KR101571040B1 - 마이크로 칩 - Google Patents

Abstract

본 발명은 복수의 LTCC 층을 포함하는 마이크로 칩에 관한 것으로, 여기서 반응 챔버가 시료 탑재를 위해 복수의 상부 층에 형성되어 있다. 히터가 상기 반응 챔버 하부에 있는 층들 중 적어도 하나에 내장되고, 온도 센서가 상기 히터와 상기 반응 챔버 사이에 있는 층들 중 적어도 하나에 내장되어, 시료를 분석한다. 상기 온도 센서는 칩 외부에 위치하여, 상기 칩 온도를 측정할 수도 있다.

Description

마이크로 칩{MICRO CHIP}

저온 동시 소성 세라믹(LTCC)으로 형성된 복수의 층을 포함하는 마이크로 PCR(중합효소 연쇄반응) 칩에 관한 것이다. 또한 본 발명은 일회용 LTCC 마이크로 PCR 칩을 가지는 휴대용 실시간 PCR 소자를 제공한다.

최근에 분자 및 세포 생물학 분야의 발전이 이루어졌는데, 신속하고 효율적인 분석 기법 개발의 결과 때문이다. 미세화 및 복합화로 인해, 유전자 칩 또는 바이오칩 기술은 하나의 실험 조작 만으로도 게놈의 완전한 규명을 가능하게 한다. PCR은 분자생물학 기술의 하나로, 핵산 분자를 생체 내에서 증폭시키는 것이다. 상기 PCR 기술은 법의학, 환경, 임상 및 산업 시료 내의 생물종 및 병원균 식별을 위한 시간 소모적이고 민감도가 떨어지는 타 기술들을 급속하게 대체하고 있다.

바이오 기술 중에서, 수많은 분자 및 임상 진단을 위해서 PCR은 생명과학 실험실에서 가장 중요한 분석 단계가 되었다. 실시간 PCR 같은 PCR 기술에서의 중대한 발전으로 기존 기술에 비해 신속한 반응 공정으로 이어졌다. 과거 수년 동안, 미세 제작 기술은 분석 시간과 시약 소모를 더욱 줄이려는 목적에서 PCR 분석 등의 반응 및 분석 시스템의 소형화로 확대되었다.

여러 연구단체들이 랩 온 어 칩(lab-on-a-chip) 소자를 연구해 왔으며, 소형화된 분리 및 반응 시스템 분야에서 여러가지 개선을 보여왔다.

현재 입수 가능한 대부분의 PCR에서, 시료, 용기, 순환기 열용량 때문에 즉각적인 온도 변화가 가능하지 않으며, 증폭 시간을 2 내지 6 시간으로 늘리게 된다. 시료 온도가 하나의 온도에서 다른 온도로 전환되는 시간 동안에, 중요한 시약을 소모하고 원하지 않는 방해 화합물을 형성하는 등, 이질적이고 바람직하지 않은 반응이 일어나게 된다.

본 발명의 목적은 보다 빠른 PCR 성능을 갖는 마이크로 칩을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 개선된 마이크로 칩을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 주된 목적 중 하나는 복수의 LTCC 층을 포함하는 마이크로 칩을 개발하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 마이크로 칩을 가공하는 방법을 개발하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로 칩을 포함하는 마이크로 PCR 소자를 개발하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로 PCR 소자를 사용하여 질병 상태를 진단하는 방법을 개발하는 데에 있다.

본 발명은 저온 동시 소성 세라믹(LTCC)으로 형성된 복수의 층을 포함하는 마이크로 칩, 여기서 반응 챔버가 시료 탑재를 위해 복수의 반응 챔버 층에 형성되고, 전도체가 상기 반응 챔버 하부에 있는 적어도 하나의 전도체 층에 내장되고, 히터가 상기 전도체 층 하부에 있는 적어도 하나의 히터 층에 내장되어 있다; 하기 단계를 포함하는 마이크로 칩을 가공하는 방법: (a) 저온 동시 소성 세라믹(LTCC)으로 만들어지고, 반응 챔버를 형성하기 위한 웰(well)을 가지는 복수의 층을 배열하는 단계, (b) 히터를 포함하는 하나 이상의 LTCC 층을 상기 챔버 하부에 위치시키는 단계, (c) 하나 또는 복수의 전도체 층(들)을 상기 히터와 반응 챔버 사이에 위치시키는 단계, 및 (d) 상기 층들을 서로 연결시켜 상기 마이크로 칩을 형성하는 단계; 하기를 포함하는 마이크로 PCR 소자: (a) 복수의 LTCC 층을 포함하는 마이크로 칩, 여기서 반응 챔버가 시료 탑재를 위해 복수의 층에 형성되고, 전도체가 상기 반응 챔버 하부에 있는 적어도 하나의 전도체 층에 내장되고, 히터가 상기 전도체 층 하부에 있는 적어도 하나의 히터 층에 내장되어 있다; (b) 상기 마이크로 칩에 내장되거나, 상기 칩 외부에 위치하여 칩 온도를 측정하는 온도 센서, (c) 상기 온도 센서 입력을 기초로 상기 히터를 제어하는 조절 회로; 및 (d) 시료로부터 형광 신호를 검출하는 광학 시스템; 및 마이크로 PCR 소자를 이용하여 시료 내 분석물을 검출하거나 질병 상태를 진단하는 방법, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 핵산을 포함하는 시료를 복수의 LTCC 층으로 이루어진 마이크로 칩 상에 탑재하는 단계, (b) 상기 마이크로 PCR 소자를 이용해서 상기 핵산을 증폭시키는 단계, 및 (c) 상기 증폭된 핵산의 형광 판독에 기초하여 분석물의 존부를 결정하거나, 또는 상기 증폭된 핵산의 형광 판독에 기초하여 병원균의 존부를 결정하여, 상기 질병 상태를 진단하는 단계,를 제공한다.

본 발명은 여기에 첨부된 도면들을 참조하여 설명될 것이다.
도 1는 상기 LTCC 마이크로 PCR 칩의 일실시예의 투시도이다.
도 2은 상기 LTCC 마이크로 PCR 칩의 일실시예의 단면도이다.
도 3는 상기 LTCC 마이크로 PCR 칩의 일실시예의 층상구조 디자인이다.
도 4은 히터 및 온도 센서를 제어하는 회로에 대한 하나의 블록도이다.
도 5는 제작된 상기 칩 반응 챔버 디자인의 하나의 모형이다.
도 6은 휴대용 장치에 의해 제어된, 통합형 히터/서미스터를 사용하는 칩 상에서 λ-636 DNA 단편의 융해를 보여준다.
도 7는 칩에서의 λ-3 11DNA 단편의 PCR 증폭을 보여준다. (a) 칩으로부터의 실시간 형광 신호; (b) 증폭 산물 확인 겔 이미지.
도 8은 살모넬라 16S 리보좀 단위에 대한 가공 혈액 및 혈장 PCR 증폭의 겔 이미지를 보여준다.
도 9은 살모넬라 16S 리보좀 단위에 대한 다이렉트 혈액 PCR 증폭의 겔 이미지를 보여준다.
도 10는 살모넬라 16S 리보좀 단위에 대한 다이렉트 혈장 PCR 증폭의 겔 이미지를 보여준다.
도 11은 마이크로 칩을 이용하여 살모넬라 유전자의 PCR 증폭을 보여준다. (a) 칩으로부터의 실시간 형광 신호; (b) 증폭 산물 확인 겔 이미지.
도 12는 LTCC 칩을 사용해서 B형 간염 바이러스 DNA를 증폭시키는 데 소용된 시간을 보여준다.
도 13은 λ-3 11 DNA의 융해에 대한 미분 형광신호(derivative of the fluorescence signal)에 대해서 LTCC 칩을 이용하여 수득된 융해 곡선을 보여준다.

본 발명은 저온 동시 소성 세라믹(LTCC, low temperature co-fired ceramics)으로 형성된 복수의 층을 포함하는 마이크로 칩에 관한 것으로, 여기서 반응 챔버가 시료 탑재를 위해 복수의 반응 챔버 층에 형성되고, 전도체가 상기 반응 챔버 하부에 있는 적어도 하나의 전도체 층에 내장되고, 히터가 상기 전도체 층 하부에 있는 적어도 하나의 히터 층에 내장되어 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 반응 챔버는 투명한 씰링 캡으로 덮여 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 칩은 온도 센서를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 온도 센서는 상기 칩의 적어도 하나의 층에 내장되어 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 온도 센서는 서미스터(thermistor)이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 칩은 외부 제어 회로를 상기 온도 센서와 히터에 연결하기 위해 접촉 패드를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 온도 센서는 상기 칩의 외부에 위치해서, 상기 칩의 온도를 측정한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 반응 챔버는 전도체 고리에 의해 둘러싸여 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 전도체 고리는 포스트(post)에 의해 상기 전도체 층에 연결된다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 전도체는 금, 은, 백금 및 팔라디움 또는 그들의 합금을 포함하는 그룹으로부터 선택된 물질로 이루어져 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 반응 챔버 기저부와 히터 사이에 간격이 있으며, 상기 간격은 약 0.2mm 내지 0.7mm이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 시료는 식품이나, 혈액, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 가래 및 뇨를 포함하는 그룹으로부터 선택된 생체 시료이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 반응 챔버는 약 1 ㎕ 내지 25㎕의 부피를 갖는다.

또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 마이크로 칩을 가공하는 방법에 관한 것이다:

a) 저온 동시 소성 세라믹(LTCC)으로 만들어지고, 반응 챔버를 형성하기 위한 웰(well)을 가지는 복수의 층을 배열하는 단계,

b) 히터를 포함하는 하나 이상의 LTCC 층을 상기 챔버 하부에 위치시키는 단계,

c) 하나 또는 복수의 전도체 층(들)을 상기 히터와 반응 챔버 사이에 위치시키는 단계, 및

d) 상기 층들을 서로 연결시켜 상기 마이크로 칩을 형성하는 단계.

본 발명의 일 실시예에서, 온도 센서를 포함하는 하나 이상의 LTCC 층을 상기 히터와 반응 챔버 사이 또는 상기 히터 하부에 위치시킨다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 챔버는 전도체 고리에 의해 둘러싸여 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 전도체 고리를 상기 전도체 층에 연결하기 위한 포스트(post)를 제공한다.

또한 하기를 포함하는 마이크로 PCR 소자에 관한 것이다:

a) 복수의 LTCC 층을 포함하는 마이크로 칩, 여기서 반응 챔버가 시료 탑재를 위해 복수의 층에 형성되고, 전도체가 상기 반응 챔버 하부에 있는 적어도 하나의 전도체 층에 내장되고, 히터가 상기 전도체 층 하부에 있는 적어도 하나의 히터 층에 내장되어 있다;

b) 상기 마이크로 칩에 내장되거나, 상기 칩 외부에 위치하여 칩 온도를 측정하는 온도 센서,

c) 상기 온도 센서 입력을 기초로 상기 히터를 제어하는 조절 회로; 및

d) 시료로부터 형광 신호를 검출하는 광학 시스템.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 소자는 휴대용 소자이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 소자는 휴대 가능한 전산 플랫폼으로 제어된다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 소자는 어레이 형태로 배열되어 다중 PCR를 수행한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 마이크로 칩은 상기 소자로부터 탈착 가능하다.

또한 마이크로 PCR 소자를 이용하여 시료 내 분석물을 검출하거나 질병 상태를 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 핵산을 포함하는 시료를 복수의 LTCC 층으로 이루어진 마이크로 칩 상에 탑재하는 단계,

b) 상기 마이크로 PCR 소자를 작동시켜서 상기 핵산을 증폭시키는 단계, 및

c) 상기 증폭된 핵산의 형광 판독에 기초하여 분석물의 존부를 결정하거나, 또는 상기 증폭된 핵산의 형광 판독에 기초하여 병원균의 존부를 결정하여, 상기 질병 상태를 진단하는 단계.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 방법은 상기 증폭 산물에 대한 정성분석과 정량분석 모두를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 시료는 식품이나 생체 시료이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 생체 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 가래 및 뇨를 포함하는 그룹으로부터 선택된 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 병원균은 바이러스, 박테리아, 균류, 효모 및 원생동물을 포함하는 그룹으로부터 선택된 것이다.

여기서 용어 '반응 챔버 층'은 반응 챔버 형성에 관여하고, 시료와 접하게 되는 마이크로 칩의 임의의 층을 의미한다.

여기서 용어 '전도체 층'은 내부에 내장된 전도체를 갖는 마이크로 칩의 임의의 층을 의미한다.

여기서 용어 '히터 층'은 내부에 내장된 히터를 갖는 마이크로 칩의 임의의 층을 의미한다.

중합효소 연쇄반응(PCR)이란, 주형으로부터 복수 사본의 특정한 DNA 단편을 합성하기 위해서 발견된 기술이다. 원래의 PCR 공정은 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq)에서 얻은 내열성 DNA 중합효소에 기초하는데, 이것은 네 개의 DNA 염기와 표적서열의 끝에 붙는 두 개의 프라이머 DNA 단편을 함유하는 혼합물 속에서 주어진 DNA 가닥에 상보적인 가닥을 만들어 내는 것이다. 상기 혼합물이 가열되어 표적서열을 포함하는 이중나선 DNA 가닥을 분리시킨 다음, 냉각되어 상기 프라이머들이 상기 분리된 가닥들 위에서 그들과 상보적인 서열을 찾아서 결합할 수 있게 하고, 상기 Taq 중합효소가 상기 프라이머를 새로운 상보적 가닥으로 신장시킨다. 가열과 냉각 순환 과정이 반복되면서 상기 표적 DNA를 기하급수적으로 만들어 내는데, 각각의 새로운 이중가닥이 분리하여 다음 합성과정에서 두 개의 주형으로 되기 때문이다.

중합효소 연쇄반응의 일반적인 온도 프로파일은 다음과 같다:

1. 93℃에서 15~30초간 변성(Denaturation)

2. 55℃에서 15~30초간 어닐링(Annealing)

3. 72℃에서 30~60초간 프라이머 신장(Extending)

하나의 예로서, 첫 단계에서는, 용액이 90-95℃로 가열되어, 이중가닥의 주형이 융해("변성")되고 두 개의 단일가닥을 형성하게 된다. 다음 단계에서는, 그것을 50-55℃ 로 냉각시켜, 짧고 특정하게 합성된 DNA 단편("프라이머")이 상기 주형 중에서 적당히 상보적인 부분에 결합한다("어닐링"). 마지막으로, 상기 용액을 72℃로 가열시켜, 특정 효소("DNA 중합효소")가 상기 용액으로부터 상보적인 염기를 결합시킴으로써 상기 프라이머를 신장시킨다. 이에 따라 하나의 이중가닥으로부터 두 개의 동일한 이중가닥이 합성되는 것이다.

상기 프라이머 신장 단계는 대략 60초/kbase로, 이삼백 염기보다 긴 생성물을 만들 수 있어야 한다. 상기는 일반적인 장비의 시간이다; 실제로는 상기 변성 및 어닐링 단계는 거의 순식간에 일어나지만, 금속 블록이나 물이 열적 평형에 사용되고 시료가 플라스틱 마이크로 원심분리 튜브에 담지되어 있을 때에는, 상업용 장비에서의 온도 속도는 보통 I⁰C /sec 미만이다.

열적으로 단절된, 저중량 PCR 챔버를 미세가공시킴으로써; 훨씬 더 빠르고, 에너지 효율이 높고, 더욱 특이적인 PCR 장비를 대량생산해 낼 수 있다. 더욱이, 어떤 하나의 온도에서 다른 온도로 빠르게 전환하기 때문에 시료가 최소한의 시간 동안만 원치 않는 온도에 머무르게 되어, 증폭된 DNA가 가장 정확하고 순도를 가질 수 있게 된다.

저온 동시소성 세라믹(LTCC)이란, 자동차, 방위, 우주, 통신 산업용 전자부품의 포장에 사용하는 후막 필름 기술의 현대적인 버젼이다. 화학적으로 불활성이고, 생체 적합성을 갖고, 열적으로 안정한(>600℃), 알루미나 기반의 유리 세라믹 재료로서, 낮은 열 전도성(<3W/mK)과, 우수한 기계 강도를 가지며, 우수한 에르미트성(hermiticity)을 제공한다.

기존에는 패키징 칩 수준의 전자 소자들에 사용되면서, 구조적이면서 전기적인 역할을 모두 수행해왔다. 본 발명자들은 LTCC가 마이크로 PCR 칩 용도에 사용하기에 적절하다는 사실을 알게 되었으며, LTCC가 그러한 목적으로 사용된 적이 없다는 사실이 최대의 발견이었다.

LTCC 기술에서 기재 기판으로는 중합체 바인더를 갖는 유리 세라믹 재료의 비소성(unfired)(그린) 층들이 바람직하다. 구조적인 특징은 상기 층들을 절단/펀칭/드릴하고, 복수 층을 적층시켜서 형성된다. 이러한 층상구조 공정은 MEMS(Micro Electro Mechanical Systems, 마이크로 전자 기계 시스템)에 필수적인 삼차원 특성을 형성시킬 수 있다. 50 마이크론 이하 특성이 LTCC 상에 쉽게 구현될 수 있다. 스크린 인쇄 전도성 저항 페이스트를 각 층 상에 처리하는 것에 의해 전기 회로가 제작된다. 복수의 층은 이들을 가로질러 펀칭하고, 전도성 페이스트를 채움으로써 상호 연결된다. 이 층들이 적층되고, 압착되고 소성된다. 80 층에 이르는 적층이 문헌 1에 기록된 바 있다. 이렇게 소성된 재료는 밀도가 높고 기계 강도가 우수하다.

일반적으로 PCR 산물은 겔 전기영동을 이용해서 분석된다. 이 기술에서, PCR 후의 DNA 단편이 전기장에서 분리되고, 형광 염료 염색으로 관찰된다. 더욱 적절한 방법은, 이중가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염료를 사용하여, 반응을 계속해서 모니터하는 것이다 (실시간 PCR). 상기 염료의 예로는 DNA에 결합되었을 때 490nm 청색 광에서 여기되고, 520nm 녹색 광을 방출하는 SYBR GREEN가 있다. 형광 세기는 PCR 과정에서 형성된 이중가닥 생성물 DNA 양에 비례하는데, 이에 따라 사이클 수에 따라 증가하게 된다.

도 1은 반응 챔버(11) 또는 웰을 표시하는 마이크로 PCR 칩의 일실시예에 따른 투시도이며, LTCC 마이크로 PCR 칩 내부에 히터(11)와 온도 센서 서미스터(13)의 어셈블리를 보여준다. 히터 전도체 선(15)과 서미스터 전도체 선(14) 또한 표시되어 있다. 이들 전도체 선들은 상기 칩 속에 구비된 히터와 서미스터가 외부 회로망과 연결할 수 있게 할 것이다.

도 2는 LTCC 마이크로 PCR 칩의 일실시예에 따른 단면도를 보여주는데, 여기서 (16a & 16b)는 히터(12) 접촉 패드를 나타내고, (17a & 17b)는 서미스터(13) 접촉 패드를 나타낸다.

도 3는 LTCC 마이크로 PCR 칩의 일실시예에 따른 층상구조 디자인를 보여주는데, 여기서 상기 칩은 12 층의 LTCC 테이프로 이루어진다. 2개의 기저층(31), 히터층(32), 전도체층(33)과 서미스터 함유층(34)으로 된 3개의 중간층, 여기서 (35)는 반응 챔버(11)에 대한 인터페이스층을 형성한다. 보이는 것처럼 반응 챔버층(36)은 6개 층으로 이루어진다. 또한 상기 전도체층(33)은 상기 히터층과 서미스터 층 사이에 구비된다. 히터 전도체 선(33)과 서미스터 전도체 선(32) 또한 표시되어 있다. 도면에서는 상기 전도체 선(32)이 서미스터 층(34)의 일 측면에 위치하고 있다. 히터 디자인은 0.2mm x 3mm 내지 2mm x 2mm의 다양한 사이즈를 가지면서 "사다리", "곡선", "선", "평판" 등 어떠한 모양이어도 무방하다. 히터의 사이즈와 모양은 요구에 따라 선택 가능하다. 상기 요구는 반응 챔버 또는 시험 시료 사이즈 또는 전도체층으로 사용된 재료에 의존하는 것들일 수 있을 것이다.

도 3은 포장된 제작 칩의 일실시예에 대한 층 확대 디자인 및 이미지를 보여주는데, 상기 LTCC 칩은 1~25㎕의 웰 부피 및 약 50%의 저항 변이(히터 및 서미스터)를 갖는다. 히터 저항값(~40Ω)과 서미스터 저항값(-1050Ω)은 예측치와 일치했다. 상기 히터는 기존의 LTCC 패키지에 사용되는 후막 필름 요소에 기반을 두고 있다. 알루미나로 된 상기 서미스터 시스템은 내장형 온도 센서 제작에 사용된다. 상기 칩의 측정된 TCR은 1 및 2 Ω/℃이었다. 상기 칩은 DuPont사의 95 1 그린 시스템 상에 가공되었다. 상기 서미스터 층은 상기 칩 내 어떤 위치에도 놓일 수 있으며, 온도 센서가 칩 내부 서미스터 대신에 칩 외부에 놓일 수도 있다.

도 4을 참조하면, 히터와 서미스터를 제어하는 회로에 대한 일실시예의 블록도로, 여기서 상기 LTCC 마이크로 PCR 칩(10) 내의 서미스터는 브릿지(46)에서 하나의 암으로서 작용한다. 브릿지 증폭기(41)로부터 브릿지의 증폭된 출력이 PID 컨트롤러(43)에 입력으로 제공되는데, 디지털화되고 PID 알고리즘은 조절된 디지털 출력을 공급한다. 상기 출력은 다시 아날로그 전압으로 재전환되고, 히터 드라이버(46)에 있는 전력 트랜지스터를 이용해서 히터를 구동시킨다. 또한, 실리콘 가공에 비해서, LTCC 가공이 더 저렴하다.

본 발명은 또한 기존의 PCR 시스템의 분석 시간, 시료 부피, 분석 및 정량화 수행 효능 측면을 개선하고자 한다. 이는 하기를 포함하는 휴대용 마이크로 PCR 소자에 의해서, PCR 산물의 실시간 현장 검출/정량화로 달성된다:

■투명 씰링 캡을 가진, 반응 챔버(들), 내장형 히터 및 온도 센서로 이루어진 일회용 PCR 칩.

■ 하기 단위체로 이루어진 휴대용 전자 장치

o 히터 및 온도 센서에 대한 제어 회로.

o 형광 광 검출 시스템.

■ 프로그램을 구동시켜서 휴대용 장치를 제어하는 스마트폰 또는 PDA(개인 디지털 보조기).

상기 일회용 PCR 칩은 내장된 히터에 의해 가열되고, 내장된 서미스터에 의해 모니터되는 반응 챔버로 이루어진다. 저온 동시소성 세라믹(LTCC) 시스템 상에서 제작되고, 히터 및 온도 센서와 접촉되는 연결기로 적당히 포장된다.

상기 내장된 히터는 LTCC에 적합성을 갖는 듀퐁 사의 CF 시리즈와 같은 저항 페이스트로 형성된다. DuPont 95, ESL (4IXXX 시리즈), Ferro (A6 시리즈) 또는 Haraeus와 같은 임의의 그린 세라믹 테이트 시스템이 이용될 수 있다. 상기 내장된 온도 센서는 알루미나 기판용으로는 PTC(양성 온도 계수, Positive Temperature Coefficient) 저항 서미스터 페이스트 (예: 509X D, 는 ESL Electroscience 사의 ESL 2612임) 제작된 서미스터이다. EMCA Remex 사의 NTC 4993 등 저항 페이스트의 NTC: 음성 온도 계수(Negative Temperature Coefficient) 또한 사용될 수 있다.

투명(300 ~ 1000nm 파장) 씰링 캡은 상기 반응 챔버로부터 시료의 증발을 막기 위한 것으로, 폴리머로 이루어져 있다.

상기 제어 회로는 온/오프 또는 PID(Proportional Integral Derivative; 비례 적분 미분) 제어 회로로 이루어지는데, 내장된 서미스터가 그 일부를 형성하는 브릿지 회로로부터의 출력에 기초해서 상기 히터를 제어한다. 여기에 언급된 히터를 제어하고 서미스터 값을 판독하는 방법은 단지 하나의 예시에 불과하다. 컨트롤러에 대한 유일한 방식이나 제한을 위한 것으로 간주되어서는 안 된다. 히터를 제어하고 서미스터 수치를 판독하기 위한 기타 수단들 및 방법이 본 개시물에 적극적으로 적용 가능하다.

형광 광 검출 시스템은 LED(발광 다이오드) 여기 소스(excitation source)와 광다이오드에서 검출된 형광을 포함하여 이루어진다. 상기 시스템은 광섬유를 보유해서 빛을 시료 위에 투사시키는 데 이용한다. 또한 광섬유는 빛을 상기 광다이오드 상에 보내는 데에 이용한다. 상기 LED 및 광다이오드는 적절한 대역통과필터를 통해서 광섬유에 커플링된다. 광검출기에서의 출력신호를 정확하게 측정하려면 매우 우수한 노이즈 대비 신호 비율을 갖는 회로가 요구된다. 여기에 언급된 형광 검출 시스템은 단지 하나의 예시에 불과하다. 검출에 대한 유일한 방식이나 제한을 위한 것으로 간주되어서는 안 된다. 어떠한 형광 검출기라도 시료 상에 투사시킬 수 없는 것이 아니라면 적용 가능하다.

본 발명은 특정한 진단 목적을 위해 시장성이 좋은 휴대용 PCR 소자를 제공한다. PDA는 실시간 검출과 소프트웨어 제어 기능을 보유한 완전한 휴대용 PCR 시스템을 제공하도록 구동하는 제어 소프트웨어를 갖는다.

열량을 줄이고, 상기 소자를 이용하여 개선된 가열/냉각 속도에 의해서, 30~40-사이클 반응, 심지어 5-25 ㎕의 중간 정도 시료부피,을 종료하는 데에 2~3 시간 소요되던 시간이 30분 미만으로 줄었다. 도 14는 B형 간염 바이러스 DNA를 본 발명에 의한 LTCC 칩을 사용해서 증폭시키는 데 소용된 시간을 보여준다. 45 사이클 동안 PCR이 진행되었으며, 도 14의 (1)에 나타난 것처럼, 증폭을 45분 이내에 달성할 수 있었다. 또한, 20분(2) 및 15분(3) 만에 45 사이클 동안 PCR이 진행될 때에도 증폭이 관찰되었다. 기존의 HBV (45 사이클)에 대한 PCR 시간은 약 2 시간 소요된다.

소형화로 인해 보다 작은 시료 사이즈와 고가의 시료를 덜 소비하면서도 정확하게 판독할 수 있다. 마이크로 시스템의 작은 열량과 작은 시료 사이즈로 인해, 마이크로 PCR을 통해서 DNA 복제 등 다수의 공정 속도를 올리면서, 신속한 저-전력 열적 순환㎕이 가능하다. 또한, 표면 화학(surface chemistry)에 의존하는 화학 공정들이 마이크로-규모에서 얻을 수 있는 부피 대비 표면 비율이 커짐에 따라 촉진된다. 마이크로 유체들의 장점은 화학 분석을 위해서 집적된 마이크로 시스템에 대한 개발 요구를 불러왔다.

마이크로 칩은 휴대용 소자(109)로 번역되었고, 따라서 복잡한 실험실로부터 PCR 기계를 없애고, 임상 진단, 식품 테스트, 혈액 은행의 혈액 스크리닝 또는 기타 다수의 적용분야에서, 이렇게 엄청나게 강력한 기술에 빈번하게 도달하게 되었다.

복수의 반응 챔버를 갖는 현존하는 PCR 장비들은 모두 같은 열적 프로토콜이 구동되는 복수의 DNA 실험 부위를 제공하고, 이에 따라 시간 효율이 좋지 않다. 반응시간과 흡수 시료부피를 최소화할 필요가 있다. 본 PCR은 매우 짧은 열적 반응과 인접 PCR 칩과 상당히 단절된 소자 어레이를 가짐으로써, 상이한 열적 프로토콜을 가진 복수의 반응을 최소한의 크로스토크(cross talk)로 효과적이고 독립적으로 구동할 수 있게 될 것이다.

PCR 산물의 분석이나 정량화는 실시간 형광 검출 시스템을 실질적으로 통합함으로써 구현된다. 이러한 시스템이 정량 및 감지 시스템과 통합되어서, B형 간염(도 12), AIDS, 결핵 등의 질병을 탐지할 수도 있다. 또 다른 시장에는 식품 감시, DNA 분석, 법의학 및 환경 감시 분야가 있다.

상기 칩 내에 균일한 온도 프로파일을 결정한 후, PCR 반응이 이들 칩 상에서 수행되었다. λ DNA 단편, 살모넬라 DNA 및 B형 간염 DNA가 이들 칩을 사용하여 성공적으로 증폭되었다. 도 5는 3차원 도시로 마이크로 칩을 보여주는데, 히터, 전도체 고리, 서미스터, 및 전도성 고리(52)와의 다양한 연결형태를 보여주고 있다. 또한 상기 전도체 고리(52)를 상기 전도체 판(33)에 연결시키는 포스트(post)(51)를 보여주고 있다.

도 6은 통합형 히터와 서미스터를 사용하는 칩 상에서 λ-636 DNA 단편의 융해에 대한 비교 플롯을 보여준다.

도 7는 λ-3 11DNA 증폭에 관련된 형광 신호가 증가하는 것을 보여준다. 열적 프로파일은 휴대용 장치에 의해 조절되고, 반응은 칩 상에서 수행되었다(3㎕ 반응 혼합물 및 6㎕ 오일). 기존의 락인 앰프를 사용해서 형광을 모니터하였다.

본 발명은 또한 진단 시스템을 제공한다. 본 진단 시스템 개발에 사용된 절차는 초기에는 몇 가지 문제에 대한 열적 프로토콜을 표준화하고, 칩 상에서 작용하게 하는 것이었다. 16S 리보좀 DNA 용으로 고안된 프라이머들은 대장균(E. coli)과 살모넬라(Salmonella)로부터 ~ 300 - 400 bp 단편을 증폭시킨 반면, stn 유전자 용 프라이머들은 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)로부터 ~ 200 bp 단편을 증폭시켰다. 수득된 산물들은 SYBR 그린 형광 검출뿐만 아니라 아가로오스 겔 전기영동에 의해 확인되었다. 도 7 및 도 11은 마이크로 칩을 이용하여 증폭된 λ-3 11DNA 와 살모넬라 유전자의 겔 사진을 보여준다.

λ-3 11DNA 증폭에 대한 열적 프로파일:

변성(Denaturation): 94℃ (90s)

94℃ (30s) - 500C (30s) - 72℃ (45s)

신장(Extension): 72℃ (120s)

살모넬라(Salmonella ) 유전자 증폭에 대한 열적 프로파일:

변성(Denaturation): 94℃ (90s)

94℃ (30s) - 55℃ (30s) - 72℃ (30s)

신장(Extension): 72℃ (300s)

가공 혈액 및 혈장으로 PCR

혈액 또는 혈장을 이들 시료에서 주된 PCR 방해물질을 침전시키는 침전제로 처리시켰다. 깨끗한 상층액을 주형으로 사용했다. 본 프로토콜을 사용해서, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)의 ~200bp 단편에 대해 증폭이 실시되었다(도 8). 도 8에서, 겔 전기영동 이미지를 보여준다.

1. 컨트롤 반응,

2. PCT 산물- 미가공 혈액,

3. PCR 산물- 가공 혈액,

4. PCR 산물- 가공 혈장

혈액 다이렉트 PCR 완충액

다이렉트 PCR 용 고유 완충액(unique buffer)을 혈액 또는 혈장 시료로 제조하였다. 본 고유 완충액 시스템을 사용해서, 혈액&혈장으로 다이렉트 PCR 증폭을 달성했다. 본 완충액 시스템으로, 본 발명의 LTCC 칩을 이용해서 증폭이 혈액은 50% & 혈장은 40%까지 얻어졌다 (도 9 및 10).

도 9에서, 겔 전기영동 이미지를 보여준다

1. PCR 산물-20% 혈액,

2. PCR 산물-30% 혈액,

3. PCR 산물-40% 혈액,

4. PCR 산물-50% 혈액; 및

도 10에서는, 겔 전기영동 이미지를 보여준다,

1. PCR 산물-20% 혈장,

2. PCR 산물-30% 혈장,

3. PCR 산물-40% 혈장,

4. PCR 산물-50% 혈장,

5. 컨트롤 반응

상기 고유 완충액은 완충염, 염소 또는 황산 함유 이가 이온, 비이온성 세제, 안정화제 및 당알코올을 포함한다.

도 13은 LTCC 칩의 융해 곡선을 보여주는데, λ-3 11 DNA의 융해에 대한 미분 형광신호(derivative of the fluorescence signal)에 대한 것이다. 본 도해는 또한 본 발명(131)과 기존의 PCR 소자(132)에 대한 비교를 제공한다.

더 날카로운 피크: 피크값/너비 (x 축) @ 반 피크값 = 1.2/43

더 얕은 피크: 피크값/너비 (x 축) @ 반 피크값 = 0.7/63

비율이 높을수록 더 날카로운 피크를 의미한다. 또한 그래프에서, y 축은 미분(융해곡선의 경사도)이고, 경사도가 높을수록 더 날카로운 융해를 의미한다.

Claims (28)

1. 하기를 포함하는 저온 동시 소성 세라믹(LTCC, low temperature co-fired ceramics) 층으로 형성된 마이크로 칩:
   a) 시료 탑재를 위해 복수의 층으로 형성된 반응 챔버,
   b) 상기 반응 챔버를 에워싸는 전도체 고리, 및
   c) 상기 전도체 고리에 열을 공급하기 위해서 적어도 하나의 층에 내장된 히터.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 히터는 상기 칩의 적어도 하나의 층에 내장된 상기 전도체 고리에 열을 공급하는, 마이크로 칩.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 전도체 고리는 전도체 층에 연결되어 있는, 마이크로 칩.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 칩은 상기 칩의 외부에 위치하거나, 상기 칩의 적어도 하나의 층에 내장된, 온도 센서를 포함하는, 마이크로 칩.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 칩은 외부 제어 회로를 온도 센서와 히터에 연결하기 위해 접촉 패드를 가지는, 마이크로 칩.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 챔버 기저부와 히터는 0.2mm 내지 0.7mm 범위인 간격을 가지는, 마이크로 칩.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 챔버는 1 ㎕ ~ 25㎕의 부피를 갖는, 마이크로 칩.
8. 하기 단계를 포함하는 마이크로 칩을 가공하는 방법:
   a) 저온 동시 소성 세라믹(LTCC)으로 만들어지고, 반응 챔버를 형성하기 위한 웰(well)을 가지는 복수의 층을 배열하는 단계, 여기서 상기 챔버는 전도체 고리로 둘러싸임,
   b) 히터를 포함하는 하나 이상의 LTCC 층을 상기 챔버 하부에 위치시키는 단계,
   c) 하나 또는 복수의 전도체 층(들)을 상기 히터와 반응 챔버 사이에 위치시키는 단계, 및
   d) 상기 층들을 서로 연결시켜 상기 마이크로 칩을 형성하는 단계.
9. 하기를 포함하는 마이크로 PCR 소자:
   a) 하기를 포함하는 LTCC 층으로 된 마이크로 칩: 시료 탑재를 위해 복수의 층으로 형성된 반응 챔버, 상기 반응 챔버를 에워싸는 전도체, 및 적어도 하나의 층에 내장되어서 열을 상기 전도체 고리에 공급하는 히터,
   b) 상기 마이크로 칩에 내장되거나, 상기 칩 외부에 위치하여 칩 온도를 측정하는 온도 센서,
   c) 상기 온도 센서 입력을 기초로 상기 히터를 제어하는 조절 회로; 및
   d) 시료로부터 형광 신호를 검출하는 광학 시스템.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 소자는 휴대용 소자이고, 상기 소자는 휴대 가능한 전산 플랫폼으로 제어되는, 마이크로 PCR 소자.
11. 제 9 항에 있어서, 상기 소자는 어레이 형태로 배열되어 다중 PCR를 수행하는, 마이크로 PCR 소자.
12. 제 9 항에 있어서, 상기 마이크로 칩은 상기 소자로부터 탈착 가능한, 마이크로 PCR 소자.
13. 하기 단계를 포함하는, 마이크로 PCR 소자를 이용하여 시료 내 분석물을 검출하는 방법:
    a) 핵산을 포함하는 시료를 전도체 고리에 의해 둘어싸인 반응 챔버 위에 탑재하고, 상기 마이크로 PCR 소자를 작동시켜서 상기 핵산을 증폭시키는 단계, 및
    b) 상기 증폭된 핵산의 형광 판독에 기초하여 분석물의 존부를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인, 방법.
15. 제 13 항에 있어서, 상기 방법은 상기 증폭 산물에 대한 정성분석과 정량분석 모두를 제공하는, 방법.
16. 제 2 항에 있어서, 상기 전도체는 상기 반응 챔버 하부에 배치된 적어도 하나의 층에 내장되는, 마이크로 칩.
    
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제

Images