KR20180132731A - 재조합 정맥내 면역글로불린(rIVIG) 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

재조합 정맥내 면역글로불린(rIVIG) 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

재조합 정맥내 면역글로불린(rIVIG) 단백질의 조성물 및 rIVIG 단백질의 정제 및 사용. 조성물은 높은 친화도로 Fc 수용체에 결합하는 올리고머 Fc 분자를 포함한다. rIVIG 단백질은 자가면역 질환, 예컨대 불응성 면역 혈소판감소증, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 다발성 경화증, 루푸스, 그레이브병, 가와사키병, 피부근염, 중증 근무력증, 갈랑-바레 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈 및 다른 면역 및 염증성 병태를 포함하는 면역 장애의 치료를 위한 면역조정 분자로서 유용하다. rIVIG 단백질은 장기 이식, 줄기 세포 이식 및 골수 이식의 면역 거부를 감소시키도록 환자에서 면역조정제로서 또한 사용될 수 있다. 추가적으로, 본 발명은 자가면역 용혈성 빈혈, 면역성 혈소판 감소증, 류마티스성 관절염, 또는 다른 개과 면역 장애를 겪는 개의 치료를 위한 수의 면역 장애에서 사용하기 위한 비인간 기원의 rIVIG 단백질, 예컨대 개과 rIVIG 단백질을 제공한다.

Description

재조합 정맥내 면역글로불린(rIVIG) 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법
관련 출원의 성명
본 출원은 2016년 3월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/315,483호(본 명세서에 이에 의해 포함됨))의 부분 계속 출원이고, 이에 대한 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 인간 IVIG 제제(정맥내 면역글로불린에 대한 두문자어)의 현재 사용에 대한 대체물로서 사용될 수 있는 재조합 단백질의 제조를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 면역학적 및 다른 장애 및 질환의 치료를 위한 이러한 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
치료제로서의 면역글로불린의 임상 용도는 Emil Behring 및 동료가 면역 혈청이 독소 매개 질환을 완화할 수 있다(1)는 것을 발견할 때인 100년전으로 거슬러 올라간다. Ogden Bruton이 무감마글로불린혈증 환자에서 면역글로불린 대체에 대한 인간 면역글로불린을 정맥내로 점적주사한 뒤로 62년이 지났다(2). 그때까지, 제제가 정제된 면역글로불린의 응집물을 함유하므로(이의 투여는 보체 캐스케이드를 통한 면역 반응의 활성화로 인해 고통스러운 국소 자극 및 불리한 전신 반응을 발생시킴), 오직 제한된 용량의 면역글로불린이 근육내 투여될 수 있다(3, 4).
1960년대 및 1970년대에 새로운 정제 공정의 개발은 응집물의 제거를 허용하여서, 훨씬 더 높은 용량으로 정맥내 투여에 적합한 조성물을 제조할 수 있게 한다(3-7). 두문자어 "IVIG"는, 이러한 제제가 또한 다른 방식, 예컨대 피하 투여를 통해 투여될 수 있더라도, 이러한 제제에 흔히 사용되는 용어로 있다. IVIG 제제에 대한 주요 적응증은 면역결핍증을 갖는 환자에서 주로 대체 치료로 남아 있다(8-10).
1981년에, 불응성 면역 혈소판감소증(refractory immune thrombocytopenia: ITP)을 또한 겪은, 광범위한 면역억제성 치료로 인해 속발성 면역결핍증을 갖는 아이를 치료하면서, Paul Imbach는 환자의 혈소판 수가 환자가 IVIG에 의해 치료된 후에도 예상치못하게 증가하였다는 것을 발견하였다(11). 혈소판 수를 증가시키기 위한 IVIG 치료의 효과는 면역결핍증이 없는 ITP 환자에서 재현되었고, 이의 면역조정 효과에 대한 IVIG 사용에 대한 길을 닦았다(12-15).
현재, IVIG는 많은 상이한 질환에 대한 치료 옵션이고, 다수의 자가면역 장애에 대한 면역조정제로서 제1선 사용으로 추천된다. 사실, 면역 결핍 증후군에서 대체 면역글로불린으로서의 IVIG의 사용이 중요한 적응증으로서 남아 있지만, IVIG는 자가면역 질환의 치료를 위해 계속해서 사용되고 있다.
IVIG 제제가 임상 치료에서 효과적일 수 있지만, 이의 지속가능성에 극단적인 영향을 가질 수 있는 현재의 실행과 연관된 다수의 논의가 존재한다. 첫째로, 부작용은 아나필락시스, 신장 병태, 혈전증 합병증 및 당뇨병 병태를 포함하여 IVIG 투여 후 대개 관찰된다. 이 논의를 해결하도록 취해진 노력은 IgA 결핍증에 대한 환자의 프리스크리닝, 및 IgA, XI 인자, 글루코스 및 나트륨의 농도의 면밀한 모니터링을 포함한다. 그러나, 이러한 단계의 각각은 공급 역량의 제한, 및 상품 비용, 및 투여 비용의 증가의 효과를 가질 수 있다. 더구나, 이 노력에도 불구하고, IVIG 사용은 부작용에 의해 계속해서 불리해지고, 이는 완전히 완화되지 않았다.
또한, 대부분의 생물학과 비교하여, IVIG는 일반적으로 체중 1㎏당 약 0.5g 내지 4g의 범위로 보통 매우 높은 용량으로 투여된다. 효능에 필요한 투약량으로부터 판단하면, IVIG의 치료학적 활성 성분(들)이 제제의 오직 매우 적은 비율을 차지하는 것으로 보인다. 제품 비용 상승에 의해 제시된 상당한 도전 및 품질 IVIG 제제를 개선하고자 하는 수요에 의해, 이들 논의 중 하나 이상을 해결하는 개선된 대안적인 조성물 및/또는 방법에 대한 상당한 수요가 존재한다:
IVIG 치료에 의해 제시된 논의는 부분적으로 IVIG의 작용 기전 명확히 결정되지 않았고, 이의 효과가 적응증으로부터 적응증으로 변할 것이라는 사실로부터 나온다.
상기 기재된 바대로, 부작용을 제거하거나 감소시킬 수 있고, 더 일치하는 품질로 제조될 수 있고/있거나, 효능을 유지하면서 더 낮은 투약량을 허용하고/하거나, 제품 비용을 감소시키는, 대안(들)을 포함하는 IVIG에 의한 개선된 치료에 대한 상당한 수요가 존재한다. 본 발명자들은 면역글로불린의 재조합 조작이 일치하는 품질로 제조될 수 있고, 효능을 유지하면서 더 낮은 투약량을 허용하고, 제품 비용을 감소시키는, 더 양호하게 한정된 분자의 제조를 허용한다고 가정하였다.
IVIG의 작용 기전이 완전히 명확하지 않지만, 본 발명자들은 적어도 몇몇 적응증을 이 적응증에서 IVIG의 치료학적 효능에 필요한 항체 구조 유전요소과 상관시킬 수 있다는 것을 가정하였다. 예를 들어, 면역결핍증의 치료에서, IVIG는 혈청 Ig의 수준을 보충하고, 감염성 물질 및/또는 이의 독소로부터 생명을 살리는 보호를 제공한다. 그러므로, 혼주된 면역글로불린의 가변 영역 내에 함유된 항원-특이성의 큰 다양성이 이 적응증에 대한 치료학적 효능을 책임진다고 고안 가능하다. 반대로, 연구는 급성 및 만성 자가면역 장애의 치료에서 IVIG의 면역조정 효과를 책임지는 것이 면역글로불린 Fc 영역이라는 관념을 지지한다.
ITP의 치료 및 동물 모델에서 온전한 IVIG 및 이의 Fc 단편이 동등한 소염 활성을 갖는다는 관찰이 이루어졌다(16). 이것은 소염 기능에서 Fc 영역의 역할을 지원할 것이다. 또한, IVIG의 면역조정 효과가 Fc 수용체를 통해 매개되고, 수지상 세포(DC)-대식세포 혼선에 의존하고, FcγRIIIa가 활성화 단계에 그리고 FcγRIIb가 마우스 ITP 모델에서 효과기 단계에서 중요하다는 것이 관찰되었다(17). 마지막으로, 마우스 ITP 모델에서 높은 함량의 Ig 이합체를 함유하는 IVIG에 의한 치료가 정상 단량체 면역글로불린에 의한 것보다 훨씬 더 효과적으로 혈소판 고갈을 반전시킨다는 관찰이 이루어졌다(18). 그러므로, 본 발명자들은 Fc 영역에 대한 낮은 친화도 결합을 보통 갖는 수지상 DC 표면 FcγRIIIa 및 FcγRIIb가, IVIG 제제의 면역조정 효과를 개선하도록 추가로 사용되는, 올리고머 Fc에 의해 제공된 친화도(다중 상호작용) 결합을 통해 IVIG 제제에 존재하는 올리고머 항체의 적은 분량과 생산적으로 상호작용할 수 있다는 것을 이론화하였다.
본 발명은 상기 우려를 완전히 또는 부분적으로 해소하는 방법 및 재료를 제공한다. 따라서, 이의 광범위한 양태에서, 본 발명은 (a) 2개 이상의 Fc 펩타이드 도메인을 포함하는 단쇄 Fc 펩타이드; 및 (b) 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함하는 재조합 정맥내 면역글로불린(rIVIG) 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 특정한 양태에서, 올리고머화 펩타이드 도메인은 삼합체화 펩타이드 도메인이다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 rIVIG 폴리펩타이드(Pan 수용체 상호작용 분자, 또는 "PRIM"이라고도 칭함)는 (a) 2개의 Fc 펩타이드 도메인을 포함하는 단쇄 Fc 펩타이드 및 (b) 올리고머화 펩타이드 도메인, 특히 삼합체화 펩타이드 도메인을 포함한다. 본 발명의 rIVIG 폴리펩타이드에서의 개별 Fc 펩타이드 도메인은 가요성 링커를 통해 연결될 수 있다. 본 발명의 특정한 실시형태에서, 가요성 링커는 아미노산 서열 G-G-G-G-S(서열 번호 9)의 5회 반복; 즉 G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S(서열 번호 10)를 포함한다. 본 발명의 다른 특정한 실시형태에서, 올리고머화 펩타이드 도메인은 서열 번호 4의 712번 내지 768번 아미노산 또는 서열 번호 6의 1번 내지 79번 아미노산을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 rIVIG 폴리펩타이드는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 (a) 2개 이상의 Fc 펩타이드 도메인을 포함하는 단쇄 Fc 펩타이드; 및 (b) 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함하는 재조합 정맥내 면역글로불린(rIVIG) 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 본 발명의 특정한 양태에서, 뉴클레오타이드 분자는 삼합체화 펩타이드 도메인을 코딩한다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 분자는 (a) 2개의 Fc 펩타이드 도메인 및 (b) 삼합체화 도메인을 포함하는 rIVIG 폴리펩타이드를 코딩한다. 특정한 실시형태에서, 본 발명은 rIVIG 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 분자를 포함하고, rIVIG 폴리펩타이드는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 면역 장애의 치료를 위한 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 재조합 면역글로불린(rIVIG) 단백질을 포함하고, 상기 rIVIG 단백질은 3개의 단쇄 Fc 도메인(scFc)을 함께 보유하는 스캐폴드를 제공하는 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 올리고머화 펩타이드 도메인은 서열 번호 6의 1번 내지 79번 아미노산 및 서열 번호 4의 712번 내지 768번 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정한 양태에서, 조성물은 3개의 단쇄 Fc 펩타이드를 포함하는 단일 단백질 종을 주로 포함한다. 상기 단쇄 Fc 펩타이드의 개별 Fc 도메인은 분자내로 상호작용하여 기능성 단쇄 Fc 펩타이드를 형성할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 발명은 rIVIG 단백질을 주로 포함하는 조성물을 제공하고, rIVIG 단백질은 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 자가면역 장애를 겪는 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 주로 재조합 면역글로불린(rIVIG) 단백질을 포함하는 조성물의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 rIVIG 단백질은 단쇄 Fc 펩타이드의 삼합체의 형성을 위한 스캐폴드를 제공하는 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 환자는 불응성 면역 혈소판감소증, 면역 혈소판감소성 자반병(immune thrombocytopenic purpura: ITP), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy: CIDP), 다발성 경화증(multiple sclerosis: MS), 전신 홍반 루푸스(SLE 또는 루푸스), 그레이브병, 가와사키병, 피부근염, 중증 근무력증, 갈랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia: IMHA), 악성 빈혈, 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 발작성 야간 혈색뇨(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: PNH), 애디슨병, 하시모토 질환(만성 갑상선염), 하시모토 뇌병증, 자가면역 백혈구감소증, 혈소판감소증, 류마티스성 관절염 및 반응성 관절염, 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease: IBD), 궤양성 대장염, 크론병, 쇼그렌 증후군, CREST 증후군, 골반 염증성 질환(PID), 강직성 척추염, 베체트병, 혈관염, 라임병(만성 또는 후기 병기) 및 I형 당뇨병으로부터 선택된 면역 장애를 겪는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 장기 이식, 골수 이식; 수혈, 또는 줄기 세포 이식을 받은 환자의 면역 거부 반응을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 재조합 면역글로불린(rIVIG) 단백질을 포함하는 조성물의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 rIVIG 단백질은 단쇄 Fc 펩타이드의 삼합체를 주로 포함하는 조성물을 제공하는 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 자가면역 장애를 겪는 비인간 포유류를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 재조합 정맥내 면역글로불린(rIVIG) 단백질을 포함하는 조성물의 유효량을 상기 비인간 포유류에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 rIVIG 단백질은 단쇄 Fc 펩타이드의 삼합체를 주로 포함하는 조성물을 제공하는 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함하고, 상기 rIVIG 단백질은 동일한 종의 비인간 포유류로부터 유래된 아미노산 서열으르 포함한다. 특정한 실시형태에서, 비인간 포유류는 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 면역성 혈소판 감소증(ITP) 또는 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택된 자가면역 장애를 겪는다. 예를 들어, AIHA를 겪는 개는 개과 기원의 아미노산 서열, 예컨대 서열 번호 7 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 삼합체성 rIVIG 단백질을 주로 포함하는 조성물에 의해 치료될 수 있다.
도 1은 본 발명의 소정의 실시형태의 작제물의 조성을 예시한다. P7005H는 CD40 리간드의 세포외 도메인의 내인성 삼합체화 역량을 이용하여 올리고머 기능성 Fc 도메인을 제조하기 위한 설계를 위한 프로토타입이다. 가장 작은 기능성 올리고머는 N 말단에서 3개의 이합체 Fc 도메인 및 C 말단에서 2개의 삼합체화된 CD40L ECD로 조립되는 6개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진다. P7005H의 복합 SEC 프로필(도 2)의 견지에서, 기능성 Fc 도메인이 scFc 포맷을 이용하여 생성되고, CD40L ECD가 콜라겐 삼합체화 도메인에 의해 대체된 P8001Z가 생성된다. SEC 프로필(도 2)이 P7005H의 것보다 더 양호하지만, P8001Z는 실질적인 양의 고차의 올리고머를 여전히 함유한다. 유사한 작제물로서, 추가적인 인간 IgG1 중쇄 힌지 영역(H)을 갖는 P8004Z는 또한 결코 이상적이지 않은 SEC 프로필을 나타내고, 힌지 영역의 포함은 단독으로 폴딩 논의를 해결하지 않는 것으로 보인다. 흥미롭게도, 추가적인 불변 영역(CL 및 CH1)이 발생할 때, P8003Z 및 P8020Z 단백질 둘 다는 훨씬 더 효율적으로 폴딩하고, 주로 적절히 폴딩된 삼합체로서 나타났다(도 2). (도 2). P8020Z 작제물은 삼합체화 스캐폴드를 이용하고, 이는 융합 단백질의 C 말단에 올리고머 Fc를 배치할 수 있게 한다. C 말단 Fc 포맷은 Fc 수용체와 상호작용하는 정기적인 항체의 배향을 면밀히 모방하는 것으로 예상된다. 중요하게는, P7005H, P8001Z, P8002Z 또는 P8004Z와 달리, 삼합체성 종의 균일한 조성은 P8003Z 및 P8020Z의 발현으로부터 성공적으로 얻어졌다(도 5 참조).
도 2는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로파일링 모델에서 본 발명의 조성물의 효과를 예시한다. 본 발명의 rIVIG 분자는 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제되고, 포스페이트 완충제 식염수(pH 7.2)로 완충제 교환되었다. 각각의 SEC 분석은 Superdex 200 10/30 SEC 칼럼(GE Healthcare)을 사용하여 0.5㎖/분의 속도로 대략 100㎕의 rIVIG 샘플을 주사함으로써 수행되었다. 화살표는 적절히 폴딩된 삼합체성 분자가 용리되는 것을 나타낸다. 도 2는 P7005H, P8001Z, P8002Z 및 P8004Z의 약 1/3 미만이 적절히 폴딩된 삼합체성 형태로 존재하는 것으로 밝혀졌다. 반대로, P8003Z 및 P8020Z의 적어도 2/3 초과가 삼합체로서 적절히 폴딩된다. 이 결과는 CL 및 CH1 도메인의 도입이 삼합체성 형태의 폴딩을 크게 증대시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 3은 FcγR 결합 모델에서 본 발명의 조성물의 효과를 예시한다. GST와 융합된 개별 인간 Fc 수용체는 ELISA 플레이트에서 코팅되었다. 비점유된 면적을 차단한 후, 인간 IgG1, P8003Z1, P8003Z3(알파-1,6 퓨코실전환효소 유전자가 결핍된 세포주(FUT8-/-)로부터 제조된 P8003Z의 비퓨코실 변이체) 또는 P8020Z1은 연속 희석된 농도로 플레이트에 첨가되었다. 결합된 인간 IgG1 및 rIVIG 변이체는 염소 항-인간 항체의 형광성 표지된 F(ab)'2 단편에 의해 정량화되었다. 도 3의 상부 패널은 인간 FcγRIIA(H131)에 대한 인간 IgG1 및 rIVIG의 친화도 측정에 대한 예를 보여준다. 곡선 핏팅(SoftMax Pro 5.1, Molecular 장치(캘리포니아주 서니베일))은 재조합 가용성 Fc 수용체에 대한 rIVIG의 KD의 예상치를 허용한다. 하기 표는 이 계산된 KD를 보여준다. 본 발명의 삼합체성 rIVIG가, 인간 IgG1이 이미 준-nM 친화도를 나타낸, 인간 FcγRI를 제외하고, 인간 IgG1과 비교하여 결합 친화도에서 유의미한 증가를 나타내고, rIVIG가 오직 미미하게 더 높은 친화도를 나타낸다는 것이 명확하다. 이 결과는 본 발명의 삼합체성 rIVIG가 친화도 이점에 의해 훨씬 더 높은 겉보기 친화도로 Fc 수용체에 결합할 수 있다는 것을 입증한다.
도 4는 콜라겐 유도된 관절염(CIA) 모델에서 본 발명의 조성물의 치료학적 효과를 예시한다. 마우스를 1일에 CFA에서 소 II형 콜라겐에 의해 프라이밍하고, 18일에 P8020Z(50㎎/㎏ 체중)에 의해 치료하고, 21일에 IFA에서 동일한 콜라겐에 의해 부스팅하였다. 각각의 발의 1 내지 4의 임상 점수(4가 가장 심각함)는 격일로 측정되었다. 임상 점수는 각각의 그룹에서 첨가되고, 마우스의 수에 의해 정규화되었다. 정기적으로 체중 1㎏당 대략 2-3g에서 사용되고 연구의 과정에 걸쳐 다회 투여된 전통적인 인간 IVIG 제제와 비교하여, P8020Z1은 50㎎/㎏의 용량이 1회 투여되어서, 투약에서의 40배 내지 60배 감소를 나타낸다.
도 5는 항-콜라겐 항체의 수동 전달에 의해 유도된 자가면역 장애에서의 본 발명의 조성물의 치료학적 효과를 예시한다. 마우스를 표시된 용량에서 혈장 유래 IVIG(pd.IVIG) 또는 재조합 IVIG(rIVIG 또는 PRIM) 분자(PM 02, 비퓨코실 P8003Z3이라고도 칭함)의 단일 주사에 의해 3일 후 및 6일에 리포폴리사카라이드와 함께 항-콜라겐 항체에 의해 치료하였다. pd.IVIG 1K에 대한 투약은 체중 1㎏당 1g이고; pd.IVIG 2K에 대해, 투약은 체중 1㎏당 2g이다. PM02 15는 체중 1㎏당 15㎎이고; PM 02 50은 체중 1㎏당 50㎎이고; PM 02 150은 체중 1㎏당 150㎎이다. pd.IVIG 1K 및 pd.IVIG 2K 둘 다는 9일과 13일 사이에 약간 더 효과적이었다. PM 02 15는 pd.IVIG의 농도 둘 다와 필적하는 치료학적 효능을 나타낸다. PM 02 50 및 PM02 150 둘 다는 pd.IVIG 투약 중 어느 하나보다 훨씬 더 양호한 효능을 나타낸다. 그러므로, PM 02은 항-콜라겐 항체의 수동 전달에 의해 유도된 자가면역 장애를 치료할 수 있는 것으로 입증되었다.
도 6은 P8003Z1 및 P8020Z1의 크기 배제 크로마토그래프 프로필을 예시한다. 본 발명의 삼합체성 rIVIG 단백질을 나타내는 피크는 본 발명의 rIVIG 펩타이드가 균일한 형태로 제조될 수 있다는 것을 입증한다.
하기 설명에서, 설명의 목적을 위해, 다수의 구체적인 세부사항이 본 발명의 완전한 이해를 제공하도록 기재되어 있다. 그러나, 본 발명이 이 구체적인 세부사항 없이 실행될 수 있고, 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 광범위한 범위로부터 벗어나지 않으면서 이에 이루어질 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련자에게 명확할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 공보가 이것이 인용된 교시를 위해 개시내용으로 구체적으로 참고로 여기서 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 '대상체'는 포유류 및 비포유류를 의미한다. 포유류는 인간; 비인간 영장류, 예컨대 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물, 예컨대 소, 말, 양, 염소 및 돼지; 가축 동물, 예컨대 토끼, 개 및 고양이; 실험실 동물, 예컨대 설치류, 예컨대 랫트, 마우스 및 기니아 피그; 등(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 포유류 클래스의 임의의 구성원을 의미한다. 비포유류의 예는 조류, 어류 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명은 재조합 정맥내 면역글로불린(rIVIG) 단백질, 이러한 rIVIG를 포함하는 조성물, 및 제조 방법, 다양한 면역학적 장애 및 병태의 치료를 위한 조성물의 정제 및 사용에 관한 것이다.
본 발명에서, 재조합 면역글로불린(rIVIG)의 설계는 올리고머화된 rIVIG 분자의 형성을 증대시키는 도메인과 함께 인간 IgG1 Fc 도메인의 다수의 카피를 함유하는 핵산 및 단백질 분자의 조작에 초점을 둔다. 임의의 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 본 발명의 rIVIG 분자가 고친화도 FcγRI뿐만 아니라, 저친화도 Fc 수용체, 즉 FcγRII 및 FcγRIII 수용체에 결합할 수 있는 것으로 예상된다. 저친화도 수용체의 증대된 결합은 필시 올리고머 Fc와 세포 표면에 존재하는 Fc 수용체의 친화도 상호작용으로 인한 것이다.
생화학적으로, 본 발명은 적절히 폴딩되고 치료학적 생성물로서 사용하기 위한 바람직한 특징을 나타내는 융합 단백질을 생성하기 위해 Fc 도메인 및 올리고머성 단백질 스캐폴드를 함께 있게 하도록 설계된 방법 및 재료를 제공한다. 치료학적으로, 본 발명의 rIVIG 단백질은 다수의 면역학적 병태의 치료를 위해 및 다수의 자가면역 장애에 대한 면역조정제로서 유용하다. 더구나, 다양한 보체 단백질이 많은 자가면역 장애에 관여한다고 가정하여, 본 발명은 임의로 추가적인 구조 요소, 예를 들어 보체 활성화 캐스케이드와 함께 성분을 소거할 수 있는 요소를 포함할 수 있다.
본 발명자들은 Fc 작제물의 변이체를 올리고머화하기 위한 다양한 단백질 스캐폴드를 사용하여 다수의 rIVIG 분자를 설계하고 발현시켰다. 소정의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 rIVIG 분자는 3개의 기능성 Fc 도메인을 형성하기 위해 3개의 단쇄 Fc 펩타이드 또는 3개의 Fc 이합체를 우선적으로 함께 있게 하는 올리고머 스캐폴드 도메인을 포함한다.
본 발명의 방법 및 재료는 자가면역 질환, 또는 면역조정이 바람직한 임의의 장애, 질환 또는 증후군(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 면역 장애를 치료하는 데 유용하다. 본 발명이 사용될 수 있는 적응증은 면역 혈소판감소성 자반병(ITP), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 다발성 경화증(MS), 전신 홍반 루푸스(SLE 또는 루푸스), 그레이브병, 가와사키병, 애디슨병, 셀리악병-스푸루, 피부근염, 중증 근무력증, 피부염, 하시모토 질환(만성 갑상선염), 하시모토 뇌병증, 갈랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈(IMHA), 악성 빈혈, 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 발작성 야간 혈색뇨(PNH), 자가면역 백혈구감소증, 혈소판감소증, 류마티스성 관절염 및 반응성 관절염, 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 대장염, 크론병, 쇼그렌 증후군, CREST 증후군, 골반 염증성 질환(PID), 강직성 척추염, 베체트병, 혈관염, 라임병(만성 또는 후기 병기) 및 I형 당뇨병을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법 및 재료는 또한 자가항체에 의해 생긴 장애, 및 장기 특이적 자가면역 장애, 예를 들어 심근염, 심근경색 후 증후군 신장염, 굿패스쳐 증후군, 간질성 방광염, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 간경변 및 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis: PSC), 항합성효소 증후군; 원형 탈모, 자가면역 혈관부종, 피부염, 건선, 전신 피부경화증, 림프구증식성 증후군, 항인지질 증후군, 자가면역 망막병증, 포도막염 및 메니에르병의 치료에 유용하다.
본 발명의 방법 및 재료는 또한 장기 이식, 골수 이식; 수혈 또는 줄기 세포 이식을 포함하는 시술에 대한 면역 또는 항체 매개 반응의 예방, 감소 및/또는 치료에 유용하다.
본 발명의 방법 및 재료는 임의의 상업적으로 이용 가능한 정맥내 면역글로빈(IVIG)이 사용되는 임의의 자가면역 적응증에 또한 사용될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 IVIG는 Carimune(등록상표), Flebogamma(등록상표), Gammagard(등록상표), Gammaked(상표명), Gammaplex, Gamunex(등록상표)-C, Octagam(등록상표) 및 Privigen(등록상표)을 포함한다. 상업적으로 이용 가능한 IVIG가 허가된 특정한 사용 및 자가면역 적응증은 하기를 포함한다: 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP); 만성 면역 혈소판감소성 자반병(ITP); 다초점성 운동 신경병증(MMN); ITP에서의 출혈의 조절; 및 소아 환자에서 Kawasaki 증후군과 연관된 관상동맥류의 예방.
본 발명은 3개의 기능성 scFc 도메인을 함유하는 균일한 종으로서 발현되고 정제될 수 있는 재조합 IVIG(rIVIG) 단백질을 포함한다. 이 삼합체성 Fc 올리고머는 친화도(다중 원자가) 상호작용으로 인해 고친화도 및 저친화도 Fc 수용체 둘 다에 결합할 수 있다. 다양한 Fc 수용체에 대한 이 증대된 친화도는 인간 IVIG의 면역조정 효과에 기인한 인간 IVIG의 제제에 존재하는 소량의 올리고머화된 항체를 연상시킨다. Fc 수용체와의 증대된 상호작용에서의 이의 의태로 인해, 본 발명의 rIVIG는 이의 수동 면역 보호 용도가 아니라 이의 면역조정 용도를 위해 전통적인 IVIG를 대체하는 것으로 예상된다.
면역글로불린
Fc 단편
본 발명은 IgG의 인간 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 불변 영역 3(CH3)을 포함하는 CH2-CH3 도메인(CH2-CH3), 바람직하게는 IgG1을 이용한다. 2개 이상의 Fc 단편, 예컨대 CH2-CH3 도메인이 사용될 때, 이들은 일반적으로 합성되거나 단쇄 Fc 펩타이드의 형태로 발현되고, 여기서 CH2-CH3 도메인은 가요성 펩타이드 링커, 예컨대 (GGGGS)5(= GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 10))를 사용하여 연결되고, 이것은 단쇄 Fc 펩타이드의 별개의 CH2-CH3 도메인 사이의 분자내 상호작용을 선호하여, 단쇄 Fc 펩타이드가 생물학적 기능을 최적화하는 3차원 입체배좌를 띄게 허용한다. 인간 IgG로부터의 힌지 영역(H), 바람직하게는 IgG1은 또한 생물학적 활성을 최적화하기 위해 적절한 입체배좌를 장려하도록 각각의 CH2 영역의 N 말단 끝에 존재할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 rIVIG 단백질은 Fc 분자의 추가의 영역을 포함한다. 예를 들어, rIVIG는 하나 이상의 IgG의 불변 영역 1(CH1) 도메인, 바람직하게는 IgG1, 및 하나 이상의 Ig 카파 또는 경쇄 불변 영역(CL) 도메인을 포함할 수 있다. CL 도메인의 C 말단 끝은 짧은 링커 서열, 예컨대 (GGGGS)2를 사용하여 CH1 도메인의 N 말단에 연결될 수 있다. 이 작제물에서, CH1 도메인은 분자간 이황화 연결의 것보다 열역학적으로 더 양호한 분자내 이황화 연결을 통해 CL 도메인과 상호작용할 수 있다. 또한, CL/CH1 도메인은 보체 성분을 소거하는 데 있어서 역할을 하고, 이는 많은 자가면역 장애에 존재하는 보체 면역 반응을 추가로 개선할 수 있다.
인간 항체 아이소유형
신체에서 명확한 기능성 역할을 발생시키는 상이한 결합 패턴을 갖는 항체의 몇몇 상이한 아이소유형이 존재하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 아이소유형에 대한 결합 친화도는 일반적으로 공지되어 있고(Gillis et al. (2014) Frontier Immunology 5:1-13), 하기 표 1에 기재되어 있다. 각각의 항체 아이소유형의 Fc가 Fc 수용체에 다르게 결합한다. 예를 들어, FcγRIIIA에 대한 인간 IgG3의 결합 친화도(0.1마이크로-몰(uM) KD)는 인간 IgG1 내지 동일한 수용체의 것(5-10uM KD)보다 적어도 50배 높다. 유사하게, FcγRIIA에 대한 인간 IgG1의 결합은 인간 IgG4의 것보다 15배 강하다. 따라서, 본 명세서에서 예가 IgG1로부터 유래된 Fc 단편을 사용하지만, 각각의 아이소유형으로부터의 Fc 단편이 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소유형의 불변 영역을 보유한 P8003Z 또는 P8020Z의 변이체는 IgG1 아이소유형의 불변 영역을 보유한 모 P8003Z 또는 P8020Z의 것으로부터 상이한 친화도를 나타내는 것으로 예상된다. 많은 자가면역 장애가 Fc 수용체의 다르게 조합된 발현과 연관되므로, 각각의 아이소유형 변이체로부터 유래된 본 발명의 rIVIG가 명확한 치료학적 이점을 제공할 수 있다.
Figure pct00001
비인간 포유류 항체 하위종류
소정의 비인간 포유류 종은 인간 항체 아이소유형과 유사한 항체의 하위종류를 갖는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 개과 면역글로불린의 4개의 공지된 하위종류가 존재한다: 각각 하위종류 A, 하위종류 B, 하위종류 C 및 하위종류 D. 하위종류는 4개의 인간 IgG 아이소유형과 기능성 특성을 공유한다. 개과 하위종류 A 및 D가 효과기 기능 음성으로 보이는 한편, 하위종류 B 및 C가 개과 Fc 감마 수용체에 결합하고 ADCC에 양성인 것으로 보고되었다. 모든 개과 하위종류가 하위종류 C를 제외하고 신생 Fc 수용체에 결합한다는 것이 추가로 보고되었다(22).
면역글로불린 Fc 도메인의 글라이코실화 및 FcγRIII (인간) 및 FcγRIV에 대한 비퓨코실 항체의 증대된 상호작용.
아이소유형 차이 이외에, 단일 글라이코실화 부위(Asn-297)에서의 차등 글라이코실화는 Fc-Fc 수용체 상호작용에서 중요한 역할을 하는 것으로 또한 공지되어 있다. 사실, Asn-297 잔기에서의 글라이코폼의 변경이 생리학적 및 병리학적 병태 하에 발생한다는 것이 명확하다(23). 또한, 차등 시알릴화는 IgG의 염증성 특성에 영향을 미치는 것으로 보고되고, 소염 병태를 유도하는 분자 스위치의 기전으로서 제안되었다(24). 더구나, 글라이칸의 제거는 완전히 신생 Fc 수용체(FcRn)를 제외하고 모든 Fc 수용체와 상호작용하는 Fc의 능력을 손상시킨다(25). 가장 흥미롭게도, N-글라이칸 복합체에서의 코어 퓨코스의 제거가 FcγRIII 상호작용에 대한 Fc의 100배 이하의 선택적 증대를 발생시키는 것으로 발견되었다(26). 항체의 비퓨코실화 형태는 알파-1,6 퓨코실전환효소 유전자가 결핍된(FUT8-/-) 숙주 세포주에서의 매우 동일한 항체를 발현함으로써 제조될 수 있다. P8003Z1이 FUT8 유능 세포에서 제조되고, P8003Z3이 FUT8 결핍 세포에서 제조된다는 점에서, P8003Z1 및 P8003Z3은 코어 퓨코실 사카라이드에서 다르다. 비퓨코실화 P8003Z3은 예상된 바대로 인간 FcγRIII 및 쥣과 FcγRIV에 증대된 결합을 나타낸다(도 3에서 KD 표 참조).
따라서, 당업자에게 명확한 것처럼, 변형된 글라이코실화를 갖는 rIVIG 단백질, 변형된 글라이코실화를 갖는 rIVIG 단백질을 생산하는 세포주 및 배양 배지는 본 발명에서 사용될 수 있고, rIVIG의 제조를 위한 이의 용도 및 면역 장애의 치료학적 치료에서의 변형된 글라이코실화를 갖는 rIVIG 단백질의 용도는 본 발명의 일부를 형성한다.
올리고머화 스캐폴드 도메인
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "올리고머화 도메인" "올리고머화 스캐폴드 도메인" 및 "올리고머성 단백질 스캐폴드"는 특정한 서열이 올리고머 구조를 형성하도록 기능한다는 것을 나타내도록 상호 교환되어 사용된다. 본 발명에서 유용한 올리고머화 스캐폴드 도메인은 이의 융합 파트너, 예컨대 단쇄 Fc 펩타이드의 삼합체화를 유도하여서, 삼합체성 rIVIG 분자를 형성하는 것(여기서, 각각의 rIVIG 분자는 2개의 H-CH2-CH3 Fc 도메인(힌지 영역-중쇄 불변 영역 2-중쇄 불변 영역 3)을 포함함)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, P8020Z (서열 번호 6)에 의해 예시된 것처럼, 올리고머화 스캐폴드 도메인은 작제물의 N 말단에 있을 수 있고, 이 경우에 올리고머화 스캐폴드 도메인의 C 말단 끝은 직접적으로 또는 간접적으로 짧은 링커 서열, 예컨대 GGGGS를 통해 CL 도메인 또는 제1 힌지 영역(H) 또는 CH2 영역의 N 말단에 연결될 수 있다. 다른 실시형태에서, P8003Z(서열 번호 4)에 의해 예시된 것처럼, 올리고머화 스캐폴드 도메인은 작제물의 C 말단에 있을 수 있고, 이 경우에 올리고머화 스캐폴드 도메인의 N 말단 끝은 직접적으로 또는 간접적으로 짧은 링커 서열, 예컨대 GGGGS(서열 번호 9)를 통해 마지막 CH3 도메인의 C 말단에 연결될 수 있다.
링커 및 가요성 링커
본 발명에서 유용한 링커 및 가요성 링커는 복수의 글라이신 또는 세린 잔기를 갖고, 제1 도메인의 C 말단 끝과 제2 도메인의 N 말단 끝 사이의 차이에 이르는 충분한 길이의 폴리펩타이드를 한정한, 글라이신- 및/또는 세린 농후 펩타이드 링커를 포함한다. 용어 "가요성 링커"는 수성 용액 중에 본질적으로 이차 구조가 없는 가요성의 비구조화 폴리펩타이드 구성의 형성을 허용하고, 2개의 단백질 도메인을 연결하기 위한 수단을 제공하는(이로써, 키메라 또는 융합 단백질은 단일 핵산 작제물로부터 단일 폴리펩타이드 분자로서 제조될 수 있음), 충분한 길이의 폴리펩타이드 서열을 한정하도록 사용된다.
링커는 별개의 도메인 사이의 분자내 상호작용을 허용하여서, 생물학적 기능을 최적화하는 3차원 입체배좌의 형성을 허용하는 방식으로 길이가 다를 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "가요성 링커"는 일반적으로 10개 이상의 아미노산 길이를 갖는 링커에 적용된다. 적합한 가요성 링커는 일반적으로 적어도 10개의 아미노산 잔기의 길이를 갖고, 약 10개 내지 약 36개의 아미노산 잔기를 갖는 링커 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직한 가요성 링커는 적어도 약 50% 초과의 글라이신 잔기 및 약 10 내지 약 30개의 아미노산 길이; 더 바람직하게는 약 12개 내지 약 25개의 아미노산 길이, 또는 약 15개 내지 약 25개의 아미노산 길이를 갖는 것이다. 본 발명에서 유용한 가요성 링커는 예를 들어 (GGGGS)n(식 중, n은 2 내지 7임)의 아미노산 서열을 포함한다. 용어 "G4S"는 서열 GGGGS(서열 번호 9)를 의미하도록 상호 교환되어 사용된다. 바람직한 가요성 링커는 (GGGGS)n(식 중, n은 2 내지 6이고; 더 바람직하게는 n은 3 내지 5임)의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 글라이신 농후 및/또는 세린 농후 펩타이드 링커는 널리 공지되어 있고, 단일 폴리펩타이드 사슬로 완전한 항체 결합 부위를 도입시키는 단쇄 Fv(sFv) 단백질을 형성하도록 항체 도메인을 연결하도록 사용된다. 12개 미만의 아미노산 잔기의 세린 농후 및/또는 글라이신 농후 펩타이드 링커는 또한 펩타이드 도메인을 연결하는 링커로서 사용될 수 있지만, 인접한 융합 펩타이드 도메인이 분자내 상호작용할 수 있는 입체배좌를 허용하는 충분한 유연성을 일반적으로 제공하지 않는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 특정한 가요성 링커는 아미노산 서열 (GGGGS)5(서열 번호 9)를 포함한다. 본 발명에서 유용한 더 짧은 링커(여기서, 가요성 링커가 바람직하지 않음)는 아미노산 GGGGS 및 (GGGGS)2를 포함하는 링커를 포함한다. 일반적으로, 링커는 비반응성 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌 및 트레오닌을 포함할 수 있다. 그러나, 링커는 일반적으로 이황화 연결을 형성할 수 있는 시스테인 잔기가 없고, 하전된 아미노산 잔기가 없다. 적합한 가요성 펩타이드 링커, 및 이의 제조에 유용한 DNA 작제물은 미국 특허 제5,258,498호; US 특허 제5,482,858호; 및 US 특허 제5,525,491호에 기재되어 있다.
정제:
본 발명은 추가로 주로 하나 이상의 본 발명의 rIVIG 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 조성물의 중량과 관련하여 사용될 때, 용어 하나 이상의 rIVIG 단백질을 "주로 포함하는"은 조성물이 전체 조성물 중량의 중량을 기준으로 기재된 rIVIG 단백질의 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 포함한다는 것을 의미한다. 조성물에서의 단백질의 양과 관련하여 사용될 때, 용어 하나 이상의 rIVIG 단백질을 "주로 포함하는"은 조성물이 몰 퍼센트를 기준으로 조성물에 존재하는 전체 단백질의 몰 퍼센트를 기준으로 기재된 rIVIG 단백질의 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 몰 퍼센트로 포함한다는 것을 의미한다.
하나 이상의 본 발명의 rIVIG 단백질을 주로 포함하는 조성물은, 단백질 G-아가로스 또는 IgG의 Fc 부분에 결합하고, IgG의 Fc 부분에 우선적으로 결합하지만, 또한 IgG의 Fab 영역에 결합할 수 있어서, 이것이 F(ab')2의 정제에 유용하게 하는, 단백질 A-아가로스를 사용하여, IgG의 정제의 전통적인 방법을 이용하여 얻어질 수 있다. 당해 분야에 공지된 추가적인 정제 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 포함하는 본 발명에 따른 rIVIG 단백질의 조성물의 추가의 정제에 사용될 수 있다. http://www.kpl.com/docs/techdocs/purifigg.pdf(2016년 3월 23일 접속), 및 여기 인용된 참고문헌; [Surolia et al. (1982) Trends Biochem. Sci. 7:74-76; Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), p. 617-618; Langone (1982) J. Immunological Methods 55:277-296; Lindmark et al. (1983) J. Immunological Methods 62:1-13; and Thruston and Henley (1988) in Walker, ed. Methods in Molecular Biology, Vol. 3 - New Protein Techniques (Humana Press: Clifton, NJ) p. 149-158]을 참조한다.
조성물
본 발명은 추가로 약제학적으로 허용 가능한 애쥬번트 또는 담체와 조합된 rIVIG 단백질의 조성물에 관한 것이다. 사용된 바대로, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 약제학적 분야에서 사용하기에 허용 가능한, 즉 허용 불가능하게 독성이 아니거나 달리 포유류에 대한 투여에 적합하다는 것을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 애쥬번트의 예는 희석제, 부형제 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일반적으로, 약물 제제에 대한 가이드를 위해 참고문헌["Remington's: The Science and Practice of Pharmacy", 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005]에 참고가 이루어질 수 있다.
약제학적 조성물은 추가 성분, 예를 들어 보존제, 완충제, 등장 물질, 항산화제 및 안정화제, 비이온성 습윤제 또는 투명화제, 점도 증가제 등을 추가로 포함할 수 있다.
용액에서 하기에 적합한 보존제는 폴리쿼터늄-1, 벤즈알코늄 클로라이드, 티메로살, 클로로뷰탄올, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 페닐에틸 알코올, 다이나트륨-EDTA, 소르브산, 벤즈에토늄 클로라이드 등을 포함할 수 있다. (필수는 아니지만) 통상적으로, 이러한 보존제는 0.001% 내지 1.0중량%의 수준으로 사용된다.
(필수는 아니지만) 통상적으로, 완충제는 생리학적 pH에서 또는 이게 가깝게 제제를 유지시키기 위해 사용된다. 적합한 완충제는 약 pH 6 내지 pH 8, 바람직하게는 약 pH 7 내지 pH 7.5에서 pH를 유지시키기에 충분한 양으로 붕산, 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 붕산나트륨, 붕산칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 나트륨 아세테이트, 나트륨 바이포스페이트 등을 포함한다.
적합한 등장 물질은 덱스트란 40, 덱스트란 70, 덱스트로스, 글라이세린, 염화칼륨, 프로필렌 글라이콜, 염화나트륨 등을 포함하여서, 주사용 용액의 염화나트륨 당량은 0.9±0.2% 범위이다.
적합한 항산화제 및 안정화제는 나트륨 바이설파이트, 나트륨 메타바이설파이트, 나트륨 티오설파이트, 티오유레아 등을 포함한다. 적합한 습윤제 및 투명화제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 282 및 틸록사폴을 포함한다. 적합한 점도 증가제는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 젤라틴, 글라이세린, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시메틸프로필셀룰로스, 라놀린, 메틸셀룰로스, 페트롤라툼, 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카복시메틸셀룰로스 등을 포함한다.
애쥬번트의 선택은 조성물의 의도된 투여 방식에 따라 달라지고, 또한 의도된 적응증 및 환자를 고려할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 화합물은 점적주사에 의해 또는 피하로 또는 정맥내로 주사에 의해 투여를 위해 제제화되고, 따라서 무균 및 발열원 비함유 형태로 수성 용액으로서 사용되고, 임의로 완충되거나 등장성이 될 수 있다. 따라서, 화합물은 증류수, 또는 더 바람직하게는 식염수, 포스페이트 완충 식염수 또는 5% 덱스트로스 용액 중에 투여될 수 있다. 상기 이외에, 본 발명의 제제는 특정한 투약량 및 투여 방식에 맞도록 추가적인 활성 성분 및/또는 불활성 성분, 예를 들어 용매, 희석제, 현탁 조제, 점증제 또는 유화제, 결합제, 안정화제, 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대 임의의 원치않는 효과를 생성하거나 달리 제제의 임의의 다른 성분(들)과 해로운 방식으로 상호작용함으로써, 임의의 종래의 캐리어 매질이 본 발명의 성분과 비혼화성인 정도를 제외하고, 이의 사용은 본 발명의 범위 내인 것으로 고려된다.
투여 방법:
약제학적 조성물은 예를 들어 전신 또는 국소 투여를 포함하는 본 명세서에 기재된 다양한 투여 방식에 적합할 수 있다. 약제학적 조성물은 주사용 용액의 형태 또는 경구 투여에 적합한 형태일 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 단일 단위 투약량 또는 다중 투약량 형태로 포장될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 경구 투여 또는 정맥내 주사를 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 투여 경로에 의해 개인, 척추동물, 포유류 또는 인간에 대한 투여에 적합하다.
본 명세서에 기재된 조성물은 정맥내(예를 들어, 점적주사 펌프에 의함), 복강내, 눈내, 동맥내, 폐내, 경구, 흡입, 소포내, 근육내, 도관내, 피하, 안내, 척추강내, 진피경유, 흉막경유, 동맥내, 국소, 흡입(예를 들어, 스프레이의 미르트로서), 점막 (예컨대, 비강 점막을 통함), 피하, 진피경유, 위장, 관절내, 수조내, 뇌실내, 직장(즉, 좌제를 통함), 질(즉, 페서리를 통함), 두개내, 요도내, 간내 및 종양내를 포함하는 임의의 경로를 통해 개인에게 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 (예를 들어, 정맥내 주사에 의해) 전신으로 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 (예를 들어, 동맥내 또는 눈내 주사에 의해) 국소로 투여된다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 혈관내, 예컨대 정맥내 또는 동맥내 투여된다. 몇몇 실시형태에서, (예를 들어, 신장 질환의 치료를 위해), 조성물은 동맥(예컨대, 신동맥)으로 직접적으로 투여된다. 바람직한 실시형태에서, 조성물은 피하로 투여된다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 눈 또는 눈 조직으로 직접적으로 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 눈에 국소로, 예를 들어, 점안액으로 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 눈에 대한 주사(눈내 주사) 또는 눈과 연관된 조직에 투여된다. 조성물은 예를 들어 눈내 주사, 눈주변 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 사이막경유 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막밑 주사, 결막하 주사, 테논주위 주사, 안구뒤 주사, 안구주위 주사 또는 후방 공막옆 전달에 의해 투여된다. 이 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 망막 약물 전달을 위한 예시적인 눈주위 경로의 설명을 위해, 문헌[Periocular routes for retinal drug delivery, Raghava et al. (2004), Expert Opin. Drug Deliv. 1(1):99-114]을 참조한다. 조성물은 예를 들어, 유리체, 방수, 공막, 결막, 공막과 결막 사이의 부위, 망막 맥락막 조직, 황반 또는 개인의 눈에서의 또는 이에 근접한 다른 부위에 투여될 수 있다.
조성물은 또한 임플란트로서 개인에게 투여될 수 있다. 바람직한 임플란트는 시간의 기간에 걸쳐 화합물을 점진적으로 방출하는 생체적합성 및/또는 생체분해성 지속 방출 제제이다. 약물 전달을 위한 눈 임플란트는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 US 제5,501,856호, 제5,476,511호 및 제6,331,313호를 참조한다. 조성물은 또한 US 4,454,151 및 US 2003/0181531 및 2004/0058313에 기재된 이온이동 방법(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 이온이동법을 사용하여 개인에게 투여될 수 있다.
투약량:
조성물의 최적 유효량은 경험적으로 결정될 수 있고, 질환의 유형 및 중증도, 투여 경로, 질환 진행 및 건강, 개인의 체중 및 체면적에 따라 달라질 것이다. 이러한 결정은 당업자의 기술 내에 있다. 유효량은 또한 시험관내 검정에 기초하여 결정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있는 조성물의 투약량의 예는 임의의 약 0.01㎍/㎏ 내지 약 300㎎/㎏의 투약량 범위 내, 또는 약 0.1㎍/㎏ 내지 약 40㎎/㎏ 내, 또는 약 1㎍/㎏ 내지 약 20㎎/㎏ 내, 또는 약 1㎍/㎏ 내지 약 10㎎/㎏ 내의 유효량을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 피하로 투여될 때, 조성물은 예를 들어 약 0.1㎍/㎏ 이하, 약 0.05㎍/㎏ 이하, 또는 0.01㎍/㎏ 이하를 포함하는 낮은 마이크로그램 범위로 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 개인에게 투여되는 조성물의 양은 예를 들어 용량당 임의의 약 10㎍ 내지 약 50㎍, 약 50㎍ 내지 약 100㎍, 약 100㎍ 내지 약 200㎍, 약 200㎍ 내지 약 300㎍, 약 300㎍ 내지 약 500㎍, 약 500㎍ 내지 약 1㎎, 약 1㎎ 내지 약 10㎎, 약 10㎎ 내지 약 50㎎, 약 50㎎ 내지 약 100㎎, 약 100㎎ 내지 약 200㎎, 약 200㎎ 내지 약 300㎎, 약 300㎎ 내지 약 400㎎, 또는 약 400㎎ 내지 약 500㎎을 포함하는 용량당 약 10㎍ 내지 약 500㎎이다.
조성물은 단일 1일 용량으로 투여될 수 있거나, 전체 1일 용량은 1일 2회, 3회 또는 4회의 분할 투약량으로 투여될 수 있다. 조성물은 또한 매일보다 덜 빈번하게, 예를 들어 1주 6회, 1주 5회, 1주 4회, 1주 3회, 1주 2회, 1주 1회, 2주 1회, 3주 1회, 1개월마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 또는 6개월마다 1회 투여될 수 있다. 조성물은 또한 시간의 기간에 걸쳐 조성물을 점진적으로 방출하고, 조성물이 덜 빈번하게, 예컨대 1개월마다 1회, 2-6개월마다 1회, 1년 1회, 또는 심지어 단일 투여로 투여되게 허용하는 지속 방출 제제, 예컨대 임플란트로 투여될 수 있다. 지속 방출 장치(예컨대, 펠릿, 나노입자, 마이크로입자, 나노구, 마이크로구 등)는 신체에서 다양한 위치에서 주사 또는 수술 임플란트에 의해 투여될 수 있다.
동시투여
본 발명은 예방학적 또는 치료학적 활성을 갖고 이러한 면역 장애 또는 질환의 치료로서 사용에 허가된 하나 이상의 추가적인 활성제와 본 발명의 rIVIG 조성물을 동시투여하는 단계를 포함하는 면역 장애 또는 질환의 개선된 치료를 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, rIVIG 조성물은 추가적인 활성제의 투여 전에, 이와 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 류마티스성 관절염(RA)의 치료에서, 본 발명의 rIVIG 조성물은 RA에서의 사용에 허가된 치료학적 항체인 Humira(등록상표)(adilimumab, AbbVie Inc.)를 포함하는 조성물과 동시투여될 수 있다. rIVIG 조성물이 RA를 겪는 환자에 대한 추가적인 경감을 제공하고, rIVIG 조성물의 효과가 Humira(등록상표)의 것과 상승작용할 것이라고 예상된다.
본 발명은 이러한 이식 또는 다른 시술 전에, 이와 동시에 또는 후에 본 발명의 rIVIG 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 장기 이식, 또는 다른 시술, 예컨대 줄기 세포 이식 또는 수혈을 받은 환자의 개선된 치료를 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 이러한 치료는 이식된 장기에 대해 항체 매개 면역 반응(즉, 면역 거부)을 예방하거나 제거하는 방법을 제공한다. rIVIG 조성물은 이러한 항체 매개 면역 반응 또는 이식된 장기의 거부에 대해 예방학적 또는 치료학적 활성을 갖는 하나 이상의 추가적인 활성제와 동시투여될 수 있다.
예를 들어, 신장 이식 수혜자의 치료에서, 본 발명의 rIVIG 조성물은 면역억제제 약물, 예컨대 사이클로스포린을 포함하는 조성물과 동시투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 동시투여될 수 있는 다른 면역억제제 약물은 칼시네우린 저해제, 예컨대 타크롤리무스; mTOR 저해제, 예컨대 시롤리무스; 항증식제, 예컨대 마이코페놀레이트 및 아자티오프린; 및 스테로이드, 예컨대 프레드니손을 포함한다. rIVIG 조성물이 면역 거부를 겪는 환자에 추가적인 경감을 제공하고, rIVIG 조성물의 효과가 면역억제제 물질의 것과 상승작용할 수 있다고 예상된다. 추가적으로, 본 발명에 따른 이러한 치료는 이러한 면역억제제 물질의 양의 감소를 허용할 수 있다.
코딩 뉴클레오타이드 분자, 재조합 벡터 및 재조합 세포주
본 발명의 rIVIG 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 분자를 합성하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 유전자 코드를 사용하여, 본 발명의 rIVIG 단백질의 아미노산 서열은 온라인 도구(27)를 이용하여 용이하게 역선사되고 코돈 최적화될 수 있고; 코딩 뉴클레오타이드 분자는 전략, 예컨대 Kim 등(28)에서 기재된 유전자 합성의 계층적 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
본 발명의 rIVIG 단백질의 발현을 위해, 코딩 뉴클레오타이드 서열이 재조합 벡터를 사용하여 숙주 세포에서 발현될 수 있고, 여기서 rIVIG 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 숙주 세포에서 rIVIG 단백질의 발현을 추진시키는 적합한 촉진자의 제어 하에 있다는 것이 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포는 예를 들어, 포유류 CHO 세포, 293T 세포(29)를 포함한다.
유전자 치료
분자는, 대개 "유전자 치료"라 칭하는, 생체내 융합 단백질의 발현에 의해 또한 전달될 수 있다. 예를 들어, 세포는 생체외 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)에 의해 조작될 수 있고, 조작된 세포는 이후 융합 단백질에 의해 치료되는 개인에게 제공된다. 이러한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 세포는 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 입자의 사용에 의해 당해 분야에 공지된 절차에 의해 조작될 수 있다. 유전자 치료를 사용한 본 발명의 rIVIG 단백질의 국소 전달은 국소화된 표적 부위로 치료제를 제공할 수 있다.
유전자 전달의 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 이 방법은 직접적인 DNA 전달(예를 들어, Wolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468 참조); 2) 리포솜 매개 DNA 전달(예를 들어, Caplen et al. (1995) Nature Med. 3:39-46; Crystal (1995) Nature Med. 1:15-17; Gao and Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285 참조); 3) 레트로바이러스 매개 DNA 전달(예를 들어, Kay et al. (1993) Science 262:117-119; Anderson (1992) Science 256:808-813 참조); 4) DNA 바이러스 매개 DNA 전달을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 DNA 바이러스는 아데노바이러스(바람직하게는 Ad2 또는 Ad5 기반 벡터), 헤르페스 바이러스(바람직하게는 단순 포진 바이러스 기반 벡터) 및 파르보바이러스(바람직하게는 "결핍성" 또는 비자율적 파르보바이러스 기반 벡터, 더 바람직하게는 아데노 연관된 바이러스 기반 벡터, 가장 바람직하게는 AAV-2 기반 벡터)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Ali et al. (1994) Gene Therapy 1:367-384](본 명세서에서 참고로 포함됨); 미국 특허 제4,797,368호 및 미국 특허 제5,139,941호를 참조한다.
이하 언급된 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유래될 수 있는 레트로바이러스는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하베이(Harvey) 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍증 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유선 종양 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스로부터 유래된다.
아데노바이러스는 이것이 광범위한 숙주 범위를 갖고, 정지성 또는 말단으로 분화된 세포, 예컨대 뉴런 또는 간세포를 감염시킬 수 있고, 본질적으로 비발암성으로 보인다는 이점을 갖는다. 예를 들어, 상기 Ali 등의 문헌(1994), 367페이지를 참조한다. 아데노바이러스는 숙주 게놈으로 통합하는 것으로 보이지 않는다. 이것이 염색체외 존재하므로, 삽입 돌연변이유발의 위험은 크게 감소한다. Ali 등의 문헌(1994), 373페이지.
아데노 연관된 바이러스는 아데노바이러스 기반 벡터와 유사한 이점을 나타낸다. 그러나, AAV는 인간 염색체 19에서 부위 특이적 통합을 나타낸다(상기 Ali 등의 문헌(1994), 377페이지).
유전자 치료 벡터는 하나 이상의 촉진자를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 다수의 세포 유형에서의 발현을 추진하는 촉진자를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 특정한 세포 유형(예컨대, 망막의 세포 또는 신자의 세포)에서의 발현을 추진하는 촉진자를 갖는다. 사용될 수 있는 적합한 촉진자는 레트로바이러스 LTR; SV40 촉진자; 및 문헌[Miller et al. (1989) Biotechniques 7(9):980-990]에 기재된 인간 사이토메갈로바이러스(CVM) 촉진자, 또는 임의의 다른 촉진자(예를 들어, 세포 촉진자, 예컨대 진핵생물 세포 촉진자, 예를 들어 히스톤, pol III 및 ß-액틴 촉진자(이들로 제한되지는 않음))를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 다른 바이러스 촉진자는 아데노바이러스 촉진자, 타이미딘 키나제(TK) 촉진자 및 B19 파르보바이러스 촉진자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 촉진자의 선택은 본 명세서에 함유된 교시내용으로부터 당해 분야의 숙련자에게 명확할 것이다.
rIVIG 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 적합한 촉진자의 제어 하에 있다. 사용될 수 있는 적합한 촉진자는 아데노바이러스 촉진자, 예컨대 아데노바이러스 주요 후기 촉진자; 또는 비상동성 촉진자, 예컨대 사이토메갈로바이러스(CMV) 촉진자; 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 촉진자; 유도성 촉진자, 예컨대 MMT 촉진자, 메탈로티오네인 촉진자; 열 쇼크 촉진자; 알부민 촉진자; ApoA1 촉진자; 인간 글로빈 촉진자; 바이러스 타이미딘 키나제 촉진자, 예컨대 단순 포진 타이미딘 키나제 촉진자; 레트로바이러스 LTR(상기 기재된 변형된 레트로바이러스 LTR을 포함); .베타.-액틴 촉진자; 및 인간 성장 호르몬 촉진자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
레트로바이러스 플라스미드 벡터는 생산자 세포주를 형성하기 위해 패키징 세포주를 형질도입하도록 사용될 수 있다. 형질감염될 수 있는 패키징 세포의 예는 문헌[Miller (1990) Human Gene Therapy 1:5-14]에 기재되어 있다. 벡터는 당해 분야에 공지된 임의의 수단을 통해 패키징 세포를 형질도입할 수 있다. 이러한 수단은 전기천공, 리포솜의 사용 및 CaPO4 침전을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 대안에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 리포솜으로 캡슐화되거나, 액체에 커플링되고, 이후 숙주에 투여될 수 있다. 생산자 세포주는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성한다. 이러한 레트로바이러스 벡터 입자는 이후 시험관내 또는 생체내 진핵 세포를 형질도입하도록 사용될 수 있다. 형질도입된 진핵 세포는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열(들)을 발현할 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵 세포는 배아 줄기 세포, 배아 암종 세포 및 조혈 줄기 세포, 간세포, 섬유아세포, 근원세포, 케라틴세포, 내피 세포 및 기관지 상피 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
생체외 투여
몇몇 실시형태에서, rIVIG 단백질의 면역조정 효과는 분자가 면역 반응을 조정하도록 기능하게 허용하는 조건 하에 생체외 신체 유체를 분자를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 적합한 신체 유체는 개인에게 반환할 수 있는 것, 예컨대 혈액, 혈장 또는 림프를 포함한다. 친화도 흡수 성분채집술은 일반적으로 문헌[Nilsson et al. (1988) Blood 58(1):38-44; Christie et al. (1993) Transfusion 33:234-242; Richter et al. (1997) ASAIO J. 43(1):53-59; Suzuki et al. (1994) Autoimmunity 19: 105-112; U.S. Pat. No. 5,733,254; Richter et al. (1993) Metabol. Clin. Exp. 42:888-894; and Wallukat et al. (1996) Int'l J. Card. 54:1910195]에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명은 분자가 면역 반응을 조정하도록 기능하게 허용하는 조건 하에 분자를 포함하는 조성물에 의해 체외로(즉, 신체 밖 또는 생체외) 개인의 혈액을 치료하는 것 및 혈액을 개인에게 반환하는 것을 포함하는 개인에서 본 명세서에 기재된 하나 이상의 질환을 치료하는 방법을 포함한다.
단위 투약량, 제조 물품 및 키트
조성물의 단위 제형이 또한 제공되고, 각각의 투약량은 예를 들어 임의의 약 0.1㎎ 내지 약 50㎎, 약 1㎎ 내지 약 50㎎, 약 5㎎ 내지 약 40㎎, 약 10㎎ 내지 약 20㎎, 또는 약 15㎎을 포함하는 약 0.01㎎ 내지 약 50㎎의 분자를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 분자 조성물의 단위 제형은 약 임의의 0.01㎎ 내지 0.1㎎, 0.1㎎ 내지 0.2㎎, 0.2㎎ 내지 0.25㎎, 0.25㎎ 내지 0.3㎎, 0.3㎎ 내지 0.35㎎, 0.35㎎ 내지 0.4㎎, 0.4㎎ 내지 0.5㎎, 0.5㎎ 내지 1.0㎎, 10㎎ 내지 20㎎, 20㎎ 내지 50㎎, 50㎎ 내지 80㎎, 80㎎ 내지 100㎎, 100㎎ 내지 150㎎, 150㎎ 내지 200㎎, 200㎎ 내지 250㎎, 250㎎ 내지 300㎎, 300㎎ 내지 400㎎, 또는 400㎎ 내지 500㎎ 분자를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단위 제형은 약 0.25㎎ 분자를 포함한다. 용어 "단위 제형"은 개인에 대한 단위 투약량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 의미하고, 각각의 단위는 적합한 약제학적 담체, 희석제 또는 부형제와 연관되어 원하는 치료학적 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 재료의 미리 결정된 분량을 함유한다. 이 단위 제형은 단일 또는 다중 단위 투약량에서 적합한 패키징에서 저장될 수 있고, 또한 추가로 무균화되고 밀봉될 수 있다.
적합한 패키징에서 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 제조 물품이 또한 제공된다. 본 명세서에 기재된 조성물(예컨대, 안과용 조성물)을 위한 적합한 패키징은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 바이알(예컨대, 밀봉 바이알), 용기, 앰플, 병, 단지, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉 Mylar 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 이 제조 물품은 추가로 무균화 및/또는 밀봉될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 조성물(또는 단위 투약량 형태 및/또는 제조 물품)을 포함하는 키트를 제공하고, 조성물을 사용하는 방법에 대한 지시(들), 예컨대 본 명세서에 기재된 용도를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 침, 주사기 및 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 지시를 갖는 패키지 인서트를 포함하는 상업용 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 제제는 면역 반응의 조정과 연관된 병태의 치료에 유용하다.
수의 용도
상기 이외에, 본 발명은 추가로 면역 장애 및 질환을 위한 비인간 포유류의 치료를 포함하는 수의 적응증에 유용한 방법 및 재료를 제공한다. 특정한 실시형태에서, 수의 용도에 유용한 본 발명의 방법 및 재료는 수의 숙주/환자와 동일한 종으로부터 기원한 펩타이드 도메인을 포함한다. 비인간 포유류는 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 면역성 혈소판 감소증(ITP), 류마티스성 관절염 또는 반응성 관절염을 포함하는 임의의 면역 장애 또는 질환을 겪을 수 있다. 비인간 포유류가 임의의 종일 수 있지만, 개의 소정의 품종이 자가면역 장애에 특히 감수성인 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 개의 치료를 위해, 하나 이상의 Fc 펩타이드 도메인 및 올리고머화 펩타이드 도메인(이들 각각은 개과 기원임)을 사용할 수 있다. 개는 특히 면역 장애, 예컨대 개 자체의 면역계가 개의 적혈구에 결합하고 파괴하는 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA)에 감수성인 것으로 공지되어 있다. AIHA 또는 종래의 치료에 반응하지 않는 면역성 혈소판 감소증(ITP)을 갖는 개에서, 또는 중증 ITP(여기서, 치명적인 출혈의 위험이 고려됨)에서, 인간 기원의 실질적인 IVIG는 치료에 사용된다. 예를 들어, 문헌[Kellerman et al. (1997) J Vet Int Med, 11:327-332]을 참조한다. 그러나, 인간 IVIG에 의해 치료된 개는 일관하여 인간 IVIG의 반복 사용 시 아나필락시스를 촉발할 수 있는 개-항-인간-항체(DAHA)를 생성한다. 이러한 이유로, 현지 이용 가능한 IVIG 조성물을 갖는 수의 환자의 치료가 심각하게 제한된다. 따라서, 본 발명의 방법 및 재료는 개과 기원의 rIVIG 조성물 및 개과 면역 장애, 예컨대 AIHA 및 ITP를 나타내는 개의 치료 방법을 제공한다.
수의 적응증에서, 본 발명은 수의 숙주/환자와 동일한 종으로부터 기원한 펩타이드 도메인을 포함하는 rIVIG 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 개의 치료를 위해, 본 발명은 하나 이상의 개과 Fc 펩타이드 도메인 및 개과 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함하는 rIVIG 폴리펩타이드를 포함한다. 인간 치료에서처럼, 본 발명의 바람직한 실시형태는 분자내 상호작용을 허용하도록 가요성 링커에 의해 연결된 2개 이상의 Fc 부분 및 삼합체화 펩타이드 도메인을 포함한다. 개과 기원의 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함하는 rIVIG 폴리펩타이드는 개과 면역 장애를 나타내는 개의 치료에 유용할 수 있다.
재조합 면역글로불린 융합 단백질
P7005H는 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 영역, 및 인간 CD40L의 세포외 도메인(ECD)을 포함하는 인간 Fc 부분으로 이루어진 융합 단백질이다. 인간 Fc 부분은 이합체화하고, CD40L ECD는 삼합체화할 수 있다. 그러므로, 융합 단백질이 3개의 이합체 Fc 및 2개의 삼합체성 CD40L을 함유하는 육합체를 형성할 것으로 예상된다. 성숙 P7005H는 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 3개의 이합체 Fc 부분을 함유하고, 우수한 IVIG-모방 활성을 나타내는 것으로 예상된다. 그러나, 각각의 기능성 Fc 도메인이 별개의 펩타이드 사슬에 있으므로, 이합체 Fc의 형성이 균일하지 않다. 더구나, 발현된 펩타이드 사슬 사이의 이황화 연결은 상당히 변할 수 있고, 분자간 상호작용 및 분자내 상호작용이 발생할 수 있어서, 육합체보다 훨씬 긴 '지퍼화된' 올리고머를 발생시킨다. 따라서, P7005H에 의해 형성된 조성물은 바람직한 것보다 상당히 덜 균일하고, 적절히 더 폴딩하고 그러므로 활성이 아닌 응집된 단백질을 포함한다. 따라서, 단백질 조성물이 더 허용 가능한 P7005H를 함유하도록, 가장 활성인 것으로 예상된 육합체를 단리하기 위해 추가의 정제 단계가 필요하다. 균일한 조성물의 제조가 추가의 정제 단계를 요하므로, 이러한 정제의 필요는 P7005H가 상업적으로 덜 생존 가능하게 한다.
본 발명의 rIVIG 조성물의 균일성의 안건을 해결하기 위해, 본 발명자들은 일련의 단쇄 인간 Fc 융합 펩타이드를 개발하였다.
P8001Z는 2개의 탠덤 인간 CH2-CH3Fc 도메인(각각의 CH2-CH3 Fc 도메인은 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 영역을 포함함), 및 GXY 삼중 반복부 및 인간 콜라겐 21로부터 유래된 NC1 도메인을 포함하는 단쇄 인간 Fc를 포함하는 융합 단백질이다. 단쇄 Fc 펩타이드는 열역학적으로 양호한 분자내 상호작용을 허용하고 단쇄에서 기능성 Fc 펩타이드의 형성을 촉진하는 2개의 CH2-CH3 Fc 도메인 사이에 가요성 링커 (GGGGS)5를 포함한다. 이 분자내 상호작용은 분자내 이황화 연결의 형성을 최소화하고, 기능성 단쇄 Fc 펩타이드의 단일 종의 형성을 최대화하는 것으로 예상된다. GXY 삼중 반복부는 콜라겐의 삼합체화를 담당하고, 3개의 Fc 영역을 함께 있게 하는 것으로 예상되고, 이들의 각각에서 가요성 링커에 의해 연결된 2개의 탠덤 CH2-CH3 Fc 도메인은 상호작용할 수 있다. P8001Z의 생성물은 따라서 P7005H 작제물의 것보다 더 균일한 것으로 예상된다.
P8003Z는, 바람직하게는 (G4S)5 링커인 가요성 링커를 통해 제1 Fc 영역의 C 말단에 탠덤으로 연결된, 단쇄 인간 IgG 카파 또는 경쇄 불변 영역(CL), 전체 IgG 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 포함하는 제1 Fc 도메인과 제2 Fc 도메인(CH2 및 CH3 포함)을 포함하는 융합 단백질이다. 가요성 링커는 작제물이 제1 및 제2 Fc 도메인이 분자내 상호작용할 수 있는 입체배좌를 띠게 한다. 제2 Fc 도메인의 C 말단은 콜라겐 GXY 삼중 반복부 및 NC1 도메인(삼합체화 도메인)에 연결된다. P8001Z에 유사하게, 콜라겐 GXY 반복부 및 NC1 도메인은 3개의 단쇄 Fc 펩타이드를 함께 놓게 있는 내인성 삼합체화 활성을 나타내고, 각각은 제1 및 제2 CH2-CH3 Fc 도메인이 상호작용할 수 있는 입체배좌로 가요성 링커를 통해 제2 CH2-CH3 Fc 도메인에 연결된 제1 CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. CL 도메인이 CH1 도메인과 헤테로이합체화한다는 것이 또한 언급되어야 한다. CL/CH1 도메인은 보체 성분을 소거하는 데 있어서 역할을 하고, 이는 많은 자가면역 장애에 존재하는 보체 면역 반응을 추가로 낮출 수 있다.
P8020Z는, N 말단으로부터 C 말단 방향의 순서로, CL-CH1-CH2-CH3-가요성 링커-CH2-CH3을 함유하는, N 말단 부분 인간 만노스 결합 단백질(MBP) 및 P8003Z의 것과 유사한 단쇄 Fc 펩타이드로 이루어진 융합 단백질이다. 인간 MBP의 N 말단 부분은 내인성 삼합체화 역량을 갖고 융합 단백질의 올리고머화를 담당한다. P8003Z의 설계와 반대로, 네이티브 면역글로불린 분자에서 발견되는 것처럼 P8020Z의 올리고머화 도메인은 융합 단백질의 N 말단에 위치하고, Ig Fc 영역은 C 말단에 위치한다. 융합 단백질의 C 말단 끝에 위치한 단쇄 Fc 펩타이드를 갖는 P8020Z의 구조는 Fc 수용체와의 이의 상호작용을 위해 정기적인 항체의 배향을 면밀히 모방하는 것으로 예상된다.
상기 재조합 rIVIG 작제물은 제조되고, 293T 세포에서 발현되고, 제조된 단백질은 당해 분야에 공지된 정제 기법을 이용하여 정제될 수 있다.
rIVIG 단백질이 적절히 폴딩하여서 주로 육합체 Fc 구조를 포함하는지를 결정하기 위해, 정제된 단백질을 크기 배제 크로마토그래프(SEC) 프로파일링에 의해 분석하였다. 도 2는 각각의 단백질 생성물의 SEC 프로필을 보여준다.
이 rIVIG 단백질의 FcγR 결합 활성은 분석되고, 정제된 단량체 인간 IgG1 항체의 것과 비교되었다(도 3).
P8003Z 및 P8020Z 작제물은 마우스 콜라겐 유도된 관절염 모델을 이용하여 이의 치료학적 효과에 대해 또한 시험되었다.
마우스를 완전 프로인트 애쥬번트(CFA)에 의해 소 II형 콜라겐에 의해 프라이밍하고, 21일에 불완전 프로인트 애쥬번트(IFA)와 동일한 콜라겐에 의해 부스팅하였다. P8020Z를 18일에 복강내 투여하였다. 염증 있는 발을 26일로부터 점수 매겼다. 도 4는 P8020에 의해 치료된 마우스가 PBS에 의해 치료된 대조군 마우스보다 훨씬 약화된 염증을 보여준다는 것을 나타냈다.
하기 실시예가 다양한 실시형태로 본 발명의 실행을 예시하지만, 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 다른 실시형태는 명세서 및 실시예의 고려로부터 당해 분야의 숙련자에게 명확할 것이다.
실시예
실시예 1:
P7005H의 작제
P7005H 단백질은 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 촉진자의 제어 하에 395개의 아미노산의 단백질을 코딩하는 포유류 발현 플라스미드 pMEhFcN1-7005로부터 발현되었다. N 말단으로부터, 코딩된 생성물은 인간 IgG1 힌지, 인간 CD40L의 세포외 도메인에 연결된 CH2, 및 CH3 영역으로 이루어진다. 하기는 제조 시스템(서열 번호 1)으로부터 생성된 바와 같은 성숙 단백질 생성물(375개의 아미노산)의 코딩 서열이다.
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 2:
P8001Z의 작제
P8001Z 단백질은 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 촉진자의 제어 하에 539개의 아미노산의 단백질을 코딩하는 포유류 발현 플라스미드 pHCM-rIVIG V1로부터 발현되었다. N 말단으로부터, 코딩된 생성물은 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 제1 CH2-CH3 Fc 도메인; 이어서 G4S 링커 (GGGGS)5의 5회 반복을 포함하는 가요성 링커; 이어서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 제2 CH2-CH3 Fc 도메인; 이어서 GXY 삼중의 11개의 카피 및 인간 콜라겐 21 A1로부터의 NC1 도메인((GXY)11-NC1)으로 이루어진다. 하기는 제조 시스템(서열 번호 2)으로부터 생성된 바와 같은 성숙 단백질 생성물(519개의 아미노산)의 코딩 서열이다.
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 3:
P8002Z의 작제
P8002Z 단백질은 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 촉진자의 제어 하에 529개의 아미노산의 단백질을 코딩하는 포유류 발현 플라스미드 pHCM-rIVIG V2로부터 발현되었다. N 말단으로부터, 코딩된 생성물은 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 제1 CH2-CH3 Fc 도메인; 이어서 G4S 링커 (GGGGS)3의 3회 반복; 이어서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 영역으로 이루어진 제2 CH2-CH3 Fc 도메인; 이어서 GGGGS 링커; 이어서 GXY 삼중의 11개의 카피 및 인간 콜라겐 21 A1로부터의 NC1 도메인((GXY)11-NC1)으로 이루어진다. 하기는 제조 시스템(서열 번호 3)으로부터 생성된 바와 같은 성숙 단백질 생성물(509개의 아미노산)의 코딩 서열이다.
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예 4:
P8003Z의 작제
P8003Z 단백질은 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 촉진자의 제어 하에 788개의 아미노산의 단백질을 코딩하는 포유류 발현 플라스미드 pHCM-rIVIG V3으로부터 발현되었다. N 말단으로부터, 생성된 생성물은 인간 카파 경쇄 불변 영역(CL); 이어서 G4S 링커 (G4S)2의 2회 반복; 이어서 인간 IgG1 중쇄 불변 영역(CH1-힌지-CH2-CH3)을 포함하는 CH1-힌지-CH2-CH3 Fc 도메인; 이어서 G4S 링커 (GGGGS)5의 5회 반복을 포함하는 가요성 링커; 이어서 인간 IgG1 중쇄 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인; 이어서 GXY 삼중의 11개의 카피 및 인간 콜라겐 21 A1로부터의 NC1 도메인((GXY)11-NC1)으로 이루어진다. 하기는 제조 시스템(서열 번호 4)으로부터 생성된 바와 같은 성숙 단백질 생성물(768개의 아미노산)의 코딩 서열이다.
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 5:
P8004Z의 작제
P8004Z 단백질은 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 촉진자의 제어 하에 569개의 아미노산의 단백질을 코딩하는 포유류 발현 플라스미드 pHCM-rIVIG V4로부터 발현되었다. N 말단으로부터, 생성된 생성물은 인간 IgG1 중쇄 힌지를 포함하는 제1 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인, CH2 및 CH3 영역(힌지-CH2-CH3); 이어서 가요성 링커 (GGGGS)5; 이어서 인간 IgG1 중쇄 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 제2 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인; 이어서 GXY 삼중의 11개의 카피 및 인간 콜라겐 21 A1로부터의 NC1 도메인(GXY11-NC1)으로 이루어진다. 하기는 제조 시스템(서열 번호 5)으로부터 생성된 바와 같은 성숙 단백질 생성물(549개의 아미노산)의 코딩 서열이다.
Figure pct00010
Figure pct00011
실시예 6:
P8020Z의 작제
P8020Z 단백질은 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 촉진자의 제어 하에 816개의 아미노산의 단백질을 코딩하는 포유류 발현 플라스미드 pHCM-rIVIG V20으로부터 발현되었다. N 말단으로부터, 생성된 생성물은 인간 만노스 결합 단백질(hMBP) N 말단 펩타이드-hMBP 콜라겐 삼중 나선 도메인; 이어서 G4S 링커 (GGGGS)3의 3회 반복; 이어서 인간 카파 경쇄 불변 영역(CL); 이어서 G4S 링커 (G4S)2의 2회 반복; 이어서 인간 IgG1 중쇄 불변 영역(CH1-힌지-CH2-CH3)을 포함하는 제1 CH1-힌지-CH2-CH3 Fc 도메인; 이어서 GGGGS 링커 (GGGGS)5의 5회 반복을 포함하는 가요성 링커; 이어서 인간 IgG1 중쇄 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인으로 이루어진다. 하기는 제조 시스템으로부터 생성된 바와 같은 성숙 단백질 생성물(796개의 아미노산)의 코딩 서열이다:
Figure pct00012
Figure pct00013
실시예 7:
K8020Z의 작제
K8020Z 단백질은 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 촉진자의 제어 하에 822개의 아미노산의 단백질을 코딩하는 포유류 발현 플라스미드 pHCM-rIVIG V40으로부터 발현되었다. N 말단으로부터, 생성된 생성물은 개과 만노스 결합 단백질(MBP) N 말단 펩타이드-개과 MBP 콜라겐 삼중 나선 도메인; 이어서 G4S 링커 (GGGGS)3의 3회 반복; 이어서 개과 카파 경쇄 불변 영역 (CL); 이어서 G4S 링커 (GGGGS)2의 2회 반복; 이어서 IgG 하위종류 B 중쇄 불변 영역(CH1-힌지-CH2-CH3)을 포함하는 개과 CH1-힌지-CH2-CH3 Fc 도메인; 이어서 G4S (GGGGS)5의 5회 반복을 포함하는 가요성 링커; 이어서 개과 IgG 하위종류 B 중쇄 힌지, CH2, 및 CH3 영역을 포함하는 개과 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인으로 이루어진다. 하기는 제조 시스템(서열 번호 7)으로부터 생성된 바와 같은 성숙 단백질 생성물(802개의 아미노산)의 코딩 서열이다.
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 8:
K8003Z의 작제
K8003Z 단백질은 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 촉진자의 제어 하에 779개의 아미노산의 단백질을 코딩하는 포유류 발현 플라스미드 pHCM-rIVIG V42로부터 발현되었다. N 말단으로부터, 코딩된 생성물은 개과 카파 경쇄 불변 영역(CL); 이어서 G4S 링커 (GGGGS)2의 2회 반복; 이어서 IgG 하위종류 B 중쇄 불변 영역(CH1-힌지-CH2-CH3)을 포함하는 개과 CH1-힌지-CH2-CH3 Fc 도메인; 이어서 G4S (GGGGS)5의 5회 반복을 포함하는 가요성 링커; 이어서 개과 IgG 하위종류 B 중쇄 힌지, CH2, 및 CH3 영역을 포함하는 개과 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인; 이어서 GXY 삼중의 11개의 카피 및 개과 콜라겐 21 A1로부터의 NC1 도메인((GXY)11-NC1)으로 이루어진다. 하기는 제조 시스템 (서열 번호 8)으로부터 생성된 바와 같은 성숙 단백질 생성물(779개의 아미노산)의 서열이다.
Figure pct00016
Figure pct00017
참고문헌
Figure pct00018
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> AB Biosciences, Inc. <120> Recombinant Intravenous Immunoglobulin (rIVIG) Compositions and Methods for Their Production and Use <130> WO2017/172853 <140> PCT/US2017/024650 <141> 2017-03-29 <150> US 62/315,483 <151> 2016-03-30 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 1 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 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695 700 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr 705 710 715 720 Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln 725 730 735 Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro 740 745 750 Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val 755 760 765 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met 770 775 780 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser 785 790 795 800 Pro Gly <210> 8 <211> 779 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 8 Arg Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp 1 5 10 15 Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln 35 40 45 Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser 65 70 75 80 His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr 85 90 95 Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val Asp Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala 130 135 140 Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly 210 215 220 Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu 260 265 270 Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys 275 280 285 Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser 325 330 335 Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro 340 345 350 Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp 370 375 380 Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile 420 425 430 Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro 465 470 475 480 Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys 485 490 495 Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 500 505 510 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 515 520 525 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 530 535 540 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 545 550 555 560 Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 565 570 575 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn 580 585 590 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 595 600 605 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 610 615 620 Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 625 630 635 640 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 645 650 655 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 660 665 670 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 675 680 685 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 690 695 700 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser 705 710 715 720 Gly Pro Pro Gly Ile Ser Lys Glu Gly Pro Pro Gly Asp Pro Gly Leu 725 730 735 Pro Gly Lys Asp Gly Asp His Gly Lys Pro Gly Ile Gln Gly Gln Pro 740 745 750 Gly Pro Pro Gly Ile Cys Asp Pro Ser Leu Cys Phe Ser Val Ile Val 755 760 765 Gly Arg Asp Pro Phe Arg Lys Gly Pro Asn Tyr 770 775 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 9 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized in La <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25

Claims (36)

  1. (a) 2개의 CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하는 단쇄 Fc 펩타이드; 및 (b) 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함하는, 재조합 정맥내 면역글로불린(recombinant intravenous immunoglobulin: rIVIG) 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고머화 펩타이드 도메인은 삼합체화 도메인인, rIVIG 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 2개의 CH2-CH3 Fc 도메인은 가요성 링커를 통해 연결된, rIVIG 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 가요성 링커는 아미노산 서열 G-G-G-G-S(서열 번호 8)의 2개 내지 6개의 반복을 포함하는, rIVIG 폴리펩타이드.
  5. 제3항에 있어서, 상기 가요성 링커는 아미노산 서열 G-G-G-G-S(서열 번호 8)의 5개의 반복을 포함하는, rIVIG 폴리펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 삼합체화 도메인의 C 말단은 단쇄 Fc 펩타이드의 N 말단에 연결된, rIVIG 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 올리고머화 펩타이드 도메인은 서열 번호 6의 1번 내지 79번 아미노산을 포함하는, rIVIG 폴리펩타이드.
  8. 제5항에 있어서, 상기 삼합체화 도메인의 N 말단은 상기 단쇄 Fc 펩타이드의 C 말단에 연결된, rIVIG 폴리펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 올리고머화 펩타이드 도메인은 서열 번호 4의 712번 내지 768번 아미노산을 포함하는, rIVIG 폴리펩타이드.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항의 rIVIG 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 분자.
  11. 제10항의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  12. 제11항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포주는 알파-1,6 퓨코실전환효소 유전자가 결핍된(FUT8-/-), 재조합 세포.
  14. 재조합 면역글로불린(rIVIG) 단백질을 포함하는 면역 장애의 치료를 위한 조성물로서, 상기 rIVIG 단백질은 주로 삼합체성 단쇄 Fc 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공하는 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함하는, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 올리고머화 펩타이드 도메인은 서열 번호 6의 1번 내지 79번 아미노산을 포함하는, 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 올리고머화 펩타이드 도메인은 서열 번호 4의 712번 내지 768번 아미노산을 포함하는, 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 주로 호모-삼합체성 Fc 이합체를 포함하는, 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 상기 rIVIG 단백질은 서열 번호 6의 아미노산 조성을 갖는, 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 상기 rIVIG 단백질은 서열 번호 4의 아미노산 조성을 갖는, 조성물.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rIVIG 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 아이소유형의 Fc 영역을 포함하는, 조성물.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rIVIG 단백질은 주로 비퓨코실된, 조성물.
  22. 자가면역 장애를 겪는 환자를 치료하는 방법으로서, 재조합 정맥내 면역글로불린(rIVIG) 단백질을 포함하는 조성물의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 rIVIG 단백질은 주로 삼합체성 단쇄 Fc 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함하는, 자가면역 장애를 겪는 환자를 치료하는 방법.
  23. 장기 이식을 받은 환자의 면역 거부 반응을 감소시키는 방법으로서, 재조합 정맥내 면역글로불린(rIVIG) 단백질을 포함하는 조성물의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 rIVIG 단백질은 주로 삼합체성 단쇄 Fc 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함하는, 장기 이식을 받은 환자의 면역 거부 반응을 감소시키는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 환자는 불응성 면역 혈소판감소증을 겪는, 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rIVIG 단백질은 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  26. 제6항에 있어서, 상기 올리고머화 펩타이드 도메인은 서열 번호 7의 1번 내지 72번 아미노산 또는 서열 번호 8의 721번 내지 779번 아미노산을 포함하는, rIVIG 폴리펩타이드.
  27. 제26항의 rIVIG 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 분자.
  28. 제27항의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  29. 제28항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 상기 세포주는 알파-1,6 퓨코실전환효소 유전자가 결핍된(FUT8-/-), 재조합 세포.
  31. 제13항에 있어서, 상기 올리고머화 펩타이드 도메인은 서열 번호 7의 1번 내지 72번 아미노산 또는 서열 번호 8의 721번 내지 779번 아미노산을 포함하는, 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 rIVIG 단백질은 IgG A, IgG B, IgG C 및 IgG D로 이루어진 군으로부터 선택된 아이소유형의 Fc 영역을 포함하는, 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 rIVIG 단백질은 주로 비퓨코실화된, 조성물.
  34. 자가면역 장애를 겪는 비인간 포유류를 치료하는 방법으로서, 재조합 정맥내 면역글로불린(rIVIG) 단백질을 포함하는 조성물의 유효량을 상기 비인간 포유류에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 rIVIG 단백질은 주로 삼합체성 단쇄 Fc 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함하고, 상기 rIVIG 단백질은 동일한 종의 비인간 포유류로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는, 자가면역 장애를 겪는 비인간 포유류를 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 비인간 포유류는 개이고, rIVIG 단백질은 서열 번호 7 및 서열 번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 비인간 포유류는 개이고, 올리고머화 펩타이드 도메인은 서열 번호 7의 1번 내지 72번 아미노산 또는 서열 번호 8의 721번 내지 779번 아미노산을 포함하는, 조성물.
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