BRPI0812248B1 - Estradômero agrupado - Google Patents

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BRPI0812248B1
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BRPI0812248-2A
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Scott E. Strome
Dan H. Schulze
David S. Block
Henrik Olsen
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Gliknik Inc.
University Of Maryland, Baltimore
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Publication of BRPI0812248B1 publication Critical patent/BRPI0812248B1/pt
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Abstract

agentes de ligação ao receptor fc de região constante de imunoglobulina. a presente invenção refere-se a compostos de reposição ivig que são derivados da criação recombinante e/ou bioquímica de biomimético(s) imunologicamente ativo(s). esses compostos de reposição são, então, selecionados in vitro para avaliar eficiência de cada composto de reposição na modulação de função imune. compostos de reposição particulares são selecionados com relação à validação e otimização de administração/dosagem in vivo. finalmente, os compostos de reposição são usados para tratar uma ampla faixa de doenças, incluindo doenças inflamatórias e autoimunes.

Description

ESTRADÔMERO AGRUPADO ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se, de modo geral, aos campos de imunologia, inflamação e imunologia de tumor. Mais especificamente, a presente invenção refere-se à moléculas biologicamente ativas compreendendo domínios Fc de imunoglobulina, composições compreendendo tais biomiméticos e métodos de uso de tais biomiméticos.
[0002] A invenção também refere-se ao tratamento e profilaxia de condições patológicas mediadas por células derivadas de monócito e, mais particularmente, ao uso de porções funcionais estabilizadas de fragmentos Fc de IgG para tal tratamento e profilaxia.
Descrição da Técnica Antecedente
[0003] Produtos de imunoglobulina de plasma humano têm sido usados desde o início da década de 1950 para tratar distúrbios de deficiência imune e, mais recentemente e mais comumente, para doenças autoimunes e inflamatórias.
[0004] Inicialmente, produtos de globulina imune foram administrados através de injeção intramuscular. Mais recentemente, globulina imune intravenosa (IVIG) tem sido usada e inicialmente foi mostrado que era eficaz no tratamento da doença autoimune púrpura trombocitopênica idiopática (ITP) (Imbach P, Barandun S, dApuzzo V. e colaboradores: High-dose intravenous gammaglobulin for idiopathic thrombocytopenic purpura in childhood. Lancet 6 de Junho de 1981; 1(8232): 1228-31). IVIG humana (referida aqui como "hIVIG") é uma formulação de produtos de imunoglobulina G (IgG) purificada, estéril, apenas com quantidades pequenas e variáveis de imunoglobulina A (IgA) ou imunoglobulina M (IgM) (veja, por exemplo, Rutter A, Luger TA: High-dose intravenous immunoglobulins: an approach to treat severe immune-mediated and autoimmune diseases of the skin. J Am Acad Dermatol., Junho de 2001; 44(6): 1010-24). Hoje, o único uso clínico mais comum de hIVIG é no tratamento de ITP.
[0005] Embora o hIVIG tenha sido um tratamento clínico eficaz, existem muitas deficiências com relação às formulações de hIVIG, incluindo o potencial por esterilidade inadequada, a presença de impurezas, falta de disponibilidade e variação lote a lote. Em particular, preparados de hIVIG podem variar grandemente quanto a seu teor de imunoglobulina A (IgA), o que pode ser de preocupação porque IgA pode causar reações alérgicas e anafiláticas em recipientes IgA-deficientes.
[0006] Em vista dos aspectos negativos da hIVIG, há uma necessidade por um meio aprimorado de tratamento de doenças autoimunes e inflamatórias.
[0007] Além disso, múltiplas condições patológicas de uma ampla variedade de tipos são mediadas por células derivadas de monócitos. Um agente terapêutico e/ou profilático único para uso em muitas, se não todas, as condições seria inestimável.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] A propriedades imunorregulatórias da IVIG residem no domínio Fc de moléculas de IgG. Por exemplo, em modelos de ITP em murino, IVIG modificada e o fragmento Fc isoladamente demonstram eficácia terapêutica na restauração de contagens de plaquetas, enquanto que fragmentos Fab de IVIG isolados não são terapêuticos (Samuelsson, A., Towers, T.L. & Ravetch, J.V. Anti-inflammatory Activity of IVIG Mediated Through of the Inhibitory Fc Receptor. Science 291, 484-486 (2001)). Além disso, o Fc, mas não fragmentos Fab de IVIG, também é terapeuticamente eficaz no tratamento de púrpura trombocitopênica idiopática em crianças e (Follea, G. e colaboradores, Intravenous plasmin-treated gammaglobulin therapy in idiopathic thrombocytopenic purpura. Nouv Rev Fr Hematol 27, 5-10 (1985); Solal-Celigny, P., Bernard, J., Herrera, A. & Biovin, P. Treatment of adult autoimmune thrombocytopenic purpura com high-dose intravenous plasmin-cleaved gammaglobulins. Scand J Haematol 31, 39-44 (1983); Debre, M. & Bonnet, M.-C. Infusion of Gcgamma fragments for treatment of children with acute immune thrombocytopenic purpura. Lancet 342, 945-49 (1993); Burdach, S.E., Evers, K. & Geurson, R. Treatment of acute idiopathic thrombocytopenic purpura of childhood with intravenous immunoglobulin G: Comparative efficacy of 7S and 5S preparations. J Pediatr 109, 770-775 (1986)).
[0009] O efeito terapêutico de IVIG é inicialmente medido através do receptor Fc gama (FcγR) e conta com cross-talk de macrófrago-Célula Dendrítica (DC) para seus efeitos tolerogênicos a longo prazo. O FcγRIIIa exerce um papel essencial na fase iniciadora e o FcγRIIb é requerido para a fase efetuadora em modelos de ITP em murino (Samuelsson, A., Towers, T.L. & Ravetch, J.V. Anti-inflammatory Activity of IVIG Mediated Through of the Inhibitory Fc Receptor. Science 291, 484-486 (2001); Siragam, V. e colaboradores, Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fc [gamma] receptors on dendritic cells. Nat Med 12, 688 (2006)). Similarmente, estudos humanos demonstram que anticorpos antirreceptor Fcγ são eficazes no tratamento de IPT resistente (Clarkson, S. e colaboradores, Treatment of refractory immune thrombocytopenic purpura with an anti-Fc gamma-receptor antibody. N Engl J Med 314, 1236-1239 (1986)). De modo importante, efeitos tolerogênicos a longo prazo são mediados por interações célula-célula, assim como transferência adotiva de DCs IVIG-tratadas é eficaz no tratamento de modelos de ITP em murino (Siragam, V. e colaboradores, Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fc[gamma] receptors on dendritic cells. Nat Med 12, 688 (2006)).
[00010] Os efeitos imunomodulatórios de IVIG requerem a agregação do FcγR. Agregação do FcγR é mediada por dímeros de IgG presentes em IVIG (5-15% da IVIG total) (Bleeker, W.K. e colaboradores, Vasoactive side effects of intravenous immunoglobulin preparations in a rat model and their treatment with recombinant platelet-activating factor acetylhydrolase. Blood 95, 1856-1861 (2000)). Por exemplo, em um modelo de ITP em murino, o tratamento com IVIG com um alto teor de "dímeros" (dímeros de moléculas de imunoglobulina inteiras) intensificou as contagens de plaquetas, enquanto que "monômeros" de IVIG (moléculas de imunoglobulina inteiras) não foi eficaz (Teeling, J.L. e colaboradores, Therapeutic efficacy of intravenous immunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies in experimental immune thrombocytopenia. Blood 98, 1095-1099 (2001)). Além disso, a despeito do fato de que fracionamento em polietileno glicol e resina de troca de íons são rotineiramente usados na fabricação de IVIG para remover agregados de IgG, a eficácia clínica da IVIG se correlaciona com a presença de dímeros no soro do paciente (Augener, W., Friedman, B. & Brittinger, G. Are aggregates of IgG the effective part of high-dose immunoglobulin therapy in adult idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)? Blut 50, 249-252 (1985)). De modo importante, o percentual de dímeros também se correlaciona com efeitos colaterais vasoativos, os quais são tratáveis com acetilhidrolase (Bleeker, W.K. e colaboradores, Vasoactive side effects of intravenous immunoglobulin preparations in a rat model and their treatment with recombinant platelet-activating factor acetylhydrolase. Blood 95, 1856-1861 (2000)).
[00011] A presente invenção refere-se à moléculas biomiméticas biologicamente ativas, composições compreendendo as mesmas e métodos de uso das mesmas. Esses biomiméticos têm ampla aplicação para tratamento de distúrbios imunológicos e inflamatórios incluindo, mas não limitado a, doenças autoimunes e eles têm utilidade como agentes de bioimunoterapia para câncer. Ainda, alguns desses biomiméticos também têm utilidade como reagentes, tal como para uso em ensaios imunológicos para testagem de função de células imunes e no diagnóstico de doenças. Além disso, os biomiméticos e composições da presente invenção têm a vantagem de superar as limitações acima listadas da hIVIG. A invenção também refere-se ao tratamento e profilaxia de condições patológicas mediadas por células derivadas de monócito e, mais particularmente, ao uso de porções funcionais estabilizadas de fragmentos Fc de IgG para o tratamento e profilaxia.
[00012] Em uma primeira modalidade, a presente invenção é dirigida a estradômeros seriais isolados compreendendo dois ou mais monômeros associado, em que cada um dos monômeros de estradômero compreende dois ou mais domínios Fc, em que a associação dos dois ou mais monômeros de estradômero forma dois ou mais domínios Fc e em que o estradômero serial se liga a especificamente a um primeiro receptor Fcγ através de um primeiro dos dois ou mais domínios Fc e a um segundo receptor Fcγ através de um segundo dos dois ou mais domínios Fc. Em uma modalidade preferida, os dois ou mais monômeros de estradômero são associados através de uma ligação covalente, uma ligação de dissulfeto ou uma ligação cruzada química.
[00013] Em uma modalidade preferida dos estradômeros seriais isolados da presente invenção, os estradômeros seriais isolados são compreendidos de dois monômeros de estradômero associados. Em uma modalidade igualmente preferida, os estradômeros seriais isolados são compreendidos de dois monômeros de estradômero associados, em que ambos os monômeros de estradômero compreendem dois monômeros com domínio Fc e em que a associação dos dois monômeros de estradômero forma dois domínios Fc. Em um primeiro exemplo particular dessas modalidades dirigidas a estradômeros seriais isolados, pelo menos um dos dois domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG e um domínio CH2 de IgG. Em um segundo exemplo particular, cada um dos dois domínios Fc compreende, independentemente, uma dobradiça de IgG e um domínio CH2 de IgG. Em um terceiro exemplo particular, pelo menos um dos dois domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG, um domínio CH2 de IgG e um domínio CH3 de IgG. Em um quarto exemplo particular, cada um dos dois domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG, um domínio CH2 de IgG e um domínio CH3 de IgG. Em um quinto exemplo particular, pelo menos um dos dois domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG1 ou um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG1 ou um domínio CH3 de IgG3. Em um sexto exemplo particular, pelo menos um dos dois domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3 e um domínio CH2 de IgG1 ou um domínio CH2 de IgG3. Em um sétimo exemplo particular, cada um dos dois domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG1 ou um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG1 ou um domínio CH3 de IgG3. Em um oitavo exemplo particular, cada um dos dois domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG1. Em um nono exemplo particular, cada um dos dois domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG3. Em um décimo exemplo particular, cada um dos dois domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG3.
[00014] Também, nessa primeira modalidade, os dois ou mais domínios Fc são, cada um, da mesma classe Fc de imunoglobulina e a classe Fc de imunoglobulina é selecionada do grupo consistindo em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Alternativamente, os dois ou mais domínios Fc são, cada um, de uma classe Fc diferente e a referida classe Fc de imunoglobulina é selecionada do grupo consistindo em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
[00015] Ainda, nessa primeira modalidade, os primeiro e segundo receptores Fcγ são, cada um independentemente, um receptor FcγI, um receptor FcγII, um receptor FcγIII ou um receptor FcγIV. De preferência, os primeiro e segundo receptores Fcγ são, cada um, um receptor FcγIIIa.
[00016] Em uma segunda modalidade, a presente invenção é dirigida a estradômeros seriais isolados compreendendo dois monômeros de estradômero associados, em que cada um dos monômeros de estradômero compreende dois monômeros com domínio Fc, em que a associação dos dois monômeros de estradômero forma dois domínios Fc, em que cada um dos referidos dois domínios Fc compreende, independentemente, uma dobradiça de IgG, um domínio CH2 de IgG e um domínio CH3 de IgG e em que o estradômero serial se liga especificamente a um primeiro receptor Fcγ através de um primeiro dos dois domínios Fc e a um segundo receptor Fcy através de um segundo dos dois domínios Fc. Em uma modalidade preferida, os dois ou mais monômeros de estradômero são associados através de uma ligação covalente, uma ligação de dissulfeto ou ligação cruzada química.
[00017] Em um primeiro exemplo particular dessa segunda modalidade, os dois domínios Fc são, cada um, da mesma classe Fc de imunoglobulina e a classe Fc de imunoglobulina é selecionada do grupo consistindo em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em um segundo exemplo particular, os dois domínios Fc são, cada um, de uma classe Fc de imunoglobulina diferente e a referida classe Fc de imunoglobulina é selecionada do grupo consistindo em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em um terceiro exemplo particular, pelo menos um dos domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG e um domínio CH2 de IgG. Em um quarto exemplo particular, cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG e um domínio CH2 de IgG. Em um quinto exemplo particular, pelo menos um dos domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG, um domínio CH2 de IgG e um domínio CH3 de IgG. Em um sexto exemplo particular, cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG, um domínio CH2 de IgG e um domínio CH3 de IgG. Em um sétimo exemplo particular, pelo menos um dos domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG1 ou um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG1 ou um domínio CH3 de IgG3. Em um oitavo exemplo particular, cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG1 ou um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG1 ou um domínio CH3 de IgG3. Em um nono exemplo particular, cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG1. Em um décimo exemplo particular, cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG3. Em um décimo primeiro exemplo particular, cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG3.
[00018] Em uma terceira modalidade, a presente invenção é dirigida a estradômeros seriais isolados ainda compreendendo um domínio Fc, em que cada um dos monômeros de estradômero compreende uma cadeia pesada de fragmento Fab e dois monômeros com domínio Fc, em que a cadeia pesada de fragmento Fab está em uma posição amino terminal ou carbóxi terminal aos monômeros com domínio Fc, em que uma cadeia leve de fragmento Fab está independentemente associada a cada cadeia pesada de fragmento Fab e em que o domínio Fab tem atividade de ligação a antígeno. Em uma modalidade preferida, cada um dos monômeros de estradômero ainda compreende um monômero de dobradiça de imunoglobulina e em que o monômero de dobradiça de imunoglobulina está em uma posição entre a cadeia pesada de fragmento Fab e os dois monômeros com domínio Fc.
[00019] Em uma quarta modalidade, a presente invenção é dirigida a estradômeros centrais compreendendo uma porção central ligada a duas ou mais unidades de estradômero central, em que cada uma das duas ou mais unidades de estradômero central compreende pelo menos um domínio Fc e em que cada uma das unidades de estradômero central é independentemente selecionada do grupo consistindo em:
  • (a) um fragmento Fc, em que o referido fragmento Fc compreende dois monômeros de fragmento Fc associados, em que cada um dos referidos monômeros de fragmento Fc compreende um monômero com domínio Fc e em que a associação dos dois monômeros de fragmento Fc forma um domínio Fc,
  • (b) um fragmento parcial Fc, em que o referido fragmento parcial Fc compreende dois monômeros de fragmento Fc parcial associados, em que cada um dos referidos monômeros de fragmento Fc parcial compreende um monômero com domínio Fc e em que a associação dos dois monômeros de fragmento Fc parcial forma um domínio Fc,
  • (c) um domínio Fc, em que o referido domínio Fc compreende dois monômeros com domínio Fc associados e em que a associação dos dois monômeros com domínio Fc forma um domínio Fc,
  • (d) um estradômero serial, em que o referido estradômero serial compreende dois ou mais monômeros de estradômero associados, em que cada um dos referidos monômeros de estradômero compreende dois ou mais monômeros com domínio Fc e em que a associação dos dois ou mais monômeros de estradômero forma dois ou mais domínios Fc, e
  • (e) um estradômero agrupado, em que o referido estradômero agrupado compreende duas ou mais unidades de estradômero agrupado multimerizadas, em que cada uma das referidas unidades de estradômero agrupado compreende uma região de multimerização e pelo menos um domínio Fc, em que cada uma das referidas unidades de estradômero agrupado compreende dois monômeros de unidade de estradômero agrupado associados, em que cada um dos referidos monômeros de unidade de estradômero agrupado compreende um monômero de região de multimerização e pelo menos um monômero com domínio Fc, em que a associação dos dois monômeros de unidade de estradômero agrupado forma uma região de multimerização e pelo menos um domínio Fc e em que as regiões de multimerização das duas ou mais unidades de estradômero agrupado multimeriza para formar o estradômero agrupado, e
em que o estradômero se liga especificamente a um primeiro receptor Fcγ através de uma primeira de duas ou mais unidades de estradômero central e a um segundo receptor Fcγ através de uma segunda de duas ou mais unidades de estradômero central.
[00020] De preferência, nessa quarta modalidade, a porção central é selecionada do grupo consistindo em uma cadeia J de imunoglobulina, albumina, lipossoma, glóbulo, peptídeo e polietileno glicol.
[00021] Em modalidades preferidas dirigidas a estradômeros centrais, as duas ou mais unidades de estradômero central são, cada uma independentemente, um fragmento Fc. Alternativamente, as duas ou mais unidades de estradômero central são, cada uma independentemente, um estradômero serial.
[00022] Em uma outra modalidade preferida dirigida a estradômeros central, o estradômero central compreende duas unidades de estradômero central, em que cada uma das duas unidades de estradômero central é, cada uma independentemente, um estradômero serial, em que o estradômero serial compreende dois monômeros de estradômero associados, em que ambos os referidos monômeros de estradômero compreende dois monômeros com domínio Fc e em que a associação dos dois monômeros de estradômero forma dois domínios Fc. Em um primeiro exemplo particular dessa modalidade, pelo menos um dos domínios Fc das duas ou mais unidades de estradômero central compreende uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG1 ou um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG1 ou um domínio CH3 de IgG3. Em um segundo exemplo particular, pelo menos um dos domínios Fc das duas ou mais unidades de estradômero central compreende uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3 e um domínio CH2 de IgG1. Em um terceiro exemplo particular, cada um dos domínios Fc das duas ou mais unidades de estradômero central compreende independentemente uma dobradiça de IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG1. Em um quarto exemplo particular, pelo menos um dos domínios Fc das duas ou mais unidades de estradômero central compreende uma dobradiça de IgG e um domínio CH2 de IgG. Em um quinto exemplo particular, cada um dos domínios Fc das duas ou mais unidades de estradômero central compreende independentemente uma dobradiça de IgG e um domínio CH2 de IgG. Em um sexto exemplo particular, cada um dos domínios Fc das duas ou mais unidades de estradômero central compreende independentemente uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG3. Em um sétimo exemplo particular, cada um dos domínios Fc das duas ou mais unidades de estradômero central compreende independentemente uma dobradiça de IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG3.
[00023] Nessa modalidade, os primeiro e segundo receptores Fcγ são, cada um independentemente, um receptor FcγI, um receptor FcγII, um receptor FcγIII ou um receptor FcγIV. De preferência, os primeiro e segundo receptores Fcγ são, cada um, receptores FcγIIIa.
[00024] Em uma quinta modalidade, a presente invenção é dirigida a estradômeros agrupados compreendendo duas ou mais unidades de estradômero agrupado multimerizadas, em que cada das unidades de estradômero agrupado compreende uma região de multimerização e pelo menos um domínio Fc, em que cada das unidades de estradômero agrupado compreende dois monômeros de unidade de estradômero agrupado associados, em que cada um dos monômeros de unidade de estradômero agrupado compreende um monômero de região de multimerização e pelo menos um monômero com domínio Fc, em que a associação dos dois monômeros de unidade de estradômero agrupado forma uma região de multimerização e pelo menos um domínio Fc, em que as regiões de multimerização das duas ou mais unidades de estradômero agrupado multimeriza para formar o estradômero agrupado e em que o estradômero agrupado se liga especificamente a um primeiro receptor Fcγ através de um primeiro domínio Fc e a um segundo receptor Fcγ através de um segundo domínio Fc.
[00025] Em modalidades preferidas, a região de multimerização é selecionada do grupo consistindo em uma dobradiça de IgG2, um domínio CH2 de IgE, um zíper de leucina, um zíper de isoleucina e um dedo de zinco.
[00026] Em uma outra modalidade preferida, os estradômeros agrupados compreendendo dois, três, quatro ou cinco unidades de estradômero agrupado multimerizadas.
[00027] Em um primeiro exemplo particular dessa quinta modalidade, pelo menos um dos domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG1 ou um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG1 ou um domínio CH3 de IgG3. Em um segundo exemplo particular, cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG1. Em um terceiro exemplo particular, pelo menos um dos domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG e um domínio CH2 de IgG. Em um quarto exemplo particular cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG e um domínio CH2 de IgG. Em um quinto exemplo particular, cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG3. Em um sexto exemplo particular, cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG3. Em um sétimo exemplo particular, cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG, um domínio CH2 de IgG e um domínio CH3 de IgG. Em um oitavo exemplo particular, pelo menos uma das unidades de estradômero agrupado compreende dois ou mais domínios Fc. Em um nono exemplo particular, cada uma das unidades de estradômero agrupado compreende dois ou mais domínios Fc.
[00028] Nessa modalidade, os primeiro e segundo receptores Fcγ são, cada um independentemente, um receptor FcγI, um receptor FcγII, um receptor FcγIII ou um receptor FcγIV. De preferência, os primeiro e segundo receptores Fcγ são, cada um, um receptor FcγIIIa.
[00029] Em uma sexta modalidade, a presente invenção é dirigida a estradocorpos compreendendo dois ou mais monômeros de estradômero associados e um domínio Fab, em que cada um dos monômeros de estradômero compreende uma cadeia pesada de fragmento Fab e dois ou mais monômeros com domínio Fc, em que a cadeia pesada de fragmento Fab está em uma posição amino terminal ou carbóxi terminal aos dois ou mais monômeros com domínio Fc, em que a associação dos dois ou mais monômeros de estradômero forma dois ou mais domínios Fc, em que uma cadeia leve de fragmento Fab está independentemente associada com a cadeia pesada de fragmento Fab de cada monômero de estradômero, em que o domínio Fab tem atividade de ligação a antígeno e em que o estradocorpo se liga especificamente a um primeiro receptor Fcγ através de um primeiro dos dois ou mais domínios Fc e a um segundo receptor Fcγ através de um segundo dos dois ou mais domínios Fc.
[00030] Em modalidades preferidas, os dois ou mais monômeros de estradômero estão associados através de uma ligação covalente, uma ligação de dissulfeto ou ligação cruzada química.
[00031] Em uma outra modalidade preferida, cada um dos referidos monômeros de estradômero dos estradocorpos ainda compreende um monômero de dobradiça de imunoglobulina e em que o monômero de dobradiça de imunoglobulina está em uma posição entre a cadeia pesada de fragmento Fab e os dois monômeros com domínio Fc.
[00032] Em uma modalidade particular, o estradocorpo compreende dois monômeros de estradômero associados, em que cada um dos referidos monômeros de estradômero compreende uma cadeia pesada de fragmento Fab e dois monômeros com domínio Fc e em que a associação dos dois monômeros de estradômero forma dois domínios Fc. Em um primeiro exemplo particular dessa modalidade, pelo menos um dos dois domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG, um domínio CH2 de IgG e um domínio CH3 de IgG. Em um segundo exemplo particular, cada um dos dois domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG, um domínio CH2 de IgG e um domínio CH3 de IgG. Em um terceiro exemplo particular, pelo menos um dos dois domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG e um domínio CH3 de IgG. Em um quarto exemplo particular cada um dos dois domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG e um domínio CH3 de IgG. Em um quinto exemplo particular, pelo menos um dos dois domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG1 ou um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG1 ou um domínio CH3 de IgG3. Em um sexto exemplo particular, cada um dos dois domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG1 ou um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG1 ou um domínio CH3 de IgG3. Em um sétimo exemplo particular, cada um dos dois domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG1. Em um oitavo exemplo particular, cada um dos dois domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG3. Em um nono exemplo particular, cada um dos dois domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG3. Em um décimo exemplo particular, pelo menos um dos dois domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3 e um domínio CH2 de IgG1 ou um domínio CH2 de IgG3. Em um décimo primeiro exemplo particular, pelo menos um dos dois domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG1 ou uma dobradiça de IgG3 e um domínio CH2 de IgG1.
[00033] Nessa modalidade, os primeiro e segundo receptores Fcγ são, cada um independentemente, um receptor FcγI, um receptor FcγII, um receptor FcγIII ou um receptor FcγIV. De preferência, os primeiro e segundo receptores Fcγ são, cada um, um receptor FcγIIIa.
[00034] Em uma sétima modalidade, a presente invenção é dirigida a métodos de alteração de uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administração, a um indivíduo que precisa da mesma, de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um estradômero serial e um veículo ou diluente. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma mistura heterogênea de estradômeros seriais e um veículo ou diluente.
[00035] Em uma oitava modalidade, a presente invenção é dirigida a métodos de alteração de uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administração, a um indivíduo que precisa da mesma, de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um estradômero central e um veículo ou diluente. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma mistura heterogênea de estradômeros centrais e um veículo ou diluente.
[00036] Em uma nona modalidade, a presente invenção é dirigida a métodos de alteração de uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administração, a um indivíduo que precisa da mesma, de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um estradômero agrupado e um veículo ou diluente. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma mistura heterogênea de estradômeros agrupados e um veículo ou diluente.
[00037] Em uma décima modalidade, a presente invenção é dirigida a métodos de alteração de uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administração, a um indivíduo que precisa da mesma, de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um estradocorpo e um veículo ou diluente. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma mistura heterogênea de estradocorpos e um veículo ou diluente.
[00038] Em uma décima primeira modalidade, a presente invenção é dirigida a métodos de seleção de um anticorpo com relação a uma atividade específica sobre uma célula do sistema imune, compreendendo: (a) contato de uma população homogênea de células do sistema imune com um anticorpo candidato, (b) medição de uma atividade da população de células de (a), (c) contato de uma população homogênea de células do mesmo tipo de célula conforme em (a) com um estradômero serial da reivindicação 1, (d) medição de uma atividade da população de células de (c) e (e) comparação da atividade medida em (b) com a atividade medida em (d), desse modo, selecionando um anticorpo com relação a uma atividade específica sobre uma célula do sistema imune. Em uma modalidade preferida, o anticorpo candidato e o estradômero serial são espécie-equivalentes e isótipo-equivalentes. Em uma outra modalidade preferida, a comparação em (e) é uma proporção da atividade medida em (d) versus a atividade medida em (b).
[00039] Em uma décima segunda modalidade, a presente invenção é dirigida a métodos de inibição da atividade de uma célula derivada de monócito (MDC). O método envolve contato da célula com uma composição contendo um substrato com um reagente Fc ligado ao mesmo. O contato pode ser in vitro, in vivo ou ex vivo. A célula pode estar em um animal, por exemplo, um animal que tem ou está em risco de desenvolver uma condição mediada por célula derivada de monócito (MDCMC). A célula pode ser, por exemplo, uma célula pode ser, por exemplo, uma célula dendrítica, um macrófago, um monócito ou um osteoclasto.
[00040] Em uma décima terceira modalidade, a presente invenção é dirigida a métodos de tratamento que incluem administração, a um animal, de uma composição compreendendo um substrato tendo um reagente Fc ligado ao mesmo, o animal tendo ou estando em risco de desenvolver uma condição mediada por célula derivada de monócito (MDCMC).
[00041] As seguintes são modalidades comuns a esses dois métodos (as décima segunda e décima terceira modalidades).
[00042] O animal pode ser, por exemplo, um ser humano.
[00043] O reagente Fc pode conter ou ser uma porção funcional de um fragmento Fc humano, por exemplo, um fragmento Fc de IgG1 humana, um fragmento Fc de IgG3 humana, um fragmento Fc de IgG2 humana ou um fragmento Fc de IgG4 humana. Além disso, ele pode incluir ou ser uma molécula de IgG. O reagente Fc pode também ser ou incluir uma porção funcional de um fragmento Fc não-humano.
[00044] O substrato pode ser ou incluir um polímero sintético, por exemplo, náilon, teflon, dacron, cloreto de polivinila, PEU ((poli)éster uretano), PTFE (politetrafluoroetileno) ou PMMA (metil metacrilato). O substrato pode incluir ou ser um metal ou liga de metal, por exemplo, aço inoxidável, platina, irídio, titânio, tântalo, uma liga de níquel-titânio ou uma liga de cobalto-cromo. O substrato pode conter ou ser um tecido animal ou um produto de tecido animal, por exemplo, um tecido ou enxerto de órgão, osso (por exemplo, osso osteogênico) ou cartilagem. O substrato pode conter ou ser uma proteína, por exemplo, colágeno ou queratina. O substrato também pode ser ou conter um polissacarídeo, por exemplo, agarose. Além disso, o substrato pode conter ou ser uma matriz tecidual, por exemplo, uma matriz tecidual acelular. O substrato pode conter ou ser uma célula animal (por exemplo, uma célula de reparo tecidual, tal como fibroblastos ou uma célula tronco mesenquimal). O substrato pode conter ou ser um sal, por exemplo, sulfato de cálcio. Além disso, o substrato pode ser ou conter um gel ou creme. Ele também pode conter ou ser de silício ou silástico. Ele também pode conter uma fibra natural, por exemplo, seda, algodão ou lã.
[00045] O substrato pode ser um tufo de transplante de cabelo ou um dispositivo médico implantável, tal como um stent (por exemplo, um stent vascular, tal como um stent de artéria coronária; ou um stent urinário, tal como um stent uretral). Ele também pode ser uma sutura cirúrgica (por exemplo, uma sutura de seda, sutura de cromo, náilon, plástico ou de metal ou um grampo cirúrgico (por exemplo, um grampo para aneurisma)). Além disso, o substrato pode ser um quadril artificial, uma articulação de quadril artificial, um joelho artificial, uma articular de joelho artificial, um ombro artificial, uma articulação de ombro artificial, um dedo ou articulação de dedo artificial, uma placa óssea, um pino ósseo, um implante de não-união, um implante de disco intervertebral, cimento ósseo ou um espaçador de cimento ósseo. Ele pode ser um shunt venoso-arterial, um fio implantável, um marca-passo, um coração artificial, um dispositivo cardíaco auxiliar, um implante coclear, um desfibrilador implantável, um estimulador da coluna espinhal, um estimulador do sistema nervoso central, um implante de nervo periférico, uma prótese dental, uma coroa dental, uma gaiola ou dispositivo de filtração embólica de grande vaso, um dispositivo percutâneo, um emplastro dérmico ou submucosal ou um dispositivo de distribuição de fármaco implantável.
[00046] O substrato pode também ser um enxerto de grande vaso sanguíneo, em que o vaso sanguíneo é, por exemplo, uma artéria carótida, uma artéria femoral ou uma aorta. Ele também pode ser um implante subdérmico, uma implante corneal, uma lente intraocular ou uma lente de contato.
[00047] O substrato pode estar na forma, por exemplo, de uma folha, um glóbulo, uma malha, uma partícula em pó, um filamento, um glóbulo ou uma fibra. Um substrato pode conter ou ser um sólido, uma semissólido ou uma substância gelatinosa. Assim, um substrato inclui substâncias que são substancialmente insolúveis em solventes aquosos, por exemplo, um lipídio solúvel em gordura, tal como um lipossoma.
[00048] A MDCMC pode ser uma condição inflamatória, uma doença autoimune, um câncer, um distúrbio de densidade óssea, uma infecção aguda ou uma infecção crônica.
[00049] Ele pode ser um processo hematoimunológico, por exemplo, Púrpura Trombocitopênica Idiopática, trombocitopenia aloimune/autoimune, trombocitopenia imune adquirido, neutropenia autoimune, anemia hemolítica autoimune, aplasia de células vermelhas associada ao Parvovírus B19, autoimunidade anti-Fator VIII adquirida, doença de von Willebrand adquirida, mieloma múltiplo e gamopatia monoclonal de significância desconhecida, sepsia, anemia aplástica, aplasia de células vermelhas pura, anemia de Diamond-Blackfan, doença hemolítica do recém-nascido, neutropenia imune-mediada, resistência à transfusão de plaquetas neonatal, púrpura pós-transfusão, síndrome urêmica hemolítica, vasculite sistêmica, púrpura trombocitopênica trombótica ou síndrome de Evan.
[00050] Alternativamente, a MDCMC pode ser um processo neuroimunológico, por exemplo, síndrome de Guillain-Barré, poliradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica, polineuropatia desmielinizante de IgM paraproteinêmica, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, miastenia gravis, neuropatia motora multifocal, síndrome do neurônio motor inferior associada com anticorpos anti-GM1, desmielinização, esclerose múltipla e neurite óptica, síndrome de Stiff Man, degeneração cerebelar paraneoplástica com anticorpos anti-Yo, encefalomielite paraneoplásica, neuropatia sensória com anticorpos anti-Hu, epilepsia, encefalite, mielite, mielopatia especialmente associada ao vírus-1 linfotrópico de células T humanas, neuropatia diabética autoimune ou neuropatia disautonômica idiopática aguda.
[00051] A MDCMC pode ser um processo de doença reumática, por exemplo, doença de Kawasaki, artrite reumatóide, síndrome de Felty, vasculite ANCA-positiva, polimiosite espontânea, dermatomiosite, síndromes antifosfolipídio, abortos espontâneos recorrentes, lupus eritematoso sistêmico, artrite idiopática juvenil, Raynaud, síndrome CREST ou uveíte.
[00052] Além disso, a MDCMC pode ser um processo de doença dermatoimunológica, por exemplo, necrólise epidérmica tóxica, gangrena, granuloma, doenças autoimunes de formação de bolha na pele, incluindo pênfigo vulgaris, penfigóide bolhoso e pênfigo foliaceus, vitiligo, síndrome de choque tóxico estreptocócico, escleroderma, esclerose sistêmica, incluindo esclerose sistêmica difusa e limitada, dermatite atópica ou dermatite atópica dependente de esteróide.
[00053] Além disso, a MDCMC pode ser um processo de doença imunológica músculo-esquelética, por exemplo, miosite de corpo de inclusão, fasciíte necrosante, miopatias inflamatórias, miosite, miopatia antidecorina (antígeno BJ), miopatia necrótica paraneoplásica, miopatia vascular X-ligada, polimiosite penacilamina-induzida, aterosclerose, doença da artéria coronária ou cardiomiopatia.
[00054] A MDCMC também pode ser um processo de doença gastrointestinal imunológica, por exemplo, anemia perniciosa, hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária, doença celíaca, dermatite herpetiforme, cirrose criptogênica, artrite reativa, doença de Crohn, doença de Whipple, colite ulcerativa ou colangite esclerosante.
[00055] A MDCMC pode ser, por exemplo, doença enxerto versus hospedeiro, rejeição anticorpo-mediada do enxerto, rejeição a transplante de medula óssea, inflamação pós-doença infecciosa, linfoma, leucemia, neoplasia, asma, diabetes mellitus do tipo 1 com anticorpos anti-células beta, síndrome de Sjogren, doença mista do tecido conectivo, doença de Addison, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, glomerulonefrite membranoproliferativa, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, micropoliarterite, síndrome de Churg-Strauss, poliarterite nodosa ou insuficiência de órgãos multissistema.
[00056] Onde a MDCMC é um câncer, ela pode ser fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de cólon, câncer pancreático, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma de duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embriônico, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma de pulmão de células pequenas, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença mielodisplásica, doença da cadeia pesada, tumores neuroendócrinos ou Schwanoma.
[00057] Onde a MDCMC é um distúrbio de densidade óssea, ela pode ser osteoporose, osteopenia, osteopetrose, hipogonadismo hipononadotrófico idiopático, anorexia nervosa, fratura não cicatrizante, osteoporose pós-menopausa, deficiência ou excesso de Vitamina D, hiperparatiroidismo primário ou secundário, doença da tiróide ou toxicidade por bisfosfonato.
[00058] Onde a MDCMC é uma infecção aguda, ela pode ser: um distúrbio fúngico, incluindo candidíase, candidemia, aspergilose; um distúrbio bacteriano, incluindo estafilococos, incluindo Staph aureus resistente à meticilina, pele estreptocócica e condições orofaringeais e sepsia gram negativa; uma infecção micobacteriana, incluindo tuberculose; uma infecção viral, incluindo mononucleose, vírus sincicial respiratório e Herpes zoster; uma infecção parasítica, incluindo malária, esquistossomose e tripanossomíase.
[00059] Onde a MDCMC é uma infecção crônica, ela pode ser onquiomicose; um distúrbio bacteriano, incluindo Helicobacter pylori; uma infecção micobacteriana, incluindo tuberculose; uma infecção viral, incluindo vírus de Epstein Barr, Papiloma Vírus humano e Herpes Simplex; uma infecção parasítica, incluindo malária e esquistossomose.
[00060] Em uma décima quarta modalidade, a presente invenção é dirigida a uma composição que contém ou é um dispositivo médico implantável ou fixável e um reagente Fc ligado ao mesmo.
[00061] Em uma décima quinta modalidade, a presente invenção é dirigida a um kit que contém um dispositivo médico implantável ou fixável e um reagente Fc. Em ambas essas modalidades, o dispositivo médico implantável ou fixável e o reagente Fc podem ser qualquer um daqueles mencionados aqui. O kit pode ainda conter um recipiente adequado.
[00062] Vantagens e características adicionais da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada, desenhos e exemplos a seguir, os quais ilustram modalidades preferidas da invenção.
[00063] O precedente esboçou amplamente as características e vantagens técnicas da presente invenção de forma que a descrição detalhada da invenção que segue possa ser melhor entendida. Vantagens e características adicionais da invenção serão descritas aqui depois as quais formam o assunto das reivindicações da invenção. Será apreciado por aqueles versados na técnica que a concepção e modalidade específica divulgadas podem ser prontamente utilizadas como uma base para modificação ou criação de outras estruturas para obtenção das mesmas finalidades da invenção. Deve também ser entendido por aqueles versados na técnica que tais construções equivalentes não se desviam do espírito e escopo da invenção conforme apresentado nas reivindicações em anexo. As novas características as quais acredita-se que sejam aspectos da invenção, bem como sua organização e método de operação, junto com outros objetivos e vantagens, serão melhor entendidos a partir da descrição quando considerada junto com os desenhos em anexo. Deve ser expressamente entendido, contudo, que cada uma das figuras é fornecida para fins de ilustração e descrição apenas e não se destina a ser uma definição dos limites da presente invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00064] A Figura 1A mostra, em uma forma esquemática, uma estrutura de monômero Fc de fragmento nativo de IgG1 tendo um domínio de dobradiça ligado a um domínio CH2 ligado a um domínio CH3; a Figura 1B mostra um fragmento Fc de IgG1 nativo, autoagregado formado de dois monômeros de fragmento Fc associados.
[00065] A Figura 1C mostra, em uma forma esquemática, uma estrutura de monômero de fragmento Fc nativo de IgG3 tendo um domínio de dobradiça ligado a um domínio CH2 ligado a um domínio CH3; a Figura 1D mostra um fragmento Fc de IgG3 nativo, autoagregado formado de dois monômeros de fragmento Fc formado de dois monômeros de fragmento Fc associados.
[00066] As Figuras 2A e 2B mostram agregados de ordem superior da estrutura do fragmento Fc nativo mostrada na Figura 1B. Fragmentos Fc podem multimerizar naturalmente em dímeros de dímero (isto é, tetrâmeros) ou mesmo agregados multiméricos de ordem superior.
[00067] A Figura 3A mostra um esquema de um anticorpo IgG1 nativo tendo um fragmento Fab nativo ligado ao fragmento Fc na dobradiça do fragmento Fc; a Figura 3B mostra a estrutura de IgG3 análoga.
[00068] A Figura 4A mostra um monômero de estradômero composto de dois monômeros com domínio Fc de IgG1 em série; a Figura 4B mostra uma estrutura de monômero de estradômero alternativa tendo, ligados em série, Fc de IgG1-Fc de IgG3-Fc de IgE.
[00069] As Figuras 5A & B mostram os monômeros de estradômero das Figuras 4A & B autodimerizando em um estradômero serial em virtude da capacidade intrínseca dos monômeros com domínio Fc componentes.
[00070] A Figura 6A mostra um monômero de estradômero contendo Fc de IgG1 - (dobradiça - CH2) de IgG1; a Figura 6B mostra um estradômero contendo sequências derivadas (dobradiça - CH2) de IgG1 - (dobradiça - CH2) de IgG3 - (dobradiça - CH2) de IgE.
[00071] As Figuras 7A & B mostram os monômeros de estradômero de 6A & B autodimerizando em um estradômero serial em virtude da capacidade intrínseca dos domínios Fc componentes.
[00072] A Figura 7C mostra um estradômero serial contendo (dobradiça) de IgE - Fc de IgG1 - (dobradiça - CH2) de IgG1 - (CH3) de IgE; a Figura 7D mostra um estradômero serial contendo um Fc de IgG3 - Fc de IgG1.
[00073] A Figura 8A mostra um construto de estradocorpo contendo um Fab com uma estrutura de estradômero serial, com cada monômero de estradômero contendo dois monômeros com domínio Fc derivados de CH2-CH3 de IgG1; a Figura 8B mostra um construto de estradocorpo conforme em 8A, mas com uma estrutura de estradômero contendo um Fc de IgG1 ligado a um Fc de IgG3 ligado a um Fc de IgE.
[00074] A Figura 9A mostra um estradocorpo de Fc de IgG1 -(dobradiça - CH2) de IgG1; a Figura 9B mostra um estradocorpo de (dobradiça - CH2) de IgG1 - (dobradiça - CH2) de IgG3 - (dobradiça -CH2) de IgE.
[00075] A Figura 10A mostra um monômero de estradômero de (dobradiça - CH2) de IgG1 - CH3 de IgG3 - CH4 de IgM e uma proteína com cadeia J; a Figura 10B mostra um estradômero central baseado em um fivemer do estradômero da Figura 10A formado através de associação do domínio CH4 de IgM a uma cadeia J.
[00076] A Figura 10C mostra um monômero de estradômero de Fc de IgG1 - Fc de IgG1 - CH4 de IgM e uma proteína com cadeia J; a Figura 10D mostra um estradômero central baseado em um fivemer do estradômero da Figura 10C formado através de associação do domínio CH4 de IgM a uma cadeia J.
[00077] A Figura 11A mostra um monômero de estradômero de Fc de IgG1 - (dobradiça - CH2) de IgG1. A Figura 11B demonstra como o monômero de estradômero na Figura 11A pode autodimerizar para formar um estradômero serial. A Figura 11C demonstra como o mesmo monômero de estradômero na Figura 11A pode ter domínios Fc monoméricos alinhados com os mesmos ou monômeros com Fc similares sobre outro monômero de estradômero, mas não como um autodímero, desse modo, formando um estradômero composto do mesmo monômero de estradômero que o autodímero, mas com uma estrutura com efeito de zíper.
[00078] A Figura 12A mostra um monômero de estradômero de Fc de IgG3 - Fc de IgG1. A Figura 12B mostra que a adição de um segundo Fc de IgG3, seguido por autodimerização, pode formar um estradômero de Fc de IgG3 - Fc de IgG1 - Fc de IgG3 estruturado ramificado.
[00079] A Figura 13A mostra um monômero de estradômero de CH2 de IgE - Fc de IgG1 - (dobradiça - CH2) de IgG1 - CH4 de IgE. A Figura 13B mostra o autodímero do monômero da Figura 13A e destaca dois sítios de ligação de FcγR formados.
[00080] A Figura 14A mostra um estradômero composto de dois domínios Fc de IgG1 unidos através de um ligante. A Figura 14B mostra um estradômero composto de dois estradômeros seriais (especificamente, em cada caso, um estradômero de Fc de IgG1) unidos através de um ligante.
[00081] A Figura 15A mostra as sequências de ácido nucleico (SEQ ID NO: 1) e aminoácido (SEQ ID NO: 2) do fragmento Fc de IgG1 humana. A Figura 15B mostra as sequências de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3) e aminoácido (SEQ ID NO: 4) do fragmento Fc de IgG2 humana. A Figura 15 C mostra as sequências de ácido nucleico (SEQ ID NO: 5) e aminoácido (SEQ ID NO: 6) do fragmento Fc de IgG3 humana. A Figura 15D mostra as sequências de ácido nucleico (SEQ ID NO: 7) e aminoácido (SEQ ID NO: 8) do fragmento Fc de IgG4 humana.
[00082] A Figura 16 mostra as sequências de ácido nucleico (SEQ ID NO: 17) e aminoácido (SEQ ID NO: 18) de um construto compreendendo {sequência sinalizadora de IgK - fragmento Fc de IgG1 - fragmento Fc de IgG1}. A sequência de aminoácido do sinalizador de IgK está em negrito. A sequência de aminoácido do primeiro fragmento Fc de IgG1 está com um sublinhado simples. A sequência de aminoácido do segundo fragmento Fc de IgG1 está com um sublinhado duplo. A serina e lisina marcadas com um asterisco são aqueles aminoácidos que podem sofrer mutação para alterar a ligação ao receptor Fcγ.
[00083] A Figura 17 mostra as sequências de ácido nucleico (SEQ ID NO: 19) e aminoácido (SEQ ID NO: 20) de um construto compreendendo {Sítios de Enzima de Restrição - sequência sinalizadora de IgK - Sítios de Enzima de Restrição - (dobradiça - CH2 - CH3 de IgG1) - Sítios de Enzima de Restrição - tags de epítopo (V5 e His) - TÉRMINO}. A sequência de aminoácido do sinalizador de IgK está em negrito. A sequência de aminoácido o fragmento Fc de IgG1 está com um sublinhado simples. A sequência de aminoácido da tag V5 está sublinhada com uma linha tracejada. A sequência de aminoácido da tag His está sublinhada em negrito.
[00084] A Figura 18 mostra as sequências de ácido nucleico (SEQ ID NO: 21) e aminoácido (SEQ ID NO: 22) de um construto compreendendo {Sítios de Enzima de Restrição - sinalizador de IgK -Sítios de Enzima de Restrição - (dobradiça - CH2 - CH3) de IgG1 -sítio XbaI - (dobradiça - CH2 - CH3) de IgG1 - TÉRMINO}. A sequência de aminoácido do sinalizador de IgK está em negrito. A sequência de aminoácido do primeiro fragmento de IgG1 está com um sublinhado simples. A sequência de aminoácido do segundo fragmento Fc de IgG1 está com um duplo sublinhado.
[00085] A Figura 19 mostra as sequências de ácido nucleico (SEQ ID NO: 21) e aminoácido (SEQ ID NO: 24) de um construto compreendendo {Sítios de Enzima de Restrição - (dobradiça - CH2 -CH3) de IgG1 - sítio XbaI - (dobradiça - CH2 - CH3) de IgG1 - Sítios de Enzima de Restrição - tags de epítopo (V5 e His) - TÉRMINO}. A sequência de aminoácido do sinalizador de IgK está em negrito. A sequência de aminoácido do primeiro fármaco Fc de IgG1 está com um sublinhado simples. A sequência de aminoácido do segundo fragmento Fc de IgG1 está com um duplo sublinhado. A sequência de aminoácido da tag V5 está sublinhada com uma linha tracejada. A sequência de aminoácido da tag His está sublinhada em negrito.
[00086] A Figura 20A mostra as sequências de aminoácido (SEQ ID NO: 31) e aminoácido (SEQ ID NO: 32) da sequência sinalizadora N-terminal de FcRgamaIIIa com o polimorfismo de fenilalanina (F) mostrado em negrito e sublinhado. O ácido nucleico variável também está em negrito e sublinhada. A Figura 20B mostra as sequências de ácido nucleico (SEQ ID NO: 33) e aminoácido (SEQ ID NO: 34) da sequência sinalizadora N-terminal de FcRgamaIIIa com o polimorfismo de valina (V) mostrado em negrito e sublinhado. O ácido nucleico variável também está em negrito e sublinhado. Ambos os construtos contêm uma tag hexaHis C-terminal para purificação.
[00087] A Figura 21 mostra as sequências de ácido nucleico (SEQ ID NO: 25) e aminoácido (SEQ ID NO: 26) de um construto compreendendo {Sítios de Enzima de Restrição - sinalizador de IgK -Sítio EcoRV - (dobradiça - CH2 - CH3) de IgG3 - (dobradiça - CH2 -CH3) de IgG1 - Sítios de Enzima de Restrição - tags de epítopo (V5 -His) - TÉRMINO}. A sequência de aminoácido do sinalizador de IgK está em negrito. A sequência de aminoácido do fragmento Fc de IgG3 está com um sublinhado simples. A sequência de aminoácido do fragmento Fc de IgG1 está com um sublinhado duplo. A sequência de aminoácido da tag V5 está com uma linha tracejada. A sequência de aminoácido da tag His está sublinhada em negrito.
[00088] A Figura 22 mostra as sequências de ácido nucleico (SEQ ID NO: 27) e aminoácido (SEQ ID NO: 26) de um construto compreendendo {Sítios de Enzima de Restrição - sinalizador de IgK -Sítio EcoRV - (CH2) de IgE - (dobradiça - CH2 - CH3) de IgG1 -(dobradiça - CH2) de IgG1 - (CH4) de IgE - TÉRMINO}. A sequência de aminoácido do sinalizador de IgK está em negrito. A sequência de aminoácido do domínio (CH2) de IgE está com um sublinhado simples. A sequência de aminoácido do domínio (dobradiça - CH2 - CH3) de IgG1 está com um sublinhado duplo. A sequência de aminoácido do domínio (dobradiça - CH2) está sublinhada com uma linha tracejada. A sequência de aminoácido do domínio (CH4) de IgE está sublinhada com uma linha ondulada.
[00089] A Figura 23A mostra um fragmento Fc e demonstra que tal fragmento Fc é composto de dois monômeros de fragmento Fc e ainda compreende um domínio Fc (círculo tracejado) e domínios Fc parciais (dobradiça, CH2 e CH3, conforme indicado). A Figura 23B a composição de um estradômero serial composto de dois monômeros de estradômero os quais são conectados por uma ligação intermonômero de estradômero. O estradômero serial compreendem pelo menos dois domínios Fc (indicados como círculos tracejados) e pode, opcionalmente, compreender uma região de ligação de domínio. A Figura 23C mostra a composição de um estradômero central compreendendo uma porção central à qual estão ligadas unidades de estradômero central que contêm pelo menos um domínio Fc cada. As unidades de estradômero central podem ser um fragmento Fc, um estradômero serial ou uma unidade de estradômero agrupado. A Figura 23D mostra a composição de um estradômero agrupado compreendendo unidades de estradômero agrupado multimerizadas, cada uma das quais tem uma região de multimerização e uma região contendo pelo menos um domínio Fc. A unidade de estradômero agrupado pode ser um fragmento Fc ou um estradômero serial. A região de multimerização, uma vez multimerizada, forma a cabeça de um estradômero agrupado. As pernas do estradômero agrupado são formadas pelas regiões de domínio Fc das unidades de estradômero agrupado que são espacialmente menos restritas do que a cabeça multimerizada do estradômero agrupado.
[00090] A Figura 24 mostra as sequências de aminoácido do estradômero apresentado na Tabela 3.
[00091] A Figura 25 mostra as sequências de aminoácido para os monômeros com domínios Fc parciais (dobradiça, CH2 e CH3) de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas (Kabat, EA, Wu, TT, Perry, HM, Gottesman, KS. e Foeller, C. 1991. Sequences of proteins of immunological interest, 5a Ed. US Public Health Services, NIH, Bethesda).
DESCRICÃO DETALHADA DE INVENÇÃO
[00092] A abordagem ao design molecular racional para compostos de reposição de hIVIG descritos aqui inclui a criação recombinante e/ou bioquímica de biomimético(s) imunologicamente ativo(s). Em métodos preferidos, esses compostos de reposição são selecionados in vitro para avaliar a eficiência de cada compostos de reposição na ligação ao receptor Fcγ e modulação de função imune. Compostos de reposição particulares são selecionados para validação e otimização de dosagem/administração. Os compostos de reposição têm utilidade para tratamento, por exemplo, de doenças autoimunes, doenças inflamatórias, osteoporose e câncer. Cada fase é descrita em detalhes abaixo junto com modalidades exemplificativas específicas.
[00093] Conforme usado aqui, o uso da palavra "a", "o" ou "um", "uma", quando usado em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou relatório descritivo, pode significar "um(a)", mas também é consistente com o significado de "um(a) ou mais", "pelo menos um(a)" e "um(a) ou mais de um(a)".
[00094] Conforme usado aqui, os termos "biomimético", "molécula de biomimético", "composto biomimético" e termos relacionados se referem a um composto feito pelo homem que imita a função de outro composto, tal como hIVIG empoçada, um anticorpo monoclonal ou o fragmento Fc de um anticorpo. Biomiméticos "biologicamente ativos" são compostos os quais possuem atividades biológicas que são as mesmas ou substancialmente similares à suas contra-partes que ocorrem naturalmente. Biomiméticos "imunologicamente ativos" são biomiméticos os quais exibem atividade imunológica semelhante ou substancialmente similar à moléculas imunologicamente ativas que ocorrem naturalmente, tais como anticorpos, citocinas, interleucinas e outras moléculas imunológicas conhecidas na técnica. Em modalidades preferidas, os biomiméticos da presente invenção são estradômeros e estradocorpos, conforme definido aqui.
[00095] Os biomiméticos imunologicamente ativos da presente invenção são criados para possuir uma ou mais atividades de modulação imune do domínio Fc de IgG e têm pelo menos (i) um primeiro domínio Fc capaz de ligação a um FcγR, incluindo FcγRI, FcγRII, FcγRIII e FcγIV e (ii) um segundo domínio Fc capaz de ligação a um Fcy, incluindo FcyRI, FcγRII, FcγRIII e FcγRIV.
[00096] Os parágrafos a seguir definem os blocos de construção dos biomiméticos da presente invenção, estrutural e funcionalmente e, então, definem biomiméticos em si. Contudo, primeiro é útil notar que, conforme indicado acima, cada um dos biomiméticos da presente invenção tem pelo menos dois domínios Fc. No mínimo, um domínio Fc é um polipeptídeo dimérico (ou uma região dimérica de um polipeptídeo maior) que compreende duas cadeias ou braços peptídicos (monômeros) que se associam para formar um sítio de ligação de receptor Fcγ funcional. Portanto, a forma funcional dos fragmentos e domínios individuais discutidos aqui geralmente existe em uma forma dimérica (ou multimérica). Os monômeros dos fragmentos e domínios individuais discutidos aqui são as cadeias ou braços únicos que devem se associar com uma segunda cadeia ou braço para formar uma estrutura dimérica funcional.
Fragmento Fc
[00097] "Fragmento Fc" é um termo da técnica que é usado para descrever a região de proteína ou estrutura dobrada de proteína que é rotineiramente encontrada no carbóxi término de imunoglobulinas (veja Figuras 3A-3B). O fragmento Fc pode ser isolado do fragmento Fab de um anticorpo monoclonal através do uso de digestão com papaína, a qual é um processo incompleto e imperfeito (veja Mihaesco C e Seligmann M. Papain Digestion Fragments of Human IgM Globulins. Journal of Experimental Medicine, Vol 127, 431-453 (1968)). Em conjunto com o fragmento Fab (contendo o domínio de ligação de anticorpo), o fragmento Fc constitui o holo-anticorpo, significando aqui o anticorpo completo. O fragmento Fc consiste das porções carbóxi terminais das cadeias pesadas de anticorpo. Cada uma das cadeias em um fragmento Fc tem entre cerca de 220-265 aminoácidos de comprimento e as cadeias são, frequentemente, ligadas via uma ligação de dissulfeto. O fragmento Fc frequentemente contém uma ou mais dobras estruturais ou subdomínios funcionais independentes. Em particular, o fragmento Fc abrange um domínio Fc, definido aqui como a estrutura mínima que se liga a um receptor Fcγ (veja, por exemplo, Figuras 1B e 1D). Um fragmento Fc isolado é compreendido de dois monômeros de fragmento Fc (por exemplo, as duas porções carbóxi terminais das cadeias pesadas de anticorpo; ainda definidas aqui) que são dimerizadas. Quando dois monômeros de fragmento Fc se associam, o fragmento Fc resultante tem atividade de ligação a receptor Fcγ.
Fragmento Fc Parcial
[00098] Um "fragmento Fc parcial" é um domínio compreendendo menos do que o fragmento Fc inteiro de um anticorpo, o qual ainda retém estrutura suficiente para ter a mesma atividade que o fragmento Fc, incluindo atividade de ligação ao receptor Fcγ. Um fragmento Fc parcial pode, portanto, carecer de parte ou toda a região de dobradiça, parte ou todo um domínio CH2, parte ou todo um domínio CH3 e/ou parte ou todo um domínio CH4, dependendo do isótipo do anticorpo do qual o domínio Fc parcial é derivado. Um exemplo de um fragmento Fc parcial inclui uma molécula compreendendo as regiões superior, central e inferior mais o domínio CH2 de IgG3 (Tan, LK, Shopes, RJ, Oi, VT e Morrison, SL, Influence of the hinge region on complement activation, C1q binding and segmental flexibility in chimeric human immunoglobulins, Proc Natl Acad Sci USA. Janeiro de 1990; 87(1): 162-166). Assim, nesse exemplo, o fragmento Fc parcial carece do domínio CH3 presente no fragmento Fc de IgG3. Fragmentos Fc parciais são compreendidos de dois monômeros de fragmento Fc parcial. Conforme ainda definido aqui, quando dois de tais monômeros de fragmento Fc parciais se associam, o fragmento Fc parcial resultante tem atividade de ligação a receptor Fcγ.
Domínio Fc
[00099] Conforme usado aqui, "domínio Fc" descreve a região mínima (no contexto de um polipeptídeo maior) ou estrutura dobrada de proteína menor (no contexto de uma proteína isolada) que pode se ligar a ou ser ligada por um receptor Fcy. Em um fragmento Fc e um fragmento Fc parcial, o domínio Fc é a região de ligação mínima que permite ligação da molécula a um receptor Fcγ. Embora um domínio Fc possa estar limitado a um polipeptídeo distinto que é ligado através de um receptor Fcγ, também estará claro que um domínio Fc pode ser uma parte ou todo um fragmento Fc, bem como parte ou todo um fragmento Fc parcial. Quando o termo "domínios Fc" é usado na presente invenção, ele será reconhecido por aqueles versados na técnica como significando mais de um domínio Fc. Um domínio Fc é compreendido de dois monômeros com domínio Fc. Conforme ainda definido aqui, quando dois de tais monômeros com domínio Fc se associam, o domínio Fc resultante tem atividade de ligação ao receptor Fcγ. Assim, um domínio Fc é uma estrutura dimérica que pode se ligar funcionalmente a um receptor Fcγ.
Domínio Fc parcial
[000100] Conforme usado aqui, "domínio Fc parcial" descreve uma porção de um domínio Fc. Domínio Fc parcial inclui os domínios de região constante de cadeia pesada (por exemplo, domínios CHI, CH2, CH3 e CH4) e regiões de dobradiça das diferentes classes e subclasses de imunoglobulina. Assim, domínios Fc parciais da presente invenção incluem os domínios CH1 de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE, os domínios CH2 de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE, os domínios CH3 de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE, os domínios CH4 de IgM e IgE e as regiões de dobradiça de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE. O domínio Fc parcial da presente invenção pode ainda compreender uma combinação de mais de um desses domínios e dobradiças. Contudo, os domínios Fc parciais individuais da presente invenção e combinações dos mesmos carecem da capacidade de se ligar a um FcγR. Portanto, os domínios parciais Fc e combinações dos mesmos compreende menos de um domínio Fc. Domínios Fc parciais podem ser ligados juntos para formar um peptídeo que tem atividade de ligação a receptor Fcγ, assim, formando um domínio Fc. Na presente invenção, domínios Fc parciais são usados com domínios Fc como os blocos de construção para criar biomiméticos da presente invenção, conforme definido aqui. Cada domínio parcial Fc é compreendido de dois monômeros com domínio Fc parcial. Quando dois de tais monômeros com domínio Fc parcial se associam, um domínio Fc parcial é formado.
[000101] Conforme indicado acima, cada um dos fragmentos Fc, fragmentos Fc parciais, domínios Fc e domínios Fc parciais são proteínas ou domínios diméricos. Assim, cada uma dessas moléculas é compreendida de dois monômeros que se associam para formar a proteína ou domínio dimérico. Embora as características e atividade da forma dimérica sejam discutidas acima, os peptídeos monoméricos são discutidos a seguir.
Monômero de fragmento Fc
[000102] Conforme usado aqui, um "monômero de fragmento Fc" é uma proteína com uma única cadeia, quando associado a outro monômero de fragmento Fc, compreende um fragmento Fc. O monômero de fragmento Fc é, assim, a porção carbóxi terminal de uma das cadeias pesadas de anticorpo que compõem o fragmento Fc de um holo-anticorpo (por exemplo, a porção contínua da cadeia pesada que inclui a região de dobradiça, domínio CH2 e domínio CH3 de IgG) (veja Figura 1A e Figura 1C). Em uma modalidade, o monômero de fragmento Fc compreende, no mínimo, uma cadeia de uma região de dobradiça (um monômero de dobradiça), uma cadeia de um domínio CH2 (um monômero com domínio CH2), uma cadeia de um domínio CH3 (um monômero com domínio CH3) e uma cadeia de um domínio CH4 (monômero com domínio CH4) continuamente ligados para formar um peptídeo.
Monômero com domínio Fc
[000103] Conforme usado aqui, "monômero com domínio Fc" descreve a proteína com uma única cadeia que, quando associada a outro monômero com domínio Fc, compreende um domínio Fc que pode se ligar a um receptor Fcγ. A associação de dois monômeros com domínio Fc cria um domínio Fc. Um monômero com domínio Fc isoladamente, compreendendo apenas um lado de um domínio Fc, não pode se ligar a um receptor Fcγ.
Monômero com domínio Fc parcial
[000104] Conforme usado aqui, "monômero com domínio Fc parcial" descreve a proteína com uma única cadeia que, quando associado com outro monômero com domínio Fc parcial, compreende um domínio Fc parcial. As sequências de aminoácido dos monômeros de dobradiça, CH2 e CH3 com domínio Fc parcial para IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 são mostrados na Figura 25. A associação de dois monômeros com domínio Fc parcial cria um domínio Fc parcial.
Estradômeros
[000105] Em modalidades particulares, os biomiméticos da presente invenção incluem estradômeros. Estradômeros são compostos biomiméticos capazes de ligação a dois ou mais receptores Fcy (veja, por exemplo, Figura 13B). Em uma modalidade preferida, os estradômeros da presente invenção são usados para se ligar a receptores Fcy sobre células efetuadoras, tais como células NK e células dendríticas imaturas e outras células derivadas de monócito. Em uma modalidade, os receptores Fcy são receptores Fcy de baixa afinidade. Um estradômero pode ter quatro conformações físicas diferentes: serial, agrupara, central ou fragmento Fc, cada um dos quais é discutido nos parágrafos seguintes. Conforme será evidente, os fragmentos Fc, fragmentos Fc parciais, domínios Fc e domínios Fc parciais discutidos acima são usados na construção das várias conformações de estradômero. Ainda, são as estruturas diméricas individuais que são os estradômeros da presente invenção.
Estradômero serial
[000106] Um "estradômero serial" é um polipeptídeo dimérico compreendido de dois monômeros de estradômero lineares que, quando associados, formam dois ou mais domínios Fc. Os domínios Fc do estradômero são funcionais apenas quando as duas cadeias peptídicas (monômeros de estradômero) estão associadas (isto é, não funcionais no estado monomérico). Assim, um estradômero serial é um composto biomimético capaz de ligação a dois ou mais receptores Fcy. Em diferentes modalidades, estradômeros seriais podem ter dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze ou mais domínios Fc, bem como domínios Fc parciais. Os domínios Fc e domínios Fc parciais dentro de um estradômero serial podem ser ligados através de ligações de domínio, conforme ainda definido aqui.
[000107] Conforme usado aqui, um "dímero de estradômero" é uma forma específica de um estradômero composto de apenas dois estradômeros. Em uma modalidade, os dímeros de estradômero são moléculas formadas através de autoagregação de monômeros de estradômero relevantes. Em outra modalidade, monômeros de estradômero nos dímeros de estradômero são fisicamente ligados através de uma ligação intermonômero de estradômero, conforme definido aqui. Um "estradômero multimérico" é compreendido de três ou mais estradômeros formados através de autoagregação de monômeros de estradômero ou através de uma ligação intermonômero de estradômero, conforme definido aqui.
Monômero de estradômero
[000108] Conforme usado aqui, o termo "monômero de estradômero" refere-se a uma única molécula peptídica contínua que, quando associado a pelo menos um segundo monômero de estradômero, forma um polipeptídeo compreendendo pelo menos dois domínios Fc (veja, por exemplo, Figuras 6A-6B, Figuras 12A). Embora, em modalidades preferidas, os estradômeros seriais sejam compreendidos de dois monômeros de estradômero associados (veja, por exemplo, Figuras 5A, 5B, 7A, 7B, 7C, 7D), um estradômero serial pode também conter três (veja Figura 11C) ou mais monômeros de estradômero. Monômeros de estradômero podem estar associados para formar estradômeros através de ligações intermonômero de estradômero ou eles podem formar estradômeros através de autoagregação.
[000109] Um monômero de estradômero pode ter uma sequência de aminoácido que formará um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze ou mais domínios Fc quando associado com outro monômero de estradômero para formar um estradômero. Um monômero de estradômero pode ainda ter uma sequência de aminoácido que formará um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze ou mais domínios Fc quando associado com outro monômero de estradômero para formar um estradômero. Um monômero de estradômero pode ainda ter uma sequência de aminoácido que formará um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze ou mais domínios Fc parciais quando associado com outro monômero de estradômero para formar um estradômero.
[000110] As regiões dos monômeros de estradômero que formarão domínios Fc e domínios Fc parciais, no contexto de um estradômero, podem simplesmente estar dispostas do carbóxi término para o amino término de regiões sucessivas dos monômeros de estradômero podem ser ligadas através de uma sequência peptídica denominada uma "ligação de domínio" aqui. A disposição dos monômeros com domínio c e monômeros com domínio Fc parcial particulares compreendendo um monômero de estradômero não é crítica. Contudo, a disposição deve permitir a formação de dois domínios Fc funcionais quando de associação dos dois monômeros de estradômero.
[000111] Em uma modalidade dos estradômeros da presente invenção, são produzidos monômeros de estradômero que contêm, no N-término do peptídeo, um monômero com domínio Fc ou monômero com domínio Fc parcial que se liga fortemente a si mesmo, tal como um único ou dois monômeros com domínio CH2 de IgE terminais ou um monômero com domínio de dobradiça de IgG3 parcial para criar um domínio Fc ou um domínio Fc parcial, respectivamente. Cada um desses monômeros de estradômero tem o complemento requerido de monômeros com domínio Fc e/ou monômeros com domínio Fc parcial para se ligar a dois receptores Fc gama quando de formação de um estradômero. Estradômeros que resultam de associação de tais monômeros de estradômero são biomiméticos capazes de ligação a dois ou mais receptores Fc gama. Em uma modalidade preferida, o domínio Fc ou domínio Fc parcial N-terminal contém um sítio de glicosilação adicional, tal como aquele que existe sobre o domínio CH2 de IgE.
[000112] Como um exemplo esclarecedor, aqueles versados na técnica entenderão que as moléculas de estradômero da presente invenção podem ser construídas preparando uma molécula de polinucleotídeo que codifica várias combinações de monômeros com domínio Fc e monômeros com domínio Fc parcial, mas com uma combinação que formará um mínimo de dois monômeros com domínio Fc. Tal molécula de polinucleotídeo pode ser inserida em um vetor de expressão, o qual pode ser usado para transformar uma população de bactérias. Monômeros de estradômero podem, então, ser produzidos através de cultura das bactérias transformadas sob condições de cultura apropriadas. Monômeros de estradômero põem, então, formar estradômeros funcionais quando de autoagregação dos monômeros de estradômero ou associação de monômeros de estradômero usando ligações intermonômero de estradômero. A presente invenção abrange estradômeros formados através da associação de monômeros de estradômero tendo sequências de aminoácido idênticas, monômeros de estradômero tendo sequências de aminoácido substancialmente similares ou monômeros de estradômero tendo sequências dissimilares. Na última modalidade, a sequência de aminoácido dos monômeros de estradômero compreendendo um estradômero precisa apenas ser de similaridade tal que dois ou mais sítios de ligação a receptor Fcγ funcionais sejam formados.
[000113] Conforme indicado acima, um domínio Fc pode ser funcionalmente definido por sua capacidade de se ligar a um receptor Fcy. Como um resultado, a sequência de aminoácido particular de um domínio Fc variará, dependendo dos domínios Fc parciais que compreendem o domínio Fc. Contudo, em uma modalidade da presente invenção, o domínio Fc compreende a região de dobradiça e um domínio CH2 de uma molécula de imunoglobulina. Em uma outra modalidade, o domínio Fc compreende a região de dobradiça e um domínio CH2 de uma molécula de imunoglobulina. Em uma outra modalidade, o domínio Fc compreende a região de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3 de uma molécula de IgG. Em uma outra modalidade, o domínio Fc compreende a região de dobradiça, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4 de uma molécula de imunoglobulina. Em ainda outra modalidade, o domínio Fc compreende a região de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH4 de uma molécula de imunoglobulina.
Ligação de domínio
[000114] Conforme indicado acima, uma "ligação de domínio" é uma ligação peptídica entre monômeros com domínio Fc e/ou monômeros com domínio Fc parcial que compreendem cada um dos monômeros individuais de estradômero dos estradômeros seriais ou estradocorpos da presente invenção. A ligação de domínio pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais aminoácidos. Uma ligação de domínio não ocorre entre monômeros com domínio Fc parcial que estão em sua sequência natural. Isto é, onde porções contíguas naturalmente ligadas de monômeros com domínio Fc são usadas, tal como a região de dobradiça, domínio CH2 e domínio CH3 de IgG, esses monômeros com domínio Fc parcial compreendem uma sequência contígua e nenhuma ligação de domínio entre esses elementos é requerida. Em contraste, por exemplo, quando dois ou mais monômeros com domínio Fc ou monômeros com domínio Fc parcial são ligados de uma maneira que não ocorre naturalmente para formar um monômero de estradômero individual, ligações de domínio podem ser usadas. Um exemplo seria a ligação entre dois peptídeos com dobradiça/CH2/CH3, criando um monômero de estradômero individual de um estradômero compreendendo: dobradiça/CH2/CH3/L/dobradiça/CH2/CH3, onde "L" é a ligação de domínio (veja, por exemplo, Figura 4A onde a ligação de domínio (não mostrada) ocorre entre o domínio CH3 de IgG1 e a dobradiça de IgG1). Nos vários casos descritos, a ligação de domínio pode ser uma das porções que ocorrem naturalmente da cadeia pesada que une os domínios de dobradiça e CH no monômero com domínio Fc de um anticorpo. Alternativamente, a ligação de domínio pode ser qualquer outra sequência de aminoácido que proporciona o espaçamento e flexibilidade necessários entre os monômeros com domínio Fc e monômeros com domínio Fc parcial de monômero de estradômero individual e que permite que os monômeros de estradômero individuais se emparelhem uns com os outros para formar os estradômeros da presente invenção.
[000115] Aqueles versados na técnica entenderão que a identidade da ligação de domínio não é particularmente importante, na medida em que ela permita que dois ou mais monômeros individuais de estradômero formem os compostos biomiméticos da presente invenção e que os compostos resultantes têm a capacidade de se ligar cruzadamente a mais de um FcγR. Considera-se que cada composto biomimético imunologicamente ativo contenha, de preferência, pelo menos uma ligação de domínio em cada monômero de estradômero do estradômero serial ou estradocorpo a qual funcionará para manter os domínios Fc do biomimético imunologicamente ativo dentro de uma região espacial restrita e a qual facilitará a atividade de ativação do FcγR, por exemplo, através de agregação de FcγRs por meio de coligação aos domínios Fc dentro do biomimético imunologicamente ativo. De preferência, as ligações de domínio permitirão o mesmo ou um grau maior de variabilidade conformacional, conforme é proporcionado pelo domínio de dobradiça de moléculas de IgG. Todas as ligações acima são bem conhecidas na técnica.
Ligação intermonômero de estradômero
[000116] Uma ligação distinta encontrada nos compostos biomiméticos da presente invenção é a "ligação intermonômero de estradômero" entre dois ou mais monômeros de estradômero individuais que compreendem os estradômeros e estradocorpos da presente invenção. Enquanto que as ligações de domínio sejam sequências de aminoácido curtas que servem para ligar os monômeros com domínio Fc e monômeros com domínio Fc parcial que compreendem monômeros de estradômero individuais dos compostos biomiméticos uns aos outros, as ligações intermonômero de estradômero servem para unir dois ou mais monômeros de estradômero individuais que compreendem os compostos biomiméticos. A ligação intermonômero de estradômero pode ser qualquer ligação capaz de associação estável dos monômeros de estradômero individuais. Em algumas modalidades, a ligação intermonômero de estradômero pode ser uma ligação covalente entre os monômeros de estradômero. Alternativamente, a ligação intermonômero de estradômero entre monômeros de estradômero pode ser através de ligação cruzada química direta. Em modalidades preferidas, as estruturas de monômero de estradômero tomam vantagem das propriedades de autoagregação entre monômeros com domínio Fc para criar estradômeros de autoagregação. Em tais modalidades, ligações de dissulfeto se formam entre os monômeros de estradômero individuais para formar os estradômero (veja, por exemplo, Figura 5A, onde ligações de dissulfeto se formam entre resíduos de cisteína dos monômeros com domínio Fc que compreendem as moléculas de biomimético, usando resíduos de cisteína que ocorrem naturalmente na sequência do monômero com domínio Fc natural ou resíduos de cisteína incorporados em um monômero com domínio Fc através de mutagênese sítio-dirigida. Tais propriedades de autoagregação naturais também podem ser usadas para formar as ligações intermonômero de estradômero entre monômeros de estradômero individuais em multímeros de estradômero. Modalidades alternativas incluem ligações intermonômero de estradômero onde ligações de dissulfeto se formam entre resíduos de cisteína introduzidos, através de mutagênese sítio-dirigida, na sequência de aminoácido compreendendo os monômeros de estradômero individuais.
[000117] Conforme discutido acima, em uma modalidade preferida, a ligação intermonômero de estradômero que forma um estradômero é uma ligação que resulta de autoagregação de monômeros de estradômero. Em uma modalidade, os dois monômeros de estradômero que compreendem o estradômero são peptídeos idênticos, de modo que os dois monômeros de estradômero individuais que compreendem o estradômero são de sequência idêntica. Contudo, aqueles versados na técnica entenderão que outras modalidades incluem estradômeros onde os monômeros de estradômero diferem uns dos outros quanto à sequência de aminoácido.
[000118] Dois monômeros de estradômero podem formar um estradômero, por exemplo, através de alinhamento em paralelo, de modo que emparelhamento ocorre entre monômeros com domínio Fc parcial idênticos nos monômeros de estradômero (veja, por exemplo, Figuras 5A-B). Contudo, a presente invenção também inclui modalidades onde emparelhamento ocorre entre monômeros com domínio parcial Fc não idênticos e modalidades (veja Figura 11C) onde emparelhamento ocorre entre monômeros com domínio Fc parcial idênticos nos monômeros de estradômero, mas onde o alinhamento dos dois monômeros de estradômero é compensado.
[000119] De forma a controlar a produção e autodimerização de um monômero de estradômero, "regiões de capping' podem ser usadas. Por exemplo, uma sequência de monômero de estradômero pode compreender os seguintes domínios Fc parciais: CH2 de IgE / dobradiça de IgG1 / CH2 de IgG1 / CH3 de IgG1 / dobradiça de IgG1 / CH2 de IgG1 / CH4 de IgE (veja Figura 13A), onde os domínios de IgE servem como um cap para prevenir um "efeito de formação de zíper". Um efeito de formação de zíper pode ocorrer quando um monômero de estradômero (veja Figura 11A) pode autodimerizar (veja Figura 11B) ou pode se alinhar não como um autodímero, mas como monômeros alternados em paralelo (veja Figura 11C). Aqueles versados na técnica entenderão que uma variedade de domínios Fc parciais, tais como a dobradiça de qualquer injeção ou o domínio CH4 de IgM ou IgE, pode ser usada isoladamente ou em combinação para levar o estradômero a autodimerizar e coibir o efeito de formação de zíper quando desejado. Outras estruturas não seriais podem conter moléculas ramificadas (veja Figura 12B), dois ou mais estradômeros alinhados em paralelo unidos por ligantes, tal como uma ligação covalente simples, ligantes peptídicos ou ligantes não peptídicos (veja Figuras 14A e 14B).
Estradômero central
[000120] Um "estradômero central" é compreendido de uma porção central à qual são ligadas duas ou mais unidades de estradômero central, em que cada unidade de estradômero central compreende pelo menos um domínio Fc, desse modo, criando um composto biomimético capaz de ligação a dois ou mais receptores Fcγ. Um fragmento Fc, fragmento Fc parcial, estradômero serial ou unidade de estradômero agrupado pode, cada um independentemente, servir como uma ou ambas (se eles compreendem dois domínios Fc) unidades de estradômero central em um estradômero central porque cada uma dessas moléculas contém pelo menos um domínio Fc. Assim, um estradômero central pode compreender uma porção central à qual está ligado pelo menos um estradômero serial.
[000121] Conforme usado aqui, a porção central de um estradômero central é qualquer estrutura física à qual as unidades de estradômero central podem ser ligadas ou covalentemente ligadas. Polipeptídeos preferidos que podem servir como a porção central incluem hemocianina do caramujo Megathura crenulata, albumina de soro bovino e ovalbumina. Ligação cruzada química entre tais porções centrais e unidades de estradômero central (por exemplo, fragmento Fc, fragmento Fc parcial, domínio Fc, estradômero serial e unidade de estradômero agrupado) pode ser obtida por meio de numerosos produtos químicos usando técnicas bem conhecidas. Produtos químicos exemplificativos geralmente adequados para uso na ligação cruzada incluem glutaraldeído, carbodiimida, ésteres de succinimida (por exemplo, MBS, SMCC), benzidina, periodato, isotiocianato, PEO (polietileno)/PEG (polietileno glicol), espaçadores, tais como Bis(NHS)PEOs, DFDNB (1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenzeno); e reagentes de ligação cruzada homobifuncionais amina-reativos, incluindo dextrana aldeído-ativada, bis(sulfo-succinimidil)suberato, Bis[2-(succinimidoóxicarbonilóxi)etil]sulfona, adipimidato•2HC1 de dimetila, pimelimidato•2HC1 de dimetila, suberimidato•2HC1 de dimetila, glutarato de dissuccinimidila, propionato de ditiobis(succinimidila), suberato de di-succinimidila, tartrato de di-succinimidila, 3,3'-ditiobispropionimidato•2HC1 de dimetila, 3,3'-Ditiobis(sulfo- succinimidilpropionato), bis[succinimidil-succinato] de etileno glicol, bis[sulfo-succinimidil-succinato] de etileno glicol, ácido β-[Tris(hidróximetil)fosfino]propiônico e aminotriacetato de tris-succinimidila. Aqueles versados na técnica serão capazes de selecionados produtos químicos e condições de ligação cruzada apropriados baseados na porção central particular selecionada e na sequência dos polipeptídeos contendo domínio Fc sendo combinados para formar um biomimético imunologicamente ativo. Veja, por exemplo, Wong, Shan S. Chemistry of protein conjugation and crosslinking. Boca Raton: CRC Press, c1991 (ISBN 0849358868).
[000122] Em outra modalidade preferida, um polipeptídeo de cadeia (J) de união pode ser usado como a porção central. Quando uma cadeia J é usada como a porção central, ligações em ponte de cisteína podem ser usadas para conectar unidades de estradômero central individuais para formar um estradômero central (veja Fig. 10A-10D). Em uma modalidade de um estradômero central, estradômeros seriais (servindo como as unidades centrais de estradômero) contendo um domínio CH4 de IgM terminal são associados com uma cadeia J para formar um estradômero central. A inclusão do domínio CH4 de IgM resulta na autoagregação de estradômeros compreendendo esse domínio Fc parcial com uma cadeia J para formar um biomimético capaz de ligação a múltiplos receptores Fc gama. Outro estradômero central exemplificativo é um compreendendo domínios Fc (servindo como as unidades de estradômero central) onde os domínios Fc têm a estrutura dobradiça de IgG3 / CH2 de IgG3 / CH3 de IgG3 / CH4 de IgM. Os domínios Fc componentes dessa molécula não podem se ligar individualmente a mais de um receptor Fc gama, mas a estrutura toda pode se ligar a cinco receptores Fc gama quando os domínios Fc componentes se associação a uma cadeia J.
[000123] Em outra modalidade, a porção central pode ser uma entidade não-polipeptídica. Uma variedade de composições adequadas pode ser fisicamente associada com as unidades de estradômero central para produzir um biomimético imunologicamente ativo. Glóbulos não tóxicos, polímeros hiper-ramificados e dendrímeros, nanopartículas e vários compostos que são classificados pelo FDA como Geralmente Considerados como Seguros (por exemplo, propileno glicol, sorbitol, lipossomas e silicato de cálcio) podem ser usados. Veja, por exemplo, Nanoparticulates as Drug Carriers por Vladimir P. Torchilin (Editor), Imperial College Press (Setembro de 2006) ISBN: 1860946305/ISBN-13: 9781860946301.
[000124] Porções centrais preferidas da presente invenção incluem um glóbulo, albumina, um lipossoma, um peptídeo e polietileno glicol.
Estradômero agrupado
[000125] Um "estradômero agrupado" é um biomimético que tem uma forma semelhante a polvo com uma "cabeça" de porção central e duas ou mais "pernas", em que cada perna compreende um ou mais domínios Fc que são capazes de ligação a pelo menos um receptor Fc gama, assim, criando um biomimético capaz de ligação a dois ou mais receptores Fc gama. Cada estradômero agrupado é compreendido de mais de uma proteína dimérica, cada uma denominada uma "unidade de estradômero agrupado". Cada unidade de estradômero agrupado é compreendida de uma região que multimeriza e uma região de "perna" que compreende pelo menos um domínio Fc funcional. A região de multimerização cria uma "cabeça" de estradômero agrupado uma vez multimerizada com a região de multimerização de outra unidade de estradômero agrupado. A região de perna é capaz de ligação a tantos receptores Fcγ quanto existem domínios Fc em cada região de perna. Assim, um estradômero agrupado é um composto biomimético capaz de ligação a dois ou mais receptores Fcγ.
[000126] A região de multimerização pode ser uma sequência peptídica que faz com que as proteínas diméricas se multimerizem adicional ou, alternativamente, a região de multimerização pode ser uma glicosilação que intensifica a multimerização de proteínas diméricas. Exemplos de regiões de multimerização peptídicas incluem dobradiça de IgG2, domínio CH2 de IgE, zíper de isoleucina e dedos de zinco. A influência da glicosilação sobre a multimerização de peptídeo é descrita na técnica (por exemplo, Role of Carbohydrate in Multimeric Structure of Factor VIII/V on Willebrand Factor Protein. Harvey R. Gralnick, Sybil B. Williams e Margaret E. Rick. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 80, No. 9, [Parte 1: Biological Sciences] (1 de Maio de 1983), páginas 2771-2774; Multimerization and collagen binding of vitronectin is modulated by its glycosylation. Kimie Asanuma, Fumio Arisaka e Haruko Ogawa. International Congress Series Volume 1223, Dezembro de 2001, Páginas 97-101).
[000127] Aqueles versados na técnica reconhecerão que uma unidade de estradômero agrupado pode, em si, compreender um estradômero serial (contendo dois ou mais domínios Fc) junto com uma região de multimerização. Assim, as "pernas" de um estradômero agrupado podem ser compreendidas de qualquer um dos tipos de estradômero serial discutidos aqui e/ou um ou mais de um fragmento Fc de IgG1 e/ou um fragmento Fc de IgG3 e/ou um único domínio Fc. Aqueles versados na técnica reconhecerão que cada um dos fragmentos Fc de IgG1 e fragmentos Fc de IgG3 em tais biomiméticos pode ser modificado para compreender fragmentos Fc parciais de qualquer imunoglobulina. Os monômeros compreendem a unidade de estradômero agrupado (a qual, conforme indicado acima, existe como uma associação dimérica de dois peptídeos) são "monômeros de unidade de estradômero agrupado". Um estresse agrupado exemplificativo que foi feito cuja unidade de estradômero agrupado não se ligaria mais de um receptor Fc gama com baixa afinidade antes de multimerização é: CH2 de IgE / dobradiça de IgG1 / CH2 de IgG1 / CH3 de IgG1.
[000128] Aqueles versados na técnica reconhecerão que, quando um estradômero serial é usado como a "perna" de um estradômero agrupado, cada "perna" será capaz de ligação de mais de um receptor Fc gama (uma vez que pelo menos dois domínios Fc estão presentes em um estradômero serial), assim, criando um biomimético capaz de ligação a mais de um receptor Fc gama. Domínios Fc parciais, outras sequências de imunoglobulina e sequências de não-imunoglobulina podem ser colocados nos términos de monômeros de unidade de estradômero agrupado individuais compreendendo as pernas para criar um estradômero agrupado, em que cada perna tem proximidade espacial preferida para aumentar sua disponibilidade de se ligar a um ou mais de um receptor Fc gama.
[000129] A região de multimerização pode ser uma sequência peptídica que faz com que os peptídeos dimerizem ou multimerizem e inclui a dobradiça de IgG2, o domínio CH2 de IgE, um zíper de isoleucina e um dedo de zinco. Conforme é conhecido na técnica, a região de dobradiça da IgG2 humana pode formar dímeros covalentes (Yoo, E.M. e colaboradores. J. Immunol. 170, 3134-3138 (2003); Salfeld Nature Biotech. 25, 1369-1372 (2007)). A formação de dímero de IgG2 é potencialmente mediada através da estrutura de dobradiça de IgG2 através de ligações de C-C (Yoo e colaboradores, 2003), sugerindo que a estrutura de dobradiça isoladamente pode mediar a formação de dímero. Assim, estradômeros seriais tendo uma dobradiça de IgG2 (e, assim, servindo como unidades de estradômero agrupado) formarão um estradômero que pode compreender dois estradômeros seriais ou mesmo três estradômeros seriais.
[000130] A sequência de aminoácido do monômero de dobradiça de IgG2 humana é como segue: ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 36). A estrutura central da dobradiça é a porção C-X-X-C do monômero de dobradiça. Assim, os monômeros de estradômero da presente invenção podem compreender a sequência completa com 12 aminoácidos do monômero de dobradiça de IgG2 ou os quatro aminoácidos centrais, junto com monômeros com domínio Fc. Embora X-X da estrutura central possa ser qualquer aminoácidos, em uma modalidade preferida, a sequência X-X é V-E ou P-P. Aqueles versados na técnica entenderão que o monômero de dobradiça de IgG2 pode ser compreendido de qualquer porção da sequência de dobradiça além da estrutura central com quatro aminoácidos, incluindo toda a sequência de dobradiça de IgG2 e algumas ou todas as sequências de domínio CH2 e CH3 de IgG2. Exemplos específicos de possíveis construtos de estradômero serial de dobradiça de IgG2 -domínio Fc de IgG1 são como segue:
Tabela 1
Figure img0001
Figure img0002
Nomenclatura: H = dobradiça, CH2 - domínio pesado constante, CH3 = domínio pesado Constante 3, 1 = IgG1, 2 = IgG2, X = qualquer aminoácido; 2x = duas dobradiças em ordem consecutiva
[000131] Esses são apenas alguns de muitos exemplos. Qualquer um dos domínios Fc de IgG1 pode, por exemplo, ser substituído por um modalidade Fc de IgG3. Proteínas adicionais com domínios de dimerização de IgG2 incluem proteínas quiméricas de IgG2-IgG1 com a adição de sequências N e/ou C terminais compreendendo sequências monoméricas com domínio de IgM ou IgE. Essas sequências N e C terminais podem ser regiões de dobradiça, domínios constantes ou ambos.
[000132] Conforme indicado acima, zíperes de leucina e isoleucina podem também ser usados como a região de multimerização. Zíperes de leucina e isoleucina (domínios enrolados em espiral) são conhecidos por facilitar a formação de dímeros, trímeros e tetrâmeros de proteína (Harbury e colaboradores. Science 262: 1401-1407 (1993); O'Shea e colaboradores. Science 243: 538 (1989)). Tomando vantagem da tendência natural de um zíper de isoleucina de formar um trímero, estradômeros agrupados podem ser produzidos usando estradômeros seriais compreendendo um zíper de isoleucina. A associação de três ou mais estradômeros seriais (as unidades de estradômero agrupado) tendo zíperes de isoleucina resulta na formação de estradômeros agrupados tendo pelo menos seis regiões de ligação a receptor Fc gama.
[000133] Embora aqueles versados na técnica entendam que diferentes tipos de zíperes de leucina e isoleucina podem ser usados. Em uma modalidade preferida, o zíper de isoleucina do regulador transcricional GCN4 modificado conforme descrito (Morris e colaboradores, Mol. Immunol. 44: 3112-3121 (2007); Harbury e colaboradores. Science 262: 1401-1407 (1993)) é usado: YTQKSLSLSPGKELLGGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGER GHGGGSNS QVSHRYPRFQSIKVQFTEYKKEKGFILTS (SEQ ID NO: 37). Essa sequência de zíper de isoleucina é apenas uma de várias sequências possíveis que podem ser usadas para multimerização de monômeros com domínio Fc. Embora a sequência toda mostrada em SEQ ID NO: 37 possa ser usada, a porção sublinhada da sequência representa a sequência central do zíper de isoleucina que pode ser usada nos estradômeros agrupados da presente invenção. Assim, monômeros de estradômero da presente invenção podem compreender a sequência completa com 88 aminoácidos do zíper de isoleucina (ILZ) ou o núcleo com 28 aminoácidos e, assim, pode compreender mais de 28 aminoácidos, mas menos de 88 aminoácidos do zíper de isoleucina. Exemplos específicos de possíveis construtos de ILZ - domínio Fc de IgG1 são mostrados como segue:
Tabela 2
Figure img0003
Nomenclatura: H = dobradiÇa, CH2 - domínio pesado constante, CH3 = domínio pesado Constante 3, 1 = IgG1, 3 = IgG3, ILZ = zíper de isoleucina
[000134] Esses são apenas uns poucos de muitos exemplos. Qualquer um dos domínios IgG1 pode, por exemplo, ser substituído por domínios de IgG3. Proteínas adicionais com domínios ILZ incluem proteínas quiméricas de IgG1 com a adição de sequências N e/ou C terminais de outras moléculas de Ig, tais como IgM ou IgE. Essas sequências N e C terminais podem ser regiões de dobradiça, domínios constantes ou ambos.
Estradômero com fragmento Fc
[000135] Um "estradômero com fragmento Fc" é compreendido de mais de um fragmento Fc. Sob determinadas circunstâncias atribuíveis à modificação pós-traducional do fragmento Fc, o fragmento Fc se liga com resistência suficiente a outro fragmento Fc para permitir a formação de uma molécula dupla que se liga a mais de um receptor Fcγ. A modificação pós-traducional que permite tal ligação inclui glicosilação e metilação. A identidade da linhagem de célula na qual os fragmentos Fc recombinantes são produzidos e condições sob as quais eles são produzidos orientam se fragmentos Fc formarão estradômeros de fragmento Fc. Por exemplo, um fragmento Fc recombinante produzido em uma célula de transfecção transitória CHO FreestyleMax forma multímeros que são visíveis sobre Western blots, se liga de acordo com uma adaptação bivalente sob um ensaio de ligação por ressonância em plasmônio e demonstra atividade biológica em um ensaio de células dendríticas comparada à IVIG. Em contraste, o mesmo fragmento Fc recombinante produzido em uma linhagem de células CHO estável não forma multímeros do fragmento Fc sobre Western blots, se liga de acordo com uma adaptação univalente sob um ensaio de ligação por ressonância em plasmônio e não demonstra atividade biológica comparável. Assim, um estradômero de fragmento Fc é um composto biomimético capaz de se ligar a dois ou mais receptores Fcγ.
[000136] Também conforme usado aqui, o termo "dímero de Fc" é um dímero de fragmentos Fc (veja Figura 2A), o termo "trímero de Fc" é um trímero de fragmentos Fc e o termo "multímero de Fc" é um multímero de fragmentos Fc (veja Figura 2B).
Estradocorpo
[000137] A presente invenção também abrange estradocorpos. Conforme usado aqui, "estradocorpo" refere-se a uma molécula compreendendo dois ou mais domínios Fc, de preferência no contexto de um estradômero (incluindo estradômeros seriais, estradômeros centrais, estradômeros agrupados e estradômeros com fragmento Fc) à qual um ou mais domínios Fab são presos (veja, por exemplo, Figuras 8A-B e 9A-B). Assim, em virtude de tais domínios Fab, estradocorpos têm capacidade de ligação a antígeno, bem como atividade de ligação ao receptor de estradômero Fcγ. Em algumas modalidades, a atividade de ligação ao receptor Fcγ pode ser em virtude de uma capacidade de se ligar e associar cruzadamente com o FcγR igual a ou maior do que a porção Fc de um holo-anticorpo de estrutura nativa. De preferência, a porção Fab do estradocorpo compreende uma cadeia pesada e uma leve. A cadeia pesada variável e a cadeia leve podem ser independentemente de qualquer imunoglobulina compatível, tal como IgA1, IgA2, IgM, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 e pode ser do mesmo ou de um isótipo de Ig diferente mas, de preferência, são do mesmo isótipo de Ig. As cadeias leves kappa ou lambda também podem ser de diferentes isótipos de Ig. Estradocorpos, assim como estradômeros, podem se ligar a dois ou mais FcyRs e modular a função imune.
[000138] Em uma modalidade, os estradômeros podem ter um Fab de uma imunoglobulina ligado a um domínio de dobradiça de Fc (H) de um estradômero para gerar um estradocorpo (por exemplo, Figuras 8A & B). Em outra modalidade, o estracorpo pode ser compreendido de Fc de IgG1 - (dobradiça - CH2) de IgG1 (por exemplo, Figur 9A). Em outras modalidades, o estracorpo pode compreender um domínio e dobradiça de IgG1, um domínio e dobradiça de IgG3 e um domínio e dobradiça de IgGE (por exemplo, Figura 9B). O Fab compreende uma cadeia pesada e uma leve, conforme encontrado em estruturas de imunoglobulina nativas (Figura 3A-B).
[000139] Estradocorpos possuirão as propriedades de ligação a antígeno da porção Fab e as propriedades do estradômero descritas acima. Tal combinação servirá para se ligar, associar cruzadamente e ativar receptores Fcγ sobre células efetuadoras em uma maior taxa do que pode ser realizado por uma parte principal Fc de um holo-anticorpo, particularmente no ambiente de baixa expressão de epítopo (por exemplo, 90% dos pacientes com câncer de mama cujos tumores não são classificados como tendo alta expressão de her/2-neu), induzindo à ADCC em um maior percentual de pacientes. Conforme indicado acima, um ou mais fragmentos Fab de ligação a antígeno podem ser adicionados aos estradômeros para formar estradocorpos. De preferência, polipeptídeos (outros que não as ligações descritas aqui) adicionados aos estradômeros não são totalmente ou parte de polipeptídeos de não-imunoglobulina.
[000140] O Fab pode ser uma estrutura quimérica compreendida de regiões constantes humanas e regiões variáveis não-humana, tal como a região variável de um anticorpo de camundongo, rato, coelho, macaco ou cabra. Aqueles versados na técnica serão capazes de fazer uma variedade de estruturas quiméricas de Fab para incorporação em estradocorpos usando metodologias atualmente disponíveis e descritas na literatura científica para tais construções. Assim, estradocorpos "humanizados" podem ser criados analogamente a anticorpos monoclonais "humanizados".
Variantes e homólogos
[000141] Aqueles versados na técnica entenderão que os estradômeros e outros biomiméticos da presente invenção podem ser criados para incluir domínios Fc de imunoglobulina específicos, tais como dois domínios Fc de IgG1 (isto é, dobradiça de IgG1/CH2 de IgG1/CH3 de IgG1/Dobradiça de IgG1/CH2 de IgG1/CH3 de IgG1). Tal estradômero poderia ser construído primeiro preparando um polinucleotídeo que codifica dois monômeros com domínio Fc de IgG1 (isto é, monômero de dobradiça de IgG1/monômero de CH2 de IgG1/monômero de CH3 de IgG1/monômero de Dobradiça de IgG1/monômero de CH2 de IgG1/monômero de CH3 de IgG1) e, então, expressão dos monômeros de estradômero a partir daí. Quando de associação de dois de tais monômeros de estradômero, um estradômero serial tendo dois domínios Fc de IgG1 será produzido.
[000142] Os estradômeros e outros biomiméticos da presente invenção também podem ser criados baseado na identidade e domínios Fc parciais de imunoglobulina específicos que compreendem os domínios Fc. Por exemplo, um estradômero serial poderia ser produzido tendo dois domínios Fc, onde o primeiro domínio Fc compreende Dobradiça de IgG1/CH2 de IgG3/CH3 de IgG1 e o segundo domínio Fc compreende Dobradiça de IgG3/CH2 de IgG1/CH3 de IgG3.
[000143] Deve ser entendido que os estradômeros e outras moléculas biomiméticas descritoas aqui podem ser derivadas de qualquer uma de uma variedade de espécies. Na verdade, domínios Fc ou domínios Fc parciais, em qualquer uma das moléculas biomiméticas da presente invenção, podem ser derivados de imunoglobulina de mais de uma espécie (por exemplo, de duas, três, quatro, cinco ou mais). Contudo, eles serão, mais comumente, derivados de uma única espécie. Além disso, será apreciado que qualquer um dos métodos descritos aqui (por exemplo, métodos de tratamento) pode ser aplicado a qualquer espécie. Geralmente, os componentes de um biomimético aplicado a uma espécie de interesse serão derivados dessa espécie. Contudo, biomiméticos nos quais todos os componentes são de uma espécie diferente ou são de mais de uma espécie (incluindo ou não a espécie à qual o método relevante é aplicado) também podem ser usados.
[000144] Os domínios CHI, CH2, CH3 e CH4 específicos e regiões de dobradiça que compreendem os domínios Fc e domínio Fc parciais dos estradômeros e outros biomiméticos da presente invenção podem ser independentemente selecionados, em termos da subclasse de imunoglobulina, bem como com relação ao organismo do qual eles são derivados. Consequentemente, os estradômeros e outros biomiméticos descritos aqui podem compreender domínios Fc e domínios Fc parciais que se originam, independentemente, de vários tipos de imunoglobulina, tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM. Similarmente, cada domínio Fc e domínio Fc parcial pode ser derivado de várias espécies, de preferência uma espécie de mamífero, incluindo primatas não-humanos (por exemplo, macacos, babuínos e chimpanzés), seres humanos, murino, rato, bovino, equino, felino, canino, suíno, coelhos, cabras, cervo, ovelha, furões, gerbil, porcos-da-índia, hâmsters, morcegos, pássaros (por exemplo, galinhas, perus e patos), peixes e répteis para produzir moléculas de estradômero quiméricas ou espécie-específicas.
[000145] Os domínios Fc e domínios Fc parciais individuais também podem ser humanizados. Aqueles versados na técnica entenderão que diferentes domínios Fc e domínios Fc parciais proporcionarão diferentes tipos de funcionalidades. Por exemplo, FcγRs se ligam especificamente à imunoglobulinas IgG e não à outras classes de imunoglobulina. Assim, aqueles versados na técnica, objetivando a criação de um estradômero com múltipla capacidade de ligação a receptor Fcy, criarão domínios Fc de estradômero que incorporam pelo menos as sequências de ligação a receptor Fcy bem caracterizadas de IgG, incluindo aquelas na região de dobradiça de IgG e nos domínio CH2 & CH3 de IgG. Aqueles versados na técnica também entenderão que várias consequências prejudiciais podem estar associadas ao uso de domínios de Ig particulares, tal como a anafilaxia associada à infusões de IgA. Os biomiméticos descritos aqui geralmente serão criados para evitar tais efeitos embora, em circunstâncias particulares, tais efeitos possam ser desejáveis.
[000146] A presente invenção também abrange estradômeros compreendendo domínios Fc e domínios Fc parciais tendo aminoácidos que diferem da sequência de aminoácido que ocorre naturalmente do domínio Fc ou domínio Fc parcial. Domínios Fc preferidos para inclusão nos compostos biomiméticos da presente invenção têm uma afinidade de ligação específica mensurável a um holo-receptor Fcγ ou uma porção de domínio extracelular solúvel de um FcγR. As sequências de aminoácido primárias e estruturas por cristalografia de raios X de numerosos domínios Fc e monômeros com domínio Fc estão disponíveis na técnica. Veja, por exemplo, Woof JM, Burton DR. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nat Rev Immunol. Fevereiro de 2004; 4(2): 89-99. Domínios Fc representativos com capacidade de ligação ao receptor Fcy incluem os domínios Fc de imunoglobulina G humana isótipos 1-4 (hIgG1_4) (SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 7, respectivamente; veja também Figura 15A-D). (Veja Fig. 2 de Robert L. Shields e colaboradores, High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII e FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR. J. Biol. Chem., Fevereiro de 2001; 276: 6591 -6604). Essas sequências nativas foram submetidas à análise de estrutura-função extensiva, incluindo mapeamento por mutagênese sítio-dirigida, de sequências funcionais14. Baseado nesses estudos de estrutura-função anteriores e nos dados de cristalografia disponíveis, aqueles versados na técnica podem criar variantes de sequência com domínio Fc funcionais (por exemplo, de SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 7), ao mesmo tempo em que preserva a capacidade de ligação ao receptor Fcγ do domínio Fc.
[000147] As alterações de aminoácido podem ser encontradas pela sequência do domínio Fc ou ser isoladas a domínios Fc parciais em particular que compreendem o domínio Fc. As variantes funcionais do domínio Fc usadas nos estradômeros e outros biomiméticos da presente invenção terão pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a um domínio Fc nativo. Similarmente, as variantes funcionais dos domínios Fc parciais usados nos estradômeros e outros biomiméticos da presente invenção terão pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a um domínio Fc parcial nativo.
[000148] Aqueles versados na técnica apreciarão que a presente invenção ainda abrange o uso de variantes funcionais de monômeros com domínio Fc na construção de monômeros de fragmento Fc, monômeros com fragmento Fc parcial, monômeros de estradômero e os outros monômeros da presente invenção. As variantes funcionais dos monômeros com domínio Fc terão pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a uma sequência de monômero com domínio Fc nativa.
[000149] Similarmente, a presente invenção também abrange o uso de variantes funcionais de monômeros de domínio Fc parcial na construção de monômeros de fragmento Fc, monômeros com fragmento Fc parcial, monômeros com domínio Fc, monômeros de estradômero e os outros monômeros da presente invenção. As variantes funcionais dos monômeros com domínio Fc parcial terão pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à sequência do monômero com domínio Fc parcial nativo.
[000150] As alterações de aminoácido podem diminuir, aumentar ou deixar inalterada a afinidade de ligação do estradômero ao receptor Fcγ. De preferência, tais alterações de aminoácido serão substituições conservativas de aminoácido, contudo, tais alterações incluem deleções, adições e outras substituições. Substituições conservativas de aminoácido incluem, tipicamente, alterações dentro dos seguintes grupos: glicina e alanina; valina, isoleucina e leucina; ácido aspártico e ácido glutâmico; asparagina, glutamina, serina e treonina; lisina, histidina e arginina; e fenilalanina e tirosina.
[000151] O termo "variante funcional", conforme usado aqui, refere-se a uma sequência relacionada, por homologia, a uma sequência de referência a qual é capaz de mediar os mesmos efeitos biológicos que a sequência de referência (quando um polipeptídeo) ou a qual codifica um polipeptídeo que é capaz de mediar os mesmos efeitos biológicos que um polipeptídeo codificado pela sequência de referência (quando um polinucleotídeo). Por exemplo, uma variante funcional de qualquer um dos biomiméticos aqui descrito teria uma homologia ou identidade especificada e seria capaz de modulação imune de DCs. Variantes de sequência funcionais incluem polinucleotídeos e polipeptídeos. A identidade de sequência é em geral, avaliada usando o BLAST 2.0 (Basic Local Alignment Search Tool), operando com os parâmetros de default: Filter - Ligado, Matriz de Escore - BLOSUM62, Tamanho de Palavra -3 e valor - 10, Penalidades por Gap - 11,1 e Alinhamentos -50.
[000152] A partir do acima, será apreciado que os estradômeros da presente invenção incluem estradômeros tendo: (a) apenas domínios Fc que ocorrem naturalmente; (b) uma mistura de domínios Fc que ocorrem naturalmente e domínios Fc com sequências de aminoácido alteradas; e (c) apenas domínios Fc com sequências de aminoácido alteradas. Tudo que é requerido é que estradômeros contendo sequências de aminoácido alteradas tenham pelo menos 25%; 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99%; 99,5%; ou 100% ou mesmo mais da capacidade de um estradômero correspondente compreendendo domínios Fc com sequências que ocorrem naturalmente de se ligar a dois ou mais receptores Fcγ.
[000153] Os sítios de ligação a receptor Fcγ antes mencionados que ocorrem nos estradômeros e estradocorpos da presente invenção podem ter a sequência alterada através de engenharia genética para derivar previsivelmente sítios de ligação com capacidades e afinidades de ligação alteradas com relação a uma sequência nativa. Por exemplo, resíduos específicos podem ser alterados para reduzir a ligação do domínio Fc dos compostos biomiméticos ao FcγRII, ao mesmo tempo em que aumenta a ligação ao FcγRIIIa. Um exemplo de uma análise de estrutura-função baseada em mutagênese extensiva para sequências de ligação ao receptor Fcy de hlgG é Robert L. Shields e colaboradores, High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII e FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR. J. Biol. Chem., Fevereiro de 2001; 276: 6591 - 6604. Estudos similares foram realizados sobre Fc de IgG de murino (Fc de mlgG). Baseado nas homologias de sequência estrutural e primária dos domínios Fc de IgG nativos dentre as espécies, aqueles versados na técnica podem traduzir o conhecimento de estrutura-função extensivo de Fc de hlgG e Fc de mlgG em mutagênese racional de todas as sequências com sítio de ligação ao receptor Fcγ nos compostos biomiméticos da presente invenção para criar especificidades e afinidade de ligação particulares pelo receptor Fcγ.
[000154] Além da composição de sequência de aminoácido de domínios Fc nativos, o teor de carboidrato do domínio Fc é conhecido por exercer um papel importante sobre a estrutura do domínio Fc e interações de ligação com FcγR. Veja, por exemplo, Robert L. Shields e colaboradores, Lack of Fucose on Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human FcyRIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. J. Biol. Chem., Julho de 2002; 277: 2673326740 (doi:10.1074/jbc.M202069200); Ann Wright e Sherie L. Morrison. Effect of C2-Associated Carbohydrate Structure on Ig Effector Function: Studies with Chimeric Mouse-Human IgG1 Antibodies in Glycosylation Mutants of Chinese Hamster Ovary Cells. J. Immunol., Abril de 1998; 160: 3393 - 3402. O teor de carboidrato pode ser controlado usando, por exemplo, sistemas de expressão de proteína em particular incluindo linhagens de célula particulares ou modificação enzimática in vitro. Assim, a presente invenção inclui estradômeros e estradocorpos compreendendo domínios Fc com o teor de carboidrato nativo do holo-anticorpo do qual os domínios foram obtidos, bem como aqueles compostos biomiméticos que tem um teor de carboidrato alterado.
[000155] A adição, à cadeia polipeptídica, de um domínio Fc parcial, uma região de multimerização ou alterações de glicosilação, pode criar uma alteração conformacional no domínio Fc, permitindo ligação intensificada do domínio Fc ao receptor Fcγ. Assim, provavelmente, alterações minimas no polipeptídeo podem também criar um estradômero capaz de ligação a múltiplos receptores Fcγ.
Domínios parciais e fragmentos parciais
[000156] Aqueles versados na técnica ainda reconhecerão que os domínios Fc e domínios Fc parciais usados nas modalidades da presente invenção não precisam ser versões com comprimento total. Isto é, a presente invenção abrange o uso de monômeros de domínio Fc e monômeros de domínio Fc parcial carecendo de aminoácidos do amino término, carbóxi término ou meio dos monômeros de domínio Fc e monômeros de domínio Fc parcial particulares que compreendem os estradômeros e outros biomiméticos da presente invenção.
[000157] Por exemplo, o sítio de ligação sobre as imunoglobulinas IgG humanas para receptores Fcγ foi descrito (por exemplo, Radaev, S., Sun, P., 2001. Recognition of Immunoglobulins by Fcγ Receptors. Molecular Immunology 38, 1073 - 1083; Shields, R.L. e colaboradores, 2001. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR. J. Biol. Chem. 276 (9), 6591-6604). Baseado nesse conhecimento, pode-se remover aminoácidos do domínio Fc dessas imunoglobulinas e determinar os efeitos sobre a interação de ligação entre o domínio Fc e o receptor. Assim, a presente invenção abrange domínios Fc de IgG tendo pelo menos cerca de 90% dos aminoácidos abrangendo as posições 233 a 338 da dobradiça inferior e CH2, conforme definido em Radaev, S., Sun, P., 2001.
[000158] Imunoglobulinas IgG com domínios Fc parciais da presente invenção incluem toda ou parte da região de dobradiça, todo ou parte do domínio CH2 e todo ou parte do domínio CH3.
[000159] Os domínios Fc parciais de IgG tendo apenas uma parte da região de dobradiça, parte do domínio CH2 ou parte do domínio CH3 são construídos a partir de monômeros de domínio Fc parcial. Assim, a presente invenção inclui monômeros da região de dobradiça de IgG derivados do N-término da região de dobradiça ou do C-término da região de dobradiça. Eles podem, assim, conter, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 ou 62 (até 15 para IgG1, até 12 para IgG2, até 62 para IgG3, até 12 para IgG4) aminoácidos da região de dobradiça.
[000160] A presente invenção também inclui monômeros de domínio CH2 de IgG derivados do N-término do domínio CH2 ou do C-término do domínio CH2. Eles podem, assim, conter, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 ou 110 (até 110 para IgG1 e IgG3, até 109 para IgG2 e IgG4) aminoácidos do domínio CH2.
[000161] A presente invenção ainda inclui monômeros de domínio CH3 de IgG derivados do N-término do domínio CH3 ou do C-término do domínio CH3. Eles podem, assim, conter, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ou 107 (até 106 para IgG1 e IgG3, até 107 para IgG2 e IgG4) aminoácidos do domínio CH3.
[000162] Domínios Fc parciais de imunoglobulinas IgA1, IgA2 e IgD da presente invenção incluem toda ou parte da região de dobradiça, todo ou parte do domínio CH2 e todo ou parte do domínio CH3. Além disso, todo ou parte do domínio CH1 da imunoglobulina IgA1, IgA2 ou IgD pode ser usado como domínios Fc parciais.
[000163] Os domínios parciais de IgA1, IgA2 e IgD tendo apenas uma parte da região de dobradiça, parte do domínio CH1, parte do domínio CH2 ou parte do domínio CH3 são construídos a partir de monômeros de domínio Fc parcial. Assim, a presente invenção inclui monômeros da região de dobradiça derivados do N-término da região de dobradiça ou do C-término da região de dobradiça de IgA1, IgA2 ou IgD. Eles podem, assim, conter, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ou 64 (até 26 para IgA1, até 13 para IgA2, até 64 para IgD) aminoácidos da região de dobradiça.
[000164] A presente invenção inclui monômeros de domínio CH2 derivados do N-término do domínio CH2 ou do C-término do domínio CH2 de IgA1, IgA2 ou IgD. Eles podem, assim, conter, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ou 107 (até 102 para IgA1, até 96 para IgA2, até 107 para IgD) aminoácidos do domínio CH2.
[000165] A presente invenção inclui domínios CH3 derivados do N- término do domínio CH3 ou do C-término dos domínios CH3 de IgA1, IgA2 ou IgD. Eles podem, assim, conter, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 ou 131 (até 113 para IgA1, até 131 para IgA2, até 110 para IgD) aminoácidos do domínio CH3.
[000166] Domínios Fc parciais de imunoglobulinas IgM e IgE da presente invenção incluem todo o parte do domínio de dobradiça / CH2, todo ou parte do domínio CH3 e todo ou parte do domínio CH4 dessas moléculas. Além disso, todo ou parte do domínio CH1 das imunoglobulinas IgM e IgE pode ser usado como domínios Fc parciais.
[000167] Os domínios parciais de IgM e IgE tendo apenas uma parte do domínio de dobradiça / CH2, parte do domínio CH3 ou parte do domínio CH4 são construídos a partir de monômeros de domínio Fc parcial. Assim, a presente invenção inclui monômeros de domínio de dobradiça / CH2 derivados do N-término do domínio de dobradiça / CH2 ou do C-término do domínio de dobradiça / CH2 de IgM ou IgE. Eles podem, assim, conter, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 ou 112 (até 112 para IgM, até 109 para IgE) aminoácidos do domínio de dobradiça / CH2.
[000168] A presente invenção inclui monômeros de domínio CH3 de IgM e IgE derivados do N-término do domínio CH3 ou do C-término do domínio CH3 de IgM ou IgE. Eles podem, assim, conter, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ou 106 (até 106 para IgM, até 105 para IgE) aminoácidos do domínio CH3.
[000169] A presente invenção inclui monômeros de domínio CH4 de IgM e IgE derivados do N-término do domínio CH4 ou do C-término do domínio CH4 de IgM ou IgE. Eles podem, assim, conter, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 ou 130 (até 130 para IgM, até 105 para IgE) aminoácidos do domínio CH4. Contudo, partes do domínio CH4 de IgM ou IgE que incluem a extremidade C-terminal do domínio CH4 terão, de preferência, mais de 18 aminoácidos de comprimento e, mais preferivelmente, terão mais de 30 aminoácidos de comprimento e, ainda mais preferivelmente, terão mais de 50 aminoácidos de comprimento.
[000170] A partir do acima, será apreciado que diferentes modalidades da presente invenção incluem estradômeros contendo: (a) domínios Fc de comprimento total; (b) uma mistura de domínios Fc de comprimento total e domínios Fc parciais; e (c) domínios Fc parciais. Em cada uma dessas modalidades, os estradômeros podem ainda compreender domínios CH1. Conforme discutido aqui, em cada modalidade desses estradômeros da presente invenção, os estradômeros têm a capacidade de se ligar a dois ou mais receptores Fcγ.
Modalidades preferidas de Estradômeros e Monômeros de estradômero
[000171] Os seguintes são exemplos de monômeros de estradômero da presente invenção:
  • 1. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1
  • 2. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG3 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1
  • 3. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG3 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1
  • 4. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1
  • 5. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG3 - CH3 de IgG1
  • 6. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG3
  • 7. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG3 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1
  • 8. Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1
  • 9. Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1
  • 10. Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG3 - Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG3 - CH3 de IgG3
  • 11. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG3 - CH3 de IgG3 -Dobradiça de IgG1 -CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1
  • 12. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG3 - Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG3 -CH3 de IgG3 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1
  • 13. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG3 - CH3 de IgG3 -Dobradiça de IgG1 -IgG2 CH2 - CH3 de IgG3
  • 14. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 - IgG4 dobradiça - IgG4 CH2 - CH3 de IgG4 - Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1
[000172] Em cada uma dessas modalidades e nas outras modalidades apresentadas aqui, deve ser entendido que ligações de domínio podem ser usadas para ligar os monômeros de domínio Fc parcial individuais que compõem os monômeros de estradômero. Em uma modalidade, os monômeros de domínio Fc parciais mostrados para cada um dos monômeros de estradômero apresentados acima são monômeros de domínio parcial Fc humanos.
[000173] A presente invenção inclui estradômeros compreendendo dois ou mais dos monômeros de estradômero listados acima. Em modalidades preferidas, a presente invenção inclui estradômeros seriais compreendendo dois monômeros de estradômero idênticos proporcionados acima.
[000174] Conforme indicado acima, a funcionalidade de ligação do estradômero a mais de um receptor Fcγ também pode ser obtida através de incorporação de uma cadeia J como uma porção central em um estradômero central, similar a uma molécula de IgM ou IgA natural. NAs imunoglobulinas IgA e IgM, a cadeia de união (J) é um peptídeo de 15 kDa que une as cadeias pesada e leve de anticorpos IgA e IgM através de ligações em ponte de dissulfeto com um "pedaço de cauda secretório" de 18 aminoácidos das porções Fc dos anticorpos. Braathen, R. e colaboradores, The Carboxyl-terminal Domains of IgA and IgM Direct Isotype-specific Polymerization and Interaction with the Polymeric Immunoglobulin Receptor, J. Bio. Chem. 277(45), 4275542762 (2002).
[000175] Tais estradômeros centrais podem ser compreendidos de monômeros de estradômero contendo um domínio Fc de CH4 que ocorre naturalmente, de preferência de imunoglobulinas IgM, desse modo, permitindo associação dos estradômero compreendendo tais monômeros de estradômero a uma cadeia J (veja Figuras 10A-10D). Os seguintes são exemplos de monômeros de estradômero os quais podem autodimerizar para formar um estradômero e, então, ser associados com uma cadeia J para formar um estradômero central composto de uma pluralidade (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, quinze, dezoito, vinte ou mais) de estradômeros:
  • 1. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 - CH4 de IgM (veja Figuras 10C-10D)
  • 2. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG3 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 - CH4 de IgM
  • 3. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG3 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 - CH4 de IgM (veja Figuras 10A-10B)
  • 4. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 - CH4 de IgM
  • 5. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG3 - CH3 de IgG1 - CH4 de IgM
  • 6. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 - CH4 de IgM
  • 7. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG3 - CH4 de IgM
  • 8. Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG3 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -CH4 de IgM
  • 9. Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 - CH4 de IgM
  • 10. Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 - CH4 de IgM
  • 11. Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG1 - CH3 de IgG1 -Dobradiça de IgG1 - CH2 de IgG1 - Dobradiça de IgG1 -CH2 de IgG3 -CH3 de IgG3 - CH4 de IgM
[000176] Em cada uma dessas modalidades e nas outras modalidades apresentadas aqui, deve ser entendido que ligações de domínio podem ser usadas para ligar os monômeros de domínio Fc parcial individuais que compõem os monômeros de estradômero. Em uma modalidade, os monômeros de domínio Fc parcial mostrados para cada um dos monômeros de estradômero apresentados acima são monômeros de domínio Fc parcial humano.
[000177] Estradômeros centrais baseados em uma cadeia J também podem ser compreendidos de fragmentos Fc, fragmentos Fc parciais e/ou domínios Fc que têm um domínio Fc de CH4. Nesse exemplo, cada um dos fragmentos Fc, fragmentos Fc parciais e domínios Fc tendo um domínio Fc de CH4 ligado à porção central pode conter apenas um sítio de ligação de receptor Fcγ mas, no contexto da tal estradômero central, forma um biomimético imunologicamente ativo contendo mais de um sítio de ligação de receptor Fcγ. Aqueles versados na técnica reconhecerao que domínios Fc parciais de diferentes imunoglobulinas nativas podem ser usados para gerar os fragmentos Fc funcionais, fragmentos Fc parciais e domínios Fc de tal estradômero central. Os seguintes são exemplos de monômeros de fragmentos Fc, fragmentos Fc parciais e domínios Fc os quais podem autodimerizar e, então, ser associados com uma cadeia J para formar um estradômero central:
  • 1. Dobradiça de IgG1 - - CH2 de IgG1 - -IgGICFB- - CH4 de IgM
  • 2. Dobradiça de IgG3 - - CH2 de IgG1 - -IgG1CFB- - CH4 de IgM
  • 3. Dobradiça de IgG1 - - CH2 de IgG3 - -IgG1CFB- - CH4 de IgM
  • 4. Dobradiça de IgG1 - - CH2 de IgG1 - - CH3 de IgG3 - - CH4 de IgM
  • 5. Dobradiça de IgG1 - - CH2 de IgG3 - - CH3 de IgG3 - - CH4 de IgM
  • 6. Dobradiça de IgG3 - - CH2 de IgG3 - -IgG1CFB- - CH4 de IgM
  • 7. Dobradiça de IgG3 - - CH2 de IgG3 - -IgG1CFB- - CH4 de IgM
  • 8. Dobradiça de IgG1 - - CH2 de IgG3 - - CH3 de IgG2 - - CH4 de IgM
  • 9. Dobradiça de IgG1 - - Dobradiça de IgG3 - CH2 de IgG3 : - CH3 de IgG2 -CH4 de IgM
  • 10. Dobradiça de IgG1 - - CH2 de IgG1 - -IgG1CFB- - CH4 de IgE - CH4 de IgM
[000178] Em cada uma dessas modalidades e nas outras modalidades apresentadas aqui, deve ser entendido que as ligações de domínio podem ser usadas para ligar os monômeros de domínio Fc parcial individuais que compõem os monômeros de estradômero. Em uma modalidade, os monômeros de domínio Fc parcial mostrados para cada um dos monômeros de estradômero apresentados acima são monômeros de domínio Fc parcial humanos.
[000179] Está claro, a partir dos exemplos acima, que monômeros de estradômero podem ser de diferentes comprimentos e composições para atingir o objetivo, quando associados através de autoagregação ou ligações intermonômero de estradômero a um segundo monômero de estradômero e associados a uma cadeia J, produzindo um estradômero central contendo mais de um sítio de ligação a receptor Fcγ. Os exemplos não são, de forma alguma, limitativos e aqueles versados na técnica apreciarão que múltiplas outras configurações de estradômero nos estradômeros são possíveis.
Receptores Fcγ
[000180] Os termos "FcγR" e "receptor Fcγ", conforme usado aqui, incluem cada membro da família do receptor Fc gama de proteínas expresso sobre superfícies de células imunes, conforme descrito em Nimmerjahn F e Ravetch JV. Fcgamma receptors: old friends and new family members. Immunity. Janeiro de 2006; 24(1): 19-28 ou conforme possa ser definido depois. Pretende-se que o termo "FcγR" aqui descrito abranja todos os membros das famílias Fc gama RI, RII e RIII. O receptor Fcy inclui receptores Fcγ de baixa e alta afinidade incluindo, mas não limitado a, FcγRI (CD64); FcγRII (CD32) e seus isótipos e alótipos, FcγRIIa LR, FcγRIIa HR, FcγRIIb e FcγRIIc; FcγRIII (CD 16) e seus isotipos FcγRIIIa e FcγRIIIb. Aqueles versados na técnica reconhecerão que a presente invenção, a qual inclui compostos que se ligam ao Fcγ, se aplicará a futuros FcγRs e isótipos e alótipos associados que podem ainda não ter sido descobertos.
[000181] Foi descrito que a IVIG se liga a e satura completamente o receptor Fc neonatal ("FcRn") e que tal inibição competitiva do FcRn pode exercer um papel importante na atividade biológica da IVIG (por exemplo, Mechanisms of Intravenous Immunoglobulin Action in Immune Thrombocytopenic Purpura. F. Jin, J. Balthasar. Human Immunology, 2005, Volume 66, Edição 4, Páginas 403-410). Uma vez que imunoglobulinas que se ligam fortemente a receptores Fcy também se ligam, pelo menos até algum grau, ao FcRn, aqueles versados na técnica reconhecerão que estradômeros os quais são capazes de ligação a mais de um receptor Fcy também se ligarão a e podem saturar completamente o FcRn.
[000182] "Atividade imunológica de IgG nativa agregada" refere-se às propriedades de IgG multimerizada as quais conferem o funcionamento de um sistema imune quando de exposição do sistema imune aos agregados de IgG. Propriedades específicas da IgG multimerizada nativa incluem ligação específica alterada a FcyRs, ligação cruzada de FcyRs sobre as superfícies de células imunes ou uma funcionalidade efetuadora de IgG multimerizada, tal como citotoxicidade célula-mediada anticorpo-dependente (ADCC), fagocitose (ADCP) ou fixação de complemento (veja, por exemplo, Nimmerjahn F, Ravetch JV. The anti-inflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 2007; 204: 11-15; Augener W, Friedman B, Brittinger G. Are aggregates of IgG the effective part of high-dose immunoglobulin therapy in adult idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)? Blut. 1985; 50: 249-252; Arase N, Arase H, Park SY, Ohno H, Ra C, Saito T. Association with FcRgamma is essential for activation signal through NKR-Pl (CD 161) in natural killer (NK) cells and NK1.1+ T cells. J Exp Med. 1997; 186: 1957-1963; Teeling JL, Jansen-Hendriks T, Kuijpers TW. e colaboradores. Therapeutic efficacy of intravenous immunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies in experimental immune thrombocytopenia. Blood. 2001; 98: 1095-1099; Anderson CF, Mosser DM. Cutting edge: biasing immune responses by directing antigen to macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 2002; 168: 3697-3701; Jefferis R, Lund J. Interaction sites on human IgG-Fc for Fc[gamma]R: current models. Immunology Letters. 2002; 82: 57; Banki Z, Kacani L, Mullauer B. e colaboradores. Cross-Linking of CD32 Induces Maturation of Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Via NF-{kappa} B Signaling Pathway. J Immunol. 2003; 170: 3963-3970; Siragam V, Brine D, Crow AR, Song S, Freedman J, Lazarus AH. Can antibodies com specificity for soluble antigens mimic the therapeutic effects of intravenous IgG in the treatment of autoimmune disease? J Clin Invest. 2005; 115: 155-160). Essas propriedades são geralmente avaliadas através de comparação com as propriedades da IgG monomérica.
[000183] "Comparável a ou superior a uma ligação cruzada de receptor Fcγ ou uma funcionalidade efetuadora de uma pluralidade de imunoglobulinas IgG agregadas que ocorrem naturalmente", conforme usado aqui, significa que o estradômero gera um valor de ensaio de cerca de 70% ou mais do valor obtido usando IVIG. Em algumas modalidades, o valor de ensaio está pelo menos dentro da faixa de erro padrão dos valores de ensaio obtidos usando IVIG. Em outras modalidades, o valor de ensaio é de 110% ou maior do que aquele da IVIG. Ensaios para ligação cruzada ao FcγR são bem conhecidos por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Falk Nimmerjahn e Jeffrey Ravetch. Fey receptors as regulators of immune responses. Nature Reviews Immunology, publicação antecipada on line em 7 de Dezembro de 2007).
[000184] "Atividades de modulação imune", "resposta de modulação imune", "modulação do sistema imune" e "modulação imune" significam alteração dos sistemas imunes através de alteração das atividades, capacidades e números relativos de uma ou mais células imunes, incluindo maturação de um tipo de célula dentro de seu tipo de célula ou em outros tipos de célula. Por exemplo, modulação imune de monócitos imaturos pode levar à maiores populações de monócitos mais maduros, células dendríticas, macrofagos ou osteoclastos, todos os quais são derivados de monócitos imaturos. Por exemplo, receptores de células imunes podem ser ligados através de biomiméticos imunologicamente ativos e ativar a sinalização intracelular para induzir à várias alterações de célula imune, referida separadamente como "ativação de modulação imune". Bloqueio de receptores de célula imune para prevenir ativação de receptor também é abrangido dentro de "modulação imune" e pode ser separadamente referido como "modulação imune inibitória".
[000185] Modulação de maturação de um monócito refere-se à diferenciação de um monócito em uma DC madura, um macrofago ou um osteoclasto. Diferenciação pode ser modulada para acelerar a taxa de maturação e/ou aumentar o número de monócitos que sofrem diferenciação. Alternativamente, a diferenciação pode ser reduzida em termos de taxa de diferenciação e/ou número de células que sofrem diferenciação.
[000186] O termo polipeptídeo ou peptídeo "isolado", conforme usado aqui, refere-se a um polipeptídeo ou um peptídeo o qual não tem contra-parte que ocorre naturalmente ou foi separado ou purificado de componentes os quais o acompanham naturalmente, por exemplo, em tecidos tais como pâncreas, fígado, baço, ovário, testículo, músculo, tecido articular, tecido neural, tecido gastrointestinal ou tecido de mama ou tecido de tumor (por exemplo, tecido de câncer de mama) ou fluidos corporais, tais como sangue, soro ou urina. Tipicamente, o polipeptídeo ou peptídeo é considerado "isolado" quando ele é pelo menos 70%, em peso seco, isento das proteínas e outras moléculas orgânicas que ocorrem naturalmente com as quais ele está naturalmente associado. De preferência, um preparado de um polipeptídeo (ou peptídeo) da invenção é pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 99%, em peso seco, do polipeptídeo (peptídeo), respectivamente, da invenção. Uma vez que um polipeptídeo ou peptídeo quimicamente sintetizado é, por sua natureza, separado dos componentes que o acompanham naturalmente, o polipeptídeo ou peptídeo sintético é "isolado".
[000187] Um polipeptídeo (ou peptídeo) isolado da invenção pode ser obtido, por exemplo, através de extração de uma fonte natural (por exemplo, de tecidos ou fluidos corporais); através de expressão de um ácido nucleico recombinante que codifica o polipeptídeo ou peptídeo; ou através de síntese química. Um polipeptídeo ou peptídeo que é produzido em um sistema celular diferente da fonte do qual ele se origina naturalmente é "isolado" porque ele será necessariamente isento de componentes os quais o acompanham naturalmente. O grau de isolamento ou pureza pode ser medido através de qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida ou análise por HPLC.
Composições farmacêuticas
[000188] A administração das composições de biomimético imunologicamente ativo descritas aqui será através de qualquer via comum, oral, parenteral ou topicamente. Vias exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, oral, nasal, bucal, retal, vaginal, oftálmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intratumoral, espinhal, intratraqueal, intraarticular, intraarterial, subaracnoide, sublingual, mucosal, brônquica, linfática, intrauterina, subcutânea, intratumor, integrada sobre um dispositivo implantável, intradural, intracortical ou dérmica. Tais composições normalmente serão administradas como uma composição farmaceuticamente aceitável, conforme descrito aqui. Em uma modalidade preferida, o biomimético imunologicamente ativo isolado é administrado intravenosamente.
[000189] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável", conforme usado aqui, inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e para retardo de absorção e semelhantes. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com os vetores ou células da presente invenção, seu uso em composições terapêuticas é considerado. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[000190] As composições de biomimético imunologicamente ativo da presente invenção podem ser formuladas em uma forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteína) e os quais são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico ou ácidos orgânicos, tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxido de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico e bases orgânicas, tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes.
[000191] Soluções injetáveis estéreis são preparadas através de incorporação do biomimético imunologicamente ativo na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas através de incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril, o qual contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para o preparo de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparo preferidos são técnicas de secagem a vácuo e liofilização, as quais proporcionam um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional, de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo.
[000192] Ainda, uma modalidade é uma composição de biomimético imunologicamente ativo adequada para administração oral proporcionada em um veículo farmaceuticamente aceitável com ou sem um diluente inerte. O veículo deverá ser assimilável ou comestível e inclui líquidos, semissólidos, isto é, pastas ou veículos sólidos. Exceto na medida em que qualquer meio, agente, diluente ou veículo convencional é prejudicial para o recipiente ou a eficácia terapêutica de um preparado de biomimético imunologicamente ativo contido no mesmo, seu uso em uma composição de biomimético imunologicamente ativo oralmente administrável para uso na prática dos métodos da presente invenção é apropriado. Exemplos de veículos ou diluentes incluem gorduras, óleos, água, soluções salina, lipídios, lipossomas, resinas, aglutinantes, enchedores e semelhantes ou combinações dos mesmos. O termo "administração oral", conforme usado aqui, inclui administração oral, bucal, enteral ou intragástrica.
[000193] Em uma modalidade, a composição é combinada com o veículo de qualquer maneira conveniente e prática, isto é, através de solução, suspensão, emulsificação, mistura, encapsulação, microencapsulação, absorção e semelhantes. Tais procedimentos são rotina para aqueles versados na técnica.
[000194] Em uma modalidade específica, a composição de biomimético imunologicamente ativo na forma em pó é combinada ou misturada completamente com um veículo semissólido ou sólido. A mistura pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, tal como através de trituração. Agentes de estabilização podem também ser adicionados no processo de mistura de forma a proteger a composição de perda de atividade terapêutica, por exemplo, através de desnaturação no estômago. Exemplos de estabilizantes para uso em uma composição oralmente administrável incluem tampões, antagonistas à secreção de ácidos do estômago, aminoácidos, tais como glicina e lisina, carboidratos, tais como dextrose, manose, galactose, lactose, sacarose, maltose, sorbitol, manitol, etc., inibidores de enzima proteolítica e semelhantes. Mais preferivelmente, para uma composição oralmente administrada, o estabilizante também pode incluir antagonistas à secreção de ácidos do estômago.
[000195] Ainda, a composição de biomimético imunologicamente ativo para administração oral a qual é combinada com um veículo semissólido ou sólido pode ainda ser formulada em cápsulas de gelatina com envoltório duro ou mole, comprimidos ou pílulas. Mais preferivelmente, cápsulas de gelatina, tabletes ou pílulas são entericamente revestidos. Revestimentos entéricos impedem a desnaturação da composição no estômago ou intestino superior, onde o pH é ácido. Veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 5.629.001. Quando atinge o intestino delgado, o pH básico no mesmo dissolve o revestimento e permite que a composição seja liberada para interagir com as células intestinais, por exemplo, células M da placa de Peyer.
[000196] Em outra modalidade, a composição de biomimético imunologicamente ativo na forma em pó é combinada ou misturada completamente com materiais que criam uma nanopartícula que encapula o biomimético imunologicamente ativo ou à qual o biomimético imunologicamente ativo é preso. Cada nanopartícula terá um tamanho de menos do que ou igual a 100 mícrons. A nanopartícula pode ter propriedades mucoadesivas que permitem a absorção gastrointestinal de um biomimético imunologicamente ativo que, de outro modo, não estaria oralmente biodisponível.
[000197] Em outra modalidade, uma composição em pó é combinada com um veículo líquido tal como água ou uma solução salina, com ou sem um agente de estabilização.
[000198] Uma formulação de biomimético imunologicamente ativo específica que pode ser usada é uma solução da proteína biomimética imunologicamente ativa em um tampão baseado em fosfato hipotônico que é isenta de potássio, onde a composição do tampão é como segue: monohidrato monobásico de fosfato de sódio a 6 mM, heptahidrato dibásico de fosfato de sódio a 9 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH de 7,0 ± 0,1. A concentração da proteína biomimética imunologicamente ativa em um tampão hipotônico pode oscilar de 10 microgramas/ml a 100 miligramas/ml. Essa formulação pode ser administrada através de qualquer via de administração, por exemplo, mas não limitado a, administração intravenosa.
[000199] Ainda, uma composição de biomimético imunologicamente ativo para administração tópica o qual é combinado com um veículo semissólido pode ser ainda formulada em um creme ou pomada de gel. Um veículo preferido para a formação de uma pomada de gel é um polímero de gel. Polímeros preferidos que são usados para fabricar uma composição de gel da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, carbopol, carbóximetil celulose e polímeros Pluronic. Especificamente, uma composição de multímero de Fc em pó é combinada com um gel aquoso contendo um agente de polimerização, tal como Carbopol 980, em resistências entre 0,5% e 5% em peso/volume para aplicação à pele para tratamento da doença sobre ou por baixo da pele. O termo "administração tópica", conforme usado aqui, inclui aplicação a uma superfície dérmica, epidérmica, subcutânea ou mucosal.
[000200] Quando de formulação, soluções são administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade tal conforme é terapeuticamente eficaz para resultar em uma melhora ou remediação dos sintomas. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como soluções ingeríveis, cápsulas para liberação de fármaco e semelhantes. Alguma variação na dosagem pode ocorrer, dependendo da condição do indivíduo que está sendo tratado. A pessoa responsável pela administração pode, em qualquer caso, determinar a dose apropriada para o indivíduo. Além disso, para administração a seres humanos, preparados deverão ir de encontro aos padrões de esterilidade, segurança geral e pureza, conforme requerido pelas normas do FDA Office of Biologies.
[000201] A via de administração variará, naturalmente, com a localização e natureza da doença que está sendo tratada e pode incluir, por exemplo, administração intradérmica, transdérmica, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutânea, percutânea, intratraqueal, intraperitoneal, intratumoral, perfusão, lavagem, injeção direta e oral.
[000202] O termo "administração parenteral", conforme usado aqui, inclui qualquer forma de administração na qual o composto é absorvido no indivíduo sem envolver absorção via o intestino. Administrações parenterais exemplificativas que são usadas na presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, administração intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intraocular ou intraarticular.
[000203] Abaixo estão exemplos específicos de várias categorias de formulação farmacêutica e vias de administração preferidas, conforme indicado, para doenças exemplificativas específicas:
[000204] Comprimido passível de dissolução bucal ou sublingual: angina, poliarterite nodosa.
[000205] Intravenosa: trombocitopenia púpura idiopática, miosite por corpo de inclusão, polineuropatia desmielinizante por IgM paraproteinêmica, fasciíte necrosante, pênfigo, gangrena, dermatomiosite, granuloma, linfoma, sepsia, anemia aplástica, insuficiência de órgãos multissistema, mieloma múltiplo e gamopatia monoclonal de significância desconhecida, polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica, miopatias inflamatórias, trombocitopenia púrpura trombótica, miosite, anemia, neoplasia, anemia hemolítica, encefalite, mielite, mielopatia, especialmente associada ao vírus-1 linfotrófico de células T humanas, leucemia, esclerose múltipla e neurite óptica, asma, necrólise epidérmica, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, miastenia gravis, neuropatia, uveíte, síndrome de Guillain-Barre, doença enxerto versus hospedeiro, síndrome de Stiff Man, degeneração cerebelar paraneoplásica com anticorpos anti-Yo, encefalomielite paraneoplásica e neuropatia sensória com anticorpos anti-Hu, vasculite sistêmica, lupus eritematoso sistêmico, neuropatia diabética autoimune, neuropatia disautonômica idiopática aguda, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, neuropatia motora multifocal, síndrome no neurônio motor inferior associada à anti-/GMI, desmielinização, glomerulonefrite membranoproliferativa, cardiomiopatia, doença de Kawasaki, artrite reumatóide e síndrome de Evans, IM - ITP, CIDP, MS, dermatomiosite, miastenia gravis, distrofia muscular. O termo "administração intravenosa", conforme usado aqui, inclui todas as técnicas para distribuir um composto ou componente da presente invenção à circulação sistêmica via uma injeção ou infusão intravenosa.
[000206] Gel dérmico, loção, creme ou emplastro: vitiligo, Herpes zoster, acne, quelite.
[000207] Supositório, gel ou infusão retal: colite ulcerativa, inflamação por hemorróida.
[000208] Oral, tal como pílula, trocisco, encapsulado ou com revestimento entérico: doença de Crohn, doença celíaca, síndrome do intestino irritável, doença hepática inflamatória, esôfago de Barrett.
[000209] Intra-cortical: epilepsia, Alzheimer, esclerose múltipla, mal de Parkinson, doença de Huntington.
[000210] Infusão ou implante intra-abdominal: endometriose.
[000211] Gel ou supositório intravaginal: vaginite bacteriana, por tricomonas ou fúngica.
[000212] Dispositivos médicos: revestidos sobre stent de artéria coronária, articulações protéticas.
[000213] Os biomiméticos imunologicamente ativos descritos aqui podem ser administrados em dosagens de cerca de 0,01 mg por kg a cerca de 300 mg por kg de peso corporal e, especialmente, de 0,01 mg por kg de peso corporal a cerca de 300 mg por kg de peso corporal e podem ser administrados pelo menos uma vez ao dia, semanalmente, bissemanalmente ou mensalmente. Um regime de dosagem bifásico pode ser usado, em que a primeira fase de dosagem compreende cerca de 0,1% a cerca de 10% da segunda fase de dosagem.
Aplicações terapêuticas de Estradômeros e Estradocorpos
[000214] Baseado em design racional e validações in vitro e in vivo, os biomiméticos imunologicamente ativos da presente invenção servirão como biofarmacêuticos importantes para tratamento de doenças autoimunes e para modulação de função imune em uma variedade de outros contextos, tais como bioimunoterapia para câncer e doenças inflamatórias. Condições médicas adequadas para tratamento com os biomiméticos imunologicamente ativos descritos aqui incluem aquelas atualmente tratadas rotineiramente com hIVIG ou nas quais descobriu-se que a hIVIG é clinicamente útil, tais como citopenias autoimunes, síndrome de Guillain-Barre, miastenia gravis, doença autoimune anti-Fator VIII, dermatimiosite, vasculite e uveíte (veja F. G. van der Meche, P. I. Schmitz, N. Engl. J. Med. 326, 1123 (1992) ; P. Gajdos e colaboradores, Lancet i, 406 (1984); Y. Sultan, M. D. Kazatchkine, P. Maisonneuve, U. E. Nydegger, Lancet ii, 765 (1984); M. C. Dalakas e colaboradores, N. Engl. J. Med. 329, 1993 (1993) ; D. R. Jayne, M. J. Davies, C. J. Fox, C. M. Black, C. M. Lockwood, Lancet 337, 1137 (1991); P. LeHoang, N. Cassoux, F. George, N. Kullmann, M. D. Kazatchkine, Ocul. Immunol. Inflamm. 8, 49 (2000)) e aqueles cânceres ou condições doentias inflamatórias nas quais um anticorpo monoclonal pode ser usado ou já está em uso clínico. Condições incluídas dentre aquelas que podem ser eficazmente tratadas pelos compostos que são o assunto da presente invenção incluem uma doença inflamatória com um desequilíbrio na produção de citocinas, um distúrbio autoimune mediado por autoanticorpos patogênicos ou células T autoagressivas ou uma fase aguda ou crônica de uma doença ou processo autoimune, inflamatório ou infeccioso reincidente, crônico.
[000215] Além disso, outras condições médicas tendo um componente inflamatório se beneficiarão de tratamento com biomiméticos imunologicamente ativos, tais como esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, enfarte do miocárdio, derrame, hepatite B, hepatite C, inflamação associada ao vírus da imunodeficiência humana, adenoleucodistrofia e distúrbios epilépticos, especialmente aqueles que se acredita estarem associados à encefalite pós-viral, incluindo síndrome de Rasmussen, síndrome de West e síndrome de Lennox-Gastaut.
[000216] A abordagem geral à terapia usando os biomiméticos imunologicamente ativos isolados descritos aqui é administrar, a um indivíduo tendo uma doença ou condição, uma quantidade terapeuticamente eficaz do biomimético imunologicamente ativo para obter um tratamento. Em algumas modalidades, doenças ou condições podem ser amplamente classificadas como doenças inflamatórias com um desequilíbrio na produção de citocinas, um distúrbio autoimune mediado por auto-anticorpos patogênicos ou células T autoagressivas ou uma fase aguda ou crônica de uma doença ou processo reincidente crônico.
[000217] Os termos "tratamento" e "tratar", conforme usado aqui, referem-se à administração, a um indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um biomimético da presente invenção, de modo que o indivíduo tenha uma melhora na doença ou condição ou um sintoma da doença ou condição. A melhora é qualquer melhora ou remediação da doença ou condição ou sintoma da doença ou condição. A melhora é uma melhora observável ou mensurável ou pode ser uma melhora na sensação de bem-estar geral do indivíduo. Assim, aqueles versados na técnica entenderão que um tratamento pode melhorar a condição doentia, mas pode não ser uma cura completa para a doença. Especificamente, melhoras no indivíduo podem incluir um ou mais de: inflamação diminuída; marcadores de laboratório inflamatórios diminuídos, tal como proteína C reativa; autoimunidade diminuída, conforme evidenciado por um ou mais de: aprimoramentos em marcadores autoimunes, tais como autoanticorpos ou na contagem de plaquetas, contagem de células brancas ou contagem de células vermelhas, rash ou púrpura diminuída, diminuição na fraqueza, entorpecimento ou latejamento, níveis de glicose aumentados em pacientes com hipoglicemia, dor articular, inflamação, edema ou degradação diminuídas, diminuição nas câimbras e frequência e volume de diarréia, angina diminuída, inflamação tecidual diminuída ou diminuição na frequência de ataques; diminuição na carga de tumor de câncer, tempo aumentado para progressão de tumor, dor diminuída por câncer, sobrevivência aumentada ou aprimoramentos na qualidade de vida; ou retardo de progressão ou melhora de osteoporose.
[000218] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", conforme usado aqui, refere-se a uma quantidade que resulta em um aprimoramento ou remediação dos sintomas da doença ou condição.
[000219] Conforme usado aqui, "profilaxia" pode significar prevenção completa dos sintomas de uma doença, um retardo no início dos sintomas de uma doença ou uma diminuição na gravidade de sintomas subsequentemente desenvolvidos pela doença.
[000220] O termo "indivíduo", conforme usado aqui, é tomado para significar qualquer indivíduo mamífero ao qual os biomiméticos da presente invenção são administrados de acordo com os métodos descritos aqui. Em uma modalidade específica, os métodos da presente descrição são empregados para tratar um ser humano. Os métodos da presente descrição podem também ser empregados para tratar primatas não-humanos (por exemplo, macacos, babuínos e chimpanzés), camundongos, ratos, bovinos, cavalos, gatos, cães, porcos, coelhos, cabras, alces, ovelha, furões, gerbil, porcos-da-índia, hâmsters, morcegos, pássaros (por exemplo, galinhas, perus e patos), peixes e répteis para produzir moléculas de estradômero espécie-específicas ou quiméricas.
[000221] Em particular, os biomiméticos da presente invenção podem ser usados para tratar condições incluindo, mas não limitado a, insuficiência cardíaca congestiva (CHF), vasculite, rosácea, acne, eczema, miocardite e outras condições do miocárdio, lupus eritematoso sistêmico, diabetes, espondilopatias, fibroblastos sinoviais e estroma de medula óssea; perda óssea; doença de Paget, osteoclastoma; mieloma múltiplo; câncer de mama, osteopenia difusa; má nutrição, doença periodontal,doença de Gaucher, histiocitose de células de Langerhans, lesão da coluna espinhal, artrite séptica aguda, osteomalácia, síndrome de Cushing, displasia fibrosa monoóstica, displasia fibrosa polióstica, reconstrução periodontal e fraturas ósseas; sarcoidose; cânceres ósseos osteolíticos, câncer de pulmão, câncer de rim e câncer retal, metástases ósseas, tratamento de dor óssea e hipercalcemia maligna humoral, espondilite anquilosante e outras espondiloartropatias; rejeição a transplante, infecções virais, neoplasias hematológicas e condições semelhantes à neoplasia, por exemplo, linfoma de Hodgkin; linfoma não-Hodgkin (linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno/leucemia linfocítica crônica, micose fungóide, linfoma de células do manto, linfoma folicular, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de zona marginal, leucemia de células pilosas e leucemia linfoplasmacítica), tumores de células precursoras de linfócito, incluindo leucemia linfoblástica aguda/linfoma de células B e leucemia linfoblástica aguda/linfoma de células B, timoma, tumores de células T e NK maduras, incluindo leucemias de células T periféricas, leucemia de células T/linfomas de células T em adultos e leucemia linfocítica granular grande, histocitose de células de Langerhans, neoplasias mielóides, tais como incluindo AML com maturação, AML sem diferenciação, leucemia pró-mielocítica aguda e leucemia monocítica aguda, síndromes mielodisplásicas e distúrbios mieloproliferativos crônicos, incluindo leucemia mielogênea crônica, tumores do sistema nervoso central, por exemplo, tumores cerebrais (glioma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma e retinoblastoma), tumores sólidos (câncer nasofaringeal, carcinoma de células basais, câncer pancreático, câncer do duto biliar, sarcoma de Kaposi, câncer testicular, uterino, vaginal ou cânceres cervicais, câncer ovariano, câncer de fígado primário ou câncer endometrial, tumores do sistema vascular (angiosarcoma e hemagiopericitoma) ou outro câncer.
[000222] "Câncer" aqui refere-se ou descreve a condição fisiológica em mamíferos que é, tipicamente, caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluindo liposarcoma, sarcoma osteogênico, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, leiomiosarcoma, rhabdomiosarcoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, condrosarcoma,), osteoclastoma, tumores neuroendócrinos, mesotelioma, cordoma, sinovioma, schwanoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, carcinoma do pulmão de células pequenas, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago, incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer cólon-retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim ou renal, câncer de próstata, câncer vulval, câncer da tiróide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, câncer testicular, câncer esofageal, tumores do trato biliar, tumor de Ewing, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma de duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embriônico, tumor de Wilm, tumor testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença mielodisplásica, doença da cadeia pesada, tumores neuroendócrinos, Schwanoma e outros carcinomas, câncer de cabeça e pescoço.
[000223] Os biomiméticos da presente invenção podem ser usados para tratar doenças autoimunes. O termo "doença autoimune", conforme usado aqui, refere-se a um grupo variado de mais de 80 doenças e condições. Em todas essas doenças e condições, o problema subjacente é que o sistema imune do corpo ataca o corpo em si. Doenças auto-imunes afetam todos os principais sistemas do corpo, incluindo tecido conectivo, nervos, músculos, sistema endócrino, pele, sangue e os sistemas respiratório e gastrointestinal. Doenças autoimunes incluem, por exemplo, lupus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide, esclerose múltipla, miastenia gravis e diabetes do tipo 1.
[000224] A doença ou condição tratável usando as composições e métodos da presente invenção pode ser um processo hematoimunológico, incluindo, mas não limitado a, Púrpura Trombocitopênica Idiopática, trombocitopenia aloimune/autoimune, trombocitopenia imune adquirido, neutropenia autoimune, anemia hemolítica autoimune, aplasia de células vermelhas associada ao Parvovírus B19, autoimunidade anti-Fator VIII adquirida, doença de von Willebrand adquirida, mieloma múltiplo e gamopatia monoclonal de significância desconhecida, sepsia, anemia aplástica, aplasia de células vermelhas pura, anemia de Diamond-Blackfan, doença hemolítica do recém-nascido, neutropenia imune-mediada, resistência à transfusão de plaquetas neonatal, púrpura pós-transfusão, síndrome urêmica hemolítica, vasculite sistêmica, púrpura trombocitopênica trombótica ou síndrome de Evan.
[000225] A doença ou condição pode ser também um processo neuroimunológico, incluindo, mas não limitado a, síndrome de Guillain-Barré, poliradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica, polineuropatia desmielinizante de IgM paraproteinêmica, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, miastenia gravis, neuropatia motora multifocal, síndrome do neurônio motor inferior associada com anticorpos anti-GM1, desmielinização, esclerose múltipla e neurite óptica, síndrome de Stiff Man, degeneração cerebelar paraneoplástica com anticorpos anti-Yo, encefalomielite paraneoplásica, neuropatia sensória com anticorpos anti-Hu, epilepsia, encefalite, mielite, mielopatia especialmente associada ao vírus-1 linfotrópico de células T humanas, neuropatia diabética autoimune ou neuropatia disautonômica idiopática aguda.
[000226] A doença ou condição pode ser também um processo de doença reumática, incluindo, mas não limitado a, doença de Kawasaki, artrite reumatóide, síndrome de Felty, vasculite ANCA-positiva, polimiosite espontânea, dermatomiosite, síndromes anti-fosfolipídio, abortos espontâneos recorrentes, lupus eritematoso sistêmico, artrite idiopática juvenil, Raynaud, síndrome CREST ou uveíte.
[000227] A doença ou condição pode também ser um processo de doença dermatoimunológica incluindo, mas não limitado a, necrólise epidérmica tóxica, gangrena, granuloma, doenças autoimunes de formação de bolha na pele, incluindo pênfigo vulgaris, penfigóide bolhoso e pênfigo foliaceus, vitiligo, síndrome de choque tóxico estreptocócico, escleroderma, esclerose sistêmica, incluindo esclerose sistêmica difusa e limitada ou dermatite atópica (especialmente dependente de esteróide).
[000228] A doença ou condição pode também ser um processo doentio imunológico músculo-esquelético incluindo, mas não limitado a, miosite por corpo de inclusão, fasciíte necrosante, miopatias inflamatórias, miosite, miopatia anti-Decorina (antígeno BJ), miopatia necrótica paraneoplásica, miopatia vascular X-ligada, polimiosite penacilamina-induzida, aterosclerose, doença da artéria coronária ou cardiomiopatia.
[000229] A doença ou condição pode também ser um processo de doença imunológica gastrointestinal incluindo, mas não limitado a, anemia perniciosa, hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária, doença celíaca, dermatite herpetiforme, cirrose criptogênica, artrite reativa, doença de Crohn, doença de Whipple, colite ulcerativa ou colangite esclerosante.
[000230] A doença ou condição pode também ser doença enxerto versus hospedeira, rejeição a enxerto anticorpo-mediada, rejeição a transplante de medula óssea, inflamação pós-doença infecciosa, linfoma, leucemia, neoplasia, asma, diabetes mellitus do tipo 1 com anticorpos anti-células beta, síndrome de Sjogren, doença mista do tecido conectivo, doença de Addison, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, glomerulonefrite membranoproliferativa, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, micropoliarterite, síndrome de Churg-Strauss, poliarterite nodosa ou insuficiência de multissistemas de órgãos.
[000231] Em outra modalidade, os estradômeros aqui descritos poderiam ser utilizados em um sistema de priming em que sangue é coletado de um paciente e transitoriamente contatado com o(s) estradômero(s) durante um período de tempo de cerca de meia hora a cerca de três horas antes de ser introduzido de volta no paciente. Nessa forma de terapia celular, as células efetuadoras do próprio paciente são expostas ao estradômero que é fixado sobre uma matriz ex vivo de maneira a modular as células efetuadoras através de exposição das células efetuadoras ao estradômero. O sangue incluindo as células efetuadoras moduladas é, então, infundido de volta no paciente. Tal sistema de iniciação poderia ter numerosas aplicações clínicas e terapêuticas.
Aplicações terapêuticas de estradocorpo em oncologia
[000232] Além de ter utilidade clínica para o tratamento de distúrbios imunológicos, estradocorpos têm uso terapêutico no tratamento de câncer e doença inflamatória. Os estradocorpos podem ser usados essencialmente seguindo protocolos conhecidos para qualquer anticorpo terapêutico correspondente. Os estradocorpos geralmente serão criados para intensificar o efeito demonstrado sobre uma célula efetuadora por um anticorpo monoclonal, tal como ADCC, em câncer ou maturação diminuída de monócito e DC, com liberação diminuída de citocina em doença autoimune e, desse modo, potencializando a resposta imune contra o câncer com relação àquilo que ocorreria usando, por exemplo, um anticorpo monoclonal fonte para a porção Fab do estradocorpo.
[000233] Domínios Fab de anticorpo monoclonal exemplificativos a partir dos quais um estradocorpo pode ser criado incluem cetuximab, rituximab, muromonab-CD3, abciximab, daclizumab, basiliximab, palivizumab, infliximab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamicin, alemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, adalimumab, omalizumab, tositumomab, 1-131 tositumomab, efalizumab, bevacizumab, panitumumab, pertuzumab, natalizumab, etanercept, IGN101, volociximab, mAb anti-CD80, mAb anti-CD23, CAT-3888, CDP-791, eraptuzumab, MDX-010, MDX-060, MDX-070, matuzumab, CP-675,206, CAL, SGN-30, zanolimumab, adecatumumab, oregovomab, nimotuzumab, ABT-874, denosumab, AM 108, AMG 714, fontolizumab, daclizumab, golimumab, CNTO 1275, ocrelizumab, HuMax-CD20, belimumab, epratuzumab, MLN1202, visilizumab, tocilizumab, ocrerlizumab, certolizumab pegol, eculizumab, pexelizumab, abciximab, ranibizimumab, mepolizumab e TNX-355, MYO-029.
[000234] Os estradômeros e estradocorpos, coletivamente biomiméticos imunologicamente ativos, descritos aqui têm uma série de outras aplicações e usos.
Alteração de respostas imunes
[000235] Os biomiméticos imunologicamente ativos divulgados aqui também podem ser prontamente aplicados para alterar respostas do sistema imune em uma variedade de contextos para realizar alterações específicas nos perfis de resposta imune. Alteração ou modulação de uma resposta imune em um indivíduo refere-se a aumento, diminuição ou alteração da proporção ou componentes de uma resposta imune. Por exemplo, a produção ou níveis de secreção de citocina podem ser aumentados ou diminuídos conforme desejado através de objetivação da combinação apropriada de FcRs com um estradômero criado para interagir com esses receptores. A produção de anticorpo pode ser aumentada ou diminuída; a proporção de duas ou mais citocinas ou receptores de célula imune pode ser alterada; ou tipos adicionais de citocinas ou anticorpos podem ser levados à produção. A resposta imune também pode ser uma função efetuadora de uma célula imune expressando um FcγR, incluindo potencial fagocítico aumentado ou diminuído de células derivadas de monócito-macrófago, função aumentada ou diminuída de osteoclasto, apresentação aumentada ou diminuída de antígeno por células que apresentam antígeno (por exemplo, DCs), função aumentada ou diminuída de células NK, função aumentada ou diminuída de células B, quando comparado com uma resposta imune a qual não é modulada por um biomimético imunologicamente ativo descrito aqui.
[000236] Em uma modalidade preferida, um indivíduo com câncer ou uma doença autoimune ou inflamatória tem sua resposta imune alterada compreendendo a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um biomimético imunologicamente ativo descrito aqui a um indivíduo, em que a quantidade terapeuticamente eficaz do biomimético imunologicamente ativo altera a resposta imune no indivíduo. Idealmente, essa intervenção trata a doença ou condição no indivíduo. A resposta imune alterada pode ser uma resposta aumentada ou diminuída e pode envolver níveis alterados de citocina, incluindo os níveis de qualquer um de IL-6, IL-10, IL-8, IL-23, IL-7, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, TNF-alfa e IFN-alfa. A invenção, contudo, não está limitada por qualquer mecanismo de ação particular dos biomiméticos descritos. A resposta imune alterada pode ser um nível de auto-anticorpo alterado no indivíduo. A resposta imune alterada pode ser um nível de células T autoagressivas alterado no indivíduo.
[000237] Por exemplo, redução da quantidade de produção de TNF-alfa em doenças autoimunes pode ter efeitos terapêuticos. Uma aplicação prática disso é a terapia com anticorpo anti-TNF-alfa (por exemplo, REMICADER), a qual é aprovada clinicamente para tratar Psoríase de placa, artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa e espondilite anquilosante. Essas doenças auto-imunes têm etiologias distintas, mas compartilham componentes imunológicos chave dos processos doentios relacionados à inflamação e atividade de célula imune. Um estradômero criado para reduzir a produção de TNF-alfa será, da mesma forma, eficaz nessas e muitas outras doenças autoimunes. O perfil de resposta imune alterado pode também ser modulação direta ou indireta para realizar uma redução na produção de anticorpo, por exemplo, auto-anticorpos que objetivam tecidos do próprio indivíduo ou níveis de células T autoagressivas alterados no indivíduo. Por exemplo, esclerose múltipla é um distúrbio autoimune envolvendo células T auto-reativas o qual pode ser tratado através de terapia com interferon beta. Veja, por exemplo, Zafranskaya M. e colaboradores, Interferon-beta therapy reduces CD4+ and CD8+ T-cell reactivity in multiple sclerosis, Immunology Maio de 2007; 121(1): 29-39-Epub 18 de Dezembro de 2006. Um estradômero criado para reduzir os níveis de células T auto-reativas, da mesma forma, será eficaz em esclerose múltipla e muitas outras doenças autoimunes envolvendo células T auto-reativas.
Aplicações em ensaios imunológicos
[000238] Os biomiméticos imunologicamente ativos descritos aqui podem ser usados para realizar ensaios imunológicos para testagem de funções de células imunes para as quais os biomiméticos imunologicamente ativos foram criados para modular.
[000239] A sinalização através de vias do receptor Fcγ de baixa afinidade requer agregação de receptor e ligação cruzada sobre a superfície celular. Acredita-se que esses parâmetros de agregação e ligação cruzada são reunidos pela ligação do Fab a um alvo antígeno-específico com subsequente interação entre a região Fc e FcγRs de baixa afinidade sobre a superfície de células responsivas. Nesse contexto, anticorpos têm o potencial de estimular respostas celulares através de duas vias distintas: 1. interação de Fab/bloqueio com/ de um alvo epítopo-específico e 2. Interações de Fc com FcRs. A despeito desse conhecimento, controles atuais para a maioria dos estudos terapêuticos usando anticorpos monoclonais empregados in vivo não se dirigem adequadamente ao potencial de interações Fc:receptor Fcγ como contribuintes para os efeitos funcionais observados. Múltiplas estratégias são empregadas atualmente para eliminar interações Fc:FcR como variáveis que possam causar confusão. Por exemplo, alguns estudos empregam fragmentos Scv (regiões variáveis com uma única cadeia) ou Fab, os quais retêm especificidade pelo epítopo, mas carecem da região Fc. Essas abordagens são limitadas pela meia-vida curta desses reagentes e seu potencial limitado de induzir à sinalização. Outros estudos empregam proteínas de fusão compostas de um receptor ou ligante fundido a um fragmento Fc. Embora esses tipos de abordagens ajudem a diferenciar efeitos Fab-específicos daqueles observados com interações de receptor/ligante, elas não controlam eficazmente os efeitos Fc-mediados. Avaliações de produtos terapêuticos baseados em anticorpo em modelos animais também podem empregar anticorpos de controle de isótipo com um sítio de ligação a Fab irrelevante. A razão para essa escolha é baseada na similaridade funcional presumida entre anticorpos do mesmo isótipo, a despeito de sua especificidade ou afinidade de ligação ao Fab. Contudo, esse uso de controles de isótipo irrelevante tem diversas deficiências fundamentais:
  • 1. Se os fragmentos Fab desses anticorpos não podem se ligar a um ligante ou epítopo antigênico, é provável que os fragmentos Fc não estimulem a sinalização através de interações com FcR de baixa afinidade em virtude da ausência de ligação cruzada ao receptor Fcy. Portanto, as diferenças funcionais observadas entre anticorpos experimentais e de controle não podem ser corretamente atribuídas à interação do Fab com um alvo epítopo-específico carecendo de um meio para ligação cruzada ao FcγR.
  • 2. Se esses isótipos são produzidos em células as quais proporcionam diferentes glicoformas ou percentuais relativos de glicoformas individuais diferentes do anticorpo precursor, a ligação a FcRs de baixa e alta afinidade será alterada, mesmo se a afinidade pelo Fab é idêntica.
[000240] Embora não haja controle perfeito para superar esse problema, uma opção é o uso de estradômeros isótipo-específicos produzidos nas mesmas células que os anticorpos precursores e fornecidos em uma dose proporcionar aos níveis de expressão do epítopo objetivado pelo anticorpo experimental. Por exemplo, o controle apropriado para um anticorpo epítopo-específico produzido em rato seria um estradômero isótipo-específico de rato capaz de agregação a um receptor Fcγ sobre a superfície de células efetuadoras.
[000241] Geralmente, uma célula imune é exposta a uma quantidade eficaz de um biomimético imunologicamente ativo para modular uma atividade de uma célula imune de uma forma conhecida e essa modulação imune é comparada com um composto ou molécula de teste para determinar se o composto de teste tem atividade de modulação imune similar.
[000242] Em outra modalidade, estradômeros termicamente agregados e imunoglobulinas agregadas podem ser usadas como reagentes para controles de laboratório em vários ensaios imunológicos descritos aqui e conhecidos por aqueles versados na técnica.
[000243] Ensaios imunológicos podem ser ensaios in vitro ou ensaios in vivo e podem envolver células imunes humanas ou não humanas usando um biomimético imunologicamente ativo espécie-equivalente ou espécie-não equivalente. Em uma modalidade, um ensaio imunológico é realizado usando uma quantidade eficaz do biomimético imunologicamente ativo para modular uma atividade de uma célula imune e comparando a modulação com a modulação de uma célula imune por um composto de teste. O estradômero ou estradocorpo pode servir à função de um reagente de controle positivo em ensaios envolvendo a testagem de outros compostos com relação ao efeito imunológico. O ensaio pode comparar o efeito do anticorpo monoclonal em questão em comparação com o estradômero para ligação ao receptor estradômero da célula efetuadora e resposta funcional, conforme medido por alterações no nível de expressão do receptor, liberação e função de citocina, tal como usando uma Reação de Linfócito Misturada. Dessa maneira, se um estradômero (o qual carece do Fab) gera uma resposta a qual é, em parte, similar ao anticorpo monoclonal, então, o efeito do anticorpo monoclonal não é, em alguma parte, em virtude da especificidade de seu Fab, mas do efeito geral de ligação e ligação cruzada a mais de um receptor Fcγ sobre a célula efetuadora. O estradômero o qual contém esse mesmo estradômero e o Fab desse mesmo anticorpo monoclonal podem ainda ajudar a distinguir a especificidade do Fab do anticorpo monoclonal a partir do efeito geral de ligação e ligação cruzada a mais de um receptor Fcγ sobre a célula efetuadora.
[000244] Se a atividade biológica de um anticorpo espécie-específico e isótipo-específico é reproduzida, no todo ou em parte, por um estradômero espécie-específico e isótipo-específico, então, está claro que a atividade do receptor Fcγ - Fc responde pela porção da atividade biológica observada atribuível ao estradômero espécie-específico e isótipo-específico. Assim, estradômeros espécie-específicos e isótipo-específicos são úteis na avaliação de anticorpos terapêuticos potenciais para determinar se e qual o grau da atividade biológica observada é atribuível à porção Fab do anticorpo de teste ou a um efeito não específico da porção Fc da molécula que se liga a e se liga cruzadamente a mais de um receptor Fcγ.
[000245] Em uma modalidade, um biomimético imunologicamente ativo isolado da presente invenção compreende pelo menos um estradômero o qual compreende pelo menos dois domínios Fc ou domínios parciais do mesmo, da mesma classe Fc de imunoglobulina, onde a classe Fc de imunoglobulina é selecionada do grupo consistindo em IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e combinações das mesmas. Tais biomiméticos são ainda capazes de se ligar especificamente a um primeiro FcγRx1, em que x1 é I, II, III ou IV e a um segundo FcγRx2, em que x2 é I, II, III ou IV. Esses biomiméticos podem ainda ser caracterizados como tendo uma atividade imunológica compreendendo uma ligação cruzada a um receptor Fcy ou funcionalidade efetuadora comparável a ou superior a uma ligação cruzada a receptor Fcγ ou uma funcionalidade efetuadora de uma pluralidade de imunoglobulinas IgG agregadas que ocorrem naturalmente a FcγRs.
[000246] Em outra modalidade, a presente invenção inclui um biomimético imunologicamente ativo isolado que compreende pelo menos um estradômero compreendendo pelo menos dois domínios Fc de diferentes classes de imunoglobulina ou domínios parciais do mesmo, em que o biomimético se liga especificamente a um primeiro FcγRx1, em que x1 é I, II, III ou IV e a um segundo FcγRx2, em que x2 é I, II, III ou IV. Esse biomimético pode ser ainda caracterizado como tendo uma atividade imunológica compreendendo uma ligação cruzada a receptor Fcγ ou funcionalidade efetuadora comparável a ou superior a uma ligação cruzada a receptor Fcγ ou funcionalidade efetuadora de uma pluralidade de imunoglobulinas IgG agregadas que ocorrem naturalmente a FcγRs.
[000247] Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um biomimético imunologicamente ativo isolado que compreende um ou mais estradômeros que cada compreende independentemente três ou mais domínios Fc, em que os três ou mais domínios Fc compreendem: a) um primeiro domínio Fc, em que o primeiro domínio Fc compreende uma dobradiça Fc (H) de uma primeira imunoglobulina, b) um segundo domínio Fc, em que o segundo domínio Fc compreende uma região constante 2 (CH2) de uma segunda imunoglobulina, em que o segundo domínio Fc é capaz de se ligar especificamente a um FcγRx1, em que x1 é I, II, III ou IV; c) um terceiro domínio Fc, em que o terceiro domínio Fc compreende uma região constante 3 (CH3) de uma terceira imunoglobulina, em que o terceiro domínio Fc é capaz de se ligar especificamente a um FcγRx2, em que x2 é I, II , III ou IV. Esses biomiméticos podem, opcionalmente, compreender um quarto domínio Fc, em que o quarto domínio Fc compreende de uma região constante 4 (CH4) de uma quarta imunoglobulina IgM. Com essa molécula, a dobradiça Fc pode conter pelo menos uma cisteína.
[000248] Em ainda outra modalidade, a presente invenção inclui um biomimético imunologicamente ativo isolado que compreende: a) um primeiro domínio Fc ou domínio Fc parcial do mesmo, em que o primeiro domínio Fc compreende um domínio de dobradiça Fc (H) de uma primeira imunoglobulina, em que o domínio de dobradiça Fc compreende pelo menos uma cisteína, em que o primeiro domínio Fc contribui para a especificidade de ligação a um FcγRx, em que x é I, II , III ou IV; e pelo menos um de: i) um segundo domínio Fc ou domínio parcial do mesmo, em que o segundo domínio Fc compreende uma região constante 2 (CH2) de uma segunda imunoglobulina, a qual pode ou não ser a mesma conforme a primeira imunoglobulina, em que o segundo domínio Fc contribui para a especificidade de ligação a um FcγRx, em que x é I, II ou III, IV; e, opcionalmente, ii) um terceiro domínio Fc ou domínio parcial do mesmo, em que o terceiro domínio Fc compreende uma região constante 3 (CH3) de uma terceira imunoglobulina, em que o terceiro domínio Fc contribui para a especificidade de ligação a um FcγRx, em que x é I, II , III ou IV; e b), opcionalmente, um quarto domínio Fc ou domínio parcial do mesmo, em que o quarto domínio Fc contribui para a especificidade de ligação a uma região constante 4 (CH4) de uma imunoglobulina IgM.
[000249] Em outra modalidade, o biomimético imunologicamente ativo isolado é um estradômero em que a fonte de imunoglobulina dos domínios Fc é a mesma ou diferente e inclui isótipos IgA, isótipos IgG, IgD, IgE e IgM. Outra modalidade de estradômero é um biomimético imunologicamente ativo isolado compreendendo uma sequência sinalizadora secretória.
[000250] Em uma modalidade preferida, a quantidade terapeuticamente eficaz dos biomiméticos imunologicamente ativos isolados da presente invenção é uma quantidade suficiente para permitir ligação dos biomiméticos a dois ou mais FcγRx, em que x é I, II, III ou IV, sobre a superfície de uma célula imune, desse modo, fazendo com que o FcγRx se agregue. A célula imune pode ser qualquer célula efetuadora imune, tal como um monócito, uma célula dendrítica, um macrófago, um osteoclasto ou uma célula NK. A maturação da célula efetuadora imune pode ser modulada pelo biomimético imunologicamente ativo. A proporção de FcγRIIa para FcγRIIb pode também se tornar alterada sobre a célula imune. A célula imune pode estar localizada no plasma, medula óssea, intestino, osso, tecido linfóide, timo, cérebro, um local de infecção ou um tumor. A atividade funcional de um macrófago, célula dendrítica, osteoclasto ou célula NK pode ser modulada.
[000251] A quantidade terapeuticamente eficaz do biomimético imunologicamente ativo isolado descrito aqui acima pode ser administrada ex vivo a uma célula imune para gerar uma célula imune tratada, seguido pela etapa de infusão da célula imune tratada no indivíduo. A célula imune tratada pode ser uma célula dendrítica, macrófago, osteoclasto ou um monócito.
[000252] Imunoterapia adicional pode ser fornecida junto com qualquer um dos biomiméticos imunologicamente ativos isolados descritos aqui em uma quantidade terapeuticamente eficaz a um indivíduo. A imunoterapia adicional pode incluir, por exemplo, um ou mais de uma molécula co-estimulatória, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, uma proteína de fusão, um anticorpo biespecífico, uma citocina, um antígeno imunologicamente reconhecido, um agente anti-câncer de pequena molécula ou um agente antiproliferativo. A imunoterapia adicional pode ser administrada concorrentemente com ou separadamente da administração do biomimético imunologicamente ativo.
[000253] Os níveis de citocina (incluindo aquelas listadas acima) podem ser alterados, por exemplo, através de administração de uma ou mais citocinas de interesse, uma ou mais de outras citocinas que modulam o nível de uma ou mais citocinas de interesse e/ou anticorpos (de qualquer um dos tipos e classes mencionados aqui) específicos para uma ou mais de qualquer uma das duas categorias de citocinas acima.
[000254] Os biomiméticos imunologicamente ativos descritos aqui podem ser usados para modular a expressão de moléculas coestimulatórias de uma célula imune, incluindo uma célula dendrítica, um macrófago, um osteoclasto, um monócito ou uma célula NK ou inibir, nessas mesmas células imunes, a diferenciação, maturação ou secreção de citocina, incluindo interleucina-12 (IL-12) ou aumentar a secreção de citocina, incluindo interleucina-10 (IL-10) ou interleucina-6 (IL-6). Aqueles versados na técnica podem também validar a eficácia de um biomimético imunologicamente ativo através de exposição de uma célula imune ao biomimético imunologicamente ativo e medição de modulação de função da célula imune, em que a célula imune é uma célula dendrítica, um macrófago, um osteoclasto ou um monócito. Em uma modalidade, a célula imune é exposta ao biomimético imunologicamente ativo in vitro e ainda compreende a etapa de determinação de uma quantidade de um receptor na superfície celular ou da produção de uma citocina, em que uma alteração na quantidade do receptor na superfície celular ou da produção de citocina indica uma modulação de função da célula imune. Em outra modalidade, a célula imune é exposta ao biomiméticoo imunologicamente ativo in vivo em um modelo animal para uma doença autoimune ainda compreendendo uma etapa de avaliação de um grau de melhora da doença autoimune.
[000255] "Capaz de se ligar especificamente a um FcγRx", conforme usado aqui, refere-se à ligação a um FcγR, tal como FcγRIII. A ligação específica é, em geral, definida como a quantidade de ligante rotulado a qual é deslocável por um subsequente excesso de ligante não rotulado em um ensaio de ligação. Contudo, isso não exclui outros meios de avaliação de ligação específica os quais são bem estabelecidos na técnica (por exemplo, Mendel CM, Mendel DB, 'Nonspecific' binding. The problem and a solution. Biochem J. 15 de Maio de 1985; 228(1): 269-72). A ligação específica pode ser medida através de uma variedade de formas bem conhecidas na técnica, tal como a tecnologia de ressonância de plasmônio em superfície (SPR) (comercialmente disponível da BIACORE®) para caracterizar as constantes de associação e dissociação dos biomiméticos imunologicamente ativos (Asian K, Lakowicz JR, Geddes C. Plasmon light scattering in biology and medicine: new sensing approaches, visions and perspectives. Current Opinion in Chemical Biology 2005, 9: 538-544).
Métodos empregando Fc fixo
[000256] De forma a entender o papel do Fc: interações do receptor Fc gama (FcγR, o receptor Fc para Fc de IgG) e a importância da função de IVIG para seu Fc sendo biologicamente imobilizado dentro de uma imunoglobulina, nós comparamos os efeitos da IVIG com a forma fixa de um fragmento Fc de IgG1 recombinante (rFCF) e uma forma solúvel de um fragmento Fc de IgG1 recombinante (sFc) contendo os domínios de dobradiça-CH2-CH3 sobre a função de monócitos durante o processo de diferenciação de monócitos em células dendríticas imaturas (iDC).
[000257] Exposição de monócitos cultivados em fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF) e interleucina-4 (IL-4) ao rFCF imobilizado e à IVIG imobilizada, mas não em IVIG solúvel em baixa dose, intensificou a expressão de CD86, retardou a expressão de CD11c e suprimiu a expressão de CD1a sobre as células. Além disso, essas alterações provavelmente não são secundárias à imobilização de proteína não-específica do rFCF sobre plástico, como IVIG termicamente agregada solúvel (sHA), rFCF de sHA ou IVIG em alta dose (reconhecida por conter Fcs multiméricos), alterações induzidas similares àquelas observadas com rFCF imobilizado.
[000258] Tomados em conjunto, nossos dados indicam que exposição de iDC à IVIG imobilizada sobre a superfície de um substrato sólido, semissólido ou gelatinoso resulta em uma população única de DCs (alta expressão de CD86, baixa expressão de CD1a), capaz de orquestrar a tolerância imune e que moléculas imobilizadas que incluem a porção funcional de fragmentos Fc de imunoglobulina G (IgG) pode ser útil como miméticos de IVIG para o tratamento de inflamação local e sistêmica, bem como uma ampla variedade de outras condições patológicas que são, direta ou indiretamente, mediadas por células derivadas de monócito (MCD), tal como iDC. Além disso, imobilização da porção funcional de Fc de IgG sobre dispositivos, descritos aqui como "dispositivos de revestimento" que são implantados nos corpos ou presos nos corpos de animais (por exemplo, pacientes humanos) com moléculas contendo a porção funcional do fragmento Fc de IgG pode diminuir, se não prevenir, respostas inflamatórias a tais dispositivos.
[000259] A invenção proporciona um método de inibição da atividade de uma célula derivada de monócito (MDC). O método inclui contato da célula com uma composição compreendendo um substrato com um reagente Fc ligado ao mesmo. O contato pode ser in vitro, in vivo ou ex vivo. Alternativamente, a célula pode estar em um animal. O animal pode ser um que tem ou está em risco de desenvolvimento de uma condição mediada por célula derivada de monócito (MDCMC). A MDC pode ser, por exemplo, uma célula dendrítica, um macrófago, um monócito ou um osteoclasto.
[000260] A invenção também proporciona um método de tratamento ou profilaxia. O método que inclui administração, a um animal, de uma composição contendo um substrato tendo um reagente Fc ligado à mesma, o animal sendo um que tem ou está em risco de desenvolvimento de uma MDCMC.
[000261] Conforme usado aqui, o termo "condição mediada por célula derivada de monócito (MDCMC)" refere-se a uma condição patológica que é direta ou indiretamente, parcial ou totalmente, em virtude da atividade de ou fatores produzidos por células derivadas de monócito. Células derivadas de monócito incluem, mas não estão limitadas a, monócitos, macrófagos, células dendríticas inter-digitação (geralmente referidas aqui como "células dendríticas" compreendendo células dendríticas-semelhantes e células dendríticas foliculares-semelhantes) (maduras e imaturas), osteoclastos, células microglia-semelhantes, células semelhantes à ilhotas que produzem insulina derivadas de monócito, mastócitos imaturos derivados de monócito e micropartículas derivadas de monócito.
[000262] Com relação a métodos usando Fc fixo, o termo "reagente Fc" refere-se a qualquer molécula ou complexo de molécula que inclui uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20 ou mais) porções funcionais de um fragmento Fc de Ig de imunoglobulina (IgG). O fragmento Fc de IgG consiste das porções C-terminais das duas cadeias pesadas de IgG de uma molécula de IgG ligadas juntas e consiste nas regiões de dobradiça, dos domínios CH2 e opcionalmente todos ou alguns (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49) dos primeiros 50 (a partir do N-término) aminoácidos dos domínios CH3, de ambas as cadeias pesadas ligadas juntas. Em seres humanos, (a) a região de dobradiça de IgG1 contém 15 aminoácidos, o domínio CH2 contém 110 aminoácidos e o domínio CH3 contém 106 aminoácidos; (b) a região de dobradiça de IgG2 contém 12 aminoácidos, o domínio CH2 contém 109 aminoácidos e o domínio CH3 contém 107 aminoácidos; (c) a região de dobradiça de IgG3 contém 62 aminoácidos, o domínio CH2 contém 104 aminoácidos e o domínio CH3 contém 106 aminoácidos; e (d) a região de dobradiça de IgG4 contém 12 aminoácidos, o domínio CH2 contém 109 aminoácidos e o domínio CH3 contém 107 aminoácidos.
[000263] Conforme em moléculas de IgG do tipo silvestre, nos reagentes Fc descritos acima, as duas cadeias polipeptídicas derivadas de cadeias pesadas de IgG são, em geral, mas não necessariamente, idênticas. Assim, um reagente Fc pode ser, sem limitação, uma molécula de IgG inteira, uma molécula de IgG inteira ligada a um polipeptídeo não derivado de imunoglobulina, um fragmento Fc de IgG, um fragmento Fc de IgG ligado a um polipeptídeo não derivado de imunoglobulina, uma porção funcional de um fragmento Fc de IgG, uma porção funcional de um fragmento Fc de IgG ligado a um polipeptídeo não derivado de imunoglobulina ou multimeros (por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, hexâmeros, heptâmeros, octâmeros, nonâmeros ou decâmeros) de qualquer um desses. Reagentes Fc podem também ser os estradômeros e estradocorpos acima descritos, contanto que eles caiam dentro da definição de um reagente Fc acima.
[000264] No Fc fixo, componentes de cadeia pesada de imunoglobulina dos reagentes Fc podem ter sequências de aminoácido do tipo silvestre ou eles podem ser sequências de aminoácido do tipo silvestre, mas com não mais de 20 (por exemplo, não mais do que: 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1) substituições de aminoácido. Tais substituições são, de preferência, mas não necessariamente, substituições conservativas. Alterações conservativas incluem, tipicamente, alterações dentro dos seguintes grupos: glicina e alanina; valina, isoleucina e leucina; ácido aspártico e ácido glutâmico; asparagina, glutamina, serina e treonina; lisina, histidina e arginina; e fenilalanina e tirosina.
[000265] Um "reagente Fc" da invenção tem pelo menos 25% (por exemplo, pelo menos: 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99.5%; ou 100% ou mesmo mais) da capacidade da molécula de IgG da qual os componentes de cadeia pesada de IgG do reagente Fc foram derivadas (a molécula de IgG de referência) para se ligar a um receptor Fc de interesse. Onde um "reagente Fc" tem componentes de cadeia pesada derivados de mais de um tipo de molécula de IgG, a molécula de IgG de referência é uma que se liga com a maior avidez ao receptor Fc de interesse.
[000266] Conforme usado aqui, "Fc fixo" refere-se a um reagente Fc que é ligado a um "substrato" conforme definido abaixo. Os termos "Fc fixo", "Fc ligado" e "Fc estabilizado" são termos sinônimos. Fc fixo é compreendido da porção funcional do Fc (incluindo, mas não limitado a, qualquer polipeptídeo que inclui a porção funcional do Fc) preso a um substrato. Fc fixo inclui, por exemplo, ligação direta, bem como ligação indireta, através de polímeros, do Fc ao substrato; incorporação do Fc de IgG completo isoladamente; incorporação apenas dos domínios funcionais de Fc de IgG; ou incorporação do Fc de IgG completo ou domínios funcionais de Fc de IgG como parte de um polipeptídeo maior, tal como um anticorpo, estradômero ou um estradocorpo.
[000267] Quando aplicado ao Fc fixo, o termo "substrato" refere-se a um objeto sólido, semissólido ou gelatinoso. O substrato pode ser implantando em ou preso (ou aderido) à superfície do corpo de um animal. Os substratos podem incluir, por exemplo, componentes líquidos ou gasosos, mas pelo menos uma porção do substrato é sólida, semissólida ou gelatinosa. Assim, um substrato pode ser uma substância que é substancialmente insolúvel em um solvente aquoso, mas solúvel em um solvente não aquoso. Tais substâncias incluem lipídios (por exemplo, fosfolipídios), ácidos graxos e outros compostos insolúveis em solvente aquoso, solúveis em gordura. A partir disso, estará claro que substratos incluem lipossomas. O substrato pode ser poroso ou não poroso. Em determinadas modalidades, o substrato é inerte à superfície e/ou corpo no qual ele é implantado, preso ou aderido.
[000268] O substrato pode conter ou ser feito de um polímero sintético, por exemplo, náilon, teflon, dacron, cloreto de polivinila, PEU ((poli) éster uretano), PTFE (politetrafluoroetileno), PMMA (metil metacrilato), PEEK, elastômeros termoplásticos, polímeros radiopacos, poliéter sulfona, silicones, policarbonatos, poliuretanos, poliisobutileno e seus copolímeros, poliésteres, poliolefinas, poliisobutileno, copolímeros de etileno-alfa-olefina, polímeros e copolímeros acrílicos, polímeros e copolímeros de haleto de polivinila, tais como cloreto de polivinila, polivinil éteres, polivinil metil éter, haletos de polivinilideno, fluoreto de polivinilideno, cloreto de polivinilideno, poliacrilonitrilo, polivinil cetonas, aromáticos de polivinila, poliestireno, polivinil ésteres, acetato de polivinila, copolímeros de monômeros de vinila, copolímeros de monômero de vinila e olefinas, copolímeros de etileno-metil metacrilato, copolímeros de acrilonitrilo-estireno, resinas ABS, copolímeros de etileno-acetato de vinila, poliamidas, Náilon 66, policaprolactona, resinas de alquídeo, polioxietilenos, polimidas, poliéteres, resinas de epóxi, raion-triacetato, celulose, acetato de celulose, butirato de celulose, butirato de acetato de celulose, celofane, nitrato de celulose, propionato de celulose, éteres de celulose, carboximetil celulose, colágenos, quitinas, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico-óxido de polietileno, polissiloxanos, polissiloxanos substituídos, copolímeros de acetato de etileno vinila, elastômeros de poliolefina e borrachas de EPDM e combinações dos mesmos.
[000269] O substrato pode também conter ou ser feito de um metal ou uma liga de metal, por exemplo, aço inoxidável, platina, irídio, titânio, tântalo, liga de níquel-titânio ou liga de cobalto-cromo. Além disso, o substrato pode incluir ou ser um tecido animal ou um produto de tecido animal, por exemplo, um tecido ou enxerto de órgão. O tecido animal pode ser por exemplo, osso (por exemplo, osso osteogênico) ou cartilagem. Além disso, o substrato pode conter uma proteína, por exemplo, colágeno ou queratina. O substrato também pode conter ou ser uma matriz tecidual, por exemplo, uma matriz tecidual acelular. Matrizes acelulares em partícula ou não partícula são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.336.616 e 6.933.326, as descrições das quais são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. O substrato também pode ser ou incluir uma célula animal (por exemplo, células de reparo tecidual, tais como fibroblastos; células tronco mesenquimais) e ele pode ser, por exemplo, um chumaço de transplante de cabelo. O substrato pode conter ou ser um polissacarídeo, por exemplo, agarose. Ele também pode conter ou ser um sal, de preferência um sal relativamente insolúvel, por exemplo, sulfato de cálcio. O substrato pode ser um gel ou creme. Além disso, ele pode conter silicone ou silástico. Substratos também podem conter uma fibra natural, por exemplo, seda, algodão ou lã.
[000270] Além disso, o substrato pode ser um dispositivo médico implantável. Ele pode ser, por exemplo, um stent (por exemplo, um stent vascular, tal como um stent de artéria coronária; um stent de vias aéreas, tal como um stent endotraqueal ou nasal; um stent gastrointestinal, tal como um stent biliar ou pancreático; ou um stent urinário, tal como um stent uretral) ou uma sutura cirúrgica (por exemplo, uma sutura de seda, uma sutura crômica, náilon, plástico ou sutura de metal) ou um grampo cirúrgico (por exemplo, um grampo para aneurisma). O substrato pode ser, por exemplo, um quadril artificial, uma articulação de quadril artificial, um joelho artificial, uma articular de joelho artificial, um ombro artificial, uma articulação de ombro artificial, um dedo ou articulação de dedo artificial, uma placa óssea, um pino ósseo, um implante de não-união, um implante de disco intervertebral, cimento ósseo ou um espaçador de cimento ósseo. Ele também pode ser um shunt arterial-venoso, um fio implantável, um marca-passo, um coração artificial, um dispositivo cardíaco auxiliar, um implante coclear, um desfibrilador implantável, um estimulador da coluna espinhal, um estimulador do sistema nervoso central e um implante de nervo periférico. Outros substratos são próteses dentais ou coroas dentais.
[000271] Em outras modalidades, o substrato pode ser um dispositivo ou gaiola de filtração embólica de grande vaso, um dispositivo percutâneo, um emplastro dérmico ou submucosal ou um dispositivo de distribuição de fármaco implantável. O substrato também pode ser enxerto de grande vaso sanguíneo, em que o vaso sanguíneo é, por exemplo, uma artéria carótida, uma artéria femoral ou uma aorta. Além disso, o substrato pode ser um implante subdérmico, um implante corneal, uma lente intraocular ou uma lente de contato.
[000272] O substrato pode estar na forma de uma folha, um glóbulo, uma malha, uma partícula em pó, uma filamento, um glóbulo ou uma fibra. Ele também pode incluir um sólido, um semissólido ou uma substância gelatinosa.
[000273] Polímeros úteis na invenção são, de preferência, aqueles que são bioestáveis, biocompatíveis, particularmente durante inserção ou implante do dispositivo no corpo e evitam irritação no tecido do corpo.
[000274] Reagentes Fc podem ser revestidos (isto é, fixos ou estabilizados) sobre substratos através de qualquer uma de uma variedade de maneiras. Por exemplo, eles podem ser revestidos diretamente sobre a superfície de substratos onde eles permanecem presos, por exemplo, através de interações hidrofóbicas. Abaixo são descritas umas poucas outras metodologias (a) - (e) envolvendo o uso de polímeros:
  • (a) O reagente Fc é misturado com uma mistura polimérica miscível a qual é, então, disposta em camadas sobre a superfície do material sintético implantável, desse modo, estabilizando o reagente Fc. Monômeros rotineiramente usados na técnica para fazer misturas poliméricas incluem PLMA [(poli)lauril metacrilato)]; PEG [polietileno glicol], PEO [óxido de polietileno]; os polímeros de alquil metacrilato funcionalizados PMMA, PEMA, PPMA e PBMA; itaconatos; fumaratos; e estirênicos.
  • (b) Uma camada de revestimento inferior polimérica ou um filme com dimensão nanométrica é aderido à superfície do substrato e, então, o reagente Fc é aderido à camada de revestimento inferior polimérica ou um filme de dimensão nanométrica, desse modo, estabilizando o reagente Fc.
  • (c) Um filme fino de um monômero polimérico é aplicado à superfície do substrato implantável e o monômero é, então, levado a polimerizar. Tais monômeros incluem, por exemplo, metano, tetrafluoroetileno, benzeno, metanol, óxido de etileno, tetraglima, ácido acrílico, alilamina, hidróxietil metacrilato, N-vinil pirrolidona e mercaptoetanol. O reagente Fc é, então, preso ao monômero resultante.
  • (d) O substrato é revestido com uma proteína, tal como proteína A ou albumina, a qual se prende ao reagente Fc, desse modo, estabilizando o Fc à superfície do substrato.
  • (e) O substrato pode ser rotulado com uma cadeia de aminoácidos hidrofóbicos que se ligam a materiais sintéticos implantáveis e fazem com que o Fc estabilizado se orientem uniformemente.
[000275] Os métodos da invenção podem ser aplicados à qualquer espécie animal e as moléculas de IgG das quais as porções IgG-derivadas dos reagentes Fc são feitas podem ser de qualquer espécie animal. Naturalmente, espécies animais relevantes são aquelas nas quais IgG ou moléculas semelhantes à IgG ocorrem. Geralmente, a espécie na qual os métodos são aplicados e a espécie da qual as porções IgG-derivadas dos reagentes Fc usados nos métodos são as mesmas. Contudo, elas não são necessariamente as mesmas. Espécies animais relevantes são, de preferência, mamíferos e esses incluem, sem limitação, seres humanos, primatas não-humanos (por exemplo, macacos, babuínos e chimpanzés), cavalos, animais bovinos (por exemplo, búfalos, vacas ou boi), porcos, cabras, ovelha, cães, gatos, coelhos, gerbil, hâmsters, ratos e camundongos. Espécies não-mamíferas incluem, por exemplo, pássaros (por exemplo, galinhas, perus e patos) e peixe.
[000276] Os termos "tratamento", "tratar" e "profilaxia" têm o mesmo significado usando Fc fixo conforme descrito acima para estradômeros e estradocorpos.
[000277] Onde os Fc fixos são dispositivos implantáveis revestidos com reagentes Fc, eles podem ser implantados em, presos a ou aderidos a órgãos internos relevantes ou tecido ou superfícies corporais de indivíduos relevantes usando métodos bem conhecidos na técnica. Onde eles são formulados, por exemplo, como suspensões, pós, eles podem ser formulados e administrados conforme descrito acima para estradômeros e estradocorpos.
[000278] Os reagentes Fc fixos da presente invenção podem ser usados para tratar ou prevenir condições incluindo, mas não limitado a, câncer, insuficiência cardíaca congestiva (CHF), vasculite, rosácea, acne, eczema, miocardite e outras condições do miocárdio, lupus eritematoso sistêmico, diabetes, espondilopatias, fibroblastos sinoviais e estroma de medula óssea; perda óssea; doença de Paget, formação óssea hipertrófica; osteopenia difusa; má nutrição, doença periodontal, doença de Gaucher, histiocitose de células de Langerhans, lesão da coluna espinhal, artrite séptica aguda, osteomalácia, síndrome de Cushing, displasia fibrosa monoostótica, displasia fibrosa poliostótica, reconstrução periodontal e fraturas ósseas, tratamento de dor óssea e hipercalcemia maligna humoral, espondilite anquilosante e outras espondiloartropatias; rejeição a transplante e infecções virais.
[000279] Todas as doenças autoimunes podem ser, em parte ou no todo, uma MDCMD. O termo "doença autoimune", conforme usado aqui, refere-se a um grupo variado de mais de 80 enfermidades crônicas. Em todas essas doenças, o problema subjacente é que o sistema imune do corpo ataca o corpo. Doenças autoimunes afetam todos os principais sistemas do corpo, incluindo tecido conectivo, nervos, músculos, o sistema endócrino, pele, sangue e os sistemas respiratório e gastrointestinal.
[000280] A doença ou condição autoimune pode ser um processo hematoimunológico, incluindo, mas não limitado a, Púrpura Trombocitopênica Idiopática, trombocitopenia aloimune/autoimune, trombocitopenia imune adquirido, neutropenia autoimune, anemia hemolítica autoimune, aplasia de células vermelhas associada ao Parvovírus B19, autoimunidade anti-Fator VIII adquirida, doença de von Willebrand adquirida, mieloma múltiplo e gamopatia monoclonal de significância desconhecida, sepsia, anemia aplástica, aplasia de células vermelhas pura, anemia de Diamond-Blackfan, doença hemolítica do recém-nascido, neutropenia imune-mediada, resistência à transfusão de plaquetas neonatal, púrpura pós-transfusão, síndrome urêmica hemolítica, vasculite sistêmica, púrpura trombocitopênica trombótica ou síndrome de Evan.
[000281] A doença ou condição autoimune pode ser um processo neuroimunológico, incluindo, mas não limitado a, síndrome de Guillain-Barré, poliradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica, polineuropatia desmielinizante de IgM paraproteinêmica, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, miastenia gravis, neuropatia motora multifocal, síndrome do neurônio motor inferior associada com anticorpos anti-GM1, desmielinização, esclerose múltipla e neurite óptica, síndrome de Stiff Man, degeneração cerebelar paraneoplástica com anticorpos anti-Yo, encefalomielite paraneoplásica, neuropatia sensória com anticorpos anti-Hu, epilepsia, encefalite, mielite, mielopatia especialmente associada ao vírus-1 linfotrópico de células T humanas, neuropatia diabética autoimune ou neuropatia disautonômica idiopática aguda.
[000282] A doença ou condição autoimune pode ser um processo de doença reumática, incluindo, mas não limitado a, doença de Kawasaki, artrite reumatóide, síndrome de Felty, vasculite ANCA-positiva, polimiosite espontânea, dermatomiosite, síndromes anti-fosfolipídio, abortos espontâneos recorrentes, lupus eritematoso sistêmico, artrite idiopática juvenil, Raynaud, síndrome CREST ou uveíte.
[000283] A doença ou condição autoimune pode ser um processo de doença dermatoimunológica incluindo, mas não limitado a, necrólise epidérmica tóxica, gangrena, granuloma, doenças autoimunes de formação de bolha na pele, incluindo pênfigo vulgaris, penfigóide bolhoso e pênfigo foliaceus, vitiligo, síndrome de choque tóxico estreptocócico, escleroderma, esclerose sistêmica, incluindo esclerose sistêmica difusa e limitada ou dermatite atópica (especialmente dependente de esteróide).
[000284] A doença ou condição autoimune pode ser um processo doentio imunológico músculo-esquelético incluindo, mas não limitado a, miosite por corpo de inclusão, fasciíte necrosante, miopatias inflamatórias, miosite, miopatia anti-Decorina (antígeno BJ), miopatia necrótica paraneoplásica, miopatia vascular X-ligada, polimiosite penacilamina-induzida, aterosclerose, doença da artéria coronária ou cardiomiopatia.
[000285] A doença ou condição autoimune pode ser um processo de doença gastrointestinal imunológica incluindo, mas não limitado a, anemia perniciosa, hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária, doença celíaca, dermatite herpetiforme, cirrose criptogênica, artrite reativa, doença de Crohn, doença de Whipple, colite ulcerativa ou colangite esclerosante.
[000286] A doença ou condição autoimune pode ser doença enxerto versus hospedeira, rejeição a enxerto anticorpo-mediada, rejeição a transplante de medula óssea, inflamação pós-doença infecciosa, linfoma, leucemia, neoplasia, asma, diabetes mellitus do tipo 1 com anticorpos anticélulas beta, síndrome de Sjogren, doença mista do tecido conectivo, doença de Addison, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, glomerulonefrite membranoproliferativa, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, micropoliarterite, síndrome de Churg-Strauss, poliarterite nodosa ou insuficiência de multissistemas de órgãos.
[000287] "Câncer" aqui refere-se a ou descreve a condição fisiológica em mamíferos que é, tipicamente, caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluindo liposarcoma, sarcoma osteogênico, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, leiomiosarcoma, rhabdomiosarcoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, condrosarcoma,), osteoclastoma, tumores neuroendócrinos, mesotelioma, cordoma, sinovioma, schwanoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, carcinoma do pulmão de células pequenas, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago, incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer cólon-retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim ou renal, câncer de próstata, câncer vulval, câncer da tiróide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, câncer testicular, câncer esofageal, tumores do trato biliar, tumor de Ewing, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma de duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embriônico, tumor de Wilm, tumor testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença mielodisplásica, doença da cadeia pesada, tumores neuroendócrinos, Schwanoma e outros carcinomas, câncer de cabeça e pescoço, neoplasias mielóides, tais como leucemias mielogêneas agudas, incluindo AML com maturação, AML sem diferenciação, leucemia pró-mielocítica aguda e leucemia monocítica aguda, síndromes mielodisplásicas e distúrbios mieloproliferativos crônicos, incluindo leucemia mielogênea crônica, tumores do sistema nervoso central, por exemplo, tumores cerebrais (glioma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma e retinoblastoma), tumores sólidos (câncer nasofaringeal, carcinoma de células basais, câncer pancreático, câncer do duto biliar, sarcoma de Kaposi, câncer testicular, uterino, vaginal ou cânceres cervicais, câncer ovariano, câncer de fígado primário ou câncer endometrial, tumores do sistema vascular (angiosarcoma e hemagiopericitoma), neoplasias e condições semelhantes à neoplasias hematológicas, por exemplo, linfoma de Hodgkin; linfoma não-Hodgkin (linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno/leucemia linfocítica crônica, micose fungóide, linfoma de células do manto, linfoma folicular, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de zona marginal, leucemia de células pilosas e leucemia linfoplasmacítica), tumores de células precursoras de linfócito, incluindo leucemia linfoblástica aguda/linfoma de células B e leucemia linfoblástica aguda/linfoma de células B, timoma, tumores de células T e NK maduras, incluindo leucemias de células T periféricas, leucemia de células T/linfomas de células T em adultos e leucemia linfocítica granular grande, cânceres ósseos osteolíticos e metástases ósseas.
[000288] Conforme usado aqui, um indivíduo "em risco de desenvolver uma doença mediada por célula derivada de monócito (MDCMD)" é um indivíduo que tem uma pré-disposição a desenvolver a MDCMD, isto é, uma pré-disposição genética de desenvolver MDCMC ou foi exposto à condições que podem resultar em MDCMD. Um indivíduo "suspeito de ter uma MDCMD" é um tendo um ou mais sintomas de uma MDCMD. A partir do acima, está claro que nem indivíduos "em risco de desenvolver uma MDCMC" nem indivíduos "suspeitos de ter uma MDCMD" são todos os indivíduos dentro de uma espécie de interesse.
[000289] Em muitos dos métodos acima, a MDCMC pode ser uma causada pelo substrato e o reagente Fc serve para prevenir ou aliviar a MDCMC.
Exemplo 1 - Design de construto de biomiméticos imunologicamente ativos
[000290] Uma sequência que codifica um monômero de fragmento Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 1) foi clonada em um vetor de expressão (pCDNA 3.1D/V5 His TOPO Invitrogen) compreendendo sítios de clivagem de enzima de restrição selecionados, um sinalizador de IgK (ainda definido abaixo) e tags de epítopo para criar a sequência de monômero de IgG1 {SítiosEnzRest - sinalizador de IgK -SítiosEnzRest - (Dobradiça-CH2-CH3) de IgG1 - SítiosEnzRest - tags de epítopo (V5 e His) - TÉRMINO}, mostrada na Figura 17 (SEQ ID NO: 19). O construto foi transfectado em células CHO (CHO-002) para produção de proteína. Adicionalmente, nós criamos vários construtos de estradômero com as estruturas gerais:
  • a) {SítiosEnzRest - sinalizador de IgK - SítiosEnzRest -(dobradiça-CH2-CH3) de IgG1 - sítio XbaI - (Dobradiça-CH2-CH3) de IgG1 - TÉRMINO} (SEQ ID NO: 21) (veja também Figura 4A e Figura 18);
  • b) {SítiosEnzRest - sinalizador de IgK - SítiosEnzRest -(Dobradiça-CH2-CH3) de IgG1 - sítio XbaI - (Dobradiça-CH2-CH3) de IgG1 -SítiosEnzRest - tags de epítopo (V5 e His) - TÉRMINO} (SEQ ID NO: 23) (veja também Figura 19);
  • c) {SítiosEnzRest - sinalizador de IgK - sítio EcoRV -(Dobradiça-CH2-CH3) de IgG3 - (Dobradiça-CH2-CH3) de IgG1 -SítiosEnzRest - tags de epítopo (V5 e His) - TÉRMINO} (SEQ ID NO: 25) (veja também Figura 21); e
  • d) {SítiosEnzRest - sinalizador de IgK - sítio EcoRV - (CH2) de IgE - (Dobradiça-CH2-CH3) de IgG1 - (Dobradiça-CH2) de IgG1 -(CH4) de IgE - TÉRMINO} (SEQ ID NO: 27) (veja também Figura 22).
[000291] O construto de estradômero de IgG1 a) (SEQ ID NO: 21; Figura 18) foi manipulado usando PCR. Primers complementares à sequência de dobradiça (na extremidade 5') de IgG1 (SEQ ID NO: 29) e ao C-término da IgG1 (na extremidade 3') (SEQ ID NO: 30) foram usados para amplificar a região de dobradiça-Fc de IgG1. Sítios de restrição foram adicionados aos iniciadores para permitir clonagem em-rede do segundo domínio Fc em série com o primeiro, o qual foi clonado em um vetor de clonagem pcDNA (pCDNA 3.1D/V5 His TOPO, Invitrogen). Um códon terminal foi adicionado antes do sítio de restrição do iniciador C-terminal para impedir leitura pelas sequências de flanqueamento para esse construto.
[000292] O construto de estradômero b) (SEQ ID NO: 23; Figura 19) foi similarmente feito e continha o Fc de IgG1 - Fc de IgG1, conforme descrito acima, mas também continha duas marcações de epítopo adicionadas ao C-término do construto. Essas tags de epítopo são usadas para identificação ou purificação da proteína. Nesse segundo construto, as duas tags de epítopo, tag V5 e His, estão presentes em rede antes do códon terminal.
[000293] Proteínas que são normalmente secretadas rotineiramente contêm uma sequência sinalizadora hidrofóbica no N-término da proteína. Para os construtos de estradômero, usa-se a sequência sinalizadora de IgK METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 35), a qual é removida da proteína à medida que ela é secretada por células de mamífero, tais como células de Ovário de Hâmster Chinês. O sítio de clivagem previsto foi baseado em algoritmos para a previsão de clivagem do sítio sinalizador (SignalP 3.0).
[000294] Construtos de estradômero adicionais, similares a a) e b) acima foram feitos, que continham a estrutura Fc de IgG1 - Fc de IgG1 conforme acima (com e sem a tag de epítopo), mas usando o domínio de dobradiça de IgG3 do construto: Fc de IgG1 - Dobradiça de IgG3 -(CH2-CH3) de IgG1.
Exemplo 2 - Design e testagem dos biomiméticos imunologicamente ativos IVIG revestida e Fc revestido estimulam alterações fenotípicas similares
[000295] IVIG e Fc, quando revestidos sobre as paredes e piso das cavidades de uma lâmina estéril estimulam alterações quase idênticas nos níveis de CD1a e CD86 sobre DC imatura e retardam a super-regulação CD11c. Em virtude do papel crítico reconhecido de DC em ITP, esses dados fornecem um modelo racional para avaliação da função de miméticos de IVIG, tais como estradômeros. Conclui-se também que o fato de que as alterações fenotípicas induzidas pela IVIG são completamente recapituladas pelo Fc recombinante sugerem que os efeitos da IVIG sobre DC são, provavelmente, altamente mediados pelo Fc.
Geração de estradômero
[000296] Construiram-se estradômeros de quatro classes diferentes para imitar os efeitos da IVIG sobre DC imatura. Os estradômeros seriais, unidades de estradômero agrupado compreendendo estradômeros agrupados, unidades de estradômero central compreendendo estradômeros centrais e estradômeros com fragmento Fc mostrados abaixo na Tabela 3 foram, cada um, produzidos, exceto onde notado. Para obter as sequências apropriadas para cada um dos construtos humanos mostrados abaixo, cDNA foi sintetizado a partir de RNA total extraído de PBMC humana. Para obter essas sequências de outras espécies, RNA foi purificado de tecido dessas espécies. Priming aleatório foi usado para produzir o cDNA. O cDNA foi usado para amplificar os fragmentos desejados usando PCR para sintetizar, clonar e, subsequentemente, caracterizar, através de análise de sequência, os fragmentos de DNA. Os construtos finais foram produzidos unindo através de extensão por sobreposição por meio de PCR (Horton RM, Hunt HD, Ho SN, Pullen, JK e Pease LR. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77: 61-68, 1989) ou utilizando sítios de restrição compatíveis para fundir os fragmentos apropriados.
[000297] Por exemplo, na clonagem de G-007, o domínio CH4 de IgE foi diretamente fundido ao domínio CH2 de IgG1 na extremidade 3' da proteína. Isso foi realizado fazendo primers que contêm as sequências de sobreposição para CH2 de IgG1 (C-término) com os aminoácidos N-terminais para CH4 de IgE. Em um caso, um primer híbrido foi usado para amplificar 5' com sequências de IgG1 e o primer complementar foi usado para amplificação com um primer 3' primer a partir do C-término de CH4 de IgE. Produtos dessas duas reações foram misturados e os primers de flanqueamento foram usados para amplificar a proteína de fusão. Análise de sequência confirmou o construto.
[000298] Em muitos casos, sítios de restrição foram utilizados que estavam, convenientemente, presentes nas extremidades das moléculas a serem unidas. Quando sítios de restrição estão em fusão, existem sequências de restrição restantes detectáveis nas extremidades das sequências ligadas. Essa abordagem foi usada para a maioria dos construtos mostrados abaixo na Tabela 3. As sequências de aminoácido dos estradômeros mostrados na Tabela 3 são proporcionadas na Figura 24. Algumas das sequências são mostradas com His-tags, conhecidas na técnica como sendo úteis na purificação de proteínas.
Tabela 3
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Expressão de proteína de estradômero
[000299] Para expressão dos estradômeros, DNA de plasmídeo que codifica os estradômeros descritos acima foi transfectado em células CHO em suspensão (sistema de expressão Freestyle® MAX CHO, Invitrogen CA). Após expressão da proteína, os estradômeros expressos foram purificados do meio de cultura através de cromatografia por afinidade em coluna usando colunas de afinidade de proteína A ou proteína G. Os estradômeros purificados foram analisados através de SDS PAGE (eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio / poliacrilamida) sob condições de redução, seguido por coloração com Coomasie Blue para confirmar a presença de bandas de proteína monomérica do tamanho esperado, conforme exemplificado: G-002: banda de aproximadamente 35K; G-004: banda de aproximadamente 70KD; G-010: banda de aproximadamente 45KD; G-011: banda de aproximadamente 80KD; G-012: banda de aproximadamente 85KD; G-018: banda de aproximadamente 70KD; G-019: banda de aproximadamente 35KD; G-028: banda de aproximadamente 37KD. DNA de plasmídeo que codifica os estradômeros descritos também pode ser transfectado em outras células de mamífero, tais como células HEK 293, BHK, NSO de murino e células SP2/0 de murino.
Formação de multímero
[000300] Foi observado que esses construtos, quando transfectados, cultivados e purificados, podem criar proteínas do tamanho esperado em análise de proteína desnaturada e não-desnaturada. Além disso, nós observamos que determinados compostos também exibem bandas maiores as quais, através de critérios de tamanho, são multímeros da proteína dimérica esperada.
[000301] A formação de compostos de ordem superior por estradômeros selecionados foi analisada através de SDS-PAGE, seguido por Western blot sob condições de não-redução (A) e condições de redução (B). Análise SDS-PAGE mostrou a formação de compostos de alto peso molecular dos estradômeros G-002, G-010 e G-019 sob condições de não-redução quando comparado com condições de redução:
  • • G-002: uma banda de aproximadamente 35KD sob condição de redução - bandas de aproximadamente 70KD (dímero) e 135KD (tetrâmero) sob condições de não-redução.
  • • G-010: uma banda de aproximadamente 45KD sob condição de redução - bandas de aproximadamente 90KD (dímero) e 180KD (tetrâmero) sob condições de não-redução.
  • • G-019: uma banda de aproximadamente 35KD sob condição de redução - bandas de aproximadamente 70KD (dímero), 140 KD (tetrâmero) sob condições de não-redução.
[000302] Foi previsto que os multímeros tetraméricos e outros de ordem superior da proteína dimerizada contribuirão significativamente para a atividade biológica do composto, conforme medido pelo ensaio de Célula Dendrítica imatura (veja abaixo).
Monômeros de estradômero, estradômeros e multímeros de ordem superior de estradômeros mantêm sítios de reconhecimento
[000303] Cada uma das proteínas na Tabela 3 é reconhecida por um anticorpo anti-IgG humana de coelho (Fc) [Thermo Scientific 31789]. Nós concluímos, a partir disso, que cada uma dessas proteínas mantêm os sítios de reconhecimento para esse anticorpo.
Formação de imagem por ressonância de plasmônio
[000304] A capacidade dos estradômeros na Tabela 3 de se ligar ao FcγRINa foi avaliada usando a tecnologia de ressonância de plasmônio em superfície (SPR) (comercialmente disponível da Biacore®). FcγRINa humano foi diretamente imobilizado via acoplamento de amina a uma lasca CM5 Biacore através de diluição do ligante em acetato, pH de 5,0, para uma concentração de 5 pg/ml. Os ligantes foram perfundidos sobre uma célula de fluxo especificada em uma taxa de 5 μl/min até que uma RU de 250 fosse atingida. As células de fluxo foram, então, bloqueadas com etanolamina. Estradômeros e IVIG foram diluídos para 1000 nM em HBS-EP (HEPES a 0,01M, pH de 7,4; NaCl a 0,15M; EDTA a 3 mM; Tensoativo P20 a 0,005%) e serialmente diluídos a 500 nM, 250 nM, 125 nM e, finalmente, 62,5 nM. Uma amostra de linha de base contendo apenas tampão (HBS-EP) também foi incluída. Uma taxa de fluxo de 20 pl/min foi usada para todas as amostras. Um total de 60 pL de amostra foi injetado, durante um tempo de invenção de 3 minutos. Regeneração foi obtida através de perfusão de tampão de operação sobre células de fluxo durante um período prolongado de tempo de aproximadamente 10 minutos.
[000305] A 500 nM, o Req medido (equilíbrio) com relação à linha de base para o construto de estradômero G-010 foi de 24,9 RU quando perfundido sobre o FcγRIIIa humano e a KD foi de 1,95e-7 usando um modelo de ligação a 1:1. IVIG a 500 nM sobre o FcγRIIIa humano proporcionou um Req de 63,6 RU e uma KD de 1,89e-7 usando um modelo de ligação a 1:1. Portanto, G-010 foi determinado como se ligando ao FcγRIIIa. Capacidade de ligação similar foi avaliada sobre outros compostos biomiméticos. Aqui estão alguns exemplos:
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[000306] Foi concluído que essas proteínas têm capacidade variada de se ligar ao FcγRIIIa recombinante através de análise por ressonância de plasmônio e que determinados compostos, tal como G-010, têm uma adaptação de curva bivalente, consistente com aquela observada para anticorpos bivalentes e indicando que o estradômero pode ter ligação multivalente ao FcγRIIIa.
Estradômeros imitam o efeito biológico da IVIG
[000307] A função biológica desses estradômeros foi avaliada. De forma a determinar a capacidade de cada um dos estradômeros na Tabela 3 de imitar a utilidade funcional da IVIG em indivíduos com ITP, foi desenvolvido um ensaio in vitro usando células dendríticas imaturas (iDC). A razão para a escolha de iDC como células alvo foi baseada em dados publicados demonstrando que a transferência adotiva de DC de camundongos tratados com IVIG conferiu proteção contra o desenvolvimento de ITP a animais naive (Siragam, V. e colaboradores. Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fc [gamma] receptors on dendritic cells. Nat Med 12, 688 (2006)). Nos estudos iniciais, foi avaliado o impacto de Fc recombinante revestido (rFc), significando fixado à lâmina, e IVIG sobre a expressão de uma variedade de marcadores de ativação, maturação e co-estimulação sobre células CD14+ humanas, cultivadas na presença de IL-4 e GM-CSF. Quando comparadas com células cultivadas em citocinas apenas, células expostas à IVIG revestida ou rFc revestido demonstraram intensificação impressionante de expressão de CD86 e sub-regulação de expressão de CD1a, bem como um retardo na super-regulação de CD11c.
[000308] Em seguida, foi determinado se os estradômeros na Tabela 3 imitavam o efeito descrito da IVIG revestida ou Fc revestida sobre iDC. Esses compostos, quando revestidos às paredes e pisos da cavidade da lâmina, imitam o efeito: G-002, G-004, G-005, G-014, G-018 e G-019. Esses compostos, quando revestidos às paredes e pisos da cavidade da lâmina, não imitam o efeito: G-010, G-011 e G-012.
[000309] Esses compostos, quando solúveis, imitam o efeito da IVIG revestida ou Fc revestido sobre iDC: G-002, G-010, G-014, G-018 e G-019. Esses compostos, quando solúveis, não imitam o efeito: G-004, G-005, G-011 e G-012.
[000310] Se exposição de iDC à IVIG revestida influenciará subsequentes respostas a estímulos pró-inflamatórios pode ser testado.
[000311] Foi tirada as seguintes conclusões a partir desses dados:
  • i. que estradômeros selecionados, quando revestidos sobre uma lâmina de cultura tecidual, imitam a capacidade funcional da IVIG revestida de super-regular a expressão de CD86 e suprimir a expressão de CD1a sobre DCs imaturas;
  • ii. que estradômeros selecionados administrados em uma baixa dose na forma solúvel imitam a capacidade funcional da IVIG revestida de super-regular a expressão de CD86 e suprimir a expressão de CD1a sobre iDCs;
  • iii. que determinados estradômeros podem induzir a uma alteração fenotípica na forma solúvel e revestida e que outros estradômeros, tal como G-010, podem induzir a uma alteração fenotípica em uma forma solúvel, mas não revestida;
  • iv. que estradômeros de diferentes estruturas podem ser biologicamente ativos, conforme evidenciado pelo estradômero de fragmento Fc formado a partir de G-002 e o estradômero agrupado formado a partir de G-010;
  • v. que estruturas maiores do que o esperado através de dimerização de monômeros de estradômero são vistas quando de análise de proteína e que essas estruturas multiméricas podem corresponder à atividade biológica comparável à IVIG; e
  • vi. que estradômeros formados de monômeros de estradômero dimerizados podem demonstrar uma adaptação bivalente quando de ressonância de plasmônio consistente com a ligação de múltiplos receptores Fcγ e sugerindo a presença de estruturas terciárias multiméricas dos estradômeros.
Exemplo 3 - Biomiméticos termicamente agregados são mais potentes do que a IVIG
[000312] Um estradômero é um mimético biologicamente ativo de imunoglobulina agregada e especialmente dos fragmentos Fc dessa imunoglobulina. Em alguns casos, a agregação térmica dos biomiméticos descritos aqui pode aumentar a atividade biológica. Foi concluído que biomiméticos termicamente agregados podem ser tão potentes quanto a IVIG.
Exemplo 4 - Fragmento Fc exibe várias atividades
[000313] O fragmento Fc tem sido usado como um controle positivo em experimentos descritos acima nos quais a proteína é revestida e, desse modo, fixada ao plástico, desse modo, exibindo comportamento biológico que imita a IVIG revestida. O fragmento Fc também pode ser usado como uma unidade de estradômero central tal como quando ele é preso à porções centrais, tal como um lipossoma, um glóbulo ou albumina. Ainda, foi demonstrado que o fragmento Fc, quando cultivado em determinados sistemas de expressão e determinados tipos de célula, tal como o sistema de transfecção transitória FreestyleMax da Invitrogen usando células CHO-S, pode formar multímeros de ordem superior quando de análise de proteína, exibir padrão de ligação bivalente quando de formação de imagem por ressonância de plasmônio e exibe atividade biológica profunda na forma solúvel comparável com a IVIG revestida no ensaio de DC imatura. Foi concluído, portanto, que, sob determinadas condições cuidadosamente controladas, o fragmento Fc forma um estradômero de fragmento Fc. Esse efeito pode induzir à modificações pós-traducionais, tais como alterações de glicosilação.
Exemplo 5 - Um estradômero central o qual é um glóbulo revestido com Fc pode alterar o potencial fagocítico com relação a glóbulos não revestidos
[000314] PBMCs são isoladas da camada leuco-plaquetária de doadores saudáveis usando centrifugação com gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. Após isolamento, as PBMCs são lavadas duas vezes com PBS. Células CD14+ são, então, purificadas usando uma coluna de separação MACS (Miltenyi). As células purificadas são contadas e resuspensas a 2 x 10-5/ml em meio RPMI completo contendo 800 μg/ml de GM-CSF e 5 ng/ml de IL-4. As células são, então, cultivadas nas cavidades de culturas não teciduais, mas de lâminas estéreis com 6 cavidades. Após cultura das células CD14+ na cultura não-tecidual, microesferas de poliestireno FITC (0,52 μm) revestidas com ou sem quantidades saturantes de Fc ou IVIG são adicionadas às células em uma proporção de 1:1 e incubadas durante 6 dias a 37°C, 5,0% de CO2 e, então, analisadas com relação à fagocitose de microesferas através de FACS.
[000315] Glóbulos revestidos com IVIG e glóbulos revestidos com Fc atuam como estradômeros centrais e podem, desse modo, alterar o potencial fagocítico com relação a glóbulos não revestidos.
Exemplo 6 - Design de biomiméticos imunologicamente ativos com afinidades alteradas de ligação ao FcγRIII
[000316] Foi mostrado que um conjunto compartilhado de resíduos de IgG1 está envolvido na ligação a todos os FcyRs. Também foi demonstrado que resíduos adicionais em moléculas de IgG1 estão envolvidos na ligação ao FcγRII e FcγRIII. Alguns resíduos, quando alterados, inibiram a ligação de um ou mais receptores. De modo interessante, a mutação dupla específica S298A/K334A intensificou a ligação de FcγRIIIa e reduziu a ligação ao FcγRIIb. Esses resíduos foram anotados sobre o construto de estradômero mostrado na Figura 16 (usando um asterisco em ambos os aminoácidos). Portanto, podem-se usar mutagênese sítio-dirigida para gerar uma molécula de estradômero tendo a estrutura codificada por SEQ ID NO: 17, mas com as mutações S298A/K334A correspondentes.
Exemplo 7 - Expressão de proteínas recombinantes
[000317] Existem numerosos sistemas de expressão que são adequados para uso na produção das composições discutidas acima. Sistemas baseados em eucariota em particular podem ser empregados para produzir sequências de ácido nucleico ou seus polipeptídeos, proteínas e peptídeos cognatos. Muitos de tais sistemas estão comercial e amplamente disponíveis.
[000318] Em uma modalidade preferida, os estradômeros descritos aqui são produzidos usando células de Ovário de Hâmster Chinês (CHO) as quais são bem estabelecidas para a produção recombinante de proteínas de imunoglobulina seguindo protocolos padronizados. Alternativamente, por exemplo, animais transgênicos podem ser utilizados para produzir os estradômeros humanos descritos aqui, geralmente através de expressão no leite do animal usando técnicas com animal transgênico bem estabelecidas. Lonberg N. Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol. Setembro de 2005; 23(9): 1117-25; Kipriyanov SM, Le Gall F. Generation and production of engineered antibodies. Mol Biotechnol. Janeiro de 2004; 26(1): 3960; veja também Ko K, Koprowski H. Plant biopharming of monoclonal antibodies. Virus Res. Julho de 2005; 111(1): 93-100.
[000319] O sistema de célula de inseto/baculovírus pode produzir um alto nível de expressão de proteína de um segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.871.986, 4.879.236, ambas incorporadas aqui por referência em sua totalidade e o qual pode ser adquirido, por exemplo, sob o nome MAXBAC® 2.0 da INVITROGEN® e BACPACK® BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM da CLONTECH®.
[000320] Outros exemplos de sistemas de expressão incluem o Sistema de Expressão de Mamífero Induzível STRATAGENE®'s COMPLETE CONTROL®, o qual utiliza um receptor sintético ecdisona-induzível. Outro exemplo de um sistema de expressão induzível está disponível da INVITROGEN®, o qual traz o Sistema T-REX™ (expressão tetraciclina-regulada), um sistema de expressão de mamífero induzível que usa o promotor de CMV de comprimento total. A INVITROGEN® também proporciona um sistema de expressão de levedo denominado Pichia methanolica Expression System, o qual é criado para produção em alto nível de proteínas recombinantes no levedo metilotrópico Pichia methanolica. Aqueles versados na técnica saberão como expressar vetores, tal como um construto de expressão descrito aqui, para produzir sua sequência de ácido nucleico ou seu polipeptídeo, proteína ou peptídeo cognato. Veja, de modo geral, Recombinant Gene Expression Protocols por Rocky S. Tuan, Humana Press (1997), ISBN 0896033333; Advanced Technologies for Biopharmaceutical Processing por Roshni L. Dutton, Jeno M. Scharer, Blackwell Publishing (2007), ISBN 0813805171; Recombinant Protein Production with Prokaryotic and Eukaryotic Cells por Otto-Wilhelm Merten, Contributor European Federation of Biotechnology, Section on Microbial Physiology Staff, Springer (2001), ISBN 0792371372.
Exemplo 8 - Expressão e purificação de biomiméticos imunologicamente ativos
[000321] Construtos de ácido nucleico descritos nos Exemplos 1 e 2 são transfectados em linhagens de células que não expressam naturalmente Ig. Os polipeptídeos codificados são expressos como proteínas secretadas em virtude de suas sequências líderes secretórias, as quais geralmente são removidas por proteases endógenas durante transporte das células ou podem ser subsequentemente clivadas e removidas através de métodos bem conhecidos na técnica. Esses biomiméticos imunologicamente ativos são purificados usando abordagens cromatográficas com Proteína A ou His tag bem conhecidas na técnica e o tamanho é verificado através de SDS PAGE (eletroforese em gel de dodecil sulfato/poliacrilamida).
Exemplo 9 - Expressão e purificação de biomiméticos imunologicamente ativos para produção em larga escala
[000322] Embora vários sistemas possam ser usados para produzir grandes quantidades de uma proteína específica, incluindo bactérias, células de inseto ou levedo, a expressão em células de mamífero pode minimizar problemas em virtude de glicosilação alterada das proteínas. Células de mamífero, tais como células CHO, têm sido usadas para superproduzir várias proteínas fundidas a uma parte principal de Ig. O domínio Fc no construto se torna uma tag que permite a subsequente purificação a partir do sobrenadante de célula usando purificação em coluna de afinidade de proteína (Harris, CL, DM Lublin e BP Morgan, Efficient generation of monoclonal antibodies for specific protein domains using recombinant immunoglobulin fusion proteins: pitfalls and solutions., J. Immunol. Methods 268: 245-258, 2002). Muitas proteínas de fusão são diretamente clonadas em rede com a região constante de Ig, especificamente os monômeros com domínio Fc parcial CH2 e CH3. Um exemplo específico de expressão do domínio extracelular do receptor de interferon gama sendo expresso com Ig tem sido usado para produzir grandes quantidades da proteína com atividade funcional (Fountoulakis, M, C. Mesa, G. Schmid, R. Gentz, M. Manneberg, M. Zulauf, Z. Dembic e G. Garotta, Interferon gamma receptor extracellular domain expressed as IgG fusion protein in Chinese hamster ovary cells: Purification, biochemical, characterization and stoichiometry of binding, J. Biol. Chem. 270: 3958-3964, 1995).
Exemplo 10 - Design de biomiméticos imunologicamente ativos com glicosilação em Fc alterada
[000323] Através de um método essencialmente conforme aquele descrito por Shields e colaboradores com relação a homo-anticorpos, domínios Fc desfucosilados podem ser feitos em células CHO mutantes carecendo de atividade enzimática para adição de fucose a carboidratos de proteína. Esses são usados para expressar estradômeros com afinidades de ligação mais forte ao FcγRIII com relação a uma forma fucosilada da mesma molécula (Robert L. Shields e colaboradores. Lack of Fucose on Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human Fc RIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. J. Biol. Chem., Julho de 2002; 277: 26733 - 26740 (doi:10.1074/jbc.M202069200)).
[000324] Foi mostrado que alterações na sialilação na N-glicana de Fc podem aumentar a atividade biológica. Kaneko Y, Nimmerjahn F, Ravetch JV. Science. 4 de Agosto de 2006; 313(5787): 627-8.Assim, uma molécula de estradômero tendo sialilação alterada pode ser produzida usando métodos similares.
[000325] Meios alternativos para alteração da glicosilação de domínios Fc de estradômero incluem técnicas quimioenzimáticas para a produção de polipeptídeos com uma estrutura de glicosilação específica. Veja Li, B., Song, H., Hauser, S. e Wang, L. X. 2006. A Highly Efficient Chemoenzymatic Approach Toward Glycoprotein Synthesis. Org. Lett. 8: 3081-3084; veja também Ped. Pat. Internacional No. PCT/US07/70818.
Exemplo 11 - Construtos de fusão de polimorfismo (176 V/F) de FoγRIIIa
[000326] Conforme discutido previamente, a atividade anti-inflamatória de IVIG é dependente de interações primárias entre o domínio Fc e FcγRIIIa. Essas interações podem ser eficazmente quantificadas usando tecnologia (SPR) para caracterizar as constantes de associação e dissociação dos biomiméticos imunologicamente ativos com as duas variantes polimórficas reconhecidas do FcγRIIIa (176 V/F). De forma a definir a afinidade de ligação e dissociação de nossos construtos de estradômero e de controle de monômero com domínio Fc, proteínas de fusão de FcγRIIIa HIS tag serão produzidas em células CHO com variantes polimórficas V (SEQ ID NO: 33) e F (SEQ ID NO: 31) na posição 176 (Figura 20). Essas sequências podem ser colocadas no pCDNA 3.1 e transfectadas em células CHO. Essas proteínas de fusão de FcγRIIIa são purificadas dos sobrenadantes de células transfectadas usando colunas de afinidade Ni2+ para purificar as proteínas. Todas as proteínas de fusão de FcγRIIIa são caracterizadas através de sequenciamento de cDNA e SDS PAGE.
[000327] Vários outros protocolos na técnica podem ser utilizados para expressar FcγRIIIa e caracterizar interações com biomimético imunologicamente ativo. Veja, por exemplo, a seção materiais e métodos de Robert L. Shields e colaboradores. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII and FcRn e Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR. J. Biol. Chem., Fevereiro de 2001; 276: 6591 - 6604 (doi:10.1074/jbc.M009483200).
Exemplo 12 - Seleção de função de biomimético biologicamente ativo in vitro
[000328] Para testar a função de biomiméticos imunologicamente ativos, tais como aqueles apresentados no Exemplo 1, um ensaio in vitro é criado para recapitular o mecanismo pelo qual parece que domínios Fc nativos reduzem inflamação in vivo. Recentemente, foi demonstrado que a hIVIG inibe a maturação de DCs e altera a secreção de IL-10, IL-12 e TNF-alfa (Bayry, J. e colaboradores, Inhibition of maturation and function of dendritic cells by intravenous immunoglobulin, Blood 101(2): 758-765(2003)). Nossos estradômeros mediam efeitos sobre DCs similares à hIVIG. A inibição de maturação de DC e alterações na secreção de citocina in vitro pode servir como um meio eficaz para definir algumas das atividades biológicas de muitos construtos de estradômero. Os construtos de estradômero descritos acima podem ainda ser validados usando os seguintes parâmetros experimentais:
Tabela 4
Figure img0010
[000329] Em um ensaio preferido in vitro mostrado na Tabela 4, o impacto sobre o fenótipo de DC humana de biomiméticos solúveis imunologicamente ativos, tendo afinidades de ligação apropriadas, é medido. Construtos com domínio Fc de sequência natural não ligada cruzadamente solúveis podem servir como controles. Marcadores de DC específicos sobre a superfície da DC são avaliados, incluindo marcadores de ativação (CD80, CD83 e CD86), bem como FcγRs. Veja Prechtel AT, Turza NM, Theodoridis AA, Steinkasserer A. CD83 knockdown in monocyte-derived DCs by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation. J Immunol. Maio de 2007; 178(9): 5454-64. Além disso, análise multiplex pode ser empregada para avaliar o impacto de nossos biomiméticos imunologicamente ativos sobre a produção de citocina pelas DCs. Jongbloed, Sarah L. e colaboradores. Enumeration and phenotypic analysis of distinct dendritic cell subsets in psoriatic arthritis and rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2006; 8(1): R15 (Publicado online em 16 de Dezembro de 2005; doi: 10.1186/ar 1864). Finalmente, para confirmar se DCs interagem com monócitos conforme esperado, DCs de controle e DCs expostas a biomiméticos imunologicamente ativos são cultivadas com monócitos purificados e avaliadas através de citometria de fluxo com relação à alterações nos níveis de ativação de receptores FcγRIIa e outros determinantes na superfície celular relacionados ao estado de ativação dos monócitos.
[000330] Em modalidades particulares, estradômeros podem diminuir os receptores FcγRIIa presentes sobre uma célula imune, desse modo, aumentando a proporção de receptores FcγRIIb inibitórios para os receptores FcγRIIa, o que resulta em inibição de funções de células imunes.
Exemplo 13 - Seleção de função de biomimético imunologicamente ativo in vivo
[000331] Numerosas doenças autoimunes, tal como trombocitopenia púrpura idiopática, esclerose múltipla, asma e doenças inflamatórias do intestino, foram estabelecidas em modelos animais reconhecidos na técnica para testagem in vivo. Wu GF, Laufer TM. The role of dendritic cells in multiple sclerosis. Curr Neurol Neurosci Rep. Maio de 2007; 7(3): 245-52; Targan SR, Karp LC. Defects in mucosal immunity leading to ulcerative colitis. Immunol Rev. Agosto de 2005; 206: 296305. Por exemplo, múltiplos modelos de ITP estão atualmente disponíveis. Veja, por exemplo, Crow AR. e colaboradores. IVIG inhibits reticuloendothelial system function and ameliorates murine passive immune thrombocytopenia independent of anti-idiotype reactivity. Br J Haematol. 2001; 115: 679-686. Biomiméticos imunologicamente ativos criados para modular o sistema imune, conforme apropriado para cada doença autoimune específica, podem ser validados em tais modelos in vivo. De modo importante, em muitos desses modelos, a administração de hIVIG provavelmente resulta em uma resposta antianticorpo humano da espécie estranha (por exemplo, camundongo) a qual tem o potencial de obscurecer ou criar um produto falso positivo relacionado a efeitos anti-inflamatórios.
[000332] Foi estabelecido um modelo de Trombocitopenia Púrpura Idiopática em camundongo de acordo com a seguinte metodologia: contagens de plaqueta foram medidas em camundongos C57BL6 através de um corte serial na veia caudal. 10 μl de sangue foram diluídos em 15 μl de tampão de citrato. As amostras foram, então, analisadas com relação à contagem absoluta de plaquetas em um citômetro HemaVet 950. Para camundongos em um grupo de controle de ITP, começando a partir do dia 2, cada plaqueta pela tarde foi privada fornecendo uma injeção intraperitoneal de 2 μg de um anticorpo anti-CD41 de camundongo de rato (MWReg30), um anticorpo antiplaqueta da BD Biosciences Pharmingen. Camundongos no grupo de controle pré-tratamento com IVIG receberam 2 g/kg (40 mg/camundongo) de IVIG humana através de injeção i.p. a cada manhã e a mesma dose de MWReg30 que o grupo de controle de ITP. Foi determinado que a IVIG é altamente protetora da contagem de plaquetas nesse modelo de ITP induzida e foi concluído que esse modelo é útil para testagem de estradômeros contra IVIG no que refere-se ao grau de proteção contra diminuição da contagem de plaquetas. Um estradômero pode ser avaliado nesse modelo em várias concentrações para avaliar a proteção relativa contra IVIG, como segue:
[000333] Grupos em experimento:
  • 1) Controle - sem ITP, sem IVIG
  • 2) grupo de controle de ITP - 2 μg de MWReg30 a cada manhã, começando no dia 2
  • 3) grupo pré-tratamento com IVIG - 40 mg de IVIG a cada manhã e 2 μg de MWReg30 ao anoitecer começando no dia 2
  • 4) Estradômero equivalente a 10-12 domínios Fc IV a cada manhã
  • 5) Estradômero equivalente a 10-11 domínios Fc IV a cada manhã
  • 6) Estradômero equivalente a 10-10 domínios Fc IV a cada manhã
  • 7) Estradômero equivalente a 10-9 domínios Fc IV a cada manhã
  • 8) Estradômero equivalente a 10-8 domínios Fc IV a cada manhã
  • 9) Estradômero equivalente a 10-7 domínios Fc IV a cada manhã
  • 10) Estradômero equivalente a 10-6 domínios Fc IV a cada manhã
Exemplo 14 - Validação de eficácia in vivo de biomiméticos imunologicamente ativos para o tratamento de ITP
[000334] Em outro modelo de ITP em murino, camundongos deficientes quanto à função de células B normais podem ser usados. A deficiência de função de células B normais serve para eliminar os efeitos idiotipo-anti-idiotopo de anticorpos anti-fragmento Fc humano de murino que seriam gerados através da administração de um fragmento Fc ou fragmento Fc humano parcial a uma camundongo e consequentes resultados falso positivos. A deficiência em função de células B pode ser gerada, por exemplo, através da administração de anticorpos anti-células B ou ocorre em camundongos geneticamente manipulados, tal como no camundongo knockout para cadeia m (Jackson Labs, cepa B6.129S2-Igh-6tm1Cgn/J) que são deficientes em células B maduras.
[000335] O sistema imune de camundongos imunodeficientes é reconstituído com PBMCs privadas de células B ou não modificadas de animais imunocompetentes. Esses animais são subsequentemente tratados com anticorpos antiplaquetas para imitar a ITP usando métodos bem definidos na técnica. Os animais são, então, tratados com biomiméticos imunologicamente ativos de acordo com o seguinte esquema:
Tabela 5. Eficácia in vivo de biomiméticos imunologicamente ativos de [domínio Fc de hlgG1 - domínio Fc de hlgG1] (SEQ ID NO: 22) para o tratamento de ITP
Figure img0011
[000336] É previsto que os grupos 1 e 2 não desenvolvam ITP quando de infusão de anticorpo, uma vez que eles não têm as células B para produzir anticorpos antiplaquetas necessários para destruição de plaquetas. Nos grupos 3 e 4, espera-se que o polipeptídeo de estradômero de {Fc de hIgG1 - Fc de hlgG1} e o polipeptídeo monomérico de Fc de hlgG1 aliviem eficazmente a ITP porque anticorpos endógenos de murino reagem com epítopos de domínio Fc de hlgG1 para ligar cruzadamente os polipeptídeos monoméricos de Fc de hlgG1. Em contraste, na ausência de anticorpos endógenos de murino, o polipeptídeo de estradômero de {Fc de hlgG1 - Fc de hlgG1} (grupo 6) é mais eficaz do que o polipeptídeo de monômero de Fc de IgG1 não ligado cruzadamente ao aliviar a IPT. O grupo 7 serve como um controle positivo para efeito de tratamento.
Exemplo 15 - Tratamento de pacientes com ITP usando formulações intravenosas de proteínas de estradômero (SEQ ID NOs: 18 & 22)
[000337] Os protocolos de tratamento para ITP com as proteínas de estradômero exemplificativas codificadas por SEQ ID NOs: 17 & 21 são utilizadas de maneira a proporcionar diretrizes padrões para terapia de ITP com hIVIG, tal como a diretriz prática do Executive Committee of the American Society of Hematology para o diagnóstico e tratamento de trombocitopenia púrpura imune primária. Veja George, JN. e colaboradores. Idiopathic thrombocytopenic purpura: a practice guideline developed by explicit methods for the American Society of Hematology. Blood. 1 de Julho de 1996; 88(1): 3-40; veja também as diretrizes de 2000 pela Italian Pediatric Hematologists, as diretrizes de 2003 pela British Hematologists e as diretrizes de 2006 pela Japanese Pediatric Hematologists. Alternativamente, os protocolos com estradômero IV para ITP podem incluir uma fase de administração inicial com dosagens de cerca de 0,1 a cerca de 0,001 vezes as dosagens do protocolo de tratamento acima. A fase com baixa dose inicial é criada para minimizar quaisquer efeitos pró-inflamatórios a curto prazo da administração de estradômero, ao mesmo tempo em que ainda é suficiente para induzir a um efeito anti-inflamatório a longo prazo, o qual é subsequentemente intensificado e mantido pela segunda fase de dosagem descrita acima. A razão para essa abordagem alternativa é que algumas modalidades de um estradômero podem ter um efeito inflamatório a curto prazo, bem como um efeito anti-inflamatório a longo prazo através de diminuição da expressão de FcγRIIa. Uma baixa dose inicial (ou baixas doses iniciais) pode ser usada para estimular o efeito anti-inflamatório a longo prazo, ao mesmo tempo em que minimiza o efeito antiinflamatório a curto prazo.
[000338] A dose eficaz de estradômero é geralmente de cerca de 0,01% a cerca de 15% da dose eficaz de hIVIG, mais preferivelmente cerca de 0,1% a cerca de 3% da dose eficaz de hIVIG, A dose eficaz de hIVIG em ITP está geralmente na faixa de cerca de 100 mg/Kg a cerca de 2 gramas/Kg, administrada a cada 10-21 dias.
[000339] A formulação intravenosa de estradômero será substancialmente a mesma que as formulações de hIVIG aprovadas pelo FDA, mas excluem os estabilizantes presentes em algumas formulações de hIVIG. Veja, por exemplo, a bula de produto para o Gammagard S/D, distribuído pela Baxter Healthcare Corporation e aprovado para terapia de ITP pelo FDA.
Exemplo 16 - Tratamento de pacientes com ITP usando administração intraperitoneal de um estradômero central
[000340] Os protocolos de tratamento para ITP com proteínas de estradômero exemplificativas representando fragmentos Fc fixados a uma porção central, tal como um lipossoma, são utilizados através de administração intraperitoneal, com dosagens de cerca de 1% a cerca de 0,001% das dosagens do protocolo padrão com IVIG intravenosa. A razão para essa abordagem alternativa é que estradômeros centrais compreendidos de fragmentos Fc fixos distribuídos em uma formulação estável à cavidade intraperitoneal serão tornados disponíveis para os múltiplos domínios Fc para afetar células efetuadoras derivadas de monócito similarmente à IVIG, mas em doses substancialmente menores.
Exemplo 17 - Design de biomiméticos imunologicamente ativos (Estradocorpos)
[000341] Dois estradocorpos foram construídos e transfectados. Para cada estradocorpo, o cDNA de codificação foi sintetizado a partir de RNA total feito a partir de linhagens de célula de hibridoma expressando o anticorpo de interesse. O estabelecimento de linhagens de célula de hibridoma é bem conhecido na técnica. Amplificação do cDNA de interesse que codifica as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de anticorpo foi feita através do kit de amplificação BD SMART® RACE (Clontech CA). Numerosos outros métodos estão disponíveis para gerar cDNA que codifica as cadeias pesada e leve para regiões variáveis de anticorpos (Sassano, M. e colaboradores, 1994. Nucleic Acids Res. 11 de Maio; 22(9): 1768-9; Jones, S.T., Bendig, M.M., 1991. Biotechnology (NY) Jan: 9(1): 88-9). Para gerar os estradocorpos, as regiões variáveis de cadeia pesada são fundidas aos construtos de estradômero costurando através de extensão por sobreposição com PCR (Hutton e Pease) ou utilizando sítios de restrição compatíveis existentes para fundir os fragmentos apropriados. Proteínas de estradômero são expressas em células CHO-S e isolados dos sobrenadantes de célula através de purificação por afinidade em coluna de proteína A. Ligação dos estradocorpos purificados ao antígeno de interesse é confirmada através de estudos de ligação por citometria de fluxo utilizando linhagens de célula expressando o antígeno.
[000342] Um ensaio de ADCC padrão empregando células NK como efetuadores e células tumorais expressando antígeno como alvos em várias proporções de efetuador-para-alvo é empregada para comparar o potencial do estradocorpo e do anticorpo monoclonal (Mab) que compartilham a mesma região Fab para induzir à ADCC contra linhagens de célula tumoral com alta e baixa expressão de antígeno. São selecionados para desenvolvimento estradocorpos que demonstram resultados similares ao Mab equivalente no ensaio de NK contra a linhagem de célula com alta expressão de epítopo, mas resultados superiores ao Mab equivalente no ensaio de NK contra a linhagem de célula com baixa expressão de epítopo.
Exemplo 18 - Tratamento de pacientes com câncer de mama usando formulações intravenosas de estradocorpo contendo o domínio de ligação a antígeno do trastuzumab
[000343] Protocolos de tratamento para câncer de mama com estradocorpo exemplificativo contendo um Fab que é ou é similar ao Fab do produto comercializado trastuzumab tendo atividade contra o epítopo her2/neu são utilizados de maneira a proporcionar diretrizes padrões para terapia de câncer de mama. Veja Romond, EH e colaboradores. Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer. NEJM. 20 de Outubro de 2005; 353: 1673-1684; Seidman, AD e colaboradores. Weekly Trastuzumab and Paclitaxel Therapy for Metastatic Breast Cancer with Analysis of Efficacy by HER2 Immunophenotype and Gene Amplification. Journal of Clinical Oncology. Vol 19, Edição 10 (Maio), 2001: 2587-2595; Vogel, CL e colaboradores. Journal of Clinical Oncology. Vol 20, Edição 3 (Fevereiro), 2002: 719-726.
[000344] É previsto que a dose eficaz de estradocorpo geralmente oscilará de cerca de 1% a cerca de 500% do anticorpo monoclonal eficaz cujo Fab é a mesma que o estradômero, mais preferivelmente cerca de 50% a cerca de 100% da dose eficaz de anticorpo monoclonal. A dose eficaz de anticorpo monoclonal no tratamento de câncer clínico varia. Para o anticorpo monoclonal de Her-2/neu, a dose está, em geral, na faixa de cerca de 2 mg/Kg a cerca de 4 mg/Kg administrada a cada 7-21 dias.
Exemplo 19 - Tratamento de pacientes com câncer de cabeça e pescoço ou cólon usando formulações intravenosas de estradocorpo contendo o domínio de ligação a antígeno do cetuximab
[000345] É previsto que protocolos de tratamento para câncer de mama com o estradocorpo exemplificativo contendo um Fab que é ou é similar ao Fab do produto comercializado cetuximab tendo atividade contra o epítopo de EGFR pode ser utilizado de maneira proporcionar diretrizes padrões para terapias de câncer de cabeça e pescoço e cólon. Veja Robert, F e colaboradores. Phase I Study of Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibody Cetuximab in Combination with Radiation Therapy in Patients with Advanced Head and Neck Cancer. Journal of Clinical Oncology, Vol 19, Edição 13 (Julho), 2001: 32343243; Bonner, JA e colaboradores. Cetuximab prolongs survival in patients with locoregionally advanced squamous cell carcinoma of head and neck: A phase III study of high dose radiation therapy with or without cetuximab. Journal of Clinical Oncology, 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings (Edição Pós-Encontro) Vol 22, No 14S (Suplemento de 15 de Julho) 2004: 5507; Shin, DM e colaboradores. Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Therapy with C225 and Cisplatin in Patients with Head and Neck Cancer. Clinical Cancer Research Vol. 7, 1204-1213, Maio de 2001; Cunningham, D e colaboradores. Cetuximab Monotherapy and Cetuximab plus Irinotecan in Irinotecan-Refractory Metastatic Colorectal Cancer. NEJM. Volume 351: 337-345, 2004.
[000346] É previsto que a dose eficaz de estradocorpo de EGFR / HER1 geralmente oscilará de cerca de 1% a cerca de 500% do anticorpo monoclonal eficaz cujo Fab é o mesmo que o estradocorpo, mais preferivelmente cerca de 50%> a cerca de 100%> da dose de anticorpo monoclonal eficaz. A dose de anticorpo monoclonal eficaz em tratamento clínico de câncer varia. Para o anticorpo monoclonal de EGFR, a dose está, em geral, na faixa de cerca de 250 - 400 mg/metro quadrado, a qual é cerca de 5 mg/Kg - 25 mg/ Kg administrada a cada 7-21 dias.
Exemplo 20. Multimerização aumentada através de glicosilação alterada pode aumentar a atividade biomimética imunologicamente ativa
[000347] Os padrões de glicosilação de proteínas expressas são dependentes da linhagem de célula na qual a proteína é expressa. A célula de Ovário de Hâmster Chinês (célula CHO) comumente usada para expressão e purificação de proteína resulta em um padrão de glicosilação que é diferente, por exemplo, das células HEK 293 as quais são de origem humana e também são comumente usadas para expressão de proteína de proteínas endógenas. Uma vez que as propriedades de ligação de fragmentos Fc e unidades de estradômero agrupado podem ser afetadas pelo padrão de glicosilação, multimerização aumentada e, portanto, atividade biológica aumentada dos peptídeos expressos podem ser obtidos através de expressão em outras linhagens de célula que não CHO ou linhagens de célula, incluindo CHO, que são geneticamente alteradas para mudar o padrão de glicosilação para uma N-glicana que promove agregação aumentada entre fragmentos Fc ou peptídeos contendo domínio Fc. Multimerização aumentada do fragmento Fc ou unidades de estradômero agrupado selecionadas através de alteração de padrões de glicosilação pode aumentar a capacidade de biomiméticos imunologicamente ativos de imitar os efeitos de hIVIG.
Exemplo 21. A exposição de DC madura (mDC) à IVIG ou rFcF (fragmentos Fc recombinantes) altera seu fenótipo?
[000348] Os fragmentos rFCF de IgG1 humana a serem usados nesse experimento foram produzidos através da tecnologia padrão de proteína recombinante. As duas cadeias do rFCF humano consistiam, cada uma, na região de dobradiça (15 aminoácidos), do domínio CH2 (110 aminoácidos) e do domínio CH3 (106 aminoácidos) da cadeia pesada de IgG1 humana.
[000349] Células CD14+ podem ser isoladas de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) obtidas do sangue de um doador humano saudável usando uma coluna de separação Miltenyi MACS. As células são cultivadas em uma concentração final de 2 x 105 /mL em GM-CSF (800 IU/mL) e IL-4 (5 ng/mL) durante 5 dias a 37°C. Os meios em todas as culturas são trocados no dia 3 de cultura. No dia 5, lipopolissacarídeo (LPS; 10 μg/ml) é adicionado à culturas apropriadas para induzir à maturação a uma DC. DCs maduras são conhecidas na técnica por não expressar níveis substantivos de CD16, CD32 ou CD64. As células são, então, cultivadas durante mais dois dias e alíquotas são analisadas com relação à expressão de CD11c, CD80, CD83, CD86, CD1a e CD1 através de citometria de fluxo por fluorescência bidimensional (FFC). As células restantes cultivadas com LPS são, então, colocadas em cavidades com IVIG revestida ou solúvel ou rFcF humana (todos a 10 μg/mL) durante 24 horas a 37°C, colhidas e analisadas com relação à expressão dos marcadores listados acima através de FFC bidimensional.
[000350] Os grupos experimentais são como segue:
  • (1) células CD14+; GM-CSF; IL-4; sem LPS ("7d-LPS")
  • (2) células CD14+: GM-CSF; IL-4; LPS ("7d+LPS")
  • (3) células CD14+; GM-CSF; IL-4; LPS; IVIG revestida ("cIVIG")
  • (4) células CD14+; GM-CSF; IL-4; LPS; IVIG solúvel ("sIVIG")
  • (5) células CD14+; GM-CSF; IL-4; LPS; rFcF revestido ("cFc")
  • (6) células CD14+; GM-CSF; IL-4; LPS; rFcF solúvel ("sFc")
  • (7) células CD14+; GM-CSF; IL-4; LPS ("Controle")
Exemplo 22. A exposição de iDC à IVIG revestida inibe a fagocitose de células sanguíneas vermelhas opsonizadas?
[000351] Células CD14+ são purificadas de PBMCs humanas de doadores humanos saudáveis conforme descrito no Exemplo 21 e cultivadas a 37 °C durante 6 dias com GM-CSF e IL-4 nas concentrações indicadas nos exemplos anteriores e na presença ou ausência de IVIG revestida ou solúvel. As células são colhidas e, então, incubadas a 37°C ou 4°C durante duas horas com células sanguíneas vermelhas humanas Rho-positivas que são não revestidas ou revestidas com anticorpo anti-D conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC). Após incubação com células sanguíneas vermelhas, células CD14+ são coradas comercialmente disponível CD1a APC-conjugada. A fagocitose é, então, avaliada através de medição por FFC bidimensional de dispersão lateral de luz (SSC-A), dispersão dianteira de luz (FSC-A), fluorescência por FITC (FITC-A) e fluorescência por APC (CD1a).
Exemplo 23. A exposição à IVIG revestida diminui a capacidade de iDC de estimular uma reação de linfócito mista alogeneica?
[000352] Células CD14+ são isoladas do sangue de um doador humano saudável, conforme descrito nos exemplos anteriores. Elas são, então, cultivadas a 37 °C durante 6 dias com GM-CSF e IL-4 na presença ou ausência de IVIG solúvel e revestida. As concentrações de todos esses reagentes são conforme descrito acima. As células são, então, colhidas e colocadas nas cavidades de lâminas de cultura tecidual de microtitulação com 96 cavidades em vários números (com a maior dose sendo 2,5 x 104 por cavidade). Células T CD3+ são purificadas de PBMCs de um segundo doador humano que era HLA-incompatível com o doador do qual as células CD14+ são isoladas. As células T são adicionadas a cada uma das cavidades das lâminas de cultura tecidual com 96 cavidades (105 células T por cavidade). Após cinco dias de co-cultura, 1 μCi de 3H-timidina são adicionados a cada uma das cavidades de cultura. As culturas são, então, incubadas durante mais 6 horas e a incorporação de 3H-timidina ("cpm") é medida como uma indicação do grau de proliferação celular nas culturas. Três populações estimuladoras de iDC diferentes são testadas: uma gerada através de cultura com GM-CSF e IL-4 apenas, uma gerada através de cultura com GM-CSF, IL-4 e IVIG revestida e uma gerada através de cultura com GM-CSF, IL-4 e IVIG solúvel.
Exemplo 24. Efeito da exposição de iDC a rFcF e IVIG revestida e solúvel sobre a expressão de citocina por iDC e mDC
[000353] Culturas contendo células CD14+, GM-CSF e IL-4 e rFcF (revestido ou solúvel) ou IVIG (revestida ou solúvel) são configuradas sob as condições descritas nos exemplos anteriores. Ao invés de testagem das células quanto à expressão de marcadores na superfície celular, capacidade fagocítica ou a capacidade de estimular MLRs alogeneicas, a produção de citocina pelas células é medida. Espera-se que o rFcF revestido module a produção de citocina pelas células de uma maneira similar à IVIG, mas não similar ao rFcF solúvel. Assim, espera-se que o nível de citocinas que inibem respostas inflamatórias (por exemplo, interleucina-4, interleucina-6 e interleucina-12) seja intensificado através de exposição das células ao rFcF revestido. Além disso, espera-se que exposição das células ao rFcF revestido resulte em uma diminuição no nível de produção de citocinas pelas células que intensificam respostas inflamatórias (por exemplo, interferon, interleucina-23 e fator-1 de necrose de tumor).
Exemplo 25. Fragmentos Fc recombinantes de camundongo
[000354] Fragmentos Fc recombinantes (rFcF) de IgG2a de camundongo foram produzidos usando técnicas padrões de clonagem e expressão de proteína recombinante. As duas cadeias do rFcF de camundongo consistiam, cada uma, da região de dobradiça (21 aminoácidos), do domínio CH2 (110 aminoácidos) e do domínio CH3 (107 aminoácidos) da cadeia pesada de IgG2a de camundongo. A IgG2a de camundongo era ativa no ensaio de iDC humana quando revestida às paredes e pisos de cavidades das lâminas.
[000355] Embora a presente invenção e suas vantagens tenham sido descritas em detalhes, deve ser entendido que várias alterações, substituições e alterações podem ser feitas aqui sem se desviar do espírito e escopo da invenção conforme definido nas reivindicações em anexo. Além disso, o escopo do presente pedido não se destina a estar limitado às modalidades particulares do processo, máquina, fabricação, composição de matéria, meios, métodos e etapas descritos no relatório descritivo. Conforme aqueles versados na técnica apreciarão prontamente a partir da descrição da presente invenção, processos, máquinas, fabricação, composições de matéria, meios, métodos ou etapas que existem presentemente ou a serem depois desenvolvidos que desempenham substancialmente a mesma função ou obtêm substancialmente o mesmo resultado que as modalidades correspondentes descritas aqui podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. Consequentemente, as reivindicações em anexo se destinam a incluir, dentro de seu escopo, tais processos, máquinas, fabricação, composições de matéria, meios, métodos ou etapas. Todas as patentes U.S. e estrangeiras, publicações de pedido de patente e literatura de não-patente (incluindo, mas não limitado a, resumos, artigos científicos de jornal, livros, literatura de produto e manuais) referidos ou citados aqui são aqui incorporados por referência em suas totalidades para validação e otimização de administração/dosagem in vivo. Finalmente, os compostos de reposição são usados para tratar uma ampla faixa de doenças, incluindo doenças inflamatórias e autoimunes.
LISTA DE REFERÊNCIAS
[000356] As referências a seguir são incorporadas por referência em sua totalidade.
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  • 22. Pedido de Patente Publicado U.S. 20060074225.

Claims (15)

  1. Estradômero agrupado, caracterizado pelo fato de que compreende duas ou mais unidades de estradômero agrupado multimerizadas em que cada uma das referidas unidades de estradômero agrupado compreende uma região de multimerização e pelo menos um domínio Fc, em que cada uma das regiões de multimerização das duas ou mais unidades de estradomero agrupados multimeriza para formar o estradomero agrupado, em que o estradomero agrupado é capaz de se ligar especificamente a pelo menos dois receptores Fc; em que pelo menos uma região de multimerização é uma dobradiça de IgG2 ou um zíper de isoleucina; e em que pelo menos um domínio Fc compreende um domínio CH2 e um domínio CH3 de IgG1 ou IgG3 ou uma combinação dos mesmos.
  2. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 1, compreendendo duas unidades de estradômero agrupado multimerizadas.
  3. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende três unidades de estradômero agrupado multimerizadas.
  4. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende quatro unidades de estradômero agrupado multimerizadas.
  5. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende cinco unidades de estradômero agrupado multimerizadas.
  6. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada um dos domínios Fc compreende uma dobradiça de IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG1.
  7. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada um dos domínios Fc compreende independentemente uma dobradiça de IgG3, um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH3 de IgG3.
  8. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das unidades de estradômero agrupado compreende dois ou mais domínios Fc.
  9. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada uma das unidades de estradômero agrupado compreende dois ou mais domínios Fc.
  10. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada uma das unidades de estradômero agrupado é capaz de especificamente se ligar a pelo menos um FcR.
  11. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato deque o pelo menos um FcR é um receptor FCy I humano, um receptor FCy II humano, um receptor FCy III humano ou um receptor FCy IV humano.
  12. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor FCy III humano é um receptor FCy IIIa.
  13. Estradômero agrupado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma região de multimerização é uma dobradiça IgG2.
  14. Estradômero agrupado, caracterizado pelo fato de que compreende dois ou mais unidades de estradômeros agrupados, em que cada uma das unidades de estradômeros agrupados compreende uma região de multimerização de dobradiça IgG2 e um domínio Fc de IgG1 compreendendo um domínio CH2 e CH3, em que a região de multimerização de dobradiça IgG2 das duas ou mais unidades de estradômeros agrupados multimerizam para formar o estradômero agrupado, e em que o estradômero agrupado é capaz de especificamente se ligar a pelo menos dois receptores FCy.
  15. Estradômero agrupado, caracterizado pelo fato de que compreende dois ou mais unidades de estradômeros agrupados, em que cada uma das unidades de estradômeros agrupados compreende uma região de multimerização de zíper de interleucina e um domínio Fc de IgG1 compreendendo um domínio CH2 e CH3, em que a região de multimerização de zíper de interleucina das duas ou mais unidades de estradômeros agrupados multimerizam para formar o estradômero agrupado, e em que o estradômero agrupado é capaz de especificamente se ligar a pelo menos dois receptores FCy.
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B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 30/05/2008 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF