CN104730265A - 手持式poct流式基因分析系统 - Google Patents

Abstract

手持式POCT流式基因分析系统包括：用于样品扩增且在上表面形成荧光检测区的热梯度微反应器，用于激发样品产生荧光并记录荧光图像的智能手机宽场荧光成像器，用于将样品定量抽取至热梯度微反应器的微流体驱动器，与热梯度微反应器、智能手机宽场荧光成像器、微流体驱动器、电源组件分别相接的电子控制系统，电源组件，含绝热底板的避光外壳；热梯度微反应器、微流体驱动器、电源组件、电子控制系统均安装在绝热底板上，智能手机宽场荧光成像器位于热梯度微反应器的正上方。本发明结构简单、体积小巧，操作方便，可现场使用，检测过程/结果直接可视，可进行高速、高灵敏、多元且实时定量的核酸检测，属于体外分子诊断技术领域。

Description

手持式POCT流式基因分析系统

技术领域

本发明属于体外分子诊断技术领域，特别涉及一种手持式POCT流式基因分析系统。

背景技术

POCT(point of care testing)一般称为即时检验，是体外诊断(IVD)的一个细分行业，其凭借便捷、快速的优势，可实现在患者身边快速取得诊断结果，成为近年来快速发展的一个新兴领域。目前正在发展的POCT依据其技术特性主要划分为三代：以快速诊断试纸(如血糖试纸条、早孕试纸条等)为基础的第一代POCT，以卡盒式核酸扩增为基础的第二代POCT，以智能手机的应用为基础的第三代POCT。相比于前两代POCT，第三代POCT由于其具备高灵敏、高特异的多参数定量检测能力和更加集成便携、操作简便、用户友好等诸多潜在优势，已成为体外即时检测领域的最前沿技术。

在第三代POCT基因分析类仪器中，普遍采用基于微流控技术的核酸扩增方法作为核心技术来实现具备上述特征的快速分子诊断。然而，目前发展中的这类POCT基因分析系统包括基于时域聚合酶链式反应(PCR)类的系统和基于等温扩增类的系统，由于其各自技术的固有特点，两类技术均存在着一些制约瓶颈。时域PCR类：其实质相当于传统热循环仪的微型化，其热循环需要精确重复的升或降温而且热元件(或结构)存在自身热惯性，这些因素通常会导致大量时间和能量消耗、温度控制的复杂、成本的上升、热设计上的笨重。等温扩增类：一方面，其扩增过程无需热循环，其检测的灵敏度、准确性和可定量性极其依赖于扩增过程在时间上的持续，通常只能针对具体样品的反应体系建立与之对应的时间持续标度，缺乏普适性，因而存在实际操作上的困难；另一方面，扩增产物的可靠检测比较困难，目前其扩增产物主要依赖终点检测(如电泳等)，虽然可以通过监测扩增过程中的荧光或溶液浊度等信号的累积来进行定量检测，但却牺牲了其检测的特异性，因为任何非特异性或附生型的产物也能累积上述检测信号，因此这类定量检测存在假阳性风险。作为一种微流控核酸扩增新技术，空域PCR利用“空间交换时间”让样品反应液反复通过两或三个恒温区来实现PCR所需的热循环，消除了精确反复升降温的需求，避免了热系统自身的热滞，在热循环速度、系统能耗、温度控制和整体尺寸等方面具有显著优势，但目前基于该技术的基因分析装置尚未达到面向POCT应用阶段，主要表现为：(1)集成度不足，仍然依赖笨重的离线设备和资源，如：泵源、温度控制系统、计算机、台式检测器和电源等；(2)功能单一，大多仅具有核酸扩增功能，缺乏关键性的在线分析能力包括实时定量检测和产物鉴别。显然，目前已发展的第三代POCT基因分析类仪器仍存在一些不便和缺陷，亟待加以进一步发展和改进。

为此，需要发明一种手持式POCT流式基因分析系统，克服现有POCT基因分析仪器在分析速度、多元与定量检测、能源消耗、便携性和操作简便等方面的缺陷与不足，使其秉承POCT理念，具有体积小巧便携，操作简便直观，可现场化使用、成本低等优点，并且具备高速高灵敏高特异性扩增、实时定量检测、多元核酸鉴别和同时多批次样品分析等能力，使之适用于更广泛的应用场合。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是：提供一种基于第三代POCT理念的体积小巧、便携、操作简便的手持式POCT流式基因分析系统。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

手持式POCT流式基因分析系统，包括：1.用于样品扩增且在上表面形成荧光检测区的热梯度微反应器，2.用于激发样品产生荧光并记录荧光图像的智能手机宽场荧光成像器，3.用于将样品定量抽取至热梯度微反应器的微流体驱动器，4.电源组件，5.与热梯度微反应器、智能手机宽场荧光成像器、微流体驱动器、电源组件分别相接的电子控制系统，6.含绝热底板的避光外壳；热梯度微反应器、微流体驱动器、电源组件、电子控制系统均安装在绝热底板上，智能手机宽场荧光成像器位于热梯度微反应器的正上方。

进一步，为了优化整体结构，使得各部件排列紧凑，热梯度微反应器、电子控制系统、电源组件从左往右依次设置，微流体驱动器位于热梯度微反应器的前方。

进一步，对热梯度反应器的结构进行优化设计：

热梯度微反应器，包括发热基底、微通道、加热元件、温度传感器和供发热基底散热的散热装置；发热基底包括实心柱体段和空心柱体段；空心柱体段的横截面为开口朝向实心柱体段的U形，实心柱体段与U形开口的一端相接且与U形开口的另一端断开；微通道呈螺线管式缠绕在发热基底外，螺线管的轴线与发热基底的长度方向一致；加热元件和温度传感器安装在实心柱体段内。此处所说的螺线管类似螺纹形状，区别在于其缠绕的母体形状并非螺纹的圆柱形或圆锥形，而为发热基底的柱体形。发热基底为导热系数适中的金属材质或其它具有线性热导率的复合导热材质。采用这种结构后，通过单个加热元件配合温度传感器、散热装置有效控制发热基底的温度，从而在发热基底表面形成解链温度区间、退火/延伸温度区间和延伸-解链线性热梯度区间，且区间的大小、位置均可灵活调整能快速对微通道内的反应液样品进行扩增，为后续荧光成像分析做准备提供高密度的通道单元和大面积的成像视野。

实心柱体段与空心柱体段相连接的部位位于发热基底的上端，实心柱体段与空心柱体段相断开的部位位于发热基底的下端，实心柱体段位于发热基底的左端，空心柱体段位于发热基底的右端；实心柱体段的左端表面为半圆柱面，空心柱体段的右端表面也为半圆柱面，两半圆柱面的半径相同。采用这种结构后，即发热基底采用特殊的形状，一方面便于微通道缠绕，另一方面能有效控制各区间的大小和位置。

发热基底的外表面设有呈螺线管式分布的U形沟槽，微通道嵌入U形沟槽中。采用这种结构后，U形沟槽将微通道环绕，加速热量的传递，热量传递均匀；同时微通道依预先加工好的U形沟槽布置，缠绕方便。

空心柱体段的下端具有一个凸出块；发热基底通过凸出块安装在散热装置上。采用这种结构后，结构简单，安装方便。

散热装置包括散热片和朝向散热片吹风的微型涡轮风扇；凸出块安装在散热片的上端。采用这种结构后，散热片配合微型涡轮风扇散热，操作简单，散热可靠；调节风扇的功率即可调整散热量的大小。

凸出块为立方体形；凸出块与发热基底为一体制作成型，发热基底的U型沟槽沿螺线管方向贯穿凸出块，凸出块的下端平面紧贴散热片的上端。采用这种结构后，凸出块与发热基底一体制作成型，两者之间留有U形沟槽，安装微通道时只需穿过U形沟槽即可。

实心柱体段的长度大于空心柱体段的长度；实心柱体段的前端与空心柱体段的前端对齐，实心柱体段的后端凸出于空心柱体段的后端。采用这种结构后，实心柱体段凸出于空心柱体段的一段形成圆柱区，其余的发热基底形成扁平区，即可将PCR预变性区控制在圆柱区处。

实心柱体段内开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的圆形通孔，实心柱体段内还开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的插孔；加热元件为电加热棒，安装在圆形通孔内；温度传感器安装在插孔内。优选的，电加热棒位于实心柱体段的半圆柱面的中心轴线上。采用这种结构后，结构简单、安装方便，加热元件可对发热基底进行均匀加热，温度易于控制。

微通道为透明毛细管。采用这种结构后，便于微通道内的反应液进行荧光的激发与成像。

微通道呈螺线管式缠绕至实心柱体段的后端，微通道位于后端的一端为进样口。采用这种结构后，可将PCR预变性区控制在圆柱区处。

进一步，对智能手机宽场荧光成像器的结构进行优化设计：

智能手机宽场荧光成像器，包括：1.带有摄像头的智能手机，2.出射光可激发荧光的荧光激发光源，3.使得荧光激发光源的出射光垂直转向并且使得被激发的荧光沿荧光的原传播方向穿过的二向色性滤光片，4.光阑，5.发射滤片；摄像头、发射滤片、二向色性滤光片、光阑从上往下依次设置；发射滤片、光阑相互平行，且均与二向色性滤光片成45度角；荧光激发光源的出射光与二向色性滤光片成45度角。采用这种结构后，结构紧凑，体积小巧，可应用于手持式便携设备。

荧光激发光源包括沿着光的传播方向依次设置的LED灯、聚光透镜、激发滤片。采用这种结构后，结构简单，操作方便，可发出能够激发荧光的特定波长的光线。

LED灯为LED面光源。采用这种结构后，在特定激发面上形成光强足够强、照射面积足够大、光强分布足够均匀的激发光斑，避免分立多个LED组合激发光源(如环形LED阵列光源)而带来的因LED位置、发光效率以及工作状态等差异造成激发光斑光强分布的不均匀与不可控。

荧光激发光源包括LED灯散热底座；该LED灯散热底座与LED灯的背面相接，LED灯的正面发光。采用这种结构后，可对LED灯及时散热，保证LED灯发光效率与使用寿命。

智能手机宽场荧光成像器，还包括一个安装暗盒；发射滤片、二向色性滤光片、激发滤片、聚光透镜均设置在安装暗盒内，摄像头位于安装暗盒的上方，光阑位于安装暗盒的下方。采用这种结构后，安装暗盒能保证荧光激发光源的出射光和被激发的荧光顺利通过，隔离除荧光激发光源的出射光和被激发的荧光外的干扰光线，提高荧光成像的信噪比，保证检测结果的灵敏性和准确度。

安装暗盒采用遮光材料或安装暗盒的内壁设有遮光涂层。采用这种结构后，结构简单，制作方便。

摄像头位于智能手机的背面，智能手机的正面设有显示摄像头拍摄的荧光图像的显示屏。采用这种结构后，使得检测结果直观可视，充分利用智能手机。

控制经反射的荧光激发光源的出射光的横截面形状的光阑上设有若干通孔。采用这种结构后，荧光有效检测区的位置、面积、形状通过安装在其近表面的光阑来调节，以适应不同的检测需求。

二向色性滤光片从右上方向左下方倾斜，荧光激发光源位于二向色性滤光片的右侧。采用这种结构后，光路结构简单紧凑。

进一步，对微流体驱动器的结构进行优化设计：

微流体驱动器包括注射器、丝杆滑块机构、减速步进电机；减速步进电机通过丝杆滑块机构驱动丝杆滑块机构中的滑块平移；注射器的针筒与绝热底板相对固定，注射器的推块与滑块相接并由滑块带动平移。采用这种结构后，控制减速步进电机转动，即可控制注射器的推杆的平移量，进而实现样品定量进样的精确控制。

进一步，对电子控制系统、电源组件的结构进行优化设计：

电子控制系统集成在一块印刷电路板上，印刷电路板立起固定在绝热底板上。采用这种结构后，印刷电路板只要采取一定的热隔离手段，即可将左侧热梯度微反应器热量隔离，避免其对电子控制系统、电源组件带来影响。

电源组件为充电电池组，充电电池组固定在绝热底板上。采用这种结构后，充电电池组同时对热梯度微反应器、智能手机宽场荧光成像器、微流体驱动器、电子控制系统供电。

进一步，避光外壳将热梯度微反应器、微流体驱动器、电源组件、电子控制系统全部包裹，避光外壳将智能手机宽场荧光成像器部分包裹，智能手机宽场荧光成像器中智能手机的显示屏露出避光外壳外；绝热底板上对应微型涡轮风扇的位置开有通风栅格，避光外壳对应散热片左侧的出风口位置开有散热口。采用这种结构后，避光外壳和绝热底板将零部件包裹，结构紧凑，体积小巧，整体易于手持操作。通风栅格和散热口可及时将内部热量散发。

本发明的原理是：

微通道紧密包埋于发热基底的U型沟槽中；通过温度传感器反馈控制加热元件工作，保持单个加热元件维持恒定温度即可在发热基底外表面形成解链温度区间、退火/延伸温度区间和延伸-解链线性热梯度区间，且通过调节散热装置的输出功率可以灵活改变上述温度区间的温度及区间长度，以适应最佳扩增效果和检测效果；微通道中的反应液通过微流体驱动器以油相为载流体驱动其沿微通道流动，依次经历解链温度区间、退火/延伸温度区间和延伸-解链线性热梯度区间。在延伸-解链温度区之间形成空间融解分析所需的线性热梯度区。优选的，通过调节散热装置的输出功率，可实现对退火/延伸区间温度跨度的改变以获得不同引物退火/延伸的最佳反应温度和合适的融解分析温度区间。优选的，发热基底的上表面作为荧光检测区，其有效检测区的位置、面积、形状通过安装在其近表面的智能手机宽场荧光成像器的光阑来来调节，以适应不同的检测需求。

智能手机宽场荧光成像器安装于热梯度微反应器的上表面正上方，用于对上表面微通道荧光图像的实时采集与监测，通过对荧光信号的时域强度和空域强度的分析可产生实时扩增曲线和高分辨融解曲线。

具有高亮度的LED灯发射的激发光通过聚光透镜收集并射向激发滤片滤波，并通过与激发滤片成45度夹角的二向色性滤光片的反射，形成与初射方向垂直的激发光，该激发光再通过光阑照射微通道内的反应液，反应液中的荧光染料激发荧光，荧光沿着直线依次通过光阑、二向色性滤光镜、发射滤片，收集到智能手机的摄像头的传感器中，从而产生微通道的实时的荧光图像。

采集到的实时荧光图像既可以显示在智能手机的显示屏上进行直接判读和分析，也可以存储在智能手机的内建存储单元中通过USB线缆传输至安装有图像分析软件的服务器电脑上进行分析处理，还可以通过无线信号(WiFi、3G、4G)实时传输到相应的网络服务器上进行远程的在线分析。

微流体驱动器主要包括：减速步进电机、含丝杆滑块机构的支架台、注射器、单片机驱动控制电路。注射器的针筒固定，注射器的推块连接在支架台的滑块上，减速步进电机在单片机驱动控制电路的控制下通过联轴器带动支架台的丝杆从而驱动注射器的推块以一定速率线性运动，完成注射器对样品的抽取动作。注射器的出口与微通道的前端出口端相连接，微通道中的反应液以矿物油为载流体，当注射器活塞运动时，从微通道后方进样口抽取反应液，驱动反应液在微通道中依次反复流过变性温区、退火/延伸温区，以实现PCR热循环。

电子控制系统主要具有以下功能单元：温度控制单元、LED驱动单元、步进电机驱动单元、电位调速器、电源管理单元。温度传感器将加热元件的温度实时反馈给温度控制单元，温度控制单元根据温度传感器反馈的温度信号来控制加热元件保持设定温度。步进电机驱动单元通过输入控制程序来设定微流体驱动器的工作模式、运动速率、行进步长等参数并具有参数记忆功能，以实现自动化的精确取样、连续驱动、暂停与终止等流体操作。LED驱动单元具备自适应的稳压稳流和功率调节功能，用于保持LED灯的长时间稳定的光强输出和对荧光激发光强进行调节。电位调速器通过调节微型涡轮风扇的转速达到强化或减弱热梯度微反应器冷却端热流，从而调整退火温度和空间融解分析区间以达到最佳扩增与检测效果。电源管理单元用于维持充电电池组电压的稳定输出和输出给不同工作电压功能模块之间电压转换和分配。

手持式POCT流式基因分析系统的一般工作过程为：由键盘输入设定的温度值、微流体流速后，单片机开启发热基底上的加热元件，由温度传感器监控实时温度并反馈给电子控制系统，并由LED显示；待稳定达到设定温度值后，微流体驱动器的减速步进电机按预先设定的流速实现进样；同时开启智能手机宽场荧光成像器，当微流体流至荧光检测区时，进行荧光图像的实时采集，获得的荧光图像显示在智能手机的显示屏上并同时存储在智能手机的存储模块中，通过USB数据线或者无线网络传输至安装有图像分析软件的服务器电脑上进行数据处理，产生相应的扩增曲线与融解曲线。

总的说来，本发明具有如下优点：

1.手持式POCT流式基因分析系统具有结构简单、体积小巧，操作方便，可现场使用，检测过程/结果直接可视，可进行高速、高灵敏、多元且实时定量的核酸检测。

2.手持式POCT流式基因分析系统操作简便，只需将含荧光染料的预混样品置于进样口，系统即可完成后续的精确取样、连续流动核酸定量扩增和空间融解曲线分析，可应用于现场化的超便携的即时核酸高速扩增、实时定量和多重基因分型，操作方便。

3.系统中的热梯度微反应器结构简单；解链温度区间、退火/延伸温度区间和延伸-解链线性热梯度区间的大小、位置均可灵活调整；能快速对微通道内的反应液进行扩增，为后续荧光成像分析做准备。

4.系统中的智能手机宽场荧光成像器结构简单、无额外镜头、成本低、体积小巧、可应用于便携式设备、检测结果直观可视、充分利用智能手机。

5.系统中的微流体驱动器结构简单，操作方便，实现微流体精准定量进样与连续平稳驱动。

6.系统采用电子控制系统，仅需将样品放置在进样口，即可实现自动化操作。

附图说明

图1是热梯度微反应器的拆分图。

图2是发热基底的立体图。

图3是发热基底的功能分区图。

图4是智能手机宽场荧光成像器的拆分图。

图5是智能手机宽场荧光成像器的主视图。

图6是微流体驱动器的立体图。

图7是电子控制系统的控制原理图。

图8是手持式POCT流式基因分析系统的立体图。

图9是10⁶拷贝/微升的单增李斯特菌基因组DNA在手持式POCT流式基因分析系统上扩增过程的典型荧光图像。

图10是图9所示荧光图像对应的扩增曲线。

图11是10⁵拷贝/微升的沙门菌基因组DNA、金葡萄球菌基因组DNA和单增李斯特菌基因组DNA在手持式POCT流式基因分析系统上串行扩增的荧光图像。

图12是图11所示荧光图像对应的融解曲线。

其中，1为热梯度微反应器，2为智能手机宽场荧光成像器，3为微流体驱动器、4为电子控制系统，5为充电电池组，6为含绝热底板的避光外壳。

1-1为发热基底，1-2为微通道，1-3为加热元件，1-4为温度传感器，1-5为散热片，1-6为微型涡轮风扇，1-1-1为插孔，1-1-2为圆形通孔，1-1-3为断开部分，1-1-4为凸出块，1-1-5为U形沟槽，1-1-6为圆柱区，1-1-7为扁平区，1-1-8为荧光检测区，1-2-1为进样口，1-2-2为出口。

2-1为智能手机，2-2为显示屏，2-3为摄像头，2-4为发射滤片，2-5为二向色性滤光片，2-6为激发滤片，2-7为LED灯，2-8为聚光透镜，2-9为光阑，2-10为LED灯散热底座，2-11为安装暗盒。

3-1为注射器，3-2为减速步进电机，3-3为联轴器，3-4为支架台，3-5为基座，3-6为滑块，3-7为滚珠法兰，3-8为丝杆，3-9为滑杆。

4-1为温度控制单元，4-2为步进电机驱动单元，4-3为LED驱动单元，4-4为电位调速器，4-5为电源管理单元。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式来对本发明做进一步详细的说明。

手持式POCT流式基因分析系统，用于现场化的高速核酸扩增、实时定量和产物融解分析等，其主要由热梯度微反应器、智能手机宽场荧光成像器、微流体驱动器、电子控制系统和充电电池组所组成。

一、热梯度微反应器的结构为：

热梯度微反应器，是应如下需求而设计制造的：(1)通过维持单个加热元件保持一定温度来产生PCR热循环所需的必要各个温度区并同时形成用于空间融解曲线分析的线性温度梯度区间，实现功能的高度集成；(2)消除以往采用独立恒温区设计中各温区之间热绝缘的需求，实现整体热结构的紧凑化和微型化；(3)减少PCR热循环过程中的能源消耗，简化温度控制，以及降低仪器成本。

热梯度微反应器主要包括：发热基底、微通道、加热元件、温度传感器、凸出块、散热片和微型涡轮风扇组成。

发热基底是由导热系数适中并易于加工成型的黄铜材料制作，外部基本尺寸为35mm×10mm×45mm。发热基底包括图1所示的位于左侧的实心柱体段和位于右侧的空心柱体段；空心柱体段的横截面为卧倒的、开口朝向实心柱体段的U形，实心柱体段与U形开口的一端相接且与U形开口的另一端断开；实心柱体段与空心柱体段相连接的部位位于发热基底的上端，实心柱体段与空心柱体段相断开的部位位于发热基底的下端，实心柱体段的左端表面为半圆柱面，空心柱体段的右端表面也为半圆柱面，两半圆柱面的半径相同。实心柱体段的长度大于空心柱体段的长度；实心柱体段的前端与空心柱体段的前端对齐，实心柱体段的后端凸出于空心柱体段的后端。实心柱体段内开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的圆形通孔，直径为4mm，该圆形通孔与半圆柱面同轴。圆形通孔旁的实心柱体段内还开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的插孔，直径为0.5mm，深度为6mm。发热基底的外表面设有呈螺线管式分布的U形沟槽，螺线管的轴线沿着前后方向设置，U形沟槽的尺寸为0.6mm(宽)×0.6mm(深)，沿发热基底的圆柱区后端按顺时针方向螺线型延伸发热基底前端。发热基底的断开部分的间距为6mm。

发热基底的空心柱体段的下端固定一凸出块，该凸出块为立方体形，凸出块的上端紧贴空心柱体段，下端紧贴并安装在紫铜散热片上。凸出块的尺寸为12mm×42mm，高度为3mm。

微通道为透明聚四氟乙烯(PTFE)毛细管，微通道呈螺线管式缠绕包埋于上述U型沟槽内，其尺寸为内径0.3mm，外径0.5mm，总长为3.5m，其中在圆柱区的圈数为3圈，用作PCR预变性区，在扁平区的圈数为42圈用作PCR扩增区。微通道位于后端的一端为进样口。

加热元件为6.8Ω电加热棒，安装在圆形通孔内；温度传感器为K型热电偶，安装在插孔内。

散热片和微型涡轮风扇共同组成散热装置，微型涡轮风扇的出风口朝向散热片，控制微型涡轮风扇的输出功率，即可控制散热片对发热基底的散热量，进而控制散热基底的温度。

二、智能手机宽场荧光成像器的结构为：

智能手机宽场荧光成像器是应如下需求而设计制造的：(1)通过单个高亮LED灯在特定激发面上形成光强足够强、照射面积足够大、光强分布足够均匀的激发光斑，避免分立多个LED组合激发光源(如环形LED阵列光源)而导致的因LED位置、发光效率以及工作状态等差异造成激发光斑光强分布的不均匀与不可控；(2)采用激发发射同轴光路设计，避免斜射等而引起激发光斑的光场分布不均以及必需的矫正消除处理；(3)利用智能手机内建高度集成的图像传感器、摄像头、显示屏以及其他必要的计算、存储、传输单元，消除了目前普遍采用的荧光宽场成像方案对CCD、显微镜或微距镜头、计算机等分立大型设备的需求。

智能手机宽场荧光成像器主要包括：智能手机、显示屏、摄像头、发射滤片、二向色性滤光片、激发滤片、LED灯、聚光透镜、光阑、LED灯散热底座、安装暗盒。

显示屏和摄像头为智能手机的内建功能单元。本实施例中的智能手机为小米手机(型号Mione，北京小米科技有限责任公司)，其摄像头的参数为：8百万像素、光圈数为f/2.4。本实施例中的发射滤片、二向色性滤光片、激发滤片等为商业化荧光滤片组(型号AF002，沈阳汇博光学技术有限公司)。本实施例中的LED灯为高亮蓝光LED面光源(型号XRE-B4，美国科锐)，发射中心波长为475nm。本实施例中的聚光透镜型号为45°CREE专配透镜，光阑通孔为25mm×42mm。。

如图5所示，智能手机的摄像头、发射滤片、二向色性滤光片、光阑从上往下依次设置；其中发射滤片、光阑相互平行，且均与二向色性滤光片成45度角；二向色性滤光片从右上方向左下方倾斜，荧光激发光源位于二向色性滤光片的右侧，即二向色性滤光片的右方依次是：激发滤片、聚光透镜、LED灯，LED灯散热底座。荧光激发光源的出射光与二向色性滤光片成45度角。智能手机的摄像头朝下，显示屏朝上。发射滤片、二向色性滤光片、激发滤片、聚光透镜均设置在安装暗盒内，摄像头位于安装暗盒的上方，光阑位于安装暗盒的下方，LED灯和LED灯散热底座位于安装暗盒的右方。安装暗盒的内壁设有遮光涂层。光阑上设有若干特定形状的通孔，有效检测区的位置、面积、形状通过安装在其近表面的光阑来调节，以适应不同的检测需求。

高亮LED灯发出的光线经过聚光透镜的收集射向激发滤片，滤成能够激发荧光的特定波长的光线，该光线经过与激发滤片成45度角的二向色性滤光片的反射后形成与从入射方向垂直的反射光线，该反射光线穿过特定形状通孔的光阑后，照射到热梯度微反应器的荧光检测区，以激发该区域内的微通道中荧光染料发射荧光，发射的荧光依次通过光阑、二向色性滤光镜，并经过发射滤片过滤后被摄像头接收，产生对应的荧光图像。摄像头连续拍照记录荧光检测区的荧光图像，并将采集到的图像信息实时显示在显示屏，或通过智能手机内建的无线传输功能模块(如WiFi、3G或4G数据网络、蓝牙等)将图像信息传送到安装有图像分析软件的服务器上进行快速分析处理，或存储在智能手机内部的存储单元中并通过USB数据线传送到上述服务器上处理，上述处理的效果为直接分析判读或生成扩增曲线与融解曲线。

三、微流体驱动器的结构为：

微流体驱动器是应如下需求而设计制造的：(1)提供精确取液和持续微量流体驱动；(2)低功耗、结构轻便紧凑、操作方便；(3)工作流程可编程设计，灵活可调以适应不同应用要求。

微流体驱动器主要包括：注射器、减速步进电机、联轴器、丝杆滑块机构(含支架台、基座、滑块、滚珠法兰、丝杆、滑杆)。本实施例中的注射器为一次性1毫升规格的聚丙烯注射器，包括针筒和推杆，推杆尾部的推块带动推杆和活塞在针筒中平动。减速步进电机的参数为：5V，20Ω，步进角0.18度，减速比为1:100。丝杆的长度为9cm，直径3mm，螺距0.5mm。支架台的整体尺寸为105mm×15mm。注射器的针筒固定在基座上，注射器的推杆卡在滑块的卡槽中。支架台上设有两端用无油轴承安装的丝杆和位于丝杆左右两侧与丝杆平行的用于导向的滑杆，滑块内设有与丝杆配套的滚珠法兰，减速步进电机的输出轴通过联轴器与螺纹丝杆相连接，丝杆转动时带动滑块线性运动，从而驱动注射器的推杆直线运动，完成注射器的抽吸动作。

四、电子控制系统的结构为：

电子控制系统是应如下需求而设计制造的：(1)具备稳健的温度控制与调节功能，以适应一定环境温度范围内热梯度微反应器的恒温需求；(2)具备可编程化的流体控制功能，以满足不同流体操作流程的自动控制需求；(3)具备自适应恒压/恒流与功率调节功能，以满足LED灯长时间稳定输出以及输出光强可调的需求；(4)保障充电电池组在满电至电力耗尽前其输出稳定电压和为工作在不同电压下的各功能模块提供适合的电压；(5)整个电子控制系统集约紧凑、体积小、功耗低。

电子控制系统主要包括：温度控制单元、LED驱动单元、步进电机驱动单元、电位调速器、电源管理单元，并由充电电池组提供系统工作电源。本实施例中模糊PID温度控制单元采用XMTG-6311工业温控器核心电路，K型热电偶将电加热棒的温度实时反馈给温度控制单元，温度控制单元根据K型热电偶反馈的温度与设定温度之间的差值情况来决定电加热棒的工作状态，最终促使电加热棒实际温度达到并维持设定温度值上。LED驱动单元为基于LM2596芯片和TI的运放控制芯片的恒压恒流集成电路。步进电机驱动单元为基于STC51F204EA单片机和L293d芯片的集成电路。充电电池组为锂电池组，额定输出电压为12V，总容量为4400mAh。

手持式POCT流式基因分析系统的具体组成方式如下：

热梯度微反应器以散热片和微型涡轮风扇所在的底面为安装面安装于绝热底板上，微型涡轮风扇所在的位置对应的绝热底板上开有通风格栅，散热片的左侧出风口所在的位置对应的避光外壳上开有散热口。在图8所示的视角下，热梯度微反应器的前端安装有微流体驱动器，微流体驱动器的注射器出口与微通道的前端的出口连接。热梯度微反应器的荧光检测区的正上方安装有智能手机宽场荧光成像器，荧光检测区所在的平面与智能手机宽场荧光成像器的底面距离为5cm。与热梯度微反应器的散热片的右侧(即出风口方向反方向)依次安装有电子控制系统和充电电池组，电子控制系统和充电电池组均固定于绝热底板上且与热梯度微反应器和微流体驱动器以印刷电路板进行物理隔离(此处主要是隔热)。热梯度微反应器的荧光检测区与智能手机宽场荧光成像器之间的光路均进行密闭避光处理(即采用遮光卡片挡光)。

在使用手持式POCT流式基因分析系统进行检测时，首先由键盘输入设定的温度值、微流体流速后，电子控制系统中的温度控制单元开启热梯度微反应器中的加热元件和微型涡轮风扇，由温度传感器监控实时温度并反馈给温度控制单元，并由LED显示；待稳定达到设定温度值后，微流体驱动器中的减速步进电机按预先设定程序实现精确取样；同时，开启智能手机宽场荧光成像器，当微流体流至荧光检测区时，智能手机宽场荧光成像器的摄像头进行荧光图像的实时采集，获得的荧光图像显示在智能手机的显示屏进行直接判读分析，或使用USB数据线或者无线网络传输至计算机，计算机通过图像分析软件对图像上的像素点进行分析，产生相应的扩增曲线与融解曲线。

本实施例中，加热元件的设定温度值为94℃，微型涡轮风扇的工作电压设置为3.5V，微流体的驱动线性流速为4mm/s,摄像头的光圈数为f/2.4，焦距为4mm，使用的采集频率为0.1Hz，使用的感光度ISO为1600。

本实施例中的样品为单增李斯特菌基因组DNA、沙门氏菌基因组DNA和金葡萄球菌基因组DNA，PCR反应体系包括1×PCR缓冲液，200μM dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)，0.04ng/μL BSA(小牛血清蛋白)，200nM引物对，1×EvaGreen^TM荧光染料，0.2unit//μL Taq聚合酶，反应体积为10μL。其中，单增李斯特菌DNA对应的引物对:上游引物5’-3’CAAGT CCTAA GACGCCAATC,下游引物5’-3’CAAGTCCTAAGACGCCAATC；金葡萄球菌DNA对应的引物对:上游引物5’-3’GGTCCTGAAGCAAGTGCATT,下游引物5’-3’ATACG CTAAG CCACG TCCAT；沙门氏菌DNA对应的引物对:上游引物5’-3’TGCTCAGACATGCCACAGT，下游引物5’-3’TGCTC GTAAT TCACC ACCATTG。

本实施例中计算机使用的图像分析软件为现有的ImageJ，生成扩增曲线和融解曲线的过程如下。

扩增曲线：(1)将采集到的扩增过程中的原始荧光图像按时间顺序对齐成一幅组合图像，同时使每一幅原始图像上的荧光通道都在组合图像上显示出来，如图9所示；(2)分离组合图像的RGB通道，仅保留荧光信息所在的绿色通道；(3)提取该绿色通道图像上垂直于荧光通道方向的宽度为100像素点的灰度值并绘制其灰度曲线；(4)使用浮动坐标提取每一条荧光通道上的最高灰度值I_max和其两侧相邻荧光通道之间区域的最低灰度值I_min，每一条荧光通道上的I_max减去其对应I_min的平均值得到该荧光通道的灰度值I；(5)以荧光通道数为横坐标，以荧光通道的灰度值为纵坐标，并通过一阶Savitzky-Golay平滑窗口平滑数据点后得到扩增曲线，如图10所示；(6)扩增曲线对应的阈值循环数C_t值通过二阶求导法产生。

融解曲线：(1)选择需要分析的荧光图像，如图11所示，分离其图像的RGB通道，仅保留荧光信息所在的绿色通道；(2)去除图像的背景灰度，提取该绿色通道图像上覆盖荧光通道方向的宽度为10像素点的灰度值并绘制其灰度曲线；(3)以像素点为横坐标，以荧光通道的灰度值为纵坐标，并通过一阶Savitzky-Golay平滑窗口平滑数据点后得到基于像素点的融解曲线；(4)根据空间温度分辨率(℃/pixel)将像素点转换为温度点T’，并根据微型涡轮风扇的工作电压得出对应融解起始点的温度T₀(涡轮风扇的工作电压与融解起始点温度的对应关系可以通过预先测得空间温度分布表查得)，通过T₀+T’得到每一个像素点对应的实际温度点，从而得到基于温度的融解曲线，如图12所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.手持式POCT流式基因分析系统，其特征在于：包括：

-用于样品扩增且在上表面形成荧光检测区的热梯度微反应器，

-用于激发样品产生荧光并记录荧光图像的智能手机宽场荧光成像器，

-用于将样品定量抽取至热梯度微反应器的微流体驱动器，

-电源组件，

-与热梯度微反应器、智能手机宽场荧光成像器、微流体驱动器、电源组件分别相接的电子控制系统，

-含绝热底板的避光外壳；

热梯度微反应器、微流体驱动器、电源组件、电子控制系统均安装在绝热底板上，智能手机宽场荧光成像器位于热梯度微反应器的正上方。

2.按照权利要求1所述的手持式POCT流式基因分析系统，其特征在于：所述热梯度微反应器、电子控制系统、电源组件从左往右依次设置，微流体驱动器位于热梯度微反应器的前方。

3.按照权利要求2所述的手持式POCT流式基因分析系统，其特征在于：所述热梯度微反应器包括：发热基底、微通道、加热元件、温度传感器和供发热基底散热的散热装置；

发热基底包括：位于左侧的实心柱体段和位于右侧的空心柱体段；空心柱体段的横截面为开口朝向实心柱体段的U形，实心柱体段与位于上方的U形开口的一端相接且与位于下方的U形开口的另一端断开；

微通道呈螺线管式缠绕在发热基底外，螺线管的轴线、发热基底的长度方向均沿着前后方向设置；

加热元件和温度传感器安装在实心柱体段内。

4.按照权利要求3所述的手持式POCT流式基因分析系统，其特征在于：所述实心柱体段的左端表面为半圆柱面，空心柱体段的右端表面也为半圆柱面，两半圆柱面的半径相同；发热基底的外表面设有呈螺线管式分布的U形沟槽，微通道嵌入U形沟槽中；实心柱体段的长度大于空心柱体段的长度；实心柱体段的前端与空心柱体段的前端对齐，实心柱体段的后端凸出于空心柱体段的后端；实心柱体段内开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的圆形通孔，实心柱体段内还开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的插孔；

加热元件为电加热棒，安装在圆形通孔内；温度传感器安装在插孔内；

散热装置包括：散热片和朝向散热片吹风的微型涡轮风扇；

空心柱体段的下端具有一个凸出块，凸出块安装在散热片上，散热片和微型涡轮风扇均安装在绝热底板上。

5.按照权利要求2所述的手持式POCT流式基因分析系统，其特征在于：所述智能手机宽场荧光成像器包括：

-带有摄像头的智能手机，

-沿着水平方向发出可激发荧光的出射光的荧光激发光源，

-使得荧光激发光源的出射光垂直向下转向并且使得被激发的荧光沿荧光的原传播方向穿过的二向色性滤光片，

-光阑，

-发射滤片；

摄像头、发射滤片、二向色性滤光片、光阑、荧光检测区从上往下依次设置；发射滤片、光阑相互平行，且均与二向色性滤光片成45度角；荧光激发光源的出射光与二向色性滤光片成45度角；荧光激发光源位于二向色性滤光片的右侧。

6.按照权利要求5所述的手持式POCT流式基因分析系统，其特征在于：所述荧光激发光源包括：从左往右依次设置的激发滤片、聚光透镜、LED灯；LED灯的右端接有LED灯散热底座；摄像头位于智能手机的背面，智能手机的正面设有显示摄像头拍摄的荧光图像的显示屏。

7.按照权利要求2所述的手持式POCT流式基因分析系统，其特征在于：所述微流体驱动器包括：注射器、丝杆滑块机构、减速步进电机；减速步进电机通过丝杆滑块机构驱动丝杆滑块机构中的滑块平移；注射器的针筒与绝热底板相对固定，注射器的推块与滑块相接并由滑块带动平移。

8.按照权利要求2所述的手持式POCT流式基因分析系统，其特征在于：所述电子控制系统集成在一块印刷电路板上，印刷电路板立起固定在绝热底板上。

9.按照权利要求8所述的手持式POCT流式基因分析系统，其特征在于：所述电源组件为充电电池组，充电电池组固定在绝热底板上。

10.按照权利要求4所述的手持式POCT流式基因分析系统，其特征在于：所述避光外壳将热梯度微反应器、微流体驱动器、电源组件、电子控制系统全部包裹，避光外壳将智能手机宽场荧光成像器部分包裹，智能手机宽场荧光成像器中智能手机的显示屏露出避光外壳外；

绝热底板上对应微型涡轮风扇的位置开有通风栅格，避光外壳对应散热片的出风口位置开有散热口。