JP6215365B2 - 免疫グロブリン定常領域Fc受容体結合因子 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は主に、免疫学、炎症、腫瘍免疫学の分野に関する。特に、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインを含む生物活性生体模倣分子、このような生体模倣薬を含む組成物、このような生体模倣薬の使用方法に関する。
1950年代前半以降の免疫不全症の治療、その後は多くが自己免疫疾患や炎症性疾患の治療に、ヒト血漿由来の免疫グロブリン製品が用いられている。
IVIGの免疫調節特性は、IgG分子のFcドメインにある。たとえば、ITPのマウスモデルでは、IVIGそのものとFc断片単独のどちらも血小板数の回復に治療効力を示すが、単離したIVIGのFab断片は治療的ではない(Samuelsson, A., Towers, T.L. & Ravetch, J.V. Anti-inflammatory Activity of IVIG Mediated Through the Inhibitory Fc Receptor. Science 291, 484-486 (2001))。さらに、Fcも小児と成人の両方で特発性血小板減少性紫斑病の治療に治療効果があるが、IVIGのFab断片には治療効果がない(Follea, G. et al. Intravenous plasmin-treated gammaglobulin therapy in idiopathic thrombocytopenic purpura. Nouv Rev Fr Hematol 27, 5-10 (1985);Solal-Celigny, P., Bernard, J., Herrera, A. & Biovin, P. Treatment of adult autoimmune thrombocytopenic purpura with high-dose intravenous plasmin-cleaved gammaglobulins. Scand J Haematol 31, 39-44 (1983);Debre, M. & Bonnet, M.-C. Infusion of Gcgamma fragments for treatment of children with acute immune thrombocytopenic purpura. Lancet 342, 945-49 (1993);Burdach, S.E., Evers, K. & Geurson, R. Treatment of acute idiopathic thrombocytopenic purpura of childhood with intravenous immunoglobulin G: Comparative efficacy of 7S and 5S preparations. J Pediatr 109, 770-775 (1986))。
(a)会合した2つのFc断片単量体を含むFc断片であって、前記Fc断片単量体が各々Fcドメイン単量体を含み、2つのFc断片単量体の会合によってFcドメインが形成される、Fc断片と、
(b)会合した2つのFc部分断片単量体を含むFc部分断片であって、前記Fc部分断片単量体が各々Fcドメイン単量体を含み、2つのFc部分断片単量体の会合によってFcドメインが形成される、Fc部分断片と、
(c)会合した2つのFcドメイン単量体を含むFcドメインであって、2つのFcドメイン単量体の会合によってFcドメインが形成される、Fcドメインと、
(d)会合した2つ以上のストラドマー単量体を含むシリアルストラドマーであって、前記ストラドマー単量体が各々2つ以上のFcドメイン単量体を含み、2つ以上のストラドマー単量体の会合によって2つ以上のFcドメインが形成される、シリアルストラドマーと、
(e)2つ以上の多量体化クラスターストラドマー単位を含むクラスターストラドマーであって、前記クラスターストラドマー単位が各々、多量体化用領域と少なくとも1つのFcドメインとを含み、前記クラスターストラドマー単位が各々、会合した2つのクラスターストラドマー単位単量体を含み、前記クラスターストラドマー単位単量体が各々、多量体化用領域単量体と少なくとも1つのFcドメイン単量体とを含み、2つのクラスターストラドマー単位単量体の会合によって多量体化用領域と少なくとも1つのFcドメインとが形成され、2つ以上のクラスターストラドマー単位の多量体化用領域が多量体化してクラスターストラドマーが形成される、クラスターストラドマーと、からなる群から選択され、
コアストラドマーが、2つ以上のコアストラドマー単位のうちの1つを介して第1のFcγ受容体と特異的に結合し、2つ以上のコアストラドマー単位のうちの別の1つを介して第2のFcγ受容体と特異的に結合する、コアストラドマーに関するものである。
本明細書に記載のhIVIG代替化合物の合理的分子設計に対する取り組みには、免疫学的に活性な生体模倣薬の組換えおよび/または生化学的創製が含まれる。好ましい方法では、これらの代替化合物をin vitroでスクリーニングして、それぞれの代替化合物のFcγ受容体への結合と免疫機能調節の効率を評価する。さらにin vivoでの確認と投与量/投与の最適化のために、特定の代替化合物を選択する。この代替化合物は、たとえば自己免疫疾患、炎症性疾患、骨粗鬆症および癌の治療に役立つ。以下、特定の代表的な実施形態と併せて、それぞれのフェーズについて詳細に説明する。
「Fc断片」とは、免疫グロブリンのカルボキシ末端に普通に見られるタンパク質領域またはタンパク質の折り畳み構造(図3A〜図3B参照)を説明するのに用いられる専門用語である。Fc断片は、不完全かつ不十分なプロセスであるパパイン消化によってモノクローナル抗体のFab断片から単離可能である(Mihaesco C and Seligmann M. Papain Digestion Fragments Of Human IgM Globulins. Journal of Experimental Medicine, Vol 127, 431-453 (1968)を参照のこと)。Fab断片(抗体結合ドメインを含む)との組み合わせで、Fc断片は、ここでは完全抗体を意味するホロ抗体を構成する。Fc断片は、抗体重鎖のカルボキシ末端部分からなる。Fc断片の鎖は各々約220〜265アミノ酸長であり、鎖同士がジスルフィド結合で結合されていることが多い。また、Fc断片には、1つ以上の独立した折り畳み構造または機能的サブドメインが含まれることも多い。特に、Fc断片は、本明細書ではFcγ受容体と結合する最小構造(たとえば、図1Bおよび図1Dを参照のこと)として定義するFcドメインを包含する。単離されたFc断片は、2つのFc断片単量体(抗体重鎖の2つのカルボキシ末端部分など;本明細書でさらに定義する)が二量体化して構成される。2つのFc断片単量体が会合すると、得られるFc断片はFcγ受容体結合活性を持つことになる。
「Fc部分断片」とは、抗体のFc断片全体までは含まないが、Fcγ受容体結合活性を含め、Fc断片と同じ活性を持てるだけの十分な構造が保たれたドメインのことである。したがって、Fc部分断片では、Fc部分ドメインが由来する抗体のアイソタイプによって、ヒンジ領域の一部または全部、CH2ドメインの一部または全部、CH3ドメインの一部または全部および/またはCH4ドメインの一部または全部が欠けていることがある。Fc部分断片の一例として、IgG3の上側のコアと下側のヒンジ領域に加えてCH2ドメインを含む分子があげられる(Tan, LK, Shopes, RJ, Oi, VT and Morrison, SL, Influence of the hinge region on complement activation, C1q binding, and segmental flexibility in chimeric human immunoglobulins, Proc Natl Acad Sci USA. 1990 January; 87(1): 162-166)。よって、この例のFc部分断片には、IgG3のFc断片に存在するCH3ドメインが欠けている。Fc部分断片は、2つのFc部分断片単量体で構成される。本明細書でさらに定義するように、このような2つのFc部分断片単量体が会合すると、得られるFc部分断片はFcγ受容体結合活性を持つことになる。
本明細書で使用する場合、「Fcドメイン」とは、Fcγ受容体と結合可能であるかFcγ受容体に結合される、最小領域(大きめのポリペプチドの場合)またはタンパク質の最小折り畳み構造(単離されたタンパクの場合)を説明するものである。Fc断片とFc部分断片のどちらでも、FcドメインはFcγ受容体との分子結合を可能にする最小結合領域である。FcドメインがFcγ受容体に結合される別個のポリペプチドに限定されることもあるが、このFcドメインはFc断片の一部または全部であってもよいし、Fc部分断片の一部または全部であってもよいことは自明であろう。本発明で「複数のFcドメイン」という用語を使用する場合、2つ以上のFcドメインを意味することは、当業者であれば分かるであろう。Fcドメインは、2つのFcドメイン単量体で構成される。本明細書でさらに定義するように、このような2つのFcドメイン単量体が会合すると、得られるFcドメインはFcγ受容体結合活性を持つことになる。このように、Fcドメインは、Fcγ受容体を機能的に結合可能な二量体構造である。
本明細書で使用する場合、「Fc部分ドメイン」とは、Fcドメインの一部を説明するものである。Fc部分ドメインは、免疫グロブリンの異なるクラスおよびサブクラスの個々の重鎖定常領域ドメイン(CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメインなど)とヒンジ領域とを含む。よって、本発明のFc部分ドメインは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgEのCH1ドメイン、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgEのCH2ドメイン、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgEのCH3ドメイン、IgMおよびIgEのCH4ドメイン、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgEのヒンジ領域を含む。本発明のFc部分ドメインは、これらのドメインとヒンジとのもう1つよりも多く(more than one more)の組み合わせをさらに含むこともある。しかしながら、本発明の個々のFc部分ドメインとこれらの組み合わせには、FcγRを結合する機能はない。したがって、Fc部分ドメインとこれらの組み合わせは、Fcドメインとは言えないものである。Fc部分ドメイン同士を結合すれば、Fcγ受容体結合活性を有するペプチドが形成されて、Fcドメインとなり得る。本発明では、Fc部分ドメインをビルディングブロックとして複数のFcドメインと併用して、本明細書で定義するような本発明の生体模倣薬を創製する。Fc部分ドメインは各々2つのFc部分ドメイン単量体で構成される。このような2つのFc部分ドメイン単量体が会合すると、Fc部分ドメインが形成される。
本明細書で使用する場合、「Fc断片単量体」とは、他のFc断片単量体と会合したときにFc断片をなす単一鎖タンパク質のことである。よって、Fc断片単量体は、ホロ抗体のFc断片を構成する抗体重鎖のうちの1つのカルボキシ末端部分である(IgGのヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメインを含む重鎖の連続部分など)(図1Aおよび図1C参照))。一実施形態では、Fc断片単量体は、最低限、ヒンジ領域の1本の鎖(ヒンジ単量体)と、CH2ドメインの1本の鎖(CH2ドメイン単量体)と、CH3ドメインの1本の鎖(CH3ドメイン単量体)とを含み、これらが連続的に結合されてペプチドを形成している。別の実施形態では、Fc断片単量体は、少なくとも、連続的に結合されてペプチドを形成している、ヒンジ領域の1本の鎖と、CH2ドメインの1本の鎖と、CH3ドメインの1本の鎖と、CH4ドメインの1本の鎖(CH4ドメイン単量体)とを含む。
本明細書で使用する場合、「Fcドメイン単量体」とは、他のFcドメイン単量体と会合したときに、Fcγ受容体と結合可能なFcドメインをなす単一鎖タンパク質を説明するものである。2つのFcドメイン単量体が会合すると、1つのFcドメインが形成される。Fcドメイン単量体単独ではFcドメインの片側しか含まれず、Fcγ受容体を結合することができない。
本明細書で使用する場合、「Fc部分ドメイン単量体」とは、他のFc部分ドメイン単量体と会合したときに、Fc部分ドメインをなす単一鎖タンパク質を説明するものである。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4のFc部分ドメインのヒンジ単量体、CH2単量体、CH3単量体のアミノ酸配列を、図25に示す。2つのFc部分ドメイン単量体が会合すると、1つのFc部分ドメインが形成される。
特定の実施形態では、本発明の生体模倣薬はストラドマーを含む。ストラドマーは、2つ以上のFcγ受容体を結合できる生体模倣化合物である(たとえば、図13B参照)。好ましい実施形態では、本発明のストラドマーは、NK細胞などのエフェクター細胞や未熟樹状細胞、他の単球由来細胞などのFcγ受容体を結合するのに用いられる。一実施形態では、Fcγ受容体が低親和性Fcγ受容体である。ストラドマーは、シリアル、クラスター、コアまたはFc断片という4つの異なる物理的コンホメーションを取り得るものであり、そのそれぞれについて以下の段落で説明する。いずれ明らかになるように、上述したFc断片、Fc部分断片、Fcドメイン、Fc部分ドメインを利用して、ストラドマーのさまざまなコンホメーションを形成する。さらに、まずは生成され、その後自己会合して本発明のストラドマーである二量体構造を形成するのは、同じく上述した個々のFcドメイン単量体およびFc部分ドメイン単量体である。
「シリアルストラドマー」とは、会合されると2つ以上のFcドメインを形成する2つの線状ストラドマー単量体で構成される二量体ポリペプチドのことである。ストラドマーの複数のFcドメインは、2つのペプチド鎖(ストラドマー単量体)が会合している場合にのみ機能的になる(すなわち、単量体の状態では非機能的である)。よって、シリアルストラドマーは、2つ以上のFcγ受容体を結合できる生体模倣化合物である。異なる実施形態では、シリアルストラドマーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14またはそれより多くのFcドメインならびにFc部分ドメインを有するものであってもよい。シリアルストラドマー内の複数のFcドメインおよびFc部分ドメインは、本明細書でさらに定義するように、ドメイン結合によって結合されていてもよい。
本明細書で使用する場合、「ストラドマー単量体」という用語は、少なくとも第2のストラドマー単量体と会合すると、少なくとも2つのFcドメインを含むポリペプチドを形成する単一の連続したペプチド分子を示す(たとえば、図6A〜図6B、図12A参照)。好ましい実施形態では、シリアルストラドマーは会合した2つのストラドマー単量体で構成される(たとえば、図5A、図5B、図7A、図7B、図7C、図7D参照)が、シリアルストラドマーは、3つ(図11C参照)またはそれよりも多くのストラドマー単量体を含むものであってもよい。ストラドマー単量体は、ストラドマー単量体間結合によって会合してストラドマーを形成することもあれば、自己凝集でストラドマーを形成することもある。
上述したように、「ドメイン結合」は、本発明のシリアルストラドマーまたはストラドボディ個々のストラドマー単量体各々をなすFcドメイン単量体および/またはFc部分ドメイン単量体間のペプチド結合である。ドメイン結合は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれより多くのアミノ酸であってもよい。ドメイン結合は、その天然の配列であるFc部分ドメイン単量体間には生じない。すなわち、IgGのヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメインなど、Fcドメイン単量体の天然の連続結合部分を使用するのであれば、これらのFc部分ドメイン単量体は連続配列を含み、これらの要素間にドメイン結合は必要ない。対照的に、たとえば、天然には生じない形で2つ以上のFcドメイン単量体または部分Fcドメイン単量体を結合させて個々のストラドマー単量体を形成する場合、ドメイン結合を用いるようにしてもよい。一例として、ヒンジ/CH2/CH3/L/ヒンジ/CH2/CH3を含むストラドマーの個々のストラドマー単量体を形成する2つのヒンジ/CH2/CH3ペプチド間の結合があげられ、ここで、「L」はドメイン結合(たとえば、IgG1のCH3ドメインとIgG1のヒンジとの間でドメイン結合(図示せず)が起こる図4Aを参照のこと)である。ここに記載のさまざまな事例では、ドメイン結合が、抗体のFcドメイン単量体におけるヒンジとCHドメインとを連結する重鎖の天然に生じる部分のうちの1つであってもよい。あるいは、ドメイン結合が、個々のストラドマー単量体のFcドメイン単量体と部分Fcドメイン単量体との間に必要な空間や柔軟性を提供し、なおかつ個々のストラドマー単量体が互いに対合して本発明のストラドマーを形成できるようにする他のアミノ酸配列であってもよい。
本発明の生体模倣化合物に見られる別の結合に、本発明のストラドマーおよびストラドボディをなす2つ以上の個々のストラドマー単量体間に発生する「ストラドマー単量体間結合」がある。ドメイン結合は、生体模倣化合物の個々のストラドマー単量体をなすFcドメイン単量体同士や部分Fcドメイン単量体同士を結合するよう機能する短いアミノ酸配列であるが、ストラドマー単量体間結合は、生体模倣化合物をなす2つ以上の個々のストラドマー単量体を連結するよう機能する。ストラドマー単量体間結合は、個々のストラドマー単量体を安定して会合できるものであれば、どのような結合であってもよい。いくつかの実施形態では、ストラドマー単量体間結合は、ストラドマー単量体間の共有結合であってもよい。あるいは、ストラドマー単量体間のストラドマー単量体間結合は、直接的な化学的架橋によるものであってもよい。好ましい実施形態では、ストラドマー単量体構造は、Fcドメイン単量体間の自然な自己凝集特性を利用して、自己会合性ストラドマーを生成する。いくつかの実施形態では、個々のストラドマー単量体間にジスルフィド結合が形成されて、ストラドマーが形成される(たとえば、ストラドマー単量体間結合(図示せず)がストラドマーの2つの個々のストラドマー単量体を連結するよう機能する図5Aを参照のこと)。ジスルフィド結合は、天然のFcドメイン単量体配列に生じるシステイン残基または部位特異的突然変異誘発によってFcドメイン単量体に取り込まれたシステイン残基のいずれかを利用して、生体模倣分子をなすFcドメイン単量体のシステイン残基間に形成される。また、こうした自然な自己凝集特性を利用して、ストラドマー多量体の個々のストラドマー単量体間にストラドマー単量体間結合を形成することも可能である。別の実施形態では、個々のストラドマー単量体をなすアミノ酸配列に部位特異的突然変異誘発によって導入されたシステイン残基間にジスルフィド結合が形成されるストラドマー単量体間結合を含む。
「コアストラドマー」は、2つ以上のコアストラドマー単位が結合されるコア部分で構成され、各コアストラドマー単位が少なくとも1つのFcドメインを含むことで、2つ以上のFcγ受容体を結合できる生体模倣化合物が形成される。Fc断片、Fc部分断片、シリアルストラドマーまたはクラスターストラドマー単位は各々独立して、これらの分子が各々少なくとも1つのFcドメインを含むことから、コアストラドマーにおけるコアストラドマー単位の一方または両方(2つのFcドメインを含む場合)として機能することができる。よって、コアストラドマーは、少なくとも1つのシリアルストラドマーが結合されるコア部分を含むものであってもよい。
「クラスターストラドマー」は、中心部分である「頭部」と2つ以上の「脚部」とを有するタコのような形をした生体模倣薬であり、それぞれの脚部が少なくとも1つのFcγ受容体を結合できる1つ以上のFcドメインを含むため、2つ以上のFcγ受容体を結合できる生体模倣薬が形成される。それぞれのクラスターストラドマーは、各々「クラスターストラドマー単位」と呼ばれる複数の二量体タンパク質で構成されている。各クラスターストラドマー単位は、多量体化する領域と、少なくとも1つの機能的Fcドメインを含む「脚部」領域とで構成される。多量体化用領域は、別のクラスターストラドマー単位の多量体化用領域との間で多量体化されると、クラスターストラドマーの「頭部」となる。脚部領域は、各脚部領域のFcドメインと同じ数だけのFcγ受容体と結合できる。よって、クラスターストラドマーは、2つ以上のFcγ受容体と結合できる生体模倣化合物である。
「Fc断片ストラドマー」は複数のFc断片で構成される。Fc断片の翻訳後修飾に起因する特定の状況下では、Fc断片が十分な強度で別のFc断片と結合して、複数のFcγ受容体と結合する分子の形成を可能にする。このような結合を可能にする翻訳後修飾としては、グリコシル化およびメチル化があげられる。組換えFc断片が生成される細胞系の同一性ならびに、これを生成する条件によって、Fc断片がFc断片ストラドマーを形成するか否かが左右される。たとえば、FreestyleMax CHO一過性形質転換細胞で生成された組換えFc断片は、ウェスタンブロットで可視化できる多量体を形成し、プラズモン共鳴を用いる結合アッセイでの二価フィット(bivalent fit)に基づいて結合し、IVIGに匹敵する生物活性を樹状細胞アッセイで呈する。これとは対照的に、安定CHO細胞系から生成された同じ組換えFc断片は、ウェスタンブロットでFc断片の多量体を形成せず、プラズモン共鳴を用いる結合アッセイでの一価フィット(univalent fit)に基づいて結合し、同程度の生物活性を呈さない。このように、Fc断片ストラドマーは、2つ以上のFcγ受容体を結合できる生体模倣化合物である。
本発明はストラドボディも包含する。本明細書で使用する場合、「ストラドボディ」とは、好ましくは1つ以上のFabドメインが結合されるストラドマー(シリアルストラドマー、コアストラドマー、クラスターストラドマーおよびFc断片ストラドマーを含む)との関連で、2つ以上のFcドメインを含む分子を示す(たとえば、図8A〜図8Bおよび図9A〜図9B参照)。よって、このようなFabドメインがゆえに、ストラドボディは抗原結合能とストラドマーFcγ受容体結合活性の両方を有する。いくつかの実施形態では、Fcγ受容体結合活性は、天然構造のホロ抗体のFc部分以上のFcγRを結合して架橋できる機能によるものである場合がある。好ましくは、ストラドボディのFab部分は、重鎖と軽鎖の両方を含む。可変の重鎖および軽鎖は独立して、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4などの適合免疫グロブリンからのものであってもよいし、同じIgアイソタイプのからのものであっても異なるIgアイソタイプからのものであってもよいが、好ましくは同じIgアイソタイプからのものである。軽鎖であるκまたはλも、異なるIgアイソタイプからのものであってもよい。ストラドマーのようなストラドボディは、2つ以上のFcγRを結合して、免疫機能を調節することができる。
IgG1由来の2つのFcドメインなどの免疫グロブリンの特定のFcドメイン(すなわち、IgG1のヒンジ/IgG1のCH2/IgG1のCH3/IgG1のヒンジ/IgG1のCH2/IgG1のCH3)を含むように本発明のストラドマーおよび他の生体模倣薬を設計可能であることは、当業者であれば理解できよう。このようなストラドマーは、まずIgG1の2つのFcドメイン単量体(すなわち、IgG1のヒンジ単量体/IgG1のCH2単量体/IgG1のCH3単量体/IgG1のヒンジ単量体/IgG1のCH2単量体/IgG1のCH3単量体)をコードするポリヌクレオチドを調製した後、そこからストラドマー単量体を発現させることで構成できよう。このような2つのストラドマー単量体が会合すると、IgG1の2つのFcドメインを有するシリアルストラドマーが生成される。
さらに、本発明の実施形態で用いられるFcドメインおよびFc部分ドメインが全長分でなくてもよいことは、当業者であれば分かるであろう。すなわち、本発明は、本発明のストラドマーおよび他の生体模倣薬をなす特定のFcドメイン単量体およびFc部分ドメイン単量体のアミノ末端、カルボキシ末端または中程からアミノ酸を欠いたFcドメイン単量体およびFc部分ドメイン単量体を用いることも包含する。
本発明のストラドマー単量体の例を以下にあげておく。
1.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3
2.IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3
3.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG3のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3
4.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3
5.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG1のCH3
6.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG3のCH3
7.IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG1のCH3−IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3
8.IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3
9.IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3
10.IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG3のCH3−IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG3のCH3
11.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG3のヒンジ−IgG3のCH2−IgG3のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3
12.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG3のヒンジ−IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG3のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3
13.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG3のヒンジ−IgG3のCH2−IgG3のCH3−IgG1のヒンジ−IgG2のCH2−IgG3のCH3
14.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG4のヒンジ−IgG4のCH2−IgG4のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3
1.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4(図10C〜図10D参照)
2.IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
3.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG3のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4(図10A〜図10B参照)
4.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
5.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
6.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
7.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG3のCH3−IgMのCH4
8.IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG1のCH3−IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
9.IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
10.IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
11.IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG3のCH3−IgMのCH4
1.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
2.IgG3のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
3.IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
4.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG3のCH3−IgMのCH4
5.IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG3のCH3−IgMのCH4
6.IgG3のヒンジ−IgG3のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
7.IgG3のヒンジ−IgG3のCH2−IgG1のCH3−IgMのCH4
8.IgG1のヒンジ−IgG3のCH2−IgG2のCH3−IgMのCH4
9.IgG1のヒンジ−IgG3のヒンジ−IgG3のCH2−IgG2のCH3−IgMのCH4
10.IgG1のヒンジ−IgG1のCH2−IgG1のCH3−IgEのCH4−IgMのCH4
「FcγR」および「Fcγ受容体」という用語は、本明細書で使用する場合、Nimmerjahn F and Ravetch JV. Fcgamma receptors: old friends and new family members. Immunity. 2006 Jan; 24(1):19-28に記載されているように、あるいは下記で定義できるように、免疫細胞表面で発現されるタンパク質のFcγ受容体ファミリの各メンバを含む。本明細書に記載の「FcγR」という用語は、FcγRI、RIIおよびRIIIファミリのすべてのメンバを包含することを意図している。Fcγ受容体は、FcγRI(CD64);FcγRII(CD32)およびそのアイソタイプおよびアロタイプFcγRIIa LR、FcγRIIa HR、FcγRIIbおよびFcγRIIc;FcγRIII(CD16)およびそのアイソタイプFcγRIIIaおよびFcγRIIIbを含むがこれに限定されるものではない、低親和性のFcγ受容体と高親和性のFcγ受容体とを含む。FcγRと結合する化合物を含む本発明は、現時点では発見されていないかもしれない将来のFcγRおよび関連のアイソタイプおよびアロタイプにも適用されることは、当業者であれば分かるであろう。
本明細書に記載の免疫学的に活性な生体模倣組成物の投与は、一般的な任意の経路すなわち、経口的、非経口的または局所的になされる。代表的な経路としては、経口、経鼻、頬側、直腸内、膣内、点眼、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、腫瘍内、脊髄、くも膜下腔内、関節内、動脈内、くも膜下、舌下、口腔粘膜、経気管支、リンパ管、子宮内、皮下、腫瘍内、植込み型装置に統合、硬膜内、皮質内または経皮があげられるが、これに限定されるものではない。このような組成物は通常、本明細書で説明するような薬学的に許容される組成物として投与される。好ましい実施形態では、免疫学的に活性な単離された生体模倣薬を静脈内投与する。
合理的設計ならびに、in vitroおよびin vivoでの検証結果に基づいて、本発明の免疫学的に活性な生体模倣薬は、癌や炎症性疾患用の生物免疫療法剤などのさまざまな他の状況で自己免疫疾患を治療し、免疫機能を調節するための重要な生物製剤として機能する。本明細書に記載の免疫学的に活性な生体模倣薬で治療するのに適した病状としては、自己免疫性血球減少症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、抗第VIII因子自己免疫疾患、皮膚筋炎、血管炎およびブドウ膜炎など、現在の常法でhIVIGによって治療されている病状またはhIVIGが臨床的に有用であることが分かっている病状(F. G. van der Meche, P. I. Schmitz, N. Engl. J. Med. 326, 1123 (1992);P. Gajdos et al., Lancet i, 406 (1984);Y. Sultan, M. D. Kazatchkine, P. Maisonneuve, U. E. Nydegger, Lancet ii, 765 (1984);M. C. Dalakas et al., N. Engl. J. Med. 329, 1993 (1993);D. R. Jayne, M. J. Davies, C. J. Fox, C. M. Black, C. M. Lockwood, Lancet 337, 1137 (1991);P. LeHoang, N. Cassoux, F. George, N. Kullmann, M. D. Kazatchkine, Ocul. Immunol. Inflamm. 8, 49 (2000)を参照)ならびに、モノクローナル抗体を使用できるか、すでにモノクローナル抗体が臨床利用されている癌または炎症性疾患の症状があげられる。本発明の主旨である化合物によって有効に治療できる症状に含まれるものとして、サイトカインネットワークのバランスが崩れた炎症性疾患、病原性自己抗体または自己攻撃性T細胞による自己免疫障害あるいは、慢性再発性の自己免疫疾患またはプロセス、炎症性疾患またはプロセスあるいは感染性疾患またはプロセスの急性期または慢性期があげられる。
免疫学的な障害を治療するという臨床的な有用性があるだけでなく、ストラドボディには癌および炎症性疾患の治療における治療的な用途もある。ストラドボディは、どのような対応の治療用抗体に対しても基本的には以下の周知のプロトコールに沿って使用できるものである。ストラドボディは通常、癌におけるADCCまたは自己免疫疾患でサイトカイン放出量が減少することによる単球およびDC成熟の減少などのモノクローナル抗体によってエフェクター細胞で現れる効果を高め、これによって、ストラドボディのFab部分に対するソースモノクローナル抗体などを使用して生じ得る免疫応答に比して癌に対する免疫応答を促進するよう設計される。
本明細書に開示の免疫学的に活性な生体模倣薬は、さまざまな状況で免疫系の応答の変更に容易に適用して、免疫応答プロファイルの特定の変化に影響を与えられるものである。被検体で免疫応答を変更または調節するというのは、免疫応答の比または構成内容を増大、減少または変化させることを示す。たとえば、適当な組み合わせのFcRを、これらの受容体と相互作用するように設計されたストラドマーを用いて標的することで、サイトカインの産生または分泌レベルを必要に応じて増減することができる。また、抗体の産生量を増減してもよいし、2つ以上のサイトカインまたは免疫細胞受容体の比を変えてもよく、別のタイプのサイトカインまたは抗体を産生させてもよい。免疫応答は、FcγRを発現している免疫細胞のエフェクターの機能であることもあり、これには、本明細書に開示の免疫学的に活性な生体模倣薬で調節されていない免疫応答と比較して、単球マクロファージ系細胞の潜在的な食作用の増加または減少、破骨細胞の機能の亢進または低減、抗原提示細胞(DCなど)による抗原提示の増大または減少、NK細胞の機能の亢進または低減、B細胞の機能の亢進または低減を含む。
免疫学的に活性な生体模倣薬を設計した際に調節対象とした免疫細胞の機能を試験するための免疫学的アッセイを、本明細書に開示の免疫学的に活性な生体模倣薬を用いて実施することができる。
1.これらの抗体のFab断片がリガンドまたは抗原エピトープを結合できないと、Fcγ受容体架橋が欠如するため、Fc断片が低親和性FcR相互作用によるシグナル伝達を刺激しなくなりやすい。したがって、実験抗体と対照抗体との間で観察される機能的な差異が、FcγRを架橋するための手段を欠いたエピトープ特異的標的とのFab相互作用に正しく起因することはあり得ない。
2.これらのアイソタイプが、親抗体とは糖型が異なるか個々の糖型の相対比率が異なる細胞で産生される場合、Fab親和性が同じであったとしても低親和性FcRと高親和性FcRの両方に対する結合が変化する。
a)少なくとも1つのシステインを含む、第1の免疫グロブリン由来のFcヒンジ(H)ドメインを含み、xがI、II、IIIまたはIVであるFcγRxへの特異性の結合に寄与する第1のFcドメインまたはそのFc部分ドメインであって、i)第1の免疫グロブリンと同じであっても異なっていてもよい第2の免疫グロブリン由来の定常領域2(CH2)を含み、xがI、IIまたはIII、IVであるFcγRxへの結合特異性に寄与する、第2のFcドメインまたはその部分ドメインと、任意に、ii)第3の免疫グロブリン由来の定常領域3(CH3)を含み、xがI、II、IIIまたはIVであるFcγRxへの結合特異性に寄与する第3のFcドメインまたはその部分ドメインと、のうちの少なくとも1つと、を含む、第1のFcドメインまたはそのFc部分ドメインと、b)、任意に、IgM免疫グロブリン由来の定常領域4(CH4)を指定する第4のFcドメインまたはその部分ドメインと、を含む、免疫学的に活性な単離された生体模倣薬を含む。
Fc:Fcγ受容体(FcγRすなわちIgGのFcに対するFc受容体)相互作用の役割と、そのFcが免疫グロブリン内で生物学的に固定化されることのIVIGの機能にとっての重要性を理解するために、本発明者らは、ヒンジ−CH2−CH3ドメインを含む、可溶状態の組換えIgG1のFc断片(sFc)と固定状態の組換えIgG1のFc断片(rFCF)の両方で、単球が未熟樹状細胞(iDC)に分化する過程でIVIGが単球の機能におよぼす影響を比較した。
(a)Fc試薬を混和性ポリマーブレンドと混合し、続いてこれを植込み型の合成材料の表面に積層することで、Fc試薬を安定させる。ポリマーブレンドを生成するのに当該技術分野において日常的に用いられている単量体としては、PLMA[ポリ(メタクリル酸ラウリル)];PEG[ポリエチレングリコール]、PEO[ポリエチレンオキシド];アルキル官能化メタクリレートポリマーPMMA、PEMA、PPMAおよびPBMA;イタコン酸塩;フマル酸塩;およびスチレン系樹脂があげられる。
(b)ポリマーアンダーコート層またはナノメートル寸法のフィルムを支持体表面に付着させた後、Fc試薬をポリマーアンダーコート層またはナノメートル寸法のフィルムに付着させることで、F試薬を安定させる。
(c)ポリマー単量体の薄膜を植込み型の支持体表面に適用した後、単量体を重合させる。このような単量体としては、たとえば、メタン、テトラフルオロエチレン(Tetrafluorethylene)、ベンゼン、メタノール、エチレンオキシド、テトラグリム、アクリル酸、アリルアミン、メタクリル酸ヒドロキシエチル、N−ビニルピロリジノン、メルカプトエタノールがあげられる。続いて、得られる単量体にFc試薬を貼り付ける。
(d)Fc試薬に付着するタンパク質Aまたはアルブミンなどのタンパク質を支持体にコーティングすることで、Fcを支持体の表面で安定させる。
(e)植込み型の合成材料に結合して安定したFcを均一に配向させる疎水性アミノ酸の鎖をFc試薬にタグ付けすることが可能である。
ヒトIgG1由来のFc断片単量体をコードする配列(配列番号1)を、選択した制限酵素開裂部位と、IgKシグナル(下記にてさらに定義する)と、エピトープタグとを含む発現ベクター(pCDNA 3.1D/V5 His TOPO Invitrogen)にクローニングし、図17(配列番号19)に示すIgG1単量体配列{RestEnzSites−IgKシグナル−RestEnzSites−IgG1(ヒンジ−CH2−CH3)−RestEnzSites−エピトープタグ(V5およびHis)−STOP}を作製した。タンパク質産生のために、このコンストラクトをCHO細胞(CHO−002)にトランスフェクトした。また、本発明者らは、以下の一般構造を有するいくつかのストラドマーコンストラクトも設計した。
a){RestEnzSites−IgKシグナル−RestEnzSites−IgG1(ヒンジ−CH2−CH3)−XbaI部位−IgG1(ヒンジ−CH2−CH3)−STOP}(配列番号21)(図4Aおよび図18も参照);
b){RestEnzSites−IgKシグナル−RestEnzSites−IgG1(ヒンジ−CH2−CH3)−XbaI部位−IgG1(ヒンジ−CH2−CH3)−RestEnzSites−エピトープタグ(V5およびHis)−STOP}(配列番号23)(図19も参照);
c){RestEnzSites−IgKシグナル−EcoRV部位−IgG3(ヒンジ−CH2−CH3)−IgG1(ヒンジ−CH2−CH3)−RestEnzSites−エピトープタグ(V5およびHis)−STOP}(配列番号25)(図21も参照);
d){RestEnzSites−IgKシグナル−EcoRV部位−IgE(CH2)−IgG1(ヒンジ−CH2−CH3)−IgG1(ヒンジ−CH2)−IgE(CH4)−STOP}(配列番号27)(図22も参照)
コーティングされたIVIGとコーティングされたFcが同様の表現型の変化を刺激する
滅菌プレートのウェルの壁面と底面にコーティングすると、IVIGおよびFcは未熟DCでCD1aおよびCD86レベルのほぼ等しい変化を刺激し、CD11cの上方制御を遅らせる。ITPにおけるDCの重要な役割であるとされている役割がゆえに、これらのデータによって、ストラドマーなどのIVIG模倣薬の機能を評価するための合理的なモデルが得られる。本発明者らは、IVIGによって誘導される表現型の変化が組換えFcによって完全に再現されることから、IVIGがDCに対しておよぼす作用にFcが介在している可能性が極めて高いであろうという結論にも至っている。
本発明者らは、IVIGが未熟DCに対しておよぼす作用を模倣するために、4通りのクラスのストラドマーを作製した。特に明記する場合を除いて、以下の表3に示すシリアルストラドマー、クラスターストラドマーを含むクラスターストラドマー単位、コアストラドマーを含むコアストラドマー単位、Fc断片ストラドマーを各々生成した。以下に示すヒトコンストラクト各々について適切な配列を得るには、ヒトPBMCから抽出した全RNAからcDNAを合成した。他の種からこれらの配列を得るには、これらの種の組織からRNAを精製した。ランダムプライミングを利用して、cDNAを生成した。cDNAを用いてPCRで所望の断片を増幅し、合成し、クローニングした後、DNA断片の配列解析によってキャラクタライズした。最終コンストラクトをオーバーラップエクステンションPCRでの連結によって作製(Horton RM, Hunt HD, Ho SN, Pullen, JK and Pease LR. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77:6168, 1989)したか、これに適合する既存の制限部位を利用して適当な断片を融合した。
ストラドマーのタンパク質を発現させるために、上述したストラドマーをコードするプラスミドDNAをCHO懸濁細胞(Freestyle(商標)MAX CHO expression system, lnvitrogen CA)にトランスフェクトした。タンパク質発現後、発現されたストラドマーを、タンパク質A親和性カラムまたはタンパク質G親和性カラムを用いる親和性カラムクロマトグラフィによって、培地から精製した。精製ストラドマーを還元条件下にてSDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)で分析した後、クマシーブルー(Coomasie Blue)染色によって、たとえば以下の想定された大きさの単量体タンパク質バンドの存在を確認した。G−002:約35KDのバンド、G−004 約70KDのバンド、G−010:約45KDのバンド、G−011:約80KDのバンド、G−012:約85KDのバンド、G−018 約70KDのバンド、G−019:約35KD、G−028 約37KDのバンド。ここに記載のストラドマーをコードするプラスミドDNAを、HEK 293、BHK細胞、マウスNSO、マウスSP2/0細胞などの他の哺乳類細胞にトランスフェクトすることも可能である。
本発明者らの観察によれば、これらのコンストラクトをトランスフェクトし、培養し、精製すると、未変性タンパク質および変性タンパク質の解析で想定された大きさのタンパク質を生成することができる。また、本発明者らの観察によれば、特定の化合物でも、大きさの基準に照らすと想定される二量体タンパク質の多量体であるさらに大きなバンドが認められた。
・G−002:還元条件下で約35KDのバンド−非還元条件下では約70KD(二量体)および135KD(四量体)にバンド
・G−010:還元条件下で約45KDのバンド−非還元条件下では約90KD(二量体)および180KD(四量体)にバンド
・G−019:還元条件下で約35KDのバンド−非還元条件下では約70KD(二量体)、140KD(四量体)にバンド
表3のタンパク質はいずれも、ウサギ抗ヒトIgG(Fc)[Thermo Scientific 31789]によって認識される。このことから、本発明者らは、これらのタンパク質が各々この抗体に対する認識部位を維持しているという結論に至っている。
表3のストラドマーがFcγRIIIaを結合する能力を表面プラズモン共鳴(SPR)技術(Biacore(登録商標)として市販)で評価した。pH5.0の酢酸緩衝液にてリガンドを濃度5ug/mlまで希釈し、ヒトFcγRIIIaをアミンカップリングによってCM5 Biacoreチップに直接固定化した。リガンドをRUが250になるまで指定のフローセルに5ul/分の速度で流した。その後、フローセルをエタノールアミンでブロックした。ストラドマーとIVIGをHBS−EP(0.01M HEPES、pH7.4;0.15M NaCl;3mM EDTA;0.005%Surfactant P20)で1000nMまで希釈し、500nM、250nM、125nM、最後に62.5nMに段階希釈した。緩衝液(HBS−EP)のみを含有するベースライン試料も含めた。すべての試料で流速を20ul/分とした。3分間の添加時間で合計60uLの試料を添加した。約10分間という長めの時間フローセルにランニング緩衝液を流し、再生をおこなった。
これらのストラドマーの生物学的機能を評価した。表3におけるストラドマーそれぞれが、ITPの個体でIVIGの機能的有用性を模倣する機能を判断するために、本発明者らは未熟樹状細胞(iDC)を用いるin vitroアッセイを開発した。標的細胞としてiDCを選択するにあたり、IVIGで処理したマウス由来のDCの養子移入によって、未処理の動物がITPの発症から保護されることを示す公開データをその論拠とした(Siragam, V. et al. Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fc[gamma] receptors on dendritic cells. Nat Med 12, 688 (2006))。本発明者らの初期研究において、本発明者らは、コーティングつまりプレートに固定した組換えFc(rFc)およびIVIGが、IL−4およびGM−CSFの存在下にて培養したヒトCD14+細胞でのさまざまな活性化、成熟および共刺激マーカーの発現に対しておよぼす影響を評価した。サイトカインだけの中で培養した細胞と比較すると、コーティングされたIVIGまたはコーティングされたrFcに曝露した細胞では、CD86発現の著しい増大とCD1a発現の下方制御ならびにCD11c上方制御の遅延が認められた。
i.選択(select)ストラドマーは、組織培養プレートにコーティングすると、コーティングされたIVIGがCD86を上方制御し、未熟DCでのCD1aの発現を抑制する機能的な能力を模倣する
ii.可溶性の形態にて低用量で投与した選択(select)ストラドマーは、コーティングされたIVIGがCD86を上方制御し、iDCでのCD1aの発現を抑制する機能的な能力を模倣する
iii.特定のストラドマーが、可溶性の形態とコーティングされた形態の両方で表現型の変化を誘導でき、G−010などの他のストラドマーは、可溶性の形態であれば表現型の変化を誘導できるが、コーティングされた形態では誘導できない
iv.G−002から形成されたFc断片ストラドマーおよびG−010から形成されたクラスターストラドマーから明らかなように、異なる構造のストラドマーが生物活性となり得る
v.ストラドマー単量体の二量体化によって想定されるよりも大きい構造がタンパク質解析で認められ、これらの多量体構造がIVIGに匹敵する生物活性に相当することがある
vi.二量体化ストラドマー単量体から作製したストラドマーは、複数のFcγ受容体と結合と一致する二価フィットをプラズモン共鳴で示すことができることから、ストラドマーの多量体三次構造の存在を示唆している。
ストラドマーは、凝集免疫グロブリン、特にこれらの免疫グロブリンの凝集Fc断片の生物活性模倣薬である。場合によっては、本明細書に記載の生体模倣薬の熱凝集によって生物活性を高めることが可能である。本発明者らは、本明細書で説明するような熱凝集生体模倣薬が、IVIGと同じくらい強力になり得るという結論に至っている。
Fc断片は、タンパク質をコーティングすることでプラスチックに固定し、それによってコーティングされたIVIGを模倣する生物学的挙動を得る、上述した実験における陽性対照として用いられてきている。また、Fc断片は、リポソーム、ビーズまたはアルブミンなどのコア部分に貼り付けたときなどに、コアストラドマー単位としても使用可能である。さらに、本発明者らは、CHO−S細胞を用いてInvitrogen FreestyleMax一過性形質転換系などの特定の発現系と特定の細胞型でFc断片を培養すると、この断片からタンパク質解析で高次の多量体を形成でき、プラズモン共鳴イメージングで二価結合パターンが得られ、未熟DCアッセイでは可溶性の形態でコーティングされたIVIGに匹敵する強い生物活性が得られることも実証した。したがって、本発明者らは、特定の慎重に制御した条件下では、Fc断片がFc断片ストラドマーを形成するという結論に至っている。この作用は、グリコシル化の変化などの翻訳後修飾による場合がある。
Ficoll Hypaque密度勾配遠心法を利用して、健常なドナーの軟膜からPBMCを単離する。単離後、PBMCをPBSで2回洗浄する。次に、MACS分離カラム(Miltenyi)を用いてCD14+細胞を精製する。精製細胞を計数し、800ug/mlのGM−CSFと5ng/mlのIL−4とを含有するRPMI完全培地2×105/mlに再懸濁させる。次に、6ウェル非組織培養滅菌プレートのウェルに細胞を播種する。CD14+細胞を非組織培養に播種後、飽和量のFcまたはIVIGをコーティングしたか、あるいはこれを使用していないポリスチレンFITCマイクロスフェア(0.52um)を1:1の比で細胞に加え、37℃、5.0%CO2で6日間インキュベートした後、FACSによりマイクロスフェアの貪食を分析する。
IgG1の共通の残基の組が、あらゆるFcγRとの結合に関与していることが明らかになっている。また、IgG1分子の別の残基がFcγRIIおよびFcγRIIIの両方に対する結合に関与していることも実証されている。残基によっては、変化すると1つ以上の受容体の結合を阻害するものもある。興味深いことに、S298A/K334Aの特定の二重変異がFcγIIIaの結合を亢進し、FcγIIbの結合を低下させた。これらの残基は、図16に示すストラドマーコンストラクトについて言及されている(両方のアミノ酸でアスタリスクを使用)。したがって、本発明者らは、部位特異的突然変異誘発を使用して、配列番号17でコードされるが対応するS298A/K334A変異のある構造を有するストラドマー分子を生成することが可能である。
上述した組成物を生成するのに適した多数の発現系が存在する。特に、真核生物ベースの系を採用して、核酸配列またはその対応するポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生することが可能である。このような系の多くが広く一般に市販されている。
実施例1および2で説明した核酸コンストラクトを、天然の状態ではIgを発現しない細胞系にトランスフェクトする。コードされるポリペプチドが、その分泌リーダー配列がゆえに分泌タンパク質として発現されるが、これは通常、細胞から運び出される際に内因性プロテアーゼによって除去されるか、当該技術分野において周知の技術によって後から切断除去できるものである。これらの分泌される免疫学的に活性な生体模倣薬を、タンパク質AまたはHisタグを用いる当該技術分野において周知のクロマトグラフ的な方法で精製し、還元および/または非還元SDS PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)で大きさを確認する。
細菌、昆虫細胞または酵母を含むさまざまな系を用いて特定のタンパク質を大量に生成可能であるが、哺乳類細胞で発現させると、タンパク質のグリコシル化の変更による問題を最小限にすることができる。CHO細胞などの哺乳類細胞が、Ig骨格に融合したさまざまなタンパク質の過剰生成に用いられている。コンストラクトのFcドメインが、タンパク質親和性カラム精製による細胞上清からの以後の精製を可能にするタグになる(Harris, CL, DM Lublin and BP Morgan Efficient generation of monoclonal antibodies for specific protein domains using recombinant immunoglobulin fusion proteins: pitfalls and solutions., J. Immunol. Methods 268:245-258, 2002)。多くの融合タンパク質が、Igの定常領域、具体的にはCH2およびCH3部分Fcドメイン単量体ととインフレームで直接的にクローニングされる。Ig発現対象となるインターフェロンγ受容体細胞外ドメインの発現の特定の例が、機能的活性を有するタンパク質を大量に生成するのに用いられている(Fountoulakis, M, C. Mesa, G. Schmid, R. Gentz, M. Manneberg, M. Zulauf, Z. Dembic and G. Garotta, Interferon gamma receptor extracellular domain expressed as IgG fusion protein in Chinese hamster ovary cells: Purification, biochemical, characterization and stoichiometry of binding, J. Biol. Chem.. 270:3958-3964, 1995)。
ホモ抗体に関してShieldsらが説明している方法と基本的には同じ方法によって、フコースをタンパク質糖鎖に加えるための酵素活性を欠いた突然変異CHO細胞に脱フコシル化Fcドメインを作製することが可能である。これらを用いて、同じ分子のフコシル化型よりもFcγRIII結合親和性の高いストラドマーを発現させる。(Robert L. Shields, et al. Lack of Fucose on Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human Fc RIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. J. Biol. Chem., Jul 2002; 277: 26733-26740 (doi:10.1074/jbc.M202069200))。
上述したように、IVIGの抗炎症活性はFcドメインとFcγRIIIaとの一次相互作用に依存する。これらの相互作用を(SPR)技術で効果的に定量化し、2つの認識されたFcγRIIIaの多型変異体(176V/F)がある免疫学的に活性な生体模倣薬の会合定数と解離定数の両方をキャラクタライズ可能である。本発明者らのFcドメイン単量体対照およびストラドマーコンストラクトの結合親和性と解離を定義するために、176位にV(配列番号33)とF(配列番号31)の両方の多型変異体があるFcγRIIIa HISタグ融合タンパク質を生成する(図20)。これらの配列をpCDNA 3.1に入れ、CHO細胞にトランスフェクトすることが可能である。これらのFcγRIIIa融合タンパク質を親和性Ni2+カラムでトランスフェクト細胞の上清から精製し、タンパク質を精製する。FcγRIIIa融合タンパク質をすべて、cDNAシーケンシングとSDS PAGEの両方でキャラクタライズする。
実施例1にあげたものなどの免疫学的に活性な生体模倣薬の機能を試験するために、in vitroでのアッセイを設計して、天然のFcドメインがin vivoで炎症を抑える機序であると思われる機序を再現する。最近になって、hIVIGがDCの成熟を阻害し、IL−10、IL−12およびTNF−αの分泌を変化させることが実証された(Bayry, J, et al., Inhibition of maturation and function of dendritic cells by intravenous immunoglobulin, Blood 101(2):758-765(2003))。本発明者らのストラドマーは、hIVIGと類似のDCに対する作用に介在する。in vitroでのサイトカイン分泌の変化とDCの成熟阻害が、多くのストラドマーコンストラクトのいくつかの生物学的活性を定義するための有効な手段として機能し得る。上述したストラドマーコンストラクトを以下の実験パラメータでさらに確認してもよい。
特発性血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、喘息、炎症性腸疾患などの多数の自己免疫疾患について、in vivo試験用の当該技術分野において周知の動物モデルが確立されている。Wu GF, Laufer TM. The role of dendritic cells in multiple sclerosis. Curr Neurol Neurosci Rep. 2007 May;7(3):245-52;Targan SR, Karp LC. Defects in mucosal immunity leading to ulcerative colitis. Immunol Rev. 2005 Aug;206:296-305。たとえば、現在ITPの多数のモデルを利用できる。たとえば、Crow AR, et al. IVIG inhibits reticuloendothelial system function and ameliorates murine passive immune thrombocytopenia independent of anti-idiotype reactivity. Br J Haematol. 2001;1 15:679-686を参照のこと。免疫系を調節するよう設計された免疫学的に活性な生体模倣薬を、特定の自己免疫疾患ごとの必要性に応じて、このようなin vivoモデルで確認することが可能である。重要なことに、これらのモデルの多くでは、hIVIGを投与すると、抗炎症作用に関連する偽陽性を目立たなくしたり、これを発生させたりする可能性がある外来種(マウスなど)の抗ヒト抗体応答が起こりやすい。
実験群
1)対照−ITPなし、IVIGなし
2)ITP対照群−2日目から開始してMWReg30を毎晩2ug
3)IVIG前処理群−2日目から開始してIVIGを毎朝40mgとMWReg30を毎晩2ug
4)1012のFcドメインIVに相当するストラドマーを毎朝
5)1011のFcドメインIVに相当するストラドマーを毎朝
6)1010のFcドメインIVに相当するストラドマーを毎朝
7)109のFcドメインIVに相当するストラドマーを毎朝
8)108のFcドメインIVに相当するストラドマーを毎朝
9)107のFcドメインIVに相当するストラドマーを毎朝
10)106のFcドメインIVに相当するストラドマーを毎朝
ITPの他のマウスモデルでは、正常なB細胞機能を欠損したマウスを用いることが可能である。正常なB細胞機能の欠損は、マウスにヒトFc断片またはFc部分断片を投与することで生成されるマウス抗ヒトFc断片抗体のイディオタイプ−抗イディオタイプ作用ならびに、結果としての偽陽性の結果をなくす機能を果たす。B細胞機能の欠損は、たとえば、抗B細胞抗体を投与することで生成可能であるか、あるいは成熟B細胞が欠損したm鎖ノックアウトマウス(Jackson Labs株B6.129S2-Igh6tm1Cgn/J)などの遺伝子改変マウスで発生する。
一次免疫応答の血小板減少性紫斑病の診断と管理に関するExecutive Committee of the American Society of Hematologyの実務ガイドラインなどのITP hIVIG療法の標準的なガイドラインに従う方法で、配列番号17および21でコードされる代表的なストラドマータンパク質を用いるITPの治療プロトコールを利用する。George, JN, et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: a practice guideline developed by explicit methods for the American Society of Hematology. Blood. 1996 Jul 1;88(1):3-40を参照のこと。また、the 2000 guidelines by Italian pediatric hematologists、the 2003 British hematologists guidelines、the 2006 Japanese pediatric hematologists guidelinesも参照のこと。あるいは、治療プロトコールの投与量の約0.1〜約0.001倍の投与量での初期投与段階をITP用のストラドマーIVプロトコールに含むようにしてもよい。低用量の初期段階は、長期的な抗炎症作用を十分に誘導できる状態を保ちつつ、ストラドマー投与によるあらゆる短期的な炎症誘発作用を最小限にするよう設計され、これを次の第二段階で上述した標準投与量に高めて維持する。この別の手法は、ストラドマーのいくつかの実施形態には、FcγRIIaの発現が減少することで、短期的な炎症作用と長期的な抗炎症作用の両方が生じる場合があることを論拠としたものである。1つまたは複数の初期の低用量を使用して、短期的な炎症作用を最小限に抑えつつ、長期的な抗炎症作用を刺激することが可能である。
リポソームなどのコア部分に固定されたFc断片に相当する代表的なストラドマータンパク質を用いるITPの治療プロトコールを、標準的な静脈内IVIGプロトコールでの投与量の約1%から約0.001%の投与量で腹腔内投与して利用する。この別の手法の論拠は、安定した製剤で腹腔に送達される固定Fc断片で構成されるコアストラドマーによって、IVIGよりも実質的に低用量でこれと同様に単球由来のエフェクター細胞に影響する複数のFcドメインが得られる点にある。
2つのストラドボディを構成し、トランスフェクトした。それぞれのストラドボディについて、該当する抗体を発現するハイブリドーマ細胞系由来の全RNAからコードcDNAを合成した。ハイブリドーマ細胞系の樹立については当該技術分野において周知である。BD SMART(商標) RACE増幅キット(Clontech CA)によって、抗体の重鎖領域と軽鎖領域をコードする該当cDNAの増幅を実施した。抗体のさまざまな領域の重鎖および軽鎖をコードするcDNAの生成に、多数の他の方法を利用できる(Sassano, M. et. al., 1994. Nucleic Acids Res. May 11;22(9):1768-9;Jones, S.T., Bendig, M.M., 1991. Biotechnology (NY) Jan: 9(1):88-9)。ストラドボディを生成するには、オーバーラップエクステンションPCRでの連結(HuttonおよびPease)によるか、適当な断片を融合するためのこれに適合する既存の制限部位を利用するかのいずれかの方法で、重鎖可変領域をストラドマーコンストラクトと融合させる。CHO−S細胞でストラドボディタンパク質を発現させ、タンパク質Aカラムアフィニティ精製によって細胞上清から単離する。該当する抗原に対する精製ストラドボディの結合を、この抗原を発現する細胞系を用いるフローサイトメトリー結合研究で確認する。
乳癌療法の標準的なガイドラインに従う方法で、her2/neuエピトープに対する活性を有する市販品のトラスツズマブ由来のFabであるか、またはこれに類似したFabを含む代表的なストラドボディを用いる乳癌用の治療プロトコールを利用する。Romond, EH et. al. Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer. NEJM. 2005 Oct. 20; 353:1673-1684;Seidman, AD et. al. Weekly Trastuzumab and Paclitaxel Therapy for Metastatic Breast Cancer With Analysis of Efficacy by HER2 Immunophenotype and Gene Amplification. Journal of Clinical Oncology. Vol 19, Issue 10 (May), 2001: 2587- 2595;Vogel, CL et. al. Journal of Clinical Oncology. Vol 20, Issue 3 (February), 2002:719-726を参照のこと。
頭頸部癌療法および結腸癌療法用の標準的なガイドラインに従う方法で、EGFRエピトープに対する活性を有する市販品のセツキシマブ由来のFabであるか、またはこれに類似したFabを含む代表的なストラドボディを用いる乳癌用の治療プロトコールを利用できると思われる。Robert, F et. al. Phase I Study of Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibody Cetuximab in Combination With Radiation Therapy in Patients With Advanced Head and Neck Cancer. Journal of Clinical Oncology, Vol 19, Issue 13 (July), 2001: 3234-3243;Bonner, JA et. al. Cetuximab prolongs survival in patients with locoregionally advanced squamous cell carcinoma of head and neck: A phase III study of high dose radiation therapy with or without cetuximab. Journal of Clinical Oncology, 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition).Vol 22, No 14S (July 15 Supplement), 2004: 5507;Shin, DM et. al. Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Therapy with C225 and Cisplatin in Patients with Head and Neck Cancer. Clinical Cancer Research Vol. 7, 12041213, May 2001;Cunningham, D et al. Cetuximab Monotherapy and Cetuximab plus Irinotecan in Irinotecan-Refractory Metastatic Colorectal Cancer. NEJM. Volume 351:337-345, 2004を参照のこと。
発現タンパク質のグリコシル化パターンは、タンパク質が発現される細胞系に左右される。タンパク質の発現と精製で一般に用いられているチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)では、たとえば、ヒト由来であって、同じく内因性タンパク質のタンパク質発現で一般に用いられているHEK293細胞とは異なるグリコシル化パターンが得られる。Fc断片およびクラスターストラドマー単位の結合特性がグリコシル化パターンに影響されることがあるため、CHO以外の細胞系あるいは、Fc断片またはFcドメイン含有ペプチド間の凝集増大を促進するN−グリカンにグリコシル化パターンが変わるように遺伝子操作されたCHOを含む細胞系での発現によって、多量体化を増し、結果として発現ペプチドの生物活性を高めることが可能である。グリコシル化パターンが変わってFc断片または選択したクラスターストラドマー単位の多量体化が増すと、免疫学的に活性な生体模倣薬がhIVIGの作用を模倣する機能が強まることがある。
この実験で使用予定のヒトIgG1由来のrFCF断片を標準的な組換えタンパク質技術で作製した。ヒトrFCFの2つの鎖は各々、ヒトIgG1重鎖のヒンジ領域(15アミノ酸)、CH2ドメイン(110アミノ酸)、CH3ドメイン(106アミノ酸)で構成されていた。
(1)CD14+細胞;GM−CSF;IL−4;LPSなし(「7d−LPS」)
(2)CD14+細胞:GM−CSF;IL−4;LPS(「7d+LPS」)
(3)CD14+細胞;GM−CSF;IL−4;LPS;コーティングされたIVIG(「cIVIG」)
(4)CD14+細胞;GM−CSF;IL−4;LPS;可溶性IVIG(「sIVIG」)
(5)CD14+細胞;GM−CSF;IL−4;LPS;コーティングされたrFcF(「cFc」)
(6)CD14+細胞;GM−CSF;IL−4;LPS;可溶性rFcF(「sFc」)
(7)CD14+細胞;GM−CSF;IL−4;LPS(「対照」)
実施例21で説明したようにして健常なヒトドナーのヒトPBMCからCD14+細胞を精製し、コーティングされたIVIGまたは可溶性IVIGの存在下または非存在下で、前の実施例で示した濃度にてGM−CSFおよびIL−4とともに37℃で6日間培養する。細胞を採取した後、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)コンジュゲート抗D抗体をコーティングしていないまたはコーティングしたRho陽性のヒト赤血球とともに、37℃または4℃のいずれかで2時間インキュベートする。赤血球とのインキュベーション後、APCコンジュゲートCD1a用にCD14+細胞を染色する。次に、側方散乱光(SSC−A)、前方散乱光(FSC−A)、FITC蛍光(FITC−A)、APC蛍光(CD1a)を測定する二次元FFCで貪食を評価する。
前の実施例で説明したようにして、健常なヒトドナーの血液からCD14+細胞を単離する。次に、これらの細胞を、可溶性IVIGおよびコーティングされたIVIGの存在下または非存在下で、GM−CSFおよびIL−4とともに37℃で6日間培養する。すべての試薬の濃度は上述したとおりである。次に、細胞を採取し、96ウェルのマイクロタイター組織培養プレートのウェルに、さまざまな数(最大用量は1ウェルあたり2.5×104)で蒔いた。CD14+細胞を単離したドナーとはHLA不適合である第2のヒトドナーのPBMCからCD3+T細胞を精製する。96ウェルの組織培養プレートの各ウェルにT細胞を加える(1ウェルあたりT細胞105個)。5日間の共培養後、各培養ウェルに1μCiの3H−チミジンを加える。次に、培養をさらに6時間インキュベートし、3H−チミジンの取り込み(「cpm」)を、培養での細胞増殖の度合いを示す指標として測定する。3通りのiDC抗原細胞個体群を試験する。1つは、GM−CSFおよびIL−4のみを用いた培養によって生成したもの、もう1つはGM−CSF、IL−4、コーティングされたIVIGを用いた培養によって生成したもの、残りはGM−CSF、IL−4、可溶性IVIGを用いた培養によって生成したものである。
CD14+細胞、GM−CSFおよびIL−4と、rFcF(コーティングされたものまたは可溶性)またはIVIG(コーティングされたものまたは可溶性)のいずれかとを含む培養を、前の実施例で説明した条件下で準備する。細胞表面マーカーの発現、食細胞能力または同種異系MLRを刺激する能力の観点で細胞を試験する代わりに、細胞が産生するサイトカインを測定する。コーティングされたrFcFが、IVIGと同様であるが可溶性rFcFとは異なる方法で、細胞によるサイトカイン産生を調節すると想定される。よって、コーティングされたrFcFに細胞を曝露することで、炎症反応を阻害するサイトカイン(たとえば、インターロイキン4、インターロイキン−6、インターロイキン−12)のレベルが高まると想定される。さらに、コーティングされたrFcFに細胞を曝露すると、炎症反応を強めるサイトカイン(たとえば、インターフェロン、インターロイキン−23および腫瘍壊死因子−I)の細胞による産生レベルが低下すると想定される。
標準的なクローニングおよび組換えタンパク質発現技術を用いて、マウスIgG2a由来の組換えFc断片(rFcF)を産生した。マウスrFcFの2つの鎖は各々、マウスIgG2a重鎖のヒンジ領域(21アミノ酸)と、CH2ドメイン(110アミノ酸)と、CH3ドメイン(107アミノ酸)とで構成されていた。マウスIgG2aは、プレートウェルの壁面と底面にコーティングした場合に、ヒトiDCアッセイにおいて活性であった。
参考文献の一覧
以下の参考文献全文を本明細書に援用する。
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22. 米国特許出願公開第20060074225号
Claims (37)
- 2つ以上の多量体化クラスターストラドマー単位を含むクラスターストラドマーであって、前記クラスターストラドマー単位の各々が、アミノ末端からカルボキシ末端に
(a)前記クラスターストラドマー単位を多量体化して前記クラスターストラドマーを形成する、少なくとも1つのIgG2のヒンジ多量体化用領域、及び
(b)IgG1、IgG3またはIgG4からのCH2及びCH3ドメインを含む、少なくとも1つのFcドメイン、を含み、
前記クラスターストラドマーが少なくとも2つのFc受容体と特異的に結合することができる、クラスターストラドマー。 - 前記クラスターストラドマーが抗原結合Fabドメインを含まない、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- 前記FcドメインがIgG1、IgG3またはIgG4からのIgGヒンジドメインをさらに含む、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- 2つの多量体化クラスターストラドマー単位を含む、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- 3つの多量体化クラスターストラドマー単位を含む、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- 4つの多量体化クラスターストラドマー単位を含む、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- 5つ以上の多量体化クラスターストラドマー単位を含む、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- 前記クラスターストラドマー単位の少なくとも1つが、2つ以上のFcドメインを含む、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- 前記クラスターストラドマー単位の各々が、2つ以上のFcドメインを含む、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- 前記クラスターストラドマー単位の各々が、少なくとも1つのFc受容体と特異的に結合することができる、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- 前記少なくとも1つのFc受容体がヒトFcγRI、ヒトFcγRII、ヒトFcγRIII、ヒトFcγRIV、FcRNまたはこれらの非ヒト等価物である、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- 前記FcドメインがIgG1のヒンジ、IgG1のCH2及びIgG1のCH3を含む、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- 配列番号:61に記載の配列のタンパク質のホモ二量体をそれぞれ含むクラスターストラドマー単位を含む、請求項1に記載のクラスターストラドマー。
- ホモ二量体型のクラスターストラドマー単位であって、ホモ二量体の各単量体が、アミノ末端からカルボキシ末端に
(a)IgG2ヒンジを含む多量体化用ドメイン単量体であって、ホモ二量体化されるときに、前記クラスターストラドマー単位を多量体化することができる多量体化用ドメイン単量体、及び
(b)IgG1のヒンジ単量体、IgG1のCH2単量体、及びIgG1のCH3単量体を含むFcドメイン単量体、を含み、
前記ホモ二量体が、少なくとも1つのFc受容体と特異的に結合することができ、多量体化して2つ以上のFc受容体と特異的に結合することができる化合物を形成する、ホモ二量体型のクラスターストラドマー単位。 - ホモ二量体の各単量体が配列番号:61に記載の配列のタンパク質を含む、請求項14に記載のホモ二量体型のクラスターストラドマー単位。
- クラスターストラドマー単位の単量体タンパク質をコードする配列を含む組換え核酸分子であって、前記クラスターストラドマー単位の単量体タンパク質が、アミノ末端からカルボキシ末端に
(a)前記クラスターストラドマー単位を多量体化して前記クラスターストラドマーを形成する、少なくとも1つのIgG2のヒンジ多量体化用領域、及び
(b)IgG1、IgG3またはIgG4からのCH2及びCH3ドメインを含む、少なくとも1つのFcドメイン、を含み、
前記クラスターストラドマーが少なくとも2つのFc受容体と特異的に結合することができる、組換え核酸分子。 - 前記IgG1Fcドメインをコードする配列が、配列番号:1に記載の配列を含む、請求項16に記載の組換え核酸分子。
- 前記IgG2のヒンジ多量体化用領域をコードする配列が、配列番号:11に記載の配列を含む、請求項16に記載の組換え核酸分子。
- 前記IgG1Fcドメインをコードする配列が配列番号:1に記載の配列を含み、前記IgG2のヒンジ多量体化用領域をコードする配列が配列番号:11に記載の配列を含む、請求項16に記載の組換え核酸分子。
- 前記IgG1Fcドメインが配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の組換え核酸分子。
- 前記IgG2のヒンジ多量体化用領域が配列番号:36のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の組換え核酸分子。
- 前記IgG1Fcドメインが配列番号:2のアミノ酸配列を含み、前記IgG2のヒンジ多量体化用領域が配列番号:36のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の組換え核酸分子。
- 請求項16から22のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む発現ベクター。
- 前記クラスターストラドマー単位が配列番号:61に記載の配列を含む、請求項16に記載の組換え核酸分子。
- 請求項16から24のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む宿主細胞。
- クラスターストラドマー単位単量体を発現する方法であって、請求項25に記載の宿主細胞を培養し、産生された前記クラスターストラドマー単位を回収する工程を含む、方法。
- 前記宿主細胞が哺乳類細胞、昆虫細胞または酵母細胞である、請求項26に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞がCHO細胞、HEK 293細胞、BHK細胞、マウスNSO細胞またはマウスSP2/0細胞である、請求項27に記載の方法。
- 炎症性疾患、癌、自己免疫疾患またはリウマチ性疾患プロセスの治療用医薬品の製造のための、クラスターストラドマー単位を含むクラスターストラドマーの使用であって、前記クラスターストラドマー単位が、配列番号:61に記載の配列のタンパク質のホモ二量体を含む、使用。
- 前記炎症性疾患が、血液免疫学的プロセス、神経免疫学的プロセス、筋骨格免疫学的疾患プロセス、皮膚免疫学的疾患プロセス、リウマチ性疾患プロセスまたは胃腸免疫学的疾患プロセスである、請求項29に記載の使用。
- 前記血液免疫学的プロセスが、特発性血小板減少性紫斑病、同種免疫性/自己免疫性血小板減少症、後天性免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、後天性抗第VIII因子自己免疫疾患、後天性フォンウィルブランド病、意義不明の高ガンマグロブリン血症、全身性血管炎、血栓性血小板減少性紫斑病またはエバンス症候群である、請求項30に記載の使用。
- 前記神経免疫学的プロセスが、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、ギラン・バレー症候群、IgM−M蛋白血症を伴う脱髄性ニューロパチー、ランバート・イートン筋無力症候群、抗/GM1抗体を伴う下位運動ニューロン症候群、脱髄、視神経炎、全身硬直症候群、抗体Yo抗体陽性傍腫瘍性小脳変性症、腫瘍随伴脳脊髄症、抗Hu抗体陽性感覚性ニューロパチー、脊髄炎、脊髄症、自己免疫性糖尿病性ニューロパチー、急性特発性自律神経ニューロパチーまたは重症筋無力症である、請求項30に記載の使用。
- パジェット病、ゴーシェ病、クッシング症候群、サルコイドーシス、強直性脊椎炎または他の脊椎関節症の治療用医薬品の製造のための、クラスターストラドマー単位を含むクラスターストラドマーの使用であって、前記クラスターストラドマー単位が、配列番号:61に記載の配列のタンパク質のホモ二量体を含む、使用。
- 前記自己免疫疾患が、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症または1型糖尿病である、請求項29に記載の使用。
- 前記リウマチ性疾患プロセスが、川崎病、フェルティ症候群、ANCA陽性血管炎、特発性多発性筋炎、皮膚筋炎または若年性特発性関節炎である、請求項30に記載の使用。
- 前記筋骨格免疫学的疾患プロセスが、封入体筋炎、壊疽性筋膜炎、炎症性ミオパチー、抗デコリン(BJ抗原)ミオパチー、傍腫瘍性壊死性ミオパチー、X連鎖性空胞性ミオパチー、ペナシラミン誘導多発性筋炎または心筋症である、請求項30に記載の使用。
- 前記胃腸免疫学的疾患プロセスが、反応性関節炎、クローン病、ホイップル病、潰瘍性大腸炎または硬化性胆管炎である、請求項30に記載の使用。
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