BRPI0816357A2 - microship - Google Patents

Abstract

MICROCHIP. A invenção é um microchip incluindo uma diversidade de camadas de LTCC em que uma câmara de reação é formada em uma diversidade de camadas superiores para carregar amostras. Um aquecedor embutido em pelo menos uma das camadas abaixo da câmara de reação e um sensor de temperatura embutido em pelo menos uma das camadas entre o aquecedor e a câmara de reação para analisar a amostra. O sensor de temperatura pode ser colocado fora do chip para medir a temperatura do chip.

Description

MICROCHIP

ÁREA DA INVENÇÃO A exposição se relaciona a um microchip PCR (reação em cadeia da pojimerase) incluindo uma diversidade de camadas feita de cerâmica co-sinterizada a baixas 5 temperaturas (LTCC). A exposição também inclui um dispositivo PCR portátil de tempo real com microchip PCR LTCC descartável.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Os recentes avanços em biologia molecular e celular aconteceram, em grande parte, cQmo resultado do desenvolvimento de técnicas analíticas rápidas e eficientes.

Graças à miniaturização e multiplexação, técnicas como chip genético ou biochip permitem a caracterização de genornas completos em uma única configuração experimental. PCR é um- método de biologia molecular para amplificação in vivo de moléculas de ácido nuclear A técnica PCR está substituindo rapidamente outras técnicas demoradas e menos sensíveis para identificação de espécies biológicas e patógenos em amostras forenses, ambientais, clínicas e industriais. Entre as biotécnicas, PCR se tornou a etapa analítica mais importante nos laboratórios de ciências biológicas para um grande número de diagnósticos moleculares e c!Ínicos.

Desenvolvimentos iii1portantes feitos na tecnolog ia PCR, como PCR em tempo real, levaram a processos de íeação rápida em comparação com métodos convencionais.

Durante vários anos, a tecnologia de microfabricação vem se expandindo para a miniaturização do sistema de análise e reação ta) como análise PCR com intenção de reduzir ainda máis o tempo de análise e o consumo de reagentes. Vários grupos de pesquisa vêm trabalhando em dispositivos de microlaboratório ("lab-on-a-chip") e levaram a diversos avanÇos nos campos de sistemas miniaturizados de separação e reação.

: 2/19 Na maioria dos pcrs hoje disponíveis, não são possÍveis mudanças instantâneas de temperatura eqi razão das capacidades de amostra, recipiente e calor do ciclador, e como rqsultado têm-se maiores tempos de amplificação de 2 a 6 horas.

Durante os períodos em,que a temperatura da amostra está em transição, ocorrem reações estranhas e indesejáveis que consomem reagentes importantes e criam compostos interferentes indesejados.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO Um objetivo da presente invenção era fornecer um microchip que permitisse desempenho PCR mais veloz.

Outro objetivo da presente invenção era fomecer um microchip melhorado.

Um dos principais objetióos da invenção é desenvolver um microchip incluindo uma diversidade de camadas de LTCC.

Ainda outro objetivo da invenção e desenvolver um método para fabricar o microch jp.

Ainda outro objetivo' da invenção é desenvolver um microdispositivo PCR incluindo o microchip.

Ainda outro objetivo dà presente invenção é desenvolver um método para diagnosticar situações de doença usando o microdispositivo PCR,

DECLARAÇÃO DA INVENÇÃO Assim, a invenção fornece m microchip incluindo uma d iversidade de camadas feitas de cerâmica co-sinterizada a baixa temperatura (LTCC), em que uma câmara de reação é formada em uma diversidade de camadas de câmara de reação para carregar uma amostra, um condutor está embutido em pelo menos uma camada condutora colocada abaixo da câmara de reação e um aquecedor está embutido em pelo menos uma camada de aquecedor colocada abaixo da(s) camada(s) 'e ,: t condutora(s); um método para fabricar um microchip incluindo as etapas: (a) disposição de uma diversidade de camadas feitas de cerâmica co-sinterizada a baixas temperaturas (LTCC) e possuindo um poço para formar uma câmara de .

~ reação, 5 (b) colocação de pelo menos uma camada de LTCC incluindo o aquecedor abaixo da câmara, (c) colocação de urha ou várias camadas condutoras entre o aquecedor e a câmara de reação, e .

(d) interconexão das camadas para formar o microch jp; 10 Um microdispositivo PCR incluindo: (a) um microchip incluindo uma diversidade de camadas de LTCC, em que uma câmara de reação é formada em uma diversidade de camadas para carregar a amostra, o condutof está embutido em pelo menos uma camada colocada abaixo da câmara de reação e o aquecedor está embutido em pelo menos uma camada 15 cojocada abaixo da(s) camada(s) condutora(s); (b) um sensor de temperatura embutido no microchip ou colocado fora do chip para medir a temperatura do chip.

(C) um circuito de controle para controlar o aquecedor com base na entrada do sensor de temperatúra, e 20 (d) um sistema óptico para detectar sinal fluorescente da amostra; Um método de detectar um analito em uma amostra ou diagnosticar uma condição de doença usando um microdispositivo PCR, tal método incluindo os seguintes passos: (a) carga de uma amQstra incluindo ácido nucléico em um microchip incluindo uma 25 diversidade de camadas LTCC,

."t i 4/19 (b) amplificação do ácido nucléico rodando o microdispositivo PCR; e (C) determinar a presença ou ausência de analito com base numa leitura de fluorescência do ácido nucléico amplificado, ou determinar a presença ou ausência .

+ .

de um patógeno com base em uma leitura de fluorescência do ácido nucléico 5 amplificado para diagnosticar a condição de doença.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS ANEXOS A invenção será descrita agora com referência aos desenhos anexos: A figura 1 mostra uma visão ortográfica de uma configuração do microchip PCR LTCC.

A figura 2 mostra uma visão de corte transversal de uma configuração do microchip 10 PCR LTCC. - A figura 3 mostra um desenho em camadas de uma configuração do microchip PCR ¶ LTCC. ,: A figura 4 mostra um diagrama de bloco de uma configuração do circuito que controla o aquecedor e o sensor de temperatura.

15 A figura 5 mostra um modelo do desenho fabricado da câmara de reação do chip.

A figura 6 mostra a fusão do fragmento de DNA de lambda-636 usando o aquecedorl termistor integrado,"Contròlado pela unidade de mão.

A Figura 7 mostra a amplificação PCR do fragmento de DNA de lambda-311 no chip, (a) Sinal de fluorescência de tempo real vindo do 'chip; (b) lmagem do gel 20 confirmando o produto da amplificação- A figura 8 mostra uha imagem do gel do PCR de sangue e plasma processado para a unidade ribossômica 16S de Salmonella.

A figura 9 mostra uma irhagem de um gel de PCR direto de sangue para a unidade ribossômica 16S de Sa|rY{one||a.

25 A figura 10 mostra uma imagem de um gel de PCR direto de plasma para a unidade .F ribossômica 16S de Salmonella.

A figura 11 mostra a amplificação PCR do gene da Salmonella usando microchip, (a) Sinal de fluorescência' de tempo real do chip; $

F (b) lmagem do gel confirmando o produto da amplificação.

5 A figura 12 mostra o tempo que se levou para amplificar o DNA Viral da Hepatite B usando o chip LTCC.

A figura 13 mostra' umap cuma de fusão do chip LTCC para derivada do sinal de fluorescência para â fusão do DNA À-311.

DESCRIÇÃO DETALHAIDA DA INVENÇÃO 10 A presente invenção se' relaciona a um microchip incluindo uma diversidade de camadas feitas de cerâmica co-sinterizada a baixa temperatura (LTCC), em que uma câmara de reação é formada em uma diversidade de camadas de câmara de reação para carregàr uma amostra, um condutor está embutido em pelo menos uma camada condutora"colocada abaixo da câmara de reação e um aquecedor está 15 embutido em pelci me4os uma camada de aquecedor colocada abaixo da(s) camada(s) condutora(s). ' Em uma configuração da presente invenção a câmara de reação é coberta com uma tampa de vedação transparente.

Em uma configuraQo da'presente invenção, o chip inclui um sensor de temperatura.

20 Em uma configuração da presente invenção o sensor de temperatura está embutido em pelo menos uma camiada do chip.

Em uma configuração da presente invenção, o sensor de temperatura é um termistor.

Em uma configuração da presente invenção, o chip fornece almofadas de contato 25 . para conectar o circuito de controle externo ao sensor de temperatura e ao aquecedor.

Em uma configuração da presente invenção o sensor de temperatura é colocado fora do chip para medir sua temperatura.

Em uma configuração da presente invenção a câmara de reação é cercada por 5 anéis condutores.

Em uma configuração da presente invenção os anéis condutores são conectados à(S) camada(s) condutora(s) por pilares.

Em uma configuração da presente invenção o condutor é feito de um material selecionado de um grupo incluindo ouro, prata, platina e paládio ou ligas destes.

Em uma configuração da presente invenção há um intervalo entre a base da câmara de reação e o aquecedor, tal intervalo ficando na faixa entre 0,2 mm até cerca de 0,7 mm.

Em uma configuração da presente invenção, a amostra é alimento ou uma amostra biológica selecionada de um grupo incluindo sangue, soro, plasma, tecidos, saliva, escarro e urina.

Em uma configuração da presente invenção, a câmara de reação possui um volume nafaixade1µlatécercade25µl.

A presente invenção também se relaciona a um método de fabricação do microchip, incluindo as etapas: í a) disposição de uma diversidade de camadas feitas de cerâmica co-sinterizada a baixas temperaturas (LTCC) e possuindo um poço para formar uma câmara de reação, b) colocação de pelo menos uma camada de LTCC incluindo o aquecedor abaixo da 'k câmara, L C) colocação de uma ou várias camadas condutoras entre o aquecedor e a câmara de reação, e d) interconexão das camadas para formar o microchip.

Em uma configuração da presente invenção, colocando pelo menos uma camada de .

%.

LTCC incluindo um sensor de temperatura entre o aquecedor e a câmara de reação 5 ou abaixo do aquecedor.

Em uma configuração da presente invenção a câmara é cercada por anéis condutores.

Uma configuração 'da presente invenção fornece pilares para conectar os anéis condutores à(S) camada(s) condutora(s).

10 A presente invenção se rèlaciona a um microdispositivo PCR de mão incluindo: a) um microchip incluindo uma diversidade de camadas de LTCC, em que uma câmara de reação é formada em uma diversidade de" camadas para carregar a amostra, o condutor está embutido em pelo menos uma camada colocada abaixo da câmara de reação' e o aquecedor está embutido em pelo menos uma camada 15 colocada abaixo da(s) camada(s) condutora(s); b) um sensor de temperatura embutido no microchip ou colocado fora do chip para medir a temperatura do cihip.

C) um circuito de controle para controlar o aquecedor com base na entrada do sensor de temperatura, e 20 d) um sistema óptico para detectar sinal fluorescente da amostra.

Em uma configuraçào da'presente invenção, o dispositivo é um dispositivo de mão.

Em uma configuração da presente invenção, o dispositivo é controlado por uma plataforma portátil de corhputação.

Em uma configuração da presente invenção, o dispositivo é disposto em um arranjo 25 para executar múltiplos PCRS.

r

H %

Em uma configuração da presente invenção, o microchip pode ser liberado do dispositivo.

A presente invenção também se relaciona a um método de detectar um analito em uma amostra ou diagnosticar uma condição de doença usando um microdispositivo 5 PCR, tal método incluindo os seguintes passos: a) carga de uma amostra incluindo ácido nucléico em um microchip incluindo uma diversidade de camàdas LTC, b) amplificação do ácido nucléico rodando o microdispositivo PCR: e C) determinação da preSença ou ausência de analito com base numa leitura de fluorescência do ácido nucléico amplificado, ou determinar a presença ou ausência de um patógeno com base em uma leitura de fluorescência do ácido nucléico amplificado para diágnosticar a condição de doença.

Em uma configuração da'presente invenção, o ácido nucléico é DNA ou RNA.

Em uma configuráção tla presente invenção, o método fomece análise tanto qualitativa quanto quantitàtiva dos produtos amplificados.

Em uma configuração da presente invenção, a amostra é alimento ou amostra biológica.

Em uma configuraÇão dá presente invenção, a amostra biológica é selecionada de um grupo incluindo 'Sangue, soro, plasma, tecidos, saliva, escarro e urina Em uma configuração da" presente invenção, o patógeno é selecionado de um grupo incluindo vÍrus, bactérias, fungos, leveduras e protozoários.

A expressão "camada de câmara de reação" na exposição se refere a qualquer camada do microchip envolvida na formação da câmara de reação e que entra em contato com a amostra. ' A expressão "camàda condutora" na exposição se refere a qualquer camada do

.., 9/19 microchip contendo um condutor embutido.

A expressão "camada de aquecedor" na exposição se refere a qualquer camada do microchip contendo um aquecedor embutido.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica descoberta para sintetizar múltiplas cópias de. um fragmento específico de DNA de um modelo. O processo PCR original se baseia na enzima de polimerase de DNA de calor estável de Thermus aquaticus (Taq), que pode sintetizar uma fita complementar a uma determinada fita de DNA em uma mistura contendo quatro bases de DNA e dois fragmentos de DNA iniciador ladeando a sequência alvo. A mistura é aquecida para separar as fitas de DNA de dupla hélice contendo a sequência alvo e depois resfriada para perrhitir aos iniciadores que encontrem e se liguem às sequências complementares nas fitas separadas e que a polimerase Taq estenda os iniciadores em novas fitas complementares. Ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento multiplicam o DNA alvo exponencialmente, já que cada nova fita dupla se separa para tornar-se dois modelos para síntese subsequente.

Um perfil de temperatura típico para a reação em cadeia da polimerase é como segue: '

1. Desnaturação a 930C por 15 a 30 segundos

2. Recozimento do lniciador a 550C para 15 a 30 segundos

3. Extensão dos iniciadores a 720C por 30 a 60 segundos Como exemplo, na primeira etapa, a soIução é aquecida a 90-950C de forma que o modelo cle dupla fita se funde ("desnatura") para formar duas fitas individuais. No próximo paço, ela é resfriada para 50-55°C de forma que pequenos fragmentos de DNA especialmente sinêetizados ("iniciadores") se unem à seção complementar apropriada do modelo ç'recozimento"). Finalmente, a solução é aquecida a 72°C

F ¢ 10/19 quando uma enzima específica ("DNA polimerase") estende os iniciadores unindo bases complementares da solução. Assim, duas fitas duplas idênticas são sintetizadas a partir de uma única fita dupla.

H ~ A etapa de extensão do iniciador tem que ser aumentada em aproximadamente 5 60seg/kbase para gerar produtos mais longos do que algumas centenas de bases.

Os tempos acima são típícos para instrumentação; na verdade, as etapas de desnaturação e recozimento acontecem quase instantaneamente, mas os Índices de temperatura em instrumentos comerciais são menores do que lOC/seg quando são usados blocos de metal iou água para equilíbrio térmico e são colocadas amostras lO nos tubos plásticos de mi.crocentrifugação.

Efetuando-se a microusinagem de câmaras PCR de baixa massa termicamente isoladas, é possÍvel produzir em rnassa um instrumento PCR mais específico e com uso mais eficiente de energia. Além disso, as rápidas transições de uma temperatura para outra asseguram' que a amostra permaneça um tempo mínimo em 15 temperaturas intermediárias Índesejadas, de forma que o DNA amplificado venha a ter fidelidade e pureza ideais.

Cerâmica Co-sinterizada a Baixas Temperaturas (LTCC) é a versão moderna da tecnologia de pellcula espessa que é usada na embalagem de componentes eletrônicos para :a indústria automotiva, de defesa, aeroespacial e de 20 telecomunicações. 'É um material vÍtreo de cerâmica com base em alumina que é quimicamente inerte, 6iocompatÍvel, termicamente estável condução térmica ("600°C), com baixa 'condução térmica ("3W/mk), boa força mecânica e proporciona boa hermeticidade. É convencionalmente usada na embalagem de dispositivos eletrônicos em nível de chip onde realizam funções estruturais e 25 elétricas. Os presehtes inventores reconheceram a adequação da LTCC para ser r i usada em aplicações de microchip PCR e, tanto quanto os inventores saibam, a LTCC não foi usada antes para tal objetivo. Os substratos básicos na tecnologia LTCC são, de preferência, camadas não quein"iadas (verdes) de material vÍtreo de cerâmica com um aglomerante polimérico. As características estruturais são 5 formadas pelo corte/punção/perfuração dessas camadas e empilhamento de camadas múltiplas. O processo camada por camada possibilita a criação de componentes tridimerísionais essenciais para MEMS (Microssistemas Eletromecânicos). ComPonentes tão pequenos quanto 50 mícrons podem ser prontamente fabricados em LTCC. Circuitos elétricos são fabricados serigrafando-se uma pasta condutora e resistiva em cada camada. As múltiplas camadas são interconectadas pela púhção de vias e preenchimento das mesmas com a pasta condutora. Essas camadàs são empilhadas, comprimidas e queimadas. A literatura registra o processament'o de pilhas de até 80 camadas. O material queimado é denso e possui boa força' mecânica.

Tipicamente, o produto PCR é analisado usando eletroforese em gel. Nessa técnica, fragmentos de DNA após PCR são separados em um campo elétrico e observados por tingimento com cora'nte fluorescente. Uni esquema mais adequado é usar um corante fluorescente que se ligue especificamente a um DNA de fita dupla para n7onitorar a reação contiriuamente (PCR em tempo real). Um exemplo de tal corante é SYBR VERDE que é excitado por Iuz azul de 490nm e emite Iuz verde de 520nm quando ligado ao DNA. A intensidade da fluorescência é proporcional à quantidade de DNA produto de dupla fita formado durante PCR e dessa forma aumenta com o número de ciclos.

A figura 1 mostra úma visão ortográfica de uma configuração do microchip PCR indicando a câmara de} reação (11) ou poço. A figura indica a montagem do aquecedor (12) e um termistor sensor de temperatura (13) dentro do microchip PCR LTCC. Também são indicadas as linhas condutoras do aquecedor (1 5) e as linhas condutoras do termistor (14). Essas linhas condutoras irão ajudar a fornecer conexão ao aquecedor e o termistor embutidos no chip com sistema de circuito 5 externo.

Faz-se referência à Figura 2, que mostra uma visão de corte transversal de uma configuração do microchip PCR LTCC em que (16a & 16b) indicam as almofadas de contato para o aquecedor (12) e (17a & 17b) indicam a almofada de contato para o termistor (13).

Faz-se referência à Figura 3, que mostra um projeto por camadas de uma configuração de microchip PCR LTCC em que o chip é composto de 12 camadas de fitas LTCC. Há duas camadas de base (31), três camadas intermediárias contendo a camada de aquecedor (32), uma camada condutora (33) e uma camada contendo o termistor (34), enquanto (35) forma a camada de interface para a câmara de reação (11). As camadas de câmara de reação (36) consistem de seis camadas, como mostrado. Também é foínecida uma camada condutora (33) entre as camadas de aquecedor e termistor. Támbém são indicadas a linhas condutora do aquecedor (33) e as linhas condutoras do termistor (32). A figura mostra que as linhas condutoras (32) são colocadas em ambos os lados da camada de termistor (34). O desenho do aquecedor pode ser de qualquer feitio, como "escada", "serpentina", "linha", "placa", etc., com o tamanhô variando de 0,2mm x 3mm a 2mm x 2mm. O tamanho e o feitio do aquecedor podem sbr selecionados com base nos requisitos. Os requisitos podem depender do tamànho da câmara de reação ou da amostra que está sendo testada ou o material sendo usado como camada condutora.

A Figura 3 mostra o projeto de camada e uma imagem de uma configuração do chip ¢ h í ? r u ; i embalado fabricadQ. O chip LTCC possui um volume de poço de 1 a 25 µ1 e uma variação de resistência (aquecedor e termistor) de cerca de 50%. Os valores de resistência do aquecedoE (~40 Q) e do termistor (-1050 Q) foram coerentes com os

C valores estimados. O aquecedor se baseia no elemento resistivo de pe!ícula 5 espessa que é utilizado em pacotes LTCC convencionais. O sistema de termistor com alumina é usado para fabricação de sensores de temperatura embutidos. O TCR medido do ch'ip foi entre 1 e 2 C)/°C. O chip foi fabricado em sistema verde DuPont 951. A camada de termistor pode ser colocada em qualquer parte no chip ou um sensor de temperatúra pode ser colocado fora do chip em vez do termistor 10 dentro do chip.

A figura 4 mostra um diagrama de bloco de uma configuração do circuito que controla o aquecedòr e o termistor em que o termistor no microchip PCR LTCC (10) age como um dos 'braços no circuito em ponte (46). A saída amplificada de ponte vinda do amplificadòr de' ponte (41) é alimentada como entrada no controlador PID 15 (43) onde é digita1izada,'e o algoritmo PID fomece uma saída digital controlada. A saida é novamente convertida de voltar para a voltagem analógica e isso conduz o aquecedor usando um transistor de força presente no condutor do aquecedor (46).

Além disso, é mais barato processar LTCC em comparação com o de silício.

A invenção tambérn propicia melhorar os sistemas PCR convencionais em tempo de 20 anátise, portabilideide, Úolume de amostra e capacidade de realizar análise e quantificação de rendimento. lsso se obtém com um microdispositivo PCR portátil, com detecção/quantificação em tempo real in loco dos produtos PCR, incluindo o que segue: - Chip PCR descartável consistindo de câmara(s) de reação, aquecedor embutido e 25 um sensor de tempèratura com uma tampa de vedação transparente.

- Uma un idade eletrônica de mão consistindo das seguintes unidades * circuito de controle para o aquecedor e o sensor de temperatura, * sistema de detecção óptica de fluorescência. .

.- - Um smart phone ou PDA (assistente digital pessoal) rodando um programa para 5 controlar a citada unidade de mão.

O chip PCR descartável consiste de uma câmara de reação que é aquecida por um aquecedor embutido e monitorada por um termistor embutido. É fabricado pelo sistema de Cerâmica Co-sinterizada a Baixas Temperaturas (LTCC) e embalado de forma adequada com um conector com contatos para o aquecedor e sensor de 10 temperatura.

O aquecedor embútido é feito de pasta resistiva como a série CF da DuPont, compatível com LTCC. Pode ser usado qualquer sistema de fita de cerâmica verde, como DuPont 95, ESL (série 41XXX), Ferro (sistema A6) ou Haraeus. O citado sensor de temperatura embutido é um termistor fabricado usando uma pasta de 15 resistência de termistor de PTC (Coeficiente de Temperatura Positivo) (por exemplo: 509X D, ESL 2612 de ESL Electroscience) para substrato de alumina. NTC: Coeficiente de Terhperatura negativo de pasta de resistência como NTC 4993 da EMCA Remex também pode ser usado.

A tampa de vedação transparente (comprimento de onda de 300 a 1OOOnm) é para 20 prevenir a evaporação da amostra da citada cârnara de reação e é feita de material polimero.

O circuito de controle consistiria de um circuito de controle liga/desliga ou um PID (Diferencial lntegral'Proporcional) que controlaria o aquecedor com base na saída de um circuito em ponte do qual o termistor faria parte. O método de controlar o 25 aquecedor e ler o valor do termistor mostrado aqui é somente um exemplo. Este não deve ser considerado o único modo de lidar com o controlador ou uma limitação.

Outro meio e método de controlar o aquecedor e Ier o valor do termistor é aplicável ao caso ora divulgado. . .

O sistema de detecção cjptica de fluorescência incluiria uma fonte de excitação de 5 um LED (Diodo Emissor de Luz) e a fluorescência detectada por um fotodiodo. O sistema iria alojar fibras ópticas que seriam usadas para projetar a Iuz na amostra.

Também pode ser usada fibra óptica para canalizar a luz no fotodiodo. O LED e o fotodiodo são acoplados à fibra óptica através de um filtro de passagem de banda apropriado. A medição precisa do sinal de saída do fotodetector requer um circuito 10 que possua uma relaçãó sinal/ruído extremamente boa. O sistema de detecção de fluorescência aqui divulgado é somente um exemplo. Este não deve ser considerado o único modo de detecção ou uma limitação. Qualquer detector de fluorescência iria funcionar a menos que não conseguisse se projetar na amostra.

A invenção fornece um sistema PCR de mão comercializável para aplicação 15 específica de diagnósticc). o pda possui um software de controle rodando para fornecer um sistema PCR de mão completo com detecção em tempo real e software de controle.

Reduzindo-se a massa térmica e os Índices melhorados de aquecimento/resfriamento usando o d ispositivo, o tempo que se leva de 2 a 3 horas 20 para concluir uma reação de 30 a 40 ciclos, mesmo para um volume moderado de amosüa de 5-25 µ1, foi tèduzido para menos de 30 minutos. A figura 12 mostra o tempo que se levou parâ«amplificar o DNA Viral da Hepatite B usando o chip LTCC da invenção. O PCR foi rodado por 45 ciclos e conseguiu obter amplificação em 45 minutos. Além disso, a amplificação também foi observada quando o PCR foi rodado 25 por 45 ciclos em Zo minutos e 15 minutos. A duração convencional de HBV (45 r a 16/19 ciclos) seria de cerca de 2 horas.

A miniaturização permite leituras precisas com menores tamanhos de amostra e consumo de menores volumes dos caros reagentes. As pequenas massas térmicas dos Microssistemas e os pequenos tamanhos de amostra permitem uma ciclagem 5 térmica de baixa energia, aumentando a velocidade de muitos processos, tal como replicação de DNA através de micro PCR. Além disso, os processos químicos qLIe dependem da química :de superfície são bastante melhorados pelas relações superhcie/volume aumeritadas que são disponiveis na microescala. As vantagens dos microfluídicos levaram à demanda pelo desenvolvimento de microssistemas integrados para análise química.

O microchip traduzido em um dispositivo de mão dessa forma remove a máquina PCR de um sofisticado' laboratório, assim aumentando o alcance dessa técnica bastante poderosa,"seja para diagnóstico clínico, teste de alimento, testes de sangue em bancos de sangue ou' várias outras áreas de aplicação.

Os instrumentos PCR existentes, com múltiplas câmaras de reação, fomecem múltiplos locais de experimento de DNA todos rodando o mesmo protocolo térmico, de forma que não"'são eficientes em relação ao tempo. Surge a necessidade de .

reduzir o tempo de Feação e voIume de tomada de amostra.

O PCR instantâneo, se brojetado no futuro, poderia ter uma gama de dispositivos com resposta térmica bastante rápida e alto isolamento dos chips PCR adjacentes para rodar múitiplas reações de forma eficaz e independente com diferentes protocolos térmicos e mínima diafonia.

A análise ou quantificação dos produtos PCR é realizada pela integração prática de um sistema de detecçãò de fluorescência em tempo real. Este sistema também poderia ser integrado a sístemas de quantificação e sensores para detectar doenças

' como Hepatite B (Figura 12), AIDS, tuberculose, etc. Outros mercados incluem monitoramento de alimentos, análise de DNA, ciência forense e monitoramento ambiental.

Após determinar à uniformidade do perfil de temperatura dentro do chip, foram realizadas reações PCR'nesses chips. Fragmentos de DNA de Lambda e DNA de Salmonella foram amplificados com sucesso usando esses chips. A Figura 5 mostra o microchip em 3 visões dimensionais, mostrando suas diversas conexões com o aquecedor, anéis condutores, termistor e anéis condutores (52). Também mostra pilares (51) que estão cohectando os anéis condutores (52) à placa condutora (33).

IO A figura 6 mostra um deqenho comparativo da fusão do fragmento de DNA À-636 no chip usando o aquecedor e termistor integrados.

A figura 7 mostra o aumento no sinal de fluorescência associado à amplificação do DNA À-311. O perfil térmico foi controlado pela unidade de mão e a reação foi realizada em um chip (mistura da reação de 3µ1 e óleo de 6µ1). A fluorescência foi monitorada usando um ainplificador lock-in convencional.

A invenção também' fornece um sistema diagnóstico. O procedimento adotado para desenvolver o sistema diagnóstico foi o de inicialmente padronizar os protocolos térmicos para alguns problemas e funcionalizá-los no chip. Os iniciadores designados para o DNA ribossômico 16S amplificaram o fragmento de E. coli e Salmonella em - 300 - 400 bp enquanto os iniciadores para o gene stn amplificaram o fragmento de Salmonella typhi em - 200 bp, Os produtos obtidoS fora'm confirmados por detecção de fluorescência verde SYBR bem como eletroforese eíii gel de agarose. As figuras 7 e 11 mostram a figura gel do DNA À-311 amplificado e o gene de Salmonella usando microchip.

Perfil térmico para amplificação de DNA À-311:

mE Desnaturação: 94°C (90s) 940C (30S) - 50OC (30S) - 72°C (45S) Extensão: 72°C (120S) ' Perfil térmico para amplificação do gene da Salmonella: Desnaturação: 94°C (90s) 94°C (30S) - 55°C (30S) - 72°C (30S) Extensão: 72°C (30OS) PCR com sangue e plasnna processado O sangue ou plasma foi íratado com um agente de precipitação que pode precipitar as principais substâncias inibidoras de PCR dessas amostras. O sobrenadante claro foi usado como modelo. Usando este protocolo, foram obtidas amplificações para fragmentos de -2ÓÒ bp de Salmonella typhi (figura 8). Na figura 8, a imagem de eletroforese em gel"'most:a

1. reação de controle, l

2. Produto PCR - sanguelsem processamento,

3. Produto PCR - sangue com processamento

4. Produto PCR - plasma processado Tampão para PCR 'direto de sangue Um tampão exclusivo fo'i formulado para PCR direto com amostras de sangue ou plasma. Usando este sis'tema de tampão exclusivo, foi obtida amplificação de PCR direto com sangue e pIasma. Com este sistema de tampão, foi obtida amplificação de até 50% para sangue e 40% para plasma (ver Figuras 9 e 10) usando o chip LTCC da invenção. Na figura 9, a imagem de eletroforese em gel mostra

1. Produto de PCR 20% de sangue, 0

2. Produto de PCR ' 3Q°/o de sangue,

3. Produto de PCR - 40% de sangue,

4. Produto de PCR - 50°6 de sangue, e Na figura 10, a imagem de eletroforese em gel mostra 1, Produto PCR - 20°6 de plasma,

2. Produto PCR - 30% de plasma,

3. Produto PCR - 4Ô°/o de plasma,

4. Produto PCR - 50°6 de pIasma,

5. reação de controle O tampão exclusivo inclui sal de tampão, um cloreto ou sulfato contendo Íon bivalente, um detergente'não-jônico, um estabilizador e um álcool de açúcar.

A figura 13 mostra:' uma' curva de fusão do chip LTCC para derivada do sinal de fluorescência para a fúsão do DNA À-311. A figura também fornece uma comparação entre esta invenção (131) e o dispositivo PCR convencional (132). Pico maior: valor do pico/largura (eixo X) @ meio valor de pico = 1,2/43 Pico menor: valor do pico/largura (eixo x) @ meio valor de pico = 0,7/63 Uma relação maior indica um pico maior. Também no gráfico, o eixo y é a derivada (incliriação da curva de fusão), inclinação maior indica maior fusão.

Claims (1)

1. REIVINDICACOES i. MICROCHIP, feito de camadas de cerâmica co-sinterizada a baixas temperaturas (LTCC), caracterizado por incluir: a) uma câmara de reação forinada em uma diversidade de camadas para carregar uma amostra, b) anéis condutores cercando a câmara de reação, e C) aquecedor embutido em pelo menos uma camada para fornecer calor aos anéis condutores.

   2. MICROCHIP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo aquecedor fornecer calor aos anéis condutores através do condutor embutido em pelo menos uma camada, de preferência colocado abaixo da câmara de reação.

   3. MICROCHIP"; de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelos anéis condutores estarem conectados à(S) camada(s) condutora(s).

   4. MICROCHIP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo chip incluir um sensor de temperatura coIocado fora do chip ou embutido em pelo menos uma camada do chip.

   5. MICROCHIP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo chip fornecer almofadas de contato para conectar q circuito de controle externo ao sensor de temperatura e ao aquêcedor.

   6. MICROCHIP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela base da câmara de reação e do aquecedor possuir um intervalo na faixa entre 0,2 mm até cerca de 0,7 mm. '

   7. MICROCHIP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela câmara de reação ter um vdume'que fica na faixa entre 1 µ1 até cerca de 25 µ1.

   8. MÉTODO DE FAéRICAÇÃO DO MICROCHIP, caracterizado por incluir as h .

   2/3 etapas: a) disposição de uma diversidade de camadas feitas de LTCC e contendo um poço para formar uma câmara de reação em que a câmara é cercada por anéis P- condutores.

   5 b) colocação de pelo menos uma camada de LTCC incluindo o aquecedor abaixo da câmara, C) colocação de uma ou várias camadas condutoras entre o aquecedor e a câmara de reação, e ' d) interconexão das camadas para formar o microchip; 10 9. MICRODlSPOSlT!VO PCR, caracterizado por incluir: a) um microchip feito dè camadas LTCC incluindo> câmara de reação formada em uma diversidade de camadas para carga de uma amostra, anéis condutores cercando a câmara de reação e aquecedor embutido em pelo menos uma camada para fornecer calor aos anéis condutores, 15 b) um sensor de (emperatura embutido no microchip ou coIocado fora do chip para medir a temperatura do íhip.

   C) um circuito de controle para controlar o aquecedor com base na entrada do sensor de temperatura, e d) um sistema óptico para detectar sinal fluorescente da amostra; 20 10. MICRODISPOSITIVO PCR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo dispositivo ser:ium díspositivo de mão controlado por uma plataforma portátil de 'I computação.

   11. MICRODISPOSIT/VO PCR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo dispositivo ser disposto de forma a conter múltiplos PCRs.

   25 12. MICRODISPOSITIVO PCR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado

   Ê pelo microchip podér ser Íiberado do dispositivo.

   13. MÉTODO DE DETECTAR UM ANALITO EM UMA AMOSTRA OU

   DIAGNOSTICAR UMA CONDIÇÃO DE DOENÇA USANDO UM MICRODISPOSITIVO PCR, tal método caracterizado por incluir os seguintes 5 passos: a) carga de uma amostra incluindo ácido nucléico em um microchip incluindo uma câmara de reação·' cercada por anéis condutores, amplificando o ácido nucléico utilizando o microdisposiüvo PCR; e b) determinação da presença ou ausência de anaiito com base numa leitura de fluorescência do ácido nucléico amplificado, ou determinar a presença ou ausência de um patógeno com base em uma Ieitura de fluorescência do ácido nucléico amplificado para diagnosticar a condição de doença.

   14. MÉTODO DE IJETECTAR UM ANALITO EM UMA AMOSTRA OU

   DIAGNOSTJCAR UMA CONDIÇÃO DE DOENÇA USANDO UM MICRODJSPOSITIVO PCR, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo ácido nucléico ser DNA ou RNA.

   15. MÉTODO DE DETECTAR UM ANALÍTO EM UMA AMOSTRA OU

   DIAGNOSTICAR UMA CONDIÇÃO DE DOENÇA USANDO UM MICRODlSPOSlTI\ÍO PCR, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo método fornecer análise (iualitativa e quantitativa dos produtos amplificados.

   V e ..

   4

   'k " 1/9 .

   W, 10 11 :tr:*±.., , ~ z" .;á],g'?tYk;.!':'.."!'·.' 0· .

   ' . '"fíÜ :..'.-' . ·'. -- %.,

   0. g' "· ,:> l' ·."i"3-t · ' r ík 'gx .m,.í5' ;'"ü ""ST 12 ¢?!:!",- ....

   *P Y !Fa?'b'"""" / ( :G;. ,'--

   Q / m . - ' 'ÇO ' ., · à ' .. .·.

   A r j3 15 ' 14 ·Figüra 1 k g"

   11 nT;Tà==L e'~ -'"'" -".' '.-""::P"?J '"F ug·. 4'. ' '":àj .'-'r '.:

   13

   '=Eád 12

   14 15

   16a . 16b 17a 17b

   Figura 2

   'F 'g 3/9

   36

   . 35

   ' 34

   " m~N~~~~ " " ' 32

   15 _--~ 31

   " F "T - - A/""

   Figura 3

   0" 4/9 W-.

   44 43 42 0 ^—-- I I Acionador rm de aquecedor I q Aquecedor '='" i Para o u) u, | Termistor smart phone üi o -—- = ¶:g? u . Amplihcador de Ponte p Ponte_ I Wheatstone \. "" "TT"" ' jjd ' 10 41 46 Figura 4 j. - -._

   *". à 5/9 a ¥-

   0 0 r

   <"Y. '"='"' 't i ^w"""'"" , ,%JM~=k' " X^'" Vmà. · ,, 7. ""C"<: --iZiZ '- í<^ -""-?="t & ."p":í.3Ct>.~>£Ü.".-·d[t · C'-.í:"iFi.|"' <] h W · G="""" ó-- '" lli Àí·«.",! 4

   'qZ í:" _ .----Mp " -·: Ij :. ":" -: ) : ji,r?>çi >" . ~.í^ 'X 5'V » ~ ' w , m

   ""y'"""""'"'""' ;: jjj L'j "'y'jj'y'"" :1;'íá- r® k, 'J ";f:'b

   Figura 5

   310T

   Ii 'JAt- :j 2®j cn ! "°t ~ _ Fusão de QNA

   € mj % m ú5 260 "yk5c 250 , 60 120 180 240 300 360 42Q 480 540 60Q 660

   Tempo (s)

   Figura 6

   .@" '

   6/9

   400 T

   O.,,,)Jm,o Tempo (S)

   (a) (b) Figura 7

   X k . . ...

   . ' â Figura 9

   'r 0 819

   J -

   R V~ 400 3 & 390j & 380j

   W 'Õ 37cj

   C '8 360 cn e 350 ! 340 ~ CD m "O a 320

   C ü5 MO " 300 nh:vu'p :r:r: 0 GOO 1200 1800 2400 30UO 3600 4200 Ternpo (s) Figura 11 fj § 9/9 %, vC

   Y 131 T ;;t /-\ / ? 1.1 g

   B Z 1.oj / \ / 132 .S! 0.9+ cy 0-0j í iii| g'" "" \ { ::j ^ 0.21~" -J' \"""\ \ \, 0K't

   0.0 L,m,m~rrmmm~mmmImlnk[i|'...un·I· '·1 I ' ,, L .l . '4'"P4 I ·. i 400 420 440 460 480 ào 520 540 Tenipo ($) ,Figura 13