CN103820316B - 基于旋转式微流控芯片的实时荧光pcr检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统，该系统包括退火低温区、延伸适温区、热变高温区、旋转模块、PCR试剂容纳腔、注入微通道、仪器固定底座、荧光检测系统；其中，温度循环控制模块包括退火低温区、延伸适温区、热变高温区；微通道循环PCR扩增模块包括旋转模块、PCR试剂容纳腔、注入微通道、仪器固定底座；荧光光谱检测模块包括荧光检测系统；本发明将微通道循环PCR扩增模块、温度循环控制模块、荧光光谱检测模块三个模块集成，实现适用于空间作业要求的便携式微型化PCR荧光实时检测系统，达到功能集成、结构缩微、重量轻体积小全自动检测的目标。

Description

基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统
技术领域
本发明涉及一种基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统，属于生物学和分析化学及医学检测领域。
背景技术
目前，在长期航天飞行中的空间飞行器内，微生物菌群的增长及菌株变异会影响仪器设备的性能及工作环境条件，对航天器及其仪器设备的正常运行产生危害。为了预防空间飞行中感染性疾病的发生、传播和进行有效治疗，急需空间在轨生物危害实时自动报警系统，其核心是微生物核酸荧光检测微系统。由于空间在轨要求设备具有全自动和微体积、小重量的技术特点。因此简化微流控荧光PCR工作系统是实现空间在轨生物危害实时自动报警系统要求的关键。
关键技术是满足“功能集成结构缩微”的微型荧光检测装置，以实现重量轻、体积小、全自动检测为目标，此外都需要对微量的样品首先进行PCR扩增反应，使目标DNA实现体外复制达到一定检测量后进行检测分析。因此，微型荧光检测装置的研究可以移植在PCR微流控生物芯片上进行，然后对检测系统在失重条件下的计算进行修正研究，以达到空间应用要求。
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，由高温热变性温区、低温退火复性温区和适温延伸温区组成一个周期，一个循环可以使DNA总量增加一倍，可以把痕量的遗传物质迅速而简便的扩增百万倍，再使用基于FRET（荧光共振能量传递技术）进行荧光实时检测，根据荧光强度以及强度相对变化的信息，可对PCR产物进行定性定量分析。
当前市场上，常见的实时荧光PCR检测仪器，都不能满足空间领域的需求，主要存在以下缺点：
1、仪器内PCR扩增系统中的温度控制模块采用金属块进行加热和风扇冷却相配合，整个系统耗电量大，体积庞大难以微型化，无法实现便携性，并且实施效率低，无法满足快速处理问题与迅速检测样本的要求；
2、仪器内荧光检测系统中的光电倍增管或电荷耦合元件自身的体积就很大，而且又是分体使用，需要有配套的光路系统，致使整个荧光微光谱检测系统的体积庞大，加大了微型化的难度。无法应用于快速发展的空间领域当中；
3、仪器内传输系统中的激发光传导和反射光采集时需要各类光学器件和光纤组成的光路进行光路传输，不仅结构复杂难以微缩集成化，并且影响实时荧光检测中的各个模块的灵敏性与稳定性；
4、目前的仪器不仅体积庞大且无法对微通道内温度的变化、微流体的流速和荧光信号之间进行实时监测和反馈；
5、对于小型仪器的中温度控制系统缺少完整的隔离性，三个温区易相互干扰，严重影响生物反应结果；
因此，研制体积小、重量轻且高度集成自动化的微型微流控PCR荧光检测系统是主要目标，其中对于三个温区间的相互干扰问题，旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统中的完全分离三个温区，可以很好的解决；并且能够最大化的减少PCR反应中试剂在温区移动时消耗的时间，提高PCR系统的检测效率；此外旋转式的芯片结构能很好的节省空间，最大化的减少体积空间，可以满足空间领域苛刻要求。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统，其主要适用于对目标样本的PCR扩增和基于微型结构的实时荧光PCR检测工作，并可应用于失重条件下的空间领域工作；同时本发明将微通道循环PCR扩增模块、温度循环控制模块、荧光光谱检测模块三个模块集成，实现适用于空间作业要求的便携式微型化PCR荧光实时检测系统，达到功能集成、结构缩微、重量轻体积小全自动检测的目标；此外在温度控制方面，完成把三个温区完全隔离的目标。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统，该系统包括退火低温区、延伸适温区、热变高温区、旋转模块、PCR试剂容纳腔、注入微通道、仪器固定底座、荧光检测系统；其中，温度循环控制模块包括退火低温区、延伸适温区、热变高温区；微通道循环PCR扩增模块包括旋转模块、PCR试剂容纳腔、注入微通道、仪器固定底座；荧光光谱检测模块包括荧光检测系统。
所述退火低温区、延伸适温区、热变高温区这三个温区作为系统的温度循环控制模块与仪器固定底座相连；仪器固定底座与旋转模块的中心轴连接；具体而言，退火低温区与延伸适温区和热变高温区内分别装有薄膜电加热片作为加热源，通过位于仪器固定底座内的微型单片机控制加热温度，同时三个温区底部分别装有铂电阻温度传感器，采集实时温度值后反馈到单片机控制系统中进行实时监控，单片机实时对加热模块进行相关调整，每个温区内的加热模块分别处于恒温状态，使样本不失去生物活性，并实时单向对PCR试剂容纳腔进行加热；所述三个温区分别位于三个不同的方向放置，相邻之间呈120°夹角，完全隔离分开，避免了温度干扰并进行安全加热，同时各控制温区具有独立性，当出现故障的时候，方便及时维修。
PCR试剂容纳腔通过注入微通道与旋转模块相连；荧光检测系统与旋转模块相连，且PCR试剂容纳腔、荧光检测系统固定在一起，所述荧光检测系统设有LED显示；退火低温区、延伸适温区、热变高温区的外形尺寸小于PCR试剂容纳腔的外形尺寸，由于在三个加热区中采用中心加热的方式，PCR试剂容纳腔的尺寸大于三个加热区有助于充分加热，使得反应更加充分。
微通道循环PCR扩增模块的工作过程如下，通过位于仪器固定底座内的微型单片机的控制，使得在旋转模块内的步进电机按照PCR扩增循环周期的要求进行转动；PCR试剂容纳腔依次经过退火低温区与延伸适温区和热变高温区的三个恒温加热区，使DNA经高温变性、低温退火以及适温延伸完成一次循环实现扩增，之后经过四十次循环实现整个样本的PCR扩增循环，其中可通过设定不同温区的宽度确定PCR试剂在不同温区所需的反应时间。
在PCR试剂容纳腔中，上表面采用耐热性、透光性较好的有机玻璃制成，将其作为PCR试剂容纳腔的上表面，以便对PCR扩增反应进行检测并减少相应误差；下表面采用传热较好的耐热材料，使得PCR试剂能够良好的接收位于底层的三个温区的加热温度；当PCR试剂容纳腔经过微通道循环PCR扩增后，通过在PCR试剂容纳腔正上方的荧光检测系统内的半导体发光二极管(LED)作为激发光源的激发光，使得样本由于激发光激发出相应荧光，之后被荧光检测系统内的光学微透镜采集，并由系统中的光电二极管(PIN)换器接收，由单片机进行算法处理，最终将生物结果输出在荧光检测系统的LED显示屏上；荧光检测模块与单片机工作流程如下，激发光源发射指定峰值波长的光，之后通过相同峰值波长的滤光片，最后经模块内部的光学微透镜聚焦到样本上；样本受到光的激发，样本发出荧光，并利用光学传感器（例如光硅电池等半导体光电转换器件）把收集到的荧光光强转化为相应的电流强度，之后通过一个放大电路把测到的电流放大并通过一个指定电阻，变成相应的电压值，之后通过AD芯片把测试到的电压值进行AD转换，之后把转换的二进制数输入到单片机中做处理，最终利用单片机算法把处理后的数据代入相应转换公式，把电压值转换成相应的荧光强度值，并在LED/LCD屏中显示；之后在每次循环后记下荧光强度值，取50次循环作为计数点处理并作图；最后输出平滑上升曲线。结果符合理论PCR反应情况，设备具有相应实际应用性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果。
1、本发明相较于传统的大型PCR检测系统，采用单片机微处理器集成控制系统，既减少了多余的外围设备，使系统更加微型化；并且功能集成化，使得PCR扩增系统与PCR实时荧光检测系统能够集成在一起共同来完成，方便每次循环后的样本检测，提高了实验处理效率。
2、本发明旋转式微流控芯片结构为载体，相对于传统的PCR循环通道中加热层一体化段加热的方法，本系统采用三个温区完全分离的方法，节省了隔热材料，减少了微通道内PCR试剂在路程中滞留时间，减少了反应区变温时间，从而加快了整体的工作效率。
3、本发明采用中轴旋转式工作方式，避免了传统PCR试剂在微通道中反复移动时PCR试剂挂壁现象，而是通过中轴电机来完成整体运动，减低了反应误差、提高了检测系统的准确性。
4、本发明中的荧光检测装置有较高的集成性，如激发光源、光的聚集与传输、光匀束、光采集、光检测等；由于取代了大型的光电倍增管PMT或电荷耦合元件CCD等，使得整个装置的特征尺寸缩小到只有毫米数量级。具有较高的便携性。
5、本发明采用单片机控制步进电机旋转速度与温区温度，整体采用密封封装，不受重力条件的影响，可以移植到空间领域应用，并且避免试剂污染环境与资源的循环利用。
附图说明
图1为基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统俯视图。
图2为基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统总结构立体图。
图3为系统中PCR试剂容纳模块的剖面图。
图4为荧光检测模块与单片机工作流程图。
图5为荧光检测单片机仿真图
图中：1、退火低温区；2、延伸适温区；3、热变高温区；4、旋转模块；5、PCR试剂容纳腔；6、注入微通道；7、仪器固定底座；8、荧光检测系统。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
一种基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统，该系统包括退火低温区1、延伸适温区2、热变高温区3、旋转模块4、PCR试剂容纳腔5、注入微通道6、仪器固定底座7、荧光检测系统8；其中，温度循环控制模块包括退火低温区1、延伸适温区2、热变高温区3；微通道循环PCR扩增模块包括旋转模块4、PCR试剂容纳腔5、注入微通道6、仪器固定底座7；荧光光谱检测模块包括荧光检测系统8。
所述退火低温区1、延伸适温区2、热变高温区3这三个温区作为系统的温度循环控制模块与仪器固定底座7相连；仪器固定底座7与旋转模块4的中心轴连接；具体而言，退火低温区1与延伸适温区2和热变高温区3内分别装有薄膜电加热片作为加热源，通过位于仪器固定底座7内的微型单片机控制加热温度，同时三个温区底部分别装有铂电阻温度传感器，采集实时温度值后反馈到单片机控制系统中进行实时监控，单片机实时对加热模块进行相关调整，每个温区内的加热模块分别处于恒温状态，使样本不失去生物活性，并实时单向对PCR试剂容纳腔5进行加热；所述三个温区分别位于三个不同的方向放置，相邻之间呈120°夹角，完全隔离分开，避免了温度干扰并进行安全加热，同时各控制温区具有独立性，当出现故障的时候，方便及时维修。
PCR试剂容纳腔5通过注入微通道6与旋转模块4相连；荧光检测系统8与旋转模块4相连，且PCR试剂容纳腔5、荧光检测系统8固定在一起，所述荧光检测系统8设有LED显示；退火低温区1、延伸适温区2、热变高温区3的外形尺寸小于PCR试剂容纳腔5的外形尺寸，由于在三个加热区中采用中心加热的方式，PCR试剂容纳腔5的尺寸大于三个加热区有助于充分加热，使得反应更加充分。
微通道循环PCR扩增模块的工作过程如下，通过位于仪器固定底座7内的微型单片机的控制，使得在旋转模块4内的步进电机按照PCR扩增循环周期的要求进行转动；PCR试剂容纳腔5依次经过退火低温区1与延伸适温区2和热变高温区3的三个恒温加热区，使DNA经高温变性、低温退火以及适温延伸完成一次循环实现扩增，之后经过四十次循环实现整个样本的PCR扩增循环，其中可通过设定不同温区的宽度确定PCR试剂在不同温区所需的反应时间。
在PCR试剂容纳腔5中，上表面采用耐热性、透光性较好的有机玻璃制成，将其作为PCR试剂容纳腔的上表面，以便对PCR扩增反应进行检测并减少相应误差；下表面采用传热较好的耐热材料，使得PCR试剂能够良好的接收位于底层的三个温区的加热温度；荧光光谱检测模块如图2所示的系统总结构图，当PCR试剂容纳腔5经过微通道循环PCR扩增后，通过在PCR试剂容纳腔5正上方的荧光检测系统8内的半导体发光二极管(LED)作为激发光源的激发光，使得样本由于激发光激发出相应荧光，之后被荧光检测系统8内的光学微透镜采集，并由系统中的光电二极管(PIN)换器接收，由单片机进行算法处理，最终将生物结果输出在荧光检测系统8的LED显示屏上；流程如图4所示，荧光检测模块与单片机工作流程如下，激发光源发射指定峰值波长的光，之后通过相同峰值波长的滤光片，最后经模块内部的光学微透镜聚焦到样本上；样本受到光的激发，样本发出荧光，并利用光学传感器（例如光硅电池等半导体光电转换器件）把收集到的荧光光强转化为相应的电流强度，之后通过一个由LM358运放芯片构成的放大电路把测到的微安级电流放大到可以用于实验的毫安级电流，并通过一个大小为1千欧的电阻，变成相应的电压值，之后通过AD芯片ADC0804把测试到的电压值进行AD转换，之后把转换的二进制数输入到单片机中做处理，最终利用单片机算法把处理后的数据代入相应转换公式，把电压值转换成相应的荧光强度值，并在LED/LCD屏中显示；之后在每次循环后记下荧光强度值，取50次循环作为计数点处理并作图；最后输出平滑上升曲线。如图5荧光检测单片机仿真图，由于仿真软件库所限，LM358运放用OP07运放来代替，LED显示屏用数码管来代替，单片机用传统51单片机。在实际中，由于51单片机与其外设模块体积相对较大，不易在微结构仪器中使用，所以我们在实际设计中，会选择AVR等微型单片机来完成。
如图3-5，系统中PCR试剂容纳模块的剖面图所示，在PCR试剂容纳腔5中，上表面采用透光较好的耐热材料，以便之后对PCR扩增反应进行检测中，减少相应误差；下表面采用传热较好的耐热材料，使得PCR试剂能够良好的接收位于底层的三个温区的加热温度。荧光光谱检测模块由图2系统总结构图所示，当PCR试剂容纳腔5经过微通道循环PCR扩增后，通过在PCR试剂容纳腔5正上方的荧光检测系统8内的半导体发光二极管(LED)作为激发光源发出峰值波长为475nm的激发光，使得样本由于激发光激发出相应荧光，之后被荧光检测系统8内的光学微透镜采集，并由系统中的光电二极管(PIN)换器接收，由单片机进行算法处理，最终将生物结果输出在荧光检测系统8上方的LED显示屏上；其中曲线在1-20循环区间内上升不明显；在20-45循环区间内有明显指数上升；在45循环之后聚合酶失去活性，曲线又逐渐停止上升趋于平稳。结果符合理论PCR反应情况，设备具有相应实际应用性。

Claims (5)

1.一种基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统，其特征在于：该系统包括退火低温区（1）、延伸适温区（2）、热变高温区（3）、旋转模块（4）、PCR试剂容纳腔（5）、注入微通道（6）、仪器固定底座（7）、荧光检测系统（8）；其中，温度循环控制模块包括退火低温区（1）、延伸适温区（2）、热变高温区（3）；微通道循环PCR扩增模块包括旋转模块（4）、PCR试剂容纳腔（5）、注入微通道（6）、仪器固定底座（7）；荧光光谱检测模块包括荧光检测系统（8）；
所述退火低温区（1）、延伸适温区（2）、热变高温区（3）这三个温区作为系统的温度循环控制模块与仪器固定底座（7）相连；仪器固定底座（7）与旋转模块（4）的中心轴连接；具体而言，退火低温区（1）与延伸适温区（2）和热变高温区（3）内分别装有薄膜电加热片作为加热源，通过位于仪器固定底座（7）内的微型单片机控制加热温度，同时三个温区底部分别装有铂电阻温度传感器，采集实时温度值后反馈到单片机控制系统中进行实时监控，单片机实时对加热模块进行相关调整，每个温区内的加热模块分别处于恒温状态，使样本不失去生物活性，并实时单向对PCR试剂容纳腔（5）进行加热；所述三个温区分别位于三个不同的方向放置，相邻之间呈120°夹角，完全隔离分开；
PCR试剂容纳腔（5）通过注入微通道（6）与旋转模块（4）相连；荧光检测系统（8）与旋转模块（4）相连，且PCR试剂容纳腔（5）、荧光检测系统（8）固定在一起，所述荧光检测系统（8）设有LED显示；退火低温区（1）、延伸适温区（2）、热变高温区（3）的外形尺寸小于PCR试剂容纳腔（5）的外形尺寸，由于在三个加热区中采用中心加热的方式，PCR试剂容纳腔（5）的尺寸大于三个加热区有助于充分加热，使得反应更加充分。
2.根据权利要求1所述的一种基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统，其特征在于：微通道循环PCR扩增模块的工作过程如下，通过位于仪器固定底座（7）内的微型单片机的控制，使得在旋转模块（4）内的步进电机按照PCR扩增循环周期的要求进行转动；PCR试剂容纳腔（5）依次经过退火低温区（1）与延伸适温区（2）和热变高温区（3）的三个恒温加热区，使DNA经高温变性、低温退火以及适温延伸完成一次循环实现扩增，之后经过四十次循环实现整个样本的PCR扩增循环，其中可通过设定不同温区的宽度确定PCR试剂在不同温区所需的反应时间。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统，其特征在于：在PCR试剂容纳腔（5）中，上表面采用耐热性、透光性较好的有机玻璃制成，将其作为PCR试剂容纳腔的上表面，以便对PCR扩增反应进行检测并减少相应误差；下表面采用传热较好的耐热材料，使得PCR试剂能够良好的接收位于底层的三个温区的加热温度。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统，其特征在于：当PCR试剂容纳腔（5）经过微通道循环PCR扩增后，通过在PCR试剂容纳腔（5）正上方的荧光检测系统（8）内的半导体发光二极管作为激发光源的激发光，使得样本由于激发光激发出相应荧光，之后被荧光检测系统（8）内的光学微透镜采集，并由系统中的光电二极管换器接收，由单片机进行算法处理，最终将生物结果输出在荧光检测系统（8）的LED显示屏上。
5.根据权利要求1或2所述的一种基于旋转式微流控芯片的实时荧光PCR检测系统，其特征在于：荧光检测模块与单片机工作流程如下，激发光源发射指定峰值波长的光，之后通过相同峰值波长的滤光片，最后经模块内部的光学微透镜聚焦到样本上；样本受到光的激发，样本发出荧光，并利用光学传感器把收集到的荧光光强转化为相应的电流强度，之后通过一个放大电路把测到的电流放大并通过一个指定电阻，变成相应的电压值，之后通过AD芯片把测试到的电压值进行AD转换，之后把转换的二进制数输入到单片机中做处理，最终利用单片机算法把处理后的数据代入相应转换公式，把电压值转换成相应的荧光强度值，并在LED/LCD屏中显示；之后在每次循环后记下荧光强度值，取50次循环作为计数点处理并作图；最后输出平滑上升曲线。
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