JP7075100B2 - 組換え静注用免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）組成物ならびにその製造及び使用方法 - Google Patents

Description

関連出願の記載
本出願は２０１６年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／３１５，４８３号の一部継続出願であり、これに対する優先権を主張し、その全体を本明細書に組み込む。

本発明は、現在使用されているヒトＩＶＩＧ（静注用免疫グロブリンの頭字語）製剤の代替品として使用可能である、組換えタンパク質の組成物及び製造方法に関する。本発明はさらに免疫性及びその他の障害ならびに疾患の治療のための、かかる組成物の使用方法に関する。

治療薬としての免疫グロブリンの臨床応用は、１００年以上前にＥｍｉｌ Ｂｅｈｒｉｎｇと同僚が毒素による疾患を免疫血清により寛解できることを発見した時に遡る（１）。Ｏｇｄｅｎ Ｂｒｕｔｏｎが無ガンマグロブリン血症患者の免疫グロブリン置換のために、ヒト免疫グロブリンを静脈内に注入するまでに、６２年が経過した（２）。それまでは、限られた量の免疫グロブリンしか筋肉内投与できず、製剤は精製された免疫グロブリンの凝集物を含有していたため、その投与によって補体カスケードを介した免疫応答活性化ゆえの痛みを伴った局部刺激や有害な全身反応が引き起こされた（３、４）。

１９６０年代及び１９７０年代において、新しい精製プロセスの開発により、凝集物の除去が可能になり、より高用量での静脈内投与に適した組成物を調製することが可能となった（３～７）。頭字語「ＩＶＩＧ」は、かかる製剤が皮下投与など他の様式で投与することもできるとしても、かかる製剤に一般的に使用され続ける用語である。ＩＶＩＧ製剤に対する主な適応症は、免疫不全を伴う患者の主要な代用療法のままであった（８～１０）。

１９８１年において、過剰な免疫抑制治療による二次的な免疫不全を伴い、難治性免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）にも罹患している子供の治療中に、Ｐａｕｌ Ｉｍｂａｃｈは患者の血小板数が、ＩＶＩＧで治療した後に予想外なことに増加していることを発見した（１１）。血小板数を増加させるためのＩＶＩＧ治療の効果は、免疫不全を伴わないＩＴＰ患者で再現され、その免疫調節効果ゆえにＩＶＩＧを使用する道が開けた（１２～１５）。

現在では、ＩＶＩＧは多くの異なる疾患に対する治療選択肢であり、多くの自己免疫疾患に対する免疫調節剤としての第１選択薬として推奨されている。実際に、免疫不全症候群の代替免疫グロブリンとしてのＩＶＩＧの使用は重要な適応症のままであるが、ＩＶＩＧはますます自己免疫疾患の治療に使用されるようになってきている。

ＩＶＩＧ製剤は臨床治療において有効であるが、その持続可能性に劇的な影響を及ぼし得る、現行の治療に関連した多くの問題が存在する。第一に副作用は、ＩＶＩＧ投与後によく観察され、アナフィラキシー、腎臓病、血栓性合併症、糖尿病が含まれる。これらの問題に取り組むための活動には、ＩｇＡ欠損症についての患者の事前スクリーニング、ならびにＩｇＡ、第ＸＩ因子、グルコース及びナトリウムの濃度の詳細なモニタリングが挙げられる。しかしながら、これらのステップのそれぞれは、供給能を制限する効果や、商品のコストに加えて投与のコストを増大させる効果を有し得る。さらに、これらの活動にもかかわらず、ＩＶＩＧの使用により、完全に改善されていない副作用によって不利益を被り続けている。

さらに、ほとんどの生物製剤とは対照的に、ＩＶＩＧは通常、非常に高用量で、一般にｋｇ体重あたり約０．５ｇ～４ｇの範囲で投与される。有効性に必要とされる用量から判断すると、ＩＶＩＧの治療効果のある化合物（複数可）は、製剤のごく一部しか占めていないようである。製品のコストが高騰し、ＩＶＩＧ製剤の品質を改善する必要性から生じる重大な課題には、これらの問題の１つまたは複数に対処する、改良された代替組成物及び／または方法に対する著しいニーズが存在する。
ＩＶＩＧ治療が呈する問題は、ＩＶＩＧの作用機序が明確に決定されていないという事実に由来し、その影響は適応症ごとに異なる。

Ｂｅｈｒｉｎｇ ａｎｄ Ｋｉｔａｓａｔｏ （１８９０）ｕｂｅｒ ｄａｓ Ｚｕｓｔａｎｄｅｋｏｍｍｅｎ ｄｅｒ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉｅ－Ｉｍｍｕｎｉｄａｔ ｕｎｄ ｄｅｒ Ｔｅｔａｎｕｓ－Ｉｍｍｕｎｉｔａｔ ｂｅｉ Ｔｈｉｅｒｅｎ．Ｄｔｓｃｈ ｍｅｄ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ １６：１１１３－１１１４ Ｂｒｕｔｏｎ（１９５２）Ａｇａｑｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ９：７２２－７２８． Ｂａｒａｎｄｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９６２）Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇａｍｍａ－ｇｌｏｂｕｌｉｎ．Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．７：１５７－１７４． Ｓｃｈｕｌｔｚｅ ａｎｄ Ｓｃｈｗｉｃｋ（１９６２）Ｏｎ ｎｅｗ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｇａｍｍａ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｄｔｓｃｈ Ｍｅｄ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．８７：１６４３－１６４４ Ｋｏｒｎｈｕｂｅｒ（１９７１）Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｓｅ ｇ－Ｇｌｏｂｕｌｉｎ－Ｔｈｅｒａｐｉｅ．Ｅｒｆａｈｒｕｎｇｅｎ ｍｉｔ ｅｉｎｅｒ ｎｅｕａｒｔｉｇｅｎ Ｐｒａｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍｓｃｈｒ Ｋｉｎｄｅｒｈｅｉｌｋ １１９：５２８－５３０． Ｍｏｒｅｌｌ ａｎｄ Ｓｋｖａｒｉｌ（１９８０）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ａｎｄ ｇａｍｍａ－ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．ＩＩ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｇａｍｍａ－ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｈｗｅｉｚ Ｍｅｄ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１１０（３）：８０－８５． Ｓｔｅｐｈａｎ（１９７５）Ｕｎｄｅｇｒａｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｕｓｅ．Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．２８：４２２－４３７． Ｈａｎｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｄｔｓｃｈ Ｍｅｄ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１０５：１６７５－１６８０． Ｌｕｔｈａｒｄｔ（１９８０）Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｄｔｓｃｈ Ｍｅｄ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１０５：９９３－９９７． Ｎｏｌｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：２３７－２４３． Ｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｉｇｈ－ｄｏｓｅ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｒ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ．Ｌａｎｃｅｔ ３１７：１２２８－１２３１． Ｎｏｓｅｗｏｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＩＶ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｗｅａｋｎｅｓｓ ｉｎ ＭＳ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．５５：１１３５－１１４３． Ｆｅｈｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ ｉｎ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｇａｍｍａ ｇｌｏｂｕｌｉｎ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３０６：１２５４－１２５８． Ｎｅｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ＩｇＧ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．Ｌａｎｃｅｔ．１：８４－８７． Ｂｕｓｓｅｌ ａｎｄ Ｈｉｌｇａｒｔｎｅｒ（１９８４）Ｔｈｅ ｕｓｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．５６：１－７．

発明の概要
上述したように、副作用を排除または低減し、より一貫した品質で製造することができ、有効性を維持しながらより低い投薬量を可能にし、及び／または商品のコストを低減することができる代替物（複数可）を含めた、ＩＶＩＧの使用による改善された治療に対する著しいニーズが存在する。本発明者らは、免疫グロブリンの組換え操作により、一定の品質で製造することができ、より明確な分子の製造が可能になり、有効性を維持したままより低い投薬量が可能となり、そして製品のコストを低減することが可能となると仮定した。

ＩＶＩＧの作用機序は完全には明らかではないが、本発明者らは、少なくともいくつかの適応症が、それらの適応症においてＩＶＩＧ治療の有効性に必要とされる抗体構造要素と、相関させることが可能であると仮定した。例えば、免疫不全の治療において、ＩＶＩＧは血清Ｉｇのレベルを補い、感染性因子及び／またはその毒素から生命を守る保護作用をもたらす。したがって、プールされた免疫グロブリンの可変領域内に含まれる抗原特異性の多様性が、これらの適応症の治療有効性の要因であると考えられる。対照的に、研究では、免疫グロブリンＦｃ領域が急性及び慢性自己免疫疾患の治療において、ＩＶＩＧの免疫調節効果の要因であるという概念を支持する。

インタクトなＩＶＩＧ及びそのＦｃフラグメントは、ＩＴＰの治療及び動物モデルにおいて同等の抗炎症活性を有することが観察された（１６）。これは、抗炎症機能におけるＦｃ領域の役割を支持する。さらに、ＩＶＩＧの免疫調節効果はＦｃ受容体を介して媒介され、樹状細胞（ＤＣ）－マクロファージのクロストークに依存し、マウスＩＴＰモデルにおいてＦｃγＲＩＩＩａは活性化段階に対して、そしてＦｃγＲＩＩｂはエフェクター相に対して重要であることが観察された（１７）。最後に、マウスＩＴＰモデルでは、高含量のＩｇ二量体を含有するＩＶＩＧでの治療が、正常な単量体免疫グロブリンでの治療よりもはるかに効果的に血小板枯渇を反転することが観察された（１８）。したがって、本発明者らは、通常、Ｆｃ領域に対して低い親和性結合を有する樹状ＤＣ表面ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂは、オリゴマーＦｃにより提供されるアビディティ（複数の相互作用）結合を通じてＩＶＩＧ製剤に存在する少量のオリゴマー抗体と生産的に相互作用することができ、さらにＩＶＩＧ製剤の免疫調節効果を改善するために利用することができると理論づけた。

本発明は、上記の懸念に完全または部分的に対処する方法及び材料を提供する。したがって、その広範な態様において、本発明は（ａ）２つ以上のＦｃペプチドドメインを含む一本鎖Ｆｃペプチド及び（ｂ）オリゴマー化ペプチドドメインを含有する組換え静注用免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）ポリペプチドを含む。本発明の特定の態様において、オリゴマー化ペプチドドメインは三量体化ペプチドドメインである。特定の実施形態において、本発明のｒＩＶＩＧポリペプチド（パン受容体相互作用分子（Ｐａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、または「ＰＲＩＭ」とも称される）は、（ａ）２つのＦｃペプチドドメイン及び（ｂ）オリゴマー化ペプチドドメイン、特に、三量体化ペプチドドメインを含む一本鎖Ｆｃペプチドを含む。本発明のｒＩＶＩＧポリペプチド中の個々のＦｃペプチドドメインは、フレキシブルリンカーを介して連結され得る。本発明の特定の実施形態において、フレキシブルリンカーはアミノ酸配列Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号９）の５回反復配列、すなわちＧ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号１０）を含む。本発明のその他の特定の実施形態において、オリゴマー化ペプチドドメインは、配列番号４のアミノ酸番号７１２～７６８を、または配列番号６のアミノ酸番号１～７９を含む。ある特定の実施形態において、本発明のｒＩＶＩＧポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。

その他の実施形態において、本発明は（ａ）２つ以上のＦｃペプチドドメインを含む一本鎖Ｆｃペプチド及び（ｂ）オリゴマー化ペプチドドメインを含有する組換え静注用免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む。本発明の特定の態様において、ヌクレオチド分子は三量体化ペプチドドメインをコードする。特定の実施形態において、本発明のヌクレオチド分子は、（ａ）２つのＦｃペプチドドメイン及び（ｂ）三量体化ドメインを含有するｒＩＶＩＧポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、本発明はｒＩＶＩＧポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を含み、そのｒＩＶＩＧポリペプチドは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。

別の態様において、本発明は免疫不全の治療のための組成物を提供し、上記組成物は組換え免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含有しており、ここで上記ｒＩＶＩＧタンパク質は、３つの一本鎖Ｆｃドメイン（ｓｃＦｃ）を集めるための足場を提供するオリゴマー化ペプチドドメインを含む。特定の実施形態において、オリゴマー化ペプチドドメインは配列番号６のアミノ酸１～７９及び配列番号４のアミノ酸７１２～７６８を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の特定の態様において、組成物は３つの一本鎖Ｆｃペプチドを含有する、主に単一のタンパク質種を含む。上記の一本鎖Ｆｃペプチドの個々のＦｃドメインは、機能的な一本鎖Ｆｃペプチドを形成するために分子間で相互作用し得る。特定の実施形態において、本発明はｒＩＶＩＧタンパク質を主に含有する組成物を提供し、そのｒＩＶＩＧタンパク質は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。

別の態様において、本発明は自己免疫疾患に罹患している患者を治療する方法を提供し、上記方法は、主に組換え免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含有する有効量の組成物を上記患者に投与することを含み、ここで上記ｒＩＶＩＧタンパク質は一本鎖Ｆｃペプチドの三量体の形成のための足場を提供するオリゴマー化ペプチドドメインを含む。特定の実施形態において、患者は、難治性免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたは狼瘡）、グレーブス病、川崎病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血（ＩＭＨＡ）、悪性貧血、溶血性貧血、無形成貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、アジソン病、橋本病（慢性甲状腺炎）、橋本脳症、自己免疫性好中球減少症、血小板減少症、リウマチ性関節炎及び反応性関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、シェーグレン症候群、ＣＲＥＳＴ症候群、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、強直性脊椎炎、ベーチェット病、血管炎、ライム病（慢性または末期）ならびにＩ型糖尿病から選択される免疫不全に罹患している。

別の態様において、本発明は臓器移植、骨髄移植、輸血、または幹細胞移植を受けた患者の免疫拒絶反応を低減する方法を提供し、上記方法は、上記患者に組換え免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含有する組成物の有効量を投与することを含み、ここで上記ｒＩＶＩＧタンパク質は、主に一本鎖Ｆｃペプチドの三量体を含む組成物を提供するオリゴマー化ペプチドドメインを含む。

別の態様では、本発明は、自己免疫疾患に罹患しているヒト以外の哺乳動物を治療する方法を提供し、その方法は、上記ヒト以外の哺乳動物に、組換え静注用免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含む有効量の組成物を投与することを含み、ここで上記ｒＩＶＩＧタンパク質は、主に一本鎖Ｆｃペプチドの三量体を含む組成物を提供するオリゴマー化ペプチドドメインを含み、そして上記ｒＩＶＩＧタンパク質は、同じ種のヒト以外の哺乳動物に由来するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒト以外の哺乳動物は、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）または関節リウマチから成る群から選択される自己免疫疾患に罹患している。例えば、ＡＩＨＡに罹患しているイヌは、配列番号７及び配列番号８のアミノ酸配列などのイヌ由来のアミノ酸配列を含有する、主に三量体ｒＩＶＩＧタンパク質を含有する組成物で治療され得る。

本発明のある特定の実施形態の構築物の組成を示す。Ｐ７００５Ｈは、ＣＤ４０リガンドの細胞外ドメインの内因性の三量体化能を用いて、オリゴマー機能性Ｆｃドメインを生成するための設計の原型である。最小の機能性オリゴマーは、Ｎ末端で３つの二量体Ｆｃドメイン及びＣ末端で２つの三量体化ＣＤ４０Ｌ ＥＣＤに組み立てられる、６つのポリペプチド鎖から成る。Ｐ７００５Ｈの複雑なＳＥＣプロファイル（図２）を踏まえて、機能的ＦｃドメインがｓｃＦｃ形態を用いて生成され、ＣＤ４０Ｌ ＥＣＤがコラーゲン三量体化ドメインによって置換されたＰ８００１Ｚが作製された。ＳＥＣプロファイル（図２）はＰ７００５Ｈのものよりも優れているが、Ｐ８００１Ｚは依然として相当量の高次オリゴマーを含んでいる。同様の構築物の、さらにヒトＩｇＧ１重鎖ヒンジ領域（Ｈ）を有するＰ８００４Ｚもまた、理想的でないＳＥＣプロファイルを示したので、ヒンジ領域のみを含むことは折り畳みの問題を解決しないようである。興味深いことに、さらなる定常領域（ＣＬ及びＣＨ_１）が導入された場合、Ｐ８００３Ｚ及びＰ８０２０Ｚタンパク質は、はるかにより効率的に折り畳まれ、主に適切に折り畳まれた三量体を示した。（図２）。（図２）。Ｐ８０２０Ｚ構築物は、融合タンパク質のＣ末端にオリゴマーＦｃを配置することを可能にする、三量体形成の足場を使用した。Ｃ末端のＦｃ形態は、Ｆｃ受容体と相互作用するための通常の抗体の配向を細かに模倣することが期待される。重要なことに、Ｐ７００５Ｈ、Ｐ８００１Ｚ、Ｐ８００２ＺまたはＰ８００４Ｚとは異なり、三量体種の均質な組成物は、幸運にもＰ８００３Ｚ及びＰ８０２０Ｚの発現から得られた（図５を参照）。 サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルモデルにおける、本発明の組成物の効果を示す。本発明のｒＩＶＩＧ分子は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）に緩衝液交換した。各ＳＥＣ分析は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０ ＳＥＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて約１００ｕｌのｒＩＶＩＧ試料を０．５ｍｌ／分の速度で注入することによって行った。矢印は、適切に折り畳まれた三量体分子が溶出したことを示す。図２は、Ｐ７００５Ｈ、Ｐ８００１Ｚ、Ｐ８００２Ｚ及びＰ８００４Ｚの約１／３未満が適切に折り畳まれた三量体型であることが判明したことを示している。対照的に、Ｐ８００３Ｚ及びＰ８０２０Ｚの少なくとも２／３超は、三量体として適切に折り畳まれている。これらの結果は、ＣＬ及びＣＨ１ドメインの導入により三量体形態の折り畳みが非常に促進されることを示す。 ＦｃγＲ結合モデルにおける本発明の組成物の効果を示す。ＧＳＴと融合した個々のヒトＦｃ受容体をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。塞がっていない領域をブロックした後、ヒトＩｇＧ１、Ｐ８００３Ｚ１、Ｐ８００３Ｚ３（α－１，６フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８^－／－）を欠損した細胞株から産生されたＰ８００３Ｚの非フコシル変異体）またはＰ８０２０Ｚ１を、段階希釈濃度でプレートに添加した。結合したヒトＩｇＧ１及びｒＩＶＩＧ変異体は、ヤギ抗ヒト抗体を蛍光標識したＦ（ａｂ）’_２フラグメントで定量した。図３の上部パネルは、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）に対するヒトＩｇＧ１とｒＩＶＩＧの親和力の測定値の例を示す。曲線のあてはめ（ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ５．１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により、組換え可溶性Ｆｃ受容体に対するｒＩＶＩＧのＫＤの評価が可能になる。下表は、これらの計算されたＫＤを示す。本発明の三量体ｒＩＶＩＧはヒトＦｃγＲＩを除いて、ヒトＩｇＧ１と比較して結合親和性の有意な増加を示すことが明らかである。ヒトＦｃγＲＩに対してヒトＩｇＧ１は既に１ｎＭ未満の親和性を示しており、ｒＩＶＩＧはわずかに高い親和性しか示さない。これらの結果より、アビディティの優位性のある本発明の三量体ｒＩＶＩＧは、非常により高い見かけの親和性でＦｃ受容体に結合可能である。 本発明の組成物の、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける治療効果を示す。マウスを１日目にウシＩＩ型コラーゲン／ＣＦＡで初回免疫し、１８日目にＰ８０２０Ｚ（５０ｍｇ／ｋｇ体重）で処置し、そして２１日目に同一のコラーゲン／ＩＦＡで追加免疫した。１～４の臨床スコアでは、４が最も重篤であり、それぞれの足を一日おきに評価した。臨床スコアは各群で加算し、そしてマウスの数で正規化した。通常約２～３ｇ／ｋｇ体重で使用され、試験期間にわたって複数回投与される従来のヒトＩＶＩＧ調製物と比較すると、Ｐ８０２０Ｚ１は５０ｍｇ／ｋｇの用量で１回投与され、投与量において４０～６０倍の減少を示した。 抗コラーゲン抗体の受身伝達により誘導される自己免疫疾患における本発明の組成物の、治療効果を示す。マウスは、指示された投与量にて、抗コラーゲン抗体で、３日後にリポ多糖で、そして６日目に血漿由来のＩＶＩＧ（ｐｄ．ＩＶＩＧ）または組換えＩＶＩＧ（ｒＩＶＩＧもしくはＰＲＩＭ）分子（ＰＭ ０２、非フコシルＰ８００３Ｚ３とも名付けられる）の単回注射で処置した。ｐｄ．ＩＶＩＧ １Ｋの投与量は、ｋｇ体重あたり１ｇｍ、ｐｄ．ＩＶＩＧ ２Ｋの投与量はｋｇ体重あたり２ｇｍである。ＰＭ０２ １５はｋｇ体重あたり１５ｍｇ、ＰＭ ０２ ５０はｋｇ体重あたり５０ｍｇ、及びＰＭ０２ １５０はｋｇ体重あたり１５０ｍｇである。ｐｄ．ＩＶＩＧ １Ｋ及びｐｄ．ＩＶＩＧ ２Ｋはどちらも９日目と１３日目の間でわずかに効果的である。ＰＭ ０２ １５は、両方の濃度のｐｄ．ＩＶＩＧと同等の治療効果を示す。ＰＭ ０２ ５０及びＰＭ０２ １５０はどちらのｐｄ．ＩＶＩＧ投与よりも非常に優れた有効性を示す。したがって、ＰＭ ０２は、抗コラーゲン抗体の受身伝達によって誘導される自己免疫疾患の治療が可能であることが示される。 Ｐ８００３Ｚ１及びＰ８０２０Ｚ１のサイズ排除クロマトグラフィーのプロファイルを示す。ピークは本発明の三量体ｒＩＶＩＧタンパク質を示し、本発明のｒＩＶＩＧペプチドが均質な形態で作成され得ることを示す。

以下の説明では、説明を目的として、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細を記述する。しかしながら、本発明はこれらの具体的な詳細なしに実施することができ、本発明のより広い範囲から逸脱することなく、それに加えて様々な改変及び変更を行うことができることは、当業者には明らかであろう。

本明細書で引用された全ての刊行物は、引用されている教示について、参照により本開示に具体的に組み込まれる。

本明細書で使用する場合、用語「対象」は哺乳動物及び哺乳動物以外を指す。哺乳動物にはヒト、チンパンジー及びその他の類人猿及びサル種などのヒト以外の霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、及びブタなどの家畜、ウサギ、イヌ、及びネコなどの愛玩動物、ラット、マウス及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物、等が挙げられるが、これらに限定されない哺乳網の任意のメンバーを指す。哺乳動物以外の例としては、鳥類、魚類などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明は、組換え静注用免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質、かかるｒＩＶＩＧを含む組成物、ならびに種々の免疫の障害及び病態の治療のためのｒＩＶＩＧの組成物の製造、精製及び使用のための方法に関する。

本発明において、組換え免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）の設計は、オリゴマー化ｒＩＶＩＧ分子の形成を促進するドメインと共に、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの複数のコピーを含む核酸分子及びタンパク質分子の操作に焦点を置いている。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、本発明のｒＩＶＩＧ分子は、高親和性ＦｃγＲＩだけでなく低親和性Ｆｃ受容体、すなわちＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩ受容体にも結合することができると期待される。低親和性受容体の増強された結合は、オリゴマーＦｃと細胞表面上に存在するＦｃ受容体とのアビディティ相互作用に起因する可能性が最も高い。

生化学的に、本発明は、適切に折り畳まれ、治療用製品としての使用に望ましい特性を示す融合タンパク質を生成するために、Ｆｃドメインとオリゴマー化タンパク質の足場を一緒にするように設計された方法及び材料を提供する。治療的に、本発明のｒＩＶＩＧタンパク質は、多数の免疫学的病態の治療に、そして多数の自己免疫疾患の免疫調節剤として有用である。さらに、様々な補体タンパク質が多くの自己免疫疾患に関与することを考慮すると、本発明は追加の構造要素、例えば補体活性化カスケードに沿って成分を除去することができる要素を任意に含んでもよい。

本発明者らは、Ｆｃ構築物の変異体をオリゴマー化するため、様々なタンパク質の足場を用いて多数のｒＩＶＩＧ分子を設計し、発現させた。ある特定の好ましい実施形態では、本発明のｒＩＶＩＧ分子は、３つの一本鎖Ｆｃペプチドまたは３つのＦｃ二量体を優先的に一緒にして３つの機能的Ｆｃドメインを形成する、オリゴマー足場ドメインを含む。

本発明の方法及び材料は、自己免疫疾患、または免疫調節が望まれる任意の障害、疾患もしくは症候群を含むが、これらに限定されない免疫疾患の治療に有用である。本発明が使用され得る適応症には、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたは狼瘡）、グレーブス病、川崎病、アジソン病、セリアック病・スプルー、皮膚筋炎、重症筋無力症、皮膚炎、橋本病（慢性甲状腺炎）、橋本脳症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血（ＩＭＨＡ）、悪性貧血、溶血性貧血、無形成貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、自己免疫性好中球減少症、リウマチ性関節炎及び反応性関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、シェーグレン症候群、ＣＲＥＳＴ症候群、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、強直性脊椎炎、ベーチェット病、血管炎、ライム病（慢性または末期）ならびにＩ型糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の方法及び材料は、自己抗体により引き起こされる障害、ならびに心筋炎、心筋梗塞後症候群腎炎、グッドパスチャー症候群、間質性膀胱炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変及び原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、抗シンセターゼ症候群、円形脱毛症、自己免疫性血管浮腫、皮膚炎、乾癬、全身性強皮症、リンパ増殖性症候群、抗リン脂質症候群、自己免疫性網膜症、ブドウ膜炎及びメニエール病を含む臓器特異的自己免疫疾患の治療にも有用である。

本発明の方法及び材料はまた、臓器移植、骨髄移植、輸血、または幹細胞移植を含む処置に対する免疫反応または抗体媒介性反応の予防、軽減及び／または治療に有用である。

本発明の方法及び材料はまた、任意の市販の静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）が使用される任意の自己免疫適応症にも使用することができる。市販のＩＶＩＧには、Ｃａｒｉｍｕｎｅ（登録商標）、Ｆｌｅｂｏｇａｍｍａ（登録商標）、Ｇａｍｍａｇａｒｄ（登録商標）、Ｇａｍｍａｋｅｄ（商標）、Ｇａｍｍａｐｌｅｘ、Ｇａｍｕｎｅｘ（登録商標）－Ｃ、Ｏｃｔａｇａｍ（登録商標）及びＰｒｉｖｉｇｅｎ（登録商標）がある。承認された市販ＩＶＩＧの特定の用途及び自己免疫の適応症には、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、多病巣運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、ＩＴＰにおける出血の制御、小児患者における川崎病に伴う冠動脈瘤の予防が挙げられる。

本発明は、３つの機能的ｓｃＦｃドメインを含む均質な種として発現及び精製され得る組換えＩＶＩＧ（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含む。この三量体Ｆｃオリゴマーは、アビディティ（複数価）相互作用により、高親和性Ｆｃ受容体及び低親和性Ｆｃ受容体の両方に結合することができる。様々なＦｃ受容体に対するこれらの増強された親和性は、ヒトＩＶＩＧの免疫調節効果に起因する、ヒトＩＶＩＧ製剤中に存在する少量のオリゴマー化抗体を連想させる。Ｆｃ受容体との増強した相互作用を模倣するので、本発明のｒＩＶＩＧは、従来のＩＶＩＧを受動的な免疫保護用途ではなく、免疫調節用途に置き換えることが期待される。

免疫グロブリン
Ｆｃフラグメント
本発明は、ＩｇＧ（ＣＨ２－ＣＨ３）、好ましくはＩｇＧ１のヒト重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び定常領域３（ＣＨ３）を含む、ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを利用する。ＣＨ２－ＣＨ３ドメインなどの２つ以上のＦｃフラグメントが使用される場合、それらは一般に（ＧＧＧＧＳ）_５（＝ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０））などのフレキシブルペプチドリンカーを用いてＣＨ２－ＣＨ３ドメインが連結された一本鎖Ｆｃペプチドの形で合成または発現され、一本鎖Ｆｃペプチドの個々のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン間の分子内相互作用を促進し、一本鎖Ｆｃペプチドが三次元立体構造をとり、生物学的機能を最適化することを可能にする。ヒトＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１に由来するヒンジ領域（Ｈ）はまた、生物学的活性を最適化するための適切な立体構造を促進するために各ＣＨ２領域のＮ末端に存在してもよい。

ある特定の実施形態において、本発明のｒＩＶＩＧタンパク質は、Ｆｃ分子のさらなる領域を含む。例えば、ｒＩＶＩＧは、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１の１つ以上の定常領域１（ＣＨ１）ドメイン、ならびに１つ以上のＩｇκまたは軽鎖定常領域（ＣＬ）ドメインを含むことができる。ＣＬドメインのＣ末端は、（ＧＧＧＧＳ）_２などの短いリンカー配列を用いて、ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結することができる。この構築物において、ＣＨ１ドメインは、分子間ジスルフィド結合よりも熱力学的にはるかに好ましい分子内ジスルフィド結合を介してＣＬドメインと相互作用することができる。さらに、ＣＬ／ＣＨ１ドメインは、補体成分を除去する役割を果たすことで、多くの自己免疫疾患に存在する補体免疫反応をさらに改善することができる。

ヒト抗体アイソタイプ
異なる結合パターンを有する、いくつかの異なるアイソタイプの抗体が存在することで、体内で異なる機能的役割がもたらされることが知られている。各アイソタイプの結合親和性は一般的に知られており（Ｇｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：１－１３）、それらを以下の表１に示す。各抗体アイソタイプのＦｃは、異なるようにＦｃ受容体に結合をする。例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ（０．１マイクロモル（ｕＭ）のＫＤ）に対するヒトＩｇＧ３の結合親和性は、同一受容体に対するヒトＩｇＧ１の結合親和性より少なくとも５０倍高い（５～１０ｕＭのＫＤ）。同様に、ＦｃγＲＩＩＡへのヒトＩｇＧ１の結合は、ヒトＩｇＧ４の結合より１５倍強い。したがって、本明細書の実施例はＩｇＧ１由来のＦｃフラグメントを使用するが、各アイソタイプ由来のＦｃフラグメントを本発明に使用することができる。例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの定常領域を有するＰ８００３ＺまたはＰ８０２０Ｚの変異体は、ＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を有する親のＰ８００３ＺまたはＰ８０２０Ｚの親和性とは異なる親和性を示すことが期待される。多くの自己免疫疾患は、Ｆｃ受容体を特異的に組み合わせた発現に関連するので、各アイソタイプ変異体に由来する本発明のｒＩＶＩＧは、異なる治療上の恩恵をもたらし得る。
表１ ヒト抗体アイソタイプのＦｃ受容体への親和性

ヒト以外の哺乳動物の抗体サブクラス
ある特定のヒト以外の哺乳動物種には、ヒト抗体アイソタイプに類似する抗体のサブクラスを有することが知られている。例えば、サブクラスＡ、サブクラスＢ、サブクラスＣ及びサブクラスＤの４つの公知のイヌ免疫グロブリンサブクラスがそれぞれ存在する。サブクラスは、４つのヒトＩｇＧアイソタイプと機能的特性を共有する。イヌサブクラスＡ及びＤはエフェクター機能陰性であると見られ、サブクラスＢ及びＣはイヌＦｃγ受容体に結合し、ＡＤＣＣに対して陽性であることが報告されている。全てのイヌサブクラスは、サブクラスＣを除く新生児Ｆｃレセプターに結合することがさらに報告されている（２２）。

免疫グロブリンＦｃドメインのグリコシル化ならびに非フコシル抗体とＦｃγＲＩＩＩ（ヒト）及びＦｃγＲＩＶの増強した相互作用。
アイソタイプの違いに加えて、単一のグリコシル化部位（Ａｓｎ－２９７）での特異なグリコシル化も、Ｆｃ－Ｆｃ受容体相互作用において重要な役割を担うことが知られている。実際、Ａｓｎ－２９７残基でのグリコフォームの変化が生理的及び病的な条件下で生じることは明らかである（２３）。さらに、特異なシアル酸付加はＩｇＧの炎症特性に影響することが報告されており、抗炎症状態を誘発する分子スイッチのメカニズムとして提唱されている（２４）。さらに、グリカンの除去によりＦｃは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を除く全てのＦｃ受容体と相互作用する能力を完全に損なう（２５）。最も興味深いことに、Ｎ－グリカン複合体のコアフコースの除去により、ＦｃγＲＩＩＩに対するＦｃの相互作用の選択的増強が、最大で１００倍となることが見出されている（２６）。非フコシル化形態の抗体は、α－１，６フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８^－／－）が欠損している宿主細胞株において全く同じ抗体を発現させることによって産生することができる。Ｐ８００３Ｚ１及びＰ８００３Ｚ３は、Ｐ８００３Ｚ１がＦＵＴ８コンピテント細胞において産生され、Ｐ８００３Ｚ３がＦＵＴ８欠損細胞において産生される点で、コアフコシル糖鎖が異なる。非フコシル化Ｐ８００３Ｚ３は、期待通り、ヒトＦｃγＲＩＩＩ及びマウスＦｃγＲＩＶへの結合が増強されている（図３ＫＤの表を参照）。

したがって、当業者には明らかであるように、修飾されたグリコシル化を有するｒＩＶＩＧタンパク質、修飾されたグリコシル化を有するｒＩＶＩＧタンパク質を産生する細胞株及び及び培地は本発明において使用され得、ならびにｒＩＶＩＧ産生のためのそれらの使用及び免疫疾患の治療的処置における修飾されたグリコシル化を有するｒＩＶＩＧタンパク質の使用は、本発明の一部を成す。

オリゴマー化足場ドメイン
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴマー化ドメイン」「オリゴマー化足場ドメイン」及び「オリゴマー化タンパク質足場」は、特定の配列がオリゴマー構造を形成するように機能することを示すために互換的に使用される。本発明に有用なオリゴマー化足場ドメインには、一本鎖Ｆｃペプチドなど、その融合相手の三量体化を誘導し、それにより三量体ｒＩＶＩＧ分子を形成するものが含まれ、各ｒＩＶＩＧ分子は、２つのＨ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（ヒンジ領域－重鎖定常領域２－重鎖定常領域３）を含む。Ｐ８０２０Ｚ（配列番号６）によって例示されるようなある特定の実施形態において、オリゴマー化足場ドメインが構築物のＮ末端にあり得る場合、オリゴマー化足場ドメインのＣ末端は、第１のヒンジ領域（Ｈ）もしくはＣＨ２領域のＮ末端、またはＣＬドメインに、ＧＧＧＧＳなどの短いリンカー配列を介して直接的または間接的に連結され得る。Ｐ８００３Ｚ（配列番号４）によって例示されるようなその他の実施形態において、オリゴマー化足場ドメインが構築物のＣ末端にあり得る場合、オリゴマー化足場ドメインのＮ末端は、ＧＧＧＧＳ（配列番号９）などの短いリンカー配列を介して直接的または間接的に最後のＣＨ３ドメインのＣ末端に連結され得る。

リンカー及びフレキシブルリンカー
本発明において有用なリンカー及びフレキシブルリンカーには、複数のグリシンまたはセリン残基を有し、ポリペプチドの長さが第１ドメインのＣ末端と第２ドメインのＮ末端の間の距離を橋渡しするのに十分であると定義される、グリシン及び／またはセリンリッチなポリペプチドリンカーが挙げられる。用語「フレキシブルリンカー」は、実質的に水溶液中で二次構造を有さない、柔軟で非構造的なポリペプチドの立体配置の形成を可能にするのに十分な長さのポリペプチド配列を定義するために使用され、キメラまたは融合タンパク質が単一の核酸構築物に由来する単一のポリペプチド分子として生成することができるように、２つのタンパク質ドメインを連結する手段を提供する。

リンカーは、別々のドメイン間の分子内相互作用を可能にするように長さを変えることができ、それによって生物学的機能を最適化する三次元立体構造の形成を可能にする。本明細書中で使用される場合、用語「フレキシブルリンカー」は、一般に、１０アミノ酸以上の長さを有するリンカーに適用される。適切なフレキシブルリンカーは、一般に、少なくとも１０アミノ酸残基の長さであり、約１０～約３６アミノ酸残基を有するリンカーポリペプチドを含む。好ましいフレキシブルリンカーは、少なくとも約５０％より多いグリシン残基及び約１０から約３０アミノ酸の長さを有するものであり、より好ましくは長さが約１２～約２５アミノ酸、または長さが約１５～約２５アミノ酸である。本発明において有用なフレキシブルリンカーとしては、例えば、（ＧＧＧＧＳ）_ｎのアミノ酸配列（ｎは２～７である）が挙げられる。用語「Ｇ４Ｓ」は、配列ＧＧＧＧＳ（配列番号９）を指すために互換的に使用される。好ましいフレキシブルリンカーには、（ＧＧＧＧＳ）_ｎのアミノ酸配列が含まれ、式中ｎは２～６であり、より好ましくは、ｎは３～５である。このようなグリシンリッチ及び／またはセリンリッチペプチドリンカーはよく知られており、抗体ドメインを連結させて、完全抗体の結合部位を単一のポリペプチド鎖に組み込む一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）タンパク質を形成するために使用されている。１２アミノ酸残基未満のセリンリッチ及び／またはグリシンリッチペプチドリンカーはまた、ペプチドドメインを連結させるためのリンカーとして使用することもできるが、隣接する融合ペプチドドメインが分子内で相互作用できる立体構造となるほどの十分な柔軟性を提供しない。本発明において使用することができる特定のフレキシブルリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_５（配列番号９）を含む。フレキシブルリンカーが望ましくない場合、本発明において有用なより短いリンカーには、アミノ酸ＧＧＧＧＳ及び（ＧＧＧＧＳ）_２を含むリンカーが挙げられる。一般に、リンカーは、アラニン及びスレオニンなどの非反応性側鎖を有する他のアミノ酸残基を含んでもよい。しかしながら、リンカーは一般に、荷電アミノ酸残基を含まず、かつジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基を含むべきでない。適切なフレキシブルペプチドリンカー及びそれらの製造に有用なＤＮＡ構築物は、米国特許第５，２５８，４９８号、米国特許第５，４８２，８５８号、及び米国特許第５，５２５，４９１号に記載されている。

精製：
本発明はさらに、本発明の１つ以上のｒＩＶＩＧタンパク質を主に含む組成物に関する。本明細書で使用されるように、組成物の重量に関して使用される場合、１つ以上のｒＩＶＩＧタンパク質を「主に含有する」という用語は、全組成物重量のうち特定のｒＩＶＩＧタンパク質を少なくとも５０重量％、少なくとも５５重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％含有する組成物であることを意味する。組成物のタンパク質の量に関して使用される場合、１つ以上のｒＩＶＩＧタンパク質を「主に含有する」という用語は、組成物に存在する全タンパク質（モル％）のうち特定のｒＩＶＩＧタンパク質（モル％）を少なくとも５０モル％、少なくとも５５モル％、少なくとも６０モル％、少なくとも６５モル％、少なくとも７０モル％、少なくとも７５モル％、少なくとも８０モル％、少なくとも８５モル％、少なくとも９０モル％、または少なくとも９５モル％含有する組成物であることを意味する。

本発明の１つ以上のｒＩＶＩＧタンパク質を主に含有する組成物は、ＩｇＧのＦａｂ領域にも結合することができ、Ｆ（ａｂ’）２の精製に有用である、ＩｇＧのＦｃ部分に結合するプロテインＡ－アガロースまたはＩｇＧのＦｃ部分に優先的に結合するプロテインＧ－アガロースを使用する、従来のＩｇＧの精製方法を使用して得てもよい。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含む、当技術分野で公知のさらなる精製方法は、本発明によるｒＩＶＩＧタンパク質組成物のさらなる精製に使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｐｌ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／ｔｅｃｈｄｏｃｓ／ｐｕｒｉｆｉｇｇ．ｐｄｆ（２０１６年３月２３日にアクセス）及びそこで引用されている以下の参考文献を参照されたい、Ｓｕｒｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．７：７４－７６、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ），ｐ．６１７－６１８、Ｌａｎｇｏｎｅ（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５５：２７７－２９６、Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６２：１－１３、及びＴｈｒｕｓｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｌｅｙ（１９８８）ｉｎ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３－Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）ｐ．１４９－１５８。

組成物
本発明はさらに、薬学的に許容されるアジュバントまたは担体と組み合わせたｒＩＶＩＧタンパク質の組成物に関する。使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、薬学分野での使用に許容される、すなわち許容できないほど毒性ではないか、そうでなければ哺乳動物への投与に不適切でないことを意味する。薬学的に許容されるアジュバントの例には、希釈剤、賦形剤などが含まれるが、これらに限定されない。一般的に薬物製剤の手引きについては、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５を参照してもよい。

医薬組成物は、追加の成分、例えば防腐剤、緩衝剤、等張剤、抗酸化剤及び安定剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤などをさらに含んでもよい。

溶液中での使用に適した防腐剤には、ポリクアテルニウム－１、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ソルビン酸、塩化ベンゼトニウムなどが含まれる。典型的には（しかし必ずしもそうではないが）、このような防腐剤は、０．００１重量％～１．０重量％のレベルで使用される。

典型的には（しかし必ずしもではないが）緩衝剤は製剤を生理学的ｐＨまたはそれに近い状態に維持するために使用される。適切な緩衝剤には、ｐＨを約ｐＨ６とｐＨ８との間、好ましくは、ｐＨ７とｐＨ７．５の間に維持するのに十分な量のホウ酸、重炭酸ナトリウム及び重炭酸カリウム、ホウ酸ナトリウム及びホウ酸カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウム、酢酸ナトリウム、重リン酸ナトリウムなどが挙げられる。

適切な等張剤には、注射溶液の塩化ナトリウム当量が０．９±０．２％の範囲になるような、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなどが挙げられる。

適切な酸化防止剤及び安定剤には、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿潤剤及び清澄剤には、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２及びチロキサポールが挙げられる。適切な増粘剤には、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ペトロラタム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。

アジュバントの選択は、組成物の意図する投与様式に依存し、意図された適応症及び患者を考慮に入れてもよい。本発明の１つの実施形態において、化合物は点滴によって、または皮下もしくは静脈内のいずれかへの注射によって投与するために製剤化され、したがって、滅菌及び発熱物質を含まない形態で、場合により緩衝化または等張化された水溶液として利用され得る。したがって、化合物は、蒸留水で、またはより望ましくは生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水もしくは５％デキストロース溶液中で投与してもよい。上記に加えて、本発明の製剤は、特定の投薬量及び投与様式に適した、追加の活性成分及び／または溶媒、希釈剤、懸濁助剤、増粘剤または乳化剤、結合剤、安定剤、滑沢剤などを含む不活性成分をさらに含んでよい。いずれかの従来の担体媒体が、任意の望ましくない効果をもたらす、またはそうでなければ製剤の他の成分（複数可）と有害な様式で相互作用することによって、本発明の成分と不適合である場合を除いて、その使用は本発明の範囲内にあると考えられる。

投与の方法：
医薬組成物は、例えば、全身投与または局所投与を含む、本明細書に記載の様々な投与様式に好適であってよい。医薬組成物は、注射可能な溶液の形態であっても、経口投与に適した形態であってもよい。本明細書に記載の医薬組成物は、単回投与または複数投与形態で包装することができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、経口投与または静脈内注射を含む、本明細書に記載の任意の投与経路による個体、脊椎動物、哺乳動物またはヒトへの投与に適している。

本明細書に記載の組成物は、静脈内（例えば、輸液ポンプによる）、腹腔内、眼内、動脈内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、経皮、経肺、動脈内、局所、吸入（例えばスプレーの霧など）、粘膜（例えば、鼻腔粘膜を介して）、皮下、経皮、胃腸内、関節内、大槽内、心室内、直腸（すなわち、座薬を介して）、膣（すなわち、ペッサリーを介して）、頭蓋内、尿道内、肝内、及び腫瘍内を含むが、これらに限定されない任意の経路を介して個体に投与され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、全身的に（例えば、静脈内注射によって）投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、局所的に（例えば、動脈内または眼内注射によって）投与される。

いくつかの実施形態において、組成物は、静脈内または動脈内などの血管内に投与される。いくつかの実施形態（例えば、腎疾患の治療のための実施例について）において、組成物は、動脈（腎動脈など）に直接投与される。好ましい実施形態において、組成物は皮下投与される。

いくつかの実施形態において、組成物は、眼または眼の組織に直接投与してもよい。いくつかの実施形態において、組成物は眼に局所的に、例えば点眼で投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、眼への注射（眼内注射）または眼に関連する組織に投与される。組成物は、例えば、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射（ｓｕｂｃｏｎｊｅｃｔｖａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、結膜下注射（ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｔｉｖａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、テノン嚢下、球後注射、球周囲注射、または後方近位強膜送達によって投与され得る。これらの方法は当技術分野で知られている。例えば、網膜薬物送達のための例示的な眼周囲経路の説明については、Ｐｅｒｉｏｃｕｌａｒ ｒｏｕｔｅｓ ｆｏｒ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｒａｇｈａｖａ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．１（１）：９９－１１４を参照されたい。組成物は、例えば、硝子体、房水、強膜、結膜、強膜と結膜との間の領域、網膜脈絡膜組織、黄斑、または個体の眼の中もしくは近傍の他の領域に投与してもよい。

組成物は、インプラントとして個体に投与することもできる。好ましいインプラントは、ある期間にわたって化合物を徐々に放出する生体適合性及び／または生分解性の持続放出製剤である。薬物送達のための眼内インプラントは当技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許第５，５０１，８５６号、第５，４７６，５１１号及び第６，３３１，３１３号を参照されたい。組成物はまた、ＵＳ４，４５４，１５１及びＵＳ２００３／０１８１５３１及び２００４／００５８３１３に記載されているイオン浸透的な方法を含むが、これに限定されないイオントフォレーシスを用いて個体に投与することもできる。

用量：
組成物の最適な有効量は経験的に決定することができ、疾患の種類及び重症度、投与経路、疾患の進行及び健康、個体の体重及び体面積に依存する。かかる決定は、当業者の技術の範囲内である。有効量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに基づいて決定することもできる。本明細書に記載の方法に用いることができる組成物の用量の例には、約０．０１ｕｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｕｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇまたは約１ｕｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｕｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの任意の用量の範囲内の有効量が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、皮下投与する場合、組成物は、例えば約０．１ｕｇ／ｋｇ以下、約０．０５ｕｇ／ｋｇ以下、または０．０１ｕｇ／ｋｇ以下を含む低マイクログラムの範囲での投与であってよい。いくつかの実施形態において、個体に投与される組成物の量は、例えば、１用量につき約１０ｕｇ～約５０ｕｇ、約５０ｕｇ～約１００ｕｇ、約１００ｕｇ～約２００ｕｇ、約２００ｕｇ～約３００ｕｇ、約３００ｕｇ～約５００ｕｇ、約５００ｕｇ～約１ｍｇ、約１ｍｇ～約１０ｍｇ、約１０ｍｇ～約５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ、約１００ｍｇ～約２００ｍｇ、約２００ｍｇ～約３００ｍｇ、約３００ｍｇ～約４００ｍｇ、または約４００ｍｇ～約５００ｍｇのいずれかを含む、１用量につき約１０ｕｇ～約５００ｍｇである。

組成物は、１日１回用量で投与してもよく、あるいは１日用量を１日２回、３回、または４回に分けて投与してもよい。組成物はまた、毎日よりも少ない頻度で、例えば週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、または６ヶ月に１回投与してもよい。組成物はまた、長い期間にわたって使用するために組成物を徐々に放出するインプラントなどの徐放性製剤で投与してもよく、組成物を１ヶ月に１回、２～６ヶ月に１回、１年に１回、あるいは１回の投与など、より少ない頻度での投与が可能になる。持続放出デバイス（ペレット、ナノ粒子、微粒子、ナノスフェア、マイクロスフェアなど）は、体内の様々な場所に注射または外科的に埋め込みにより投与されてもよい。

同時投与
本発明は、免疫不全または免疫疾患の改善された治療のための方法を提供し、その方法は、予防的または治療的活性を有するか、またはかかる免疫不全または免疫疾患の治療への使用が承認されている１つ以上の追加の活性薬剤と本発明のｒＩＶＩＧ組成物を同時投与することを含む。かかる方法において、ｒＩＶＩＧ組成物は、追加の活性薬剤の投与の前、同時または後に投与してもよい。例えば、関節リウマチ（ＲＡ）の治療において、本発明のｒＩＶＩＧ組成物は、ＲＡでの使用が承認された治療用抗体であるＨｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ、ＡｂｂＶｉｅ Ｉｎｃ．）を含む組成物と同時投与してもよい。ｒＩＶＩＧ組成物は、ＲＡに罹患している患者にさらなる軽減をもたらし、ｒＩＶＩＧ組成物の効果がＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効果と相乗的であり得ることが期待される。

本発明は、臓器移植、または幹細胞移植もしくは輸血などの他の処置を受けた患者の、改善された治療のための方法であって、かかる移植もしくはその他の処置の前、同時または後に本発明のｒＩＶＩＧ組成物を投与することを含む方法を提供する。本発明によるこのような治療は、移植臓器に対する抗体媒介性免疫応答（すなわち、免疫拒絶反応）を予防または軽減するための方法を提供する。ｒＩＶＩＧ組成物は、そのような抗体媒介性免疫応答または移植臓器の拒絶に対して予防的または治療的活性を有する、１つ以上の追加の活性薬剤と同時投与してもよい。

例えば、腎臓被移植者の治療において、本発明のｒＩＶＩＧ組成物は、シクロスポリンなどの免疫抑制剤を含む組成物と同時投与してもよい。本発明の組成物と同時投与してもよい他の免疫抑制剤には、タクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤、シロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ミコフェノール酸及びアザチオプリンなどの抗増殖剤、及びプレドニゾンなどのステロイドが含まれる。ｒＩＶＩＧ組成物は、免疫拒絶に苦しむ患者にさらなる軽減をもたらし、ｒＩＶＩＧ組成物の効果は免疫抑制剤の効果と相乗的であることが期待される。さらに本発明によるそのような治療により、そのような免疫抑制剤の量を減らすことが可能になる。

コード化ヌクレオチド分子、組換えベクター及び組換え細胞株
本発明のｒＩＶＩＧタンパク質をコードするヌクレオチド分子を合成する方法は、当技術分野で公知である。遺伝コードを用いて本発明のｒＩＶＩＧタンパク質のアミノ酸配列は容易に逆翻訳され、オンラインツールを用いて、コドン最適化され得る（２７）。コード化ヌクレオチド分子は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．に記載の遺伝子合成の階層的手法などの戦略を用いて合成してもよい（２８）。

本発明のｒＩＶＩＧタンパク質の発現については、コード化ヌクレオチド配列は組換えベクターを用いて宿主細胞中で発現することが知られており、ここで、ｒＩＶＩＧタンパク質をコードする核酸配列は、宿主細胞中でｒＩＶＩＧタンパク質の発現を駆動する適切なプロモーターの制御下にある。適切な宿主細胞としては、例えば、哺乳動物ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞が挙げられる（２９）。

遺伝子治療
分子は、ｉｎ ｖｉｖｏでの融合タンパク質の発現によって送達することもでき、多くの場合、それは「遺伝子治療」と呼ばれる。例えば、ｅｘ ｖｉｖｏで融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて細胞を操作してもよく、その後、その操作した細胞は、融合タンパク質で治療する個体に提供される。このような方法は当技術分野でよく知られている。例えば細胞は、当技術分野で公知の手順で、本発明の融合タンパク質をコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により操作してもよい。遺伝子治療を用いた本発明のｒＩＶＩＧタンパク質の局所的送達により、局所的な標的領域に治療剤が提供され得る。

遺伝子送達の方法は、当技術分野で公知である。これらの方法には、直接的なＤＮＡ転移（例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５－１４６８を参照されたい）、２）リポソーム介在性ＤＮＡ転移（例えばＣａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：３９－４６、Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：１５－１７、Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９：２８０－２８５を参照されたい）、３）レトロウイルス介在性ＤＮＡ転移（例えばＫａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１１７－１１９、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３を参照されたい）、４）ＤＮＡウイルス介在性ＤＮＡ転移が含まれるが、これらに限定されない。そのようなＤＮＡウイルスには、アデノウイルス（好ましくはＡｄ２またはＡｄベースの５ベクター）、ヘルペスウイルス（好ましくは単純ヘルペスウイルスベースのベクター）、及びパルボウイルス（好ましくは「欠損」または非自律性パルボウイルスベースのベクター、より好ましくはアデノ随伴ウイルスベースのベクター、最も好ましくはＡＡＶ－２ベースのベクター）が挙げられる。例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：３６７－３８４、米国特許第４，７９７，３６８号（参照により本明細書に組み込まれる）、及び米国特許第５，１３９，９４１号を参照されたい。

前述したレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスにはモロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、乳がんウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する。

アデノウイルスは、幅広い宿主を持ち、休止期または最終分化した細胞（例えば、ニューロンまたは肝細胞）に感染することができ、実質的に非発がん性であると思われるという利点を有している。例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）（前掲、ｐ．３６７）を参照されたい。アデノウイルスは宿主ゲノムに組み込まれていないように見える。それらは染色体外に存在するため、挿入変異誘発のリスクは大幅に低減される。Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）（前掲、ｐ．３７３）。

アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスベクターと同様の利点を示す。しかしＡＡＶはヒト１９番染色体に部位特異的な組込みを示す（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、前掲、ｐ．３７７）。

遺伝子治療ベクターは、１つ以上のプロモーターを含んでもよい。いくつかの実施形態において、ベクターは複数の細胞型で発現を駆動するプロモーターを有する。いくつかの実施形態において、ベクターは特定の細胞型（網膜の細胞または腎臓の細胞など）で発現を駆動するプロモーターを有する。使用することができる適切なプロモーターには、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７（９）：９８０－９９０に記載されるヒトサイトメガロウイルス（ＣＶＭ）プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えばヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ及びβ－アクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない真核生物細胞プロモーターなどの細胞プロモーター）が含まれるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターには、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、及びＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者には明らかであろう。

ｒＩＶＩＧタンパク質をコードする核酸配列は、好ましくは適切なプロモーターの制御下にある。使用することができる適切なプロモーターには、アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異種プロモーター、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡ１プロモーター、ヒトグロビンプロモーター、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルス性チミジンキナーゼプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ（前述の改変レトロウイルスＬＴＲを含む）、β－アクチンプロモーター、及びヒト成長ホルモンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

レトロウイルスプラスミドベクターを用いて、パッケージング細胞株を形質導入して、プロデューサー細胞株を形成させることができる。トランスフェクションされ得るパッケージング細胞の例は、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５－１４に記載されている。ベクターは、当技術分野で公知の任意の手段によってパッケージング細胞に形質導入することができる。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、及びＣａＰＯ_４沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替例において、レトロウイルスプラスミドベクターはリポソームに封入するか、または脂質に結合させた後に、宿主に投与してもよい。プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列（複数可）を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。このようなレトロウイルスベクター粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで真核細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列（複数可）を発現する。形質導入され得る真核細胞には、胚性幹細胞、胚性がん腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、及び気管支上皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。

Ｅｘ Ｖｉｖｏ投与
いくつかの実施形態において、ｒＩＶＩＧタンパク質の免疫調節効果は、体液を、分子が免疫応答を調節するように機能する条件下でｅｘ ｖｉｖｏで分子を含む組成物と接触させることによって達成され得る。適切な体液には、血液、血漿、またはリンパ液などの個体に戻すことができるものが含まれる。アフィニティー吸着アフェレーシスは、一般に、Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｌｏｏｄ ５８（１）：３８－４４、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３３：２３４－２４２、Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＡＳＡＩＯ Ｊ．４３（１）：５３－５９、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ １９：１０５－１１２、米国特許第５，７３３，２５４号、Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．４２：８８８－８９４、及びＷａｌｌｕｋａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ’ｌ Ｊ．Ｃａｒｄ．５４：１９１０１９５に記載されている。

したがって、本発明は個体において、個体の血液を体外的に（すなわち体の外側またはｅｘ ｖｉｖｏで）分子を含む組成物で、その分子が免疫応答を調節するように機能する条件下で処理し、その血液を個体に戻すことを含む、本明細書に記載の１つ以上の疾患を治療する方法を含む。

単位剤形、製造品、及びキット
単回投与形態の組成物もまた提供され、各用量は約０．０１ｍｇ～約５０ｍｇを含有し、例えば約０．１ｍｇ～約５０ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４０ｍｇ、約１０ｍｇ～約２０ｍｇ、または約１５ｍｇのいずれかの分子を含む。いくつかの実施形態において、分子組成物の単回投与形態は、約０．０１ｍｇ～０．１ｍｇ、０．１ｍｇ～０．２ｍｇ、０．２ｍｇ～０．２５ｍｇ、０．２５ｍｇ～０．３ｍｇ、０．３ｍｇ～０．３５ｍｇ、０．３５ｍｇ～０．４ｍｇ、０．４ｍｇ～０．５ｍｇ、０．５ｍｇ～１．０ｍｇ、１０ｍｇ～２０ｍｇ、２０ｍｇ～５０ｍｇ、５０ｍｇ～８０ｍｇ、８０ｍｇ～１００ｍｇ、１００ｍｇ～１５０ｍｇ、１５０ｍｇ～２００ｍｇ、２００ｍｇ～２５０ｍｇ、２５０ｍｇ～３００ｍｇ、３００ｍｇ～４００ｍｇ、または４００ｍｇ～５００ｍｇのいずれかの分子を含む。いくつかの実施形態において、単回投与形態は約０．２５ｍｇの分子を含む。「単位投与形態」という用語は、個体の単位投与量として適切な、物理的に分離した単位を指し、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を、適切な薬学的担体、希釈剤または賦形剤と共に含む。これらの単位投与形態は、１回または複数回の単位投与量で適切な包装の中に保存することができ、さらに滅菌及び密封することもできる。

適切な包装の、本明細書に記載の組成物を含む製品も提供される。本明細書に記載される組成物（眼科用組成物など）の適切な包装は、当技術分野で公知であり、例えばバイアル（密封バイアルなど）、容器、アンプル、瓶、広口瓶、フレキシブル包装（例えば密封マイラーまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。これらの製品は、さらに滅菌及び／または密封されていてもよい。

本発明はまた、本明細書に記載の使用など、組成物の使用方法に関する説明書（複数可）をさらに含み得る、本明細書に記載の組成物（または単位投与形態及び／または製品）を含むキットも提供する。本明細書に記載のキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び本明細書に記載の任意の方法を実施するための説明書を付け加えた、添付文書を含む、商業的及びユーザーの観点から望ましいその他のものをさらに含み得る。

本発明の組成物及び製剤は、免疫応答の調節に関連する病態の治療に有用である。

動物用途
上記に加えて、本発明は、免疫不全及び免疫疾患のためのヒト以外の哺乳動物の治療を含む、動物の適応症に有用な方法及び材料をさらに提供する。特定の実施形態において、動物の使用に有用な本発明の方法及び材料は、動物宿主／患者と同じ種に由来するペプチドドメインを含む。ヒト以外の哺乳動物は、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、関節リウマチまたは反応性関節炎を含むいずれかの免疫異常または免疫疾患に罹患していることがある。ヒト以外の哺乳動物は任意の種であってよく、特定の品種のイヌは特に自己免疫疾患になりやすいことが知られている。例えば、イヌの治療のために、各々がイヌ起源の１つ以上のＦｃペプチドドメイン及びオリゴマー化ペプチドドメインを使用することができる。特にイヌは、イヌ自身の免疫系がイヌの赤血球に結合して破壊する、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）などの免疫不全になりやすいことが知られている。従来の療法に応答しないＡＩＨＡもしくは免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、または致命的な出血のリスクがかなり高いと思われる重症のＩＴＰを有するイヌにおいて、ヒト起源のＩＶＩＧが治療に利用されている。例えば、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ Ｖｅｔ Ｉｎｔ Ｍｅｄ，１１：３２７－３３２を参照されたい。しかし、ヒトＩＶＩＧで治療されたイヌは、ヒトＩＶＩＧの反復使用時にアナフィラキシーを引き起こし得るイヌ抗ヒト抗体（ＤＡＨＡ）を一貫して産生する。そのため、現在利用可能なＩＶＩＧ組成物での動物患者の治療は厳しく制限されている。したがって、本発明の方法及び材料は、イヌ起源のｒＩＶＩＧ組成物、ならびにＡＩＨＡ及びＩＴＰなどのイヌ免疫不全を示すイヌの治療方法を提供する。

動物の適応症において、本発明は、動物宿主／患者と同じ種に由来するペプチドドメインを含むｒＩＶＩＧポリペプチドを含む。したがって、イヌの治療のために、本発明は、１つ以上のイヌＦｃペプチドドメイン及びイヌオリゴマー化ペプチドドメインを含むｒＩＶＩＧポリペプチドを含む。ヒトの治療のように、本発明の好ましい実施形態は、分子内相互作用を可能にするためにフレキシブルリンカーによって連結された、２つ以上のＦｃ部分、及び三量体化ペプチドドメインを含む。イヌ起源のオリゴマー化ペプチドドメインを含むｒＩＶＩＧポリペプチドは、イヌ免疫不全を示すイヌの治療に有用であり得る。

組換え免疫グロブリン融合タンパク質
Ｐ７００５Ｈは、ヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３領域、ならびにヒトＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むヒトＦｃ部分から成る融合タンパク質である。ヒトＦｃ部分は二量体化することができ、ＣＤ４０Ｌ ＥＣＤは三量体化することができる。したがって、融合タンパク質が、３つの二量体Ｆｃと２つの三量体ＣＤ４０Ｌを含む、六量体を形成することが期待される。成熟Ｐ７００５Ｈは、ヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む、３つの二量体Ｆｃ部分を含有し、そして優れたＩＶＩＧに類似した活性を示す。しかし、それぞれの機能性Ｆｃドメインは別々のペプチド鎖上にあるため、二量体Ｆｃの形成は均質ではない。さらに、発現ペプチド鎖間のジスルフィド結合は著しく変動し得、分子内と同様に分子間相互作用が生じることで、六量体よりもかなり大きな「ジッパー」オリゴマーが生じる。したがって、Ｐ７００５Ｈにより形成される組成物は、所望よりも著しく不均質であり、適切に折り畳まれない凝集タンパク質を含むため、活性にはならない。したがってＰ７００５Ｈを含有するタンパク質組成物がさらに受け入れられるためには、最も活性が期待される六量体を単離するために、さらなる精製工程が必要である。均質な組成物の製剤にはさらなる精製工程が必要となるため、かかる精製の必要性はＰ７００５Ｈの商業的利用可能性を低下させる。

本発明のｒＩＶＩＧ組成物の均質性の問題に取り組むために、本発明者らは一連の一本鎖ヒトＦｃ融合ペプチドを開発した。

Ｐ８００１Ｚは、一本鎖ヒトＦｃを含む融合タンパク質であり、２つの直列型のヒトＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含み、各ＣＨ２－ＣＨ３ ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３領域を含有し、そしてヒトコラーゲン２１由来のＧＸＹトリプレット反復配列及びＮＣ１ドメインを含む。一本鎖Ｆｃペプチドは２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン間にフレキシブルリンカー（ＧＧＧＧＳ）_５を含み、熱力学的に好ましい分子内相互作用を可能にし、一本鎖の機能的Ｆｃペプチドの形成を促進する。この分子内相互作用は、分子間ジスルフィド結合の形成を最小限に抑え、機能的一本鎖Ｆｃペプチドの単一種の形成を最大にすることが期待される。ＧＸＹトリプレット反復配列はコラーゲンの三量体化を担い、３つのＦｃ領域を一緒にすることが期待され、その各々において、フレキシブルリンカーによって連結された２つの直列型ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが相互作用し得る。したがって、Ｐ８００１Ｚの生成物は、Ｐ７００５Ｈ構築物の生成物よりも均質であると期待される。

Ｐ８００３Ｚは一本鎖ヒトＩｇＧκまたは軽鎖定常領域（ＣＬ）、完全なＩｇＧ定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含む第１のＦｃドメインと、フレキシブルリンカー（好ましくは（Ｇ４Ｓ）_５リンカー）を介して第１Ｆｃ領域のＣ末端に直列に連結された第２のＦｃドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３を含む）を含む融合タンパク質である。フレキシブルリンカーは、構築物の第１及び第２のＦｃドメインが分子内で相互作用する立体構造をとることを可能にする。第２のＦｃドメインのＣ末端は、コラーゲンＧＸＹトリプレット反復配列及びＮＣ１ドメイン（三量体化ドメイン）に直列に接続される。Ｐ８００１Ｚと同様に、コラーゲンＧＸＹ反復配列及びＮＣ１ドメインは、３つの一本鎖Ｆｃペプチドをまとめる内因性の三量体化活性を示し、それぞれ第１及び第２のＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが相互作用し得る立体構造で、フレキシブルリンカーを介して第２のＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに接続される、第１のＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含んでいる。ＣＬドメインがＣＨ１ドメインとヘテロ二量体化することも言及されるべきである。ＣＬ／ＣＨ１ドメインは、補体成分を除去する役割を果たすことで、多くの自己免疫疾患に存在する補体免疫反応をさらに減らすことができる。

Ｐ８０２０Ｚは、Ｎ末端部分のヒトマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）と、Ｐ８００３Ｚのものと同様の一本鎖Ｆｃペプチドとから成る融合タンパク質であり、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＣＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－フレキシブルリンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を含有している。ヒトＭＢＰのＮ末端部分は、内因性の三量体化能力を有し、融合タンパク質のオリゴマー化を担っている。Ｐ８００３Ｚの設計とは対照的に、Ｐ８０２０Ｚのオリゴマー化ドメインは融合タンパク質のＮ末端に位置し、Ｉｇ Ｆｃ領域は天然の免疫グロブリン分子に見られるようにＣ末端に位置する。融合タンパク質のＣ末端に位置する一本鎖Ｆｃペプチドを有するＰ８０２０Ｚの構造は、Ｆｃ受容体とのその相互作用のための規則抗体の配向を厳密に模倣すると期待される。

上記の組換えｒＩＶＩＧ構築物を作製し、２９３Ｔ細胞で発現させ、そして産生されたタンパク質は、当技術分野で公知の精製技術を用いて精製することができる。

ｒＩＶＩＧタンパク質が、主に六量体Ｆｃ構造を含むように適切に折り畳まれているかどうかを決定するために、精製タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイリングによって解析する。図２は各タンパク質産物のＳＥＣプロファイルを示す。

これらのｒＩＶＩＧタンパク質のＦｃγＲ結合活性を分析し、精製した単量体ヒトＩｇＧ１抗体のそれと比較した（図３）。

Ｐ８００３Ｚ及びＰ８０２０Ｚ構築物は、マウスコラーゲン誘導性関節炎モデルを用いた治療効果についても検討した。

マウスは完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を含むウシＩＩ型コラーゲンで初回免疫し、２１日目に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を含む同じコラーゲンで追加免疫した。Ｐ８０２０Ｚは１８日目に腹腔内投与した。炎症を起こした足は、２６日目から評価した。図４は、Ｐ８０２０で処置したマウスが、ＰＢＳで処置した対照マウスより非常に減弱した炎症を示したことを示す。

以下の実施例は、様々な実施形態における本発明の実施を例示するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。その他の実施形態は、本明細書及び実施例の考察から当業者に明らかとなるであろう。
実施例１：
Ｐ７００５Ｈの構成
Ｐ７００５Ｈタンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーターの制御下で３９５アミノ酸のタンパク質をコードする、哺乳動物の発現プラスミドｐＭＥｈＦｃＮ１－７００５により発現する。Ｎ末端から、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域から成るコード産物は、ヒトＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインに連結される。以下は、産生系から生成された成熟タンパク質産物（３７５アミノ酸）のコード配列である（配列番号１）。
Ｐ７００５Ｈのタンパク質配列（３７５アミノ酸）（配列番号１）：

表２

実施例２：
Ｐ８００１Ｚの構成
Ｐ８００１Ｚタンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーターの制御下で５３９アミノ酸のタンパク質をコードする、哺乳動物の発現プラスミドｐＨＣＭ－ｒＩＶＩＧ Ｖ１により発現する。コード産物は、Ｎ末端からヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む第１のＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン、続いて５回反復配列のＧ４Ｓリンカー（ＧＧＧＧＳ）_５を含むフレキシブルリンカー、続いてヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む第２のＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン、続いてヒトコラーゲン２１ Ａ１に由来するＧＸＹトリプレットの１１コピー及びＮＣ１ドメイン（（ＧＸＹ）１１－ＮＣ１）から成る。以下は、産生系から生成された成熟タンパク質産物（５１９アミノ酸）のコード配列である（配列番号２）。
Ｐ８００１Ｚのタンパク質配列（５１９アミノ酸）（配列番号２）：

表３

実施例３：
Ｐ８００２Ｚの構成
Ｐ８００２Ｚタンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーターの制御下で５２９アミノ酸のタンパク質をコードする、哺乳動物の発現プラスミドｐＨＣＭ－ｒＩＶＩＧ Ｖ２により発現する。コード産物は、Ｎ末端からヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む第１のＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン、続いて３回反復配列のＧ４Ｓリンカー（ＧＧＧＧＳ）_３、続いてヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む第２のＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン、続いてＧＧＧＧＳリンカー、続いてヒトコラーゲン２１ Ａ１に由来するＧＸＹトリプレットの１１コピー及びＮＣ１ドメイン（（ＧＸＹ）１１－ＮＣ１）から成る。以下は、産生系から生成された成熟タンパク質産物（５０９アミノ酸）のコード配列である（配列番号３）。
Ｐ８００２Ｚのタンパク質配列（５０９アミノ酸）（配列番号３）：

表４

実施例４：
Ｐ８００３Ｚの構成
Ｐ８００３Ｚタンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーターの制御下で７８８アミノ酸のタンパク質をコードする、哺乳動物の発現プラスミドｐＨＣＭ－ｒＩＶＩＧ Ｖ３により発現する。コード産物は、Ｎ末端からヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）、続いてＧ４Ｓリンカーの２回反復配列（Ｇ４Ｓ）_２、続いてヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、続いてＧ４Ｓリンカーの５回反復配列を含むフレキシブルリンカー（ＧＧＧＧＳ）_５、続いてヒトＩｇＧ１重鎖ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン、続いてヒトコラーゲン２１ Ａ１に由来するＧＸＹトリプレットの１１コピー及びＮＣ１ドメイン（（ＧＸＹ）１１－ＮＣ１）から成る。以下は、産生系から生成された成熟タンパク質産物（７６８アミノ酸）の配列である（配列番号４）。
Ｐ８００３Ｚのタンパク質配列（７６８アミノ酸）（配列番号４）：

表５

実施例５：
Ｐ８００４Ｚの構成
Ｐ８００４Ｚタンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーターの制御下で５６９アミノ酸のタンパク質をコードする、哺乳動物の発現プラスミドｐＨＣＭ－ｒＩＶＩＧ Ｖ４により発現する。コード産物は、Ｎ末端からヒトＩｇＧ１重鎖ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む第１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、続いてフレキシブルリンカー（ＧＧＧＧＳ）_５、続いてヒトＩｇＧ１重鎖ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む第２のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン、続いてヒトコラーゲン２１ Ａ１に由来するＧＸＹトリプレットの１１コピー及びＮＣ１ドメイン（ＧＸＹ１１－ＮＣ１）から成る。以下は、産生系から生成された成熟タンパク質産物（５４９アミノ酸）のコード配列である（配列番号５）。
Ｐ８００４Ｚのタンパク質配列（５４９アミノ酸）（配列番号５）：

表６

実施例６：
Ｐ８０２０Ｚの構成
Ｐ８０２０Ｚタンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーターの制御下で８１６アミノ酸のタンパク質をコードする、哺乳動物の発現プラスミドｐＨＣＭ－ｒＩＶＩＧ Ｖ２０により発現する。コード産物はＮ末端から、ヒトマンノース結合タンパク質（ｈＭＢＰ）Ｎ末端ペプチド－ｈＭＢＰコラーゲン三重らせんドメイン、続いてＧ４Ｓリンカーの３回反復配列（ＧＧＧＧＳ）_３、続いてヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）、続いてＧ４Ｓリンカーの２回反復配列（Ｇ４Ｓ）_２、続いてヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む第１の ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、続いてＧＧＧＧＳリンカーの５回反復配列を含むフレキシブルリンカー（ＧＧＧＧＳ）_５、続いてヒトＩｇＧ１重鎖ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインから成る。以下は、産生系から生成された成熟タンパク質産物（７９６アミノ酸）の配列である。
Ｐ８０２０Ｚのタンパク質配列（７９６アミノ酸）（配列番号６）：

表７

実施例７：
Ｋ８０２０Ｚの構成
Ｋ８０２０Ｚタンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーターの制御下で８２２アミノ酸のタンパク質をコードする、哺乳動物の発現プラスミドｐＨＣＭ－ｒＩＶＩＧ Ｖ４０により発現する。コード産物は、Ｎ末端からイヌマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）Ｎ末端ペプチド－イヌＭＢＰコラーゲン三重らせんドメイン、続いてＧ４Ｓリンカーの３回反復配列（ＧＧＧＧＳ）_３、続いてイヌκ軽鎖定常領域（ＣＬ）、続いてＧ４Ｓリンカーの２回反復配列（ＧＧＧＧＳ）_２、続いてＩｇＧサブクラスＢ重鎖定常領域を含むイヌＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、続いてＧ４Ｓの５回反復配列を含むフレキシブルリンカー（ＧＧＧＧＳ）_５、続いてイヌＩｇＧサブクラスＢ重鎖ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイヌヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインから成る。以下は、産生系から生成された成熟タンパク質産物（８０２アミノ酸）のコード配列である（配列番号７）。
Ｋ８０２０Ｚのタンパク質配列（８０２アミノ酸）（配列番号７）：

表８

実施例８：
Ｋ８００３Ｚの構成
Ｋ８００３Ｚタンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーターの制御下で７７９アミノ酸のタンパク質をコードする、哺乳動物の発現プラスミドｐＨＣＭ－ｒＩＶＩＧ Ｖ４２により発現する。コード産物は、Ｎ末端からイヌκ軽鎖定常領域（ＣＬ）、続いてＧ４Ｓリンカーの２回反復配列（ＧＧＧＧＳ）_２、続いてＩｇＧサブクラスＢ重鎖定常領域を含むイヌＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、続いてＧ４Ｓの５回反復配列を含むフレキシブルリンカー（ＧＧＧＧＳ）_５、続いてイヌＩｇＧサブクラスＢ重鎖ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイヌヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン、続いてイヌコラーゲン２１ Ａ１に由来するＧＸＹトリプレットの１１コピー及びＮＣ１ドメイン（（ＧＸＹ）１１－ＮＣ１）から成る。以下は、産生系から生成された成熟タンパク質産物（７７９アミノ酸）の配列である（配列番号８）。
Ｋ８００３Ｚのタンパク質配列（７７９アミノ酸）（配列番号８）：

表９

参考文献
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本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
（ａ）２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む一本鎖Ｆｃペプチドと（ｂ）オリゴマー化ペプチドドメインを含む、組換え静注用免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）ポリペプチド。
(項目２)
前記オリゴマー化ペプチドドメインが三量体化ドメインである、項目１に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
(項目３)
前記２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが、フレキシブルリンカーを介して連結されている、項目２に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
(項目４)
前記フレキシブルリンカーがアミノ酸配列Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号８）の２～６つの反復配列から成る、項目３に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
(項目５)
前記フレキシブルリンカーがアミノ酸配列Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号８）の５つの反復配列を含む、項目３に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
(項目６)
前記三量体化ドメインのＣ末端が、前記一本鎖ＦｃペプチドのＮ末端に連結されている、項目５に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
(項目７)
前記オリゴマー化ペプチドドメインが、配列番号６のアミノ酸番号１～７９を含む、項目６に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
(項目８)
前記三量体化ドメインのＮ末端が、前記一本鎖ＦｃペプチドのＣ末端に連結されている、項目５に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
(項目９)
前記オリゴマー化ペプチドドメインが配列番号４のアミノ酸番号７１２～７６８を含む、項目８に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
(項目１０)
項目３～９に記載のｒＩＶＩＧポリペプチドをコードする、ヌクレオチド分子。
(項目１１)
項目１０に記載のヌクレオチド配列を含む、組換えベクター。
(項目１２)
項目１１に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
(項目１３)
細胞株は、α－１，６フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠損している（ＦＵＴ８ ^－／－ ）、項目１２に記載の組換え細胞。
(項目１４)
組換え免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含む、免疫異常の治療のための組成物であって、前記ｒＩＶＩＧタンパク質は、主に三量体一本鎖Ｆｃペプチドを含む組成物を提供するオリゴマー化ペプチドドメインを含む、前記組成物。
(項目１５)
前記オリゴマー化ペプチドドメインが配列番号６のアミノ酸番号１～７９を含む、項目１４に記載の組成物。
(項目１６)
前記オリゴマー化ペプチドドメインが配列番号４のアミノ酸配列番号７１２～７６８を含む、項目１４に記載の組成物。
(項目１７)
前記組成物が主にホモ三量体Ｆｃ二量体を含む、項目１４に記載の組成物。
(項目１８)
前記ｒＩＶＩＧタンパク質が、配列番号６のアミノ酸組成を有する、項目１４に記載の組成物。
(項目１９)
前記ｒＩＶＩＧタンパク質が、配列番号４のアミノ酸組成を有する、項目１４に記載の組成物。
(項目２０)
前記ｒＩＶＩＧタンパク質がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から成る群から選択されるアイソタイプのＦｃ領域を含む、項目１４～１９に記載の組成物。
(項目２１)
前記ｒＩＶＩＧタンパク質は主に非フコシル化されている、項目１４～２０に記載の組成物。
(項目２２)
自己免疫疾患に罹患している患者を治療する方法であって、前記患者に組換え静注用免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含む有効量の組成物を投与することを含み、ここで前記ｒＩＶＩＧタンパク質は、主に三量体一本鎖Ｆｃ分子を含む組成物を提供するオリゴマー化ペプチドドメインを含む、前記方法。
(項目２３)
臓器移植を受けた患者の免疫拒絶反応を低減する方法であって、前記患者に組換え免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含む有効量の組成物を投与することを含み、ここで前記ｒＩＶＩＧタンパク質は、主に三量体一本鎖Ｆｃ分子を含む組成物を提供するオリゴマー化ペプチドドメインを含む、前記方法。
(項目２４)
前記患者が難治性の免疫性血小板減少症を罹患している、項目２２に記載の方法。
(項目２５)
前記ｒＩＶＩＧタンパク質が、配列番号４及び配列番号６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２２～２４のいずれかに記載される方法。
(項目２６)
前記オリゴマー化ペプチドドメインは、配列番号７のアミノ酸番号１～７２または配列番号８のアミノ酸番号７２１～７７９を含む、項目６に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
(項目２７)
項目２６に記載のｒＩＶＩＧポリペプチドをコードする、ヌクレオチド分子。
(項目２８)
項目２７に記載のヌクレオチド配列を含む、組換えベクター。
(項目２９)
項目２８に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
(項目３０)
細胞株は、α－１，６フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠損している（ＦＵＴ８ ^－／－ ）、項目２９に記載の組換え細胞。
(項目３１)
前記オリゴマーペプチドドメインが配列番号７のアミノ酸番号１～７２または配列番号８のアミノ酸番号７２１～７７９を含む、項目１３に記載の組成物。
(項目３２)
前記ｒＩＶＩＧタンパク質がＩｇＧ Ａ、ＩｇＧ Ｂ、ＩｇＧ Ｃ及びＩｇＧ Ｄから成る群から選択されるアイソタイプのＦｃ領域を含む、項目３１に記載の組成物。
(項目３３)
前記ｒＩＶＩＧタンパク質が主に非フコシル化されている、項目３１または３２に記載の組成物。
(項目３４)
自己免疫疾患に罹患しているヒト以外の哺乳動物を治療する方法であって、前記ヒト以外の哺乳動物に組換え静注用免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含む有効量の組成物を投与することを含み、ここで前記ｒＩＶＩＧタンパク質は、主に三量体一本鎖Ｆｃ分子を含む組成物を提供するオリゴマー化ペプチドドメインを含み、及び前記ｒＩＶＩＧタンパク質は、同種のヒト以外の哺乳動物に由来するアミノ酸配列を含む、前記方法。
(項目３５)
前記ヒト以外の哺乳動物はイヌであり、前記ｒＩＶＩＧタンパク質は配列番号７及び配列番号８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目３４に記載の方法。
(項目３６)
前記ヒト以外の哺乳動物はイヌであり、前記オリゴマー化ペプチドドメインは、配列番号７のアミノ酸番号１～７２または配列番号８のアミノ酸番号７２１～７７９を含む、項目３４に記載の組成物。

Claims (34)

1. （ａ）ＣＬドメインと、ＣＨ１ドメインと、２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む一本鎖Ｆｃペプチドと、（ｂ）オリゴマー化ペプチドドメインを含む、組換え静注用免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）ポリペプチドであって、前記オリゴマー化ペプチドドメインが三量体化ドメインであり、前記２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが、フレキシブルリンカーを介して連結されており、前記ＣＬドメインのＣ末端が、短いリンカー配列によって前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結されており、そして、前記オリゴマー化ペプチドドメインが、
   （ｉ）前記ポリペプチドのＮ末端にある場合には、前記オリゴマー化ペプチドドメインのＣ末端が前記ＣＬドメインのＮ末端に連結されており、あるいは
   （ｉｉ）前記ポリペプチドのＣ末端にある場合には、前記オリゴマー化ペプチドドメインのＮ末端が最後のＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、
   前記ｒＩＶＩＧポリペプチド。
2. 前記フレキシブルリンカーがアミノ酸配列Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号９）の２～６つの反復配列を含む、請求項１に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
3. 前記フレキシブルリンカーがアミノ酸配列Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号９）の５つの反復配列を含む、請求項１に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
4. 前記オリゴマー化ペプチドドメインのＣ末端が、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結されている、請求項３に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
5. 前記オリゴマー化ペプチドドメインが、配列番号６のアミノ酸番号１～７９を含む、請求項４に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
6. 前記オリゴマー化ペプチドドメインのＮ末端が、前記一本鎖ＦｃペプチドのＣ末端に連結されている、請求項３に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
7. 前記オリゴマー化ペプチドドメインが配列番号４のアミノ酸番号７１２～７６８を含む、請求項６に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
8. 請求項２～７のいずれかに記載のｒＩＶＩＧポリペプチドをコードする、核酸。
9. 請求項８に記載の核酸を含む、組換えベクター。
10. 請求項９に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
11. 細胞は、α－１，６フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠損している（ＦＵＴ８^－／－）、請求項１０に記載の組換え細胞。
12. 組換え免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含む、免疫異常の治療のための組成物であって、前記ｒＩＶＩＧタンパク質は、ＣＬドメインと、ＣＨ１ドメインと、２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む一本鎖Ｆｃペプチドと、主に三量体一本鎖Ｆｃペプチドを含む組成物を提供するオリゴマー化ペプチドドメインとを含み、前記オリゴマー化ペプチドドメインが三量体化ドメインであり、前記２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが、フレキシブルリンカーを介して連結されており、前記ＣＬドメインのＣ末端が、短いリンカー配列によって前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結されており、そして、前記オリゴマー化ペプチドドメインが、
    （ｉ）前記ポリペプチドのＮ末端にある場合には、前記オリゴマー化ペプチドドメインのＣ末端が前記ＣＬドメインのＮ末端に連結されており、あるいは
    （ｉｉ）前記ポリペプチドのＣ末端にある場合には、前記オリゴマー化ペプチドドメインのＮ末端が最後のＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、前記組成物。
13. 前記オリゴマー化ペプチドドメインが配列番号６のアミノ酸番号１～７９を含む、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記オリゴマー化ペプチドドメインが配列番号４のアミノ酸配列番号７１２～７６８を含む、請求項１２に記載の組成物。
15. 前記組成物が主にホモ三量体Ｆｃ二量体を含む、請求項１２に記載の組成物。
16. 前記ｒＩＶＩＧタンパク質が、配列番号６のアミノ酸組成を有する、請求項１２に記載の組成物。
17. 前記ｒＩＶＩＧタンパク質が、配列番号４のアミノ酸組成を有する、請求項１２に記載の組成物。
18. 前記ｒＩＶＩＧタンパク質がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から成る群から選択されるアイソタイプのＦｃ領域を含む、請求項１２～１７のいずれかに記載の組成物。
19. 前記ｒＩＶＩＧタンパク質は主に非フコシル化されている、請求項１２～１８のいずれかに記載の組成物。
20. 自己免疫疾患に罹患している患者を治療するための組成物であって、組換え静注用免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含み、ここで前記ｒＩＶＩＧタンパク質は、ＣＬドメインと、ＣＨ１ドメインと、２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む一本鎖Ｆｃペプチドと、主に三量体一本鎖Ｆｃ分子を含む組成物を提供するオリゴマー化ペプチドドメインとを含み、前記オリゴマー化ペプチドドメインが三量体化ドメインであり、前記２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが、フレキシブルリンカーを介して連結されており、前記ＣＬドメインのＣ末端が、短いリンカー配列によって前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結されており、そして、前記オリゴマー化ペプチドドメインが、
    （ｉ）前記ポリペプチドのＮ末端にある場合には、前記オリゴマー化ペプチドドメインのＣ末端が前記ＣＬドメインのＮ末端に連結されており、あるいは
    （ｉｉ）前記ポリペプチドのＣ末端にある場合には、前記オリゴマー化ペプチドドメインのＮ末端が最後のＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、前記組成物。
21. 臓器移植を受けた患者の免疫拒絶反応を低減するための組成物であって、組換え免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含み、ここで前記ｒＩＶＩＧタンパク質は、ＣＬドメインと、ＣＨ１ドメインと、２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む一本鎖Ｆｃペプチドと、主に三量体一本鎖Ｆｃ分子を含む組成物を提供するオリゴマー化ペプチドドメインとを含み、前記オリゴマー化ペプチドドメインが三量体化ドメインであり、前記２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが、フレキシブルリンカーを介して連結されており、前記ＣＬドメインのＣ末端が、短いリンカー配列によって前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結されており、そして、前記オリゴマー化ペプチドドメインが、
    （ｉ）前記ポリペプチドのＮ末端にある場合には、前記オリゴマー化ペプチドドメインのＣ末端が前記ＣＬドメインのＮ末端に連結されており、あるいは
    （ｉｉ）前記ポリペプチドのＣ末端にある場合には、前記オリゴマー化ペプチドドメインのＮ末端が最後のＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、前記組成物。
22. 前記患者が難治性の免疫性血小板減少症を罹患している、請求項２０に記載の組成物。
23. 前記ｒＩＶＩＧタンパク質が、配列番号４及び配列番号６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２２のいずれかに記載される組成物。
24. 前記オリゴマー化ペプチドドメインは、配列番号７のアミノ酸番号１～７２または配列番号８のアミノ酸番号７２１～７７９を含む、請求項４に記載のｒＩＶＩＧポリペプチド。
25. 請求項２４に記載のｒＩＶＩＧポリペプチドをコードする、核酸。
26. 請求項２５に記載の核酸を含む、組換えベクター。
27. 請求項２６に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
28. 細胞は、α－１，６フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠損している（ＦＵＴ８^－／－）、請求項２７に記載の組換え細胞。
29. 前記オリゴマー化ペプチドドメインが配列番号７のアミノ酸番号１～７２または配列番号８のアミノ酸番号７２１～７７９を含む、請求項１２に記載の組成物。
30. 前記ｒＩＶＩＧタンパク質がＩｇＧ Ａ、ＩｇＧ Ｂ、ＩｇＧ Ｃ及びＩｇＧ Ｄから成る群から選択されるアイソタイプのＦｃ領域を含む、請求項２９に記載の組成物。
31. 前記ｒＩＶＩＧタンパク質が主に非フコシル化されている、請求項２９または３０に記載の組成物。
32. 自己免疫疾患に罹患しているヒト以外の哺乳動物を治療する方法であって、前記ヒト以外の哺乳動物に組換え静注用免疫グロブリン（ｒＩＶＩＧ）タンパク質を含む有効量の組成物を投与することを含み、ここで前記ｒＩＶＩＧタンパク質は、ＣＬドメインと、ＣＨ１ドメインと、２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む一本鎖Ｆｃペプチドと、主に三量体一本鎖Ｆｃ分子を含む組成物を提供するオリゴマー化ペプチドドメインとを含み、前記ｒＩＶＩＧタンパク質は、同種のヒト以外の哺乳動物に由来するアミノ酸配列を含み、前記オリゴマー化ペプチドドメインが三量体化ドメインであり、前記２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが、フレキシブルリンカーを介して連結されており、前記ＣＬドメインのＣ末端が、短いリンカー配列によって前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結されており、そして、前記オリゴマー化ペプチドドメインが、
    （ｉ）前記ポリペプチドのＮ末端にある場合には、前記オリゴマー化ペプチドドメインのＣ末端が前記ＣＬドメインのＮ末端に連結されており、あるいは
    （ｉｉ）前記ポリペプチドのＣ末端にある場合には、前記オリゴマー化ペプチドドメインのＮ末端が最後のＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、前記方法。
33. 前記ヒト以外の哺乳動物はイヌであり、前記ｒＩＶＩＧタンパク質は配列番号７及び配列番号８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記ヒト以外の哺乳動物はイヌであり、前記オリゴマー化ペプチドドメインは、配列番号７のアミノ酸番号１～７２または配列番号８のアミノ酸番号７２１～７７９を含む、請求項３２に記載の方法。

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