ES2714559T3 - Microchip - Google Patents

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ES2714559T3
ES2714559T3 ES08838206T ES08838206T ES2714559T3 ES 2714559 T3 ES2714559 T3 ES 2714559T3 ES 08838206 T ES08838206 T ES 08838206T ES 08838206 T ES08838206 T ES 08838206T ES 2714559 T3 ES2714559 T3 ES 2714559T3
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heater
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pcr
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Kishore Kumar
Raviprakash Jayaraman
Sankaranand Narasimha
Renjith Radhakrishnan
Sathyadeep Viswanathan
Chandrasekhar Nair
Pillarisetti Subbarao
Manjula Jagannath
Shilpa Chennakrishnaiah
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Bigtec Pvt Ltd
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Abstract

microchip (10) hecho de capas de cerámica cocida a baja temperatura que comprende una cámara de reacción (11) formada en una pluralidad de capas para cargar una muestra, caracterizado porque una pluralidad de anillos conductores (52) rodea la cámara de reacción (11), donde cada uno de la pluralidad de anillos conductores (52) están conectados entre sí a través de una pluralidad de soportes (51); un conductor se integra en la capa conductora (33) colocada debajo de la cámara de reacción (11), donde la capa conductora (33) se conecta a los anillos conductores (52) a través de los soportes (51), y un calentador (12) se integra en una capa calefactora (32) colocada debajo de la capa conductora (33), donde la cámara de reacción (11) es calentada por el calentador (12) a través de la capa conductora (33) conectada a los anillos conductores (52).

Description

DESCRIPCION
Microchip
Campo de la invencion
La descripción se refiere a un chip de micro PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) que comprende una pluralidad de capas hechas de ceramica cocida a baja temperatura (LTCC). La descripción tambien proporciona un dispositivo de pCr en tiempo real portáti clon un chip de micro PCR de LTCC desechable.
Antecedentes de la invencion
Se han producido avances recientes en biologfa molecular y celular como resultado del desarrollo de tecnicas analtticas rapidas y eficientes. Debido a la miniaturizacion y a las tecnicas de multiplexacion como el chip genetico o biochip es posible la caracterizacion de genomas completos en una sola configuracion experimental. La PCR es un procedimiento de biologfa molecular para la amplificacion in vivo de moleculas de acido nuclear. La tecnica de PCR esta reemplazando rapidamente a otras que consumen tiempo y a tecnicas menos sensibles para la identificacion de especies biologicas y patogenos en muestras forenses, ambientales, clmicas e industriales. Entre las biotecnicas, la PCR se ha convertido en la etapa analftica mas importante en laboratorios de ciencias biologicas para un gran numero de diagnosticos moleculares y clmicos: el desarrollo significativo hecho en la tecnologfa de PCR como la PCR en tiempo real, ha conducido a procesos de reaccion rapidos en comparacion con los procedimientos convencionales. Durante los ultimos anos, la tecnologfa de microfabricacion se ha expandido a la miniaturizacion del sistema de reaccion y analisis como el analisis por PCR con la intencion de reducir aun mas el tiempo de analisis y el consumo de reactivos. Varios grupos de investigacion han estado trabajando en los dispositivos 'laboratorio en un chip' y han liderado numerosos avances en los campos de la separacion miniaturizada y los sistemas de reaccion. En la mayona de las PCR disponibles ahora, los cambios de temperatura instantaneos no son posibles debido a que las capacidades termicas de la muestra, del contenedor y del ciclador y la amplificacion extendida calculan un resultado de 2 a 6 horas. Durante los periodos en los que la temperatura de la muestra esta haciendo una transicion de una temperatura a otra, se producen reacciones extranas e indeseables que consumen reactivos importantes y crean compuestos interferentes no deseados.
El documento WO 01/41931 A2 se refiere a procedimientos y aparatos para realizar analisis. Se refiere, particularmente a dispositivos microflmdicos. Los dispositivos pueden ser fabricados mediante la tecnologfa de ceramica multicapa para formar dispositivos en los que se puedan realizar reacciones moleculares controladas independientemente y en paralelo, tales como reacciones de amplificacion de acido nucleico que incluyen PCR. El dispositivo comprende un pocillo de manipulacion de muestra que puede ser una camara de amplificacion de ADN. Para transportar fluidos en la camara de amplificacion de ADN a una temperatura adecuada para realizar la PCR, el dispositivo puede estar provisto de un calentador en contacto termico con la camara. El calentador se puede configurar como una bobina que rodea la camara, estando definida la bobina por bucles de material conductor. El documento WO 00/21659 A1 describe un dispositivo integrado multicapa microflmdico y procedimientos para hacer el mismo. El dispositivo se forma mediante la smtesis conjunta de una pluralidad de capas de laminas verdes. El dispositivo puede incluir un calentador formado por una bobina vertical enrollada alrededor de una cavidad.
El documento EP 0870 541 A2 se refiere a una planta microqmmica de ceramica integrada que tiene un cuerpo ceramico unitario formado a partir de multiples capas ceramicas en el estado verde en el que se sinterizan de manera conjunta. El cuerpo ceramico forma una camara para mezclar o hacer reaccionar productos qmmicos en un fluido. La camara puede tener una estructura de bobina helicoidal integrada que se puede conectar a una fuente de alimentacion externa para calentar la camara.
Objetos de la invencion
Un objeto de la presente invencion era proporcionar un microchip que permita una ejecucion mas rapida de la PCR. Otro objeto de la presente invencion era proporcionar un microchip mejorado.
Uno de los principales objetos de la invencion es desarrollar un microchip que comprende una pluralidad de capas de LTCC.
Otro objeto mas de la presente invencion es desarrollar un procedimiento de fabricacion del microchip.
Otro objeto mas adicional de la presente invencion es desarrollar un dispositivo de micro PCR que comprende el microchip.
Otro objeto mas de la presente invencion es desarrollar un procedimiento para diagnosticar afecciones o enfermedades utilizando el dispositivo de micro PCR.
Estado de la invencion
Por consiguiente, la invencion proporciona un microchip como se describe en la reiv 1i,nd unic parcoicóendimiento de fabricacion de un microchip como se describe en la reivindica 6c,ió unn dispositivo de micro PCR como se describe en la reivindicación 7 y un procedimiento de deteccion de un analito en una muestra o el diagnostico de una afeccion o enfermedad como se describe en la reivindi 1c2a.ción
Breve descripción de los dibujos adjuntos
La invencion se describira ahora con referencia a los dibujos adjuntos:
La figura 1 muestra una vista ortografica de una realización del chip de micro PCR de LTCC.
La figura 2 muestra una seccion transversal de una realización del chip de micro PCR de LTCC.
La figura 3 muestra un diseno capa por capa de una realización del chip de micro PCR de LTCC.
La figura 4 muestra un diagrama de bloques de una realización del circuito que controla el calentador y el termistor.
La figura 5 muestra un modelo del diseno de la camara de reaccion del chip fabricado.
La figura 6 muestra la fusion del fragmento de ADN lambda-636 en el chip mediante el calentador / termistor integrado, controlado por la unidad manual.
La figura 7 muestra la amplificacion por PCR del fragmento de ADN lambda-311 en el chip. (a) Senal de fluorescencia en tiempo real desde el chip; (b) Imagen del gel que confirma el producto de amplificacion.
La figura 8 muestra una imagen de un gel de PCR de sangre y plasma procesados para la unidad ribosomal 16S de salmonela.
La figura 9 muestra una imagen de un gel de PCR en sangre directa para la unidad ribosomal 16S de salmonela. La figura 10 muestra una imagen de una PCR en plasma directa de gel para la unidad ribosomal 16S de salmonela.
La figura 11 muestra la amplificacion por PCR del gen de salmonela mediante microchip. (a) Senal de fluorescencia en tiempo real desde el chip; (b) Imagen del gel que confirma el producto de amplificacion.
La figura 12 muestra el tiempo necesario para amplificar el ADN viral de hepatitis B mediante un chip de LTCC. La figura 13 muestra la curva de fusion del chip de LTCC para la derivada de la senal de fluorescencia para la fusion del ADN A-311.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a un microchip que comprende una pluralidad de capas hechas de ceramica cocida a baja temperatura (LTCC), donde una camara de reaccion se forma en una pluralidad de capas de camara de reaccion para cargar una muestra, un conductor se integra en al menos una capa conductora colocada debajo de la camara de reaccion y un calentador se integra en al menos una capa calefactora colocada debajo de la(s) capa(s) conductora(s). En una realización de la presente invencion, la camara de reaccion esta cubierta con una tapa de sellado transparente. En una realización de la presente invencion, el chip comprende un sensor de temperatura. En una realización de la presente invencion, el sensor de temperatura se integra en al menos una capa de sensor del chip. En una realización de la presente invencion, el sensor de temperatura es un termistor. En una realización de la presente invencion, el chip proporciona almohadillas de contacto para conectar el circuito de control externo al sensor de temperatura y al calentador. En una realización de la presente invencion, el sensor de temperatura se coloca fuera del chip para medir la temperatura del chip.
En la presente invencion, la camara de reaccion esta rodeada de anillos conductores.
En la presente invencion, los anillos conductores se conectan a la(s) capa(s) conductora(s) con soportes.
En una realización de la presente invencion, el conductor esta hecho de material seleccionado del grupo que comprende oro, plata, platino y paladio o aleaciones de los mismos.
En una realización de la presente invencion, hay una separacion entre la base de la camara de reaccion y el calentador, y dicha separacion oscila entre aproximadamente 0,2 mm y aproximadamente 0,7 mm.
En una realización de la presente invencion, la muestra es un alimento o una muestra biologica seleccionada de un grupo que comprende sangre, suero, plasma, tejidos, saliva, esputo y orina.
En una realización de la presente invencion, la camara de reaccion tiene un volumen que oscila desde aproximadamente 1 pl hasta aproximadamente 25 pl.
La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento de fabricacion de un microchip que comprende las etapas de:
a) disponer la pluralidad de capas hechas de ceramica cocida a baja temperatura (LTCC) y que tienen un pocillo para formar una camara de reaccion,
b) colocar al menos una capa de LTCC que comprende el calentador debajo de la camara,
c) colocar una o varias capas conductoras entre el calentador y la camara de reaccion, e
d) interconectar las capas para formar el microchip.
En una realización de la presente invencion, donde colocar al menos una capa de LTCC que comprende un sensor de temperatura entre el calentador y la camara de reaccion o debajo del calentador.
En la presente invencion, la camara de reaccion esta rodeada de anillos de conduccion.
La presente invencion proporciona soportes para conectar los anillos de conduccion a la(s) capa(s) conductora(s). La presente invencion tambien se refiere a un dispositivo de micro PCR que comprende:
a) un microchip que comprende una pluralidad de capas de LTCC, donde se forma una camara de reaccion en una pluralidad de capas para cargar la muestra, el conductor se integra en al menos una capa colocada debajo de la camara de reaccion y el calentador se integra en al menos una capa colocada debajo de la(s) capa(s) conductora(s);
b) un sensor de temperatura integrado en el microchip o colocado fuera del chip para medir la temperatura del chip,
c) un circuito de control para controlar el calentador basado en la entrada del sensor de temperatura; y d) un sistema opti
En una realización de la presente invencion, el dispositivo es un dispositivo manual.
En una realización de la presente invencion, el dispositivo se controla con una plataforma informatica portát.il En una realización de la presente invencion, el dispositivo esta dispuesto en una matriz para llevar a cabo multiples PCR.
En una realización de la presente invencion, el microchip es liberable del dispositivo.
La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento de deteccion de un analito en una muestra o el diagnostico de una afeccion o enfermedad utilizando un dispositivo de micro PCR, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
a) cargar una muestra que comprende acido nucleico en un microchip que comprende una pluralidad de capas de LTCC,
b) amplificar el acido nucleico ejecutando el dispositivo de micro PCR; y
c) determinar la presencia o ausencia del analito basado en una lectura de fluorescencia del acido nucleico amplificado o determinar la presencia o ausencia de un patogeno basado en una lectura de fluorescencia del acido nucleico amplificado para diagnosticar la afeccion o enfermedad.
En una realización de la presente invencion, el acido nucleico es ADN o ARN.
En una realización de la presente invencion, el procedimiento proporciona un analisis tanto cualitativo como cuantitativo de los productos amplificados.
En una realización de la presente invencion, la muestra es un alimento o una muestra biologica.
En una realización de la presente invencion, la muestra biologica se selecciona de un grupo que comprende sangre, suero, plasma, tejidos, saliva, esputo y orina.
En una realización de la presente invencion, el patogeno se selecciona de un grupo que comprende virus, bacterias, hongos, levaduras y protozoos.
El termino “capa de la camara de reaccion” en la descripción se refiere a cualquier capa del microchip involucrada en la formacion de la camara de reaccion y que entra en contacto con una muestra.
El termino “capa conductora” en la descripción se refiere a cualquier capa del microchip que tiene un conductor integrado en la misma.
El termino “capa calefactora” en la descripción se refiere a cualquier capa del microchip que tiene un calentador integrado en la misma.
La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) es una tecnica descubierta para sintetizar multiples copias de un fragmento espedfico de ADN desde una plantilla. El proceso original de PCR se basa en la enzima polimerasa de ADN estable al calor de Thermus aquaticus (Taq), que puede sintetizar una cadena complementaria a una cadena de ADN dada en una mezcla que contiene cuatro bases de ADN y dos fragmentos cebadores de ADN que flanquean la secuencia de destino. La mezcla se calienta para separar las cadenas de ADN de doble helice que contienen la secuencia de destino y luego se enfna para permitir que los cebadores encuentren y se unan a sus secuencias complementarias en las cadenas separadas y la Taq polimerasa para extender los cebadores en nuevas cadenas complementarias. Los repetidos ciclos de calentamiento y enfriamiento multiplican de manera exponencial el ADN de destino, ya que cada nueva cadena doble se separa para convertirse en dos plantillas para una mayor smtesis. Un perfil de temperatura tfpico para la reaccion en cadena de la polimerasa es el siguiente:
1. Desnaturalizacion a 93 °C durante 15 a 30 segundos.
2. Recocido del cebador a 55 °C durante 15 a 30 segundos.
3. Extension de los cebadores a 72 °C durante 30 a 60 segundos.
Como ejemplo, en la primera etapa, la solucion se calienta a 90 - 95 °C, de modo que la plantilla de doble cadena se funda (“se desnaturalice”) para formar dos cadenas individuales. En la proxima etapa, se enfna a 50 - 55 °C, de modo que los fragmentos de ADN especialmente cortos sintetizados (“cebadores”) se unan a la seccion complementaria de la plantilla (“recocido”). Finalmente, la solucion se calienta a 72 °C cuando una enzima espedfica (“ADN polimerasa”) extiende los cebadores uniendo bases complementarias de la solucion. Por lo tanto, dos cadenas dobles identicas se sintetizan a partir de una sola cadena doble.
La etapa de extension del cebador debe incrementarse por aproximadamente 60 seg / kbase para generar productos mas largos que unos pocos cientos de bases. Los anteriores son tiempos instrumentales tfpicos; de hecho, las etapas de desnaturalizacion y recocido se producen casi instantaneamente, pero los indices de temperatura en instrumentos comerciales generalmente son inferiores a 1 °C / seg cuando se utilizan bloques metalicos o agua para el equilibrio termico y las muestras estan contenidas en tubos de microcentnfuga de plastico.
Mediante la micromecanizacion de las camaras de PCR de baja masa aisladas termicamente, es posible producir en masa un instrumento de PCR mucho mas rapido, mas eficiente energeticamente y mas espedfico. Ademas, las transiciones rapidas de una temperatura a otra aseguran que la muestra emplee una cantidad minima de tiempo a temperaturas intermedias no deseables, de modo que el ADN amplificado tenga optima fidelidad y pureza.
La ceramica cocida a baja temperatura (LTCC) es la version moderna de la tecnologfa de peftcula gruesa que se utiliza en el empaque de componentes electronicos para la automocion, la defensa, la industria aeroespacial y de telecomunicaciones. Es un material ceramico vftreo a base de alumina que es qmmicamente inerte, biocompatible, termicamente estable (> 600 °C), tiene baja conductividad termica (< 3W / mK), buena resistencia mecanica y proporciona buena hermeticidad. Se utiliza convencionalmente en el empaque de dispositivos electronicos al nivel de chip donde proporciona funciones tanto estructurales como electricas. Los presentes inventores han reconocido la idoneidad de la LTCC para ser utilizada en aplicaciones de microchips de PCR y, de acuerdo con lo que saben los inventores, la LTCC no ha sido utilizada antes para dicho fin. Los sustratos basicos en la tecnologfa de LTCC son preferentemente capas (verdes) no cocidas de material ceramico vftreo con un aglutinante polimerico. Las caractensticas estructurales estan formadas por el corte / punzonado / perforacion de estas placas y el apilamiento de multiples capas. El proceso de capa por capa permite crear caractensticas tridimensionales esenciales para MEMS (sistemas microelectromecanicos). Se pueden fabricar facilmente caractensticas de hasta 50 micrones en LTCC. Los circuitos electricos se fabrican mediante serigraffa de pasta conductiva y resistente en cada capa. Las capas multiples estan interconectadas por vfas de perforacion y se rellenan con pasta conductiva. Estas capas son apiladas, comprimidas y cocidas. El procesamiento de pilas de hasta 80 capas ha sido reportado en la literatura 1. El material cocido es denso y tiene buena resistencia mecanica.
Normalmente, el producto de la PCR se analiza mediante electroforesis en gel. En esta tecnica, los fragmentos de ADN despues de la PCR se separan en un campo electrico y se observan mediante tincion con una tintura fluorescente. Un esquema mas adecuado es utilizar una tintura fluorescente que se une espedficamente al ADN de cadena doble para monitorizar la reaccion continuamente (PCR en tiempo real). Un ejemplo de este tipo de tintura es SYBR GREEN que es excitado por 490 nm de luz azul y emite 520 nm de luz verde cuando se une al ADN. La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN de producto de doble cadena formado durante la PCR y por lo tanto aumenta con el numero de ciclos.
La figura 1 muestra una vista ortografica de una realización del microchip de PCR que indica la camara de reaccion (11) o el pocillo. La figura indica el montaje del calentador (12) y un termistor de sensor de temperatura (13) dentro del chip de micro PCR de LTCC. Tambien se indican las lmeas conductoras del calentador (15) y las lmeas conductoras del termistor (14). Estas lmeas conductoras ayudaran a proporcionar la conexion del calentador y el termistor integrado de manera articulada con circuitos externos.
Con referencia a la figura 2 que muestra una vista en seccion transversal de una realización del chip de micro PCR de LTCC donde (16a y 16b) indican las almohadillas de contacto para el calentador (12) y (17a y 17b) indican la almohadilla de contacto para el termistor (13).
Con referencia a la figura 3, que muestra el diseno de capa por capa de una realización del chip de micro PCR de LTCC, donde el chip consiste en 12 capas de cintas de LTCC. Hay dos capas base (31), tres capas intermedias que tienen la capa calefactora (32), una capa conductora (33) y una capa que tiene el termistor (34) mientras que (35) forma la capa de interfaz a la camara de reaccion (11). Las capas de la camara de reaccion (36) consisten en seis capas como se muestra. La capa conductora (33) tambien se proporciona entre el calentador y las capas del termistor. Tambien se indican la lmea conductora del calentador (33) y las lmeas conductoras del termistor (32). En la figura se muestran las lmeas conductoras (32) colocadas a cada lado de la capa del termistor (34). El diseno del calentador puede ser de cualquier forma como “escalera”, “serpentina”, “lmea”, “placa”, etc., con un tamano que vana de 0,2 mm x 3 mm a 2 mm x 2 mm. El tamano y la forma del calentador pueden seleccionarse basandose en los requisitos. Los requisitos podnan ser similares, dependiendo del tamano de la camara de reaccion o la muestra probada o el material utilizado como capa conductora.
La figura 3 muestra el diseno de capas y una imagen de una realización del chip de empaque fabricado. El chip de LTCC tiene un volumen de pocillo de 1 a 25 pl y una variacion de resistencia (calentador y termistor) de alrededor del 50 %. Los valores de resistencia del calentador (~40 Q) y del termistor (~1050 Q) fueron consistentes con los valores estimados. El calentador se basa en un elemento resistivo de pelmula gruesa que se emplea en paquetes convencionales de LTCC. El sistema de termistor con alumina se utiliza para la fabricacion de sensores de temperatura integrados. El TCR medido del chip estuvo entre 1 y 2 Q / °C. El chip se fabrico en el sistema verde DuPont 951. La capa del termistor puede colocarse en cualquier lugar del chip o un sensor de temperatura puede colocarse fuera del chip en lugar del termistor dentro del chip.
Con referencia a la figura 4, que muestra el diagrama de bloques de una realización del circuito que controla el calentador y el termistor donde el termistor en el chip de micro PCR de LTCC (10) actua como uno de los brazos en el puente (46). La salida amplificada del puente desde el amplificador del puente (41) se da como entrada al controlador PID (43), donde se digitaliza y el algoritmo PID proporciona una salida digital controlada. La salida se convierte nuevamente a la tension analogica y esto impulsa el calentador utilizando un transistor de potencia presente en el controlador del calentador (46). Ademas, es mas barato procesar la LTCC en comparacion con el procesamiento de la silicona.
La invencion tambien proporciona mejorar los sistemas de PCR convencionales en tiempo de analisis, portabilidad, volumen de muestra y la capacidad de realizar analisis y cuantificacion del rendimiento. Esto se consigue con un dispositivo de micro PCR portát,il con deteccion / cuantificacion sobre el terreno en tiempo real de los productos de PCR que comprende lo siguiente:
- Un chip de PCR desechable que consiste en una camara o camaras de reaccion, un calentador integrado y un sensor de temperatura con una tapa de sellado transparente.
- Una unidad electronica manual que consiste en las siguientes unidades:
- Circuito de control para el calentador y el sensor de temperatura.
- Sistema de deteccion optica de fluorescencia.
- Un telefono inteligente o PDA (asistente digital personal) que ejecuta un programa para controlar dicha unidad manual.
El chip de PCR desechable consiste en una camara de reaccion que es calentada por un calentador integrado y monitorizada por un termistor integrado. Se fabrica en un sistema de ceramica cocido a baja temperatura (LTCC) y se empaca adecuadamente con un conector con contactos para el calentador y el sensor de temperatura.
El calentador integrado esta hecho de pasta de resistencia como la serie CF de DuPont compatible con LTCC. Puede utilizarse cualquier sistema de cinta de ceramica verde, tal como DuPont 95, ESL (serie 41XXX), Ferro (sistema A6) o Haraeus. Dicho sensor de temperatura integrado es un termistor fabricado utilizando una pasta de termistor de resistencia de PTC (coeficiente de temperatura positivo) (por ejemplo, 509X D, son ESL 2612 de ESL Electroscience) para sustratos de alumina. Tambien puede utilizarse un NTC: coeficiente de temperatura negativo de pasta de resistencia como NTC 4993 de EMCA Remex.
La tapa de sellado transparente (longitud de onda de 300 a 1000 nm) sirve para evitar la evaporacion de la muestra desde dicha camara de reaccion y esta hecha de material polfmero.
El circuito de control consistina en un circuito de control de encendido / apagado o de PID (diferencial integral proporcional), que controlana el calentador basado en la salida de un circuito puente del cual el termistor integrado podna formar una parte. El procedimiento de control del calentador y de lectura del valor del termistor descrito en el presente documento es solo un ejemplo. Esto no debe ser considerado como la unica forma del controlador o como una limitacion. Otros medios y procedimientos para controlar el calentador y leer el valor del termistor tambien se pueden aplicar al descriptor instantaneo.
El sistema de deteccion optica de fluorescencia podna comprender una fuente de excitacion de un LED (diodo emisor de luz) y la fluorescencia detectada por un fotodiodo. El sistema contendna fibras opticas que se utilizanan para proyectar la luz sobre la muestra. La fibra optica tambien se puede utilizar para canalizar la luz hacia el fotodiodo. El LED y el fotodiodo estan acoplados a la fibra optica a traves de un filtro de paso de banda apropiado. Para la medicion precisa de la senal de salida del fotodetector se requiere un circuito que tenga muy buena relacion senal - ruido. El sistema de deteccion de fluorescencia descrito en el presente documento es solo un ejemplo. Esto no debe ser considerado como la unica forma de deteccion o como una limitacion. Cualquier detector de fluorescencia funcionana a menos que no sea capaz de proyectarse en la muestra.
La invencion proporciona un sistema de PCR manual comercializable para aplicacion diagnostica espedfica. El PDA tiene software de control en ejecucion para proporcionar un sistema de PCR manual completo con deteccion en tiempo real y control de software.
A traves de la reduccion de la masa termica e indices de calentamiento / enfriamiento mejorados mediante el dispositivo, el tiempo de 2 a 3 horas necesario para terminar una reaccion de 30 a 40 ciclos, incluso para un volumen de muestra moderado de 5 a 25 pl, se redujo a menos de 30 minutos. La figura 12 muestra el tiempo necesario para amplificar el ADN viral de hepatitis B mediante un chip de LTCC de la presente invencion. La PCR se realizo durante 45 ciclos y fueron capaces de lograr la amplificacion en 45 minutos. Ademas, se observo la amplificacion cuando se realizo la PCR durante 45 ciclos en 20 minutos y 15 minutos tambien. La PCR convencional para el VHB (45 ciclos) durana aproximadamente 2 horas.
La miniaturizacion permite lecturas precisas con tamanos de muestras mas pequenos y consumo de volumenes mas pequenos de reactivos costosos. Las pequenas masas termicas de los microsistemas y los pequenos tamanos de muestra permiten un rapido ciclo termico de baja potencia que aumenta la velocidad de muchos procesos como la replicacion de ADN a traves de la micro PCR. Ademas, los procesos qmmicos que dependen de la qmmica superficial se mejoran considerablemente a traves del aumento de la superficie a relaciones de volumen disponibles en la microescala. Las ventajas de los mecanismos microflmdicos han impulsado el desarrollo de microsistemas integrados para el analisis de productos qmmicos.
El microchip convertido en un dispositivo manual, por lo tanto, elimina la maquina de PCR de un sofisticado laboratorio, aumentando asf el alcance de esta tecnica extremadamente potente, ya sea para el diagnostico clmico, ensayos alimentarios, analisis de sangre en bancos de sangre o una serie de otras areas de aplicacion.
Los instrumentos de PCR existentes con camaras de reaccion multiple proporcionan multiples sitios de experimentos de ADN, ejecutando todos, el mismo protocolo termico y no siendo, por lo tanto, eficaces en terminos de tiempo. Surge la necesidad de minimizar el tiempo de reaccion y el volumen de muestra de entrada.
La presente PCR esta disenada para su uso a largo plazo y podna tener una serie de dispositivos con respuesta termica muy rapida y altamente aislados de los chips de PCR adyacentes para poder ejecutar de manera efectiva e independiente multiples reacciones con diferentes protocolos termicos con una minima interferencia.
El analisis o cuantificacion de los productos de PCR se realiza mediante la integracion practica de un sistema de deteccion de fluorescencia en tiempo real. Este sistema tambien podna integrarse con sistemas de cuantificacion y deteccion para la deteccion de enfermedades como la hepatitis B (figura 12), el SIDA, la tuberculosis, etc. Otros mercados incluyen la monitorizacion de alimentos, el analisis de ADN y la monitorizacion ambiental y de ciencia forense.
Despues de determinar la uniformidad del perfil de temperatura en relacion con el chip, se llevaron a cabo las reacciones de PCR en estos chips. Fragmentos de ADN lambda y ADN de salmonela se han amplificado con exito utilizando estos chips. La figura 5 muestra el microchip en vistas de 3 dimensiones que muestran sus diversas conexiones con el calentador, los anillos conductores, el termistor y los anillos de conduccion (52). Tambien muestra soportes (51) que conectan los anillos conductores (52) a la placa conductora (33).
La figura 6 muestra un grafico comparativo de la fusion del fragmento de ADN A-636 en el chip utilizando el calentador y el termistor integrados.
La figura 7 muestra el aumento de la senal de fluorescencia asociado con la amplificacion de ADN A-311. El perfil termico fue controlado por la unidad manual y se realizo la reaccion en un chip (3 pl de mezcla de reaccion y 6 pl de aceite). La fluorescencia se monitorizo utilizando un amplificador de bloqueo convencional.
La presente invencion tambien proporciona un sistema diagnostico. El procedimiento adoptado para el desarrollo del sistema diagnostico ha tenido como objetivo normalizar inicialmente los protocolos termicos para un par de problemas y luego lograr las mismas funciones en el chip. Los cebadores disenados para ADN ribosomal 16S amplificaron el fragmento ~ 300 - 400 bp de E. coli y salmonela, mientras que los cebadores para el gen stn amplificaron el fragmento ~ 200 pb de salmonela typhi. Los productos obtenidos fueron confirmados por deteccion de fluorescencia verde SYBR, asf como electroforesis en gel de agarosa. Las figuras 7 y 11 muestran la imagen de gel del ADN A-311 amplificado y el gen de salmonela mediante microchip.
Perfil termico para la amplificacion de ADN A-311:
Desnaturalizacion: 94 °C (90 s)
94 °C (30 s) - 50 °C (30 s) - 72 °C (45 s)
Extension: 72 °C (120 s)
Perfil termico para la amplificacion del gen de salmonela:
Desnaturalizacion: 94 °C (90 s)
94 °C (30 s) - 55°C (30 s) - 72 °C (30 s)
Extension: 72 °C (300 s)
PCR con sangre y plasma procesados
La sangre o el plasma se trato con un agente precipitante que puede precipitar las sustancias inhibidoras de PCR principales de estas muestras. El sobrenadante claro se utilizo como plantilla. Mediante este protocolo, se obtuvieron amplificaciones para un fragmento de ~ 200 pb de salmonela typhi (figura 8). En la figura 8, la imagen de electroforesis en gel muestra
1. reaccion de control,
2. producto de PCR - sangre sin procesar,
3. producto de PCR - sangre procesada,
4. producto de PCR - plasma procesado.
Tampon de PCR directa en sangre
Se ha formulado un tampon unico para PCR directa con muestras de sangre o plasma. Mediante este sistema de tampon unico se ha logrado la amplificacion por PCR directa con sangre y plasma. Con este sistema de tampon, se ha obtenido una amplificacion de hasta el 50 % para la sangre y del 40 % para el plasma (veanse las figuras 9 y 10) utilizando el chip de LTCC de la presente invencion. En la figura 9, la imagen de electroforesis en gel muestra: 1. producto de PCR - 20 % de sangre,
2. producto de PCR - 30 % de sangre,
3. producto de PCR - 40 % de sangre,
4. producto de PCR - 50 % de sangre; y
en la figura 10, la imagen de electroforesis en gel muestra:
1. producto de PCR - 20% de plasma,
2. producto de PCR - 30 % de plasma,
3. producto de PCR - 40 % de plasma,
4. producto de PCR - 50 % de plasma,
5. reaccion de control.
El tampon unico comprende una sal de tampon, un cloruro o sulfato que contiene ion bivalente, un detergente no ionico, un estabilizador y un alcohol de azucar.
La figura 13 muestra la curva de fusion del chip de LTCC para la derivada de la senal de fluorescencia para la fusion del ADN X-311. La figura tambien proporciona una comparacion entre la presente invencion (131) y el dispositivo de PCR convencional (132).
Pico mas mtido: valor pico / anchura (eje x) @ medio valor pico = 1,2 / 43
Pico mas superficial: valor pico / anchura (eje x) @ medio valor pico = 0,7 / 63
Una relacion mas alta indica un pico mas mtido. Tambien en la grafica, el eje y es la derivada (pendiente de la curva de fusion), una pendiente mas alta indica una fusion mas nftida.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un microchip (10) hecho de capas de ceramica cocida a baja temperatura que comprende una camara de reaccion (11) formada en una pluralidad de capas para cargar una muestra, caracterizado porque
una pluralidad de anillos conductores (52) rodea la camara de reaccion (11), donde cada uno de la pluralidad de anillos conductores (52) estan conectados entre s^ a traves de una pluralidad de soportes (51);
un conductor se integra en la capa conductora (33) colocada debajo de la camara de reaccion (11), donde la capa conductora (33) se conecta a los anillos conductores (52) a traves de los soportes (51), y
un calentador (12) se integra en una capa calefactora (32) colocada debajo de la capa conductora (33), donde la camara de reaccion (11) es calentada por el calentador (12) a traves de la capa conductora (33) conectada a los anillos conductores (52).
2. El microchip (10) de acuerdo con la reivindic 1a,c dioónnde el chip (10) comprende un sensor de temperatura (13) colocado fuera del chip (10) o integrado en al menos una capa del sensor del chip (10).
3. El microchip (10) de acuerdo con la reivindic 1a,c dióonnde el chip (10) comprende almohadillas de contacto (16a y 16b) para conectar el circuito de control externo al sensor de temperatura (13) y al calentador (12).
4. El microchip (10) de acuerdo con la reivindica 1c,ió dnonde hay una separacion entre la base de la camara de reaccion (11) y el calentador (12), y dicha separacion oscila entre aproximadamente 0,2 mm y aproximadamente 0,7 mm.
5. El microchip (10) de acuerdo con la reivindicac 1i,ó dnonde la camara de reaccion (11) tiene un volumen que oscila desde aproximadamente 1 pl hasta aproximadamente 25 pl.
6. Un procedimiento de fabricacion de un microchip (10) que comprende las etapas de disponer una pluralidad de capas hechas de ceramica cocida a baja temperatura y que tiene un pocillo para formar una camara de reaccion (11), caracterizado porque la camara de reaccion (11) esta rodeada por la pluralidad de anillos de conduccion (52) y el microchip (10) es el microchip (10) de acuerdo con la reivind 1ic,a dcoinódne el procedimiento comprende las siguientes etapas adicionales:
conectar cada uno de la pluralidad de anillos conductores (52) a traves de la pluralidad de soportes (51); colocar al menos una capa de ceramica cocida a baja temperatura que comprende el calentador (12) debajo de la camara (11);
colocar una o varias capas conductoras (33) entre el calentador (12) y la camara de reaccion (11); e interconectar las capas para formar el microchip (10).
7. Un dispositivo de micro PCR que comprende un microchip (10), un sensor de temperatura (13) integrado en el microchip (10) o colocado fuera del chip (10) para medir la temperatura del chip, un circuito de control (43) para controlar el calentador (12) basado en la entrada del sensor de temperatura, y un sistema opti
senal de fluorescencia de la muestra, caracterizado porque el microchip (10) es el microchip (10) de acuerdo con la reivindicacion 1.
8. El dispositivo de micro PCR de acuerdo con la reivindi 7c,a dcoinódne el dispositivo es un dispositivo manual.
9. El dispositivo de micro PCR de acuerdo con la reivindicació 7,n donde el dispositivo se controla con una plataforma informatica portát.il
10. El dispositivo de micro PCR de acuerdo con la reivindic 7a,c dióonnde el microchip (10) esta dispuesto en una matriz para llevar a cabo multiples PCR.
11. El dispositivo de micro PCR de acuerdo con la reivindicaci 7ó,n donde el microchip (10) es liberable del dispositivo.
12. Un procedimiento de deteccion de un analito en una muestra o de diagnostico de una afeccion o enfermedad utilizando un dispositivo de micro PCR, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
cargar una muestra que comprende acido nucleico en un microchip (10) que comprende una pluralidad de capas de LTCC, cuyo microchip (10) tiene una camara de reaccion (11), amplificar el acido nucleico mediante la ejecucion del dispositivo de micro PCR; y
determinar la presencia o ausencia del analito basado en una lectura de fluorescencia del acido nucleico amplificado o determinar la presencia o ausencia de un patogeno basado en una lectura de fluorescencia del acido nucleico amplificado para diagnosticar la afeccion o enfermedad, caracterizado porque la camara de reaccion (11) esta rodeada por anillos conductores (52) y el dispositivo de micro PCR es un dispositivo de micro PCR de acuerdo con la reivindicación 7.
13. El procedimiento de acuerdo con la 12, donde r eeli avciindodi ncuaccleióicno es ADN o ARN.
14. El procedimiento de acuerdo con la 12, don rdeeivi enld pircoacceidóimniento proporciona un analisis tanto cualitativo como cuantitativo de los productos amplificados.
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