KR101571038B1 - 휴대용 마이크로 ｐｃｒ 소자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히터, 시료를 탑재하는 반응 챔버를 포함하는 LTCC 마이크로 PCR 칩을 포함하는 휴대용 마이크로 PCR 소자에 관한 것이다. 또한 온도센서로부터 수신된 입력을 기초로 상기 히터를 조절하기 위한 히터 제어부를 더 포함한다. 또한, 시료로부터의 형광 신호를 탐지하기 위한 광섬유를 갖는 광학 시스템, 및 기타 소자(들)와 상호작용을 위한 적어도 하나의 통신 인터페이스를 더 포함한다.

Description

휴대용 마이크로 ＰＣＲ 소자{HAND HELD MICRO PCR DEVICE}

본 발명은 일회용 저온 동시소성 세라믹(low temperature co-fired ceramics, LTCC) 마이크로 PCR 칩을 포함하는 휴대 가능한 실시간 PCR 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 마이크로-PCR을 제어하고 모니터하기 위한 방법 및, PCR과 연관된 장치에 관한 것이다.

지난 5년간, 랩 온 어 칩(lab-on-a-chip) 기술에 기반을 둔 임상진단 시스템 연구 개발이 엄청나게 증가되어 왔다. 이러한 시스템은 임상 진단학에 대단한 미래를 보여주고 있다. 매우 적은 부피의 시료와 시약을 소비한다. 각각의 소형 칩들은 저렴하고 일회용이 가능하다. 샘플링부터 결과물 수득까지 걸리는 시간도 매우 짧은 경향이 있다. 현재 가장 발전된 칩 디자인을 가지고, 집적된 미세유동 회로 하나에서 모든 분석 기능들-샘플링, 시료 전처리; 분리, 희석, 혼합 단계들; 화학반응; 및 검출-을 수행할 수 있다. 랩온어칩 시스템으로 인해 고안자들은 높은 수준의 성능과 다기능을 발휘하는, 소형의, 휴대 가능하고, 튼튼하고, 저렴하고, 사용이 간편한 진단 장비들을 고안할 수 있게 되었다. 미세유동학-미세채널에 흐르는 유체가 큰 규모에서는 기능하지 않을 분석 장치와 어세이(assay) 포맷 디자인이 가능하게 할 수 있다.

랩온어칩 기술은 시료에 수행되는 실험실 공정을 미세가공 구조물(Microfabricated structure) 내에서 모방하려는 것이다. 가장 성공적인 소자는 유체 시료 상에서 작동하는 것들이었다. 수많은 화학 처리, 정제, 및 반응 공정들이 이러한 소자들 위에서 시연되어 왔다. 화학 측정 공정을 완전하게 수행하는 소자를 생산하기 위해 화학 공정들을 어느 정도 하나로 집적시킨 것이 언급되어 왔다. 이들 소자는 허용된 실험실 분석 공정에 기초하며, 따라서 기존의 화학 감지 보다 더 복잡한 시료 매트릭스를 수용할 수 있다.

최근에 분자 및 세포 생물학 분야의 광범위한 발전이 이루어져 왔는바, 신속하고 효율적인 분석 기법 개발의 결과 때문이다. 미세화 및 복합화로 인해, 유전자 칩 또는 바이오칩 기술은 하나의 실험 조작 만으로도 게놈의 완전한 규명을 가능하게 한다. PCR(중합효소 연쇄반응, Polymerase chain reaction)은 분자생물학 기술의 하나로, 핵산 분자를 생체 내에서 증폭시키는 것이다. 상기 PCR 기술은 법의학, 환경, 임상 및 산업 시료 내의 생물종 및 병원균 식별을 위한 시간 소모적이고 민감도가 떨어지는 타 기술들을 급속하게 대체하고 있다.

바이오 기술 중에서, 수많은 분자 및 임상 진단을 위해서 PCR은 생명과학 실험실에서 가장 중요한 분석 단계가 되었다. 실시간 PCR 같은 PCR 기술에서의 중대한 발전으로 기존 기술에 비해 신속한 반응 공정으로 이어졌다. 과거 수년 동안, 미세 제작 기술은 분석 시간과 시약 소모를 더욱 줄이려는 목적에서 PCR 분석 등의 반응 및 분석 시스템의 소형화로 확대되었다.

현재 입수 가능한 대부분의 PCR에서, 즉각적인 온도 변화는 시료, 용기, 순환기 열용량 때문에 가능하지 않으며, 증폭 시간을 2 내지 6 시간으로 늘리게 된다. 시료 온도가 하나의 온도에서 다른 온도로 전환되는 시간 동안에, 중요한 시약을 소모하고 원하지 않는 방해 화합물을 형성하는, 이질적이고 바람직하지 않은 반응이 일어나게 된다.

LTCC는 반도체 소자를 포장하는 데에 이용된다. 이 시스템은 전기적 및 구조적 기능을 합체 가능하게 한다. LTCC 가공 공정에 있어서 층상 구조 조직 시퀀스로 인해 집적된 전기적 요소들을 갖는 삼차원 구조를 쉽게 형성시킬 수 있다. 추가로, 실리콘 가공에 비해서 가공 비용이 저렴하다. 칩은 LTCC (저온 동시 소성 세라믹) 같은 세라믹 기판 상에서 가공되어, 기계 및 전기 요소들을 쉽고 저렴하게 집적시킬 수 있게 한다.

PDA 등의 휴대용 전산 플랫폼을 이용하면 상기 시스템에 충분한 전산력을 부여해서 전자제품들을 제어하고, 고가이지만 단순한 사용자 인터페이스를 제공해서 데이터를 디스플레이 할 수 있다. 또한 전체 시스템을 모듈로 만들어서, 사용자로 하여금 최소 비용으로 간편한 시스템 업그레이드화를 가능하게 한다.

본 발명의 주된 목적은 휴대용 마이크로 PCR 소자를 개발하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 휴대용 마이크로-PCR 소자를 모니터하고 제어하는 방법을 개발하는 것에 있다.

본 발명은 히터, 시료를 탑재하는 반응 챔버를 포함하는 LTCC 마이크로 PCR 칩, 온도 센서로부터 수신된 입력을 기반으로 상기 히터를 조절하기 위한 히터 제어부, 상기 시료로부터의 형광 신호를 검출하는 광 검출 시스템, 및 다른 소자와 상호작용하기 위한 적어도 하나의 통신 인터페이스 을 포함하는, 휴대용 마이크로 PCR 소자를 제공하며; 또한 휴대용 마이크로-PCR 소자를 모니터하고 제어하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은, 통신 인터페이스를 통해서 상기 휴대용 마이크로 PCR 소자와 기타 소자 간의 통신을 형성하는 단계, 상기 기타 소자로부터 수신된 열적 프로파일값에 기초하여 열 순환 공정을 개시하여, LTCC 마이크로 PCR 칩을 제어하는 단계, 및 광학 시스템에 의해 감지된 광학 신호를 상기 기타 소자로 송출하는 단계를 포함한다.

본 발명은 여기에 첨부된 도면들을 참조하여 설명될 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 LTCC 마이크로 PCR 소자의 일실시예의 개략도이다.
도 2는 상기 LTCC 마이크로 PCR 칩의 일실시예의 투시도이다.
도 3은 상기 LTCC 마이크로 PCR 칩의 일실시예의 단면도이다.
도 4는 상기 LTCC 마이크로 PCR 칩의 일실시예의 층상구조 디자인이다.
도 5는 제작된 상기 칩 반응 챔버 디자인의 하나의 모형이다.
도 6은 분기형 광섬유를 이용한 하나의 분기형 광검출 시스템이다.
도 7은 히터 및 온도 센서를 제어하는 회로에 대한 하나의 블록도이다.
도 8은 휴대용 장치에 의해 제어된, 통합형 히터/서미스터를 사용하는 칩 상에서 λ-636 DNA 단편의 융해를 보여준다.
도 9는 칩에서의 λ-3 11DNA 단편의 PCR 증폭을 보여준다. (a) 칩으로부터의 실시간 형광 신호; (b) 증폭 산물 확인 겔 이미지.
도 10은 살모넬라 16S 리보좀 단위에 대한 가공 혈액 및 혈장 PCR 증폭의 겔 이미지를 보여준다.
도 11은 살모넬라 16S 리보좀 단위에 대한 다이렉트 혈액 PCR 증폭의 겔 이미지를 보여준다.
도 12는 살모넬라 16S 리보좀 단위에 대한 다이렉트 혈장 PCR 증폭의 겔 이미지를 보여준다.
도 13은 마이크로 칩을 이용하여 살모넬라 유전자의 PCR 증폭을 보여준다. (a) 칩으로부터의 실시간 형광 신호; (b) 증폭 산물 확인 겔 이미지.
도 14는 LTCC 칩을 사용해서 B형 간염 바이러스 DNA를 증폭시키는 데 소용된 시간을 보여준다.
도 15는 PDA 어플리케이션과 휴대용 장치 간의 통신 방법 개요를 보여주고 있다.
도 16은 λ-3 11 DNA의 융해에 대한 미분 형광신호(derivative of the fluorescence signal)에 대해서 LTCC 칩을 이용하여 수득된 융해 곡선을 보여준다.
도 17은 PDA에서 구동하는 열적 순환 프로그램에 대한 흐름도를 보여준다.
도 18은 마이크로칩을 사용하여 증폭시킨 HBV DNA의 실시간 형광 신호를 보여준다.
도 19는 빔분리기를 사용하는 빔분리기 광 검출 시스템을 보여준다.
도 20은 하이브리드 광 검출 시스템을 보여준다.

본 발명은:

a) 히터, 시료 탑재용 반응 챔버를 포함하는 LTCC 마이크로 PCR 칩,

b) 온도 센서로부터 수신된 입력을 기반으로 상기 히터를 조절하기 위한 히터 제어부,

c) 상기 시료로부터의 형광 신호를 검출하는 광 검출 시스템, 및

d) 다른 소자와 상호작용하기 위한 적어도 하나의 통신 인터페이스를 포함하는, 휴대용 마이크로 PCR 소자에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 히터와 상기 반응 챔버 사이에는 적어도 하나의 전도체 층이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 반응 챔버는 전도체 고리에 의해 둘러싸여 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 전도체 고리는 포스트(post)에 의해 상기 전도체 층에 연결된다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 전도체는 금, 은, 백금 및 팔라디움 또는 그들의 합금을 포함하는 그룹으로부터 선택된 물질로 이루어져 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 온도 센서는 상기 칩의 외부에 위치해서, 상기 칩의 온도를 측정한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 온도 센서는 상기 칩의 적어도 하나의 층에 내장되어 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 온도 센서는 서미스터(thermistor)이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 온도 센서는 브릿지 회로의 하나의 암(arm)으로서 연결되어 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 브릿지 회로 출력은 그것을 상기 히터 제어부로 송급하기 전에 증폭되어 상기 히터를 조절한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 칩은 상기 반응 챔버를 덮기 위해서 투명한 씰링 캡을 포함하고 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 칩은 일회용이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 광 검출 시스템은 빔분리기 광 검출 시스템(beamsplitter optical detection system), 하이브리드 광 검출 시스템(hybrid optical detection system) 및 분기형 광 검출 시스템(bifurcated optical detection system)을 포함하여 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 광학 시스템은 광원과, 시료에서의 형광 신호를 검출하는 포토 검출기를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서, 락인(lock-in) 증폭기가 상기 검출된 신호를 증폭시킨다.

본 발명의 일 실시예에서, 분기형 광학 시스템은 하나의 분기 말단 (605a)에 놓인 광원을 갖는 분기형 광섬유와, 상기 광섬유의 다른 분기 말단(605a)에 놓인 광검출기를 이용한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 분기형 광섬유의 공통 말단(605b)은 상기 시료를 향해 가리키고 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이브리드 광 검출 시스템은 광섬유를 이용해서 빛을 시료 상에 향하게 한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이브리드 광 검출 시스템은 렌즈를 이용해서 시료에서 방출된 빔에 초점을 맞춘다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 통신 인터페이스는 시리얼, USB, 블루투스 또는 그들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되어진다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 기타 소자는 상기 칩 및 상기 휴대용 소자로부터의 증폭된 신호의 온도를 수집한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 기타 소자는 스마트폰, PDA 및 프로그래밍 가능한 소자를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

또한 본 발명은 휴대용 마이크로-PCR 소자를 모니터하고 제어하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:

a) 통신 인터페이스를 통해서 상기 휴대용 마이크로 PCR 소자와 기타 소자 간의 통신을 형성하는 단계,

b) 상기 기타 소자로부터 수신된 열적 프로파일값에 기초하여 열 순환 공정을 개시하여, LTCC 마이크로 PCR 칩을 제어하는 단계, 및

c) 광학 시스템에 의해 감지된 광학 신호를 상기 기타 소자로 송출하는 단계.

본 발명의 일 실시예에서, 사용자 인터페이스를 통해서 상기 열적 프로파일값을 상기 기타 소자로 사용자에 의해서 송출하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 사용자 인터페이스를 통한 열적 프로파일을 생성하고, 변형하거나 삭제하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 기타 소자는 상기 사용자 확인 절차를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 기타 소자는 복수의 열적 프로파일을 저장한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 열적 프로파일은 설정값 및 사이클 수를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 설정값에 의해 결정된 온도에서와 시간 동안 상기 칩을 유지시킨다.

본 발명의 일 실시예에서, 열적 순환 과정을 중지시킴으로써 상기 마이크로 PCR 칩 온도를 실온으로 가져온다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 열적 순환이 중단될 때 마이크로 PCR 칩 온도를 일정하게 유지시킨다.

본 발명의 일 실시예에서, 모바일 블루투스 시리얼 포트 프로파일 스택(stack)을 이용하여 상기 기타 소자와 통신한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 열 및 광 데이터를 상기 기타 소자의 디스플레이 장치에 플롯시킨다.

기타 소자(101)는 예를 들어 유선 기반(RS232 시리얼 포트, USB)이나 무선 (시리얼 포트 프로파일을 구현하는 블루투스) 등과 같은 임의의 표준 통신 인터페이스(107)를 통해서 상기 휴대용 소자와 상호작용할 수 있는 것들이다.

LTCC 마이크로 PCR 칩은 LTCC 층들로 형성된 PCR 칩이며, 상기 휴대용 소자에 쉽게 탈부착될 수 있다.

열적 프로파일은 설정값인 온도와 시간뿐만 아니라, 열적 순환 과정을 완료하기 위한 사이클 수에 대한 계수를 갖는다.

중합효소 연쇄반응(PCR)이란, 주형으로부터 복수 사본의 특정한 DNA 단편을 합성하기 위해서 발견된 기술이다. 원래의 PCR 공정은 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq)에서 얻은 내열성 DNA 중합효소에 기초하는데, 이것은 네 개의 DNA 염기와 표적서열의 끝에 붙는 두 개의 프라이머 DNA 단편을 함유하는 혼합물 속에서 주어진 DNA 가닥에 상보적인 가닥을 만들어 내는 것이다. 상기 혼합물이 가열되어 표적서열을 포함하는 이중나선 DNA 가닥을 분리시킨 다음, 냉각되어 상기 프라이머들이 상기 분리된 가닥들 위에서 그들과 상보적인 서열을 찾아서 결합할 수 있게 하고, 상기 Taq 중합효소가 상기 프라이머를 새로운 상보적 가닥으로 신장시킨다. 가열과 냉각 순환 과정이 반복되면서 상기 표적 DNA를 기하급수적으로 만들어 내는데, 각각의 새로운 이중가닥이 분리하여 다음 합성과정에서 두 개의 주형으로 되기 때문이다.

중합효소 연쇄반응의 일반적인 온도 프로파일은 다음과 같다:

1. 93℃에서 15~30초간 변성(Denaturation)

2. 55℃에서 15~30초간 어닐링(Annealing)

3. 72℃에서 30~60초간 프라이머 신장(Extending)

하나의 예로서, 첫 단계에서는, 용액이 90-95℃로 가열되어, 이중가닥의 주형이 융해("변성")되고 두 개의 단일가닥을 형성하게 된다. 다음 단계에서는, 그것을 50-55℃ 로 냉각시켜, 짧고 특정하게 합성된 DNA 단편("프라이머")이 상기 주형 중에서 적당히 상보적인 부분에 결합한다("어닐링"). 마지막으로, 상기 용액을 72℃로 가열시켜, 특정 효소("DNA 중합효소")가 상기 용액으로부터 상보적인 염기를 결합시킴으로써 상기 프라이머를 신장시킨다. 이에 따라 하나의 이중가닥으로부터 두 개의 동일한 이중가닥이 합성되는 것이다.

상기 프라이머 신장 단계는 대략 60초/kbase로, 이삼백 염기보다 긴 생성물을 만들 수 있어야 한다. 상기는 일반적인 장비의 시간이다; 실제로는 상기 변성 및 어닐링 단계는 거의 순식간에 일어나지만, 금속 블록이나 물이 열적 평형에 사용되고 시료가 플라스틱 마이크로 원심분리 튜브에 담지되어 있을 때에는, 상업용 장비에서의 온도 속도는 보통 I⁰C /sec 미만이다.

열적으로 단절된, 저중량 PCR 챔버를 미세가공시킴으로써; 훨씬 더 빠르고, 에너지 효율이 높고, 더욱 특이적인 PCR 장비를 대량생산해 낼 수 있다. 더욱이, 어떤 하나의 온도에서 다른 온도로 빠르게 전환하기 때문에 시료가 최소한의 시간 동안만 원치 않는 온도에 머무르게 되어, 증폭된 DNA가 가장 정확하고 순도를 가질 수 있게 된다.

저온 동시소성 세라믹(LTCC)이란, 자동차, 방위, 우주, 통신 산업용 전자부품의 포장에 사용하는 후막 필름 기술의 현대적인 버젼이다. 화학적으로 불활성이고, 생체 적합성을 갖고, 열적으로 안정한(>600℃), 알루미나 기반의 유리 세라믹 재료로서, 낮은 열 전도성(<3W/mK)과, 우수한 기계 강도를 가지며, 우수한 에르미트성(hermiticity)을 제공한다.

기존에는 패키징 칩 수준의 전자 소자들에 사용되면서, 구조적이면서 전기적인 역할을 모두 수행해왔다. 본 발명자들은 LTCC가 마이크로 PCR 칩 용도에 사용하기에 적절하다는 사실을 알게 되었으며, LTCC가 그러한 목적으로 사용된 적이 없다는 사실이 최대의 발견이었다.

LTCC 기술에서 기재 기판으로는 중합체 바인더를 갖는 유리 세라믹 재료의 비소성(unfired)(그린) 층들이 바람직하다. 구조적인 특징은 상기 층들을 절단/펀칭/드릴하고, 복수 층을 적층시켜서 형성된다. 이러한 층상구조 공정은 MEMS(Micro Electro Mechanical Systems, 마이크로 전자 기계 시스템)에 필수적인 삼차원 특성을 형성시킬 수 있다. 50 마이크론 이하 특성이 LTCC 상에 쉽게 구현될 수 있다. 스크린 인쇄 전도성 저항 페이스트를 각 층 상에 처리하는 것에 의해 전기 회로가 제작된다. 복수의 층은 이들을 가로질러 펀칭하고, 전도성 페이스트를 채움으로써 상호 연결된다. 이 층들이 적층되고, 압착되고 소성된다. 80 층에 이르는 적층이 문헌에 기록된 바 있다. 이렇게 소성된 재료는 밀도가 높고 기계 강도가 우수하다.

도 1은 다양한 구성 요소들과 그들의 기능을 보여주는, 마이크로 PCR 소자의 일실시예에 대한 개략도이다. 상기 소자는 열적 순환을 위해 내장된 히터 및 내장된 온도 센서와 함께 시료를 보유하기 위한 반응 챔버를 갖는 일회용 LTCC 마이크로 PCR 칩(103)을 포함한다. 상기 온도 센서는 서미스터(thermistor)이다. 또한 상기 온도 센서는 상기 칩 내부에 설치되는 대신 칩 외부에 위치할 수도 있다. 상기 온도 센서는 온도 측정이 가능한 임의의 센서이면 된다. 상기 LTCC 마이크로 PCR 칩(103)은, 상기 온도 센서 값에 기초하여 히터를 제어하는 히터 제어부와 드라이버 회로를 갖는 제어 회로망(102)을 포함하는 휴대용 전자 소자(109)에 접속되어 있다. 상기 온도 센서 값은 온도 감지 회로(107)를 통해서 상기 히터 제어부로 송급된다. 상기 히터 제어부는 상기 칩의 온도를 설정하고, 마이크로 컨트롤러(106)가 설정값으로 제공한 시간 동안 상기 온도를 유지한다. 상기 휴대용 소자(109) 위의 모든 요소는 배터리 팩(108)에 의해 작동된다.

또한 상기 휴대용 소자(109)는 상기 마이크로 PCR 칩(103)으로부터의 형광 신호 검출을 위해 광학 시스템(104)을 구비하고 있다. 이는 광원, 광원 제어용 회로, 시료에서 방출된 광을 감지하는 검출기, 신호(상기 시료로부터의) 증폭을 위한 회로를 포함하고 있다. 상기 휴대용 소자(109)는 USB/블루투스 내지 스마트폰/PDA 등의 기타 처리 소자(101) 또는 데이터 입수 및 제어를 위한 임의의 처리 소자와 접속될 것이다. 상기 배터리는 외부 소스로부터 자체적으로 재충전하도록 된 포트를 갖는 충전 가능형 배터리일 수 있다. 예를 들면, 상기 배터리는 IA를 초과하여 피크 전류를 공급할 수 있는 니켈 카드뮴, 리튬 이온 또는 폴리머 등일 수 있다.

또한 상기 휴대용 소자는 적어도 하나의 통신 인터페이스(107)를 포함하여, 상기 기타 소자(101)와 통신한다. 상기 통신 인터페이스(107)는 유선 기반(RS232 시리얼 포트, USB)이거나 무선 (시리얼 포트 프로파일을 구현하는 블루투스)일 수 있다. 일반적으로 시리얼 포트 프로파일은 그 속도와 실행 편의성 때문에 통신용으로 사용된다. 상기 인터페이스는 상기 기타 소자(101)와 마이크로 컨트롤러(106) 간의 데이터와 지시를 전달한다.

여기서 기타 소자(101)는 상기 휴대용 소자를 제어하고 모니터할 수 있는 것이다. 예를 들면, 상기 기타 소자는 PDA, 스마트폰, 컴퓨터, 마이크로 컨트롤러, 또는 상기 휴대용 소자와 통신 가능한 임의의 처리 소자일 수도 있다. 상기 기타 소자는 또한 사용자 인터페이스를 제공하여, 사용자에 의해서 데이터를 입력하고 가시화한다. 여기서 참조된 상기 기타 소자는 관련 소프트웨어 구동 능력을 가짐으로써, 상기 휴대용 소자(109)를 통신, 제어, 모니터한다.

마이크로 컨트롤러(106)는 상기 휴대용 소자(109) 상의 전자부품을 제어하고, 인터페이스를 통해서 상기 기타 소자(101)와 통신한다. 상기 마이크로 컨트롤러는 아날로그-디지털 및 디지털-아날로그 컨버터를 가지고, 아날로그 회로, 즉 제어 회로(102), 온도 감지 회로(107), 광학 회로(105)와 작용한다. 상기 마이크로 컨트롤러(106)는 상기 기타 소자로부터 설정값을 수집해서, 상기 제어 회로(102)에 제공한다. 상기 마이크로 컨트롤러는 또한 상기 온도 감지 회로(107)에 의해 감지된 온도와, 상기 광학 회로(105)에 의해 제공된 광학 데이터를 상기 기타 소자에 제공하기도 한다. 여기서 광학 데이터는 상기 광학 시스템(105)에 의해 검출된 신호를 말한다.

도 2는 반응 챔버(201) 또는 웰을 표시하는 마이크로 PCR 칩의 일실시예에 따른 투시도이며, LTCC 마이크로 PCR 칩 내부에 히터(201)와 온도 센서 서미스터(203)의 어셈블리를 보여준다. 히터 전도체 선(205)과 서미스터 전도체 선(204) 또한 표시되어 있다. 이들 전도체 선들은 상기 칩 속에 구비된 히터와 서미스터가 외부 회로망과 연결할 수 있게 할 것이다.

도 3은 LTCC 마이크로 PCR 칩의 일실시예에 따른 단면도를 보여주는데, 여기서 (206a & 206b)는 히터(202) 접촉 패드를 나타내고, (207a & 207b)는 서미스터(203) 접촉 패드를 나타낸다.

도 4는 LTCC 마이크로 PCR 칩의 일실시예에 따른 층상구조 디자인을 보여주는데, 여기서 상기 칩은 12 층의 LTCC 테이프로 이루어진다. 2개의 기저층(401), 히터층(402), 전도체층(403)과 서미스터 함유층(404)으로 된 3개의 중간층, 여기서 (405)는 반응 챔버(201)에 대한 인터페이스층을 형성한다. 보이는 것처럼 반응 챔버층(406)은 6개 층으로 이루어진다. 또한 상기 전도체층(403)은 상기 히터층과 서미스터 층 사이에 구비된다. 상기 히터 전도체 선(205)과 서미스터 전도체 선(204) 또한 표시되어 있다. 도면에서는 상기 전도체 선(204)이 서미스터 층(404)의 일 측면에 위치하고 있다. 히터 디자인은 0.2mm x 3mm 내지 2mm x 2mm의 다양한 사이즈를 가지면서 "사다리", "곡선", "선", "평판" 등 어떠한 모양이어도 무방하다. 히터의 사이즈와 모양은 요구에 따라 선택 가능하다. 상기 요구는 반응 챔버 또는 시험 시료 사이즈 또는 전도체층으로 사용된 재료에 의존하는 것들일 수 있을 것이다.

상기 LTCC 칩은 1~25㎕의 웰 부피를 갖는다. 상기 히터는 기존의 LTCC 패키지에서 채용된 후막 필름 저항성 요소에 기반을 두고 있다. 알루미나를 갖는 상기 서미스터 시스템은 내장된 온도 센서의 제작을 위해 사용된다. 상기 칩의 측정된 TCR은 1 및 2 Ω/℃이었다. 상기 칩은 DuPont사의 95 1 그린 시스템 상에 가공되었다. 상기 서미스터 층은 상기 칩 내 어떤 위치에도 놓일 수 있으며, 온도 센서가 칩 내부 서미스터 대신에 칩 외부에 놓일 수도 있다.

상기 칩 내에 균일한 온도 프로파일을 결정한 후, PCR 반응이 이들 칩 상에서 수행되었다. λ DNA 단편, 살모넬라 DNA 및 B형 간염 DNA가 이들 칩을 사용하여 성공적으로 증폭되었다. 도 5는 3차원 도시로 마이크로 칩을 보여주는데, 히터, 전도체 고리, 서미스터, 및 전도성 고리(502)와의 다양한 연결형태를 보여주고 있다. 또한 상기 전도체 고리(502)를 상기 전도체 판(403)에 연결시키는 포스트(post)(501)를 보여주고 있다.

상기 내장된 히터는 LTCC에 적합성을 갖는 듀퐁 사의 CF 시리즈와 같은 저항 페이스트로 형성된다. DuPont 95, ESL (4IXXX 시리즈), Ferro (A6 시리즈) 또는 Haraeus와 같은 임의의 그린 세라믹 테이프 시스템이 이용될 수 있다. 상기 내장된 온도 센서는 알루미나 기판용으로 PTC(양성 온도 계수; Positive Temperature Coefficient) 저항 서미스터 페이스트 (예: 509X D, 는 ESL Electroscience 사의 ESL 2612임)로 제작된 서미스터이다. EMCA Remex 사의 NTC 4993 등 저항 페이스트의 NTC: 음성 온도 계수(Negative Temperature Coefficient) 또한 사용될 수 있다.

투명(300 ~ 1000nm 파장) 씰링 캡은 상기 반응 챔버로부터 시료의 증발을 막기 위한 것으로, 폴리머로 이루어져 있다.

광 검출 시스템 (104, 105)

광(형광) 검출 시스템은 광원, 일반적으로 LED, 적정 파장의 광 선별용 필터, 시료로부터 광을 전달하고 수집하기 위한 광학소자(optics), 및 광 센서 (광다이오드, 광전자배증관(photomultiplier tube), 광트랜지스터, 이미지 센서, 등)를 포함하여 이루어진다. 또한 회로망(105)을 포함하여, 상기 광원을 구동시키고, 광 센서로부터 신호를 검출한다. 휴대가능 용도로는, 광다이오드 또는 광트랜지스터 또는 이미지 센서가 바람직한데, 낮은 전력 소비(<lmilliW) 때문이다. PCR 생성물의 실시간 검출에는 형광 기술을 이용하는데, PCR 혼합물에 존재하는 광민감성 염료 (SYBR Green 등의 형광물질)가 특정 파장의 빛을 흡수해서 더욱 높은 파장에서 방출한다(SYBR Green의 경우, 470nm & 520nm). 일반적으로, 방출기 광의 세기는 PCR의 성공적인 진행에 따라서 점진적으로 증가하거나 감소한다. 상기 방출된 세기 변화를 관찰하는 것으로 PCR 소자에 대한 실시간 검출 성능을 부여한다. PCR 시료로부터 빛을 커플링하고 수집하는 것은 여러가지 방법에 의해 달성될 수 있다. 하기 방법들이 시스템에 이용될 수 있다.

·분기 말단부(605a)와 공통 말단부(605b)를 포함하는 분기형 광 섬유(605)(다중모드 플라스틱 또는 실리카 섬유 또는 섬유 다발)를 이용하는 분기형 광 검출 시스템(Bifurcated optical detection system). 상기 분기 말단부들 중 하나(605a)는 LED(601)로부터 시료에 빛을 입사시키기 위한 것이고, 다른 말단부는 입사광을 광 검출기(602)로 향하게 하기 위한 것이다. 상기 공통 말단부(605b)는 빛을 시료 상에 향하게 한다. 본 방법은 광학을 이용해서, 빛을 섬유와 필터에 그리고 그로부터 커플링시켜서 파장을 선택하도록 한다.

·빔 분리기, 렌즈 및 필터를 사용하여, 빛을 시료에 초점 맞추고 검출하는, 빔 분리기 광 검출 시스템(beamsplitter optical detection system), 도 19.

·초점 렌즈, 필터, 검출기를 사용하여 조명하고 직접 검출하기 위한 광섬유를 사용하는 하이브리드 광 검출 시스템(Hybrid optical detection system), 도 20.

도 6은 광학 시스템의 일실시예를 보여주는데, 본 발명에 따른 PCR 소자용으로 바람직하다. 본 도해는 분기 말단부(605a)의 한쪽 말단부에는 LED(601) 여기 소스를 가지며, 다른쪽 분기 말단부(605a)에는 광 검출기(602)에서 검출된 형광을 함유하도록 이루어진 분기형 광섬유(605)를 갖는 구조를 보여준다. LED(601)와 광 검출기(602)가 상기 광섬유의 분기 말단부(605a)와, LTCC 칩(200)의 반응 챔버(201)를 향하고 있는 공통 말단부(605b)에 커플링된다. 또한 커플러(603a & 603b) 각각에 의해서, LED(601)에 커플링된 필터(604a)와, 광 검출기(602)에 커플링된 필터(604b)를 보여주고 있다.

도 7에서처럼, 검출기(602)로부터의 출력신호는 히터 제어부로 보내지기 전에, 증폭기 회로(701)를 이용해서 증폭된다 (광전자배증관, 아발란치 광다이오드(avalanche photodiode)에서는 즉시). 증폭기 회로의 하나의 예가 위상동기회로(PLL; Phase-locked loop)이다(락인 앰프(lock-in amplifier)). 이 회로에서 빛은 지정된 주파수 (일반적으로 10 Hz ~ 500 kHz 범위)에서 펄스된다. 출력 신호(형광 신호) 처리 회로는 동일 주파수 대에서 잠기고, 비례하는 직류(DC)를 생성하는데, 상기 직류는 증폭되고 전압으로 전환되고 추가 증폭되어 마이크로 컨트롤러(106)로 보내진다. 이 회로는 신호를 신호의 노이즈 비율에 증대시키고, 신호 내의 주파수 관련 노이즈를 제거한다. 상기 락인 회로는 균형 잡힌 변조기/복조기 (Analog Devices사의 AD 630 JN 등)에 기초하고 있다.

도 7은 히터와 서미스터를 제어하는 회로에 대한 블록도로, 여기서 LTCC 마이크로 PCR 칩(200) 내의 서미스터는 브릿지 회로(706)에서 하나의 암으로서 작용한다. 온도 센서가 칩 외부에 위치하더라도, 브릿지 회로의 하나의 암에 연결될 수 있다. 브릿지 증폭기(701)로부터 브릿지의 증폭된 출력이 PID 제어부(703)에 입력으로 제공되는데, 디지털화되고 PID 알고리즘은 조절된 디지털 출력을 공급한다. 상기 출력은 다시 아날로그 전압으로 재전환되고, 히터 드라이버(704)에 있는 전력 트랜지스터를 이용해서 히터를 구동시킨다.

히터 제어부(703)에 설치된 아날로그 회로는 P 또는 PI 또는 PD 또는 PID (Proportional Integral Derivative; 비례 적분 미분)을 이용하거나, 서미스터로부터의 출력에 기반을 둔 단순한 온/오프 제어부일 수도 있다. 상기 온도 센서가 온도 변화를 감지하는 회로의 일부이다. 본 도해에서, 서미스터의 하나의 예는 휘트스톤 브릿지 회로(wheatstone bridge circuit)(706)의 일부로 만들어진 온도 센서로 간주된다. 가열 또는 냉각에 의한 서미스터 저항 변화로 인해 상기 회로에서 한정적인 출력 전압이 생긴다. 이 전압은 LTCC 칩 상의 웰 온도와 연관된다. 측정된 전압은 히터가 켜질지 꺼져야 할지를 결정하기 위해 이용된다. 상기 히터에는 (LTCC 칩 상의) 웰에 수득되는 최대 온도에 의해 정해진 프리셋 전원이 공급된다. 히터와 서미스터에서의 저항 변화를 설명하기 위해서 (최적의 칩 경우, -20%), 자가 보정 회로가 개발되었으며, 상기 휴대용 소자에서 실행되고 있다. 상기 회로는 상기 저항 변화를 보상하는데, 외부에 노출된 상업용 서미스터(PTIOO)를 사용함에 의해서이다.

상기 히터 제어 회로는 마이크로 컨트롤러에 의해 관리된다. 상기 마이크로 컨트롤러는 통신 인터페이스를 통해서 소망하는 열적 프로파일을 작동시키도록 프로그램되어 있다. 상기 프로그램은 상기 히터 제어 회로(102)를 제어하여, LTCC 칩에 소망하는 프로파일을 작동시킨다. PDA에서 운영되는 소프트웨어 (WincowsCE 구동 iPaq)를 사용해서 상기 마이크로 컨트롤러를 제어하기 위해서 블루투스 인터페이스로 테스트하였다. 블루투스 통신용 소프트웨어 개발과 GUI(그래픽 사용자 인터페이스) 개발이 휴대용 소자(109)에서 실행되고 있다. 여기에 개시한 히터 제어 및 온도 센서 수치 판독 방법은 단지 하나의 예시일 뿐이다. 컨트롤러에 대한 유일한 방법으로 간주되거나 한정으로 간주되어서는 안 된다. 히터를 제어하고 서미스터 수치를 판독하기 위한 기타 수단들 및 방법이 본 개시물에 적극적으로 적용 가능하다.

상기 기타 소자는 사용자로 하여금 GUI(그래픽 사용자 인터페이스)를 통해서 PCR에 대한 열적 프로파일을 생성하게 한다. 상기 열적 프로파일은 통신 인터페이스(107)를 통해서 마이크로 컨트롤러에 전달된다. 상기 열적 프로파일은 설정값 (온도 및 시간)과 사이클 개수를 포함한다. 상기 온도 센서 데이터 및 광 검출 데이터가 마이크로 컨트롤러에서 상기 기타 소자로 전송되고, 그 위에 표시된다. 컴퓨터 또한 상기 데이터를 평가해서 반응 결과를 보여줄 것이다. 휴대용 컴퓨터는 Windows CE/모바일, Palm OS, Symbian, 리눅스 같은 운영 체계에서 구동된다. 또 다른 실시예에서는, 상기 설정값 만 휴대용 소자로 전송되고, 사이클 개수는 상기 기타 소자에 의해 모니터될 수 있다. 마이크로 컨트롤러는 상기 기타 소자에 의해 열적 프로파일에서 보내진 상기 설정값을 달성한다.

일반적으로 PCR 산물은 겔 전기영동을 이용해서 분석된다. 이 기술에서, PCR 후의 DNA 단편이 전기장에서 분리되고, 형광 염료 염색으로 관찰된다. 더욱 적절한 방법은, 이중가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염료를 사용하여, 반응을 계속해서 모니터하는 것이다 (실시간 PCR). 상기 염료의 예로는 DNA에 결합되었을 때 490nm 청색 광에서 여기되고, 520nm 녹색 광을 방출하는 SYBR GREEN가 있다. 형광 세기는 PCR 과정에서 형성된 이중가닥 생성물 DNA 양에 비례하는데, 이에 따라 사이클 수에 따라 증가하게 된다.

하기 예시는 기타 소자를 갖는 휴대용 소자(109)를 사용하여 달성될 수 있는 다양한 가능성을 설명하고 있다. 여기서 고려된 기타 소자는 PDA/스마트폰이다.

표적 PDA/스마트폰 어플리케이션은 윈도우 모바일 5 플랫폼에서 구동하고, 상기 휴대용 장치와 통신하도록 제공된 윈도우 모바일 블루투스 시리얼 포트 프로파일(SPP)을 사용한다. 상기 휴대용 장치는 데이터 통신용 UART(Universal asynchronous receive and transmit; 범용 비동기 송수신기) 포트를 통해 마이크로 컨트롤러와 접속하는 블루투스 모듈을 포함하여 이루어진다. 본 어플리케이션의 중심 기능은 저장된 다양한 열적 프로파일을 통해서 상기 휴대용 장치의 열적 순환과정을 제어하고 모니터하는 것이다. 그리고, 두 가지 수준의 접속 제어; 데이터 플롯, 열적 프로파일 형성, 등의 기능을 갖는다. 도 15는 본 어플리케이션과 휴대용 장치 간의 통신 방법을 보여주고 있다.

PDA 어플리케이션

PDA 어플리케이션 프로그램이 설정값(온도 및 시간)과 사이클 수를 포함한 입력 데이터를 받아들인다. 상기 설정값이 블루투스 연결을 통해 휴대용 장치에 전달되고, 상기 휴대용 장치의 반응을 기다린다. 상기 설정값을 얻으면, 상기 휴대용 장치는 이를 차기 지시사항 세트를 보내는 PDA에 통신한다(도 17). 상기 PDA는 또한 휴대용 장치로부터 데이터(온도 및 광학 데이터)를 수신해서 표시한다. PDA에서 전송된 상기 지시사항을 통신하고 실행하기 위해서, 상기 휴대용 장치는 프로그램이 내장된 마이크로 컨트롤러를 보유하여, 블루투스 통신과 아날로그 회로 컨트롤을 가능하게 한다. 아울러, 상기 마이크로 컨트롤러의 프로그램은 계속해서 온도와 광학 데이터를 PDA에 전송한다.

상기 PDA 어플리케이션은 4가지 모듈을 가진다:

1. 접속 제어

2. GUI

3. 데이터 처리 및 통신

접속 제어:

1. 본 모듈은 사용자가 상기 어플리케이션에 로그인할 수 있게 한다.

2. 사용자 이름 & 암호로 된 로그인 화면이 있다.

3. 두 가지 수준의 접속 제어를 갖는다. a. 관리자, b. 사용자

4. 관리자는 하기 권한을 갖는다:

a. 사용자 및 사용자 폴더 생성

b. 열적 프로파일 생성

c. 휴대용 소자(109)에 연결/변경

5. 사용자가 자신들의 사용자 이름 & 암호로 로그인하게 되면, 어플리케이션을 실행, 그들의 세션에 맞는 데이터를 보여주고 저장할 권한을 갖게 된다.

GUI

1. GUI 모듈은 하기를 위해서 화면을 제공한다:

a. 관리자가 다양한 설정 (온도 & 시간)에 진입하고, 열적 프로파일을 생성/삭제/변형.

b. 사용자 및 사용자 폴더 생성/삭제

c. 휴대용 소자 변경

i. 어플리케이션은 블루투스 스택을 사용해서 범위 내에 있는 블루투스 소자를 탐지한다. 탐지 후에는, 범위 내에서 입수 가능한 모든 소자를 디스플레이한다. 관리자는 상기 휴대용 소자를 선택하고, 어플리케이션이 블루투스 스택에게 휴대용 소자(109)와 짝을 이룰 것을 요청할 것이다. 짝을 이룬 후에는, 향후에 사용하기 위해서 짝지어진 소자의 정보를 저장할 것이다.

d. 어플리케이션 시작, 정지, 재시작 및 중지.

e. 어플리케이션에서 송수신된 데이터를 보여주는, 로그 창.

2. GUI 모듈은 휴대용 장치에서 수집된 열적 & 광학 데이터를 플롯하는 스크린을 가진다.

데이터 처리 모듈

데이터 처리 모듈은 하기 기능을 갖는다:

1. 데이터 변환

2. 통신 알고리즘

데이터 변환:

1. 사용자가 선택한 열적 프로파일에서 데이터를 수집한다.

2. 하기는 전형적인 열적 프로파일이다:

초기 설정값

설정값 1

설정값 2

사이클 수

설정값 3

최종 설정값

3. 설정값이 온도 및 시간을 포함하는 값을 가지기 때문에, 온도 값이 전압값으로 하기 식을 이용해서 변환된다:

여기서 V는 전압이고, t는 온도이고, x & y는 미리 정해진 상수이다.

4. 이에 따라 얻어진 전압값은 하기 식에 따라서 10-비트 16진법(베이스-16) 값으로 변환될 것이다:

여기서 V 는 전압이다.

5. 시간값(초 단위)은 16진법(헥사) 값으로 변환된다.

6. 휴대용 장치에서 수집된 열적 데이터는 16진법 값에서 전압으로 변환되어, 하기 식을 이용하여 플롯할 것이다:

7. 전압은 재차 온도로 변환된다:

t=V*y+x

8. 수집된 광학 데이터는 전압으로 변환되고, 즉시 플롯을 위해 전송될 것이다,

데이터 통신:

데이터 통신 모듈이 윈도우 모바일 블루투스 스택과 통신한다. 하기 프로토콜이 상기 통신 중에 전해진다.

시작:

어플리케이션 프로그램에 의해 제공된 시작 버튼이 열적 순환 과정을 개시한다. 상기 어플리케이션이 블루투스 스택에 휴대용 장치와의 무선 시리얼 포트 연결을 요청한다. 상기 요청을 확인한 후, PDA는 휴대용 장치와의 통신을 시작한다.

종료/중지/계속(Stop/Pause/Continue)

종료 명령으로 상기 열적 순환을 종료시키고, 휴대용 장치의 칩 온도가 실온- 본 과정이 재시작될 수 없는 온도-으로 떨어지게 할 것이다.

중지는 칩 온도를 그 당시의 온도로 유지시킬 것이다. 이것은 계속 명령에 의해 취소될 수 있다.

PDA 등의 휴대용 컴퓨터 플랫폼을 사용하면 시스템에 충분한 전산 기능을 부여해서, 전자제품을 제어할 수 있으며, 풍부하지만 간단한 사용자 인터페이스를 제공해서 데이터를 디스플레이할 수 있다. 또한 그것은 시스템 전체를 모듈화시킬 수 있으며, 따라서 사용자에게 최소 비용으로 쉽게 시스템을 업그레이드할 수 있게 해준다.

본 발명은 특정한 진단 목적을 위해 시장성이 좋은 휴대용 PCR 소자를 제공한다. 상기 기타 소자에서 가동중인 프로그램은 휴대용 PCR 시스템에 실시간 검출과 소프트웨어 제어 기능을 제공한다.

열량을 줄이고, 상기 소자를 이용하여 개선된 가열/냉각 속도에 의해서, 30~40-사이클 반응, 심지어 5-25 ㎕의 중간 정도 시료부피,을 종료하는 데에 2~3 시간 소요되던 시간이 30분 미만으로 줄었다. 도 14는 B형 간염 바이러스 DNA를 본 발명에 의한 LTCC 칩을 사용해서 증폭시키는 데 소용된 시간을 보여준다. 45 사이클 동안 PCR이 진행되었으며, 도 14의 (1)에 나타난 것처럼, 증폭을 45분 이내에 달성할 수 있었다. 또한, 20분(2) 및 15분(3) 만에 45 사이클 동안 PCR이 진행될 때에도 증폭이 관찰되었다. 기존의 HBV (45 사이클)에 대한 PCR 시간은 약 2 시간 소요된다.

소형화로 인해 보다 작은 시료 사이즈와 고가의 시료를 덜 소비하면서도 정확하게 판독할 수 있다. 마이크로 시스템의 작은 열량과 작은 시료 사이즈로 인해, 마이크로 PCR을 통해서 DNA 복제 등 다수의 공정 속도를 올리면서, 신속한 저-전력 열적 순환이 가능하다. 또한, 표면 화학(surface chemistry)에 의존하는 화학 공정들이 마이크로-규모에서 얻을 수 있는 부피 대비 표면 비율이 커짐에 따라 촉진된다. 마이크로 유체들의 장점은 화학 분석을 위해서 집적된 마이크로 시스템에 대한 개발 요구를 불러왔다.

마이크로 칩은 휴대용 소자(109)로 번역되었고, 따라서 복잡한 실험실로부터 PCR 기계를 없애고, 임상 진단, 식품 테스트, 혈액 은행의 혈액 스크리닝 또는 기타 다수의 적용분야에서, 이렇게 엄청나게 강력한 기술에 빈번하게 도달하게 되었다.

복수의 반응 챔버를 갖는 현존하는 PCR 장비들은 모두 같은 열적 프로토콜이 구동되는 복수의 DNA 실험 부위를 제공하고, 이에 따라 시간 효율이 좋지 않다. 반응시간과 흡수 시료부피를 최소화할 필요가 있다. 본 PCR은 매우 짧은 열적 반응과 인접 PCR 칩과 상당히 단절된 소자 어레이를 가짐으로써, 상이한 열적 프로토콜을 가진 복수의 반응을 최소한의 크로스토크(cross talk)로 효과적이고 독립적으로 구동할 수 있게 될 것이다.

PCR 산물의 분석이나 정량화는 실시간 형광 검출 시스템을 실질적으로 통합함으로써 구현된다. 이러한 시스템이 정량 및 감지 시스템과 통합되어서, B형 간염(도 12), AIDS, 결핵 등의 질병을 탐지할 수도 있다. 또 다른 시장에는 식품 감시, DNA 분석, 법의학 및 환경 감시 분야가 있다.

도 8은 통합형 히터와 서미스터를 사용하는 칩 상에서 λ-636 DNA 단편의 융해에 대한 비교 플롯을 보여준다.

도 9는 λ-3 11DNA 증폭에 관련된 형광 신호가 증가하는 것을 보여준다. 열적 프로파일은 휴대용 장치에 의해 조절되고, 반응은 칩 상에서 수행되었다(3㎕ 반응 혼합물 및 6㎕ 오일). 기존의 락인 앰프를 사용해서 형광을 모니터하였다.

본 발명은 또한 진단 시스템을 제공한다. 본 진단 시스템 개발에 사용된 절차는 초기에는 몇 가지 문제에 대한 열적 프로토콜을 표준화하고, 칩 상에서 작용하게 하는 것이었다. 16S 리보좀 DNA 용으로 고안된 프라이머들은 대장균(E. coli)과 살모넬라(Salmonella)로부터 ~ 300 - 400 bp 단편을 증폭시킨 반면, stn 유전자 용 프라이머들은 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)로부터 ~ 200 bp 단편을 증폭시켰다. 수득된 산물들은 SYBR 그린 형광 검출뿐만 아니라 아가로오스 겔 전기영동에 의해 확인되었다. 도 9 및 도 13은 마이크로 칩을 이용하여 증폭된 λ-3 11DNA 와 살모넬라 유전자의 겔 사진을 보여준다.

λ-3 11DNA 증폭에 대한 열적 프로파일:

변성(Denaturation): 94℃ (90s)

94℃ (30s) - 500C (30s) - 72℃ (45s)

신장(Extension): 72℃ (120s)

살모넬라(Salmonella ) 유전자 증폭에 대한 열적 프로파일:

변성(Denaturation): 94℃ (90s)

94℃ (30s) - 55℃ (30s) - 72℃ (30s)

신장(Extension): 72℃ (300s)

가공 혈액 및 혈장으로 PCR

혈액 또는 혈장을 이들 시료에서 주된 PCR 방해물질을 침전시키는 침전제로 처리시켰다. 깨끗한 상층액을 주형으로 사용했다. 본 프로토콜을 사용해서, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)의 ~200bp 단편에 대해 증폭이 실시되었다(도 10). 도 10에서, 겔 전기영동 이미지를 보여준다.

1. 컨트롤 반응,

2. PCT 산물- 미가공 혈액,

3. PCR 산물- 가공 혈액,

4. PCR 산물- 가공 혈장

혈액 다이렉트 PCR 완충액

다이렉트 PCR 용 고유 완충액(unique buffer)을 혈액 또는 혈장 시료로 제조하였다. 본 고유 완충액 시스템을 사용해서, 혈액&혈장으로 다이렉트 PCR 증폭을 달성했다. 본 완충액 시스템으로, 본 발명의 LTCC 칩을 이용해서 증폭이 혈액은 50% & 혈장은 40%까지 얻어졌다 (도 11 및 12).

도 11에서, 겔 전기영동 이미지를 보여준다

1. PCR 산물-20% 혈액,

2. PCR 산물-30% 혈액,

3. PCR 산물-40% 혈액,

4. PCR 산물-50% 혈액; 및

도 12에서, 겔 전기영동 이미지를 보여준다,

1. PCR 산물-20% 혈장,

2. PCR 산물-30% 혈장,

3. PCR 산물-40% 혈장,

4. PCR 산물-50% 혈장,

5. 컨트롤 반응

상기 고유 완충액은 완충염, 염소 또는 이가 이온 함유 황산, 비이온성 세제, 안정화제 및 당알코올을 포함한다.

도 16은 LTCC 칩의 융해 곡선을 보여주는데, λ-3 11 DNA의 융해에 대한 미분 형광신호(derivative of the fluorescence signal)에 대한 것이다. 본 도해는 또한 본 발명(161)과 기존의 PCR 소자(162)에 대한 비교를 제공한다.

더 날카로운 피크: 피크값/너비 (x 축) @ 반 피크값 = 1.2/43

더 얕은 피크: 피크값/너비 (x 축) @ 반 피크값 = 0.7/63

비율이 높을수록 더 날카로운 피크를 의미한다. 또한 그래프에서, y 축은 미분(융해곡선의 경사도)이고, 경사도가 높을수록 더 날카로운 융해를 의미한다.

도 19는 휴대용 소자에 채택 가능한 빔분리기를 가진 광학 시스템에 대한 일실시예를 보여준다. 본 형광 검출 시스템은 LED 광원(193), 빛 초점용 렌즈(196), 특정 파장 빛을 선택하기 위한 대역통과필터(195), 빔분리기(191), 입사 빔과 칩(200) 상에 탑재된 시료로부터의 신호 초점용 렌즈(198), 특정 파장 빛을 선택하기 위한 대역통과필터(194), 초점 렌즈(197) 및 광검출기(192)를 포함하여 이루어진다.

도 20은 광섬유와 렌즈를 갖는 하이브리드 광학 시스템에 대한 일실시예를 보여준다. 이 형광 검출 시스템은, 광섬유(213)에 커플링된 특정 파장 빛을 선택하기 위한 대역통과 필터를 갖는 LED 광원(도시되지 않음)을 포함하고 있다. 선택사항으로, 적절한 렌즈를 사용하여, 상기 광섬유에서 시료 쪽에 나오는 빛을 초점 맞출 수도 있다. 렌즈들(212)을 사용해서, 칩(200) 상에 탑재된 시료로부터 방출된 빛을 칼럼화한다. 특정 파장의 방출광을 선택하기 위한 대역통과 필터(214)와 그것을 광검출기 상에 초점 맞추기 위한 초점 렌즈(212)를 포함하고 있다.

Claims (33)

1. a) 히터, 시료 탑재용 반응 챔버를 포함하는 LTCC 마이크로 PCR 칩,
   b) 온도 센서로부터 수신된 입력을 기반으로 상기 히터를 조절하기 위한 히터 제어부,
   c) 상기 시료로부터의 형광 신호를 검출하는 광 검출 시스템,
   d) 기타 소자와 상호작용하기 위한 적어도 하나의 통신 인터페이스, 및
   e) 상기 적어도 하나의 통신 인터페이스와 인터페이스되어 상기 기타 소자로부터의 설정 포인트 값을 수집하여 상기 설정 포인트 값의 온도값을 상기 히터 제어부로 제공하여 상기 히터를 조절하는 마이크로컨트롤러로서, 상기 온도 센서로부터의 입력 및 상기 광 검출 시스템으로부터 검출되는 형광 신호를 상기 적어도 하나의 통신 인터페이스를 통해 상기 기타 소자에 제공하는, 마이크로컨트롤러를 포함하는 휴대용 마이크로 PCR 소자.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 히터와 상기 반응 챔버 사이에는 적어도 하나의 전도체 층이 제공되는, 소자.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 챔버는 전도체 고리에 의해 둘러싸여 있는, 소자.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 전도체 고리는 포스트로 전도체 층에 연결되어 있는, 소자.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 온도 센서는 상기 칩의 외부에 위치하거나, 상기 칩의 적어도 하나의 층에 내장되어서, 상기 칩의 온도를 측정하는, 소자.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 온도 센서는 브릿지 회로의 하나의 암(arm)으로서 연결되어 있고, 상기 브릿지 회로 출력은 상기 히터 제어부로 송급되기 전에 증폭되어 상기 히터를 조절하는, 소자.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 칩은 상기 반응 챔버를 덮기 위한 투명한 씰링 캡을 포함하는, 소자.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 광 검출 시스템은 광원과, 시료에서의 형광 신호를 검출하는 포토 검출기를 포함하고, 상기 광 검출 시스템은 빔분리기 광 검출 시스템, 하이브리드 광 검출 시스템 및 분기형 광 검출 시스템을 포함하여 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 소자.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 통신 인터페이스는 시리얼, USB, 블루투스 또는 그들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되어지는, 소자.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 기타 소자는 스마트폰, PDA 및 프로그래밍 가능한 소자를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 상기 칩 및 상기 휴대용 소자로부터의 증폭된 신호의 온도를 수집하는, 소자.
11. 휴대용 마이크로-PCR 소자를 모니터하고 제어하기 위한 방법, 여기서 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
    a. 적어도 하나의 통신 인터페이스를 통해 마이크로컨트롤러에 의하여 상기 휴대용 마이크로 PCR 소자와 기타 소자 간의 통신을 형성하는 단계,
    b. 상기 기타 소자로부터 상기 마이크로컨트롤러에 의해 수신된 열적 프로파일값에 기초하여 열 순환 공정을 개시하여, LTCC 마이크로 PCR 칩을 제어하는 단계, 및
    c. 광학 시스템에 의해 감지된 광학 신호 및 온도 센서로부터의 입력을 상기 적어도 하나의 통신 인터페이스를 통해 마이크로컨트롤러를 이용하여 상기 기타 소자로 송출하는 단계.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 열적 프로파일값을 상기 기타 소자로 송출하고, 사용자 인터페이스를 통한 열적 프로파일을 생성하고, 변형하거나 삭제하는 것인, 방법.
13. 제 11 항에 있어서, 상기 기타 소자는 사용자 확인 절차를 제공하고, 상기 기타 소자는 복수의 열적 프로파일을 저장하는, 방법.
14. 제 11 항에 있어서, 상기 열적 프로파일은 설정값 및 사이클 수를 제공하고, 여기서 상기 설정값에 의해 결정된 온도에서와 시간 동안 상기 칩을 유지시키는, 방법.
15. 제 11 항에 있어서, 열적 순환 과정을 중지시킴으로써 상기 마이크로 PCR 칩 온도를 실온으로 가져오고, 상기 열적 순환이 중단될 때 마이크로 PCR 칩 온도를 일정하게 유지시키는, 방법.
16. 제 11 항에 있어서, 상기 열 및 광 데이터를 상기 기타 소자의 디스플레이 단위 상에 플롯시키는,방법.
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