고, 자가-결합 또는 상호-스트라도머 모노머 결합을 통해 제 2 모노머에 결합되고 J 사슬에 결합될 때, 하나 이상의 Fcγ 수용체 결합 부위를 포함하는 코어 스트라도머를 생산한다. 예들은 결코 제한적이지 않고 당업자는 스트라도머들에서 여러 다른 스트라도머 구조들이 가능하다는 것을 알 것이다.
Fc γ 수용체들
본 발명에서 사용된 "FcγR" 및 "Fcγ 수용체"라는 용어는 Nimmerjahn F and Ravetch JV Fcgamma receptors: old friends and new family members. Immunity. 2006 Jan; 24(1):19-28에 기술된 대로 또는 이하에서 정의된 대로 면역세포 표면들 상에 발현된 단백질들의 Fc 감마 수용체 집단의 각 구성원을 포함한다. 본 발명에서 기술된 "FcγR"는 Fc 감마 RI, RII 및 RIII 집단의 각 구성원들을 포함한다. Fcγ 수용체는 FcγRI(CD64); FcγRII(CD32) 및 이의 아이소타이프 및 알로타이프 FcγRIIa LR, FcγRIIa HR, FcγRIIb 및 FcγRIIc; FcγRIII(CD16) 및 이의 아이소타이프 FcγRIIIa 및 FcγRIIIb를 포함하나 이에 제한되지 않는 낮은 친화성 및 높은 친화성 Fcγ 수용체들을 포함한다. 당업자는 FcγR에 결합하는 화합물들을 포함하는 본 발명은 아직 발견되지 않은 미래 FcγRs 및 결합된 아이소타이프 및 알로타이프에 사용될 것이라는 것을 인식할 것이다.
IVIG는 신생아 Fc 수용체("FcRn")에 결합하고 완전히 포화하고 FcRn의 이런 경쟁적 억제는 IVIG의 생물학적 활성에 중요한 역할을 할 수 있다는 것이 기술되어 있다(예를 들어, Mechanisms of Intravenous Immunoglobulin Action in Immune Thrombocytopenic Purpura. F. Jin, J. Balthasar. Human Immunology, 2005, Volume 66, Issue 4, Pages 403-410). Fcγ 수용체들에 강하게 결합하는 면역글로불린들은 FcRn에 적어도 어느 정도 결합하기 때문에, 당업자는 하나 이상의 Fcγ 수용체에 결합할 수 있는 스트라도머들은 FcRn에 결합할 것이고 완전히 포화시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다.
"결합된 고유 IgG의 면역학적 활성"은 면역 시스템이 IgG 응집체에 노출되자마자 면역 시스템의 기능화에 영향을 주는 다중화된 IgG의 특성들을 의미한다. 고유 다중화된 IgG의 특이적 특성들은 FcγRs에 대한 변화된 특이적 결합, 면역 세포들의 표면들에 FcγRs의 가교 또는 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 식작용(ADCP) 또는 보체 결합과 같은 다중화된 IgG의 효과기 기능성을 포함한다(예를 들어, Nimmerjahn F, Ravetch JV. The anti-inflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 2007; 204:11-15; Augener W, Friedman B, Brittinger G. Are aggregates of IgG the effective part of high-dose immunoglobulin therapy in adult idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)? Blut. 1985;50:249-252; Arase N, Arase H, Park SY, Ohno H, Ra C, Saito T. Association with FcRgamma is essential for activation signal through NKR-P1 (CD161) in natural killer (NK) cells and NK1.1+ T cells. J Exp Med. 1997;186:1957-1963; Teeling JL, JansenHendriks T, Kuijpers TW, et al. Therapeutic efficacy of intravenous immunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies in experimental immune thrombocytopenia. Blood. 2001;98:1095-1099; Anderson CF, Mosser DM. Cutting edge: biasing immune responses by directing antigen to macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 2002;168:3697-3701; Jefferis R, Lund J. Interaction sites on human IgG-Fc for Fc[gamma]R: current models. Immunology Letters. 2002;82:57; Banki Z, Kacani L, Mullauer B, et al. Cross-Linking of CD32 Induces Maturation of Human MonocyteDerived Dendritic Cells Via NF-{kappa}B Signaling Pathway. J Immunol. 2003;170:3963-3970; Siragam V, Brine D, Crow AR, Song S, Freedman J, Lazarus AH. Can antibodies with specificity for soluble antigens mimic the therapeutic effects of intravenous IgG in the treatment of autoimmune disease? J Clin Invest. 2005;115:155160 참조). 이런 특성들은 모노머 IgG의 특성들과 비교해서 일반적으로 평가된다.
본 발명에서 사용된 "Fcγ 수용체 가교 또는 복수의 자연적으로 발생하는 결합된 IgG 면역글로불린들의 효과기 기능성에 필적가능하건 우수한"은 스트라도머가 IVIG를 사용하여 얻은 값의 약 70% 이상의 분석 값을 나타낸다는 것을 의미한다. 일부 실시예들에서, 분석 값은 IVIG를 사용하여 얻은 적어도 분석 값들의 표준에러범위 내에 있다. 다른 실시예들에서, 분석 값은 IVIG의 값보다 110% 이상이다. FcγR 가교에 대한 분석은 당업자에게 주지되어 있다(예를 들어, Falk Nimmerjahn and Jeffrey Ravetch. Fca receptors as regulators of immune responses. Nature Reviews Immunology, advanced published on line December 7, 2007 참조). "면역 조절 활성들", "면역 반응 조절", "면역 시스템 조절" 및 "면역 조절"은 이의 세포 타입 내에서 또는 다른 세포 타입 속에서 세포 타입의 성숙을 포함하는 하나 이상의 면역 세포들의 활성, 능력 및 상대 수들을 변화시킴으로써 면역 시스템을 변화시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 미성숙 단핵구들의 면역 조절은 더욱 성숙한 단핵구들, 수지상 세포들, 대식세포들 또는 파골세포들의 더 큰 집단을 유도할 수 있고, 이의 전부는 미성숙 단핵구들로부터 유도된다. 예를 들어, 면역 세포 수용체들은 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스에 의해 결합될 수 있고 "면역 조절 활성화"로 개별적으로 불리는 다양한 면역 세포 변화들을 유도하기 위해 세포간 시그널링을 활성화할 수 있다. 수용체 활성을 막는 면역 세포 수용체들의 봉쇄는 "면역 조절" 내에 포함되고 "억제 면역 조절"로 개별적으로 불릴 수 있다.
단핵구의 성숙의 조절은 단핵구의 성숙 DC, 대식세포 또는 파골세포 속으로의 분화를 의미한다. 분화는 분화의 속도 및/또는 분화가 진행중인 세포들의 수 면에서 감소될 수 있다.
본 발명에서 사용된 "분리된" 폴리펩타이드 또는 펩타이드라는 용어는 자연적으로 발생하는 복사물을 갖지 않거나, 예를 들어, 췌장, 간, 비장, 난소, 고환, 근육, 연결 조직, 신경 조직, 위장관 조직 또는 유방 조직 또는 종양 조직(예를 들어, 유방암 조직)과 같은 조직 또는 혈액, 혈청 또는 소변과 같은 체액들에 자연적으로 이를 포함하는 구성요소들로부터 분리되거나 정제된 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 의미한다. 통상적으로, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 자연적으로 결합된 단백질들 및 다른 자연적으로 발생하는 유기 분자들로부터 분리된 적어도 70중량%일 때 "분리된 것으로" 생각된다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드(또는 펩타이드)의 제제는 본 발명의 건중량으로 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 폴리펩타이드(펩타이드)이다. 화학적으로 합성되어진 폴리펩타이드 또는 펩타이드는, 이의 특성에 의해, 이를 자연적으로 포함하는 구성요소들로부터 분리되기 때문에, 합성 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 "분리된다".
본 발명의 분리된 폴리펩타이드(또는 펩타이드)는, 예를 들어, 자연 원료로부터(예를 들어, 조직 또는 체액으로부터) 추출; 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산의 발현; 또는 화학적 합성에 의해 얻을 수 있다. 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 자연적으로 발생하는 원료와 다른 세포 시스템에서 생산되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 분리되는데, 이는 자연적으로 이를 포함하는 구성요소들로부터 필수적으로 없기 때문이다. 분리 및 정제의 정도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
약학적 조성물들
본 발명에서 기술된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스 조성물들의 투여는 임의의 통상적인 경로, 경구, 비경구 또는 국소를 통할 것이다. 예시적 경로들은 경구, 비강, 구강, 직장, 질내, 눈, 피하, 근육내, 복강내, 정맥내, 동맥내, 종양내, 척추, 경막내, 관절내, 동맥내, 지주막 하, 설하, 경구 점막, 기관지, 림프구, 자궁내, 피하, 종양내, 이식용 장치에 통합, 경막내, 피질내, 또는 피부를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이런 조성물들은 보통 본 발명에서 개시된 대로 약학적으로 허용가능한 조성물들로 투여될 것이다. 한 바람직한 실시예에서 분리된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스는 정맥으로 투여된다.
본 발명에서 사용된 대로 "약학적으로 허용가능한 담체"라는 용어는 임의의 및 모든 용매들, 분산 매질들, 코팅제, 항박테리아 및 항곰팡이제, 등장액 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질들에 대한 이런 매질들 및 물질들의 용도는 당업계에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 본 발명의 벡터들 또는 세포들과 혼용할 수 없는 경우를 제외하고, 치료적 조성물들로서 이의 용도가 고려된다. 보충적 활성 성분들은 조성물들 속에 포함될 수 있다.
본 발명의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 조성물들은 자연적 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염들은 산 첨가 염들(단백질의 유리 아미노기들로 형성)을 포함하고, 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산들로 형성된다. 유리 카복시기들로 형성된 염들은, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염들 및 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로케인 등과 같은 유기 염들로부터 유도될 수 있다.
살균 주사액들은 필요한 양의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스를 필요에 따라 상기한 다양한 다른 성분들을 가진 적절한 용매에 혼합하고 여과 살균시킴으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액들은 다양한 살균 활성 성분들을 염기성 분산 매질 및 상기한 것들로부터 필요한 다른 성분들을 포함하는 살균 부형제 속에 혼합시킴으로써 제조된다. 살균 주사액들의 제조에서 살균 분말들의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분들의 분말과 이의 이전에 살균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분을 생산하는 진공 건조 및 동결 건조 기술들이다.
또한, 한 실시예는 경구 투여에 적합한 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 조성물이고 불활성 희석제와 함께 또는 없이 약학적으로 허용가능한 담체에 제공된다. 담체는 동화할 수 있거나 섭취할 수 있어야 하고 액체, 반 고체, 즉, 페이스트 또는 고체 담체를 포함한다. 임의의 통상적인 매질, 물질, 희석제 또는 담체가 복용자에게 해롭거나 그 안에 포함된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 제제의 치료 효과에 해로운 경우를 제외하고, 본 발명의 방법들을 실시하는데 사용하기 위한 경구로 투여할 수 있고 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 조성물에서 이의 용도는 적합하다. 담체 또는 희석제의 예들은 지방, 오일, 물, 살균 용액, 지질, 리포솜, 수지, 접합제, 충전제 등 또는 이의 조합을 포함한다. "경구 투여"라는 용어는 경구, 구강, 장내 또는 위내 투여를 포함한다.
한 실시예에서, 조성물은 임의의 편리하고 실용적인 방식, 즉, 용액, 현탁액, 에멀젼화, 혼합물, 캡슐화, 미세캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 혼합된다.
구체적인 실시예에서, 분말 형태의 면역학적으로 활성인 조성물은 반-고체 또는 고체 담체와 결합되거나 완전히 혼합된다. 혼합은 분쇄와 같은 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 안정화제들은, 즉 위에서 변성을 통해 조성물의 치료 활성이 손실되는 것을 막기 위해서 혼합 공정에 첨가될 수 있다. 경구 투여성 조성물에 사용하기 위한 안정제들의 예는 버퍼, 위 산의 분비에 대한 길항제, 글리신과 리신과 같은 아미노산, 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프록토스, 락토오스, 수크로오스, 말토스, 소르비톨, 만니톨 등과 같은 탄수화물, 단백질분해효소 억제제 등을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 경구 투여된 조성물의 경우, 안정제는 위산의 분비에 대한 길항제를 포함할 수 있다.
또한, 반 고체 또는 고체 담체와 결합하는 경구 투여를 위한 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 조성물은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 정제 또는 알약으로 추가로 제제화될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 젤라틴 캡슐, 정제, 또는 알약은 장으로 코팅된다. 장 코팅은 pH가 산성인 위 또는 위 창자에서 조성물의 변성을 막는다. 즉, 미국특허 제 5,629,001 참조. 소장에 도달하자마자, 염기성 pH는 코팅을 용해시켜 조성물이 장 세포들, 예를 들어, 파이어판 M 세포(Peyer’s patch M cells)와 상호작용하도록 배출되게 한다.
다른 실시예에서, 분말 형태의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 조성물은 면역학적으로 활성인 바이오미메틱을 캡슐화하는 나노입자를 형성하는 물질들과 결합하거나 완전히 혼합되고 또는 면역학적으로 활성인 바이오미메틱은 이에 부착된다. 각각의 나노입자는 100 마이크론 미만의 크기를 가질 것이다. 나노입자는 면역학적으로 활성인 바이오미메틱의 위장관 흡수를 허용하는 점막부착성을 가질 수 있고 그렇지 않으면 경구적으로 생체이용가능성이 없을 것이다.
다른 실시예에서, 분말 조성물은 안정제와 함께 또는 없이 물 또는 식염수와 같은 액체 담체와 결합된다.
상요될 수 있는 특이적인 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 제제는 칼륨이 없는 저장성 인산염계 버퍼 속의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 단백질의 용액이고 버퍼의 조성물이 다음과 같다: 6mM 인산나트륨 일염기 일수소화물, 9mM 인산나트륨 이염기 헵타수소화물, 50mM 염화나트륨, pH 7.0+/- 0.1. 저장성 버퍼 속의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 단백질의 농도는 10 마이크로그램/ml 내지 100 밀리그램/ml의 범위일 것이다. 이 제제는 정맥 투여에 제한되지 않는 임의의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.
또한, 반 고체 담체와 결합된 국소 투여를 위한 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 조성물은 크림 또는 겔 연고로 추가로 제제화될 수 있다. 겔 연고의 형성을 위한 바람직한 담체는 겔 폴리머이다. 본 발명의 겔 조성물을 제조하는데 사용되는 바람직한 폴리머들은 카보풀, 카복시메틸-셀룰로오스, 및 플루로닉 폴리머들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 분말 Fc 멀티머 조성물은 질병의 치료를 위해 피부에 또는 피부 아래에 도포하기 위해 0.5% 내지 5% wt/volume 강도로 카보폴 980과 같은 중합제를 포함하는 수용성 겔과 혼합된다. 본 발명에서 사용된 "국소 투여"라는 용어는 피부, 표피, 피하 또는 점막 표면에 대한 도포를 포함한다.
제제화한 후, 용액들은 복용 제제와 혼용가능한 방식으로 투여되고 치료적으로 효과적인 양으로 증상들을 개선하거나 치료한다. 제제들은 주사 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 복용 형태로 쉽게 투여된다. 복용량의 약간의 변화는 치료될 피험자의 상태에 따라 일어날 수 있다. 투여에 책임이 있는 사람은 어떤 경우에는 개개의 피험자를 위해 적절한 복용량을 결정할 수 있다. 또한, 인간 투여의 경우, 제제들은 생물학적 기준들의 FDA에 의해 필요로 하는 무균 상태, 일반적인 안전 및 순도 기준을 충족한다.
투여의 경로는, 치료될 질병의 위치와 특성에 따라 자연적으로 변할 것이고, 예를 들어, 피내, 경피, 비경구, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 경피, 경기관지, 복강내, 종양내, 주입, 세척, 직접 주입 및 경구 투여를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "비경구 투여"라는 용어는 임의의 형태의 투여를 포함하며 화합물은 내장을 통한 흡수 없이 피험자에게 흡수된다. 본 발명에서 사용된 예시적 비경구 투여는 근육내, 정맥내, 복강내, 종양내, 안내 또는 관절내 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
아래는 다양한 약학적 제제 및 구체적인 질병에 대한 바람직한 투여 경로들의 구체적인 예들이다:
구강 또는 설하 가용성 정제: 앙기나, 결절다발동맥염.
정맥성: 특발성 혈소판감소성 자반증, 봉입체 근염, 파라프로테인성 IgM 탈수초성 다발신경병증, 괴사성 근막염, 수포창, 괴저, 피부근염, 육아종, 림프종, 패혈증, 재생불량성빈혈, 다발체계성 장기부전, 다발성 골수종 및 단클론감마글로불린병증, 만성염증성 탈수초성 다발성 신경근병, 염증성 근병증, 혈전성 혈소판감소성 자색반증, 근염, 빈혈, 종양 형성, 용혈성 빈혈, 뇌염, 척수염, 인간 T-세포 림프종 바이러스-1 관련 척수증, 백혈병, 다발성 경화증 및 시신경염, 천식, 표피 괴사융해증, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 중증근무력증, 신경병증, 포도막염, 길란바레 증후군, 이식편대숙주병, 근강직 증후군, 항-Yo항체를 가진 부신생물 소뇌퇴행증, 신생물딸림뇌척수염, 항-Hu 항체를 가진 감각신경병증, 전신성 맥관염, 전신홍반성루프스, 자가면역 당뇨성 신경병증, 급성 특발성 자율신경 신경병증, 보크트-고야나기-하라다 증후군, 다초점운동신경병증, 항-GM1 항체 관련 하위운동신경원증후군, 탈수초신경병증, 막증식성 사구체신염, 심장근증, 가와사키병, 류마티스 관절염 및 이반 증후군 IM -ITP, CIDP, MS, 피부근염, 중증근무력증 및 근위축증. 본 발명에서 사용된 "정맥 투여"라는 용어는 본 발명의 화합물 또는 조성물을 정맥 주사 또는 주입을 통해 전신순환으로 전달하는 모든 기술들을 포함한다.
피부 겔, 로션, 크림 또는 패치: 백반증, 대상포진, 여드름, 구선염.
좌약, 겔, 또는 주입: 궤양성 대장염, 치질성 염증.
캡슐화되거나 장용성 코팅을 가진 경구용 알약, 트로키: 크론병, 복강부전증, 과민성 장증후군, 염증창자병, 바렛 식도.
뇌피질내: 간질, 알츠하이머, 다발성 경화증, 파킨슨병, 헌팅톤병.
복강내 주입 또는 이식: 자궁내막증.
질내 겔 또는 좌약: 박테리아성, 트리코모나스성 또는 곰팡이성 질염.
의료 장치들: 관상동맥 스텐트, 보철 조인트.
본 발명에서 기술된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스는 체중(kg)당 약 0.01mg 내지 kg 당 약 300mg의 복용량으로 투여될 수 있고 특히 체중(kg)당 0.01mg 내지 체중(kg)당 약 300mg으로 투여될 수 있고 적어도 하루에 1번, 1주에 1번, 2주에 1번 또는 한 달에 1번 투여될 수 있다. 2단계 복용 요법이 사용될 수 있고 제 1 복용 단계는 제 2 복용 단계의 약 0.1% 내지 약 10%을 포함한다.
스트라도머들 및 스트라도바디들의 치료 용도
합리적인 설계 및 인비트로 및 인비보 입증을 기초로, 본 발명의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스들은 자가면역질환을 치료하고 암과 염증 질환에 대한 생체면역치료로서 다양한 다른 내용에서 면역기능을 조절하기 위한 중요한 생약으로서 작용할 것이다. 본 발명에서 기술된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스에 의한 치료에 적합한 의학적 이상은 통상적으로 hIVIG로 일반적으로 치료되는 것들을 포함하거나 hIVIG는 자가면역혈구감소증, 피부근염, 맥관염, 포도막염(예를 들어, F. G. van der Meche, P. I. Schmitz, N. Engl. J. Med. 326, 1123 (1992); P. Gajdos et al., Lancet i, 406 (1984); Y. Sultan, M. D. Kazatchkine, P. Maisonneuve, U. E. Nydegger, Lancet ii, 765 (1984); M. C. Dalakas et al., N. Engl. J. Med. 329, 1993 (1993); D. R. Jayne, M. J. Davies, C. J. Fox, C. M. Black, C. M. Lockwood, Lancet 337, 1137 (1991); P. LeHoang, N. Cassoux, F. George, N. Kullmann, M. D. Kazatchkine, Ocul. Immunol. Inflamm. 8, 49 (2000)) 및 단클론 항체가 사용될 수 있고 이미 임상적으로 사용되는 암들 또는 염증 질환에 임상적으로 효과적인 것으로 입증되었다. 본 발명의 주제인 화합물들에 의해 효과적으로 치료될 수 있는 것들 중에 포함된 이상들은 사이토카인 네트워크의 불균형에 의한 염증 질환, 병적 자가항체들 또는 자가면역성 T 세포들에 의해 매개된 자가면역질환 또는 만성 재발성 자가면역의 급성 또는 만성 단계, 염증 또는 감염 질환 또는 진행을 포함한다.
또한, 근위축성 측색 경화증, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 심근경색, 뇌졸중, B형 간염, C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 관련 염증, 부신백질이영양증, 및 라스무센 증후군, 웨스트 증후군 및 레녹스 가스토 증후군을 포함하는 바이러스성 후의 뇌염과 관련이 있는 것으로 생각되는 것들과 같은 염증 성분을 가진 의학적 이상은 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스에 의한 치료로 효과를 얻을 것이다.
본 발명에서 기술된 분리된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스를 사용하는 치료에 대한 일반적인 방법은 치료하기 위해 분리된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱의 치료적 유효량을 질환 또는 이상을 가진 피험자에게 투여하는 것이다. 일부 실시예들에서, 질환 또는 이상은 사이토카인 네트워크의 불균형에 의한 염증 질환, 병적 자가항체들 또는 자가면역성 T 세포들에 의해 매개된 자가면역질환 또는 만성 재발성 자가면역의 급성 또는 만성 단계, 염증 또는 감염 질환 또는 진행으로 넓게 분류할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "치료하는" 및 "치료"라는 용어는 본 발명의 치료적 유효량의 바이오미메틱을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 피험자가 질환 또는 이상 또는 질환 또는 이상의 증상이 개선되는 것을 의미한다. 이 개선은 질환 또는 이상 또는 질환 또는 이상의 증상의 개선 또는 치료이다. 이 개선은 관찰할 수 있거나 측정할 수 있는 개선이거나 피험자의 행복의 일반적인 느낌의 개선일 수 있다. 따라서, 당업자는 치료는 질환을 개선할 수 있으나 완전한 치료는 아닐 수 있다는 것을 안다. 구체적으로, 피험자들의 개선은 감소된 염증; C-반응성 단백질과 같은 감소된 염증 실험용 마커; 자가항체들과 같은 마커들 또는 백혈구 수, 백색 세포 수, 또는 적색 세포 수의 개선, 감소된 발진 또는 자반병, 허약, 마비 또는 저림의 감소, 과혈당증을 가진 환자들에서 증가된 글루코스 레벨, 감소된 관절 통증, 염증, 종기 또는 퇴화, 경련 및 설사 주기 및 부피 감소, 감소된 앙기나, 감소된 조직 염증, 또는 발작 주기의 감소 중 하나 이상에 의해 증명되는 감소된 자가면역성; 암 종양 걱정의 감소, 종양 진행 시간의 증가, 감소된 암 통증, 증가된 생존 또는 삶의 질 개선; 또는 골다공증의 진행의 지연 또는 개선 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "치료적 유효량"이란 용어는 질환 또는 이상의 증상의 개선 또는 치료를 일으키는 양을 의미한다.
본 발명에서 사용된 대로, "예방"은 질환의 증상들의 완전한 예방, 질환의 증상들의 개시의 지연 또는 연속적으로 진행된 질환 증상들의 심각성 감소를 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 "피험자"라는 용어는 본 발명에서 기술된 방법들에 따라 본 발명의 바이오미메틱스가 투여되는 임의의 포유류 피험자를 의미하는 것으로 생각된다. 한 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법들은 인간 피험자를 치료하기 위해 사용된다. 본 발명의 방법들은 또한 종-특이적 또는 키메릭 스트라도머 분자들을 생산하기 위해 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 개코원숭이, 및 침팬지), 생쥐, 쥐, 소, 말, 고양이, 개, 돼지, 토끼, 염소, 사슴, 양, 흰담비, 게르빌루스쥐, 기니 피그, 햄스터, 박쥐, 새(예를 들어, 닭, 칠면조 및 오리), 물고기 및 파충류를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 바이오미메틱스는 울혈성 심부전(CHF), 맥관염, 홍조증, 여드름, 습진, 심근염, 심근의 다른 이상, 전신홍반성루프스, 당뇨병, 척추병증, 활막 섬유아세포, 및 골수 기질; 뼈 손실; 파젯병, 파골세포종; 다발성 골수종; 유방암; 폐용성 골결핍; 영양결핍, 치주염, 고셔병, 랑게르한스 세포 조직구증, 척수손상, 급성 감염성 관절염, 골연화증, 쿠싱증후군, 단골성 섬유성 골이형성증, 다골성 섬유성 골이형성증, 치주 재건, 및 골절; 사르코이드증; 골가용성암, 폐암, 신장암, 직장암; 골전이, 골통증 치료, 악성체액고칼슘혈증, 강직성 척추염, 및 다른 척추관절병증; 이식 거부, 바이러스 감염, 혈액종양, 호지킨 림프종과 같은 종양-유사 이상; 비-호지킨 림프종(버키트 림프종, 소림프구성 림프종/만성 림프성 백혈병, 균상 식육종, 세로 림프종, 소포 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종, 마지날 존 림프종, 모양 세포성 백혈병, 림프형질세포성 백혈병), B-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종, 및 T-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종을 포함하는 림프구 전구체 세포들의 종양, 흉선종, 말초 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종 및 거대 과립 림프구성 백혈병을 포함하는 성숙 T 및 NK 세포들의 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 성숙에 의한 AML, 분화 없는 AML을 포함하는 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 급성 단핵구성 백혈병과 같은 골수성 종양, 골수 이형성 증후군, 및 만성 골수성 백혈병을 포함하는 만성골수증식질환, 뇌종양(신경아교종, 신경아세포종, 성상세포종, 수아세포종, 상의세포종 및 망막아종), 고체 종양(비인두암, 기저세포암, 췌장암, 담도암, 카포시 육종, 고환암, 자궁암, 질암 또는 자궁경부암, 난소암, 원발성 간암 또는 자궁내막암, 순환계 종양(혈관육종 및 혈관주위세포종))과 같은 중추 신경계 종양 또는 다른 암을 포함하나 이에 제한되지 않는 이상을 치료하는데 사용될 수 있다.
"암"은 제어되지 않은 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는 포유류들의 생리학적 이상을 의미하거나 기술한다. 암의 예들은 암종, 림프종, 폐모세포종, 육종(지방육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피혈관육종, 림프관육종, 림프관 내피혈관육종, 횡문근육종, 섬유육종, 점액육종, 연골육종), 신경내분비 종양, 중피종, 척색종, 활막종, 신경초종, 수막종, 선암, 흑색종, 및 백색종 또는 림프액 성악성 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이런 암들의 더욱 구체적인 예들은 편평세포암(예를 들어, 상피편평세포암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암 및 폐 편평암종, 소세포 폐암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장관암을 포함하는 위암 또는 장암, 췌장암, 신경교아세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 타액선암, 신장암 또는 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 폐암, 항문암, 음경암, 고환암, 식도암, 담도계 종양, 유잉 종양, 기저세포암, 샘암종, 한선암종, 피지샘암, 유두상 암종, 유두상 선암, 낭선암, 수양암종, 기관지원성 암종, 신장세포암, 간종양, 담관암, 융모암, 정소상피종, 배아암종, 윌름즈 종양, 자궁경부암, 고환종양, 폐암, 소세포폐암, 방광암, 상피세포암, 신경교종, 신경교성상세포종, 수아세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경초증, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막아종, 백혈병, 림프종, 다발성골수종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 골수이형성병, 중쇄병, 신경내분비종양, 신경초종 및 다른 암종뿐만 아니라 머리 및 목 암을 포함한다.
본 발명의 바이오미메틱스는 자가면역질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "자가면역질환"이라는 용어는 80개 이상의 질환과 이상의 다양한 그룹을 의미한다. 이런 모든 질환과 이상에서, 중요한 문제는 신체 면역시스템이 신체 자체를 공격하는 것이다. 자가면역질환들은 연결조직, 신경, 근육, 내분비계, 피부, 혈액 및 순환계 및 위장관계를 포함하는 모든 주요 신체 시스템에 영향을 준다. 자가면역질환들은, 예를 들어, 전신홍반성루프스, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 1형 당뇨병을 포함한다.
본 발명의 조성물과 방법을 사용하여 치료할 수 있는 질환 또는 이상은 특발성 혈소판감소성 자반증, 동종면역/자가면역 혈소판감소증, 후전성 면역 혈소판감소증, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 파르보바이러스 B 19-연관 적혈구무형성증, 후천성 항인자 VIII 자가면역, 후천성 폰빌레브란드병, 다발성 골수종 및 단클론감마글로불린병증, 패혈증, 재생불량빈혈, 진정 적혈구무형성증, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 신생아 용혈성 질환, 면역-매개 호중구감소증, 혈소판수혈불응화, 수혈후 자반증, 용혈성 요독 증후군, 전신성 맥관염, 혈전성 혈소판감소성 자반증 또는 이반 증후군을 포함하나 이에 제한되지 않는 혈액면역학적 작용일 수 있다.
질환 또는 이상은 길란바레 증후군, 만성염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 중증근무력증, 다초점운동신경병증, 항-GM1 항체 관련 하위운동신경원증후군, 탈수초신경병증, 다발성 경화증 및 시신경염, 근강직 증후군, 항-Yo항체를 가진 부신생물 소뇌퇴행증, 신생물딸림뇌척수염, 항-Hu 항체를 가진 감각신경병증, 간질, 뇌염, 척수염, 인간 T-세포 림프종 바이러스-1 관련 척수증, 자가면역 당뇨성 신경병증 또는 급성 특발성 자율신경 신경병증을 포함하나 이에 제한되지 않는 신경면역학적 작용일 수 있다.
질환 또는 이상은 가와사키병, 류마티스 관절염, 펠티증후군, ANCA 양성 혈관염, 자발 다발성근염, 피부근염, 항인지질 증후군, 자궁견관무력증, 전신홍반성루프스, 유아 특발성 관절염, 레이노 증후군, CREST 증후군 또는 포도막염을 포함하나 이에 제한되지 않은 류마티스 질환 작용일 수 있다.
질환 또는 이상은 표피 괴사융해증, 괴저, 육아종, 심상성천포창, 수포유천포창, 및 낙엽성천포창을 포함하는 자가면역 피부 수포성 질병, 백반증, 포도알균 독성 쇼크 증후군, 경피증, 미만성 및 제한성 전신 경화증을 포함하는 전신 경화증, 아토피 피부염, 또는 스테로이드 의존성 아토피 피부염을 포함하나 이에 제한되지 않는 피부면역질환 작용일 수 있다.
질환 또는 이상은 봉입체 근염, 괴사성 근막염, 염증성 근병증, 근염, 항-데코린(BJ 항원) 근병증, 부신생물 괴사성 근병증, X-관련 액포형성 근병증, 페니실아민-유도 다발성근염, 죽경화증, 심장동맥병, 또는 심장근증을 포함하나 이에 제한되지 않는 근골격계 면역질환일 수 있다.
질환 또는 이상은 악성 빈혈, 자가면역성 만성 간염, 원발성 담즙성 경변, 만성소화장애증, 포진상 피부염, 잠복성 간경변증, 반응성 관절염, 크론병, 휘플병, 궤양성 대장염, 또는 경화성 담관염을 포함하나 이에 제한되지 않는 위장관 면역질환 작용일 수 있다.
질환 또는 이상은 이식편대숙주병, 항체-매개 이식 거부반응, 골수이식 후 거부반응, 백혈병, 종양 형성, 천식, 항-베타 세포 항체들을 가진 제 1 형 당뇨병, 쇼그렌 증후군, 혼합결합조직병, 아디손병, 보크트-고야나기-하라다 증후군, 막증식성 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너육아종증, 현미경적 다발성 동맥염, 처그-스트라우스 증후군, 다발성 동맥염, 또는 다장기 기능부전일 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명에서 기술된 스트라도머들은 프리밍 시스템에서 사용될 수 있는데 혈액은 환자로부터 채취되어 환자 속에 다시 주입되기 이전에 약 1시간 내지 약 3시간의 시간 동안 스트라도머(들)와 일시적으로 접촉된다. 세포 치료의 형태로부터, 환자 자신의 효과기 세포들은 효과기 세포들을 스트라도머에 노출시킴으로써 효과기 세포들을 조절하기 위해 매트릭스에 엑스 비보로 고정된 스트라도머에 노출된다. 조절된 효과기 세포들을 포함하는 혈액은 환자에게 다시 주입된다. 이런 프리밍 시스템은 여러 임상적 및 치료적 응용분야를 가질 수 있다.
종양학에서 치료적 스트라도머 응용분야
면역학적 질환들을 치료하기 위한 임상적 용도 이외에, 스트라도바디들은 암 및 염증 질환 치료에서 치료 용도를 가진다. 스트라도바디들은 임의의 상응하는 치료 항체를 위해 필수적으로 다음 공지된 프로토콜을 사용할 수 있다. 스트라도바디들은 일반적으로 암에서 ADCC 또는 감소된 단핵구 및 자가면역질환에서 감소된 사이토카인 방출에 의한 DC 성숙과 같이 단클론 항체에 의해 효과기 세포에 대해 입증된 효과를 증가시키도록 설계될 것이고, 스트라도바디의 Fab 부분에 대한 소스 단클론 항체를 사용하여 일어날 수 있는 것에 비례하여 암에 대한 면역반응을 강력하게 한다.
이로부터 스트라도바디가 설계될 수 있는 예시적 단클론 항체 Fab 도메인들은 세툭시맙, 리툭시맙, 뮤로모납-CD3, 압시지맙, 다클리주맙, 바실리지맙, 팔리비주맙, 인플리지맙, 트라스투주맙, 겜투즈맙, 오조가미신, 알렘투즈맙, 이브리투모맙 티욱제탄, 아달리무맙, 오말리주맙, 토시투모맙, I-131 토시투모맙, 에팔리주맙, 베바시주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 나탈리주맙, 에타네르셉트, IGN101, 볼록시지맙, 안티-CD80 mAb, Anti-CD23 mAb, CAT-3888, CDP-791, 에라프투즈맙, MDX-010, MDX-060, MDX-070, 마투주맙, CP-675,206, CAL, SGN-30, 자놀리무맙, 아데카투무맙, 오레고보맙, 니모투주맙, ABT-874, 데노수맙, AM 108, AMC 714, 폰톨리주맙, 다클리주맙, 골리무맙, CNTO 1275, 오크렐리주맙, HuMax-CD20, 벨리무맙, 에프라투주맙, MLN1202, 비실리주맙, 토실리주맙, 오크렐리주맙, 세르토리주맙 페골, 에쿨리주맙, 펙셀리주맙, 압시지맙, 라니비지무맙, 메폴리주맙, TNX-355, 및 MYO-029를 포함한다.
본 발명에서 개시된, 스트라도머들 및 스트라도바디들, 집단적으로 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스는 여러 다른 응용분야와 용도를 가진다.
면역반응 변경
본 발명에서 개시된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스는 면역반응 프로파일에 특이적 변화들을 일으키기 위해 다양한 문맥으로 면역시스템 반응들을 조절하도록 쉽게 사용될 수 있다. 피험자의 면역반응을 변경 또는 조절하는 것은 면역반응의 비율 또는 성분들을 증가, 감소 또는 변화시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 사이토카인 생산 또는 분비 레벨은 이런 수용체들과 상호작용하도록 설계된 스트라도머와 FcRs의 적절한 조합을 표적화함으로써 원하는 대로 증가 또는 감소될 수 있다. 항체 생산은 증가 또는 감소될 수 있다; 둘 이상의 사이토카인 또는 면역세포 수용체들의 비율은 변화될 수 있다; 또는 다른 형태의 사이토카인 또는 항체들이 생산될 수 있다. 면역반응은 본 발명에 개시된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱에 의해 조절되지 않는 면역반응과 비교해서 증가되거나 감소된 단핵구 대식세포 유도 세포들의 식균작용 효능, 증가되거나 감소된 파골세포 기능, 항원-제공 세포들(예를 들어, DC)에 의해 증가되거나 감소된 항원 제공, 증가되거나 감소된 NK 세포 기능, 증가되거나 감소된 B-세포 기능과 같은 FcγR을 발현하는 면역세포의 효과기 기능일 수 있다.
한 바람직한 실시예에서, 암 또는 자가면역 또는 염증 질환을 가진 피험자는 본 발명에 기술된 치료적 유효량의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 이들의 면역반응을 변화시키고, 치료적 유효량의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱은 피험자의 면역반응을 변화시킨다. 이상적으로 본 발명은 피험자의 질환 또는 이상을 치료한다. 변화된 면역반응은 증가되거나 감소된 반응일 수 있고 IL-6, IL-10, IL-8, IL-23, IL-7, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, TNF-알파 및 IFN-알파의 임의의 레벨을 포함하는 변화된 사이토카인 레벨을 포함할 수 있다. 그러나 본 발명은 기술된 바이오미메틱스의 작용의 임의의 특정 메커니즘에 제한되지 않는다. 변화된 면역반응은 피험자의 변화된 자가항체 레벨일 수 있다. 변화된 면역반응은 피험자의 변화된 자가면역성 T-세포 레베일 수 있다.
예를 들어, 자가면역질환들에서 TNF-알파 생산의 양을 감소시키면 치료 효과를 가질 것이다. 이것은 실질적인 응용분야는 반상 건선, 류마타스 관절염, 건선성 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염을 치료하는데 임상적으로 증명된 안티TNF-알파 항체 치료(예를 들어, REMICADE®)이다. 이런 자가면역질환들은 구별된 병인을 가지나 염증 및 면역세포 활성에 관한 질환 작용의 중요한 면역학적 성분들을 공유한다. TNF-알파 생산을 감소시키도록 설계된 스트라도머는 이들에서 효과적일 것이고 다른 자가면역질환에서도 효과적일 수 있다. 변화된 면역반응 프로파일은, 예를 들어, 피험자 자신의 조직들을 표적화하는 자가항체들 또는 피험자에서 변화된 자가면역성 T-세포 레벨와 같은 항체 생산에서 감소를 일으키는 직접 또는 간접 조절일 수 있다. 예를 들어, 다발성 경화증은 인터페론 베타 치료에 의해 치료될 수 있는 자가반응 T-세포를 포함하는 자가면역질환이다. 예를 들어, Zafranskaya M, et al., Interferon-beta therapy reduces CD4+ and CD8+ T-cell reactivity in multiple sclerosis, Immunology 2007 May;121(1):29-39-Epub 2006 Dec 18 참조. 자가반응성 T-세포 레벨들을 감소하도록 설계된 스트라도머는 다발성 경화증에서 효과적일 것이고 자가반응성 T-세포들을 포함하는 다른 자가면역질환에서도 효과적일 것이다.
면역학적 분석법에서 응용분야
본 발명에서 개시된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스는 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스가 조절하도록 설계된 면역세포 기능을 검사하기 위한 면역학적 분석법을 수행하는데 사용될 수 있다.
낮은 친화성 Fcγ 수용체 경로를 통한 시그널링은 수용체 결합과 세포 표면상에서의 가교를 필요로 한다. 이런 결합과 가교 변수들은 Fc 부위와 반응 세포들의 표면상에서 낮은 친화성 FcγRs 사이의 뒤이은 상호작용에 의해 항원 특이적 표적에 대한 Fab 결합을 통해 충족되는 것으로 가정된다. 이 문맥에서, 항체들은 두 개의 구별된 경로를 통해 세포 반응을 일으키는 효력을 가진다: 1. Fab 상호작용/에피토프 특이적 표적에 의한 봉쇄/의 봉쇄 및 2. FcRs와의 Fc 상호작용. 이런 사실에도 불구하고, 인비보에서 사용된 단클론 항체들을 사용하는 대다수의 치료 연구들에 대한 현재의 대조군들은 Fc의 효능을 적절하게 나타내지 않는다: 관찰된 기능성 효과들에 대한 공헌자로서 Fcγ 수용체 상호작용. 여러 전략이 혼란 변수로서 Fc:FcR 상호작용을 제거하도록 현재 사용된다. 예를 들어, 일부 연구들은 Scv(단일 사슬 가변 영역) 또는 에피토프 특이성을 가지나 Fc 부위가 없는 Fab 단편들을 사용한다. 이런 방법들은 이런 시약들의 짧은 반감기 및 시그널링을 유도하는 이들의 제한된 효능에 의해 제한된다. 다른 연구들은 Fc 단편에 융합된 수용체 또는 리간드로 구성된 융합 단백질들을 사용한다. 이런 형태의 방법들이 수용체 리간드 상호작용에 의해 관찰된 효과들로부터 Fab 특이적 효과들을 구별하는데 도움을 주는 반면, 이들은 Fc 매개 효과들을 적절하게 제어하지 않는다. 동물 모델에서 항체 기초 치료들의 평가는 관련없는 Fab 결합 부위에 의한 아이소타이프 대조군 항체들을 사용할 수 있다. 이런 선택에 대한 근본적 이유는 이들의 Fab 결합 특이성 또는 친화성과 상관없이 동일한 아이소타이프의 항체들 사이의 예상된 기능적 유사성을 기초로 한다. 그러나, 관련없는 아이소타이프 대조군들의 이런 용도는 여러 기본적인 결함을 가진다:
1. 이런 항체들의 만일 Fab 단편들이 리간드 또는 항원 에피토프와 결합하지 않는 경우, Fc 단편들은 Fcγ 수용체 가교가 없기 때문에 낮은 친화성 FcR 상호작용을 통한 시그널링을 자극하지 않을 것이다. 따라서, 실험 항체 및 대조군 항체 사이의 관찰된 기능적 차이는 FcγR을 가교시키는 수단이 없는 에피토프 특이적 표적과의 Fab 상호작용에 정확하게 기여하지 못할 것이다.
2. 만일 이런 아이소타이프들이 다른 당형들 또는 개별 당형들의 부모 항체와 다른 상대 백분율을 나타내는 세포들에서 생산되는 경우, 낮은 및 높은 친화성 FcRs에 대한 결합은, 비록 Fab 친화성이 동일할지라도 변할 것이다.
이런 문제를 극복하기 위한 완벽한 대조군이 없지만, 한 옵션은 부모 항체들과 동일한 세포들에서 생산되고 실험 항체에 의해 표적화된 에피토프의 발현 레벨에 비례하는 복용량으로 제공되는 아이소타이프 특이적 스트라도머들의 사용이다. 예를 들어, 쥐에서 생산되는 에피토프-특이적 항체에 대한 적절한 대조군은 효과기 세포들의 표면에 Fcγ 수용체를 결합시키는 쥐 아이소타이프-특이적 스트라도머일 것이다.
일반적으로, 면역세포는 공지된 방식으로 면역세포의 활성을 조절하는 유효량의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱에 노출되고 이런 면역 조절은 검사 화합물이 동일한 면역 조절 활성을 갖는 지를 측정하기 위해 검사 화합물 또는 분자와 비교된다.
다른 실시예에서, 열 결합된 스트라도머들 및 결합된 면역글로불린들은 본 발명에서 기술되고 당업자에게 공지된 다양한 면역학적 분석법에서 실험 대조군들 위한 시약들로 사용될 수 있다.
면역학적 분석법은 인비트로 분석법 또는 인비보 분석법일 수 있고 종들-일치되거나 종들-불일치된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱을 사용하는 인간 또는 비인간 면역세포들을 포함한다. 한 실시예에서 면역학적 분석법은 면역 세포의 활성을 조절하기 위해 유효량의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱을 사용하고 조절을 검사 화합물에 의한 면역 세포의 조절과 비교함으로써 수행된다. 스트라도머 또는 스트라도바디는 면역학적 효과를 위한 다른 화합물들의 검사를 포함하는 분석법에서 양성 대조군 시약의 기능을 수행할 수 있다. 분석법은 피험자 단클론 항체의 효과를 수용체 발현 레벨, 사이토카인 방출 및 혼합 림프구 반응을 사용하는 것과 같은 기능에서의 변화들에 의해 측정된 대로 효과기 세포 Fcγ 수용체 결합 및 기능성 반응에 대한 스트라도머와 비교할 수 있다. 이런 방식으로, 만일 스트라도머(Fab가 없음)가 단클론 항체와 부분적으로 유사한 반응을 유발하는 경우 단클론 항체의 효과는, 어느 정도, 이의 Fab의 특이성 때문이 아니고 효과기 세포 상에 하나 이상의 Fcγ 수용체와 결합 및 가교하는 일반적인 효과 때문이다. 이런 동일한 스트라도머와 이 동일한 단클론 항체로부터의 Fab를 포함하는 스트라도바디는 단클론 항체 Fab의 특이성을 효과기 세포 상에 하나 이상의 Fcγ 수용체와 결합 및 가교하는 일반적인 효과와 구별하는 것을 도울 수 있다.
종들-특이적 및 아이소타이프-특이적 항체의 생물학적 활성이 종들-특이적 및 아이소타이프-특이적 스트라도머에 의해 부분적으로 또는 전체로 복제되는 경우 Fc-Fcγ 수용체 활성은 종들-특이적 및 아이소타이프-특이적 스트라도머에 영향을 줄 수 있는 관찰된 생물학적 활성의 일부를 차지한다. 따라서 종들-특이적 및 아이소타이프-특이적 스트라도머들은 관찰된 생물학적 활성이 검사 항체의 Fab 부분 또는 하나 이상의 Fcγ 수용체와 결합 및 가교하는 분자의 Fc 부분의 비특이적 효과에 영향을 주는지 또는 어느 정도 인지를 결정하기 위해 잠재적인 치료 항체들을 평가하는데 효과적이다.
한 실시예에서, 본 발명의 분리된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱은, 면역글로불린 Fc 종류가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경우, 동일한 면역글로불린 Fc 종류로부터의 적어도 2개의 Fc 도메인 또는 이의 부분 도메인을 포함하는 적어도 하나의 스트라도머를 포함한다. 이런 바이오미메틱스는 제 1 FcγRx1, x1은 I, II, III 또는 IV 및 제 2 FcγRx2, x2는 I, II, III 또는 IV에 특이적으로 결합할 수 있다. 이런 바이오미메틱스는 Fcγ 수용체 가교 또는 복수의 자연적으로 발생하는 결합된 IgG 면역글로불린의 효과기 기능성에 필적하거나 뛰어난 Fcγ 수용체 가교 또는 효과기 기능성을 포함하는 면역학적 활성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 실시예에서 본 발명은 다른 면역글로불린 종류들 또는 이의 부분 도메인들로부터의 적어도 2개의 Fc 도메인들을 포함하는 적어도 하나의 스트라도머를 포함하는 분리된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱을 포함하며, 바이오미메틱은 제 1 FcγRx1, x1은 I, II, III 또는 IV 및 제 2 FcγRx2, x2는 I, II, III 또는 IV에 특이적으로 결합할 수 있다. 이런 바이오미메틱은 Fcγ 수용체 가교 또는 복수의 자연적으로 발생하는 결합된 IgG 면역글로불린의 효과기 기능성에 필적하거나 뛰어난 Fcγ 수용체 가교 또는 효과기 기능성을 포함하는 면역학적 활성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 실시예에서 본 발명은 각각 독립적으로 셋 이상이 Fc 도메인을 포함하는 하나 이상의 스트라도머를 포함하는 분리된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱을 포함하고, 셋 이상의 Fc 도메인들은 a) 제 1 Fc 도메인, 제 1 Fc 도메인은 제 1 면역글로불린의 Fc 힌지(H)를 포함하고, b) 제 2 Fc 도메인, 제 2 Fc 도메인은 제 2 면역글로불린의 불변 부위 2(CH2)를 포함하고, 제 2 Fc 도메인은 제 1 FcγRx1, x1은 I, II, III 또는 IV에 특이적으로 결합할 수 있고; c) 제 3 Fc 도메인, 제 3 Fc 도메인은 제 3 면역글로불린의 불변 부위 3(CH3)을 포함하고, 제 3 Fc 도메인은 제 1 FcγRx2, x2는 I, II, III 또는 IV에 특이적으로 결합할 수 있다. 이런 바이오미메틱스는 제 4 Fc 도메인을 선택적으로 포함할 수 있고, 제 4 Fc 도메인은 제 4 면역글로불린 IgM의 불변 부위 4(CH4)를 포함한다. 이 분자에 의해 Fc 힌지는 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 a) 제 1 Fc 도메인 또는 이의 Fc 부분 도메인, 제 1 Fc 도메인은 제 1 면역글로불린의 Fc 힌지(H)를 포함하고, Fc 힌지 도메인은 적어도 하나의 시스테인, 여기서 제 1 Fc 도메인은 FcγRx, x는 I, II, III 또는 IV에 특이적으로 결합하는데 기여하고; 및 i) 제 2 Fc 도메인 또는 이의 부분 도메인, 여기서 제 2 Fc 도메인은 제 1 면역글로불린과 동일하거나 동일하지 않을 수 있는 제 2 면역글로불린으로부터의 불변 부위 2(CH2)를 포함하고, 제 2 Fc 도메인은 FcγRx, x는 I, II, III 또는 IV에 특이적으로 결합하는데 기여하고; 및 선택적으로, ii) 제 3 Fc 도메인 또는 이의 부분 도메인 중 적어도 하나를 포함하고, 여기서 제 3 Fc 도메인은 제 3 면역글로불린으로부터의 불변 부위 3(CH3)을 포함하고, 제 3 Fc 도메인은 FcγRx, x는 I, II, III 또는 IV에 특이적으로 결합하는데 기여하고; 및 b) 선택적으로, 제 4 Fc 도메인 또는 이의 부분 도메인, 여기서 제 4 Fc 도메인은 IgM 면역글로불린으로부터의 불변 부위 4(CH4)에 대한 결합 특이성에 기여한다.
다른 실시예에서, 분리된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱은 스트라도머이고 Fc 도메인들의 면역글로블린 소스는 동일하거나 다르며 IgA 아이소타이프, IgG 아이소타이프, IgD, IgE 및 IgM을 포함한다. 다른 스트라도머 실시예는 분비 신호 서열을 포함하는 분리된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱이다.
한 바람직한 실시예에서 치료적 유효량의 분리된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스는 면역세포의 표면상에서 둘 이상의 FcγRx, x는 I, II, III 또는 IV와 바이오미메틱스가 결합하게 하여 FcγRx가 뭉치게 하는데 충분한 양이다. 면역세포는 단핵구, 수지상 세포, 대식세포, 파골세포 또는 NK 세포와 같은 임의의 면역 효과 세포일 수 있다. 면역 효과 세포의 성숙은 면역학적으로 활성인 바이오미메틱에 의해 조절될 수 있다. FcγR IIa 대 FcγR IIb의 비율은 면역 세포들에 대해 변하게 될 것이다. 면역 세포는 혈장, 골수, 장, 뼈, 림프 조직, 흉선, 뇌, 감염 또는 종양 부위에 위치할 수 있다. 대식세포, 수지상세포, 파골세포 또는 NK 세포의 기능적 활성은 조절될 수 있다.
본 발명에 기술된 치료적 유효량의 분리된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱은 치료된 면역세포들을 형성하기 위해 면역 세포에 엑스 비보로 투여될 수 있고 치료된 면역 세포를 피험자에게 주입하는 단계가 이어질 수 있다. 치료된 면역 세포는 수지상 세포, 대식세포, 파골세포 또는 단핵구일 수 있다.
다른 면역치료가 치료적 유효량의 분리된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스 중 임의의 것과 함께 피험자에게 제공될 수 있다. 추가 면역치료는, 예를 들어, 하나 이상의 보조 자극분자, 단클론 항체, 다클론 항체, 융합 단백질, 생체특이적 항체, 사이토카인, 면역학적으로 인식된 항원, 소형 분자 항암제 또는 세포증식억제제를 포함할 수 있다. 다른 면역치료는 면역학적으로 활성인 바이오미메틱의 투여와 동시에 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
사이토카인(상기한 것 포함) 레벨은, 예를 들어, 하나 이상의 관심 사이토카인, 하나 이상의 관심 사이토카인의 레벨을 조절하는 하나 이상의 다른 사이토카인 및/또는 상기 두 종류의 사이토카인 중 임의의 하나 이상에 대해 특이적인 항체(본 발명에서 인용된 형태 및 종류 중 임의의 것)를 투여함으로써 변화될 수 있다.
본 발명에서 기술된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스는 대식세포, 수지상세포, 파골세포 또는 NK 세포를 포함하는 면역 세포로부터 보조 자극분자들의 발현을 조절하거나 이런 동일한 면역 세포들에서 분화, 성숙 또는 인터루킨-12(IL-12)를 포함하는 사이토카인 분비를 억제하거나 인터루킨-10(IL-10) 또는 인터루킨-6(IL-6)을 포함하는 사이토카인 분비를 증가시키는데 사용될 수 있다. 당업자는 면역 세포를 면역학적으로 활성인 바이오미메틱에 노출하고 면역 세포 기능의 조절을 측정하여 면역학적으로 활성인 바이오미메틱의 효능을 증명할 수 있고, 여기서 면역 세포는 수지상 세포, 대식세포, 파골세포 또는 단핵구이다. 한 실시예에서, 면역 세포는 면역학적으로 활성인 바이오미메틱에 인비트로로 노출되고 세포 표면 수용체 또는 사이토카인 생산의 양을 결정하는 단계를 더 포함하고, 여기서 세포 표면 수용체 또는 사이토카인 생산의 양의 변화는 면역 세포 기능의 조절을 나타낸다. 다른 실시예에서 면역 세포는 자가면역 질환을 위한 모델 동물에서 면역학적으로 활성인 바이오미메틱에 인비보로 노출되고 자가면역질환의 개선 정도를 분석하는 단계를 더 포함한다.
본 발명에서 사용된 FcγRx에 특이적으로 결합할 수 있는"은 FcγRIII과 같은 FcγR에 결합하는 것을 의미한다. 특이적 결합은 결합 분석에서 뒤이은 과량의 표지화되지 않은 리간드에 의해 교환될 수 있는 식별화된 리간드의 양으로 일반적으로 정의된다. 그러나, 이것은 당업계에 잘 정립된 특이적 결합을 분석하는 다른 수단을 배제하지 않는다(예를 들어, Mendel CM, Mendel DB, 'non-specific' binding. The problem, and a solution. Biochem J. 1985 May 15;228(1):269-72). 특이적 결합은 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 결합 및 분해 상수를 나타내는 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술(BIACORE®통해 구입가능)과 같이 당업계에 주지된 다양한 방식으로 측정될 수 있다(Asian K, Lakowicz JR, Geddes C. Plasmon light scattering in biology and medicine: new sensing approaches, visions and perspectives. Current Opinion in Chemical Biology 2005, 9:538-544).
고정 Fc 를 사용하는 방법
Fc:Fc 감마 수용체(FcγR, IgG Fc에 대한 Fc 수용체) 상호작용의 역할 및 면역글로불린 내에서 생물학적으로 면역화된 Fc의 IVIG 기능에 대한 중요성을 이해하기 위해서, 단핵구들이 미성숙 수지상 세포들(iDC)로 분화하는 동안 단핵구들의 기능에 대한 재조합 IgG1 Fc 단편(rFCF)의 고정 형태 및 한지-CH2-CH3 도메인을 포함하는 재조합 IgG1 Fc 단편(sFc)의 가용 형태를 가진 IVIG의 효과들을 비교하였다.
과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)와 인터루킨-4(IL-4)에서 배양한 단핵구들을 저용량 가용성 IVIG가 아닌 고정된 rFCF 및 고정된 IVIG에 노출하면 세포들에서 CD86 발현을 증가시켰고, CD11c의 발현을 지연시켰고 CD1a의 발현을 억제하였다. 게다가, 이런 변화들은 플라스틱상에서 rFCF의 비-특이적 단백질 고정화에 파생적이지 않을 것인데, 이는 가용성 열 결합(sHA)IVIG, sHA rFCF 또는 고용량 IVIG(멀미터 Fcs를 포함하는 것으로 인식)가 고정된 rFCF에 의해 관찰된 것과 유사한 변화들을 유도하기 때문이다.
데이터는 iDC를 고체, 반고체, 또는 젤라틴 기질 상에 고정된 IVIG에 노출하면 면역 내성을 조정할 수 있는 DC's(하이 CD86, 로우 CD1a)의 독특한 집단을 형성하고, 면역글로불린 G(IgG) Fc 단편들의 기능성 부분을 포함하는 고정화된 분자들은 국소 및 전신 염증뿐만 아니라 iDC와 같은 단핵구 유도 세포들(MDC)에 의해 직접 또는 간접적으로 매개되는 다양한 다른 병리학적 이상의 치료를 위한 IVIG의 모방체로서 효과적일 것이다. 또한, 신체 속에 삽입되거나 IgG Fc 단편의 기능성 부분을 포함하는 분자들을 가진 동물의 신체(예를 들어, 인간 환자)에 부착되는 본 발명에서 "코팅 장치들"로 기술된 장치들 상에 IgG Fc의 기능성 부분을 고정화하면 이런 장치들에 대한 염증 반응들을 만일 막지 못한다면 감소시킬 수 있다.
본 발명은 단핵구 유도 세포(MDC)의 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 기질에 부착된 Fc 시약을 가진 기질을 포함하는 조성물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 접촉은 인비트로, 인비보 또는 엑스 비보일 수 있다. 선택적으로, 세포는 동물의 것이다. 단핵구 유도 세포 매개 이상(MDCMC)을 가지고 있거나 진행할 위험이 있는 것일 수 있다. MDC는 예를 들어, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구 또는 파골세포일 수 있다.
본 발명은 또한 치료법 또는 예방법을 제공한다. 이 방법은 MDCMC를 가지고 있거나 진행할 위험이 있는 동물에게 기질에 부착된 Fc 시약을 가진 기질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용된 대로, "단핵구-유도 세포 매개 이상(MDCMC)"이라는 용어는 단핵구 유도 세포의 활성 또는 단핵구 유도 세포에 의해 형성된 인자에 직접 또는 간접, 부분 또는 전체적으로 기인한 병리학적 이상을 의미한다. 단핵구 유도 세포들은 단핵구, 대식세포, 상호교차수지상세포(일반적으로 수지-유사 세포 및 소포 수지-유사 세포를 포함하는 "수지상 세포"로 불림), 파골세포, 미세아교세포-유사 세포, 단핵구 유도 인슐린-생산 섬-유사 세포, 단핵구 유도 미성숙 비만 세포 및 단핵구 유도 미세 입자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
고정 Fc를 사용하는 방법에 대해, "Fc 시약"이라는 용어는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20 이상)의 면역글로불린 Ig(IgG) Fc 단편의 기능성 부분을 포함하는 임의의 분자 또는 분자 착물을 의미한다. IgG의 Fc 단편은 서로 연결된 IgG 분자의 두 IgG 중사슬의 C-말단으로 구성되고 함께 연결된 두 중사슬의 힌지 부위, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 구성된다. "IgG Fc 단편의 기능성 부분"은 서로 연결된 중사슬의 힌지 부위, CH2 도메인, 및 선택적으로 전부 또는 일부(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 49)의 제 1 50(N-말단으로부터의) 아미노산의 CH3 도메인으로 구성된다. 인간에서, (a) IgG1 힌지 부위는 15개 아미노산을 포함하고, CH2 도메인은 110개 아미노산을 포함하고 CH3 도메인은 106개 아미노산을 포함하고; (b) IgG2 힌지 부위는 12개 아미노산을 포함하고, CH2 도메인은 109개 아미노산을 포함하고, CH3 도메인은 107개 아미노산을 포함하고; (c) IgG3 힌지 부위는 62개 아미노산을 포함하고, CH2 도메인은 104개 아미노산을 포함하고 CH3 도메인은 106개 아미노산을 포함하고; (d) IgG4 힌지 부위는 12개 아미노산을 포함하고, CH2 도메인은 109개 아미노산을 포함하고 CH3 도메인은 107개 아미노산을 포함한다.
야생형 IgG 분자로서, 상기한 Fc 시약에서, IgG 중사슬로부터 유도된 두 개의 폴리펩타이드 사슬은 일반적으로 동일하나 필수적인 것은 아니다. 따라서, Fc 시약은, 제한 없이, 전체 IgG 분자, 비-면역글로불린 유도 폴리펩타이드에 연결된 전체 IgG 분자, IgG Fc 단편, 비-면역글로불린 유도 폴리펩타이드에 연결된 IgG Fc 단편, IgG Fc 단편의 기능성 부분, 비-면역글로불린 유도 폴리펩타이드에 연결된 IgG Fc 단편의 기능성 부분 또는 이들 중 임의의 것의 멀티머(예를 들어, 다이머, 트라이머, 테트라머, 펜타머, 헥사머, 헵타머, 옥타머, 노나머 또는 데카머)일 수 있다. Fc 시약은 상기 Fc 시약의 정의에 해당하는 한 상기한 스트라도머들 및 스트라도바디들일 수 있다.
고정 Fcγ에서, Fc 시약의 면역글로불린 중사슬 구성요소는 야생형 아미노산 서열을 가질 수 있거나 많아야 20개의 아미노산 치환(예를 들어, 많아야: 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1)을 가진 야생형 아미노산 서열일 수 있다. 이런 치환은 바람직하게는 보존적 치환이나 필수적이진 않다. 보존적 변화는 통상적으로 다음 그룹 내의 변화를 포함한다: 글리신과 알라닌; 발린, 아이소루신 및 루신; 아스파라트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티틴 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 타이로신.
본 발명의 "Fc 시약"은 IgG 분자의 활성의 적어도 25%(예를 들어, 적어도 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99.5%; 또는 100% 이상)을 가지며 관심 Fc 수용체에 결합하도록 Fc 시약의 IgG 중사슬 구성요소들은 (기준 IgG 분자)로부터 유도되었다. "Fc 시약"이 한 가지 형태 이상의 IgG 분자로부터 유도된 중사슬 구성요소를 갖는 경우, 기준 IgG 분자는 관련된 관심 Fc 수용체에 대해 최대 능력으로 결합하는 것이다.
본 발명에서 사용된 "고정 Fc"는 아래에 정의된 "기질"에 결합하는 Fc 시약을 의미한다. "고정 Fc", "결합된 Fc" 및 "안정화된 Fc"라는 용어는 동의어이다. 고정 Fc는 기질에 부착된 Fc(Fc의 기능성 부분을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함하나 이에 제한되지 않음)의 기능성 부분으로 이루어진다. 고정 Fc는, 예를 들어, 기질에 대한 직접 결합뿐만 아니라 Fc의 폴리머들을 통한 기질에 대한 간접 결합; 분리된 전장 IgG의 합체; IgG Fc의 기능성 도메인들만의 합체; 또는 전장 IgG Fc 또는 항체, 스트라도머 또는 스트라도바디와 같은 대형 폴리펩타이드의 일부로서 IgG Fc의 기능성 도메인의 합체를 포함한다.
고정 Fc에 사용되는 것과 같이, "기질"이란 용어는 고체, 반고체 또는 젤라틴 물체를 의미한다. 기질은 동물의 신체에 이식 또는 신체의 표면에 부착(또는 접착)될 수 있다. 기질은, 예를 들어, 액체 또는 기체 구성요소를 포함하나 기질의 적어도 일부는 고체, 반고체 또는 젤라틴이다. 따라서, 기질은 수성 용매에 실질적으로 불용성이나 비 수성 용매에 용해되는 물질일 수 있다. 이런 물질은 지질(예를 들어, 인지질), 지방산 및 다른 지방-가용성 수성 용매-불용성 화합물을 포함한다. 이로부터, 기질들은 리포솜을 포함한다는 것이 분명해질 것이다. 기질은 다공성 또는 비다공성일 수 있다. 특정 실시예들에서, 기질은 기질이 이식, 부착 또는 접착되는 표면 및/또는 신체에 삽입된다.
기질은 합성 폴리머, 예를 들어, 나일론, 테프론, 데크론, 폴리바이닐 클로라이드, PEU(폴리(에스터 우레탄)), PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌), PMMA(메틸 메타크릴레이트) PEEK, 열가소성 엘라스토머, 방사선 불투과성 폴리머, 폴리에터설폰, 실리콘, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리아이소부틸렌 및 이의 코폴리머, 폴리에스터, 폴리올레핀, 폴리아이소부틸렌, 에틸렌알파올레핀 코폴리머, 아크릴 폴리머 및 코폴리머, 폴리바이닐 클로라이드, 폴리바이닐 에터, 폴리바이닐 메틸 에터, 폴리바이닐리덴 헬라이드, 폴리바이닐리덴 플로라이드, 폴리바이닐리덴 클로라이드, 폴리아크릴로나이트릴, 폴리바이닐 케톤, 폴리바이닐 아로매틱스, 폴리스티렌, 폴리바이닐 에스터, 폴리바이닐 아세테이트, 바이닐 모노머들의 코폴리머, 바이닐 모노머와 올레핀의 코폴리머, 에틸렌-메틸 메타크릴레이트 코폴리머, 아크릴로나이트릴-스티렌 코폴리머과 같은, 바이닐 헬라이드 폴리머 및 코폴리머, ABS 수지, 에틸렌-바이닐 아세테이트 코폴리머, 폴리아마이드, 나일론 66, 폴리카프로락톤, 알키드 수지, 폴리옥시에틸렌, 폴리이미드, 폴리에터, 에폭시 수지, 레이온-트라이아세테이트, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 뷰티레이트, 셀룰로오스 아세테이트 뷰티레이트, 셀로판, 셀룰로오스 나이트레이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 에터, 카복시메틸 셀룰로오스, 콜라겐, 키틴, 폴리애틱산, 폴리글리콜산, 폴리액틴 산-폴리에틸렌 옥사이드 코폴리머, 폴리실록산, 치환된 폴리실록산, 에틸렌 바이닐 아세테이트 코폴리머, 폴리올레핀 엘라스토머 및 EPDM 고무 및 이의 조합으로 제조되거나 포함할 수 있다.
기질은 금속 또는 금속 합금, 예를 들어, 스테인리스 강, 백금, 이리듐, 티타늄, 탄탈륨, 니켈-티타늄 합금, 또는 코발트 크롬 합금으로 제조되거나 포함할 수 있다. 또한, 기질은 동물 조직 또는 동물 조직 생성물, 예를 들어, 조직 또는 장기 이식편이거나 포함할 수 있다. 동물 조직은, 예를 들어, 뼈(예를 들어, 뼈형성골) 또는 연골일 수 있다. 또한, 기질은 단백질, 예를 들어, 콜라겐 또는 케라틴을 포함할 수 있다. 기질은 조직 매트릭스, 예를 들어, 무세포 조직 매트릭스이거나 포함할 수 있다. 미립자 및 비 미립자 무세포 매트리그는 예를 들어, 전문이 본 발명에 포함된 미국특허 제 5,336,616호 및 제 6,933,326호에 상세하게 기술된다. 기질은 동물 세포(예를 들어, 섬유아세포 또는 간엽 줄기세포와 같은 조직 치료 세포)이거나 포함할 수 있고 예를 들어, 모발 이식 플러그일 수 있다. 기질은 폴리사카라이드, 예를 들어, 아가로스이거나 포함할 수 있다. 또한 기질은 염, 바람직하게는 상대적으로 불용성인 염, 예를 들어, 황산칼슘이거나 포함할 수 있다. 기질은 겔 또는 크림이거나 포함할 수 있다. 또한 기질은 실리콘 또는 실라스틱이거나 포함할 수 있다. 또한 기질은 천연 섬유, 예를 들어, 실크, 무명 또는 양모를 포함할 수 있다.
또한, 기질은 이식가능한 의료 장치일 수 있다. 기질은, 예를 들어, 스텐트(예를 들어, 관상동맥 스텐트와 같은 혈관 스텐트; 기관내 또는 비강 스텐트와 같은 공기통로 스텐트; 담즙 또는 췌장 스텐트와 같은 위장관 스텐트; 또는 요도 스텐트와 같은 비뇨기 스텐트) 또는 외과 봉합사(예를 들어, 견제 봉합사, 크로믹 겉(chromic gut), 나일론, 플라스틱 또는 금속 봉합사 또는 외과용 클립(예를 들어, 동맥류 클립)일 수 있다. 또한, 기질은 인공 엉덩이, 인공 엉덩이 조인트, 인공 무릎, 인공 무릎 조인트, 인공 어깨, 인공 어깨 조인트, 인공 손가락 또는 발가락 조인트, 골판, 뼈 합정, 뼈 불유합 임플란트, 추간판 임플란트, 골 시멘트, 또는 골 시멘트 스페이서일 수 있다. 또한 기질은 동정맥루(arterial-venous shunt), 이식형 와이어, 페이스메이커, 인공심장, 심장 지원 장치, 인공귀, 이식형 제세동기, 척수 자극기, 중추신경계 자극기 또는 말초신경 임플란트일 수 있다. 다른 기질은 치과 보철물 또는 덴탈 크라운일 수 있다.
다른 실시예들에서, 기질은 대형 혈관색전발생장치 또는 케이지(vessel embolic filtering device or cage), 경피적 장치, 피부 또는 점막하 패치 또는 이식형 약물전달장치일 수 있다.기질은 대형 혈관 이식물일 수 있고, 혈관은, 예를 들어, 경동맥, 대퇴동맥, 대동맥이다. 기질은 피하 임플란트, 각막 임플란트, 안내 렌즈 또는 컨택트 렌즈일 수 있다.
기질은, 예를 들어, 시트, 비트, 메시, 분말 입자, 실, 비드 또는 섬유의 형태일 수 있다. 기질은 고체, 반고체 또는 젤라틴 물질이거나 포함할 수 있다.
본 발명에서 효과적인 폴리머들은 특히 장치를 신체에 삽입하거나 이식할 때 생체안정성, 생체혼용성이고 신체 조직에 대한 거부를 피하는 것들이 바람직하다.
Fc 시약들은 다양한 방법들 중 임의의 것으로 기질 상에 코팅(즉, 고정되거나 안정화됨)될 수 있다. 예를 들어, Fc 시약은, 예를 들어, 소수성 상호작용에 의해 부착되는 기질들의 표면상에 직접 코팅될 수 있다. 아래는 폴리머들의 사용을 포함하는 여러 다른 방법들((a)-(e)) 을 기술한다:
(a) Fc 시약은 나중에 이식가능한 합성 물질의 표면에 적층되어 Fc 시약을 안정화시키는 혼합가능한 폴리머 혼합물과 혼합된다. 폴리머 혼합물을 제조하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 모노머들은 PLMA[폴리(라우릴 메타크릴레이트)]; PEG[폴리에틸렌 글리콜], PEO[폴리에틸렌 옥사이드]; 알킬 기능화된 메타크릴레이트 폴리머 PMMA, PEMA, PPMA 및 PBMA; 이타코네이트; 퓨마레이트 및 스티레닉스를 포함한다.
(b) 폴리머 하부코팅층 또는 나노미터 두께 막은 기질 표면상에 부착되고 Fc 시약은 폴리머 하부코팅층 또는 나노미터 두께 막에 부착되어, Fc 시약을 안정화시킨다.
(c) 폴리머 모노머의 박막을 이식가능한 기질 표면에 도포하고 모노머는 중합을 일으킨다. 이런 모노머는, 예를 들어, 메테인, 테트라플루오로에틸렌, 벤젠, 메탄올, 에틸렌 옥사이드, 테트라글림, 아크릴산, 알릴아민, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, N-바이닐 파이롤리돈 및 머캡토에탄올을 포함한다. Fc 시약은 얻어진 모노머에 부착된다.
(d) 기질은 Fc 시약에 부착되어 기질의 표면에 대해 Fc를 안정화시키는 단백질 A 또는 알부민과 같은 단백질로 코팅된다.
(e) Fc 시약은 이식가능한 합성 물질에 결합되어 안정화된 Fc를 균일하게 위치시키는 소수성 아미노산의 사슬을 붙일 수 있다.
본 발명의 방법들은 임의의 동물 종들에 사용될 수 있고 Fc 시약의 IgG-유도 부분들이 유도되는 IgG 분자들은 임의의 동물 종들의 것일 수 있다. 자연적으로, 관련된 동물 종들은 IgG 또는 IgG-유사 분자들이 발생하는 것들이다. 일반적으로 본 방법이 사용되는 종들 및 본 방법에서 사용된 Fc 시약의 IgG-유도 부분이 유도되는 종들은 동일하다. 그러나, 종들은 반드시 동일할 필요는 없다. 관련된 동물 종들은 바람직하게는 인간, 비 인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지), 말, 소과 동물(예를 들어, 황소, 젖소 또는 소), 돼지, 염소, 양, 개, 고양이, 토끼, 게르빌루스쥐, 햄스터, 쥐 및 생쥐를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비 포유류 종들은, 예를 들어, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 및 오리) 및 물고기를 포함한다.
"치료하는", "치료" 및 "예방"이라는 용어는 스트라도머들 및 스트라도바디들에 대해 상기한 대로 고정 Fc를 사용하는 동일한 의미를 가진다.
고정 Fc가 Fc 시약으로 코팅된 이식가능한 장치들에 사용되는 경우, 고정 Fc는 당업계에 주지된 방법들을 사용하여 관련 피험자의 관련 내장 기관 또는 조직 또는 신체 표면에 이식되거나 부착되거나 접착될 수 있다. 고정 Fc가, 예를 들어, 현탁액, 분말로 제제화되는 경우, 이들은 스트라도머들 및 스트라도바디들에 대해 상기한 대로 제제화되고 투여될 수 있다.
본 발명의 고정 Fc 시약은 암, 울혈성 심부전(CHF), 맥관염, 홍조증, 여드름, 습진, 심근염, 심근의 다른 이상, 전신홍반성루프스, 당뇨병, 척추병증, 활막 섬유아세포, 및 골수 기질; 뼈 손실; 파젯병, 파골세포종; 다발성 골수종; 유방암; 폐용성 골결핍; 영양결핍, 치주염, 고셔병, 랑게르한스 세포 조직구증, 척수손상, 급성 감염성 관절염, 골연화증, 쿠싱증후군, 단골성 섬유성 골이형성증, 다골성 섬유성 골이형성증, 치주 재건, 및 골절, 골통증 치료, 악성체액고칼슘혈증, 강직성 척추염, 및 다른 척추관절병증; 이식 거부 및 바이러스 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는 이상들을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
모든 자가면역질환들은 일부 또는 전체 MDCMD일 수 있다. 본 발명에서 "자가면역질환"이라는 용어는 80개 이상의 만성 질환들의 다양한 그룹을 의미한다. 이런 모든 질환들에서, 중요한 문제는 신체의 면역시스템이 신체 자체를 공격한다는 것이다. 자가면역질환들은 자가면역질환들은 연결조직, 신경, 근육, 내분비계, 피부, 혈액 및 순환계 및 위장관계를 포함하는 모든 주요 신체 시스템에 영향을 준다.
자가면역질환 또는 이상은 특발성 혈소판감소성 자반증, 동종면역/자가면역 혈소판감소증, 후전성 면역 혈소판감소증, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 파르보바이러스 B 19-연관 적혈구무형성증, 후천성 항인자 VIII 자가면역, 후천성 폰빌레브란드병, 다발성 골수종 및 단클론감마글로불린병증, 패혈증, 재생불량빈혈, 진정 적혈구무형성증, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 신생아 용혈성 질환, 면역-매개 호중구감소증, 혈소판수혈불응화, 수혈후 자반증, 용혈성 요독 증후군, 전신성 맥관염, 혈전성 혈소판감소성 자반증 또는 이반 증후군을 포함하나 이에 제한되지 않는 혈액면역학적 작용일 수 있다.
자가면역질환 또는 이상은 길란바레 증후군, 만성염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 중증근무력증, 다초점운동신경병증, 항-GM1 항체 관련 하위운동신경원증후군, 탈수초신경병증, 다발성 경화증 및 시신경염, 근강직 증후군, 항-Yo항체를 가진 부신생물 소뇌퇴행증, 신생물딸림뇌척수염, 항-Hu 항체를 가진 감각신경병증, 간질, 뇌염, 척수염, 인간 T-세포 림프종 바이러스-1 관련 척수증, 자가면역 당뇨성 신경병증 또는 급성 특발성 자율신경 신경병증을 포함하나 이에 제한되지 않는 신경면역학적 작용일 수 있다.
자가면역질환 또는 이상은 가와사키병, 류마티스 관절염, 펠티증후군, ANCA 양성 혈관염, 자발 다발성근염, 피부근염, 항인지질 증후군, 자궁견관무력증, 전신홍반성루프스, 유아 특발성 관절염, 레이노 증후군, CREST 증후군 또는 포도막염을 포함하나 이에 제한되지 않는 류마티스 질환 작용일 수 있다.
자가면역질환 또는 이상은 표피 괴사융해증, 괴저, 육아종, 심상성천포창, 수포유천포창, 및 낙엽성천포창을 포함하는 자가면역 피부 수포성 질병, 백반증, 포도알균 독성 쇼크 증후군, 경피증, 미만성 및 제한성 전신 경화증을 포함하는 전신 경화증, 아토피 피부염, 또는 스테로이드 의존성 아토피 피부염을 포함하나 이에 제한되지 않는 피부면역질환 작용일 수 있다.
자가면역질환 또는 이상은 봉입체 근염, 괴사성 근막염, 염증성 근병증, 근염, 항-데코린(BJ 항원) 근병증, 부신생물 괴사성 근병증, X-관련 액포형성 근병증, 페니실아민-유도 다발성근염, 죽경화증, 심장동맥병, 또는 심장근증을 포함하나 이에 제한되지 않는 근골격계 면역질환일 수 있다.
자가면역질환 또는 이상은 악성 빈혈, 자가면역성 만성 간염, 원발성 담즙성 경변, 만성소화장애증, 포진상 피부염, 잠복성 간경변증, 반응성 관절염, 크론병, 휘플병, 궤양성 대장염, 또는 경화성 담관염을 포함하나 이에 제한되지 않는 위장관 면역질환 작용일 수 있다.
자가면역질환 또는 이상은 이식편대숙주병, 항체-매개 이식 거부반응, 골수이식 후 거부반응, 백혈병, 종양 형성, 천식, 항-베타 세포 항체들을 가진 제 1 형 당뇨병, 쇼그렌 증후군, 혼합결합조직병, 아디손병, 보크트-고야나기-하라다 증후군, 막증식성 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너육아종증, 현미경적 다발성 동맥염, 처그-스트라우스 증후군, 다발성 동맥염, 또는 다장기 기능부전일 수 있다.
"암"은 제어되지 않은 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는 포유류들의 생리학적 이상을 의미하거나 기술한다. 암의 예들은 암종, 림프종, 폐모세포종, 육종(지방육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피혈관육종, 림프관육종, 림프관 내피혈관육종, 횡문근육종, 섬유육종, 점액육종, 연골육종), 신경내분비 종양, 중피종, 척색종, 활막종, 신경초종, 수막종, 선암, 흑색종, 및 백색종 또는 림프액 성악성 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이런 암들의 더욱 구체적인 예들은 편평세포암(예를 들어, 상피편평세포암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암 및 폐 편평암종, 소세포 폐암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장관암을 포함하는 위암 또는 장암, 췌장암, 신경교아세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 타액선암, 신장암 또는 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 폐암, 항문암, 음경암, 고환암, 식도암, 담도계 종양, 유잉 종양, 기저세포암, 샘암종, 한선암종, 피지샘암, 유두상 암종, 유두상 선암, 낭선암, 수양암종, 기관지원성 암종, 신장세포암, 간종양, 담관암, 융모암, 정소상피종, 배아암종, 윌름즈 종양, 자궁경부암, 고환종양, 폐암, 소세포폐암, 방광암, 상피세포암, 신경교종, 신경교성상세포종, 수아세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경초증, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막아종, 백혈병, 림프종, 다발성골수종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 골수이형성병, 중쇄병, 신경내분비종양, 신경초종 및 다른 암종뿐만 아니라 머리 및 목 암, 성숙에 의한 AML, 분화 없는 AML을 포함하는 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 급성 단핵구성 백혈병과 같은 골수성 종양, 골수 이형성 증후군, 및 만성 골수성 백혈병을 포함하는 만성골수증식질환, 뇌종양(신경아교종, 신경아세포종, 성상세포종, 수아세포종, 상의세포종 및 망막아종), 고체 종양(비인두암, 기저세포암, 췌장암, 담도암, 카포시 육종, 고환암, 자궁암, 질암 또는 자궁경부암, 난소암, 원발성 간암 또는 자궁내막암, 순환계 종양(혈관육종 및 혈관주위세포종))과 같은 중추 신경계 종양, 혈액 종양 및 호지킨 림프종과 같은 종양-유사 이상; 비-호지킨 림프종(버키트 림프종, 소림프구성 림프종/만성 림프성 백혈병, 균상 식육종, 세로 림프종, 소포 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종, 마지날 존 림프종, 모양 세포성 백혈병, 림프형질세포성 백혈병), B-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종, 및 T-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종을 포함하는 림프구 전구체 세포들의 종양, 흉선종, 말초 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종 및 거대 과립 림프구성 백혈병을 포함하는 성숙 T 및 NK 세포들의 종양, 골가용성암 및 골전이를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 대로, "단핵구-유도 세포 매개 질환(MDCMD)가 발생할 위험이 있는" 피험자는 MDCMD가 발생하기 위한 소인, 즉, MDCMD가 발생할 유전적 소인을 갖거나 MDCMD를 일으킬 수 있는 조건들에 노출된 피험자이다. "MDCMD를 가진 것으로 의심되는" 피험자는 하나 이상의 MDCMD 증상을 가진 피험자이다. 상기로부터, "MDCMD가 발생할 위험이 있는" 피험자 또는 "MDCMD를 가진 것으로 의심되는" 피험자가 관심 종들 내의 모든 개인들이 아니라는 것이 명백할 것이다.
상기한 방법들 중 임의의 것에서, MDCMC는 기질에 의해서 발생하는 것일 수 있고 Fc 시약은 MDCMC를 예방 또는 완화하는 역할을 한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1a는 CH3 도메인에 연결된 CH2 도메인에 연결된 힌지 도메인을 가진 IgG1으로부터 고유 Fc 단편 모노머 구조의 개략적 형태를 도시한다; 도 1b는 두 개의 결합된 Fc 단편 모노머들로 형성된 자가응집된, 고유 IgG1 Fc 단편을 도시한다.
도 1c는 CH3 도메인에 연결된 CH2 도메인에 연결된 힌지 도메인을 가진 IgG3으로부터 고유 Fc 단편 모노머 구조의 개략적 형태를 도시한다; 도 1d는 두 개의 결합된 Fc 단편 모노머들로 형성된 자가응집된, 고유 IgG3 Fc 단편을 도시한다.
도 2a 및 2b는 도 1b에 도시된 고유 Fc 단편 구조의 높은 등급 응집체를 도시한다. Fc 단편들은 다이머의 다이머들(즉, 테트라머) 또는 더 높은 등급의 멀티머 응집체로 자연적으로 다중화될 수 있다.
도 3a는 Fc 단편의 힌지에서 Fc 단편에 연결된 고유 Fab 단편을 가진 고유 IgG1 항체를 개략적으로 도시한다; 도 3b는 유사한 IgG3 구조를 도시한다.
도 4a는 시리얼 두 개의 IgG1 Fc 도메인 모노머들로 구성된 스트라도머 모노머를 도시한다; 도 4b는 시리얼 IgG1 Fc-IgG3 Fe-IgE Fc에 연결된 다른 스트라도머 모노머 구조를 도시한다.
도 5a 및 b는 구성요소 Fc 도메인 모노머들의 고유 능력에 의해 시리얼 스트라도머로 자동이합체화하는 도 4a 및 b의 스트라도머 모노머들을 도시한다.
도 6a는 IgG1 Fc - IgG1(힌지 - CH2)를 포함하는 스트라도머 모노머를 도시하고; 도 6b는 IgG1(힌지 - CH2) - IgG3(힌지 - CH2) - IgE(힌지 - CH2) 유도 서열들을 포함하는 스트라도머를 도시한다.
도 7a 및 b는 구성요소 Fc 도메인 모노머들의 고유 능력에 의해 시리얼 스트라도머로 오토다이머화하는 도 6a 및 b의 스트라도머 모노머들을 도시한다.
도 7c는 IgE(힌지) - IgG1 Fc - IgG1(힌지 - CH2) - IgE(CH3)를 포함하는 시리얼 스트라도머를 도시한다. 도 7d는 IgG3Fc - IgG1Fc를 포함하는 시리얼 스트라도머를 도시한다.
도 8a는 두 개의 IgG1 CH2-CH3 유도 Fc 도메인 모노머들을 포함하는 각각의 스트라도머 모노머를 가진 시리얼 스트라도머 구조를 가진 Fab를 포함하는 스트라도바디 구조체를 도시한다; 도 8b는 8a와 같으나 IgE Fc에 연결된 IgG3 Fc에 연결된 IgG1 Fc를 포함하는 스트라도머 구조를 가진 스트라도바디 구조체를 도시한다.
도 9a는 IgG1 Fc - IgG1(힌지 - CH2) 스트라도바디를 도시한다; 도 9b는 IgG1(힌지 - CH2) - IgG3(힌지 - CH2) - IgE(힌지 - CH2)3-스트라도바디를 도시한다.
도 10a는 IgG1(힌지 - CH2) - IgG3 CH3 - IgM CH4 스트라도머 모노머 및 J 사슬 단백질을 도시한다; 도 10b는 IgM CH4 도메인을 통해 J 사슬에 결합되어 형성된 도 10a의 스트라도머의 파이브머(fivmer)를 기초로 한 코어 스트라도머를 도시한다.
도 10c는 IgG1 Fc - IgG1 Fc - IgM CH4 스트라도머 모노머 및 J 사슬 단백질을 도시한다; 도 10d는 IgM CH4 도메인을 통해 J 사슬에 결합되어 형성된 도 10c의 스트라도머의 파이브머를 기초로 한 코어 스트라도머를 도시한다.
도 11a는 IgG1 Fc - IgG1(힌지 - CH2) 스트라도머 모노머를 도시한다. 도 11b는 도 11a의 스트라도머 모노머가 어떻게 시리얼 스트라도머를 형성하기 위해 자동이합체화하는 지를 증명한다. 도 11c는 도 11a의 동일한 스트라도머 모노머가 어떻게 모노머 Fc 도메인들이 자동이합체가 아닌 다른 스트라도머 모노머 상에 동일하거나 유사한 Fc 도메인 모노머들과 정렬시켜, 자동이합체로서 동일한 스트라도머 모노머로 구성되나 지퍼 효과 구조를 가진 스트라도머를 형성하는지를 증명한다.
도 12a는 IgG3 Fc - IgG1 Fc 스트라도머 모노머를 도시한다. 도 12b는 제 2 IgG3 Fc를 첨가하고 자동이합체화가 가지형 구조의 IgG3 Fc - IgG1 Fc - IgG3 Fc 스트라도머를 형성할 수 있다는 것을 도시한다.
도 13a는 IgE CH2 - IgG1 Fc - IgG1(힌지 - CH2) - IgE CH4 스트라도머 모노머를 도시한다. 도 13b는 도 13a 모노머의 자동이합체를 도시하며 형성된 두 개의 FcγR 결합 부위를 강조한다.
도 14a는 링커에 의해 연결된 두 개의 IgG1 Fc 도메인으로 구성된 스트라도머를 도시한다. 도 14b는 링커에 의해 연결된 두 개의 시리얼 스트라도머로 구성된 스트라도머(구체적으로 각각의 경우 2(IgG1 Fc) 스트라도머)를 도시한다.
도 15a는 인간 IgG1 Fc 단편의 핵산(SEQ ID NO:1) 및 아미노산(SEQ ID NO:2) 서열들을 도시한다. 도 15b는 인간 IgG2 Fc 단편의 핵산(SEQ ID NO:3) 및 아미노산(SEQ ID NO:4) 서열들을 도시한다. 도 15c는 인간 IgG3 Fc 단편의 핵산(SEQ ID NO:5) 및 아미노산(SEQ ID NO:6) 서열들을 도시한다. 도 15d는 인간 IgG4 Fc 단편의 핵산(SEQ ID NO:7) 및 아미노산(SEQ ID NO:8) 서열들을 도시한다.
도 16은 {IgK 신호 서열 - IgG1 Fc 단편 - IgG1 Fc 단편}을 포함하는 구조체의 핵산(SEQ ID NO:17) 및 아미노산(SEQ ID NO:18) 서열들을 도시한다. IgK 신호의 아미노산 서열은 굵게 나타냈다. 제 1 IgG1 Fc 단편의 아미노산 서열은 한 줄로 밑줄을 쳤다. 제 2 IgG1 Fc 단편의 아미노산 서열은 두 줄로 밑줄을 쳤다. 별표로 표시한 세린 및 리신은 Fcγ 수용체 결합을 변화시키도록 돌연변이될 수 있는 아미노산들이다.
도 17은 {제한효소부위-IgK 신호 서열-제한효소부위-IgG1(힌지-CH2-CH3)-제한효소부위-에피토프 태그(V5 and His)-STOP}을 포함하는 구조체의 핵산(SEQ ID NO:19) 및 아미노산(SEQ ID NO:20) 서열들을 도시한다. IgK 신호의 아미노산 서열은 굵게 나타냈다. IgG1 Fc 단편의 아미노산 서열은 한 줄로 밑줄을 쳤다. V5 태그의 아미노산 서열은 단속선으로 밑줄을 쳤다. His 태그의 아미노산 서열은 굵게 밑줄을 쳤다.
도 18은 {제한효소부위-IgK 신호 서열-제한효소부위-IgG1(힌지-CH2-CH3)-XbaI 부위-IgG1(힌지-CH2-CH3)-STOP}을 포함하는 구조체의 핵산(SEQ ID NO:21) 및 아미노산(SEQ ID NO:22) 서열들을 도시한다. IgK 신호의 아미노산 서열은 굵게 나타냈다. 제 1 IgG1 Fc 단편의 아미노산 서열은 한 줄로 밑줄을 쳤다. 제 2 IgG1 Fc 단편의 아미노산 서열은 두 줄로 밑줄을 쳤다.
도 19는 {제한효소부위-IgK 신호 서열-제한효소부위-IgG1(힌지-CH2-CH3)-XbaI 부위-IgG1(힌지-CH2-CH3)-제한효소부위-에피토프 태그(V5 and His)-STOP}을 포함하는 구조체의 핵산(SEQ ID NO:23) 및 아미노산(SEQ ID NO:24) 서열들을 도시한다. IgK 신호의 아미노산 서열은 굵게 나타냈다. 제 1 IgG1 Fc 단편의 아미노산 서열은 한 줄로 밑줄을 쳤다. 제 2 IgG1 Fc 단편의 아미노산 서열은 두 줄로 밑줄을 쳤다. V5 태그의 아미노산 서열은 단속선으로 밑줄을 쳤다. His 태그의 아미노산 서열은 굵게 밑줄을 쳤다.
도 20a는 굵게 나타내고 밑줄을 친 페닐알라닌(F) 다형체를 가진 FcR감마IIIa의 N-말단 신호 서열의 핵산(SEQ ID NO:31) 및 아미노산(SEQ ID NO:32) 서열들을 도시한다. 가변성 핵산을 굵게 나타내고 밑줄을 쳤다. 도 20b는 굵게 나타내고 밑줄을 친 발린(V) 다형체를 가진 FcR감마IIIa의 N-말단 신호 서열의 핵산(SEQ ID NO:33) 및 아미노산(SEQ ID NO:34) 서열들을 도시한다. 가변성 핵산을 굵게 나타내고 밑줄을 쳤다. 두 구조체들은 정제를 위한 C-말단 헥사 His 태그를 포함한다.
도 21은 {제한효소부위-IgK 신호 서열-EcoRV 부위-IgG3(힌지-CH2-CH3)-IgG3(힌지-CH2-CH3)-제한효소부위-에피토프 태그(V5 and His)-STOP}을 포함하는 구조체의 핵산(SEQ ID NO:25) 및 아미노산(SEQ ID NO:26) 서열들을 도시한다. IgK 신호의 아미노산 서열은 굵게 나타냈다. IgG3 Fc 단편의 아미노산 서열은 한 줄로 밑줄을 쳤다. IgG1 Fc 단편의 아미노산 서열은 두 줄로 밑줄을 쳤다. V5 태그의 아미노산 서열은 단속선으로 밑줄을 쳤다. His 태그의 아미노산 서열은 굵게 밑줄을 쳤다.
도 22는 {제한효소부위-IgK 신호 서열-EcoRV 부위-IgE(CH2)-IgG1(힌지-CH2-CH3)-IgG1(힌지-CH2)-IgE(CH4)-STOP}을 포함하는 구조체의 핵산(SEQ ID NO:27) 및 아미노산(SEQ ID NO:28) 서열들을 도시한다. IgK 신호의 아미노산 서열은 굵게 나타냈다. IgE(CH2) 도메인의 아미노산 서열은 한 줄로 밑줄을 쳤다. IgG1(힌지-CH2-CH3) 도메인의 아미노산 서열은 두 줄로 밑줄을 쳤다. IgG1(힌지-CH2) 도메인의 아미노산 서열은 단속선으로 밑줄을 쳤다. IgE(CH4) 도메인의 아미노산 서열은 물결 선으로 밑줄을 쳤다.
도 23a는 Fc 단편을 도시하고 이런 Fc 단편은 두 개의 Fc 단편 모노머로 구성되고 Fc 도메인(단속선 원) 및 Fc 부분 도메인(힌지, CH2 및 CH3로 나타냄)을 더 포함한다는 것을 증명한다. 도 23b는 상호-스트라도머 모노머 결합에 의해 연결되는 두 개의 스트라도머 모노머로 구성된 시리얼 스트라도머의 조성물을 도시한다. 시리얼 스트라도머는 적어도 두 개의 Fc 도메인(단속선 원으로 나타냄)을 포함하고 선택적으로 도메인 결합 부위를 포함할 수 있다. 도 23c는 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하는 코어 스트라도머 단위에 결합된 코어 모이어티를 포함하는 코어 스트라도머의 조성물을 도시한다. 코어 스트라도머 단위는 Fc 단편, 시리얼 스트라도머 또는 클러스터 스트라도머 단위일 수 있다. 도 23d는 다중화된 클러스터 스트라도머 단위를 포함하는 클러스터 스트라도머의 조성물을 나타내고, 이의 각각은 다중화 부위 및 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하는 부위를 가진다. 클러스터 스트라도머 단위는 Fc 단편 또는 시리얼 스트라도머일 수 있다. 일단 다중화되면, 다중화 부위는 클러스터 스트라도머의 헤드를 형성한다. 클러스터 스트라도머의 레그는 클러스터 스트라도머의 다중화된 헤드보다 공간적으로 덜 억제되는 클러스터 스트라도머 단위의 Fc 도메인 부위에 의해 형성된다.
도 24는 표 3에 나타낸 스트라도머의 아미노산 서열들을 도시한다.
도 25는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 Fc 부분 도메인 모노머들(힌지, CH2 및 CH3)에 대한 아미노산 서열들을 도시한다(Kabat, EA, Wu, TT, Perry, HM, Gottesman, KS, and Foeller, C. 1991. Sequences of proteins of immunological interest 5th Ed. US Public Health Services, NIH, Bethesda).
실시예 1 - 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 구조체 설계
인간 IgG1(SEQ ID NO:1)로부터의 Fc 단편 모노머를 암호화하는 서열은 도 17(SEQ ID NO:19)에 도시된 대로, IgG1 모노머 서열 {RestEnzSites-IgK signal-RestEnzSites-IgG1(Hinge-CH2-CH3)-RestEnzSites-epitope tags(V5 and His)- STOP}을 생성하기 위해서 선택된 제한 효소 절단 부위, IgK 신호(이하에서 정의) 및 에피토프 태그를 포함하는 발현 벡터(pCDNA 3.1D/V5 His TOPO Invitrogen) 속에 복제하였다. 구조체는 단백질 생산을 위해 CHO 세포들(CHO-002) 속에 트랜스펙트하였다. 또한, 일반적인 구조들을 가진 여러 스트라도머 구조체들을 설계하였다:
a) {RestEnzSites-IgK signal-RestEnz Sites-IgGl(Hinge-CH2-CH3)-XbaI site IgGl(Hinge-CH2-CH3)- STOP} (SEQ ID NO: 21) (see also Figure 4A and Figure 18);
b) {RestEnzSites-IgK signal-RestEnz Sites-IgGl(Hinge-CH2-CH3)-XbaI site IgG1 (Hinge-CH2-CH3)-RestEnzSites-epitope tags (V5 and His)-STOP} (SEQ ID NO: 23) (see also Figure 19);
c) {RestEnzSites-IgK signal-EcoRV Site-IgG3(Hinge-CH2-CH3)-IgGl(Hinge CH2-CH3)-RestEnzSites-epitope tags(V5 and His)-STOP} (SEQ ID NO.: 25) (see also Figure 21); and
d) {RestEnzSites-IgK signal-EcoRV Site-IgE(CH2)-IgGl(Hinge-CH2-CH3)-IgGl(Hinge-CH2)-IgE(CH4)-STOP} (SEQ ID NO.:27) (see also Figure 22).
IgG1 스트라도머 구조체 a)(SEQ ID NO: 21; 도 18)는 PCR을 사용하여 가공하였다. IgG1(SEQ ID NO:29)의 힌지 서열(5'말단)에 상보적이고 IgG1(3'말단)(SEQ ID NO:30)의 C 말단에 상보적인 프라이머들을 IgG1 힌지-Fc 부위를 증폭하는데 사용하였다. 제한 부위들은 pcDNA 복제 벡터(pCDNA 3.1DN5 His TOPO, Invitrogen) 속에 복제된 제 1 Fc 도메인과 함께 연속해서 제 2 Fc 도메인을 인프레임 복제하도록 프라이머들을 첨가하였다. 이 구조체를 위한 인접 서열들(flanking sequences)을 통해 읽는 것을 막기 위해 정지 코돈을 C 말단 프라이머의 제한 부위 이전에 첨가하였다.
스트라도머 구조체 b)(SEQ ID NO:23, 도 19)는 유사하게 제조하였고 상기한 대로 IgG1 Fc - IgG1 Fc를 포함하나 구조체의 C 말단에 첨가된 두 개의 에피토프 태그를 포함한다. 이런 에피토프 태그들은 단백질의 동정 또는 정제를 위해 사용된다. 이 제 2 구조체에서, 두 개의 에피토프 태그, V5 및 His 태그는 정지 코돈 이전에 프레임 내에 존재한다.
정상적으로 분비되는 단백질들은 단백질의 N 말단에 소수성 신호 서열을 통상적으로 포함한다. 스트라도머 구조체들의 경우, 중국햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포에 의해 분비되는 것과 같이 단백질로부터 제거되는 IgK 신호 서열 METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO:35) 을 사용하였다. 예상된 절단 부위는 신호 부위 절단 예측을 위한 알고리즘을 기초로 하였다(SignalP 3.0).
상기 a) 및 b)와 유사한, IgG1 Fc - IgG1 Fc 구조를 포함한 다른 스트라도머 구조체들은 상기한 대로(에피토프 태그를 갖거나 갖지 않음) 그러나 구조체:IgG1 Fc - IgG3 힌지 - IgG1(CH2 - CH3)에서 IgG3 힌지 도메인을 사용하여 제조하였다.
실시예 2 - 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 설계 및 검사
코팅된 IVIG 및 코팅된 Fc 가 유사한 표현형 변화를 자극한다
살균판의 웰의 벽과 바닥에 코팅될 때 IVIG 및 Fc는 미성숙 DC에 대한 CD1a 및 CD86 레벨에 거의 동일한 변화를 자극하고 CD11c의 상승 제어를 지연한다. ITP에서 DC의 인식된 중요한 역할 때문에, 이런 데이터는 스트라도머들과 같은 IVIG 모방체들의 기능을 평가하기 위한 합리적인 모델을 제공한다. IVIG에 의해 유발된 표현형 변화들은 재조합 Fc에 의해 완전히 반복된다는 사실은 DC에 대한 IVIG의 효과들은 Fc 매개될 가능성이 크다는 것을 주장한다고 결론내렸다.
스트라도머 생성
미성숙 DC에 대한 IVIG의 효과들을 모방하기 위해 4개의 다른 종류의 스트라도머를 제조하였다. 아래 표 3에 나타낸 시리얼 스트라도머들, 클러스터 스트라도머들을 포함하는 클러스터 스트라도머 단위들, 코어 스트라도머들을 포함하는 코어 스트라도머 단위들 및 Fc 단편 스트라도머들은 메모한 곳을 제외하고 각각 생산하였다. 아래 나타낸 인간 구조체들의 각각에 대한 적절한 서열들을 얻기 위해서, cDNA는 인간 PBMC로부터 추출된 전체 RNA로부터 합성하였다. 다른 종들로부터 이런 서열들을 얻기 위해서, RNA는 이런 종들의 조직으로부터 정제되었다. cDNA를 생산하기 위해 랜덤 프리밍(Random priming)을 사용하였다. cDNA는 DNA 단편을 합성하고, 복제하고 서열 분석에 의해 특징화하기 위해 PCR을 사용하여 원하는 단편들을 증폭하는데 사용하였다. 최종 구조체들은 PCR(Horton RM, Hunt HD, Ho SN, Pullen, JK and Pease LR. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77:6168, 1989)에 의한 오버랩 연장에 의해 꿰매 붙이거나 적절한 단편들을 융합하기 위해 존재하는 혼용가능한 제한 부위를 사용하여 생산하였다.
예를 들어, G-007의 복제에서, IgECH4 도메인은 단백질의 3'말단에서 IgG1의 CH2 도메인에 직접 융합하였다. 이것은 IgECH4에 대한 N 말단 아미노산을 가진 IgG1CH2(C 말단)을 위한 오버래핑 서열들을 포함하는 프라이머들을 제조함으로써 성취되었다. 한 경우에, 하이브리드 프라이머는 IgG1 서열들로 5'를 증폭하기 위해 사용되었고 상보적 프라이머는 IgECH4의 C말단으로부터 3' 프라이머로 증폭하기 위해 사용되었다. 이런 두 반응으로부터의 생성물들은 혼합하였고 인접 프라이머들은 융합 단백질을 증폭하기 위해 사용하였다. 서열 분석으로 구조체를 확인하였다.
많은 경우에, 결합될 분자들의 말단에 편리하게 존재하는 제한 부위들을 사용하였다. 제한 부위들이 융합될 때 연결된 서열들의 말단에 탐지가능한 나머지 제한 서열들이 존재한다. 이런 방법은 표 3에 나타낸 구조체들의 대부분에 대해 사용되었다. 표 3에 나타낸 스트라도머들의 아미노산 서열들은 도 24에 제공된다. 서열들의 일부는 단백질들을 정제하는데 효과적인 것으로 당업계에 공지된 His-tags를 가진 것으로 나타난다.
시리얼 스트라도머
N-말단 Hin CH2 CH3 Hin CH2 CH3
G-003 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
G-004 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG
G-007 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgECh4
G-011 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
G-012 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgECh4
G-012 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgECh4
G-014 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
G-016 IgG3 IgG3 IgG3 IgG1 IgG1 IgG1
(x-b)RestEnz
G-017 링커 IgG1 IgG IgGlx-b IgG1 IgG1 IgG1
G-023 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 Ig3H 32/62
G-024 IgG3 IgG3 IgG3 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
G-025 107aa IgG1 IgG1 IgG1
G-026 107aa IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
Fc 단편 스트라도머 및 코어 스트라도머 성분
N-말단 Hin CH2 CH3 Hin CH2 CH3
G-002 IgG1 IgG1 IgG1
G-022 IgG1 IgG1 IgG1 IgG3Hing
클러스터 스트라도머 단위들
N-말단 Hin CH2 CH3 Hin CH2 CH3
G-008 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgMCH3-CH4-TP
G-009 IgG1 IgG1 IgG1 gMCH3-CH4-TPI
G-010 IgECh2 IgG1 IgG1 IgG1
G-018 IgG2 IgG2 IgG2 IgG1 IgG1 IgG1
G-019 IgG2Hing IgG1 IgG1 IgG
G-020 IgG2Hing IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
G-021 IgG2Hing IgG1 IgG1 IgG1
G-027 IgECh2-IgECh2 IgG1 IgG1 IgG1
G-028 ILZ IgG1 IgG1 IgG1
G-029 ILZ-IgECh2 IgG1 IgG1 IgG1
G-030 ILZ IgG2 IgG2 IgG2 IgG1 IgG1 IgG1
G-031 ILZ-IgG2hing IgG1 IgG1 IgG1
G-032 ILZ-ILZ IgG1 IgG1 IgG1
G-033 IgG2Hing-IgECh2 IgG1 IgG1 IgG
G-034 IgG2hing-ILZ IgG2 IgG2 IgG2 IgG1 IgG1 IgG1
G-035 IgG2hing-IgG2hing IgG1 IgG1 IgG1
G-036 IgG2hing-ILZ IgG1 IgG1 IgG1
만들어짐
N-말단 H CH2 CH3 H CH2 CH3 H CH2 CH3
401 IgG1 IgG1 IgG1 IgG3 IgG3 IgG3
402 IgG3 IgG1 IgG1 IgG3 IgG1 IgG1
403 IgG1 IgG3 IgG1 IgG1 IgG3 IgG1
404 IgG3 IgG3 IgG1 IgG3 IgG3 IgG1
406 IgG1 IgG1 없음 IgG3 IgG3 없음
407 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3
408 IgG1 IgG1 IgG1 IgG3 IgG3 IgG3 IgG1 IgG1 IgG1
409 IgG3 IgG3 IgG3 IgG1 IgG1 IgG1 IgG3 IgG3 IgG3
410 IgG3 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG3 IgG1 IgG1
411 IgG3 IgG3 IgG1 IgG3 IgG3 IgG1 IgG3 IgG3 IgG1
412 IgG1 IgG1 IgG4CH4 IgG3 IgG3 IgG4CH4 IgG1 IgG1 IgGCH4
413 IgG1 IgG1 IgG3 IgG3 IgG1 IgG1
414 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
415 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3 IgG3
이런 단백질들은 플라스몬 공명 분석에 의해 재조합 FcγRIIIa에 결합하는 변화된 능력을 가지며 G-010과 같은 특정 화합물들은 2가 항체에서 보인 것과 일치하는 2가 곡선 적합(curve fit)을 가지며 스트라도머는 FcγRIIIa에 대한 다가 결합을 가질 수 있다는 것을 결론내렸다.
스트라도머는 IVIG 의 생물학적 효과를 모방한다
이런 스트라도머들의 생물학적 기능을 평가하였다. ITP를 가진 개인에서 IVIG의 기능성 용도를 모방하기 위해서 표 3의 스트라도머들의 각각의 능력을 측정하기 위해서, 미성숙 수지상 세포(iDC)를 사용하는 인비트로 분석법을 개발하였다. iDC를 표적 세포들로 선택하는 근거는 IVIG로 치료된 생쥐로부터 DC의 선택적 전달이 치료되지 않은 동물에 대한 ITP의 발생에 대한 보호를 전달하는 지를 입증하는 공개된 데이터를 기초로 하였다(Siragam, V. et al. Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fc[gamma] receptors on dendritic cells. Nat Med 12, 688 (2006)). 최초 연구들에서, 판에 고정된 것을 의미하는 코팅된 재조합 Fc(rFc) 및 IVIG의 다양한 활성화의 발현, 성숙 및 IL-4와 GM-CSF의 존재하에서 배양된 인간 CD14+ 세포들에 대한 보조자극 마커에 대한 영향을 평가하였다. 사이토카인에서만 배양된 세포들과 비교해서, 코팅된 IVIG 또는 코팅된 rFc에 노출된 세포들은 CD86 발현의 놀라운 증가 및 CD1a 발현의 하강 제어뿐만 아니라 CD11c 상승 제어에 지연을 입증하였다.
다음으로, 표 3의 스트라도머들은 iDC에 대한 코팅된 IVIG 또는 코팅된 Fc의 상기 효과를 모방하는 지를 측정하였다. 이런 화합물들은 플레이트 웰 벽과 바닥에 코팅될 때 효과: G-002, G-004, G-005, G-014, G-018, 및 G-019를 모방하였다. 이런 화합물들은 플레이트 웰 벽과 바닥에 코팅될 때 효과: G-010, G-011 및 G-012를 모방하지 않았다.
이런 화합물들은 용해될 때 iDC 대한 코팅된 IVIG 또는 코팅된 Fc의 효과: G-002, G-010, G-014, G-018, 및 G-019를 모방하였다. 이런 화합물들은 용해될 때 효과: G-004, G-005, G-011 및 G-012를 모방하지 않았다.
코팅된 IVIG에 대한 iDC의 노출이 염증-전 자극에 대한 후속 반응들에 영향을 미칠지를 검사할 수 있다.
이런 데이터로부터 다음 결론을 얻었다:
i. 조직 배양판에 코팅될 때, 선택된 스트라도머들은 미성숙 DC에 대한 CD86을 상승제어하고 CD1a 발현을 억제하는 코팅된 IVIG의 기능적 능력을 모방한다,
ii. 가용 형태로 저용량으로 투여될 때 선택된 스트라도머들은 iDC에 대한 CD86을 상승제어하고 CD1a 발현을 억제하는 코팅된 IVIG의 기능적 능력을 모방한다,
iii. 특정 스트라도머들은 가용 형태 및 코팅 형태에서 표현형 변화를 유도할 수 있고 G-010과 같은 다른 스트라도머들은 코팅된 형태가 아닌 가용 형태에서 표현형 변화를 유도할 수 있다,
iv. 다른 구조들의 스트라도머들은 G-002로부터 형성된 Fc 단편 스트라도머 및 G-010으로부터 형성된 클러스터 스트라도머에 의해 입증된 대로 면역학적으로 활성일 수 있다,
v. 스트라도머 모노머들의 이중화에 의해 예상보다 큰 구조들이 단백질 분석에서 보이고 이런 멀티머 구조들은 IVIG와 비교해서 생물학적 활성이 일치할 수 있다, 및
vi. 이중화 스트라도머 모노머들로부터 형성된 스트라도머들은 다중 Fcγ 수용체들의 결합과 일치하는 플라스몬 공명에 대한 2가 적합(bivalent fit)을 나타내며 스트라도머들의 멀티머 3차 구조의 존재를 나타낸다.
실시예 3 - 열 결합된 바이오미메틱스는 IVIG 보다 더욱 효능이 있다
스트라도머는 결합된 면역글로불린 및 특히 이런 면역글로불린의 결합된 Fc 단편들의 면역학적으로 활성인 모방체이다. 일부 예들에서, 상기한 바이오미메틱스드의 열 결합은 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다. 상기한 대로 열 결합 바이오미메틱스는 IVIG 같이 효능이 있을 것으로 결론내렸다.
실시예 4 - Fc 단편은 여러 활성들을 나타낸다
Fc 단편은 상기한 실험들에서 양성 대조군으로 사용되었고 여기서 단백질은 코팅되고 플라스틱에 고정되어 코팅된 IVIG를 모방하는 생물학적 행동을 나타낸다. Fc 단편은 리포솜, 비드 또는 알부민과 같은 코어 모이어티들에 부착될 때 코어 스트라도머 단위로서 사용될 수 있다. 또한, CHO-S 세포들을 사용하는 인비트로겐 프리스타일맥스 일시적 트렉스펙션 시스템과 같은 특정 발현 시스템 및 특정 세포 형태에서 배양될 때 Fc 단편은 단백질 분석에서 고등급 멀티머들을 형성하고 플라스몬 공명 이미징에서 2가 결합 패턴을 나타내고 미성숙 DC 분석법에서 코팅된 IVIG과 필적할만한 강한 생물학적 활성을 가용 형태에서 나타낸다는 것을 입증하였다. 따라서 특정한 주의 깊게 제어된 조건하에서, Fc 단편은 Fc 단편 스트라도머를 형성한다는 결론을 내렸다. 이 효과는 당화 변화와 같은 번역-후 변형 때문일 것이다.
실시예 5 - Fc -코팅 비드인 코어 스트라도머는 코팅되지 않은 비드에 비해 식균세포 효능을 변화시킬 수 있다
PBMCs는 피콜 하이페크 밀도 기울기 원심분리(Ficoll Hypaque density gradient centrifugation)를 사용하여 건강한 도너들의 완충 코트로부터 분리한다. 분리 후, PBMCs를 PBS로 2회 세척한다. 그런 후에 CD14+ 세포들을 MACS 분리 컬럼(Miltenyi)을 사용하여 정제한다. 정제된 세포들을 계수하고 800㎍/ml GM-CSF 및 5ng/ml IL-4를 포함하는 2x10^5/ml RPMI 완전 배지에 재현탁한다. 그런 후에 세포들은 살균 6-웰 판인 비-조직 배양액의 웰에 씨드한다. CD14+ 세포들을 비 조직 배양액에 씨딩한 후, 포화량의 Fc 또는 IVIG로 코팅되거나 코팅되지 않은 폴리스티렌 FITC 미세구들(0.52㎛)을 1:1 비율로 세포에 첨가하고 6일 동안 37℃, 5.0% CO2에서 배양하고 FRCS에 의해 미세구들의 식균 작용을 분석한다.
IVIG-코팅 비드 및 Fe-코팅 비드는 코어 스트라도머들로 작용하고 코팅되지 않은 비드에 대한 식균 효능을 변화시킬 수 있다.
실시예 6 - 변화된 Fc γ RIII 결합 친화성을 가진 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 설계
IgG1의 잔기들의 공유된 세트는 모든 FcγRs와 결합하는데 관여한다는 것을 나타내었다. IgG1 분자들에서 다른 잔기들은 FcγRII 및 FcγRIII 모두에 결합하는데 관여한다는 것이 입증되었다. 일부 잔기들은 변화되었을 때 하나 이상의 수용체들의 결합을 억제하였다. 흥미롭게도, S298A/K334A의 특이적 이중 돌연변이는 FcγIIIa의 결합을 증가시키고 FcγIIB에 대한 결합을 감소시켰다. 이런 잔기들은 도 16에 도시된 스트라도머 구조체에 대해 (양 아미노산에 별표를 사용하여) 표시하였다. 따라서 SEQ ID NO:17에 의해 암호화된 구조를 가지나 상응하는 S298A/K334A 돌연변이를 가진 스트라도머 분자를 생성하기 위해 자리 지정 돌연변이유발을 사용하였다.
실시예 7 - 재조합 단백질들의 발현
상기한 조성물들을 생산하는데 사용하기에 적합한 여러 발현 시스템들이 존재한다. 특히 진핵세포-기초 시스템이 핵산 서열들, 또는 이들의 동족 폴리펩타이드, 단백질 및 펩타이드를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 많은 이런 시스템은 상업적으로 광범위하게 사용될 수 있다.
한 바람직한 실시예에서, 기술된 스트라도머들은 표준 프로토콜을 따라 면역글로불린 단백질들의 재조합 생산을 위해 잘 정립된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포들을 사용하여 생산한다. 선택적으로, 예를 들어, 형질전환 동물들은 잘 정립된 형질전환 동물 기술들을 사용하여 동물의 젖 속에 발현시킴으로써 상기한 인간 스트라도머들을 생산하는데 사용될 수 있다. Lonberg N. Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1117-25; Kipriyanov SM, Le Gall F. Generation and production of engineered antibodies. Mol Biotechnol. 2004 Jan;26(1):39-60; Ko K, Koprowski H. Plant biopharming of monoclonal antibodies. Virus Res. 2005 Jul;111(1):93-100 참조.
곤충 세포/바큘로바이러스 시스템은 전문이 참조로 포함된 미국특허 제 5,871,986호, 제 4, 879, 236호에 기술된 이형 핵산 단편의 높은 레벨의 단백질 발현을 생산할 수 있고 INVITROGEN® 및 BACPACKTM BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM FROM CLONTECH®로부터 MAXBAC® 2.0이란 이름으로 구입할 수 있다.
발현 시스템들의 다른 예들은 합성 액디손-유도 수용체를 사용하는 STRATAGENE®'s COMPLETE CONTROLTM 유도가능한 포유류 발현 시스템을 포함한다. 유도가능한 발현 시스템의 다른 예는 전장 CMV 프로모터를 사용하는 유도가능한 포유류 발현 시스템인 T-REXTM(테트라사이클린-제어 발현) 시스템을 가진 INVITROGEN®로부터 구입할 수 있다. INVITROGEN®은 메탄올자화 효모 피치아 메타놀리카에서 재조합 단백질들의 높은 레벨의 생산을 위해 설계된 피치아 메타놀리카 발현 시스템으로 불리는 효모 발현 시스템을 제공한다. 당업자는 이의 암호화된 핵산 서열 또는 이의 동족 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드를 생산하기 위해, 상기한 발현 구조체와 같은 벡터를 어떻게 발현시키는지 알 것이다. Recombinant Gene Expression Protocols By Rocky S. Tuan, Humana Press (1997), ISBN 0896033333; Advanced Technologies for Biopharmaceutical Processing By Roshni L. Dutton, Jeno M. Scharer, Blackwell Publishing (2007), ISBN 0813805171; Recombinant Protein Production With Prokaryotic and Eukaryotic Cells By Otto-Wilhelm Merten, Contributor European Federation of Biotechnology, Section on Microbial Physiology Staff, Springer (2001), ISBN 0792371372 참조.
실시예 8 - 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 발현 및 정제
실시예 1 및 2에 기술된 핵산 구조체들은 자연적으로 Ig를 발현하지 않는 세조주 속으로 트랜스펙트된다. 암호화된 폴리펩타이드는 운송하는 동안 내인성 프로테아제에 의해 세포들에서 제거되거나 당업계에 주지된 기술들에 의해 연속적으로 절단되고 제거될 수 있는 이들의 분비성 리더 서열들 때문에 분비된 단백질들로 발현된다. 이런 분비된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스는 당업계에 주지된 단백질 A 또는 His 태그 크로마토그래피법을 사용하여 정제되고 크기는 환원성 및/또는 비환원성 SDS PAGE(소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)에 의해 변한다.
실시예 9 - 대용량 생산을 위한 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 발현 및 정제
다양한 시스템이 박테리아, 곤충 세포 또는 효모를 포함하는 다량의 특이적 단백질을 생산하는데 사용되는 반면에, 포유류 세포들의 발현은 단백질들의 변화된 당화 때문에 문제들을 최소화할 수 있다. CHO 세포들과 같은 포유류 세포들은 Ig 주쇄에 융합된 다양한 단백질들을 과다생산하기 위해 사용되었다. 구조체에서 Fc 도메인은 단백질 친화성 컬럼 정제를 사용하여 세포 상청액으로부터 연속적인 정제를 허용하는 태그가 된다(Harris, CL, DM Lublin and BP Morgan Efficient generation of monoclonal antibodies for specific protein domains using recombinant immunoglobulin fusion proteins: pitfalls and solutions., J. Immunol. Methods 268:245-258, 2002). 많은 융합 단백질들은 Ig의 불변 부위, 구체적으로 CH2 및 CH3 부분 Fc 도메인 모노머들로 프레임 내에서 직접 복제된다. Ig로 발현되는 인터페론 감마 수용체 세포외 도메인의 발현의 구체적인 예는 기능성 활성을 가진 다량의 단백질을 생산하는데 사용되었다(Fountoulakis, M, C. Mesa, G. Schmid, R. Gentz, M. Manneberg, M. Zulauf, Z. Dembic and G. Garotta, Interferon gamma receptor extracellular domain expressed as IgG fusion protein in Chinese hamster ovary cells: Purification, biochemical, characterization and stoichiometry of binding, J. Biol. Chem.. 270:3958-3964, 1995).
실시예 10 - 변화된 Fc 당화에 의한 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 설계
동일 항체들에 대해 쉴드 등에 의해 기술된 것과 실질적으로 동일한 방법에 의해, 탈푸코실화된 Fc 도메인들은 푸코실을 단백질 탄수화물에 첨가하기 위한 효소 활성이 없는 돌연변이 CHO 세포들에서 제조될 수 있다. 이들은 동일한 분자의 푸코실화된 형태에 비해 더 강한 FcγRIII 결합 친화성을 가진 스트라도머들을 발현하는데 사용된다(Robert L. Shields, et al. Lack of Fucose on Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human Fc RIR and Antibody-dependent Cellular Toxicity. J. Biol. Chem., Jul 2002; 277: 26733 - 26740 (doi:10.1074/jbc.M202069200)).
Fc N-글리칸에서 시알릴화(sialyation)의 변화는 생물학적 활성을 증가시킨다는 것이 입증되었다. Kaneko Y, Nimmerjahn F, Ravetch JV. Science. 2006 Aug 4;313(5787):627-8. 따라서, 변화된 시알릴화를 가진 스트라도머 분자는 동일한 방법들을 사용하여 생산될 수 있다. Li, B., Song, H., Hauser, S., and Wang, L. X. 2006. A Highly Efficient Chemoenzymatic Approach Toward Glycoprotein Synthesis. Org. Lett. 8:30813084; See, also, International Pat. App. No. PCT/US07/70818 참조.
실시예 11 - Fc γ RIIIa (176V/F)다형체의 융합 구조체들
상기한 대로, IVIG의 항염증 활성은 Fc 도메인과 FcγRIIIa 사이의 1차 상호작용에 의존한다. 이런 상호작용들은 FcγRIIIa(176 V/F)의 두 개의 인식된 다형체 변형체를 가진 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 결합 및 분해 상수를 나타내기 위한 (SPR) 기술을 사용하여 효과적으로 정량화될 수 있다. Fc 도메인 모노머 대조군과 스트라도머 구조체들의 결합 친화성과 분해를 정의하기 위해서, FcγRIIIa HIS 태그 융합 단백질들은 위치 176에서 V(SEQ ID NO:33) 및 F(SEQ ID NO:31) 다형체 변형체를 가진 CHO 세포들에서 생산될 것이다(도 20). 이런 서열들은 pCDNA 3.1에 주입될 수 있고 CHO 세포들로 트랜스펙트될 수 있다. 이런 FcγRIIIa 융합 단백질들은 단백질을 정제하기 위한 친화성 Nit' 컬럼을 사용하여 트랜스펙트된 세포들로부터의 상청액으로부터 정제된다. 모든 FcγRIIIa 융합 단백질들은 cDNA 서열화 및 SDS PAGE에 의해 특징화된다.
당업계에서 다양한 다른 프로토콜은 FcγRIIIa를 발현하고 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스와의 상호작용을 특징화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, the materials and methods section of Robert L. Shields, et al. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII, and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR. J. Biol. Chem., Feb 2001; 276: 6591 - 6604 (doi:10.1074/jbc.M009483200) 참조.
실시예 12 - 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스 기능의 인비트로 스크리닝
실시예 1에 제공된 것과 같은 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 기능을 검사하기 위해서, 인비트로 분석법이 매커니즘을 반복하도록 설계되며 이에 의해 고유 Fc 도메인은 염증을 인비보로 감소시키는 것으로 나타난다. hIVIG는 DCs의 성숙을 억제하고 IL-10, IL-12 및 TNF-알파의 분비를 변화시킨다는 것이 최근에 입증되었다(Bayry, J, et al., Inhibition of maturation and function of dendritic cells by intravenous immunoglobulin, Blood 101(2):758-765(2003)). 본 발명의 스트라도머들은 hIVIG와 유사하게 DCs에 대한 효과를 매개한다. 사이토카인 분비 인비트로에서 DC 성숙 및 변화의 억제는 여러 스트라도머 구조체의 생물학적 활성들의 일부를 정의하기 위한 효과적인 수단으로 작용할 수 있다. 상기한 스트라도머 구조체들은 다음 실험 변수들을 사용하여 추가로 증명될 수 있다.
그룹 실험 조건 결과 측정 1(FAGS) 결과 측정 2 ELISA/Elispot
1 없음 CD1a,14,40,80,83,86, HLADR IL-10, IL-12, TNFa, IL-23
2 가용성 IVIG CD1a,14,40,80,83,86, HLADR IL-10, IL-12, TNFa, IL-23
3 고정 WIG CD1a,14,40,80,83,86, HLADR IL-10, IL-12, TNFa, IL-23
4 가용성 Fc CD1a,14,40,80,83,86, HLADR IL-10, IL-12, TNFa, IL-23
5 고정 Fc CD1a,14,40,80,83,86, HLADR IL-10, IL-12, TNFa, IL-23
6 가용성 스트라도머 CD1a,14,40,80,83,86, HLADR IL-10, IL-12, TNFa, IL-23
7 고정 스트라도머 CD1a,14,40,80,83,86, HLADR IL-10, IL-12, TNFa, IL-23
표 4에 나타낸 한 바람직한 인비트로 분석에서, 적절한 결합 친화성을 가진 가용성인 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 인간 DC 표현형에 대한 충격이 측정된다. 가용성 비가교 자연 서열 Fc 도메인 구조체들은 대조군으로 작용할 수 있다. 활성화의 마커(CD80, CD83 및 CD86)뿐만 아니라 FcγRs를 포함하는 DC 표면에 대한 특이적 DC 마커들이 평가된다. Prechtel AT, Turza NM, Theodoridis AA, Steinkasserer A. CD83 knockdown in monocyte-derived DCs by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation. J Immunol. 2007 May 1;178(9):5454-64 참조. 또한, 다중 분석은 본 발명의 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 DC 사이토카인 생산에 대한 충격을 평가하기 위해 사용될 수 있다. Jongbloed, Sarah L., et al. Enumeration and phenotypic analysis of distinct dendritic cell subsets in psoriatic arthritis and rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2006; 8(1): R15 (Published online 2005 December 16. doi: 10.1186Iar1864). 마지막으로, 예상한 대로 단핵구들과 DCs 상호작용을 확인하기 위해서, 대조군 DCs와 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스에 노출된 DCs를 정제된 단핵구들로 배양하고 FcγRIIa 수용체들 및 단핵구들의 활성 상태와 관련된 다른 세포 표면 결정자를 활성화하는 레벨의 변화에 대해 유세포 분석기로 평가한다.
실시예 13 - 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스 기능의 인비보 스크리닝
특발성 혈소판감소성 자반증, 다발성 경화증, 천식 및 염증성 장 질환과 같은 여러 자가면역질환은 인비보 검사를 위한, 정립되고 당업계에 인식된 동물 모델들을 가진다. Wu GF, Laufer TM. The role of dendritic cells in multiple sclerosis. Curr Neurol Neurosci Rep. 2007 May;7(3):245-52; Targan SR, Karp LC. Defects in mucosal immunity leading to ulcerative colitis. Immunol Rev. 2005 Aug;206:296-305. 예를 들어, ITP의 여러 모델은 현재 구입할 수 있다. 예를 들어, Crow AR, et al. IVIG inhibits reticuloendothelial system function and ameliorates murine passive immune thrombocytopenia independent of anti-idiotype reactivity. Br J Haematol. 2001;1 15:679-686 참조. 각각의 특이적 자가면역질환에 대해 적합한 면역시스템을 조절하도록 설계된 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스는 이런 인비보 모델에서 입증될 수 있다. 중요한 것은, 많은 이런 모델에서, hIVIG의 투여는 거짓 양성 생성물 관련 항 염증 효과들을 숨기거나 만드는 효능을 가진 외래 종들(예를 들어, 생쥐) 항-인간 항체 반응을 일으킬 수 있다.
우리는 다음 방법에 따라 특발성 혈소판감소성 자반증의 생쥐 모델을 만들었다: 일련의 꼬리 정맥 칼자국 표시에 의해 C57BL6에서 혈소판 수를 측정하였다. 10㎕의 혈액을 15㎕ 시트르산염 버퍼에서 희석하였다. 그런 후에 HemaVet 950 세포분석기에서 절대 혈소판 수에 대해 샘플들을 분석하였다. ITP 대조군 그룹에 있는 생쥐의 경우, 2일에 시작해서, 매일 오후 BD 바이오사이언스 파밍겐으로부터의 항-혈소판 항체인 2㎍ Rat Anti-Mouse CD41(MWReg30)의 복강내 주사를 제공하여 고갈시켰다. IVIG 전치료 대조군의 생쥐는 매일 아침 i.p. 주사로 2g/kg(40mg/생쥐) 인간 IVIG를 받았고 ITP 대조군과 동일한 양 MWReg30을 받았다. IVIG는 유도된 TIP의 이 모델에서 혈소판 수를 잘 보호한다고 결정했고 이 모델은 혈소판 수 감소로부터의 보호의 상대 등급을 위해 IVIG에 대항해 스트라도머들을 검사하는데 효과적이라는 것는 결론을 내렸다. 스트라도머는 다음과 같이 IVIG에 대한 보호를 평가하기 위해 다양한 농도에서 이 모델에서 평가할 수 있다:
실험 그룹
1) 대조군 - No ITP, No IVIG
2) ITP 대조군 - 2일 시작해서 매일 아침 2㎍ MWReg30
3) IVIG 전치료 그룹 - 매일 아침 40mg IVIG 및 2일 시작해서 매일 아침 2㎍ MWReg30
4) 10^12 Fc 도메인 IV 매일 아침과 동일한 스트라도머
5) 10^11 Fc 도메인 IV 매일 아침과 동일한 스트라도머
6) 10^10 Fc 도메인 IV 매일 아침과 동일한 스트라도머
7) 10^9 Fc 도메인 IV 매일 아침과 동일한 스트라도머
8) 10^8 Fc 도메인 IV 매일 아침과 동일한 스트라도머
9) 10^7 Fc 도메인 IV 매일 아침과 동일한 스트라도머
10) 10^6 Fc 도메인 IV 매일 아침과 동일한 스트라도머
실시예 14 - ITP 를 치료하기 위한 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스 효과의 인비보 증명
ITP의 다른 설치류 모델에서, 정상적인 B 세포 기능이 결핍된 생쥐를 사용하였다. 정상적인 B 세포 기능 결핍은 인간 Fc 단편 또는 Fc 부분 단편을 생쥐에 투여하여 발생할 수 있는 설치류 항-인간 Fc 단편 항체들의 유전자형-항유전자형 효과 및 결과로 얻은 거짓 양성 결과들을 제거하는 역할을 한다. B 세포 결핍은, 예를 들어, 항-B 세포 항체들의 투여를 통해 발생할 수 있거나 성숙한 B 세포가 결핍된 m 사슬-낙 아웃 생쥐(m chain-knock out mouse)(Jackson Labs strain B6.129S2-Igh-6tm1Cgn/J)와 같은 유전학적으로 처리된 생쥐에서 발생한다.
면역결핍 생쥐의 면역시스템은 면역완벽 동물들의 변형되지 않거나 B 세포 결핍 PBMCs로 재구성된다. 이런 동물들은 당업계에서 잘 정의된 기술들을 사용하여 ITP를 모방하도록 항-혈소판 항체들로 연속적으로 처리된다. 동물들은 다음 계획에 따라 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스로 처리된다:
ITP의 치료를 위한 [hIgG1 Fc 도메인 - hIgG1 Fc 도메인](SEQ ID NO:22)면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 인비보 효능.
그룹 동물 # 생쥐를 재구성하기 위해 사용된 PBMC's 치료 결과 측정
1 5 없음 IgG1 Fc 혈소판 수
2 5 없음 IgG1 Fc - IgG1 Fc 스트라도머 혈소판 수
3 5 변형되지 않음 IgG1 Fc 혈소판 수
4 5 변형되지 않음 IgG1 Fc - IgG1 Fc 스트라도머 혈소판 수
5 5 B 세포 결핍 IgG1 Fc 혈소판 수
6 5 B 세포 결핍 IgG1 Fc - IgG1 Fc 스트라도머 혈소판 수
7 5 변형되지 않음 hIVIG 혈소판 수
그룹 1 및 2는 혈소판 파괴에 필수적인 항-혈소판 항체들을 생산하는 B 세포들을 갖지 않기 때문에 항체 주입에 의해 ITP를 발생시키지 않을 것이다. 그룹 3 및 4에서, {hIgG1 Fc - hIgG1 Fc} 스트라도머 폴리펩타이드 및 hIgG1 Fc 모노머 폴리펩타이드는 ITP를 효과적으로 완화시키는데 이는 내인성 설치류 항체들이 hIgG1 Fc 모노머 폴리펩타이드를 가교하는 hIgG1 Fc 도메인 에피토프와 반응하기 때문이다. 반대로, 내인성 설치류 항체들이 없는 경우, {hIgG1 Fc - hIgG1 Fc} 스트라도머 폴리펩타이드(그룹 6)는 미가교-연결 IgG1 Fc 모노머 폴리펩타이드(그룹 5)보다 ITP를 완환시키는데 더욱 효과적이다. 그룹 7은 치료 효과를 위한 양성 대조군으로 작용한다.
실시예 15 - 스트라도머 단백질( SEQ ID NOs : 18 & 22)의 정맥 제제를 사용하여 ITP를 가진 환자들 치료
SEQ ID NO: 17 & 21에 의해 암호화되는 예시적 스트라도머 단백질들을 가진 ITP에 대한 치료 프로토콜은 원발성 혈소판감소성 자반증의 진단과 치료를 위한 혈액학 실용 가이드라인의 미국사회의 집행위원회와 같은 ITP hIVIG 치료를 위한 표준 가이드라인을 따르는 방식으로 사용된다. JN, et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: a practice guideline developed by explicit methods for the American Society of Hematology. Blood. 1996 Jul 1;88(1):3-40; the 2000 guidelines by Italian pediatric hematologists, the 2003 British hematologists guidelines and the 2006 Japanese pediatric hematologists guidelines 참조. 선택적으로, ITP를 위한 스트라도머 IV 프로토콜은 상기 치료 프로토콜 복용량의 약 0.1 내지 약 0.001배의 복용량에 의한 최초 투여 단계를 포함할 수 있다. 최초 낮은 복용량 단계는 스트라도머 투여의 임의의 단기간 친 염증 효과를 최소화하도록 설계되나 장기간 항 염증 효과를 유도하는데 충분하여, 상기한 제 2 단계 표준 복용에 의해 뒤이어 강화되고 유지된다. 이런 선택적 방법에 대한 근거는 스트라도머의 일부 실시예들은 단기간 염증 효과뿐만 아니라 FcγRIIa의 발현의 감소를 통한 장기간 항 염증 효과를 모두 가질 수 있다는 것이다. 최초 낮은 복용량(또는 최초 낮은 복용량들)은 장기간 항 염증 효과를 자극하는 반면 단기간 염증 효과를 최소화하는데 사용될 수 있다.
효과적인 스트라도머 복용량은 일반적으로 약 0.01% 내지 약 15%의 유효 hIVIG 복용량, 더욱 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 3%의 유효 hIVIG 복용량이다. ITP에서 유효 hIVIG 복용량은 매 10-21일에 투여된 약 100mg/kg 내지 약 2그램/Kg이다.
스트라도머 정맥 제제는 FDA 승인 hIVIG 제제들과 실질적으로 동일한 것이나 일부 hIVIG 제제들에 존재하는 안정제들을 뺄 수 있다. 예를 들어, the product insert for Gammagard S/D, distributed by Baxter Healthcare Corporation and approved for ITP therapy by the FDA 참조.
실시예 16 - 코어 스트라도머의 복강내 투여를 사용하여 ITP 를 가진 환자들 치료
리포솜과 같이 코어 모이어티에 고정된 Fc 단편들을 대표하는 예시적 스트라도머 단백질을 가진 ITP에 대한 치료 프로토콜은 약 1% 내지 약 0.001%의 표준 정맥 IVIG 프로토콜 복용량의 복용량으로 복강내 투여에 의해 사용된다. 이런 선택적 방법에 대한 근거는 안정한 제제에서 복강내에 전달된 고정 Fc 단편들로 구성된 코어 스트라도머는 IVIG와 유사하나 실질적으로 낮은 복용량으로 단핵구 유도 효과기 세포들에 영향을 주기 위해 다중 Fc 도메인들을 사용한다는 것이다.
실시예 17 - 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스(스트라도바디들)의 설계
두 개의 스트라도바디들은 제조되고 트랜스펙트되었다. 각각의 스트라도바디의 경우, 암호화 cDNA는 관심 항체를 발현하는 하이브리도 세포주으로부터 제조된 전체 RNA로부터 합성되었다. 하이브리도마 세포줄 만들기는 당업계에 주지되어 있다. 항체 중사슬 및 경사슬 가변 부위를 암호화하는 관심 cDNA의 증폭은 BD SMARTTM RACE 증폭 키트(Clontech CA)에 의해 수행되었다. 여러 다른 방법이 항체들의 가변 부위에 대한 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 cDNA를 생성하는데 사용된다(Sassano, M. et. al., 1994. Nucleic Acids Res. May 11;22(9):1768-9; Jones, S.T., Bendig, M.M., 1991. Biotechnology (NY) Jan: 9(1):88-9.). 스트라도바디들을 생성하기 위해, 중사슬 가변 부위들은 PCR(Hutton and Pease)로 오버랩 연장시켜 붙여서 스트라도머 구조체들에 융합되거나 적절한 단편들을 융합하는 존재하는 혼용가능한 제한 부위를 사용한다. 스트라도바디 단백질들은 CHO-S 세포들에서 발현되고 단백질 A 컬럼 친화성 정제에 의해 세포 상청액으로부터 분리된다. 정제된 스트라도바디들의 관심 항원에 대한 결합은 항원을 발현하는 세포주들을 사용하는 유세포 분석기 결합 연구들에 의해 확인된다.
효과기로서 NK 세포들과 표적으로서 항원 발현 종양세포들 다양한 효과기-대-표적 비율로 사용하는 표준 ADCC 분석은 고 및 저 항원 발현 종양 세포주에 대해 ADCC를 유도하기 위해 스트라도바디 및 동일한 Fab 부위를 공유하는 단클론 항체(Mab)의 효능을 비교하는데 사용된다. 스트라도바디들은 높은 에피토프 발현 세포주에 대한 NK 분석에서 쌍을 이룬 Mab과 유사하나 낮은 에피토프 발현 세포주에 대한 NK 분석에서 쌍을 이룬 Mab보다 우수한 결과를 나타내는 성장에 대해 선택된다.
실시예 18 - 트라스투주맙의 항원-결합 도메인을 포함하는 스트라도바디의 정맥 제제를 사용하는 유방암를 가진 환자들 치료
her2/neu 에피토프에 대한 활성을 가진 판매되는 제품인 트라수투주맙의 Fab이거나 유사한 Fab를 포함하는 예시적 스트라도바디에 의한 유방암의 치료 프로토콜은 유방암 치료에 대한 표준 가이드라인을 따른 방식을 사용한다. Romond, EH et. al. Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer. NEJM. 2005 Oct. 20; 353:1673-1684; Seidman, AD et. al. Weekly Trastuzumab and Paclitaxel Therapy for Metastatic Breast Cancer With Analysis of Efficacy by HER2 Immunophenotype and Gene Amplification. Journal of Clinical Oncology. Vol 19, Issue 10 (May), 2001: 2587- 2595; Vogel, CL et. al. Journal of Clinical Oncology. Vol 20, Issue 3 (February), 2002:719-726 참조.
유효 스트라도바디 복용량은 Fab가 스트라도바디와 동일한 유효 단클론 항체복용량의 약 1% 내지 약 500%, 더욱 바람직하게는 유효 단클론 항체 복용량의 약 50% 내지 약 100%일 것이라고 예상된다. 임상적인 암 치료에서 유효 단클론 항체 복용량은 변한다. Her-2 neu 단클론 항체의 경우 복용량은 일반적으로 매일 7-21일 투여된 약 2mg/kg 내지약 4mg/kg이다.
실시예 19 - 세툭시맙의 항원-결합 도메인을 포함하는 스트라도바디의 정맥 제제를 사용하는 머리 및 목 또는 결장 암을 가진 환자들 치료
EGFR 에피토프에 대한 활성을 가진 판매되는 제품인 세툭시맙의 Fab이거나 유사한 Fab를 포함하는 예시적 스트라도바디에 의한 머리 및 목 및 결장 암의 치료 프로토콜은 머리 및 목 및 결장 암 치료에 대한 표준 가이드라인을 따른 방식을 사용한다고 예상된다. 예를 들어, Robert, F et. al. Phase I Study of Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibody Cetuximab in Combination With Radiation Therapy in Patients With Advanced Head and Neck Cancer. Journal of Clinical Oncology, Vol 19, Issue 13 (July), 2001: 3234-3243; Bonner, JA et. al. Cetuximab prolongs survival in patients with locoregionally advanced squamous cell carcinoma of head and neck: A phase III study of high dose radiation therapy with or without cetuximab. Journal of Clinical Oncology, 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition).Vol 22, No 14S (July 15 Supplement), 2004: 5507; Shin, DM et. al. Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Therapy with C225 and Cisplatin in Patients with Head and Neck Cancer. Clinical Cancer Research Vol. 7, 12041213, May 2001; Cunningham, D et al. Cetuximab Monotherapy and Cetuximab plus Irinotecan in Irinotecan-Refractory Metastatic Colorectal Cancer. NEJM. Volume 351:337-345, 2004 참조.
유효 EGFR/HER1 스트라도바디 복용량은 Fab가 스트라도바디와 동일한 유효 단클론 항체복용량의 약 1% 내지 약 500%, 더욱 바람직하게는 유효 단클론 항체 복용량의 약 50% 내지 약 100%일 것이라고 예상된다. 임상적인 암 치료에서 유효 단클론 항체 복용량은 변한다. EGFR 단클론 항체의 경우 복용량은 일반적으로 매일 7-21일 투여된 약 5mg/kg - 25mg/kg인 약 250 - 400mg/제곱미터이다.
실시예 20. 변화된 당화에 의한 증가된 다중화는 면역학적으로 활성인 바이오미메틱 활성을 증가시킨다
발현된 단백질들의 당화 패턴은 단백질이 발현되는 세포주에 의존한다. 단백질 발현과 정제를 위해 통상적으로 사용된 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포)는 인간 기원이고 내인성 단백질의 단백질 발현에 통상적으로 사용되는 HEK 293 세포들과 다른 당화 패턴을 나타낸다. Fc 단편들 및 클러스터 스트라도머 단위들의 결합 특성들이 당화 패턴에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 증가된 다중화 및 발현된 펩타이드의 증가된 생물학적 활성은 CHO 이외의 세포주 또는 당화 패턴을 Fc 단편들 또는 Fc 도메인-포함 펩타이드 사이의 증가된 결합을 향상시키는 N-글리칸으로 변화시키도록 유전학적으로 처리된 CHO를 포함하는 세포주에서 발현에 의해 성취될 수 있다. 당화 패턴들을 변화시킴으로써 Fc 단편 또는 선택된 클러스터 스트라도머 단위들의 증가된 다중화는 hIVIG의 효과들을 모방하는 면역학적으로 활성인 바이오미메틱스의 능력을 증가시킬 수 있다.
실시예 21. 성숙 DC ( mDC )의 IVIG 또는 rFcF (재조합 Fc 단편)에 대한 노출이 이들의 표현형을 바꾸는가?
본 실험에서 사용될 인간 IgG1로부터의 rFcF 단편들은 표준 재조합 단백질 기술에 의해 생산되었다. 인간 rFcF의 두 사슬은 인간 IgG1 중사슬의 힌지 부위(15 아미노산), CH2 도메인(110 아미노산) 및 CH3 도메인(106 아미노산)으로 각각 이루어진다.
CD14+ 세포들은 Miltenyi MACS 분리 컬럼을 사용하여 건강한 인간 도너의 혈액으로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC)로부터 분리될 수 있다. 세포들은 5일 동안 37℃에서 2 x 105/mL in GMCSF (800 IU/mL) 및 IL-4 (5 ng/mL)의 최종 농도에서 배양한다. 모든 배지는 배양의 3일에 다시 공급한다. 5일에, 리포폴리사카라이드(LPS; 10㎍/ml)를 성숙 DC으로의 성숙을 유도하기 위해 적절한 배지에 첨가한다. 성숙 DCs는 CD16, CD32 또는 CD64의 상당한 레벨을 발현하는 않는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 그런 후에 세포들은 추가로 2일 동안 배양하고 분취액을 2차원 형광 유세포 분석(FFC)에 의해 CD11c, CD80, CD83, CD86, CD1a, 및 CD14 발현에 대해 분석한다. LPS로 배양한 잔존하는 세포들을 24시간 동안 37℃에서 가용성 또는 코팅된 IVIG 또는 인간 rFcF(모두 10㎍/mL)을 가진 웰에 놓고 배양하고 2차원 FFC에 의해 상기 마커들의 발현을 분석한다.
실험 그룹은 다음과 같다:
(1) CD14+ cells; GM-CSF; IL-4; no LPS("7d-LPS")
(2) CD14+ cells: GM-CSF; IL-4; LPS("7d+LPS")
(3) CD14+ cells; GM-CSF; IL-4; LPS; 코팅된 WIG("cIVIG")
(4) CD14+ cells; GM-CSF; IL-4; LPS; 가용성 IVIG("sIVIG")
(5) CD14+ cells; GM-CSF; IL-4; LPS; 코팅된 rFcF("cFc")
(6) CD14+ cells; GM-CSF; IL-4; LPS; 가용성 rFcF("sFc")
(7) CD14+ cells; GM-CSF; IL-4; LPS("대조군")
실시예 22 iDC 의 코팅된 WIG 에 대한 노출이 옵소닌화된 적혈구 세포들을 억제하는가?
CD14+ 세포들은 실시예 21에 기술한 대로 건강한 인간 도너의 인간 PBMC로부터 정제하고 GM-CSF와 IL-4로 이전 실시예에서 나타낸 농도와 코팅된 또는 가용성 IVIG의 존재 또는 부존재하에서 6일 동안 37℃에서 배양한다. 세포들을 수확하고 아이소티오시아네이트(FITC) 컨쥬케이트 항-D 항체로 코팅되지 않거나 코팅된 Rho-양성 인간 적혈구 세포들로 2시간 동안 37℃ 또는 4℃에서 배양한다. 적혈구 세포들로 배양한 후, CD14+ 세포들은 APC-컨쥬케이트 CD1a에 대해 염색된다. 식균작용은 사이드 라이트 스캐터(SSC-A), 포워드 라이트 스캐터(FSC-A), FITC 형광(FITC-A) 및 APC 형광(CD1a)을 측정하는 2차원 FFC에 의해 평가한다.
실시예 23. 코팅된 IVIG 에 대한 노출이 동종이계 혼합 림프구 반응을 자극하는 iDC의 능력을 감소시킨다
CD14+ 세포들은 이전 실시예에 기술한 대로 건강한 인간 도너의 혈액으로부터 분리한다. 그런 후에 코팅된 또는 가용성 IVIG의 존재 또는 부존재하에서 GM-CSF와 IL-4로 6일 동안 37℃에서 배양한다. 모든 시약들의 농도는 상기한 것과 같다. 세포들을 수확하고 다양한 수(웰 당 최대 복용량 2.5 x 104)에서 96웰 미세적정 조직 배양판의 웰 속에 놓는다. CD3+ T 세포들은 CD14+ 세포들이 분리되는 도너와 혼용할 수 없는 HLA인 제 2 인간 도너의 PBMC로부터 정제된다. T 세포들을 96웰 조직 배양판(웰 당 105 T 세포)의 웰의 각각에 첨가한다. 공동 배양 5일 후, 1μCi의 3H-티미딘을 배양 웰들의 각각에 첨가한다. 배양액을 6시간 동안 배양하고 3H-티미딘("cpm")의 혼합은 배양액에서 세포 확산의 정도의 표시로 측정한다. 3개의 다른 iDC 자극제 집단을 검사한다: GM-CSF에 의해 배양되어 발생한 것, GM-CSF, IL-4 및 코팅된 IVIG에 의한 배양에 의해 발생한 것 및 GM-CSF, IL-4 및 가용성 IVIG에 의한 배양에 의해 발생한 것.
실시예 24. iDC 의 코팅된 및 가용성 rFcF 및 IVIG 에 대한 노출의 iDC 및 mDC에 의한 사이토카인 발현에 대한 효과
CD14+ 세포, GM-CSF, 및 IL-4 및 rFcF(코팅되거나 가용성) 또는 IVIG(코팅되거나 가용성)를 포함하는 배양액을 이전 실시예들에서 기술한 조건하에서 준비한다. 세포 표면 마커들의 발현에 대해 세포들을 검사하는 것 대신에, 식균 능력 또는 동종이계 MLRs를 자극하는 능력, 세포에 의한 사이토카인 생산을 측정한다. 코팅된 rFcF는 IVIG와 동일하나 가용성 rFcF와 유사하지 않은 방식으로 세포들에 의한 사이토카인 생산을 조절할 것으로 예상된다. 따라서, 염증 반응을 억제하는 사이토카인(예를 들어, 인터루킨 4, 인터루킨 6 및 인터루킨 12)의 레벨은 세포들을 코팅된 rFcF에 노출시킴으로써 증가할 것이라고 예상된다. 또한, 세포들의 코팅된 rFcF에 대한 노출은 염증 반응을 증가시키는 사이토카인(예를 들어, 인터페론, 인터루킨 23 및 종양 괴사 인자-I)의 세포들에 의한 생산의 레벨을 감소할 것이라고 예상된다.
실시예 25. 재조합 생쥐 Fc 단편들
생쥐 IgG2A로부터의 재조합 Fc 단편들(rFcF)은 표준 클로닝 및 재조합 단백질 발현 기술을 사용하여 생산하였다. 생쥐 rFcF의 두 사슬은 생쥐 IgG2a 중사슬의 힌지 부위(21 아미노산), CH2 도메인(110 아미노산) 및 CH3 도메인(107 아미노산)으로 각각 이루어진다. 생쥐 IgG2a는 플레이트 웰의 벽과 바닥에 코팅될 때 인간 iDC 분석에서 활성을 나타내었다.
비록 본 발명 및 이의 장점이 상세하게 기술되었으나, 다양한 변화, 치환 및 변형이 첨부된 청구항에 정의된 대로 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명의 범위는 명세서에서 개시된 공정, 장치, 제조, 물질의 조성물, 수단 ,방법, 및 단계의 특정 실시예에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 본 발명에 개시된 상응하는 실시예들과 실질적으로 같은 기능을 나타내거나 실질적으로 같은 결과를 얻는 현재 존재하거나 나중에 개발될 수 있는 공정, 장치, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법, 또는 단계를 본 발명의 상세한 설명으로부터 쉽게 알 것이다. 따라서, 첨부된 청구항은 공정, 장치, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법, 또는 단계를 범위 내에 포함한다. 본 발명에서 언급하건 인용한 모든 미국 및 외국 특허, 특허출원공보, 및 비특허 문헌(요약서, 과학 저널 기사, 책, 제품 문헌 및 매뉴얼을 포함하나 이에 제한되지 않음)은 전문이 참조로 본 발명에 포함된다.
1. 둘 이상의 결합된 스트라도머 모노머들을 포함하고, 상기 스트라도머 모노머들의 각각은 둘 이상의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, 둘 이상의 스트라도머 모노머들의 결합은 둘 이상의 Fc 도메인들을 형성하고 시리얼 스트라도머는 둘 이상의 Fc 도메인들의 첫 번째를 통해 제 1 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하고 둘 이상의 Fc 도메인들의 두 번째를 통해 제 2 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 분리된 시리얼 스트라도머.
2. 제 1 항에 있어서, 둘 이상의 스트라도머 모노머들은 공유결합, 이황화 결합 또는 화학적 가교를 통해 결합하는 분리된 시리얼 스트라도머.
3. 제 1 항에 있어서, 분리된 시리얼 스트라도머는 두 개의 결합된 스트라도머 모노머를 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
4. 제 1 항에 있어서, 분리된 시리얼 스트라도머들은 두 개의 결합된 스트라도머 모노머들을 포함하고, 상기 스트라도머 모노머들의 모두는 두 개의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, 두 개의 스트라도머 모노머들의 결합은 두 개의 Fc 도메인들을 형성하는 분리된 시리얼 스트라도머.
5. 제 4 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
6. 제 4 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 독립적으로 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
7. 제 4 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
8. 제 4 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
9. 제 4 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
10. 제 4 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지 및 IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
11. 제 4 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
12. 제 4 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
13. 제 4 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG3 힌지, IgG3 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
14. 제 4 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
15. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체들은 각각 독립적으로 Fcγ 수용체 I, Fcγ 수용체 II, Fcγ 수용체 III 또는 Fcγ 수용체 IV인 분리된 시리얼 스트라도머.
16. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체는 각각 Fcγ 수용체 IIIa인 분리된 시리얼 스트라도머.
17. 제 1 항에 있어서, 둘 이상의 Fc 도메인은 각각 동일한 면역글로불린 Fc 종류이고, 상기 면역글로불린 Fc 종류는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분리된 시리얼 스트라도머.
18. 제 1 항에 있어서, 둘 이상의 Fc 도메인은 각각 다른 면역글로불린 Fc 종류이고, 상기 면역글로불린 Fc 종류는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분리된 시리얼 스트라도머.
19. 두 개의 결합된 스트라도머 모노머들을 포함하고, 상기 스트라도머 모노머들의 각각은 두 개의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, 두 개의 스트라도머 모노머들의 결합은 두 개의 Fc 도메인들을 형성하고, 상기 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 독립적으로 포함하고, 시리얼 스트라도머는 두 개의 Fc 도메인들의 첫 번째를 통해 제 1 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하고 두 개의 Fc 도메인들의 두 번째를 통해 제 2 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 분리된 시리얼 스트라도머.
20. 제 19 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인은 각각 동일한 면역글로불린 Fc 종류이고, 상기 면역글로불린 Fc 종류는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분리된 시리얼 스트라도머.
21. 제 19 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인은 각각 다른 면역글로불린 Fc 종류이고, 상기 면역글로불린 Fc 종류는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분리된 시리얼 스트라도머.
22. 제 19 항에 있어서, Fc 도메인들 중 적어도 하나는 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
23. 제 19 항에 있어서, Fc 도메인들의 각각은 독립적으로 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
24. 제 19 항에 있어서, Fc 도메인들 중 적어도 하나는 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
25. 제 19 항에 있어서, Fc 도메인들의 각각은 독립적으로 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
26. 제 19 항에 있어서, Fc 도메인들 중 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
27. 제 19 항에 있어서, Fc 도메인들의 각각은 독립적으로 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
28. 제 19 항에 있어서, Fc 도메인들의 각각은 독립적으로 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
29. 제 19 항에 있어서, Fc 도메인들의 각각은 독립적으로 IgG3 힌지, IgG3 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
30. 제 19 항에 있어서, Fc 도메인들의 각각은 독립적으로 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 포함하는 분리된 시리얼 스트라도머.
31. 제 19 항에 있어서, Fab 도메인을 더 포함하고, 스트라도머 모노머들의 각각은 Fab 단편 중사슬 및 두 개의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, Fab 단편 중사슬은 두 개의 Fc 도메인 모노머들에 대해 아미노 말단 또는 카복시 말단에 위치하고, Fab 단편 경사슬은 각각의 Fab 단편 중사슬과 독립적으로 결합되고 Fab 도메인은 항원-결합 활성을 가진 분리된 시리얼 스트라도머.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 스트라도머 모노머들의 각각은 면역글로불린 힌지 모노머를 더 포함하고, 면역글로불린 힌지 모노머는 Fab 단편 중사슬과 두 개의 Fc 도메인 모노머들 사이에 위치하는 분리된 시리얼 스트라도머.
33. 둘 이상의 코어 스트라도머 단위에 연결된 코어 모이어티를 포함하고, 상기 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 각각은 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하고 코어 스트라도머 단위들의 각각은 다음을 포함하는 그룹으로부터 독립적으로 선택되고:
(a) Fc 단편, 여기서 Fc 단편은 두 개의 결합된 Fc 단편 모노머들을 포함하고, 상기 Fc 단편 모노머들의 각각은 Fc 도메인 모노머를 포함하고, 두 개의 Fc 단편 모노머들의 결합은 Fc 도메인을 형성하고,
(b) Fc 부분 단편, 여기서 Fc 부분 단편은 두 개의 결합된 Fc 부분 단편 모노머들을 포함하고, 상기 Fc 부분 단편 모노머들의 각각은 Fc 도메인 모노머를 포함하고, 두 개의 Fc 부분 단편 모노머들의 결합은 Fc 도메인을 형성하고,
(c) Fc 도메인, 여기서 Fc 도메인은 두 개의 결합된 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, 두 개의 Fc 도메인 모노머들의 결합은 Fc 도메인을 형성하고,
(d) 시리얼 스트라도머, 여기서 시리얼 스트라도머는 둘 이상의 결합된 스트라도머 모노머들을 포함하고, 상기 스트라도머 모노머들의 각각은 둘 이상의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고 둘 이상의 스트라도머 모노머들의 결합은 둘 이상의 Fc 도메인을 형성하고,
(e) 클러스터 스트라도머, 여기서 상기 클러스터 스트라도머는 둘 이상의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위를 포함하고, 상기 클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 다중화 부위 및 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하고, 상기 클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 두 개의 결합된 클러스터 스트라도머 단위 모노머들을 포함하고, 상기 클러스터 스트라도머 단위 모노머들의 각각은 다중화 부위 모노머 및 적어도 하나의 Fc 도메인 모노머를 포함하고, 두 개의 클러스터 스트라도머 단위 모노머들의 결합은 다중화 부위과 적어도 하나의 Fc 도메인을 형성하고 둘 이상의 클러스터 스트라도머 단위들의 다중화 부위는 클러스터 스트라도머를 형성하기 위해 다중화되고, 상기 코어 스트라도머는 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 첫 번째를 통해 제 1 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하고 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 두 번째를 통해 제 2 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 코어 스트라도머.
34. 제 33 항에 있어서, 코어 모이어티는 면역글로불린 J 사슬, 알부민, 리포솜, 비드, 펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 코어 스트라도머.
35. 제 33 항에 있어서, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들은 각각 독립적으로 Fc 단편인 코어 스트라도머.
36. 제 33 항에 있어서, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들은 각각 독립적으로 시리얼 스트라도머인 코어 스트라도머.
37. 제 33 항에 있어서, 코어 스트라도머는 두 개의 코어 스트라도머 단위들을 포함하고, 두 개의 코어 스트라도머 단위들의 각각은 독립적으로 시리얼 스트라도머이고, 시리얼 스트라도머는 두 개의 결합된 스트라도머 모노머들을 포함하고, 상기 스트라도머 모노머들 모두는 두 개의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, 두 개의 스트라도머 모노머들의 결합은 두 개의 Fc 도메인을 형성하는 코어 스트라도머.
38. 제 33 항에 있어서, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인, 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 포함하는 코어 스트라도머.
39. 제 33 항에 있어서, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지 및 IgG1 CH2 도메인을 포함하는 코어 스트라도머.
40. 제 33 항에 있어서, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 코어 스트로머.
41. 제 33 항에 있어서, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 포함하는 코어 스트로머.
42. 제 33 항에 있어서, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 독립적으로 포함하는 코어 스트로머.
43. 제 33 항에 있어서, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 각각은 IgG3 힌지, IgG3 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 코어 스트로머.
44. 제 33 항에 있어서, 둘 이상의 코어 스트라도머 단위들의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 코어 스트라도머.
45. 제 33 항에 있어서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체들은 독립적으로 Fcγ 수용체 I, Fcγ 수용체 II, Fcγ 수용체 III 또는 Fcγ 수용체 IV인 코어 스트라도머.
46. 제 33 항에 있어서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체는 각각 Fcγ 수용체 IIIa인 코어 스트라도머.
47. 둘 이상의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하고, 상기 클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 다중화 부위 및 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하고, 상기 클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 두 개의 결합된 클러스터 스트라도머 단위 모노머들을 포함하고, 상기 클러스터 스트라도머 단위 모노머들의 각각은 다중화 부위 모노머 및 적어도 하나의 Fc 도메인 모노머를 포함하고, 두 개의 클러스터 스트라도머 단위 모노머들의 결합은 다중화 부위과 적어도 하나의 Fc 도메인을 형성하고, 둘 이상의 클러스터 스트라도머 단위들의 다중화 부위는 클러스터 스트라도머를 형성하기 위해 다중화되고, 클러스터 스트라도머는 첫 번째 Fc 도메인을 통해 제 1 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하고 두 번째 Fc 도메인을 통해 제 2 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 클러스터 스트라도머.
48. 제 47 항에 있어서, 다중화 부위는 IgG2 힌지, IgE CH2 도메인, 루신, 아이소루신 지퍼 및 아연 핑거로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 클러스터 스트라도머.
49. 제 47 항에 있어서, 클러스터 스트라도머는 두 개의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하는 클러스터 스트라도머.
50. 제 47 항에 있어서, 클러스터 스트라도머는 세 개의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하는 클러스터 스트라도머.
51. 제 47 항에 있어서, 클러스터 스트라도머는 네 개의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하는 클러스터 스트라도머.
52. 제 47 항에 있어서, 클러스터 스트라도머는 다섯 개의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하는 클러스터 스트라도머.
53. 제 47 항에 있어서, Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인, IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 포함하는 클러스터 스트라도머.
54. 제 47 항에 있어서, Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인, 및 IgG1 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 클러스터 스트라도머.
55. 제 47 항에 있어서, Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 포함하는 클러스터 스트라도머.
56. 제 47 항에 있어서, Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지 및 IgG CH2 도메인을 독립적으로 포함하는 클러스터 스트라도머.
57. 제 47 항에 있어서, Fc 도메인들의 각각은 IgG3 힌지, IgG3 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 클러스터 스트라도머.
58. 제 47 항에 있어서, Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인, 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 클러스터 스트라도머.
59. 제 47 항에 있어서, Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 클러스터 스트라도머.
60. 제 47 항에 있어서, 클러스터 스트라도머 단위들의 적어도 하나는 둘 이상의 Fc 도메인을 포함하는 클러스터 스트라도머.
61. 제 47 항에 있어서, 클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 둘 이상의 Fc 도메인들을 포함하는 클러스터 스트라도머.
62. 제 47 항에 있어서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체들은 독립적으로 Fcγ 수용체 I, Fcγ 수용체 II, Fcγ 수용체 III 또는 Fcγ 수용체 IV인 클러스터 스트라도머.
63. 제 47 항에 있어서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체는 각각 Fcγ 수용체 IIIa인 클러스터 스트라도머.
64. 둘 이상의 결합된 스트라도머 모노머들과 Fab 도메인을 포함하고, 스트라도머 모노머들의 각각은 Fab 단편 중사슬 및 둘 이상의 Fc 도메인 모노머들을 포함하고, Fab 단편 중사슬은 둘 이상의 Fc 도메인 모노머들에 대해 아미노 말단 또는 카복시 말단에 위치하고, 둘 이상의 스트라도머 모노머들의 결합은 둘 이상의 Fc 도메인들 형성하고, Fab 단편 경사슬은 각각의 스트라도머 모노머의 Fab 단편 중사슬과 독립적으로 결합되고, Fab 도메인은 항원-결합 활성을 가지며, 스트라도바디는 둘 이상의 Fc 도메인들의 첫 번째를 통해 제 1 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하고 둘 이상의 Fc 도메인들의 두 번째를 통해 제 2 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 스트라도바디.
65. 제 64 항에 있어서, 둘 이상의 스트라도머 모노머들은 공유 결합, 이황화 결합 또는 화학적 가교를 통해 결합되는 스트라도바디.
66. 제 64 항에 있어서, 상기 스트라도머 모노머들의 각각은 면역글로불린 힌지 모노머를 더 포함할 수 있고, 면역글로불린 힌지 모노머는 Fab 단편 중사슬과 두 개의 Fc 도메인 모노머들 사이에 위치하는 스트라도바디.
67. 제 64 항에 있어서, 스트라도바디는 두 개의 결합된 스트라도머 모노머들을 포함하고, 상기 스트라도머 모노머들의 각각은 Fab 단편 중사슬과 두 개의 도메인 모노머들을 포함하고, 두 개의 스트라도머 모노머들의 결합은 Fc 도메인들을 형성하는 스트라도바디.
68. 제 67 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함하는 스트라도바디.
69. 제 67 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 스트라도바디.
70. 제 67 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG 힌지 및 IgG CH3 도메인을 포함하는 스트라도바디.
71. 제 67 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG 힌지 및 IgG CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 스트라도바디.
72. 제 67 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 포함하는 스트라도바디.
73. 제 67 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지, IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 스트라도바디.
74. 제 67 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 스트라도바디.
75. 제 67 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG3 힌지, IgG3 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 스트라도바디.
76. 제 67 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 각각은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG3 CH3 도메인을 독립적으로 포함하는 스트라도바디.
77. 제 67 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지 및 IgG1 CH2 도메인 또는 IgG3 CH2 도메인을 포함하는 스트라도바디.
78. 제 67 항에 있어서, 두 개의 Fc 도메인들의 적어도 하나는 IgG1 힌지 또는 IgG3 힌지 및 IgG1 CH2 도메인을 포함하는 스트라도바디.
79. 제 64 항에 있어서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체들은 독립적으로 Fcγ 수용체 I, Fcγ 수용체 II, Fcγ 수용체 III 또는 Fcγ 수용체 IV인 스트라도바디.
80. 제 64 항에 있어서, 제 1 및 제 2 Fcγ 수용체는 각각 Fcγ 수용체 IIIa인 스트라도바디.
81. 제 1 항의 치료적 유효량의 시리얼 스트라도머 및 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 면역반응을 변화시키는 방법.
82. 제 33 항의 치료적 유효량의 코어 스트라도머 및 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 면역반응을 변화시키는 방법.
83. 제 47 항의 치료적 유효량의 클러스터 스트라도머 및 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 면역반응을 변화시키는 방법.
84. 제 64 항의 치료적 유효량의 스트라도바디 및 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 면역반응을 변화시키는 방법.
85. 제 81 항에 있어서, 약학적 조성물은 시리얼 스트라도머 및 운반체 또는 희석제의 치료적 유효량의 이종 혼합물을 포함하는 방법.
86. 제 82 항에 있어서, 약학적 조성물은 코어 스트라도머 및 운반체 또는 희석제의 치료적 유효량의 이종 혼합물을 포함하는 방법.
87. 제 83 항에 있어서, 약학적 조성물은 클러스터 스트라도머 및 운반체 또는 희석제의 치료적 유효량의 이종 혼합물을 포함하는 방법.
88. 제 84 항에 있어서, 약학적 조성물은 스트라도바디들 및 운반체 또는 희석제의 치료적 유효량의 이종 혼합물을 포함하는 방법.
89. (a) 면역 시스템의 세포들의 균질 집단과 후보 항체를 접촉시키는 단계, (b) (a)의 세포들의 집단의 활성을 측정하는 단계, (c) (a)와 동일한 세포 타입 형태의 세포들의 균질 집단과 제 1 항의 시리얼 스트라도머를 접촉시키는 단계, (d) (c)의 세포들의 집단의 활성을 측정하는 단계 및 (e) (b)에서 측정한 활성을 (d)에서 측정된 활성과 비교하여, 면역 시스템의 세포에 대한 특이적 활성에 대한 항체를 스크리닝하는 단계를 포함하여 면역시스템이 세포에 대한 특이적 활성에 대해 항체를 스크리닝하는 방법.
90. 제 89 항에 있어서, 후보 항체 및 시리얼 스트라도머는 종들이 일치하고 아이소타이프 일치하는 방법.
91. 제 89 항에 있어서, (e)에서의 비교는 (d)에서 측정한 활성 대 (b)에서 측정한 활성의 비율인 방법.
92. Fc 시약이 부착된 기질을 포함하는 조성물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하여 단핵구 유도 세포(MDC)의 활성을 억제하는 방법.
93. 제 92 항에 있어서, 접촉은 인비트로, 인비보 또는 엑스비보인 방법.
94. 제 92 항에 있어서, 세포는 동일 속에 있는 방법.
95. 제 94 항에 있어서, 동물은 단핵구 유도 세포 매개 이상(MDCMC)을 갖거나 진행시킬 위험을 갖는 방법.
96. 제 92 항 내지 제 95 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 수지상 세포인 방법.
97. 제 92 항 내지 제 95 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 대식세포인 방법.
98. 제 92 항 내지 제 95 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 파골세포인 방법.
99. Fc 시약이 부착된 기질을 포함하는 조성물을 단핵구 유도 세포 매개 이상(MDCMC)을 갖거나 진행시킬 위험을 갖는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
100. 제 94 항 또는 제 99 항에 있어서, 동물은 인간인 방법.
101. 제 92 항 내지 제 100 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 시약은 인간 Fc 단편의 기능성 부분을 포함하는 방법.
102. 제 101 항에 있어서, 인간 Fc 단편은 IgG1 Fc 단편인 방법.
103. 제 101 항에 있어서, 인간 Fc 단편은 IgG3 Fc 단편인 방법.
104. 제 101 항에 있어서, 인간 Fc 단편은 IgG2 또는 IgG4 Fc 단편인 방법.
105. 제 92 항 내지 제 104 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 시약은 IgG 분자를 포함하는 방법.
106. 제 92 항 내지 제 100 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 시약은 비인간 Fc 단편의 기능성 부분을 포함하는 방법.
107. 제 92 항 내지 제 106 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 합성 폴리머를 포함하는 방법.
108. 제 107 항에 있어서, 합성 폴리머는 나일론, 테프론, 다크론, 폴리바이닐 클로라이드, PEU(폴리(에스터 우레탄)), PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 및 PMMA(메틸메타크릴레이트)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
109. 제 92 항 내지 제 107 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 금속 또는 금속 합금을 포함하는 방법.
110. 제 109 항에 있어서, 금속 또는 금속 합금은 스테인리스 강, 백금, 이리듐, 티타늄, 탄탈륨, 니켈-티타늄 합금 또는 코발트-크롬 합금으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
111. 제 92 항 내지 제 110 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 동물 조직 또는 동물 조직 생성물을 포함하는 방법.
112. 제 111 항에 있어서, 동물 조직은 조직 또는 기관 이식물인 방법.
113. 제 111 항 또는 제 112 항에 있어서, 동물 조직은 뼈(예를 들어, 골형성 뼈) 또는 연골인 방법.
114. 제 92 항 내지 제 113 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 단백질을 포함하는 방법.
115. 제 92 항 내지 제 114 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 콜라겐을 포함하는 방법.
116. 제 92 항 내지 제 115 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 케라틴을 포함하는 방법.
117. 제 92 항 내지 제 116 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 조직 매트릭스를 포함하는 방법.
118. 제 117 항에 있어서, 조직 매트릭스는 무세포 조직 매트릭스인 방법.
119. 제 92 항 내지 제 118 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 동물 세포(예를 들어, 섬유아세포 또는 간엽 줄기세포와 같은 조직 치료 세포)을 포함하는 방법.
120. 제 92 항 내지 제 119 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 모방 이식 플러그인 방법.
121. 제 92 항 내지 제 120 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 폴리사카라이드를 포함하는 방법.
122. 제 92 항 내지 제 121 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 아가로스를 포함하는 방법.
123. 제 92 항 내지 제 122 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 염을 포함하는 방법.
124. 제 92 항 내지 제 123 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 황산 칼슘을 포함하는 방법.
125. 제 92 항 내지 제 124 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 겔 또는 크림을 포함하는 방법.
126. 제 92 항 내지 제 124 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 실리콘을 포함하는 방법.
127. 제 92 항 내지 제 126 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 사일스틱을 포함하는 방법.
128. 제 92 항 내지 제 127 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 천연 섬유를 포함하는 방법.
129. 제 128 항에 있어서, 자연 섬유는 실크, 목화 또는 양모를 포함하는 방법.
130. 제 92 항 내지 제 129 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 이식가능한 의료 장치인 방법.
131. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 스텐트(예를 들어, 관상동맥 스텐트와 같은 혈관 스텐트; 기관내 또는 비강 스텐트와 같은 공기통로 스텐트; 담즙 또는 췌장 스텐트와 같은 위장관 스텐트; 또는 요도 스텐트와 같은 비뇨기 스텐트)인 방법.
132. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 외과 봉합사(예를 들어, 견제 봉합사, 크로믹 겉(chromic gut), 나일론, 플라스틱 또는 금속 봉합사 또는 외과용 클립(예를 들어, 동맥류 클립)인 방법.
133. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 인공 엉덩이, 인공 엉덩이 조인트, 인공 무릎, 인공 무릎 조인트, 인공 어깨, 인공 어깨 조인트, 인공 손가락 또는 발가락 조인트, 골판, 뼈 합정, 뼈 불유합 임플란트, 추간판 임플란트, 골 시멘트, 또는 골 시멘트 스페이서인 방법.
134. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 동정맥루(arterial-venous shunt)인 방법.
135. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 이식형 와이어인 방법.
136. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 페이스메이커, 인공심장, 심장 지원 장치, 인공귀, 이식형 제세동기, 척수 자극기, 중추신경계 자극기, 말초신경 임플란트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
137. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 치과 보철물 또는 덴탈 크라운인 방법.
138. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 대형 혈관색전발생장치 또는 케이지(vessel embolic filtering device or cage)인 방법.
139. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 경피적 장치인 방법.
140. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 피부 또는 점막하 패치인 방법.
141. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 이식형 약물전달장치인 방법.
142. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 대형 혈관 이식물이고, 혈관은, 예를 들어, 경동맥, 대퇴동맥, 대동맥인 방법.
143. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 피하 임플란트인 방법.
144. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 각막 임플란트, 안내 렌즈 또는 컨택트 렌즈인 방법.
145. 제 92 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 시트, 비트, 메시, 분말 입자, 실, 비드 또는 섬유인 방법.
146. 제 92 항 내지 제 145 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 고체, 반고체 또는 젤라틴 물질을 포함하는 방법.
147. 제 92 항 내지 제 146 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 지방-가용성 지질을 포함하는 방법.
148. 제 92 항 내지 제 147 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 리포솜을 포함하는 방법.
149. 제 95 항 내지 제 148 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 염증성 이상, 자가면역질환, 암, 골밀도 질환, 급성 감염 또는 만성 감염인 방법.
150. 제 95 항 내지 제 149 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 혈액면역학적 작용인 방법.
151. 제 95 항 내지 제 150 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 특발성 혈소판감소성 자반증, 동종면역/자가면역 혈소판감소증, 후전성 면역 혈소판감소증, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 파르보바이러스 B 19-연관 적혈구무형성증, 후천성 항인자 VIII 자가면역, 후천성 폰빌레브란드병, 다발성 골수종 및 단클론감마글로불린병증, 패혈증, 재생불량빈혈, 진정 적혈구무형성증, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 신생아 용혈성 질환, 면역-매개 호중구감소증, 혈소판수혈불응화, 수혈후 자반증, 용혈성 요독 증후군, 전신성 맥관염, 혈전성 혈소판감소성 자반증 또는 이반 증후군인 방법.
152. 제 95 항 내지 제 150 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 신경면역학적 작용인 방법
153. 제 95 항 내지 제 150 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 길란바레 증후군, 만성염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 중증근무력증, 다초점운동신경병증, 항-GM1 항체 관련 하위운동신경원증후군, 탈수초신경병증, 다발성 경화증 및 시신경염, 근강직 증후군, 항-Yo항체를 가진 부신생물 소뇌퇴행증, 신생물딸림뇌척수염, 항-Hu 항체를 가진 감각신경병증, 간질, 뇌염, 척수염, 인간 T-세포 림프종 바이러스-1 관련 척수증, 자가면역 당뇨성 신경병증 또는 급성 특발성 자율신경 신경병증인 방법.
154. 제 94 항 내지 제 149 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 류마티스 질환 작용인 방법.
155. 제 95 항 내지 제 149 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 가와사키병, 류마티스 관절염, 펠티증후군, ANCA 양성 혈관염, 자발 다발성근염, 피부근염, 항인지질 증후군, 자궁견관무력증, 전신홍반성루프스, 유아 특발성 관절염, 레이노 증후군, CREST 증후군 또는 포도막염인 방법.
156. 제 95 항 내지 제 149 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 피부면역질환 작용인 방법.
157. 제 95 항 내지 제 149 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 표피 괴사융해증, 괴저, 육아종, 심상성천포창, 수포유천포창, 및 낙엽성천포창을 포함하는 자가면역 피부 수포성 질병, 백반증, 포도알균 독성 쇼크 증후군, 경피증, 미만성 및 제한성 전신 경화증을 포함하는 전신 경화증, 아토피 피부염, 또는 스테로이드 의존성 아토피 피부염인 방법.
158. 제 95 항 내지 제 149 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 근골격계 면역질환 작용인 방법.
159. 제 95 항 내지 제 149 항 또는 제 158 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 봉입체 근염, 괴사성 근막염, 염증성 근병증, 근염, 항-데코린(BJ 항원) 근병증, 부신생물 괴사성 근병증, X-관련 액포형성 근병증, 페니실아민-유도 다발성근염, 죽경화증, 심장동맥병, 또는 심장근증인 방법.
160. 제 95 항 내지 제 149 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 위장관 면역질환 작용인 방법.
161. 제 95 항 내지 제 149 항 중 어느 한 항에 있어서, 악성 빈혈, 자가면역성 만성 간염, 원발성 담즙성 경변, 만성소화장애증, 포진상 피부염, 잠복성 간경변증, 반응성 관절염, 크론병, 휘플병, 궤양성 대장염, 또는 경화성 담관염인 방법.
162. 제 95 항 내지 제 149 항 중 어느 한 항에 있어서, MDCMC는 이식편대숙주병, 항체-매개 이식 거부반응, 골수이식 후 거부반응, 백혈병, 종양 형성, 천식, 항-베타 세포 항체들을 가진 제 1 형 당뇨병, 쇼그렌 증후군, 혼합결합조직병, 아디손병, 보크트-고야나기-하라다 증후군, 막증식성 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너육아종증, 현미경적 다발성 동맥염, 처그-스트라우스 증후군, 다발성 동맥염, 또는 다장기 기능부전인 방법.
163. 제 149 항에 있어서, 암은 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피혈관육종, 림프관육종, 림프관 내피혈관육종, 활막종, 중피종, 유윙종양, 평활근육종, 횡문근육종, 대장암, 췌장암, 유방암, 자궁암, 전립선암, 편평상피세포암, 기저세포암, 샘암종, 한선암, 피지샘암, 유두상암, 유두상 선암, 낭선암, 수양암종, 기관지원성 암종, 신장세포암, 간종양, 담관암, 융모암, 정소상피종, 배아암종, 윌름즈 종양, 자궁경부암, 고환종양, 폐암, 소세포폐암, 방광암, 상피세포암, 신경교종, 신경교성상세포종, 수아세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경초증, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막아종, 백혈병, 림프종, 다발성골수종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 골수이형성병, 중쇄병, 신경내분비종양, 및 신경초종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
164. 제 149 항에 있어서, 골밀도 질환은 골다공증, 골감소증, 골화석증, 특별성 저성선자극호르몬성저성선증, 거식증, 비치유성 골절, 폐경기골다공증, 비타민 D 결핍 또는 과다, 원발성 또는 속발성 부갑상선 기능항진증, 갑상선 질환 또는 비스포스포네이트 독성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
165. 제 149 항에 있어서, 급성 감염은 칸디다증, 칸디다혈증 또는 아스페르길루스증을 포함하는 진균성 질환; 메티실린내성 황색포도구균을 포함하는 포도구균, 연쇄상구균성 피부 및 중인두 이상 또는 그람 음성 패혈증을 포함하는 박테리아 질한; 폐결핵을 포함하는 미코박테륨 감염; 단핵구증, 호흡기 바이러스 감염 또는 대상포진 감염을 포함하는 바이러스 감염; 말라리아, 주혈흡충병 또는 트리파노소마증을 포함하는 기생충 감염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
166. 제 149 항에 있어서, 만성 감염인 경우, MDCMC는 조갑진균증; 헬리코박터 파일로리균을 포함하는 박테리아 질환; 폐결핵을 포함하는 미코박테륨 감염; 엡스타인-바르 바이러스 감염, 인간 파필로마 바이러스 감염 또는 헤르페스 바이러스 감염을 포함하는 바이러스 감염; 또는 말라리아 또는 트리파노소마증을 포함하는 기생충 감염으로부터 선택되는 방법.
167. 제 95 항 또는 제 99 항에 있어서, MDCMC는 기질에 의해 유발되는 방법.
168. 이식형 또는 부착형 의료 장치 및 이에 부착된 Fc 시약을 포함하는 조성물.
169. 이식형 또는 부착형 의료 장치 및 이에 부착된 Fc 시약을 포함하는 키트.
170. 제 169 항에 있어서, 적절한 용기를 더 포함하는 키트.
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aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc 576 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc 624 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 672 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 699 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 80 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 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cct gaa ctc 200 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 40 45 50 ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc 248 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 55 60 65 ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg 296 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 70 75 80 agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 344 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 85 90 95 100 gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc 392 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 105 110 115 acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg 440 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 120 125 130 aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc 488 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 135 140 145 ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca 536 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 150 155 160 cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag 584 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 165 170 175 180 gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc 632 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 185 190 195 gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg 680 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 200 205 210 cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc 728 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 215 220 225 acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 776 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 230 235 240 gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc 824 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 245 250 255 260 ctg tct ccg ggt aaa agt cta gac ccc aaa tct tgt gac aaa act cac 872 Leu Ser Pro Gly Lys Ser Leu Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 265 270 275 aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc 920 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 280 285 290 ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc 968 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 295 300 305 cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag 1016 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 310 315 320 gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 1064 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 325 330 335 340 aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc 1112 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 345 350 355 gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag 1160 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 360 365 370 tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc 1208 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 375 380 385 tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 1256 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 390 395 400 cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg 1304 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 405 410 415 420 gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat 1352 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 425 430 435 ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 1400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 440 445 450 gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg 1448 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 455 460 465 tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg 1496 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 470 475 480 cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa acc 1544 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Thr 485 490 495 500 ggt tga catcatcacc atcaccattg atgagttaaa cccgctga 1588 Gly <210> 18 <211> 501 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Asp Ile Gln His Ser Gly Gly Arg Ser 20 25 30 Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 35 40 45 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 50 55 60 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 65 70 75 80 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 85 90 95 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 100 105 110 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 115 120 125 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 130 135 140 Ala Leu Pro Ala Pro Ile 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Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu Ser Thr 70 75 80 gcc tct acc acg cag gag ggt gag ctg gcc tcc aca caa agc gag ctc 344 Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser Glu Leu 85 90 95 100 acc ctc agc cag aag cac tgg ctg tca gac cgc acc tac acc tgc cag 392 Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln 105 110 115 gtc acc tat caa ggt cac acc ttt gag gac agc acc aag aag tgt gca 440 Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala 120 125 130 ggc ggc cgc tcg agt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 488 Gly Gly Arg Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 135 140 145 cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 536 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 150 155 160 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 584 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 165 170 175 180 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 632 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 185 190 195 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 680 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 200 205 210 ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc 728 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 215 220 225 acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 776 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 230 235 240 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 824 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 245 250 255 260 gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 872 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 265 270 275 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 920 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 280 285 290 ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 968 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 295 300 305 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1016 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 310 315 320 tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1064 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 325 330 335 340 cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 1112 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 345 350 355 cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa agt cta gac 1160 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Leu Asp 360 365 370 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct 1208 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 375 380 385 gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 1256 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 390 395 400 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 1304 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 405 410 415 420 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 1352 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 425 430 435 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac 1400 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 440 445 450 aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1448 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 455 460 465 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1496 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 470 475 480 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga 1544 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 485 490 495 500 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag 1592 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 505 510 515 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1640 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 520 525 530 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag 1688 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 535 540 545 acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1736 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 550 555 560 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca 1784 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 565 570 575 580 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc 1832 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 585 590 595 ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa ggc ccg cgt gct gcc ccg gaa gtc tat 1880 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr 600 605 610 gcg ttt gcg acg ccg gag tgg ccg ggg agc cgg gac aag cgc acc ctc 1928 Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg 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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 225 230 235 240 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 245 250 255 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 260 265 270 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 275 280 285 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 290 295 300 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 305 310 315 320 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 325 330 335 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 340 345 350 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 355 360 365 Lys Ser Leu Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 370 375 380 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 385 390 395 400 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 405 410 415 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 420 425 430 Trp 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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105

Claims (33)

  1. 둘 이상의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하는 클러스터 스트라도머로서, 상기 클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 아미노 말단부터 카복시 말단까지,
    (a) 클러스터 스트라도머 단위들을 다중화하여 클러스터 스트라도머를 형성하는 적어도 하나의 IgG2 힌지 다중화 부위; 및
    (b) IgG1, IgG3 또는 IgG4로부터의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하며,
    여기서 클러스터 스트라도머는 적어도 두 개의 Fc 수용체들에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 클러스터 스트라도머.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 클러스터 스트라도머는 항원-결합 Fab 도메인을 포함하지 않는 것인 클러스터 스트라도머.
  3. 제 1 항에 있어서,
    Fc 도메인은 IgG1, IgG3 또는 IgG4로부터의 IgG 힌지 도메인을 추가로 포함하는 것인 클러스터 스트라도머.
  4. 제 1 항에 있어서,
    2개의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하는 것인 클러스터 스트라도머.
  5. 제 1 항에 있어서,
    3개의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하는 것인 클러스터 스트라도머.
  6. 제 1 항에 있어서,
    4개의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하는 것인 클러스터 스트라도머.
  7. 제 1 항에 있어서,
    5개 이상의 다중화된 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하는 것인 클러스터 스트라도머.
  8. 제 1 항에 있어서,
    클러스터 스트라도머 단위의 적어도 하나는 둘 이상의 Fc 도메인을 포함하는 것인 클러스터 스트라도머.
  9. 제 1 항에 있어서,
    클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 둘 이상의 Fc 도메인을 포함하는 것인 클러스터 스트라도머.
  10. 제 1 항에 있어서,
    클러스터 스트라도머 단위들의 각각은 적어도 하나의 FcR에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 클러스터 스트라도머.
  11. 제 10 항에 있어서,
    적어도 하나의 FcR은 인간 Fcγ 수용체 I, 인간 Fcγ 수용체 II, 인간 Fcγ 수용체 III, 인간 Fcγ 수용체 IV, FcRN, 또는 이의 비인간 동등체인 클러스터 스트라도머.
  12. 제 1 항에 있어서,
    Fc 도메인은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 및 IgG1 CH3을 포함하는 것인 클러스터 스트라도머.
  13. 제 1 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 61의 단백질의 호모다이머를 각각 포함하는 클러스터 스트라도머 단위들을 포함하는 것인 클러스터 스트라도머.
  14. 제 1 항에 있어서,
    환자의 암 또는 자가면역질환 치료에 사용하기 위한 클러스터 스트라도머.
  15. 호모다이머 클러스터 스트라도머 단위로서, 호모다이머의 각 모노머는 아미노 말단부터 카복시 말단까지:
    (a) 호모다이머화될 때 클러스터 스트라도머 단위를 다중화할 수 있는 IgG2 힌지를 포함하는 다중화 도메인 모노머; 및
    (b) IgG1 힌지 모노머, IgG1 CH2 모노머, 및 IgG1 CH3 모노머를 포함하는 Fc 도메인 모노머를 포함하며,
    여기서 호모다이머는 적어도 하나의 Fc 수용체에 특이적으로 결합할 수 있으며 다중화하여 둘 이상의 Fc 수용체들에 결합할 수 있는 화합물을 형성하는 것인 호모다이머 클러스터 스트라도머 단위.
  16. 제 15 항에 있어서,
    호모다이머의 각 모노머가 SEQ ID NO: 61의 단백질을 포함하는 것인 호모다이머 클러스터 스트라도머 단위.
  17. 두 개의 모노머들 및 Fab 도메인을 포함하는 화합물로서, 상기 모노머들의 각각은
    (a) 다이머화될 때 다중화 부위를 형성하는 다중화 부위 모노머;
    (b) 다이머화될 때 Fc 감마 수용체에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인을 형성하는 적어도 하나의 Fc 단편 모노머, 또는 힌지 부위의 일부 또는 전부, CH2 도메인의 일부 또는 전부, CH3 도메인의 일부 또는 전부, CH4 도메인의 일부 또는 전부, 또는 이들의 조합이 결핍되고 다이머화될 때 Fc 감마 수용체 결합 활성을 가진 Fc 도메인을 형성하는 적어도 하나의 Fc 부분 단편 모노머; 및
    (c) Fab 단편 중사슬로, Fab 단편 경사슬은 Fab 중사슬과 독립적으로 결합되어 Fab 도메인을 형성하며, Fab 도메인은 항원-결합 활성을 가지는 것인 Fab 단편 중사슬을 포함하는 것인 두 개의 모노머들 및 Fab 도메인을 포함하는 화합물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    다중화 부위는 IgG2 힌지 및 아이소루신 지퍼로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 화합물.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 모노머들의 각각은 IgG2 힌지, IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인, 및 IgG1 CH3 도메인을 포함하는 것인 화합물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 모노머들의 각각은 두 개의 IgG1 힌지, 두 개의 IgG1 CH2 도메인, 및 두 개의 IgG1 CH3 도메인을 포함하는 것인 화합물.
  21. 제 17 항에 있어서,
    상기 모노머들의 각각은 아이소루신 지퍼, IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인, 및 IgG1 CH3 도메인을 포함하는 것인 화합물.
  22. 제 17 항에 있어서,
    상기 모노머들의 각각은 아이소루신 지퍼, IgG2 힌지, IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인, 및 IgG1 CH3 도메인을 포함하는 것인 화합물.
  23. 제 17 항에 있어서,
    Fab 도메인은 세툭시맙, 리툭시맙, 뮤로모납-CD3, 압시지맙, 다클리주맙, 바실리지맙, 팔리비주맙, 인플리지맙, 트라스투주맙, 겜투즈맙, 오조가미신, 알렘투즈맙, 이브리투모맙 티욱제탄, 아달리무맙, 오말리주맙, 토시투모맙, I-131 토시투모맙, 에팔리주맙, 베바시주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 나탈리주맙, 에타네르셉트, IGN101, 볼록시지맙, 안티-CD80 mAb, Anti-CD23 mAb, CAT-3888, CDP-791, 에라프투즈맙, MDX-010, MDX-060, MDX-070, 마투주맙, CP-675,206, CAL, SGN-30, 자놀리무맙, 아데카투무맙, 오레고보맙, 니모투주맙, ABT-874, 데노수맙, AM 108, AMC 714, 폰톨리주맙, 다클리주맙, 골리무맙, CNTO 1275, 오크렐리주맙, HuMax-CD20, 벨리무맙, 에프라투주맙, MLN1202, 비실리주맙, 토실리주맙, 오크렐리주맙, 세르토리주맙 페골, 에쿨리주맙, 펙셀리주맙, 압시지맙, 라니비지무맙, 메폴리주맙, TNX-355, 및 MYO-029로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단클론 항체의 Fab 도메인인 화합물.
  24. 둘 이상의 모노머들 및 코어 모이어티를 포함하는 화합물로서, 코어 모이어티는 둘 이상의 모노머들에 연결 또는 공유 결합되는 폴리펩타이드 또는 비-폴리펩타이드 개체이며, 상기 모노머들의 각각은 다이머화될 때 Fc 감마 수용체에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인을 형성하는 적어도 하나의 Fc 단편 모노머, 또는 힌지 부위의 일부 또는 전부, CH2 도메인의 일부 또는 전부, CH3 도메인의 일부 또는 전부, CH4 도메인의 일부 또는 전부, 또는 이들의 조합이 결핍되고 다이머화될 때 Fc 감마 수용체 결합 활성을 가진 Fc 도메인을 형성하는 적어도 하나의 Fc 부분 단편 모노머를 포함하는 것인 둘 이상의 모노머들 및 코어 모이어티를 포함하는 화합물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 모노머들의 각각은 다이머화될 때 다중화 부위를 형성하는 다중화 부위 모노머를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  26. 제 25 항에 있어서,
    다중화 부위 모노머는 IgG2 힌지 및 아이소루신 지퍼로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 화합물.
  27. 제 24 항에 있어서,
    코어 모이어티는 면역글로불린 J 사슬, 알부민, 리포솜, 비드, 펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 화합물.
  28. 제 24 항에 있어서,
    Fab 도메인을 추가로 포함하며, 상기 모노머들의 각각은 Fab 단편 중사슬을 포함하고, Fab 단편 경사슬은 Fab 중사슬과 독립적으로 결합되어 Fab 도메인을 형성하며, Fab 도메인은 항원-결합 활성을 가지는 것인 화합물.
  29. 삭제
  30. (a) 면역 시스템의 세포들의 균질 집단과 후보 항체를 접촉시키는 단계,
    (b) (a)의 세포들의 집단의 활성을 측정하는 단계,
    (c) (a)와 동일한 세포 타입 형태의 세포들의 균질 집단과 두 개의 모노머들을 포함하는 화합물을 접촉시키는 단계로, 상기 모노머들의 각각은 다이머화될 때 다중화 부위를 형성하는 다중화 부위 모노머; 다이머화될 때 Fc 감마 수용체에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인을 형성하는 적어도 하나의 Fc 단편 모노머, 또는 힌지 부위의 일부 또는 전부, CH2 도메인의 일부 또는 전부, CH3 도메인의 일부 또는 전부, CH4 도메인의 일부 또는 전부, 또는 이들의 조합이 결핍되고 다이머화될 때 Fc 감마 수용체 결합 활성을 가진 Fc 도메인을 형성하는 적어도 하나의 Fc 부분 단편 모노머를 포함하는 것인 단계,
    (d) (c)의 세포들의 집단의 활성을 측정하는 단계, 및
    (e) (b)에서 측정한 활성을 (d)에서 측정된 활성과 비교하는 단계를 포함하는 면역시스템의 세포에 대한 특이적 활성에 대해 항체를 스크리닝하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    후보 항체 및 (c)의 화합물은 종들이 일치하고 아이소타입이 일치하는 것인 방법.
  32. 제 30 항에 있어서,
    상기 모노머들의 각각은 Fab 단편 중사슬을 추가로 포함하고, Fab 단편 경사슬은 Fab 단편 중사슬과 독립적으로 결합되어 Fab 도메인을 형성하며, Fab 도메인은 항원-결합 활성을 가지는 것인 방법.
  33. 삭제
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