JP2011509070A - ハンドヘルドマイクロpcr装置 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
a)ヒータ、及び試料を装填するリアクションチャンバを含むLTCCマイクロPCRチップ、
b)温度センサから受け取った入力情報に基づいて、該ヒータを制御するためのヒータ制御手段、
c)該試料からの蛍光シグナルを検出するための光学検知システム、並びに
d)他の装置と通信するための少なくとも一の通信インターフェース
を含むハンドヘルドマイクロPCR装置に関する。
a)ハンドヘルドマイクロPCR装置と他の装置との間の通信を、通信インターフェースを介して確立し、
b)LTCCマイクロPCRチップを制御するために他の装置から受け取った熱プロファイル値に基づいて熱サイクリング工程を開始し、
並びに
c)光学システムによって検知された光シグナルを他の装置へ送る
工程を含む前記方法に関する。
1.93℃、15〜30秒間での変性
2.55℃、15〜30秒間でのプライマのアニーリング
3.72℃、30〜60秒間でのプライマの伸長
光学(蛍光)検知システムは、照明源(典型的にはLED)、適合な波長の光を選択するためのフィルタ、試料から光を回収し運ぶための光学部品、及び光センサ(光ダイオード、光電子増倍管、光トランジスタ、イメージセンサなど)を含む。それは、また、光源を駆動し、光センサからのシグナルを検出する回路構成(105)を含む。ポータブル用途では、低消費電力(<1ミリW)のために光ダイオードや光トランジスタあるいはイメージセンサが好ましい。PCR産物のリアルタイム検知には蛍光技術を採用し、ここで、PCR混合物内に存在する感光性染料(SYBRグリーンのようなフルオロフォア)が一定波長の光を吸収し、高波長を放出する(SYBRグリーンの場合、470nm及び520nm)。典型的には、放出光強度は、PCRの上首尾な進行とともに徐々に増減する。放出強度の変化のモニタリングは、PCR装置のリアルタイム検知能力を与える。PCR試料からの光のカップリング及び採集は、いろいろな方法で達成することができる。以下の方法が、本システムに採用可能である:
・焦点レンズ、フィルタ及び検知器を用いた照明及び検知用光ファイバを採用したハイブリッド光学検知システム。図20
PDAアプリケーションプログラムは、セットポイント値(温度及び時間)並びにサイクル数を含むインプットデータを許可する。セットポイント値は、ハンドヘルドユニットへブルートゥースコネクションを介して伝達され、そして、ハンドヘルドユニットの応答を待つ。セットポイント値に達すると、ハンドヘルドユニットは、同じものをPDAへ通信し、PDAは次のインストラクションセットを送る(図17)。PDAは、また、ハンドヘルドからデータ(温度及び光学データ)を受け取り、それを表示する。PDAによって送られるインストラクションを通信し、そして実行するため、ハンドヘルドは、ブルートゥース通信及びアナログ回路の制御を可能にする埋め込まれたプログラムを持つマイクロコントローラを有する。さらに、マイクロコントローラ上のプログラムは、継続的に温度及び光学データをPDAへ送る。PDAアプリケーションは、4つのモジュールを有する:
1.アクセス制御
2.GUI
3.データ処理及び通信
1.このモジュールは、ユーザにアプリケーションへのログインを許可する
2.それは、ユーザネーム及びパスワードを持ったログインスクリーンを有する
3.二つのレベルのアクセス制御を有する
a.管理
b.ユーザ
4.管理者は、以下の権限を有する:
a.ユーザ及びユーザフォルダを作成する
b.熱プロファイルを作成する
c.ハンドヘルド装置(109)を結合/変更する
5.ユーザネーム及びパスワードで一度ログインしたユーザは、アプリケーションを実行し、セッションに関係するデータを見、記憶する権限を有する。
1.GUIモジュールは、以下のためのスクリーンを提供する:
a.管理者が、異なるセットポイント値(温度及び時間)を入力し、及び熱プロファイルを作成/削除/修正する
b.ユーザ及びユーザフォルダを作成/削除する
c.ハンドヘルド装置を変更する
i.アプリケーションは、レンジ内のブルートゥース装置検出するためにブルートゥーススタックを使用する。検出後、それは、レンジ内のすべての使用可能な装置を表示する。管理者は、ハンドヘルド装置を選択し、アプリケーションがブルートゥーススタックにハンドヘルド装置(109)との提携(pair)を要求する。提携後、提携装置情報を将来の使用のために記憶する
d.アプリケーションのスタート、ストップ、リスタート及びポーズ
e.伝達され及びアプリケーションによって受け取られたデータを示すログウインドウ
2.GUIモジュールは、ハンドヘルドユニットから収集した熱及び光学的データをプロットするスクリーンを有する。
データ処理モジュールは、以下の機能を有する:
1.データ変換
2.通信アルゴリズム
1.データは、ユーザにより選択された熱プロファイルから収集する。
2.以下は典型的な熱プロファイルである:
6.ハンドヘルドユニットから収集した熱データは、下式を用いて16進数値からプロット用電圧に変換される。
データ通信モジュールは、ウインドウズモバイルブルートゥーススタックと通話する。以下のプロトコルが通信の間、フォローされる:
アプリケーションプログラムによって設けられたスタートボタンが熱サイクリング工程を開始する。アプリケーションは、ブルートゥーススタックにハンドヘルドユニットとの無線シリアルポートコネクションを確立するよう要求する。認識を受けとった後、PDAは、ハンドヘルドユニットとの通信を開始する。
ストップコマンドは、サーマルサイクリングをストップし、ハンドヘルドユニットにチップ温度を室温へ下げるよう指示する−この工程は、再スタートされない。ポーズは、チップ温度を現在のランニング温度に維持する。これは、続行コマンドにより取り消すことができる。
変性:94℃(90秒)
94℃(30秒) − 50℃(30秒) − 72℃(45秒)
伸長:72℃(120秒)
変性:94℃(90秒)
94℃(30秒) − 55℃(30秒) − 72℃(30秒)
伸長:72℃(300秒)
血液又は血漿を、試料から主要なPCR阻害物質を沈殿させることのできる沈殿剤で処理した。透明な上清を、テンプレートとして用いた。このプロトコルを用いて、Salmonella typhiから〜200bp断片の増幅を得た(図10)。図10に、ゲル電気泳動写真を示す。
1.コントロール反応、
2.PCR産物−血液(未処理)、
3.PCR産物−処理血液、
4.PCR産物−処理血漿
血液又は血漿試料を用いた直接PCRのためにユニークバッファを配合した。このユニークバッファシステムを用いて、血液及び血漿を用いた直接PCR増幅を達成した。本発明のLTCCチップを用いてこのバッファシステムを用いると、最高50%の血液、及び40%の血漿で増幅が達成された(図11及び12参照)。
図11にゲル電気泳動写真を示す。
1.PCR産物−20%血液、
2.PCR産物−30%血液、
3.PCR産物−40%血液、
4.PCR産物−50%血液、及び
図12にゲル電気泳動写真を示す。
1.PCR産物−20%血漿、
2.PCR産物−30%血漿、
3.PCR産物−40%血漿、
4.PCR産物−50%血漿、
5.コントロール反応
より鋭いピーク:ピーク値/幅(x軸)@ハーフピーク値=1.2/43
より浅いピーク:ピーク値/幅(x軸)@ハーフピーク値=0.7/63
Claims (33)
- a)ヒータ、及び試料を装填するリアクションチャンバを含むLTCCマイクロPCRチップ、
b)温度センサから受け取った入力情報に基づいて、該ヒータを制御するためのヒータ制御手段、
c)該試料からの蛍光シグナルを検出するための光学検知システム、並びに
d)他の装置と通信するための少なくとも一の通信インターフェース
を含むハンドヘルドマイクロPCR装置。 - 該ヒータと該リアクションチャンバとの間に少なくとも一のコンダクタ層が設けられる、請求項1に記載の装置。
- 該リアクションチャンバは、コンダクタリングによって囲まれている、請求項1に記載の装置。
- 該コンダクタリングは、該コンダクタ層にポストで結合されている、請求項2及び3に記載の装置。
- 該コンダクタは、金、銀、白金及びパラジウム又はこれらの合金を含む群から選択される材料でできている、請求項2、3及び4に記載の装置。
- 該温度センサは、チップの温度を測定するために該チップの外部に置かれている、請求項1に記載の装置。
- 該温度センサは、該チップの少なくとも一の層の中に埋設されている、請求項1に記載の装置。
- 該温度センサは、サーミスタである、請求項7に記載の装置。
- 該温度センサは、ブリッジ回路の一のアームに結合されている、請求項1に記載の装置。
- 該ブリッジ回路出力は、ヒータを制御するためのヒータ制御手段に供給される前に増幅される、請求項1及び9に記載の装置。
- 該チップは、該リアクションチャンバにカバーをするための透明シーリングキャップを含む、請求項1に記載の装置。
- 該チップは、ディスポーザブルである、請求項1に記載の装置。
- 該光学検知システムは、ビームスプリッタ光学検知システム、ハイブリッド光学検知システム及び分岐光学検知システムを含む群から選択される、請求項1に記載の装置。
- 該光学システムは、光源、及び、該試料からの蛍光シグナルを検出するための光検出器を含む、請求項1に記載の装置。
- 該検出シグナルをロックインアンプが増幅する、請求項14に記載の装置。
- 該分岐光学システムは、光ファイバの一つの分岐端(605a)に置かれた光源、及び、該光ファイバのもう一つの端(605a)に置かれた光検出器を有する分岐光ファイバを使用する、請求項13及び14に記載の装置。
- 該分岐光ファイバの共通端(605b)が、該試料に向いている、請求項1及び16に記載の装置。
- 該ハイブリッド光学検知システムは、該試料上に光を向けるために光ファイバを使用する、請求項1及び13に記載の装置。
- 該ハイブリッド光学検知システムは、該試料からの散乱ビームを焦点に合わせるためのレンズを使用する、請求項1及び13に記載の装置。
- 該通信インターフェースは、シリアルインターフェース、USB、ブルートゥース又はこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項1に記載の装置。
- 他の装置は、ハンドヘルド装置からチップ温度及び増幅したシグナルを収集する、請求項1及び15に記載の装置。
- 他の装置は、スマートフォン、PDA及びプログラマブルデバイスを含む群から選択される、請求項1に記載の装置。
- ハンドヘルドマイクロPCR装置をモニタ及び制御する方法であって、
a)ハンドヘルドマイクロPCR装置と他の装置との間の通信を、通信インターフェースを介して確立し、
b) LTCCマイクロPCRチップを制御するために他の装置から受け取った熱プロファイル値に基づいて熱サイクリング工程を開始し、
並びに
c)光学システムによって検知された光シグナルを他の装置へ送る
工程を含む前記方法。 - 該熱プロファイル値を他の装置へユーザによってユーザーインターフェースを介して供給する、請求項23に記載の方法。
- 該熱プロファイルを、ユーザーインターフェースを介して生成、修正又は削除する、請求項23及び24に記載の方法。
- 他の装置は、ユーザの認証を備える、請求項23及び25に記載の方法。
- 他の装置は、複数の熱プロファイルを記憶する、請求項23に記載の方法。
- 該熱プロファイルは、セットポイント値及びサイクル数を提供する、請求項23に記載の方法。
- セットポイント値により決められた温度と時間にチップを維持する、請求項23に記載の方法。
- 熱サイクリング工程をストップすることによって、マイクロPCRチップ温度を室温までもってゆく、請求項23及び28のいずれかに記載の方法。
- 熱サイクルをポーズするとき、マイクロPCRチップの温度を一定に維持する、請求項23に記載の方法。
- モバイルブルートゥースシリアルポートプロファイルスタックを用いて他の装置と通信する、請求項23に記載の方法。
- 熱及び光学データを他の装置の表示装置上にプロットする、請求項23に記載の方法。
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