CN101868721B

CN101868721B - 手持微pcr装置

Info

Publication number: CN101868721B
Application number: CN2008801167118A
Authority: CN
Inventors: K·K·库马尔; R·贾亚拉曼; S·K·纳拉希姆哈; R·M·拉德哈克里什南; S·维斯瓦纳桑; C·B·纳伊尔; P·V·苏巴拉奥; M·贾甘纳斯; S·钱纳克里什纳埃赫; S·蒙达尔; V·文卡塔拉曼
Original assignee: Bigtec Pvt Ltd
Current assignee: Bigtec Pvt Ltd
Priority date: 2007-10-12
Filing date: 2008-10-13
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2028-10-13
Also published as: BRPI0817985A2; TWI448686B; CA2702418C; AP2683A; CA2702418A1; HUE045587T2; HUE043078T2; AU2008310525A1; EP2212691B1; EA201070390A1; EP2212692B1; BRPI0816357A2; AP2930A; TN2010000157A1; TWI523949B; CL2008003007A1; HK1149327A1; ZA201002536B; WO2009047804A3; LT2212691T

Abstract

本发明涉及一种手持微PCR装置，该手持微PCR装置包括LTCC微PCR芯片，该芯片包括加热器、以及装载样品的反应室。该手持微PCR装置还包括基于从温度传感器接收的输入调节加热器的加热器控制。该手持微PCR装置还具有包括光纤以检测来自样品的荧光信号的光学系统以及与一个或多个其他装置交互的至少一个通信接口。

Description

手持微PCR装置

技术领域

本发明涉及一种具有用后可丢弃的低温共烧陶瓷(LTCC)微PCR芯片的便携式实时PCR系统。本发明还描述了一种用于控制和监视微PCR和PCR涉及设备的方法。

技术背景

在过去的5年里，基于芯片上实验室技术的临床诊断系统的研究和发展急速增长。这些系统在临床诊断方面具有很好的前景。这些系统仅消耗非常小容量的样品材料和试剂。各个小芯片可以是便宜且用后可丢弃的。从采样到结果的时间会非常短。最先进的芯片设计可以在单个集成微流体电路中执行所有的分析功能-采样、样品预处理；分离、稀释和混合步骤；化学反应；以及检测。芯片上实验室系统允许设计者制作小型、便携、健壮、低成本且容易使用的提供高性能和多样性的诊断仪器。微流体，即流经微通道的流体，使得不大规模作用的分析装置和化验形式的设计成为可能。

芯片上实验室技术试图在微制造结构内模仿对样品执行的实验室过程。最成功的装置是那些对流体样品进行操作的装置。已经在这些装置上证实了大量的化学处理、提纯和反应过程。已经证实了化学处理的一定程度的单片集成来制作执行完整化学测量过程的装置。这些装置基于接受的实验室分析过程且因而能够适应比常规化学感测更复杂的样品阵列。

由于快速和高效分析技术的发展，在分子和细胞生物学中获得了最新的进步。由于微型化和倍增，像基因芯片或生物芯片这样的技术能够在单个实验布置中实现全部基因组的特征化。PCR(聚合酶链反应)是用于核酸分子的体内扩增的分子生物方法。PCR技术正快速代替用于识别法医、环境、临床和工业样品中的生物种和病原体的其他耗时和较不敏感的技术。在生物技术中，对于大量分子和临床诊断，PCR已经成为生命科学实验中最重要的分析步骤。像实时PCR这样的PCR技术中的重大发展已经导致和常规方法相比更快速的反应过程。在过去的几年里，微制造技术已经扩展到诸如PCR分析之类的反应和分析系统的微型化，旨在进一步减小分析时间和试剂消耗。

在当前可用的大多数PCR中，因为样品、容器和循环器热容量以及2至6小时的延长扩增时间，瞬时温度变化是不可能的。在样品温度从一个温度过渡到另一温度的时间段中，会发生消耗重要试剂且产生多余干扰化合物的不希望的额外反应。

LTCC用在封装半导体装置中。这种系统能够实现电学和结构功能的集成。通过LTCC制造工艺中的逐层制造序列可以方便地实现形成有集成电学元件的三维结构的制造。另外，该工艺与硅工艺相比更为廉价。在例如LTCC(低温共烧陶瓷)之类的陶瓷基板上制造芯片能够方便且便宜地实现机械和电学元件的集成。

PDA之类的便携式计算平台的使用给予系统足够的计算能力来控制电子电路且提供丰富但简单的用户界面来显示数据。它还使得整个系统模块化且因此允许用户使用最小成本实现系统的简单升级。

发明内容

本发明的原则性目的是发展一种手持微PCR装置。

本发明的另一目的是发展一种用于监视和控制手持微PCR装置的方法。

因此，本发明提供：一种手持微PCR装置，包含：包含加热器、用于装载样品的反应室的LTCC微PCR芯片、基于从温度传感器接收的输入调节加热器的加热器控制、检测来自样品的荧光信号的光学检测系统以及与其他(一个或多个)装置交互的至少一个通信接口；并且本发明还提供一种监控和控制手持微PCR装置的方法，该方法包含以下步骤：通过通信接口在该手持微PCR装置和其他装置之间建立通信，基于从其他装置接收的热配置值初始化热循环过程以控制LTCC微PCR芯片，以及发送光学系统检测的光学信号到其他装置。

附图说明

现在将参考附图描述本发明：

图1示出根据本发明的LTCC微PCR装置的一个实施例的示意图。

图2示出LTCC微PCR芯片的一个实施例的正投影图。

图3示出LTCC微PCR芯片的一个实施例的横截面图。

图4示出LTCC微PCR芯片的一个实施例的逐层设计。

图5示出制造的芯片反应室设计的模型。

图6示出使用分叉光纤的分叉光学检测系统。

图7示出控制加热器和温度传感器的电路的框图。

图8示出使用由手持单元控制的集成加热器/热敏电阻器的芯片上的λ-636DNA片段的熔解。

图9示出芯片上λ-311DNA片段的PCR扩增。(a)来自芯片的实时荧光信号；(b)确认扩增产物的凝胶的图像。

图10示出用于16S核醣体单位的沙门氏菌的经处理的血液和血浆PCR的扩增的凝胶的图像。

图11示出用于16S核醣体单位的沙门氏菌的直接血液PCR的扩增的凝胶的图像。

图12示出用于16S核醣体单位的沙门氏菌的直接血浆PCR的扩增的凝胶的图像。

图13示出使用微芯片的沙门氏菌的基因的PCR扩增。(a)来自芯片的实时荧光信号；(b)确认扩增产物的凝胶的图像。

图14示出使用LTCC芯片扩增乙型肝炎病毒DNA花费的时间。

图15示出与手持单元通信的个人数字助理(PDA)应用的概览。

图16示出通过使用用于熔解λ-311DNA的荧光信号的微分的LTCC芯片获得的熔解曲线。

图17示出运行在PDA中的热循环程序的流程图。

图18示出使用微芯片扩增的HBV DNA的实时荧光信号。

图19示出使用分束器的分束器光学检测系统。

图20示出混合光学检测系统。

具体实施方式

本发明涉及一种手持微PCR装置，包含：

a)LTCC微PCR芯片，包括加热器、装载样品的反应室，

b)加热器控制，基于从温度传感器接收的输入调节加热器，

c)光学检测系统，检测来自样品的荧光信号，以及

d)至少一个通信接口，与一个或多个其他装置交互。

在本发明的一个实施例中，至少一个导体层设置在加热器和反应室之间。

在本发明的一个实施例中，反应室由导体环围绕。

在本发明的一个实施例中，导体环使用柱连接到导体层。

在本发明的一个实施例中，导体由从包括金、银、铂和钯或其合金的组中选出的材料制成。

在本发明的一个实施例中，温度传感器放置在芯片外部以测量芯片温度。

在本发明的一个实施例中，温度传感器嵌入在该芯片的至少一个层中。

在本发明的一个实施例中，温度传感器是热敏电阻器。

在本发明的一个实施例中，温度传感器连接作为桥式电路的一个臂。

在本发明的一个实施例中，桥式电路输出在馈入到加热器控制以调节加热器之前被扩增。

在本发明的一个实施例中，芯片包括透明密封帽以覆盖反应室。

在本发明的一个实施例中，芯片是用后可丢弃的。

在本发明的一个实施例中，光学检测系统从包括分束器光学检测系统、混合光学检测系统和分叉光学检测系统的组中选出。

在本发明的一个实施例中，光学系统包括光源和用于检测来自样品的荧光的光检测器。

在本发明的一个实施例中，锁定放大器放大检测的信号。

在本发明的一个实施例中，该分叉光学系统使用分叉光纤，其中光源布置在光纤的一个分叉端(605a)且光检测器布置在光纤的另一分叉端(605a)。

在本发明的一个实施例中，分叉光纤的公共端(605b)指向样品。

在本发明的一个实施例中，混合光学检测系统使用光纤将光引入到样品上。

在本发明的一个实施例中，混合光学检测系统使用透镜聚焦来自样品的发射光束。

在本发明的一个实施例中，通信接口从包括串口、USB、蓝牙或其组合的组中选出。

在本发明的一个实施例中，其他装置收集芯片的温度和来自手持装置的放大信号。

在本发明的一个实施例中，其他装置从包括智能手机、PDA和可编程装置的组中选出。

本发明还涉及一种监控和控制手持微PCR装置的方法，所述方法包含以下步骤：

a)通过通信接口在手持微PCR装置和其他装置之间建立通信，

b)基于从其他装置接收的热配置值初始化热循环过程以控制LTCC微PCR芯片，以及

c)发送光学系统检测的光学信号到其他装置。

在本发明的一个实施例中，由用户通过用户接口向其他装置馈入热配置值。

在本发明的一个实施例中，通过用户接口创建、修改或删除热配置。

在本发明的一个实施例中，其他装置提供用户的认证。

在本发明的一个实施例中，其他装置存储多个热配置。

在本发明的一个实施例中，热配置提供设定点值和循环次数。

在本发明的一个实施例中，将芯片维持在一温度且维持由设定点值决定的时间。

在本发明的一个实施例中，通过停止热循环过程将微PCR芯片温度带入室温。

在本发明的一个实施例中，当热循环暂停时，维持微PCR芯片温度恒定。

在本发明的一个实施例中，使用移动蓝牙串口配置堆栈(mobileBluetooth serial port profile stack)与其他装置通信。

在本发明的一个实施例中，在其他装置的显示单元上绘制热和光学数据。

其他装置(101)是能够通过任意标准通信接口(107)(例如基于有线(RS232串口、USB)或无线(实施串口模式的蓝牙)等)与手持装置交互的装置。

LTCC微PCR芯片是由LTCC层制成的PCR芯片。该芯片可以方便地附接到手持单元或从其拆卸。

热配置具有设定点值以及完成热循环处理的循环次数的温度和时间。

聚合酶链反应(PCR)是发现的一种用于从模板合成DNA的特异性片段的多个副本的技术。原始PCR工艺基于来自水生栖热菌(Taq)的热稳定的DNA聚合酶，该DNA聚合酶可以在包含4个DNA碱基和两个与目标序列相邻的引物DNA片段的混合物中合成给定DNA链的互补链。加热该混合物以分离包含目标序列的双螺旋DNA链，随后冷却该混合物以允许引物在分离链上发现和结合它们的互补序列，且Taq聚合酶将引物延伸为新互补链。因为每个新的双链分离为用于进一步合成的两个模板，所以重复的加热和冷却循环指数地倍增目标DNA。

用于聚合酶链反应的典型温度范围如下：

1.在93℃变性15至30秒

2.在55℃退火15至30秒

3.在72℃延伸引物30至60秒。

作为示例，在第一步骤，溶液被加热到90-95℃，使得双链模板熔解(“变性”)以形成两个单链。在下一步骤中，溶液被冷却到50-55℃，使得尤其短的合成DNA片段(“引物”)结合到模板的合适的互补部分(“退火”)。最后，当特异性酶(“DNA聚合酶”)通过结合来自溶液的互补碱基延伸引物时，溶液被加热到72℃。因而从单个双链合成了两个相同的双链。

引物延伸步骤必须以约60秒/千碱基(sec/kbase)的速率增加以产生比几百个碱基更长的产物。上面是典型的仪器时间；实际上，变性和退火步骤几乎瞬时发生，但是当金属块或水用于热平衡且样品被包含在塑料微量离心管中时，商业仪器中的温度速率通常小于1℃/秒。

通过热绝缘的显微机械加工小质量PCR室；可以大规模产生更快、更能量有效且更加特异性的PCR仪器。而且，从一个温度到另一温度的快速转变确保样品在不希望的中间温度花费很少的时间，使得扩增的DNA具有最佳保真度和纯度。

低温共烧陶瓷(LTCC)是在用于汽车、防御、宇航和通信产业的电子组件封装中使用的厚膜技术的现代版本。它是化学惰性、生物兼容、热稳定(＞600℃)的氧化铝基玻璃状陶瓷材料，具有低导热性(＜3W/mK)、良好的机械强度且提供良好的厄米矩阵性。它通常用在封装芯片级电子器件中，其中这些电子器件用于结构功能和电学功能两者。本发明的发明人意识到LTCC用于微PCR芯片应用的适用性，且据发明人尽力了解，LTCC至今尚未用于此类目的。LTCC技术中的基板优选地是具有聚合结合物的玻璃状陶瓷材料的非烧结(生)层。结构特征通过切割/冲压/钻孔这些层且层叠多个层来形成。分层处理使得能够形成对于MEMS(微机电系统)而言十分关键的三维特征。小于50微米的特征可容易地在LTCC上制造。电学电路可通过在每一层上丝网印刷导电和电阻浆料制造。多个层通过冲压通孔且使用导电浆料填充这些而互连。这些层被堆叠、压缩和烧结。在文献1中已经报告了高达80层的堆叠处理。烧结材料是致密的且具有好的机械强度。

图1示出了指示各个组件及其功能的微PCR装置的实施例的示意图。该装置包含用后可丢弃的LTCC微PCR芯片(103)，其具有反应室来保持样品，该反应室具有用于热循环的嵌入式加热器和嵌入式温度传感器。温度传感器是热敏电阻器。温度传感器还可以放置在芯片外部而不是嵌入在芯片内部。温度传感器可以是能够测量温度的任意传感器。LTCC微PCR芯片(103)连接到手持电子单元(109)，该手持电子单元(109)包括具有加热器控制和驱动器电路的控制电路(102)，基于温度传感器的值控制加热器。温度传感器的值通过温度感测电路(107)馈入到加热器控制。加热器控制设置芯片温度且维持该温度达一个时间段，该时间段由微控制器(106)设置为设定点值。手持单元(109)上的所有组件通过电池组(108)供电。

手持装置(109)还容纳有用于检测来自微PCR芯片(103)的荧光信号的光学系统(104)。该系统包括光源、用于控制光源的电路、用于感测来自样品的发射光的检测器、用于放大(来自样品)信号的电路。手持装置(109)连接到象USB/蓝牙到智能手机/PDA之类的其他处理装置(101)或用于数据采集和控制的任意处理装置。

电池可以是可充电电池，具有设置为从外部源自充电的端口。例如，电池可以是能够提供超过1A的峰值电流的镍镉、锂离子或聚合物。

手持装置还包括至少一个通信接口(107)以与其他装置(101)通信。通信接口(107)可以基于有线(RS 232串口，USB)或无线(实施串口配置的蓝牙)。典型地，由于其速度和实施简单，使用串口配置进行通信。接口在其他装置(101)和微控制器(106)之间传送数据和指令。

此处，其他装置(101)是能够控制和监控手持装置的装置。例如，其他装置可以是PDA、智能电话、计算机、微控制器或能够与手持装置通信的任意处理装置。其他装置还提供用户接口以实现用户输入和观察数据。此处的其他装置具有运行相关软件以连接、控制和监视手持装置(109)的能力。

微控制器(106)控制手持装置(109)上的电子电路并且通过接口与其他装置(101)通信。微控制器具有用于与模拟电路(即控制电路(102)、温度感测电路(107)和光学电路(105))交互的模数和数模转换器。微控制器(106)从其他装置收集设定点的值，并且将它提供给控制电路(102)。微控制器还向其他装置提供由温度感测电路(107)感测的温度和由光学电路(105)提供的光学数据。此处光学数据是光学系统检测的信号(105)。

图2示出了指示反应室(201)或阱的微PCR芯片的实施例的正透射图。该图指示了LTCC微PCR芯片内部的加热器(202)和温度传感器热敏电阻器(203)的组合件。还指示了加热器导线(205)和热敏电阻器导线(204)。这些导线将帮助提供外部电路与嵌入在芯片内部的加热器和热敏电阻器的连接。

参考图3，示出了LTCC微PCR芯片的一个实施例的横截面图，其中(206a&206b)指示用于加热器(202)的接触焊盘而(207&207b)至少用于热敏电阻器(203)的接触焊盘。

参考图4，示出了LTCC微PCR芯片的一个实施例的逐层设计，其中芯片由12个LTCC带层组成。存在两个基层(401)，包括加热器层(402)、导体层(403)以及具有热敏电阻器的层(404)的三个中间层，其中该具有热敏电阻器的层(404)又形成对反应室(201)的界面层(405)。如图所示，反应室层(406)由6个层组成。在加热器和热敏电阻器层之间还设置导体层(403)。还指示了加热器导线(205)和热敏电阻器导线(204)。在该图中，示出了导线(204)布置在热敏电阻器层(404)的任一侧。加热器设计可以具有“阶梯”、“蜿蜒”、“线”、“板”等任意形状，大小在0.2mm×3mm至2mm×2mm间变化。加热器的大小和形状可以基于具体要求来选择。这些要求会依赖于反应室的大小或待测样品或用作导体层的材料。

LTCC芯片具有1至25μl的阱体积。加热器基于在常规LTCC封装中采用的厚膜电阻元件。使用氧化铝的热敏电阻器系统用于制作嵌入式温度传感器。测得的芯片TCR为1至2Ω/℃。芯片在DuPont 951生系统上制作。热敏电阻器层可以布置在芯片中的任何位置，或者温度传感器可以布置在芯片外部，取代芯片内部的热敏电阻器。

在判断芯片中的温度配置的均匀性之后，在这些芯片上实施PCR反应。已成功地使用这些芯片扩增了λDNA片段、沙门氏菌DNA、和乙肝DNA。图5以3维视图形式示出了微芯片，图中示出了微芯片与加热器、导体环、热敏电阻器和导电环(502)的各种连接。它还示出连接导体环(502)到导体板(403)的柱(501)。

嵌入式加热器由电阻器浆料制成，例如与LTCC兼容的来自Dupont的CF系列。可以使用任意生陶瓷带系统，诸如DuPont 95、ESL(41XXX系列)、Ferro(A6系统)或Haraeus。所述嵌入式温度传感器是针对氧化铝基板使用PTC(正温度系数)电阻热敏电阻器浆料(例如409X D是来自ESL Electroscience的ESL 2612)制作的热敏电阻器。也可以使用NTC：负温度系数电阻浆料，比如来自EMCARemex的NTC 4993。

透明(300至1000nm波长)密封帽用于防止样品从所述反应室蒸发且由聚合物材料制成。

光学检测系统(104，105)

光学(荧光)检测系统包含照射源(典型地是LED)、用于选择合适波长的光的滤波器、用于传送和收集来自样品的光的光学器件、以及光传感器(光电二极管、光电倍增管、光晶体管、图像传感器等)。该系统还包含驱动光源，检测来自光传感器的信号的电路(105)。在便携式应用中，光电二极管或光晶体管或图像传感器因其低功耗(＜1毫瓦)是优选的。PCR产物的实时检测采用荧光技术，其中在PCR混合物中存在的光敏染料(像SYBR Green的荧光团)吸收某一波长的光且以更长的波长(对于SYBR Green来说是470nm和520nm)发射。典型地，发射器光强随着PCR的成功进行逐渐增加或减小。监视发射强度中的变化为PCR装置带来了实时检测能力。来自PCR样品的光的耦合和收集可以经由多种方式实现。下面的方法可以在本系统中使用：

●分叉光学检测系统，使用具有分叉端(605a)和公共端(605b)的分叉光纤(605)(多模塑料或硅化物光纤或光纤束)。分叉端(605a)之一用于将来自LED(601)的光入射到样品上，且另一端用于将光入射到光检测器(602)上。公共端(605b)将光引导到样品上。除了用于波长选择性的滤波器之外，该方法利用用于将光耦合到光纤或耦合来自光纤的光的光学器件。

●分束器光学检测系统，使用分束器、透镜和用于将光聚焦到样品和检测的滤波器。图19。

●混合光学检测系统，采用光纤用于照射，且使用聚焦透镜、滤波器和检测器进行直接检测。图20。

图6示出了优选地用于根据本发明的PCR装置的光学系统的一个实施例。该图示出了使用分叉光纤(605)的构造，该分叉光纤(605)包括位于分叉端(605a)一端的LED激励源(601)和检测荧光的位于另一端(605a)的光检测器(602)。LED(601)和光检测器(602)耦合到光纤的分叉端(605a)和公共端(605b)以进入LTCC芯片(200)的反应室(201)。该图还示出了分别通过耦合器(603a&603b)耦合到LED(601)的滤波器(604a)和耦合到光检测器(602)的滤波器(604b)。

来自检测器(602)的输出信号在发送到加热器控制器之前使用如图7所示的放大器电路(70)(原处的光倍增管、雪崩光电二极管)放大。放大器电路的示例是锁相环(PLL)电路(锁定放大器)。在该电路中，照射是预定频率(典型地10Hz至500kHz的范围)的脉冲。输出信号(荧光信号)处理电路锁定到相同的频率且产生成比例的直流(DC)，该直流被放大、转换成电压且进一步放大、发送到微控制器(106)。该电路增强了信号的信噪比并且消除了信号中的频率相关噪声。锁定电路基于均衡调制器/解调器(例如来自Analog Devices的AD 630 JN)。

图7示出了控制加热器和热敏电阻器的电路的框图，其中LTCC微PCR芯片(200)中的热敏电阻器用作桥式电路(706)中的一个臂。即使当温度传感器置于芯片外部时，该温度传感器可以连接到桥式电路的一个臂。给出来自桥式放大器(701)的桥的放大输出作为PID控制器(703)的输入，其中该输入被数字化且PID算法提供受控的数字输出。该输出被重新转换回模拟电压，且该电压使用加热器驱动器(704)中存在的功率晶体管驱动加热器。

为加热器控制(703)实施的模拟电路采用P或PI或PD或PID(比例积分微分)或者可以是基于热敏电阻器的输出的简单开/关控制。温度传感器是检测温度变化的电路的一部分。在该图中，热敏电阻器的示例被认为是温度传感器，其中它形成为惠斯登桥式电路(706)的一部分。由于加热或冷却导致的热敏电阻器阻值的变化导致电路的有限输出电压。该电压与LTCC芯片上的阱的温度相关。测得的电压用于确定加热器开启或是关闭。加热器被供给以(LTCC芯片上)阱中达到的最大温度决定的预设功率。为了计及加热器和热敏电阻器中的电阻变化(对于优化芯片约为20％)，必须开发自校准电路且该自校准电路以手持方式实施。该电路通过使用暴露于背景的商业热敏电阻器(PT100)补偿电阻中的变化。

加热器控制电路由微控制器管理。微控制器被编程为通过通信接口运行所需的热配置。程序控制加热器控制电路(102)以在LTCC芯片上运行所需配置。已经对蓝牙接口进行了测试，用于使用运行在PDA上的软件(运行WincowsCE的iPaq)控制微控制器。在手持装置(109)中实施用于蓝牙通信的软件的开发和GUI(图形用户界面)的开发。此处公开的控制加热器和读取温度传感器值的方法仅是示例。该示例不应被认为是控制器的唯一方法或限制。控制加热器和读取热敏电阻器值的其他方式和方法也可应用于本公开。

其他装置使得用户能够通过GUI(图形用户界面)创建用于PCR的热配置。热配置通过通信接口(107)传递到微控制器。热配置包含设定点值(温度和时间)和循环次数。来自微控制器的温度传感器数据和光学检测数据被发送到其他装置且在其上显示。计算机还将评估数据并显示反应的结果。便携式计算机运行像Windows CE/Mobile、Palm OS、Symbian、Linux之类的操作系统。在其他实施例中，仅将设定点的值发送到手持装置而由其他装置监视循环次数。微控制器通过其他装置获得从热配置发送的设定点的值。

典型地，使用凝胶电泳分析PCR产物。在该技术中，PCR之后的DNA片段在电场中分离且通过使用荧光染料着色观察。更合适的方案是使用特异性结合到双链DNA的荧光染料以连续监视反应(实时PCR)。这类染料的一个示例是由490nm蓝光激励且在结合到DNA时发射520nm绿光的SYBR GREEN。荧光强度正比于在PCR过程中形成的双链产物DNA的量且因此随着循环次数增加。

下面的示例解释可以使用手持装置(109)和其他装置实现的不同可能性。在该示例中其他装置被认为是PDA/智能电话。

目标PDA/智能电话应用运行在Windows mobile 5平台上。它使用windows移动蓝牙串口模式(SPP)堆栈来与手持单元通信。手持单元包含蓝牙模块，其通过用于数据通信的UART(通用异步接收和发射)端口与微控制器交互。该应用的核心功能是通过各种存储的热配置控制和监视手持单元的热循环处理。它还具有两级访问控制、数据绘制、创建热配置之类的功能性。图15示出该应用和手持单元之间的通信方法。

PDA应用

PDA应用程序接受包括设定点值(温度和时间)和循环次数的输入数据。设定点值通过蓝牙连接传递到手持单元并等待手持单元响应。当获得设定点值时，手持单元将该设定点值传送给PDA，PDA再发送下一组指令(图17)。PDA还从手持单元接收数据(温度和光学数据)且显示这些数据。为了通信和执行PDA发送的指令，手持单元具有微控制器，该微控制器具有使能蓝牙通信和控制模拟电路的嵌入式程序。另外，微控制器上的程序连续向PDA发送温度和光学数据。

PDA应用具有4个模块：

1.访问控制

2.GUI

3.数据处理和通信

访问控制：

1.该模块允许用户登录应用。

2.其具有带用户名和密码的登录屏。

3.具有两级访问控制，a：管理，b。用户

4.管理员具有如下权力：

a.创建用户和用户文件夹，

b.创建热配置，

c.连接到手持装置(109)/改变手持装置(109)。

5.用户一旦使用其用户名和密码登录，则具有执行应用、查看和存储属于其会话的数据的权力。

GUI

1.GUI模块提供屏幕以用于：

a.管理员键入不同设定点(温度&时间)并创建/删除/修改热配置。

b.创建/删除用户和用户文件夹。

c.改变手持装置。

i.该应用使用蓝牙堆栈来检测范围内的蓝牙装置。在检测之后，它显示范围内所有可用的装置。管理员将选择手持装置且该应用请求蓝牙堆栈与手持装置(109)配对。在配对之后，该应用将存储配对的装置信息以便今后使用。

d.启动、停止、重启和暂停应用。

e.目志窗口，显示该应用发射和接收的数据。

2.GUI模块具有屏幕以绘制从手持装置收集的热数据和光学数据。

数据处理模块

数据处理模块具有以下功能：

1.数据转换，

2.通信算法。

数据转换

1.从用户选择的热配置收集数据。

2.下面是典型的热配置：

初始设定点

最终设定点

3.当设设定点包含温度和时间时，温度值通过如下公式转换为电压值：

V = \frac{t - x}{y}

其中V是电压且t是温度，x&y是预定常量。

4.如此获得的电压值使用下面的公式转换成10位十六进制(base-16)值：

其中V是电压。

5.时间值(秒)被转换成十六进制(hex)值。

6.从手持单元收集的热数据将使用下面的公式从十六进制值转换成电压以用于绘图：

\frac{Hex}{1023} * V_{sup ply}

7.电压再次转换为温度：

t＝V*y+x

8.收集的光学数据将被转换成电压且将直接发送以用于绘图。

数据通信：

数据通信模块与windows移动蓝牙堆栈通话。在通信过程中遵循下面的协议。

开始：

应用程序提供的开始按钮启动热循环处理。该应用请求蓝牙堆栈建立与手持单元的无线串口连接。在接收确认之后，PDA开始与手持单元通信。

停止/暂停/继续

停止命令将停止热循环且指示手持单元将芯片温度带至室温，该处理无法重启。暂停将保持芯片温度为当前运行温度。这可以通过继续命令撤销。

诸如PDA的便携式计算平台的使用为系统带来了足够计算能力能力以控制电子电路且提供丰富且简单的界面来显示数据。它还使得整个系统模块化且因此使得用户能够使用最小成本实现系统的简单升级。

本发明提供用于特异性诊断应用的适于销售的手持PCR系统。在其他设备上运行的程序为完整的手持PCR系统提供实时检测和软件控制。

通过使用该装置减小热量并改善加热/冷却速率，即使对于5-25μl的中等样品体积，完成30至40次循环反应所花费时间从2至3小时缩短至小于30分钟。图14示出了使用本发明的LTCC芯片扩增乙型肝炎病毒DNA所花费的时间。PCR运行45个周期且能够在45分钟内实现扩增，如图14中的(1)所示。而且，当PCR在20分钟(2)和15分钟(3)内运行45次循环时仍然能够观察到扩增。用于HBV的常规PCR持续时间(45次循环)则需要约2个小时。

微型化允许使用更小的样品尺寸且消耗更少体积的昂贵试剂来获得精确的读数。微系统的小热量和小样品尺寸允许快速低功耗热循环，由此增加多种处理(诸如通过微PCR的DAN复制)的速度。另外，通过增加微尺度上可用的表面积体积比，依赖于表面化学性的化学过程极大地增强。微应用流体学的优点能够促进了用于化学分析的集成微系统的发展。

转变成手持装置(109)的微芯片由此将PCR机器从复杂的实验室中移出，因而增加了这种极其强大技术的推进，使得它用于临床诊断、食品测试、血库的血液筛查或者其他应用领域。

使用多个反应室的现有PCR仪器提供全都运行相同的热协议的多个DNA实验点，因此并不是时间有效的。存在缩短反应时间和引入样品体积的需要。

今后设计的即用型PCR将具有装置阵列，该装置阵列具有极快热响应并且与相邻PCR芯片高度隔离，从而能够使用不同的热协议以最小的串扰来有效独立地运行多个反应。

PCR产物的分析或量化通过实时荧光检测系统的实际集成实现。该系统也可以与量化和感测系统集成以检测像乙肝(图12)、AIDS、肺结核之类的疾病。其他市场包括食品监控、DNA分析、法医科学和环境监控。

图8示出了使用集成加热器和热敏电阻器的芯片上的λ-636DNA片段的熔解的比较图。

图9示出了与λ-311DNA的扩增相关联的荧光信号的增加。热配置由手持单元控制且在芯片(3μl反应混合物和6μl油)上执行反应。使用常规锁定放大器监视荧光。

本发明还提供诊断系统。发展诊断系统所采用的过程必须首先标准化用于几个问题的热协议，随后在芯片上功能化所述热协议。为扩增16S核醣体DNA约300～400bp片段而设计的引物来自大肠杆菌和沙门氏菌，而为扩增stn基因约200bp片段而设计的引物来自伤寒沙门氏菌。获得的产物通过SYBR绿荧光检测以及琼脂糖凝胶电泳确认。图9和图13示出了使用微芯片扩增的λ-311 DNA和沙门氏菌基因的凝胶照片。

用于扩增λ-311 DNA的热配置：

变性：94℃(90s)

94℃(30s)-50℃(30s)-72℃(45s)

延伸：72℃(120s)

用于扩增沙门氏菌基因的热配置：

变性：94℃(90s)

94℃(30s)-55℃(30s)-72℃(30s)

延伸：72℃(300s)

使用经处理的血液和血浆的PCR

使用沉淀试剂处理血液或血浆，该沉淀试剂可以从这些样品沉淀主要PCR抑制物。清液用作模板。使用该协议，获得来自伤寒沙门氏菌(图10)约200bp片段的扩增。在图10中，凝胶电泳图像显示：

1.控制反应，

2.PCR产物-未处理的血液，

3.PCR产物-经处理的血液，

4.PCR产物-经处理的血浆。

血液直接PCR缓冲器

提出了唯一缓冲剂用于使用血液或血浆样品的直接PCR。使用该唯一缓冲剂系统，已经实现了使用血液和血浆的直接PCR扩增。使用本发明的LTCC芯片，通过这种缓冲剂系统可获得针对血液高达50％的扩增，以及针对血浆高达40％的扩增(参见图11和图12)。

在图11中，凝胶电泳图像显示：

1.PCR产物-20％血液，

2.PCR产物-30％血液，

3.PCR产物-40％血液，

4.PCR产物-50％血液；并且

在图12中，凝胶电泳图像显示：

1.PCR产物-20％血浆，

2.PCR产物-30％血浆，

3.PCR产物-40％血浆，

4.PCR产物-50％血浆，

5.控制反应。

唯一缓冲物包括缓冲盐、包含二价离子的氯化物或硫化物、非离子清洁剂、稳定剂和醇。

图16示出了用于熔解λ-311 DNA的荧光信号的微分的LTCC芯片的熔解曲线。该图还提供了本发明(161)和常规PCR装置(162)之间的比较。

较陡的峰：峰值/宽度(x轴)半峰值＝1.2/43

较浅的峰：峰值/宽度(x轴)半峰值＝0.7/63

较高的比例指示较陡的峰。而且，在该图中，y轴是微分(熔解曲线的斜率)，较高的斜率表示较陡的熔解。

图19示出将在手持装置中采用的具有分束器的光学系统的实施例的描述。荧光检测系统包含LED光源(193)、聚光的透镜(196)、用于选择特定波长的的带通滤波器(195)、分束器(191)、聚焦入射光和来自装载到芯片(200)的样品的信号的透镜(198)，用于选择特定波长光的带通滤波器(194)、聚焦透镜(197)以及光检测器(192)。

图20示出了结合光纤和透镜的混合光学系统的实施例的描述。该荧光检测系统包含图中未示出的LED光源、以及用于选择耦合到光纤(213)的特定波长光的带通滤波器。光纤将光引导到样品上。可选地，合适的透镜可用于将来自光纤的光聚焦到样品上。透镜(212)用于聚集来自装载到芯片(200)的样品的发射光。带通滤波器(214)用于选择特定波长的发射光且聚焦透镜(212)将特定波长的发射光聚焦到光检测器。

Claims

1.一种手持微PCR装置，包括：

a)LTCC微PCR芯片，包括加热器、装载样品的反应室，

b)加热器控制，基于从温度传感器接收的输入调节所述加热器，

c)光学检测系统，检测来自所述样品的荧光信号，以及

d)至少一个通信接口，与一个或多个其他装置交互。

2.根据权利要求1所述的装置，其中至少一个导体层设置在所述加热器和所述反应室之间。

3.根据权利要求1所述的装置，其中所述反应室被导体环围绕。

4.根据权利要求3所述的装置，其中至少一个导体层设置在所述加热器和所述反应室之间，并且所述导体环使用柱连接到所述至少一个导体层。

5.根据权利要求1所述的装置，其中所述芯片包括至少一个层并且所述温度传感器放置在芯片外部或嵌入在所述芯片的至少一个层中以测量芯片温度。

6.根据权利要求1所述的装置，其中所述温度传感器被连接作为桥式电路的一个臂，所述桥式电路输出在馈入到所述加热器控制以调节所述加热器之前被放大。

7.根据权利要求1所述的装置，其中所述芯片包括透明密封帽以覆盖所述反应室。

8.根据权利要求1所述的装置，其中所述光学检测系统包括光源和光检测器，所述光学检测系统是从包括分束器光学检测系统、混合光学检测系统和分叉光学检测系统的组中选出的。

9.根据权利要求1所述的装置，其中所述通信接口从包括串口、USB、蓝牙或其组合的组中选出。

10.根据权利要求1所述的装置，其中所述其他装置从包括接收来自所述手持微PCR装置的芯片温度和放大信号的智能电话、PDA和可编程装置的组中选出。

11.一种监视和控制手持微PCR装置的方法，所述方法包括以下步骤：

a.通过通信接口在所述手持微PCR装置和其他装置之间建立通信，

b.基于从所述其他装置接收的热配置值初始化热循环过程以控制LTCC微PCR芯片，以及

c.把光学系统检测的光学信号发送到其他装置。

12.根据权利要求11所述的方法，其中通过用户接口向所述其他装置馈入所述热配置值，创建、修改或删除所述热配置值。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述其他装置提供用户的认证，所述其他装置存储多个热配置值。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述热配置值提供设定点值和循环次数，其中将所述芯片维持在一温度且维持由设定点值确定的一段时间。

15.根据权利要求11所述的方法，其中通过停止热循环过程将微PCR芯片温度带至室温，并且当热循环暂停时，维持微PCR芯片温度恒定。

16.根据权利要求11所述的方法，其中在所述其他装置的显示单元上绘制热和光学数据。