KR101358078B1

KR101358078B1 - 근위축성 측삭 경화증의 신경퇴행을 감소시키기 위한 방법및 조성물

Info

Publication number: KR101358078B1
Application number: KR1020077012360A
Authority: KR
Inventors: 유서홍
Original assignee: 주식회사 유스팜인터내셔널
Priority date: 2004-11-01
Filing date: 2005-10-31
Publication date: 2014-02-06
Also published as: DE602005025391D1; WO2006050165A2; IL182805A0; EP1814558B1; US20060142241A1; WO2006050165A3; ATE491456T1; EP1814558A2; AU2005302452B2; CA2585471A1; EP2255812A1; JP2008518935A; IL182805A; AU2005302452A1; KR20070089926A

Abstract

본 발명은 1종 이상의 담즙산과, 수가용성 전분 전화물 또는 비전분 다당류로 이루어진 투명한 수용액에 관한 것이다. 본 발명의 수용액은 신경퇴행성 질환 및/또는 운동 뉴런 질환을 가진 대상에서 치료적 효과를 지닌 약제학적 화합물과 함께 대상에게 투여될 수 있다. 일부의 실시형태에 있어서, 상기 질환은 근위축성 측삭 경화증이다.

담즙산, 수가용성 전분 전화물, 수가용성 비전분 다당류, 근위축성 측삭 경화증

Description

근위축성 측삭 경화증의 신경퇴행을 감소시키기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR REDUCING NEURODEGENERATION IN AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS}

본 발명은 신경퇴행 과정 또는 질환의 적어도 하나의 증상을 개선 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

어느 때라도, 30,000명의 많은 미국인들이 거의 항상 치명적인 근위축성 측삭 경화증(ALS: Amyotrophic Lateral Sclerosis)을 앓고 있다. 루게릭병으로도 알려진 ALS는 뇌 및 척수에서의 운동 뉴런(motor neuron)들을 공격해서 근 무력 및 위축증을 초래하는 진행성 신경퇴행성 질환이다. 초기의 증상은 보행 및 기민성의 상실을 포함한다. 이 질환이 진행함에 따라, 환자는 마비되어, 호흡의 보조를 필요로 한다. ALS 환자의 기대 수명은 진단 후 사망의 원인인 호흡기능의 상실을 초래하기까지 통상 3 내지 5년이다.

ALS 병인은 단지 부분적으로 이해된다. 가족성(유전적)인 경우는 전체 ALS 환자의 약 5 내지 10%에 불과하다. 이 서브세트(subset)의 ALS 환자 내에서, 5명 중 1명은 오늘날까지 확인된 유일한 유전적 결합인 SOD1 유전자의 돌연변이를 갖고 있다. 그 돌연변이 대립형질은 운동 뉴런에 독성인 것으로 여겨지는 단백질의 생 산을 초래한다. 대부분의 경우, 즉 나머지 90 내지 95%는 확인할 수 있는 패턴 없이 자연발증인 것처럼 일어난다. 따라서, ALS는 언제든지 누구에게나 발병가능성이 있는 것으로 보인다. 효과적인 치료는 드물거나 실존하지 않는다.

발명의 개요

따라서, 국한되지는 않지만 ALS를 포함하는 신경퇴행 과정 또는 질환의 진행을 개선하거나 제거하는 데 유용한 방법 및 조성물이 필요하게 되었다.

본 발명은 신경퇴행 과정 또는 질환의 적어도 하나의 증상을 개선 또는 치료하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 일부의 실시형태에 있어서, 본 발명은 신경퇴행 과정 또는 질환의 진행을 개선하거나 제거하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 담즙산의 투명하고 안정한 용액은 진행성 신경퇴행 장애를 가진 대상에게 투여될 수 있다. 일부의 실시형태에 의하면, 담즙산 용액은 다른 약제(예를 들어, 릴루졸(riluzole))를 더 포함할 수 있다. 일부의 실시형태에 있어서, 본 발명의 담즙산 용액은 근위축성 측삭 경화증을 가진 대상에게 투여될 수 있다. 일부의 실시형태에 의하면, 릴루졸과 담즙산의 병용 투여는 어느 한쪽 약제만 단독으로 투여하는 것보다 놀라운 개선된 결과를 가져올 수 있다. 일부의 실시형태에 있어서, 본 발명의 담즙 조성물과 릴루졸의 병용 투여는 일부의 실시형태에 있어서 릴루졸 독성이나 부작용을 경감시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 (1) 담즙산, 담즙산 유도체, 담즙산 염, 또는 아민과의 담즙산 컨쥬게이트, (2) 물 및 (3) 담즙산과 전분 전화물이 선택된 pH 범위 내의 어떠한 pH에서도 용액 상태로 되도록 충분량의 수가용성 전분 전화물을 포함할 수 있다.

또, 본 발명은 (1) 담즙산, 담즙산 유도체, 담즙산 염, 또는 아민과의 담즙산 컨쥬게이트, (2) 물 및 (3) 담즙산과 다당류가 선택된 pH 범위 내의 어떠한 pH에서도 용액 상태로 되도록 충분량의 수가용성 비전분 다당류를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (1) 담즙산, 담즙산 유도체, 담즙산 염, 또는 아민과의 담즙산 컨쥬게이트, (2) 물, (3) 약제학적 적정량의 약제학적 화합물 및 (4) 담즙산, 약제학적 화합물 및 탄수화물이 선택된 pH 범위 내의 어떠한 pH 레벨에서도 용액 상태로 되도록 충분량의 수가용성 전분 전화물 또는 수가용성 비전분 다당류를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부의 비제한적인 실시형태에 의하면, 상기 약제학적 화합물은 신경퇴행성 질환을 가진 대상에게 투여할 경우 유익한 효과를 갖는 약물이면 어떠한 것이라도 된다. 본 발명의 하나의 비제한적인 실시형태에 의하면, 상기 약제학적 화합물은 릴루졸, 또는 릴루졸의 약제학적으로 활성인 혹은 활성가능한 대사산물, 프로드럭(pro-drug) 유도체 또는 유사물일 수 있다.

본 발명은 또한 담즙산 조성물의 용액 투약 형태(dosage form)에 관한 것이다. 이들 용액 투약 형태의 이점은 담즙산의 향상된 생체이용률 및 흡수성을 포함한다. 용액 투약 형태의 부가적인 이점은 약제학적 화합물의 향상된 생체이용률 및 흡수성을 포함한다.

본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, (1) 담즙산, 담즙산 유도체, 담즙산 염, 또는 아민과의 담즙산 컨쥬게이트, (2) 물 및 (3) 담즙산 성분과 탄수화물이 선택된 pH 범위 내의 어떠한 pH에서도 용액 상태로 되도록 충분량의 탄수화물을 포함하되, 상기 탄수화물은 수가용성 전분 전화물과 수가용성 비전분 다당류의 배합물인 조성물을 제공한다. 가용성 비전분 다당류와 고분자량 전분 전화물의 양쪽 모두를 함유하는 실시형태에 있어서, 각각의 양은, 상기 조성물에 함께 배합될 경우, 이들은 상기 담즙산 성분, 고분자량 전분 전화물, 가용성 비전분 다당류 및 만약 있다면 약제학적 화합물이 선택된 pH 범위 내의 어떠한 pH에서도 용액상태로 되도록 충분한 양이면 된다.

본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 약제에 대한 반응 강도 또는 효능을 증대시킬 수 있는 요법 조성물의 배합물이 제공된다. 더욱 구체적으로는, 신경퇴행 장애를 앓고 있는 대상에게 담즙산 및 릴루졸을 포함하는 본 발명의 조성물을 투여하는 것은, 이들 화합물의 어느 것을 단독으로 투여하는 것 이상의 부가적인 효과를 지닐 수 있다.

발명의 상세한 설명

성인 ALS 환자 중 약 85% 내지 90%는 당해 질환의 가족력(family history)을 갖지 않는다. 이 외관상 랜덤하거나 우연한 발병은 일부의 전문가가 이들 사례를 산발성 ALS(SALS)로서 취급하기에 이르렀다. 이에 대해서, ALS는 환자의 약 10% 내지 15% 정도가 상염색체 우성 질환 상태처럼 유전적일 수 있다. 이들 사례는 가족성 ALS(FALS)로서 확인되었다. FALS 사례의 약 1/5에 있어서, 돌연변이 유전자는 세포질 효소인 Cu/Zn 과산화물 디스무테이스-1(SOD)이다. Cu/Zn SOD 중 90개 이상의 돌연변이는 확인되어 있고 30개 부위에 걸쳐서 분포되어 있다. 이들 돌연변이는 유전자 산물의 정상 기능을 단순히 해치는 것에 반하는 FALS를 초래하는 새로운 역기능을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 인간 Cu/Zn SOD(A4V, G93A, G85R, G37R)를 과발현하는 트랜스제닉(transgenic) 마우스들에 의한 실험에 있어서, SOD1 활성의 상실과 질환의 발병 혹은 중증도 간에는 상관이 없었다.

SOD1 돌연변이를 가진 FALS 환자의 증상과 병상은 SALS를 가진 환자의 것과 밀접하게 유사하다. 돌연변이 SOD1을 발현하는 마우스들로부터 운동 뉴런에 있어서의 임상적 진행 및 병리학적 변형도 환자에서 발견되는 것과 현저하게 유사하며, 이것은 SALS 및 FALS의 신경퇴행의 기전이 공통의 성분을 공유할 수 있는 것을 시사한다. 미토콘드리아는 세포의 수명과 사망을 조절하는 많은 대사 및 세포자멸 경로에 있어서 중추적인 역할을 한다. 미토콘드리아는 또한 카스파제-의존 혹은 카스파제-독립 방식의 양쪽 모두에서 작용할 수 있는 세포자멸촉진인자(pro-apoptotic factor)의 방출에 의해 활성화될 수 있는 내인성 세포자멸 캐스케이드의 개시부위이다. 미토콘드리아 기능장애는 ALS의 발병기전에 직접 포함될 수 있다. 미토콘드리아 기능장애는 칼슘-매개 흥분독성의 소인으로 되어, 반응성 산소종의 발생을 증대시키고/시키거나, 내재적 세포자멸 경로에 입회시킴으로써 운동 뉴런 사멸을 초래한다.

미토콘드리아 기능장애는 개별의 미토콘드리아로부터 예를 들어 흥분성 시납스 하에 아마도 국소적인 칼슘 매개 독성에 반응하여 사이토크롬 c 등의 세포자멸촉진인자, 세포자멸 유도인자(AIF: apoptosis inducing factor) 및 endoG의 비연속적인 방출을 가져올 수 있다. 이 국소적인 독성은 예를 들어 수상 돌기 분지 혹은 축상 분지 등의 서브세포 구획부(subcellular compartment)들의 사멸을 유발할 수도 있었다. 이런 종류의 서브세포 구획 변성은 세포의 즉사를 유발하기에 불충분할 수 있었으나, 소정 기간에 걸쳐 세포체에 퍼질 수 있었다. 이 시나리에 따라, ALS에 있어서, 축삭은 원위 방향에서부터 근위방향으로 변성되고(역행사망성: dying back), 수상돌기는 최종 운동 뉴런 사멸 전에 위축되게 된다. 이 세포 사멸 기전은 뉴런이 복잡한 서브세포 분지를 갖기 때문에 뉴런 변성에 대해 특이할 수 있고, 이것은 다른 세포 형태에서의 전형적인 세포 사멸 기전에 비해서 비교적 느리게 진행될 수 있다. 그 결과, 질환의 과정에 있어서 임의의 주어진 시간에, 단지 소수의 세포만이 실제로 세포자멸로 사망하는 것일 수 있다.

SOD1 돌연변이에 의한 운동 뉴런 변성은 세포 배양 및 트랜스제닉 마우스 모델들에서 연구될 수 있다. 시험관내(in vitro) 분석에 있어서, 만연된 진행성 운동 뉴런 사멸은 hSOD1(human Cu/Zn-superoxide dismutase gene)에 있어서 G93A(93번 위치에서 글리신→알라닌) 및 A4V(4번 위치에서 알라닌→발린) 등의 과오돌연변이에서 관찰될 수 있다. 예를 들어, 뉴런 분화 후 24시간째에 야생형, G93A 및 A4V hSOD1의 세포 생존율은 MTT 에세이 및 트리판 블루 염색을 모두 이용해서 평가되었다. 생존율은 시간 경과에 따라 상당히 감소되었다. 야생형 세포에 있어서, 생존율은 뉴런 분화후 48시간째에 상당히 감소하고(85.91 ± 9.08%)(P < 0.05), 72시간 후에는 59.41 ± 13.54%였다(P < 0.01). 뉴런 분화 후 24시간째에 생존율은 야생형 세포(100 + 6.97%)에 비해서 G93A(63.71 ± 6.25%) 및 A4V 세포(58.85 ± 7.83%)에서 훨씬 많이 감소되었다. 또한, 48시간째에, 생존율은 G93A 세포에서 23.12 ± 8.96%로, A4V 세포에서 20.79 ± 8.07%로 더욱 감소되었다(P < 0.01). 72시간째에는, 이들 돌연변이 세포는 생존율 약 0%로 거의 모두 사멸되었다. 이들 결과는 hSOD1에 있어서 G93A 또는 A4V 돌연변이가 운동 뉴런을 더욱 취약하게 하는 것을 시사한다. 이들 결과에 비추어, 본 발명에 따라 수행된 분석들은 이후의 시점에서 일어날 수 있는 실질적인 생존율 저하를 피하기 위해서 몇몇 실시형태에 있어서 약 24시간에 수행될 수 있다.

G93A 또는 A4V를 발현하는 트랜스제닉 마우스들은 정상 또는 정상 이상의 SOD 활성에도 불구하고 가혹한 운동 뉴런 변성 증후군을 발전시킨다. 이에 대해서, 이들 증상은 Cu/Zn SOD가 녹아웃(knocked out)되거나 과발현되는 마우스들에서는 일어날 수 없다.

산화질소(NO)는 중추신경계에서 생리적 및 병리적 과정에서 역할할 수 있고, 미토콘드리아는 뇌에서의 NO 독성의 주된 표적일 수 있다. NO는 초과산화물 음이온과 상호작용해서 반응성 과산화아질산염을 형성하고, 이것은 산화적 손상, 에너지 대사의 파괴, 칼슘 항상성 및 미토콘드리아 작용에 의해 세포 사멸을 초래할 수 있다. 이 독성은 NOS 억제제 및 산화질소 스캐벤저(scavenger), 즉, 과산화아질산염 및 하이드록실 라디칼 스캐벤저에 의해 방지될 수 있다.

S-니트로소글루타티온(GSNO)은 생리적 조건 하에서 서서히 자발적으로 NO를 방출할 수 있는 유용한 NO 도너일 수 있다. GSNO는 체내에서 NO용의 보존 및/또는 수송 비히클(transport vehicle)일 수 있다. GSNO의 대사 효소는 세균에서부터 인간까지 보존될 수 있다. 산화적 응력 동안 내피세포들 및 별아교세포(astroglial cell)들에서 발생될 수 있는 내인성 GSNO는 래트(rat)의 소뇌에 위치될 수 있다. 따라서, GSNO는 내인성 NO 저장소일 수 있고, 뇌에서 하나 이상의 역할을 할 수 있다. 흥미롭게도, 세포를 GSNO로 처리할 경우 현저한 세포자멸이 관찰될 수 있다.

FALS 변이(mutant) CuZnSOD 효소의 일부는 시험관내(in vitro) 야생형 단백질에 비해서 유의적으로 증가된 과산화 활성을 유발할 수 있다. 과산화물(O₂)과 산화질소(NO)의 산물인 과산화아질산염은 니트로늄 이온을 생성하는 변이 SOD의 Cu² ⁺와 반응해서 단백질의 니트로화에 이어서 신경 독성을 초래하고; ALS 환자의 운동 뉴런은 니트로티로신에 대한 증가된 면역반응력을 발휘한다. 증강된 과산화효소 활성은 하이드록실 라디칼의 생산을 증대시키며, 이것은 뉴런을 손상시킬 수 있다.

일부의 실시형태에 있어서, 본 발명의 담즙산 조성물은 UDCA의 기존의 시판의 투약 형태의 하나 이상의 단점이 없을 수 있다. 또한, 본 발명의 담즙산 조성물은 일부의 실시형태에 있어서 ALS 및/또는 진행성 ALS의 적어도 하나의 증상을 개선 및/또는 치료할 수 있다. 본 발명의 일부의 실시형태에 의하면 담즙산 투약 형태는 경구 및 비경구 투여에 적합하거나 쉽게 적응될 수 있다. 일부의 실시형태에 있어서, 본 발명의 담즙산 조성물은 수가용성 전분 전화물(예를 들어, 전분의 가수분해에 기인하는 산물) 및 UDCA의 순수 분자(intact molecule)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부의 실시형태에 의한 담즙산 조성물은 물속에 가용화될 수 있고, 임의의 pH에서 침전되는 일없이 수용액 상태일 수 있다.

일부의 실시형태에 있어서, 본 발명의 용액 중의 UDCA의 용해도는 상용화된 UDCA의 대략 3000배 이상일 수 있고(0.15 mol 대 0.05 mmol), TUDCA보다 300배 이상일 수 있다. 본 발명의 용액은 일부의 실시형태에 있어서 가용화된 UDCA를 혈액, 뇌, 위, 십이지장, 빈창자, 돌창자 및/또는 결장으로 전달할 수 있다. 일부의 실시형태에 있어서, 경구 및 비경구 투약 형태는 예를 들어 UDCA를 500 ㎎ 함유할 수 있고, 기존의 상용화 UDCA 형태보다 적어도 8배 이상 높은 Cmax와, 기존의 상용화 UDCA 형태보다 약 4 내지 6배 작은 Tmax를 가질 수 있다.

또한, 일부의 실시형태에 의하면, 본 발명의 담즙 조성물은 임의의 pH에서 어떠한 침전물도 함유하지 않을 수 있으며, 전신 약물로서 작용할 수 있다. 일부의 실시형태에 의하면, 용액은 1종 이상의 약제학적 화합물(예를 들어, ALS에 대해서 치료적 활성인 약제학적 화합물)과 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 담즙 조성물과 다른 약제학적 화합물의 투여는 일부의 실시형태에 있어서 (a) 약제학적 화합물에 대한 반응 강도의 증가, (b) 약제학적 화합물의 효능 증가, (c) 필요 용량의 약제학적 화합물의 감소 및/또는 (d) 약제학적 화합물의 독성 감소를 가져올 수 있다. 또한, 본 발명의 용액은 투여 경로 및 시간의 양쪽 모두의 관점에서 개별적으로 투여될 수도 있다.

본 발명의 용액은 일부의 실시형태에 있어서 ALS 질환 및/또는 진행성 ALS 질환을 치료하거나 개선하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 용액은

파시니아자이드(Pasiniazide)(항결핵제),

벤즈티아자이드(Benzthiazide)(이뇨제, 항고혈압제),

프레드니솔론(글루코코르티코이드), 멘톨 국소 진통제, (항가려움제),

멥히드롤린 나프탈렌설포네이트(Mebhydrolin Naphthalenesulfonate)(H1, 항히스타민제),

트리클로르메티아자이드(Trichlormethiazide)(이뇨제, 항고혈압제),

옥시테트라사이클린(항균제),

아카인 설페이트(Arcaine sulphate)(NOS 억제제, NMDA 억제제, 항원충제(anti-protozoal)),

에리트로마이신(항균제), 글루타티온(중금속중독, 항산화제),

트리옥살렌(Trioxsalen)(멜라닌화제, 건선 치료제),

닐리드린HCL(NylidrinHCL)(말초혈관 확장제),

데스메틸디아제팜(Desmethyldiazepam)(진정제, 소신경 안정제),

톤질아민 HCL(Thonzylamine HCL)(항히스타민제),

발프로에이트 Na(Valproate Na)(항경련제), 아미노페나존(해열진통제, 진통제),

설파메티졸(항균제), 드로페리돌(Droperidol)(신경이완제),

2-티오우라실 티로이드(억제제), 키누렌산(비타민 B 결핍증에 있어서의 영양소),

푸시딘산(Fusidic acid)(항균제),

류코보린 Ca(Leucovorin Ca)(항빈혈제, 엽산 길항제에 대한 해독제),

황산스파르테인(Sparteine sulfate)(분만촉진제),

아미그달린(Amygdalin)(항염증제, 실험적 항신생물제),

프라목신 HCL(Pramoxine HCL)(마취제; 국소),

퓨로세마이드(Furosemide)(이뇨제, 항고혈압제),

디니톨마이드(Dinitolmide)(항원충제), 부데소나이드(Budesonide)(항염증제),

플로프로피온(Flopropione)(진경제),

플루오로메톨론(Fluorometholone)(글루코코르티코이드, 항염증제),

N-포밀메티오닐페닐알라닌(N-Formylmethionylphenylalanine)(화학주성 펩타이드),

티오펜탈 Na(Thiopental Na)(마취제), 란소프라졸(Lansoprazole)(항궤양 작용제),

토실산 브레틸륨(Bretylium Tosylate)(노르에피네프린 방출 억제제),

세파만돌 Na(Cefamandole Na)(항균제), 옥시벤다졸(항기생충약),

사이클로류실글리신(Cycloleucylglycine)(마약 유발 도파민 R 감도 억제),

단트롤렌 Na(Dantrolene Na)(골격근육이완제), 테트로퀴논(각질용해제),

피페라진(항기생충제), 에스쿨린(Aesculin)(항염증제),

에티스테론(Ethisterone)(프로제스틴), 디메타디온(항경련제),

그리세오풀빈(항진균제, 중기 유사분열 억제, 중합 미세관 및 관련 단백질과의 상호작용),

아세타미노살롤(Acetaminosalol)(진통제, 해열진통제),

이소구바신 HCL(Isoguvacine HCL)(GABA 작용제),

푸트레신 DIHCL(Putrescine DIHCL)(오르니틴디카복실라제 억제제, 세포성장인자),

에메틴 HCL(Emetine HCL)(항아메바제, RNA, DNA 및 단백질 합성 억제),

설파닐아마이드(항균제), 미모신(Mimosine)(탈모제),

아세틸콜린(심장 억제제, 축동제, 말초혈관 확장제),

프랄리독심 메실레이트(Pralidoxime Mesylate)(콜린에스테라제 재활성제),

리실트립토파닐-리신(DNA에 대한 아세테이트 결합),

헤코게닌(Hecogenin)(스테로이드 전구체),

프레드니솔론 아세테이트(글루코코르티코이드), 알벤다졸(항기생충약),

하이드로클로로티아자이드(이뇨제), 데메클로사이클린 HCL(항균제),

니트로푸라존(Nitrofurazone)(국소 항감염제),

디클록사실린 Na(Dicloxacillin Na)(항균제), 알파-토코페롤(비타민 E 결핍),

테트라사이클린 HCL(항아메바제, 항균제, 항리케치아제),

페노파이브레이트(Fenofibrate)(항고지혈제),

프로베네시드(Probenecid)(요산배설촉진제), 트레티노인(Tretinoin)(각질용해제),

아세타미노펜(Acetaminophen)(진통제, 해열진통제),

히드라스티닌 HCL(Hydrastinine HCL)(강심제, 자궁항상제(uterine homeostatic)),

d[-Arg-2] 쿄토르핀 아세테이트(Kyotorphin acetate)(진통제),

NMDA(NMDA 작용제), 세프메타졸 Na(Cefmetazole Na)(항균제),

리바비린(항바이러스제), 0-벤질-L-세린(아미노산 유도체),

피크로톡신(자극제, 경련제, GABA R 길항제, 어독(ichthyotoxin)),

옥세타진(Oxethazine)(국소 마취제), 설파티아졸(항균제),

트리클로르메틴(항신생물제, 세포독성), 나부메톤(항염증제),

로람페니콜(항균제, 항리케치아제, 단백질합성 억제), 릴루졸,

인삼 및 그의 추출물, 글리시리진 및 글리시리진산, 카보퀴논의 유도체,

코엔자임 QlO, 크레아틴, 인슐린 유사 성장 인자-1, 미노사이클린, 메캄세린,

살리프로덴(xaliproden), 가바펜틴, 덱스트로메토르판, 탈람파넬(talampanel),

IL-I, TR-500, 프로시스테인, 뇌유도 신경영양성 인자, 바클로펜, 티자니딘,

벤조디아제핀류, 글리코피롤레이트, 아트로핀, 퀴닌, 페니토인 및 모르핀 등의 운동 뉴런 사멸을 감소시키는 약제학적 화합물을 포함할 수 있다..

래트에게 공급된 소수성 담즙염은 간에서 세포자멸을 유발시킬 수 있다. 또한, 우르소데옥시콜산(UDCA)의 병용투여는 생체내 간세포 세포자멸을 억제할 수 있다. 간세포 및 간외 세포 양쪽 모두에 있어서, 세포자멸은 소수성 산류, 에탄올, 전환성장인자-α, 작용성 Fas 항체 또는 오카다익산(okadaic acid) 등의 다양한 인자에 의해 유발될 수 있다. 놀랍게도, UDCA는 사립체막 교란, 박스 전위(Bax translocation) 및/또는 사이토크롬 c 방출을 조율함으로써 세포자멸을 감쇠시키고 세포보호를 발현할 수 있다.

우르소데옥시콜산(3α-7β-디하이드록시-5β-콜란산; UDCA)은 비독성 친수성 담즙산이고, 총 담즙산의 단지 약 3% 정도의 낮은 농도이지만, 통상 인간의 담즙에 존재한다. UDCA는 미국 FDA(Food and Drug Administration)에서 승인된 유일한 약물로, 다양한 담즙정체성 장애의 치료에 이용될 수 있다.

웅담의 주성분인 UDCA는 많은 유형의 간질환에 대한 치료 및 보호용의 약제학 제제로서 유용할 수 있다. 현재 그의 의약적 용도는 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 임신성 간내담즙울체, 낭성 섬유증 관련 간 질환, 다수의 소아 간 장애 및 간의 만성 이식편-대-숙주병(chronic graft-versus-host disease)인 다양한 담즙정체성 장애 및 방사선투과-담석의 용해를 포함한다.

UDCA의 약리 작용은 용량의존 방식에서의 UDCA를 통한 독성 담즙산의 교환 및/또는 치환, 용량의존 방식에서의 세포보호 작용, 용량의존 방식에서의 세포막의 안정화/보호, 용량의존 방식에서의 항세포자멸 효과, 용량의존 방식에서의 세포내 글루코코르티코이드 수용체의 활성화에 의한 면역조절 효과, NF-kB의 억제 및 산화질소합성효소의 유도저해에 의한 항염증효과, 용량의존 방식에서의 담즙 분비의 자극, 용량의존 방식에서의 세포외유출의 자극 및 세관막 전달체의 삽입을 포함할 수 있다.

UDCA는 실제적으로 pH 1 내지 8에서 불용성이다. 그의 양성자화 형태의 용해도는 약 0.05 mM이다. 그의 타우린 컨쥬게이트화 대사산물(TUDCA; 0.45mM)의 용해도는 UDCA 용해도보다 약 10배 높다. 게다가, TUDCA는 양자화된 경우 비교적 낮은 용해도를 가진 유일한 담즙산(BA)이다. 경구 투여후, UDCA의 대략 30 내지 60%는 비이온 수동 확산(nonionic passive diffusion)에 의해 빈창자 및 돌창자의 길이를 따라 흡수되고, 결정 UDCA의 불용성으로 인해 결장에서 작은 정도(섭취 용량의 20%)까지 능동 수송 기전에 의해 돌창자에 흡수되며, 이것은 그의 비이온화된 분자의 낮은 수용해도와 이온화된 담즙염 종들보다 더 큰 친지성으로 인해 매우 느리고 불완전한 용해를 초래하게 되며, 따라서, 생물학적 멤브레인 속으로 분배될 수 있게 된다.

UDCA는 일단 간세포에 의해 흡수되면, TUDCA 및 GUDCA와 컨쥬게이트될 수 있고, 이들 TUDCA 및 GUDCA는 인간에서 분비된 담즙산으로 간의 일차 통과 청소율(hepatic first-pass clearance)에 의해 담즙에서 배설되는 것이다. 따라서, 그의 혈액 레벨은 체순환에 있어서 매우 낮다. 담즙산은 광범위한 간의 재순환을 받거나, 또는 유리 UDCA도 간세포에 의해 담즙 중에 분비될 수 있고, 이것은 담관세포에 의해 활성적으로 유효하게 재흡수될 수 있다. UDCA 및 GUDCA는 능동 및 수동 수송 기전의 양쪽 모두에 의해 흡수되는 한편, 타우로-컨쥬게이트된 UDCA(TUDCA)는 말단의 돌창자에서 활성적으로 수송될 수 있다.

일부의 실시형태에 있어서, 10±12 ㎎/㎏/day 이상의 UDCA 용량은, 대량의 UDCA가 장 세균에 의해 7-케토-리토콜산을 통해 CDCA로 생체내 변환될 수 있으므로, 담즙 내에서 그의 비율을 더욱 증가시키지 않을 수 있다. 대안적으로는, UDCA는 7β-하이드록실기의 에피머화에 의해 CDCD로, 나아가서는 리토콜산(LCA)으로 변환될 수 있다. 따라서, UDCA의 용량 증가에 따라, UDCA의 흡수는 감소된다.

일부의 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물의 투여는 치료 효과를 갖도록 간, 체순환 및/또는 뇌에서 적절한 양의 UDCA를 얻을 수 있다. 본 발명의 용액은, 일부의 실시형태에 있어서 유의하게 UDCA의 수용해성의 증가, 막투과성의 증가 및 UDCA의 CDCA로의 에피머화의 방지 효과를 발휘할 수 있다.

ALS 환자에 대한 생존 시간 및 수명은 질병의 초기 단계 동안 수면 중에 부여되는 호흡 요법 및 질환이 진행하여 삼키기가 더욱 어렵게 됨에 따라 양호한 영향을 유지하는 대안적인 급식 방법에 의해 향상될 수 있다. 오늘날, ALS의 치료에 대해 미국 식약청에서 승인된 유일한 약물은 릴루졸이다. 그러나, 릴루졸을 공급받은 환자의 수명은 불과 수개월밖에 연장되지 않는다. 줄기세포 및 유전자 요법과 관련된 연구는 미개척 분야로 유망하지만, 치료하는 의사에게 이용가능한 선택권은 아직 증강되지 못하고 있다.

임의의 특정 작용 기전에 국한되는 일없이, 본 발명은 신경퇴행과정을 개선할 수 있는 가용성 담즙산의 투명하고 안정한 용액을 제공한다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 릴루졸을 포함한다. 이미 FDA 승인을 받은 ALS 치료용의 유일한 약물인 릴루졸은 신호전달 동안 방출된 글루타메이트의 양을 감소시킴으로써 작용할 수 있다. 릴루졸 효능은 본래 2회의 주로 제어된 임상 시험에서 입증되어 있었다. 약물의 가장 빈번한 유해 사례로는 욕지기, 구토, 식욕부진, 설사, 무력증, 기면증, 현기증, 구강 주위 감각이상, 복통 및 현기증이 있었다. 이들 중, 현기증, 설사, 욕지기, 구강 주위 감각이상 및 식욕부진은 고용량을 투여받은 환자에 있어서 더욱 빈번하게 나타난다. 증가된 혈청 아미노전이효소 레벨은 일반적으로 릴루졸 치료를 개시하는 3개월 내에 관찰될 수 있다. 그러나, 이들 레벨은 2 내지 6개월의 치료 후에 떨어진다. 혈청 아미노전이효소 레벨의 모니터링은 릴루졸 치료의 첫해 동안 권장된다.

담즙산은 세포내 시그널링제(signaling agent)로서 역할할 수 있어, 세포 수송을 조율해서, 세포내 Ca² ⁺ 레벨을 변화시켜서 세포 표면 수용체를 활성화시킨다. 우르소데옥시콜산(UDCA)은 간담즙성 장애의 치료에 있어서 입증된 임상 효능을 지닌 친수성 담즙산이다. UDCA는 생체내 글리신 또는 타우린과 신속하게 컨쥬게이트되어 글리코우르소데옥시콜산 및 타우로우르소데옥시콜산(TUDCA)을 각각 생산할 수 있다. UDCA와 그의 유도체 및 컨쥬게이트들은 세포자멸을 억제함으로써 세포보호제로서 작용할 수 있다.

글루타메이트 신경독성은 세포자멸을 통해서 세포 사멸을 초래할 수 있으므로, 세포자멸을 차단하는 것은 급성 및 만성 신경퇴행 과정을 늦출 수 있다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 담즙 조성물은 p53에 의해 매개된 독성 효과를 차단한다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 담즙 조성물은 산화 과정에 의해 매개된 독성 효과를 차단한다.

본 발명은 (i) 1종 이상의 가용성 담즙산, 수가용성 담즙산 유도체, 담즙산 염, 및 아민과 컨쥬게이트된 담즙산(총칭 "담즙산"), (ii) 물 및 (iii) 원하는 pH 범위 내의 임의의 pH에서 첨전물을 형성하지 않는 용액을 생성하는 데 충분한 양의 1종 이상의 수가용성 전분 전화물 또는 수가용성 비전분 다당류를 포함하는 수성 용액에 관한 것이다. 상기 조성물은 그 자체가 약제학적 효과를 가진 담즙산 또는 담즙산 염을 함유할 수 있다. 본 발명의 제형은 원하는 pH 범위에 걸쳐서 본 발명의 조성물에 용해상태로 있는 약제학적 재료의 전달을 위한 담체, 애주번트(adjuvant) 혹은 증강제(enhancer)로서 작용할 수 있다. 또는, 본 발명의 일부의 실시형태에 의하면, 상기 조성물은 불완전하게 가용성인 비-담즙산 약제를 포함할 수 있다.

일부의 실시형태에 있어서, 상기 담즙산과 상기 탄수화물은 산성으로부터 알칼리성까지의 임의의 pH에서 침전되는 일없이 용액상태인 것이 이점일 수 있다. 담즙산의 이들 수용액계는 침전물 혹은 입자를 실질적으로 함유하지 않는다. 본 발명의 추가의 이점은 50℃ 보존의 가속 조건하에서 수개월 관찰 후에도 수용액계가 강산 혹은 알칼리성의 첨가 후 투명도, 색상 혹은 냄새의 변화와 같은 물리적 외관의 변화가 없음을 입증하는 것이다.

본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 담즙산의 수용액계는 경구 투여되고, 그 후에, 장의 산성 위액 및 알칼리성 위액에 대한 노출에 의해 담즙산의 침전 없이 위장관을 통해 장에 도달한다. 이들 용해된 담즙산 제형은 장 내 고유의 용액계가 효과적으로 또한 완전히 흡수될 수 있고, 그 결과, 장간 순환될 수 있는 것을 입증한다. 본 발명의 실시형태에 의하면, 담즙산 용해도(예를 들어, 물리적 외관의 변화 및 침전)는 임의의 담즙산의 카복실산 측쇄가 프로톤화(비이온화)될 수 있는지, 이온화되어 있는지 혹은 단순한 카복실산인지의 여부에 의해 영향받는다.

담즙산 카복실산 측쇄의 이온화 상태는 일부의 수용액계에 있어서 담즙산의 소수성 및 친수성에 크게 영향을 줄 수 있다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 그 이온화 상태는 pH를 조정해서 담즙산의 독성, 흡수성 및 양친매성을 제어함으로써 조절된다. 1종 이상의 담즙산은 치료적 활성제로서, 약물의 애주번트로서, 약물의 담체로서 혹은 약물 용해도의 증강제로서 이들 수용액계에 용해될 수 있다. 이들 수용액계는 구강 소비용, 관장제, 구강세정제, 가글제(gargle), 비강제제, 귀 제제, 주사제, 세척제(douche), 국소 피부 제제, 기타 국소 제제 및 화장제제용으로 제조될 수 있고, 이들 제제는 장시간 후 물리적 외관의 열화나 침전이 생기는 단점 없이 원하는 pH를 지닌다.

가용성 담즙산은 수가용성 담즙산의 임의의 유형이다. 담즙산 염은 담즙산의 임의의 수가용성 염이다. 담즙 염은 인지질 및 콜레스테롤에 대한 커다란 가용화 능력을 발휘하고, 따라서, 양호한 세정제이다. 더욱 소수성의 담즙염은 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro) 양쪽 모두의 다양한 격막에 대해서 더욱 유해할 수 있다. 담즙산의 수성 용해 염은 상기 설명된 담즙산과 아민과의 반응에 의해 형성될 수 있고, 이때의 아민으로는 트리엔틴, 디에틸렌 트리아민, 테트라에틸렌 펜타민 등의 지방족 유리 아민류; 아르기닌, 리신, 오르니틴 등의 염기성 아미노산; 암모니아; D-글루카민, N-알킬글루카민 등의 아미노 당류; 콜린 등의 4차 암모늄 유도체; 피페라진, N-알킬피페라진, 피페리딘, N-알킬피페리딘, 모르폴린, N-알킬모르폴린, 피롤리딘 등의 복소환식 아민; 트리에탄올아민 및 트리메탄올아민 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 의하면, 담즙산의 수가용성 금속 염, 담즙산과 사이클로덱스트린 및 그의 유도체간의 포접 화합물 및 수가용성 O-설폰화 담즙산도 가용성 담즙산염으로서 포함될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시형태에 의한 가용성 담즙산 유도체는 대응하는 탈유도체화 담즙산보다 수용액 중 가용성이 동일하거나 그보다 큰 유도체일 수 있다. 담즙산 유도체는 할로겐 및 아미노기를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 기타 작용기를 지닌 담즙산의 하이드록실기 및 카복실산기에서 형성된 유도체를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 가용성 담즙산은 HCl, 인산, 구연산, 아세트산, 암모니아 또는 아르기닌 중의 하나와 배합되는 담즙산의 유리산 형태의 수성 제제를 포함할 수 있다.

본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있는 담즙산으로는 우르소데옥시콜산, 케노데옥시콜산, 콜산, 히오데옥시콜산, 데옥시콜산, 7-옥솔리토콜산, 리토콜산, 아이오도데옥시콜산, 이오콜산, 타우로우르소데옥시콜산, 타우로케노데옥시콜산, 타우로데옥시콜산, 타우로리토콜산, 글리코우르소데옥시콜산, 타우로콜산, 글리코콜산, 및 스테로이드 핵에 있는 하이드록실기 혹은 카복실산기에서의 그들의 유도체를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 하나의 이점은 용액 중의 담즙산의 전달이 기존의 시판 제제보다 더욱 높은 생체내 담즙산 레벨을 달성할 수 있는 점이다. 따라서, 담즙산의 치료상 잠재성은 기존의 제형보다 훨씬 충분히 달성될 수 있다. 담즙이 불완전하게 가용화되는 기존 제형에 의해 달성될 수 있는 담즙산의 생체내 레벨은 낮아지고, 다량의 담즙산의 투여를 필요로 한다. 담즙산이 본 발명의 제형에 완전히 용해되므로, 보다 낮은 용량이 투여된 경우에도 담즙산의 더욱 높은 생체내 레벨이 달성될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 복수의 담즙산은 단일 제형에서 사용될 수 있다. 소수성 활성이 다른 2종 이상의 담즙염의 혼합물은 중간의 소수성 활성의 단일 담즙염으로서 거동할 수 있다. 그 결과, 소수성 활성이 상이한 2종 이상의 담즙산의 혼합물의 세척성 및 독성은 개별 성분에 대한 것의 중간인 경우도 있다.

소수성 활성이 상이한 2종 이상의 담즙산의 혼합물은 중간의 소수성 활성의 단일 담즙염으로서 거동할 수 있다. 그 결과, 소수성 활성이 상이한 2종 이상의 담즙산의 혼합물의 세척성 및 독성은 개별 성분에 대한 것의 중간인 경우도 있다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 탄수화물은 수가용성 전분 전화물 및 수가용성 비전분 다당류를 포함한다. 본 발명의 일부의 실시형태에 의하면, 수가용성 전분 전화물은 각종 pH 조건하에서 전분의 부분 혹은 불완전 가수분해로부터 직접 얻어진 탄수화물을 포함한다. 비제한적인 예로는 말토덱스트린, 덱스트린, 액체 포도당, 콘 시럽 고형물(액체 포도당의 건조 분말) 및 가용성 전분(예를 들어 말토덱스트린 또는 콘 시럽 고형물)을 들 수 있다. 일부의 실시형태에 있어서, 콘 시럽 고형물인 MALTRIN^® M200 및 말토덱스트린인 MALTRIN^® M700을 사용할 수 있고, 이들은 모두 미국 아이오와주의 머스커틴에 소재한 Grain Processing Corporation사의 상품명 GPC^®로 제조된 것을 사용할 수 있다. 본 실시형태의 목적을 위해서, 용어 "콘 시럽"은 콘 시럽과 액체 포도당을 모두 포함할 수 있다. 전분 전화물이 중합체로 이루어진 경우, 이 중합체는 적어도 하나의 환원 단부와 적어도 하나의 비환원 단부를 지닐 수 있으며, 직쇄 혹은 분기쇄일 수 있다. 또, 분자량은 약 100 질량단위 내지 106 질량단위 이상일 수 있다. 고분자량의 수가용성 전분 전화물은 분자량 105 이상을 지닌 것이다.

본 발명의 일부의 실시형태에 의하면, 수가용성 비전분 다당류는 각종 가수분해 혹은 합성 기전에 의해 각종 pH 조건하에서 얻어질 수 있다. 비제한적인 예로는 덱스트란, 구아 고무, 펙틴, 난소화성의 가용성 섬유 등을 들 수 있다. 중합체로 이루어진 경우, 해당 중합체는 적어도 하나의 환원 단부와 적어도 하나의 비환원 단부를 지닌다. 상기 중합체는 직쇄 혹은 분기쇄일 수 있다. 분자량은 약 100 질량단위 내지 106 질량단위 이상일 수 있다. 바람직하게는 분자량은 105 질량단위 이상을 지닌다.

본 발명의 실시형태에서 사용되는 고분자량의 수가용성 전분 전화물 및/또는 가용성 비전분 다당류의 양은, 적어도 제제에 있어서 선택된 담즙산(들)에 원하는 농도 및 원하는 pH 범위에서 가용성을 부여하는 데 필요한 양이다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, UDCA 침전을 방지하는 데 필요한 UDCA에 대한 말토덱스트린의 대략 최소 중량비는 6:1(즉, 물 100 ㎖ 중, UDCA 0.2 g마다 1.2 g, UDCA 1 g마다 6 g 및 UDCA 2 g마다 12 g)일 수 있다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 말토덱스트린의 대략 최소량은 케노데옥시콜산 200 ㎎마다 30 g, 7-케토리토콜산 200 ㎎마다 12 g, 콜산 200 ㎎마다 10 g 및 데옥시콜산 200 ㎎마다 50 g일 수 있다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 본 발명의 수용액 투약 형태로부터 담즙산의 침전을 방지하는 데 필요한 UDCA에 대한 액체 포도당(시판의 저렴한 콘 시럽)의 대략 최소 중량비는 약 25:1(즉, 물 100 ㎖ 중 UDCA 500 ㎎마다 12.5 g 및 물 200 ㎖ 중 우르소데옥시콜산 1 g마다 25 g)일 수 있다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 본 발명의 수용액 투약 형태로부터 담즙산의 침전을 방지하는 데 필요한 액체 포도당(콘 시럽 고형물, 예를 들어 MALTRIN^® M200)의 건조 분말의 대략 최소량은 물 100 ㎖ 중 우르소데옥시콜산 1 g마다 30 g, 물 200 ㎖ 중 우르소데옥시콜산 2 g마다 대략 60 g이다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 본 발명의 수용액 투약 형태로부터 담즙산의 침전을 방지하는 데 필요한 가용성 비전분 다당류의 대략 최소량은 물 100 ㎖ 중 우르소데옥시콜산 500 ㎎마다 구아고무 50 g, 물 100 ㎖ 중 우르소데옥시콜산 500 ㎎마다 펙틴 8O g이다. 고분자량 수가용성 전분 전화물 또는 가용성 비전분 다당류의 최소 필요량은 주로 농도보다 오히려 용액 제제에서의 담즙산의 절대량에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 제형은 전분 전화물 및/또는 비전분 다당류 이외에도 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 일부의 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 사이클로덱스트린이 없을 수도 있다.

본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 상기 제형은 식이섬유를 더 포함한다. 식이섬유의 비제한적 예로는 구아 고무, 펙틴, 금불초(psyllium), 귀리 고무, 콩 섬유, 귀리겨, 옥수수피, 셀룰로오스 및 소맥겨를 들 수 있다.

본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 상기 제형은 유화제를 더 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "유화제"는 유화제 및 현탁제를 포함한다. 유화제의 비제한적인 예로는 구아 고무, 펙틴, 아카시아, 카라기난, 카복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 하이드록시메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 포비돈, 트래거캔스 고무, 산탄 검 및 소르비탄 에스테르를 들 수 있다.

제형이 그의 담즙산, 전분 전화물, 가용성 비전분 다당류 및/또는 그의 약제학적 화합물을 침전시키지 않을 선택된 pH 범위는 수계에서 얻어질 수 있는 임의의 범위의 pH 레벨일 수 있다. 바람직하게는, 이 범위는 약 pH 1 내지 약 pH 14 사이, 더욱 바람직하게는 약 pH 1 내지 약 pH 10 사이일 수 있다. 더욱더 바람직하게는, 이 범위는 투여 방법에 따라 약제학적 제형이 제제로부터 용액 상태로 유지되고, 체내에 투여되어 흡수되기에 충분한 수계에서 얻어질 수 있는 임의의 하위세트(subset)의 pH 레벨이다. 따라서, 상기 조성물은 약제학적 화합물이 구강, 위 및 장에서 우세한 pH 레벨에서 침전되는 일없이 용액 상태에 있는 약제학적 제형으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 담즙산은 산성 조건하에서 담즙산의 일반적인 불용성에도 불구하고 유리 담즙산으로서 산성 조건하에 용해된 채로 있게 된다.

본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 약제는 릴루졸이다. 기타 약제학적 화합물의 비제한적인 예로는 호르몬, 호르몬 길항제, 진통제, 해열제, 항염증 약물, 면역활성 약물, 항신생물성 약물, 항생물질, 항염증제, 교감신경흥분제, 항감염약, 항종양제 및 마취제를 포함한다. 추가의 비제한적인 예로는 위장관, 간, 심혈관계 및 호흡계통을 표적으로 하거나 영향을 미치는 약물을 포함한다. 약제학적 화합물의 추가의 비제한적인 예로는

인슐린, 헤파린, 칼시토닌, 암피실린, 옥트레오타이드, 실데나필 구연산염,

칼시트리올, 디하이드로타키스테롤, 암포모르핀, 요힘빈, 트라조돈,

아시클로비르, 아만타딘·HCl, 리만타딘·HCl, 시도포비르,

델라비르딘·메실레이트, 디다노신, 팜시클로비르,

포스카르넷 나트륨(foscarnet sodium), 플루오로우라실, 간시클로비르 나트륨,

이독수리딘, 인터페론-α, 라미부딘, 네비라핀, 펜시클로비르, 리바비린,

스타부딘, 트리플루리딘, 발라사이클로비르·HCl, 잘시타빈, 지도부딘,

인디나비르·H₂SO₄, 리토나비르, 넬피나비르·CH₃SO₃H, 사퀴나비르·CH₃SO₃H,

d-페니실라민, 클로로퀸, 하이드록시클로로퀸, 아우로티오글루코오스,

금 나트륨 티오말레이트, 아우라노핀 레바미솔, DTC, 이소프리노신,

메틸 이노신 모노포스페이트, 무라밀 디펩타이드, 디아족사이드,

하이드랄라진·HCl, 미녹시딜, 디피리다몰, 이속수프린(isoxsuprine)·HCl,

니아신, 닐리드린·HCl, 펜톨라민, 독사조신·CH₃S0₃H, 프라조신·HCl,

테라조신·HCl, 클로니딘·HCl, 니페디핀, 몰시도민, 아미오다론,

아세틸살리사이클산, 베라파밀, 딜티아젬, 니솔디핀, 이스라디핀, 베프리딜,

이소소르바이드·이질산염, 펜타에리트리톨·사질산염, 니트로글리세린,

시메티딘, 파모티딘, 니자티딘, 라니티딘, 란소프라졸, 오메프라졸,

미소프로스톨, 수크랄페이트, 메토클로프라미드·HCl, 에리트로마이신,

비스무트 화합물, 알프로스타딜, 알부테롤, 피르부테롤, 테르부탈린·H₂SO₄,

살메트롤, 아미노필린, 디필린, 에페드린, 에틸노르에피네프린, 이소에타린,

이소프로테레놀, 메타프로테레놀, n-도크로밀, 옥시트리필린, 테오필린,

비톨테롤, 페노테롤, 부데소나이드, 플루니솔리드,

베클로메타손·디프로피온산염, 플루티카손·프로피온산염, 코데인,

황산 코테인, 인산 코데인, 덱스트로메토르판·HBr,

트리암시놀론·아세토나이드, 몬테루카스트 나트륨,

자피르루카스트(zafirlukast), 질레우톤(zileuton), 크로몰린 나트륨,

이프라트로피움 브로마이드, 네도크로밀 나트륨 벤조에이트,

디펜히드라민·HCl, 하이드로코돈·이주석산염, 메타돈·HCl, 황산 모르핀,

아세틸시스테인, 구아이페네신, 탄산 암모늄, 염화 암모늄,

주석산 칼륨 안티몬, 글리세린, 테르핀·수화물, 팔미트산 콜포스세릴,

아토르바스타틴·칼슘, 세르바스타틴·나트륨, 플루바스타틴·나트륨,

로바스타틴, 프라바스타틴·나트륨, 심바스타틴,

피크로라지아 쿠르바(picrorrhazia kurrva), 안드로그라피스 파니쿨라타,

모린가 올레이페라, 알비찌아 레벡, 아드하타 바시카, 강황(curcuma longa),

여주(momordica charantia), 짐네마 실베스타(gymnema sylvestre),

터미나릴아 아르쥬나(terminalia arjuna), 아자디락타 인디카,

티노스포리아 코르디폴리아, 메트로니다졸, 암포테리신 B, 클로트리마졸,

플루코나졸, 할로프로긴, 케토코나졸, 그리세오풀빈, 이트라코나졸,

테르비나핀·HCl, 에코나졸·HNO₃, 미코나졸, 니스타틴, 옥시코나졸·HNO₃,

술코나졸·HN0₃, 세티리진·2HCl, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 프레드니솔론,

코르티손, 카테킨 및 그의 유도체, 글리시리진, 글리시리진산, 베타메타손,

루드로코르티손·아세트산염, 플루니솔리드, 플루티카손·프로피온산염,

메틸 프레드니솔론, 소마토스타틴, 리스프로, 글루카곤, 프로인슐린,

불용성 인슐린, 아카보스, 클로르프로파미드, 글리피자이드, 글리부라이드,

메트포르민·HCl, 레파글리나이드, 톨부타마이드, 아미노산, 콜히친,

설핀피라존, 알로푸리놀, 피록시캄, 톨메틴 나트륨, 인도메타신, 이부프로펜,

디플루니살, 메페남산, 나프록센 및 트리에틴을 들 수 있다.

상기 제형에 포함될 수 있는 약제학적 화합물의 추가 예로는 제형에 첨가될 경우 가용성이 유지되는 화합물이면 어떠한 것이라도 된다. 제형에 있어서의 추가의 약제학적 화합물과 함께, 용액 중의 담즙산은 산 및/또는 알칼리에서 가용안정적이며 필요한 경우 본 발명에 있어서의 담즙산의 소정 농도의 이들 수용액 투약 형태 내에 첨가될 수 있는 애주번트, 담체, 또는 임의의 치료적 활성제의 용해도 증강제로서 작용될 수 있고, 이들의 예로서는 인슐린(pH 7.4-7.8), 헤파린(pH 5-7.5), 칼시토닌, 암피실린, 아만타딘, 리만타딘, 실데나필, 네오마이신 황산염(pH 5-7.5), 아포모르핀, 요힘빈, 트라조돈, 리바비린, 파클리탁셀 및 그의 유도체, 레티놀 및 트레티노인 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또, 메트포르민 HCl(pH 5-7), 라니티딘 HCl, 시메티딘, 라미부딘, 세트리진 2HCl(pH 4-5), 아만타딘, 리만타딘, 실데나필, 아포모르핀, 요힘빈, 트라조돈, 리바비린 및 덱사메타손, 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 코르티손, 니아신, 타우린, 비타민, 자연산 아미노산, 카테킨 및 그의 유도체, 글리시리잘 추출물(glycyrrhizal extract), 및 글리시리진 및 글리시리진산 등의 그의 주성분, 그리고, 수가용성 비스무트 화합물(예를 들어, 비스무트 나트륨 주석산염(bismuth sodium tartrate)) 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 산 및/또는 알칼리에 가용성이고 안정한 임의의 치료적 활성제는 필요에 따라 본 발명의 우르소데옥시콜산을 함유하는 이들 수용액 투약 제형에 첨가될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시형태는 pH 조절제에 의해 실시될 수 있다. 비제한적인 예로는 HCl, H₃PO₄, H₂SO₄, HNO₃, CH₃COOH, 구연산, 말산, 주석산, 락트산, 인산염, 에이데트산(eidetic acid) 및 알칼리류를 포함한다.

본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 제형은 인간 및 포유동물 질환을 치료하는 데 이용될 수 있다. 본 발명은 ALS, ALS관련 장애 및 기타 신경퇴행 장애의 치료를 상정할 수 있다. 또, 본 발명의 용액은 위장장애, 간 질환, 담석 및 고지혈증을 치료하는 데 이용될 수 있다. 간질환의 비제한적인 예로는 알코올-유발 간질환과 비알코올-유발 간질환을 포함한다. 위장 장애의 비제한적인 예로는 만성 위염, 역류 위염 및 소화 궤양 질환을 포함한다. 비알코올-유발 간질환의 비제한적인 예로는 원발성 담즙성 간경변, 급성 및 만성 간염, 원발성 경화성 담관염, 만성 활동 간염 및 간에서의 지방 과다 축적을 포함한다. 본 발명은 또한 바이러스 질환, 세균성 질환 및 진균 질환의 치료를 상정할 수 있다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 제형은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염을 치료 및/또는 박멸하기 위해 투여된다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 제형은 C형 간염 바이러스 감염, A형 인플루엔자, C형 인플루엔자, 제1형 파라인플루엔자, 센다이(sendai), 풍진 및 슈도레이비스 바이러스(pseudorabies virus)를 치료 및/또는 박멸하기 위해 투여된다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 제형은 급성 혹은 만성 염증성 질환을 치료하기 위해 투여된다. 염증성 질환의 비제한적인 예로는 기관지염, 만성 인두염 및 만성 편도염을 포함한다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 제형은 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위해 투여된다.

본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 제형은 액체, 고체, 분말 혹은 정제로서 투여될 수 있도록 변형된다. 본 발명의 일부의 실시형태에 있어서, 제형은 비경구 용액(예를 들어, 주사용 용액, 용액, 시럽, 농후 시럽 혹은 페이스트)으로 이루어진다. 용액의 비제한적인 예는 말토덱스트린의 농도가 500 g/ℓ 미만인 말토덱스트린 용액이다. 시럽의 비제한적인 예는 말토덱스트린의 농도가 500 g/ℓ 이상 1.0 ㎏/ℓ 이하인 말토덱스트린 용액이다. 농후 시럽의 비제한적인 예는 말토덱스트린의 농도가 1.0 ㎏/ℓ 이상 1.2 ㎏/ℓ 이하인 말토덱스트린 용액이다. 페이스트의 비제한적인 예는 말토덱스트린의 농도가 1.2 ㎏/ℓ보다 높은 말토덱스트린 용액이다.

본 발명의 투약 제형의 안정성은 다양한 pH 및 온도 레벨에서 가용성 담즙산, 고분자량 수가용성 전분 전화물 및 물을 포함하는 제제에 있어서 시간 경과에 따른 당해 담즙산의 농도를 측정함으로써 평가될 수 있다. 각 담즙산의 체류 시간(고성능 액체 크로마토그래피)은 필요에 따라 복합 샘플, 즉, 복수의 담즙산을 지닌 샘플에 존재하는 각 담즙산의 개별적인 분석을 허용하도록 조정될 수 있다. 안정성 시험도 시험 용액의 광산란특성을 평가함으로써 수행될 수도 있다. 또한, 확립된 촉진 시험 조건이 이용될 수 있다.

본 발명의 용액에 대해 수행된 모든 안정성 시험은 HPLC에 의해 측정된 담즙산의 농도가 다양한 pH 레벨에서 시간 경과에 따라 적절하게 변화되지 않는 점에서 만족할 만하였다. 특히, 시험된 모든 담즙산 용액 제형은 시험기간에 걸쳐 침전이나 물리적 외관변화 없이 안정성 시험에 있어서 우수한 결과를 보였다. 일부의 제형은 2년에 걸쳐 안정하게 유지된다. 시험된 본 발명에 따른 수용액 투약 형태는 염화수소산 용액 중에서 안정적이고 가용성인 치료적 활성제 및 화학적 활성제의 첨가에도 불구하고 상기 촉진 조건하에서 다양한 pH 조건에서 물리적으로 혹은 화학적으로 변화되지 않았다. 따라서, 이들 수용액계는 산성 조건에서의 침전을 비롯한 안정성의 문제 없이 다양한 pH 조건에서 미셀(micelle) 형성에 의해 담즙산이 약물의 애주번트, 약물의 담체 또는 약물의 용해도 증강제로서 역할하는 치료적으로 활성인 담즙산 제제 및/또는 약물(약제학적 화합물) 전달 제제를 위한 매우 가치있는 약제학적 제형일 수 있다.

인간의 뉴런 세포는 본 발명의 용액 및 50 μM의 과산화수소 및/또는 시스플라틴에 의해 처리하였다. 과산화수소는 강력한 산화제이다. 시스플라틴은 반응성 산소종(ROS: reactive oxygen species)의 생산을 자극하고, 이것은 항산화 방어계를 방해한다. 다음에, 세포 생존율, 세포 증식 및 세포자멸은 MTT 환원의 측정에 의해 분석하였다. 특히 외인성 ROS 및 H₂O₂를 이용한 몇몇 연구는, 인간 및 래트의 말초 맥관성 평활근 세포(VSMC: vascular smooth muscle cell)를 비교적 낮은 레벨의 산화제 응력에 대해서 단시간에 노출하는 것은 세포 성장을 촉진시키는 반면, 고농도에서의 연장된 노출은 세포자멸 또는 괴사에 의해 세포 사멸에 이르게 하는 것을 입증하고 있다.

본 발명의 용액에 의한 혹은 본 발명의 용액 없이 과산화수소에 대한 세포 생존율은 MTT 에세이를 이용해서 평가하였다. 본 발명의 용액(0.2 ㎎/㎖ 가용화 UDCA) 및 과산화수소(50 μM)에 의해 처리된 세포들은 가장 높은 세포 생존율(대조군 100%와 비교해서 75%)을 보였다. 가장 낮은 세포 생존율(대조군 100%와 비교해서 26%)은 과산화수소(50 μM) 단독으로 처리된 세포에서 관찰되었다. 이들 효과는 용량의존 방식에서 발견되었다.

시스플라틴의 존재 중의 세포 생존율은 마찬가지 방법으로 평가되었다. 가장 높은 세포 생존율(대조군 100%와 비교해서 87%)은 시스플라틴(20 μM)과 본 발명의 용액(가용성 UDCA 1 ㎎/㎖)의 양쪽 모두에 의해 처리된 세포에서 관찰된 반면, 가장 낮은 세포 생존율(대조군 100%와 비교해서 35%)은 시스플라틴(20 μM) 단독으로 처리된 세포에서 관찰되었다. 이들 효과도 용량 의존 방식에서 발견되었다. MTT 에세이에 의하면, 본 발명의 용액은 거의 완전하게 과산화수소-유발 산화 세포독성을 차단할 수 있고, 시스플라틴-유발 산화 세포독성을 완전히 차단할 수 있다. 결론적으로, 본 발명의 용액은 강력한 산화방지성과 비세포독성을 지닌다.

도 1a는 수명 및 그 결과를 동물이 사망했을 때 시간에 대한 생존 백분율로서 표시한 도면;

도 1b는 로타로드 검사(Rotarod test) 및 그 결과를 동물이 사망할 때까지 매주 미끄러지기 전 로드 상에 남아 있던 시간으로서 표시한 도면;

도 2는 야생형 세포, A4V 세포 및 G93A 세포에 의한 세포 생존율 에세이의 결과를 표시한 막대 그래프로, 도면 중, 왼쪽 막대는 세포들을 미처리한 경우, 가 운데 막대는 본 발명의 용액 중 200 nM 용해성 UDCA로 배양한 경우, 오른쪽 막대는 본 발명의 용액 중 20 μM 용해성 UDCA로 배양한 경우를 각각 나타내고 있음;

도 3은 야생형 세포, A4V 세포 및 G93A 세포에 의한 세포 생존율 에세이의 결과를 표시한 막대 그래프로, 도면 중, 왼쪽 막대는 세포들을 미처리한 경우, 가운데 막대는 500 μM S-니트로소글루타티온(GSNO)으로 배양한 경우, 오른쪽 막대는 500 μM GSNO에 이어서 본 발명의 20 μM UDCA 용액으로 배양한 경우를 각각 나타내고 있음;

도 4A는 미처리 A4V 세포(대조군 세포)를 나타낸 현미경사진;

도 4B는 500 μM S-니트로소글루타티온(GSNO)으로 배양한 A4V 세포를 나타낸 현미경사진;

도 4C는 500 μM GSNO로 배양하고 나서, 계속해서 본 발명의 20 μM 용해성 UDCA 용액으로 배양한 A4V 세포를 나타낸 현미경사진;

도 4D는 미처리 G93A 세포를 나타낸 현미경사진;

도 4E는 500 μM GSNO로 배양한 G93A 세포를 나타낸 현미경사진;

도 4F는 500 μM GSNO로 배양하고 나서, 계속해서 본 발명의 20 μM 용해성 UDCA 용액으로 배양한 G93A 세포를 나타낸 현미경사진.

본 발명의 일부의 실시형태는 이하의 실시예와 관련해서 이해될 수 있다. 그러나, 당업자라면 본 발명에 개시된 구체적인 재료, 조성물 및 결과는 단지 설명을 위해 예시된 것일 뿐, 본 발명의 범위 및 그의 각종 실시형태를 제한하기 위해 의도된 것이 아님은 물론 그와 같이 해석해서도 안되는 것임을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.

실시예 1: 담즙산 용액의 제조

담즙산의 원액(stock solution)은 먼저 500 ㎖ NaOH(6.7 g) 용액 중에 UDCA(60 g)를 용해시킴으로써 준비하였다. 다음에, 얻어진 투명한 용액에, 격렬한 교반하에 말토덱스트린 375 g을 조금씩 첨가하였다. 이어서, 높은 처리량으로 초음파 분해(750W, 2OkHz)를 실시하면서 HCl의 적가에 의해 pH를 7.0 내지 7.2로 조정하였다. 다음에, 주사용 증류수에 의해 체적을 1.0 ℓ까지 조정하였다. 최후로, 얻어진 투명한 용액을 무균 조건 하에서 0.22 μ GP 익스프레스 플러스 멤브레인(express plus membrane)을 이용해서 여과 멸균처리하였다. (이 여과는 멸균를 위해서 중요하지만, 용액이 이미 투명하므로 입상물을 제거하기 위한 것은 아니다.) 이 용액의 원하는 UDCA 농도로의 희석액을 표준 약제 실무에 따라 제조하였다.

실시예 2: 담즙산 용액의 제조

담즙산의 원액은 먼저 400 ㎖ NaOH(2.7 g) 용액 중에 UDCA(25 g)를 용해시킴으로써 준비하였다. 다음에, 얻어진 투명한 용액에, 격렬한 교반하에 말토덱스트린 745 g을 조금씩 첨가하였다. 이 얻어진 용액에 메틸 p-하이드록시벤조에이트 0.95 g 및 아황산수소 나트륨 0.3 g을 함유하는 보존액 100 ㎖를 첨가하고 나서, 교반하였다. 다음에, 의약용수(pharmaceutical grade water)로 체적을 1.0 ℓ까지 조정하였다. 최후로, 얻어진 투명한 용액을 적절한 여과장치에 의해서 여과하였다. (이 여과는 용액이 이미 투명하므로 입상물을 제거하기 수행된 것은 아니다.) 이 용액의 원하는 UDCA 농도로의 희석액을 표준 약제 실무에 따라 제조하였다.

실시예 3: 동물 시험

트랜스제닉 래트; 본 실시예에서 이용된 트랜스제닉 동물들은 글리신93-알라닌 변이체(G93A)를 지닌 이형접합성 hSOD1 담체(carrier)였다. 이 균주는 잭슨 래보라토리즈사(Jackson Laboratories)로부터 구입한 감소된 복제수의 hSOD1을 함유하는 B6SJL-TgN(SOD1-G93A) 1Gur(The Jackson Lab., 미국 메인주의 바하바시에 소재)로서 등록되어 있다. ALS 환자에 있어서 확인된 변이를 가진 인간 SOD1 유전자를 과발현하는 트랜스제닉 마우스들은 성인에서 발병하는 진행성 운동 퇴행을 발전시켰다. 이들 트랜스제닉 마우스들은 상기 질환에 대한 모델인 것으로 여겨졌고, 질환의 진행 및 사망률을 지연시키기 위한 다수의 전략을 시험하는 데 이용되고 있다.

ALS에서의 본 발명의 잠재적인 유익을 평가하기 위해, 본 발명의 용액 중의 용해성 UDCA 240㎎/㎏을, G93A 트랜스제닉 마우스들이 태어난 지 70일이 되었을 때 시작해서 사망할 때까지 매주 2회 경구 투여하였다.

수명 및 그의 결과; 대조군 마우스들(n=8) 및 처리된 마우스들(n=8)의 평균 수명은 도 1에 표시되어 있다. 투명한 용액(25 ㎎/㎏)은 평균 생존 시간을 대조군 마우스들(n=8)의 134.8 일로부터 처리된 마우스들(n=8)에 대해서 146.6 일로 증가시켰으며, 따라서 사망의 지연은 13일로 되었다. 이것은 G93A 마우스들의 수명이 8.81%로 증가된 것에 상당한다.

로타로드 검사 및 그의 결과; 운동 수행능을 평가하기 위해 로타로드를 이용 하였다. 마우스들을 회전 방향에 대항해서 당해 로드 위에 올려놓고, 당해 로드에서 뒤쪽으로 미끄러지는 것을 피하도록 이들을 강제로 앞쪽으로 이동시켰다. 수일간의 학습 기간 후, 마우스들은 15 r.p.m.에서 회전중인 로타로드 상에 머물 수 있었다. 이 마우스들은 1주에 한번씩 시험하였다. 각 마우스는 각 로타로드 검사에 대해 3회 시험을 받게 하여, 미끄러지기 전에 상기 로드 상에 남아 있던 시간을 기록하였다(잠복기). 로타로드 상에 가장 오래 머문 시간을 운동 수행능의 척도로서 3회의 시험 중에서 선택하였다.

처리된 마우스들의 운동 수행능은 질환이 진행됨에 따라 크게 향상되었지만, 미처리 마우스들의 운동 수행능은 질환이 진행됨에 따라 더욱 급속히 떨어졌다. 미처리 마우스들과 처리된 마우스들 간의 운동 수행능의 차이는 112일째(p=0.01), 119일째(0.001), 126일째(p=0.01), 133일째(p=0.001) 및 140일째(p=0.043)에 가장 유의하였다.

결론; SOD1-G93A 래트에서 진행성 세포골격 변질이 광범위하게 입증되기 시작한 70일의 시기는 ALS의 임상적 발병일로서 알려져 있다. 이들 데이터는 용해성 UDCA 용액이 수명을 유의하게 연장하고, 마비의 발병을 지연시키며, ALS-마우스 모델에서 근육강도와 관련된 기능성 파라미터의 진전을 늦추는 것을 입증하였다. 게다가, 용해성 UDCA의 투여에 의한 70일보다 많은 나이의 모델에 대한 개선된 운동 수행능에 의하면, 본 발명의 용액이 운동 수행능을 회복시키면서 진행성 ALS 질환을 치료할 수 있었다.

실시예 4: 세포생존 실험

야생형 세포, G93A 세포 및 A4V 세포에 대한 용해성 UDCA 용액의 보호 효과(protective effect)를 평가하기 위해서, 이들 세포를 뉴런 분화 후 20O nM 또는 20 μM의 용해성 UDCA를 함유하는 용액으로 처리하고 나서, 24시간 배양하였다. 야생형 세포, G93A 세포 및 A4V 세포에 대한 용해성 UDCA 용액의 보호효과는 MTT 에세이 및 트리판 블루 염색의 양쪽 모두를 이용해서 결정하였다. 세포 생존율은 도 2에 표시된 바와 같이 세포 생존 %로서 표현될 수 있다.

GSNO는 세포자멸과 관련되는 것으로 알려져 있다. hSOD1에 있어서 G93A 변이체 및 A4V 변이체를 함유하는 세포들 및 야생형 세포에 대해서 GSNO에 대한 용해성 UDCA의 항세포자멸적 효과를 평가하기 위해서, 야생형 세포, G93A 세포 및 A4V 세포를 500 μM GSNO에서 24시간 배양하여 세포자멸을 유발시키고 나서, 그의 세포 생존율을 구하였다. 다음에, 이들 세포자멸-유발 야생형 세포, G93A 세포 및 A4V 세포를 20 μM 용해성 UDCA에서 24시간 배양하고, MTT 에세이 및 트리판 블루 염색의 양쪽 모두를 이용해서 재차 세포 생존율을 구하였다. 세포 생존율은 도 3에 표시된 바와 같이 세포 생존 %로서 표현될 수 있다.

세포 배양: VSC 4.1.(ventral spinal cord 4.1; 운동신경세포-신경모세포종 하이브리드 세포)을 사토의 성분(Sato's components)(Sigma, 미국 미주리주의 세인트 루이스시에 소재) 및 2%의 열에 불활성인 소신생아 혈청(HyClone, 미국 유타주의 로간시에 소재)을 가진 둘베코의 변성 이글 배지(Dulbecco's modified Eagles' medium)/F-12 성장 배지(Gibco, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드)에서 유지하였다. 이들을 폴리-(L-오르니틴)-프리코팅된 배양접시(Falcon, Franklin lakes, NJ) 상에서 대수증식기 성장에서 성장시켰다. 컨플루언시(confluency) 후, 세포들을 1 × 10ⁿ(n=4) 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트(NUNC, 덴마크)에서 평판 배양하였다. 면역탁본법(immunoblot)을 위해서, 1 × 10ⁿ (n=5) 세포들을 100 mm 접시(Falcon, 미국 뉴저지주의 프랭클린 레이크시에 소재)에 접종하였다.

안정한 세포주의 구축 및 확립: 야생형(대조군) 또는 변이형(G93A, A4V) 인간 Cu/Zn SOD-1 cDNA를 pcDNA 3.0의 BamHI 부위 및 EcoRII 부위 속에 클로닝하였다. 이 삽입물을 함유하지 않은 빈 벡터(empty vector)를 대조군으로 사용하였다. 세포들을 트랜스펙션시키고(Superfect, Qiagen, 미국 캘리포니아주의 발렌시아시에 소재), G418을 400 ㎎/㎖의 농도로 함유한 배지(Gibco, 뉴욕주의 그랜드 아일랜드)에 유지하였다. 단일 콜로니 또는 혼주 콜로니는 인간 이외의 SOD1 다클론성 항체(Calbiochem, 미국 캘리포니아주의 라졸라시에 소재)를 이용해서 웨스턴 블롯 분석에 의해 인간 SOD1(WT, 변이체)의 발현을 명백히 한 후 실험을 위해 이용하였다. 이들 세포주는 VSC 4.1 세포와 같은 조건하에서 성장시켰다.

보호 효과를 평가하기 위한 MTT 에세이 및 트리판 블루 염색 및 그 결과; 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 세포에 흡수시키고 미토콘드리아 숙신산 탈수소효소의 작용에 의해 포르마잔으로 전환시켰다. 따라서, 포르마잔의 축적은 미토콘드리아의 활성을 직접 반영하고 세포 생존율을 간접적으로 반영한다. 이와 같이 해서, 뉴론 분화된 세포들(야생형 세포(대조군), G93A 세포, A4V 세포)을 96 웰 플레이트 중 1 × 10ⁿ (n=4) 세포/웰의 밀도로 평판 배양하였다. 생존율에 대한 G93A 변이체 또는 A4V 변이체의 효과를 평가하기 위해서, 평판 배양된 세포를 1 mM 디부티릴 cAMP 및 0.025 ug/㎖ 아피디콜린을 함유하는 배지에서 배양하고, 야생형 세포, G93A 세포 및 A4V 세포의 생존율을 농도의 함수로서 평가하였다. 생존율에 대한 용해성 UDCA의 보호 효과를 평가하기 위해, 20OnM 및 20 μM의 용해성 UDCA를 상기 배지에 첨가하였다. 24시간의 배양후, 각 웰에 배지(200 ㎕)를 첨가하고 나서 2 ㎎/㎖ MTT(Sigma, 미국 미주리주의 세인트 루이스시에 소재) 50 ㎕를 첨가하였다. 계속해서, 상기 용액 220 ㎕를 각 웰로부터 제거하고, 이어서, 각 웰에 디메틸설폭사이드 150 ㎕를 다시 첨가하였다. 마지막으로, 마이크로플레이트 믹서에 의해 각 웰 중의 입자들을 10분간 용해시키고 나서 ELISA 플레이트 리더 상에서 540 ㎚에서 OD(optical density)를 판독하였다. 그 결과를 세포 배양하지 않고 측정한 OD를 이용해서 교정하였다. 트리판 블루 염색을 위해서, 각 플레이트로부터 회수한 세포 10 ㎕에 트리판 블루 용액 10 ㎕를 첨가하고, 세포들을 2분간 배양하였다. 염색되지 않고 살아 있는 세포들을 혈색소계를 이용해서 계수하였다. 세포 생존율은 세포 생존 %로서 표현되었다.

야생형 세포, G93A 세포 및 A4V 세포의 생존율은 미처리 야생형 세포(대조군; 100%)에 비해서 각각 200 nM의 용해성 UDCA에 의해 처리된 경우 100%, 130% 및 115%였다. 200 nM보다 100배 높은 농도의 용해성 UDCA(20 μM)에서, 야생형 세포, G93A 세포 및 A4V 세포의 생존율은 미처리 야생형 세포(대조군; 100%)에 비해서 각각 89%, 133% 및 101%였다. 이 실험 데이터는 용해성 UDCA가 G93A 세포 및 A4V 세포에 대한 보호효과를 가지며 또한 야생형 세포, G93A 세포 및 A4V 세포에 대해 서 비독성인 것을 나타내었다.

GSNO 에 의한 세포 자멸을 평가하기 위한 DAPI 염색 및 그 결과; 4',6-디아미노-2-페닐인돌 이염산염(DAPI) 염색을 다음과 같이 행하여 세포자멸을 평가하였다. 분화 후, 야생형 세포(대조군), G93A 세포 및 A4V 세포를 500 μM GSNO에 의해/500 μM GSNO 없이 24 시간 배양하고; 이어서, 이들 세포들을 265 g에서 2분간 원심분리하고, 이 세포 펠릿(cell pellet)에 4% 중성 완충 포르말린(100 ㎕)을 첨가하였다. 상기 세포 현탁액 중 50 ㎕를 유리 슬라이드에 도포하고, 실온에서 건조시켰다. 고정된 세포들을 PBS로 세척하고, 공기 건조시키고 나서, DNA-특이적 플루오로크롬인 DAPI(Sigma, 미국 미주리주의 세인트 루이스시에 소재)에 의해 20분간 염색하였다. 부착된 세포들을 PBS로 세정하고, 공기 건조 후, 90% 글리세롤에 놓았다. 상기 슬라이드를 올림푸스 형광현미경(사진)하에 관찰하였다. 세포 생존율은 세포 생존 %로서 표현되었다.

DAPI 염색은 G93A 세포 및 A4V 세포(19% 대 25% 각각) 간의 세포자멸 세포 백분율이 야생형 세포(8%)에 비해서 유의하게 증가하는 것을 나타내었다. G93A 세포 및 A4V 세포에서의 세포자멸을 겪은 세포의 증가된 백분율은 GSNO의 세포자멸 효과가 야생형 세포보다 G93A 세포 및 A4V 세포 상에서 더욱 유의한 것을 입증하였다.

용해성 UDCA 의 항세포자멸적 효과를 평가하기 위한 MTT 에세이 및 트리판 블루 염색 및 그 결과; 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 세포에 흡수시키고, 미토콘드리아 숙신산 탈수소효소의 작용에 의해 포 르마잔으로 전환시켰다. 따라서, 포르마잔의 축적은 미토콘드리아의 활성을 직접 반영하고 세포 생존율을 간접적으로 반영한다. 이와 같이 해서, 뉴론 분화된 세포들(야생형 세포(대조군), G93A 세포, A4V 세포)을 96 웰 플레이트 중 1 × 10ⁿ (n=4) 세포/웰의 밀도로 평판 배양하였다. 평판 배양된 세포를 1 mM 디부티릴 cAMP 및 0.025 ug/㎖ 아피디콜린을 함유하는 배지에서 배양하고, 그 후, 500 μM의 GSNO를 첨가한 채/첨가하지 않은 채 24시간 동안 더욱 배양하였다. 세포에 대한 용해성 UDCA의 항세포자멸적 효과를 평가하기 위해, 20OnM 및 20 μM의 용해성 UDCA를 상기 배지에 첨가하였다. 24시간의 배양후, 각 웰에 배지(200 ㎕)를 첨가하고 나서 2 ㎎/㎖ MTT(Sigma, 미국 미주리주의 세인트 루이스시에 소재) 50 ㎕를 첨가하였다. 계속해서, 상기 용액 220 ㎕를 각 웰로부터 제거하고, 이어서, 각 웰에 디메틸설폭사이드 150 ㎕를 다시 첨가하였다. 마지막으로, 마이크로플레이트 믹서에 의해 각 웰 중의 입자들을 10분간 용해시키고 나서 ELISA 플레이트 리더 상에서 540 ㎚에서 OD를 판독하였다. 그 결과를 세포 배양하지 않고 측정한 OD를 이용해서 교정하였다. 트리판 블루 염색을 위해서, 각 플레이트로부터 회수한 세포 10 ㎕에 트리판 블루 용액 10 ㎕를 첨가하고, 세포들을 2분간 배양하였다. 염색되지 않고 살아 있는 세포들을 혈색소계를 이용해서 계수하였다. 세포 생존율은 세포 생존 %로서 표현되었다.

S-니트로소글루타티온-유발 세포자멸에 의한 생존율의 감소는 야생형 세포에서보다 G93A 세포 및 A4V 세포에서 더욱 현저하였다. GSNO 처리된(세포자멸) 세포 중의 용해성 UDCA에 의한 생존율의 증가는 야생형 세포에 비해서 G93A 세포 및 A4V 세포에서 유의하였다. 더욱 구체적으로는, 야생형 세포(92%)에 비해서, G93A 변이체 및 A4V 변이체의 생존율은 500 μM GSNO에 의한 배양 후 24시간째에 각각 81% 및 75%였다. 용해성 UDCA를 첨가하여 더욱 배양한 후, 야생형 세포, G93A 세포 및 A4V 세포의 생존율은, 야생형 세포에서는 92%에서 98%까지, G93A 세포에서는 81%에서 100%까지, 그리고 A4V 세포에서는 75%에서 115%까지 증가하였다.

이 실험은 가용성 UDCA 용액이 G93A 세포 및 A4V 세포를 NO-매개 세포자멸로부터 보호할 수 있고 또한 ALS의 세포자멸-매개 손상 세포를 회복시킬 수 있는 것을 증명하고 있다.

당업자라면, 신경퇴행성 질환 및/또는 운동 뉴론 질환의 증상을 개선 및/또는 치료하기 위해 기타 다른 등가의 또는 대안적인 방법이 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 방법 및 투약 용량은 나이가 다른 대상(예를 들어, 어린이, 성인 등), 추가적인 알레르기 또는 질병 상태를 가진 대상 및/또는 알레르기 및/또는 증상의 중증도가 다양한 대상을 진단 및/또는 치료하도록 임의의 척도로 설계될 수 있다. 또한, 방법 및 투약 용량은 시간(예를 들어, 달마다 혹은 계절마다)에 따른 변동에 적합하도록 할 수 있다. 명백한 변화 및 변경에 따른 이들 등가물 및 대용물은 본 발명의 범위 내에 포함되도록 의도되어 있다. 예를 들어, 제공된 수치 및/또는 범위의 종말점은 모든 실시형태에 대해서 엄격한 한계로 되도록 의도되어 있지 않다. 게다가, 당업자라면 단일의 실시형태, 용도 및/또는 이점이 다른 실시형태, 용도 및/또는 이점을 두루 제어하거나 배제하도록 의도된 것이 아님을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 의약적 전문가는 서로에게 선호도를 부여하는 상황을 상정할 수 있다. ALS 및 담즙산 대사의 유전학, 생화학 및 세포 생물학의 현행의 인식에 대한 광범위한 정보를 포함하지만, 앞으로의 연구는 이들 인식의 측면들이 부정확하거나 불완전한 것임을 드러낼 수도 있다. 따라서, 당업자라면 본 발명이 일부가 취해지든 전부가 취해지든지 간에 특정 모델이나 작용 기전으로 제한되지 않은 것임을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 당업자는 기타 등가의 또는 대안적인 조성물 및 방법이 이용될 수 있는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 다수의 화합물이 담즙산과 함께 투여될 수 있는 것으로 설명하였으나, 기타 다른 화합물도 포함될 수 있음은 물론이다. 또한, 약제의 투여는 담즙산 조성물의 투여와 동일 시각에 수행될 수 있거나, 또는 이들 두 가지는 동일한 혹은 중복되는 시간주기(예를 들어, 동일 시간, 동일 일자 또는 동일한 주) 동안 간단히 투여될 수 있다. 따라서, 전술한 본 발명은 이하의 청구범위에 예시된 바와 같은 본 발명의 범주를 예시하기 위해 의도된 것일 뿐 제한하기 위한 것은 아니다.

Claims

(a) 우르소데옥시콜산(UDCA);

(b) 말토덱스트린; 및

(c) 물을 포함하되,

상기 우르소데옥시콜산과 상기 말토덱스트린은 양쪽 모두 선택된 pH 값 범위 내의 용액의 모든 pH 값에 대해 용액 상태인 투명한(clear) 수용액을 포함하는, 신경퇴행성 질환 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 뇌졸중 및 척수손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 근위축성 측삭 경화증인 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 근위축성 측삭 경화증은 진행성의 근위축성 측삭 경화증인 조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 우르소데옥시콜산은 치료적 활성량으로 존재하는 것인 조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 선택된 pH 범위는 1 내지 10인 조성물.
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(a) 우르소데옥시콜산(UDCA);

(b) 말토덱스트린; 및

(c) 물을 포함하되,

상기 우르소데옥시콜산과 상기 말토덱스트린은 양쪽 모두 선택된 pH 값 범위 내의 용액의 모든 pH 값에 대해 용액 상태인 투명한(clear) 수용액을 포함하며,

진행성 연수마비(progressive bulbar palsy), 가성 연수마비(pseudobulbar palsy), 원발성 측삭경화증, 진행성 근육 위축 및 후소아마비 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 운동 뉴런(motor neuron) 질환 치료용 조성물.
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제 15항에 있어서, 상기 우르소데옥시콜산은 치료적 활성량으로 존재하는 것인 조성물.
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제 15항에 있어서, 상기 선택된 pH 범위는 1 내지 10인 조성물.
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