KR102456699B1 - 디다노신을 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

디다노신을 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102456699B1
KR102456699B1 KR1020210160155A KR20210160155A KR102456699B1 KR 102456699 B1 KR102456699 B1 KR 102456699B1 KR 1020210160155 A KR1020210160155 A KR 1020210160155A KR 20210160155 A KR20210160155 A KR 20210160155A KR 102456699 B1 KR102456699 B1 KR 102456699B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
disease
lps
alzheimer
didanosine
group
Prior art date
Application number
KR1020210160155A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220068945A (ko
Inventor
유성운
남혜리
이영환
Original Assignee
주식회사 오에이티씨
재단법인대구경북과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 오에이티씨, 재단법인대구경북과학기술원 filed Critical 주식회사 오에이티씨
Publication of KR20220068945A publication Critical patent/KR20220068945A/ko
Priority to KR1020220132676A priority Critical patent/KR20220145310A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102456699B1 publication Critical patent/KR102456699B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A61K31/522—Purines, e.g. adenine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. hypoxanthine, guanine, acyclovir
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/322—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the nervous system or on mental function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/30—Other Organic compounds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 디다노신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

디다노신을 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating of neuroinflammatory disease comprising didanosine}
본 발명은 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
중추신경계는 신경세포와 신경교세포로 이루어져 있다. 신경교세포는 전체 뇌세포의 약 90%를 차지하며, 부피로는 뇌 전체의 약 50%를 차지하고 있다. 신경교세포는 다시 성상세포(astrocytes), 미세아교세포(microglia) 및 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)의 세 종류로 분류할 수 있다. 이 중, 미세아교세포는 분화된 대식세포(specialized macrophage)의 일종으로, 뇌에 널리 분포한다. 미세아교세포는 조직 잔해 및 죽은 세포들을 삼키는 식세포로서 작용할 뿐 아니라 뇌의 생체방어 활동에 참여하는 역할을 한다.
한편, 신경염증은 신경계의 면역 반응의 일종으로, 알츠하이머, 파킨슨병, 다발성경화증을 포함하는 많은 퇴행성 신경 질환과 매우 밀접하게 연관되어 있으며, 현재 퇴행성 신경 질환의 전형적 특징으로 생각되고 있다. 신경염증 반응은 선천성 면역 세포(미세아교세포)의 활성화, 염증 매개체 예컨대 산화질소(nitric oxide; NO), 사이토카인 및 케모카인의 방출, 대식세포 침윤을 포함하며, 이는 신경 세포의 사멸을 유도한다. 미세아교세포 및 성상세포의 염증 활성화는 병리학적 마커 및 퇴행성 신경 질환의 진행에 있어 중요한 메커니즘으로 생각된다. 미세아교세포 활성의 엄격한 조절은 뇌 항상성을 유지하고 감염 및 염증 질환을 예방하는 데 필수적이기 때문에 미세아교세포의 활성을 조정하여 신경염증을 완화시키기 위한 물질의 발굴이 필요하다.
한편, 디다노신(didanosine)은 FDA 승인을 받은 HIV/AIDS 치료에 사용되는 뉴클레오시드(nucleoside) 역전사 효소 억제제로서, 천연 dATP와 경쟁적으로 작용하여 HIV 역전사 효소를 억제하고, 3’-OH 그룹이 결여된 바이러스 DNA에서 5’에서 3’으로의 포스포디에스터 링크(phosphodiester linkage) 결합을 억제하여 바이러스 DNA 사슬 종결자(chain terminator)로 작용한다. 디다노신은 혈 뇌 장벽(blood brain barrier)을 쉽게 통과할 수 있어, 뇌에도 영향을 쉽게 줄 수 있다. 그러나 디다노신을 이용하여 신경염증을 억제하거나 뇌에 작용하는 효과는 알려지지 않은바, 이에 대한 연구가 필요한 실정이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 신경염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 추가 일 예는 디다노신 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일 예는 대상의 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용으로 사용되는, 디다노신 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물은 아밀로이드 베타의 분해를 촉진할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 조성물은 신경염증을 억제하여 기억력을 회복시킬 수 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 미세아교세포 (microglia)의 아밀로이드 베타 분해 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 신경계 염증에 대한 항염 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 기억력 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경염증성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 생산하기 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 신경염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세하게 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 “디다노신(didanosine)”은 화학식 C10H12N4로 구성되고, IUPAC 명명법에 의해 9-[(2R,5S)-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1H-purin-6-one로 명명되며 하기 [화학식 1]의 구조를 갖는 화합물을 의미하며, 본 발명의 일 예에 따른 신경 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분은, 디다노신, 이의 유도체, 대사산물 및 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112021133684495-pat00001
본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 디다노신은 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적 또는 식품학적으로 허용되는 다양한 유기산 또는 무기산에 의해 형성된 산 부가염을 사용할 수 있다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 다이카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻을 수 있다. 이러한 무독성 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 수베레이트, 세바케이트, 푸마렝트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디온산, 벤조산, 클로로벤조산, 메틸벤조산, 디니트로 벤조산, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조산, 프달산, 테레프달레이트, 벤젠실폰산, 톨루엔실폰산, 클로로벤젠설폰산, 크실렌설폰산, 페닐아세트산, 페닐프로피온산, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트, 트라이플루오로아세트산 등을 사용하여 제조할 수 있다.
이때, 본 발명에 따른 상기 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 [화학식 1]의 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 디다노신은 염기를 사용하여 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 리튬, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 농약학상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예를들면, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “신경 염증성 질환”은 신경계의 염증에 의하여 발생하는 질환을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 뇌졸중, 치매, 알츠하이머 병, 인지 장애, 기억 장애, 주의력 장애, 파킨슨 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증, 신경병증성 통증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 알츠하이머 질병(AD)은, 예를 들어 특발성 알츠하이머 질병(sporadic Alzheimer disease, SAD), 또는 가족성 알츠하이머 치매 (Familial Alzheimer's disease, FAD) 등을 포함할 수 있다. 가족성 알츠하이머 치매의 주 원인은 PSEN 유전자 때문이라고 알려져 있으며, PSEN 유전자는 막관통단백질인 presenilin을 발현하는 유전자이며 gamma-secretase의 촉매 부위를 발현시킨다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 질환은 유전성 치매 또는 가족성 알츠하이머 병 (Familial Alzheimer’s Disease; FAD)인 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 질환은 Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin 1 (PSEN1), 및 Presenilin 2 (PSEN2) 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 변이를 가지는 알츠하이머 질환 또는 알츠하이머 관련 치매인 것일 수 있다. 상기 Presenilin 2 유전자 변이는 PSEN2 N141I 외 A85V, N141Y, M174I, G212V, A237V, M239I 및 M239V로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 질환은, 신경 염증에 의해 발생되는 인지장애, 기억력 저하, 알츠하이머 병 또는 이의 관련 증상일 수 있으며, 노화, 유전적 변이, 두부외상, 우울증 또는 고혈압에 의한 합병증 증상 등과 함께 발생되거나 악화될 수 있다.
상기 신경 염증은 유전적 돌연변이, 감염, 뇌타박상 (brain trauma), 및 알코올 중독으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이 유발한 것일 수 있다. 상기 유전적 돌연변이는 Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin 1 (Psen1), 및 Presenilin 2 (Psen2)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 변이인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “신경 염증 유도에 의한 알츠하이머”는 신경 염증반응을 인위적으로 발생시켜 유도된 치매를 의미하며, 노화에 의한 치매 모델과 달리 단기간 내에 치매를 발현시킬 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 “신경 염증 유도에 의한 알츠하이머”는 신경 염증반응을 인위적으로 발생시켜 유도된 치매를 의미한다.
더욱 자세하게는, 본 발명에 따른 대상 및/또는 질환은, 정상 대상 또는 정상 질환과 비교하여 Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin 1 (Psen1), 및 Psenilin 2 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 변이 특성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 조성물은 중추신경계에서 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 상기 염증성 사이토카인은 신경염증성 사이토카인일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “염증성 사이토카인”이란 세균이나 바이러스 감염, 조직 손상 따위에 의한 염증 반응에 관여하는 사이토카인을 의미하며, 본 발명의 디다노신 또는 이의 염을 포함하는 조성물은 상기 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것일 수 있고, 본 발명에 의해 억제되는 염증성 사이토카인은 바람직하게는 IL-6일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 이론에 제한됨이 없이, 신경염증성 질환에서는 염증성 사이토카인이 증가될 수 있으며, IL-6 등의 염증성 사이토카인을 억제시켜 알츠하이머 등의 신경염증성 질환을 치료 및 개선시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 디다노신 또는 이의 염은 전사활성 인자의 손상을 회복시킴으로써 염증성 사이토카인의 발현을 억제시켜 알츠하이머를 비롯한 신경염증성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본원 실시예에서 디다노신 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물이 미세아교세포에서 신경염증을 유발하는 신경 염증성 사이토카인의 발현을 억제하여 동물모델의 항염증 효과를 통해 알츠하이머의 예방, 개선 또는 치료 효과를 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 디다노신을 처리하는 경우 알츠하이머 동물 모델의 1차 미세아교세포에서 IL-6의 분비를 유의적으로 감소시키고 (실시예 6 참조), 세포 독성이 거의 없는 것을 확인하였다 (실시예 5 참조).
본원 실시예에서 신경 염증성 질환, 예컨대 신경 염증성 알츠하이머가 발병된 마우스 모델에서 유래된 미세아교세포에 디다노신을 처리하는 경우 염증성 사이토카인의 발현을 억제함으로써 항염증 효과 및 기억력 회복 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 미세아교세포의 신경염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 상기 미세아교세포는 Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin 1 (PSEN1), 및 Presenilin 2 (PSEN2) 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 변이를 가지는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 기억력 개선용 조성물인 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명자들은 미세아교세포에서 염증반응을 일으키는 염증성 사이토카인의 발현을 조절하여 신경염증성 질환을 치료할 수 있는 물질에 대해 연구한 결과, 알츠하이머가 발병된 PSEN2 N141I KI/+ 마우스 모델의 미세아교세포에 디다노신을 처리하는 경우 염증성 사이토카인 IL-6의 발현억제를 통해 항염증 효과가 나타나고, 아밀로이드 베타 분해를 촉진하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 또한, 다른 알츠하이머병 모델인 5XFAD 마우스에서 디다노신이 감퇴된 인지기능을 개선하는 것을 확인하였다.
본 명세서에서 "PSEN2 유전자"는 PSEN2 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 지칭한다. PSEN2 유전자는 NCBI 기준 서열로 사람 PSEN2 유전자는 NC_000001.11 (226870594..226903829)에 위치하고, 마우스 PSEN2 유전자는 NC_000067.7에 위치하며, 이들 서열뿐만 아니라 공지된 오솔로그로 포함한다. "PSEN2 폴리펩타이드"는 NCBI 기준 서열으로 사람 PSEN2 단백질은 NP_000438.2에 위치하고, 마우스 PSEN2 단백질은 NP_001122077에 위치하며, 이들 서열뿐만 아니라 공지된 오솔로그로 포함한다.
본 발명에 따른 신경염증 및/또는 알츠하이머 병과 연관성을 갖는 PSEN2 유전자의 변이로는 A85V, N141I, N141Y, M174I, G212V, A237V, M239I, 또는 M239V이 알려져 있으며, 이들 변이를 1종 이상 포함할 수 있다 (Jiang et al., “A Review of the Familial Alzheimer’s Disease Locus PRESENILIN 2 and Its Relationship to PRESENILIN 1.”Journal of Alzheimer’s Disease 66 (2018) 1223-1339).
본원 실시예에 의하면, 가족성 알츠하이머 돌연변이 중 하나로서 presenilin 2 유전자의 141번 아미노산 N(아르기닌)이 I(아이소류신)으로 치환된 Psen2 N141I knock-in (KI) 동물모델에, 디다노신을 처리하는 경우 염증성 사이토카인 IL-6(Interleuckine-6)의 발현을 억제하고, 이를 통해 항염증 효과 및 기억력 회복 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 또 다른 일 예는, 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 신경염증에 대한 항염 조성물에 관한 것이다.
이에, 본 발명의 또 다른 일 예는, 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 기억력 개선용 조성물에 관한 것이다.
상기 실시예 결과들로부터 본 발명에 따른 디다노신을 동물모델 또는 이의 미세아교세포에 처리하는 경우 신경염증 반응이 완화되는 것을 확인하였으며, 디다노신은 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있다고 알려져 있는바, 본 발명에 따른 조성물은 알츠하이머를 비롯한 신경염증 질환 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 미세아교세포 (microglia)의 아밀로이드 베타 분해 촉진용 조성물에 관한 것이다. 또는, 본 발명의 또 다른 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학 조성물의, 미세아교세포 (microglia)의 아밀로이드 베타 분해 촉진 용도에 관한 것이다. 또는, 본 발명의 또 다른 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 미세아교세포 (microglia)의 아밀로이드 베타 분해 촉진에 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 미세아교세포는 신경염증에 의해 아밀로이드 베타 분해능이 저하된 것일 수 있다.
상기 미세아교세포는 Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin 1 (PSEN1), 및 Presenilin 2 (PSEN2) 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 변이를 가지는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 미세아교세포는 Presenilin 2 유전자 변이를 가지는 미세아교세포, 구체적으로 Psen2 N141I KI/+ 미세아교세포일 수 있다.
본원 실시예에서 미세아교세포에 디다노신을 처리한 결과, 저하된 아밀로이드 베타 분해 능력을 회복하였으며, 이에 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 미세아교세포의 아밀로이드 베타 분해 능력을 회복시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 디다노신(didanosine) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 신경염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 상기 식품은 건강기능식품일 수 있다. 상기 디다노신, 상기 신경염증성 질환 등은 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 조성물이 건강기능식품 조성물의 형태인 경우, 특정보건용 식품, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학 및 의료효과가 높은 식품으로 제조 될 수 있으며, 상기 식품은 경우에 따라, 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품으로 혼용될 수 있으며, 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 식품 조성물에 통상적으로 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 디히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시 톨루엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품에 있어서, 디다노신의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 식품의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경염증성 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물, 상기 신경염증성 질환 등은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 “개체”는 쥐, 가축, 생쥐, 인간 등 포유류일 수 있으며, 구체적으로 신경염증성 질환, 예를 들어 알츠하이머 병의 치료가 필요한 반려견, 경주마, 인간 등일 수 있고, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 대상의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 대상의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 4 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 HIV 치료제로 투여되는 디다노신 유효량의 1배 미만, 0.9배 이하, 0.8배 이하, 0.7배 이하, 0.6배 이하, 0.5배 이하, 0.4배 이하, 0.3배 이하, 0.2배 이하, 0.1배 이하, 0.09배 이하, 0.08배 이하, 0.07배 이하, 0.06배 이하, 0.05배 이하, 0.04배 이하, 0.03배 이하, 0.02배 이하, 또는 0.01배 이하로 투여되는 것일 수 있다. 이 때 상기 투여량의 하한값이 특정되지 않아도, 신경염증성 질환의 예방 또는 치료를 위해 통상의 기술자가 본원발명을 명확하게 실시할 수 있을 것이나, 예를 들어 상기 투여량의 하한값은 HIV 치료제로 투여되는 디다노신 유효량의 0.0001배 이상, 0.0005배 이상, 0.001배 이상, 0.005배 이상, 0.01배 이상, 0.05배 이상, 또는 0.1배 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 0.001 내지 4 mg/kg, 0.001 내지 3 mg/kg, 0.001 내지 2.5 mg/kg, 0.001 내지 2 mg/kg, 0.001 내지 1.5 mg/kg, 0.001 내지 1 mg/kg, 0.001 내지 0.9 mg/kg, 0.001 내지 0.8 mg/kg, 0.001 내지 0.7 mg/kg, 0.001 내지 0.6 mg/kg, 0.001 내지 0.5 mg/kg, 0.001 내지 0.45 mg/kg, 0.001 내지 0.4 mg/kg, 0.005 내지 4 mg/kg, 0.005 내지 3 mg/kg, 0.005 내지 2.5 mg/kg, 0.005 내지 2 mg/kg, 0.005 내지 1.5 mg/kg, 0.005 내지 1 mg/kg, 0.005 내지 0.9 mg/kg, 0.005 내지 0.8 mg/kg, 0.005 내지 0.7 mg/kg, 0.005 내지 0.6 mg/kg, 0.005 내지 0.5 mg/kg, 0.005 내지 0.45 mg/kg, 0.005 내지 0.4 mg/kg, 0.01 내지 4 mg/kg, 0.01 내지 3 mg/kg, 0.01 내지 2.5 mg/kg, 0.01 내지 2 mg/kg, 0.01 내지 1.5 mg/kg, 0.01 내지 1 mg/kg, 0.01 내지 0.9 mg/kg, 0.01 내지 0.8 mg/kg, 0.01 내지 0.7 mg/kg, 0.01 내지 0.6 mg/kg, 0.01 내지 0.5 mg/kg, 0.01 내지 0.45 mg/kg, 0.01 내지 0.4 mg/kg, 0.1 내지 4 mg/kg, 0.1 내지 3 mg/kg, 0.1 내지 2.5 mg/kg, 0.1 내지 2 mg/kg, 0.1 내지 1.5 mg/kg, 0.1 내지 1 mg/kg, 0.1 내지 0.9 mg/kg, 0.1 내지 0.8 mg/kg, 0.1 내지 0.7 mg/kg, 0.1 내지 0.6 mg/kg, 0.1 내지 0.5 mg/kg, 0.1 내지 0.45 mg/kg, 또는 0.1 내지 0.4 mg/kg 농도의 일일 투여량으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신경염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “개선”이란 본 발명의 따른 조성물의 투여로 신경염증성 질환의 증상 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신경염증성 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 자세하게는, 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 치료 중인 상태, 장애 또는 질환과 연관되거나 또는 이에 의해 야기되는 적어도 하나의 증상의 감소 또는 완화를 포함한다. 치료된 대상체는 증상(예를 들어, 알츠하이머병 또는 연관된 병태)의 부분적 또는 전체적 완화를 나타낼 수 있거나 또는 증상은 본 발명에 따른 치료 후에 정적으로 남아있을 수 있다. 용어 "치료"는 예방, 요법 및 치유를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에 따른 조성물이 약학적 조성물의 형태인 경우, 약학적으로 유효한 양의 디다노신을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 상기 약학적 조성물의 신경염증성 질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물, 상기 신경염증성 질환 등은 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 일 예는 신경염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 생산하기 위한 상기 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물, 상기 신경염증성 질환 등은 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 일 예는 신경염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물, 상기 신경염증성 질환 등은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 예 따른 조성물은 신경염증성 사이토카인의 발현을 억제할 수 있어 신경염증성 질환에 효과적이며, 알츠하이머 마우스의 인지기능을 개선시킴을 확인하였는바, 의약품, 의약외품 소재 개발 및 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 일 예에 따른 조성물은 신경염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, 아밀로이드 베타의 분해를 촉진하며, 알츠하이머 동물 모델에서 인지기능을 개선할 수 있어 신경염증성 질환에 효과적임을 확인하였는바, 의약품, 의약외품 소재 개발 및 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 Psen2 N141I 변이 알츠하이머 질병 마우스 모델의 제작에 대한 것으로, 도 1a는 N141I 표적 삽입을 위한 모식도를 나타낸 것이고, 도 1b는 정상(야생형), KI/+, KI/KI 마우스의 Sanger 시퀀싱 크로마토그램 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 Psen2 N141I 변이 알츠하이머 질병 마우스 모델이 정상(야생형) 마우스에 비해 과도하게 염증반응을 일으킨다는 것을 확인한 것으로서, 도 2a는 다양한 농도의 lipopolysaccharide (LPS) 복강 주사에 의한 신경염증을 유도한 동물에서 IL-6의 혈중 농도를 나타낸다. 다양한 농도의 LPS 복강 주사에 의해서 IL-6는 모든 LSP 농도에서 Psen2 변이 알츠하이머 마우스에서 과발현 되며, 정상 마우스와 알츠하이머 모델의 발현 차이는 낮은 농도에서 점점 벌어진다. 도 2b는 LPS 복강 주사에 의한 TNF-α의 생성을 나타내며, 모든 LPS 농도에서 TNF-α는 정상 마우스와 Psen2 N141I 변이 알츠하이머 마우스 간에 동일한 혈중 농도를 나타낸다. 도 2c는 염증성 사이토카인들인 IL-6, CXCL1, CCL2, CCL5의 혈중농도의 변화를 나타낸다. 야생형 마우스에서는 염증반응을 일으키지 않는 낮은 농도의 LPS(0.35 μg/kg)를 주사했을 때 Psen2 N141I 변이 마우스에서만 염증 사이토카인들이 현저하게 증가함을 보여준다.
도 3a는 정상 마우스와 Psen2 N141I 변이 알츠하이머 마우스의 해마에서 Iba-1 (미세아교세포 표지항체) 염색 이미지를 보여주고, 도 3b는 IMARIS 소프트에어를 사용하여 Iba-1 신호를 3D 필라멘트 이미지화한 그림이며, 도 3c는 IMARIS 소프트웨어의 FilamentTracker 분석을 통해 dendrite 길이와 가지 수 데이터를 보여준다. 이를 통해, Psen2 N141I 변이 알츠하이머 마우스는 낮은 농도의 염증자극에도 염증성 사이토카인들을 생성하여 과도하게 면역반응을 일으킨다는 것을 알 수 있다.
도 4는 Psen2 N141I 변이 알츠하이머 마우스 모델이 낮은 농도의 LPS 복강 주사에 의하여 기억력 악화를 나타내는 것을 확인한 결과로, 도 4a는 Y-maze 분석을 통해 신경 염증 유도된 Psen2 N141I 변이 마우스는 기억력 악화를 보임을 확인한 것이다. 도 4b는 Y-maze 분석에서 마우스의 운동성에 차이가 없음을 보여주는 것이다. 도 4c는 T-maze 분석 실험 방법에 대한 모식도이며, 도 4d는 T-maze 분석을 통해 신경 염증 유도된 Psen2 N141I 변이 마우스는 성공률이 현저히 떨어져 기억력 악화를 보임을 확인한 것이다.
도 5는 야생형 마우스에서 유래된 미세아교세포에 디다노신을 처리한 다음 세포 사멸율을 관찰한 결과이다.
도 6은 야생형(WT) 및 알츠하이머 동물모델인 Psen2 N141I KI/+ 마우스(KI/+)에서 유래된 미세아교세포에 LPS와 디다노신의 처리에 따라 염증성 인자인 IL-6의 분비량을 측정한 결과이다.
도 7은 야생형(WT) 및 알츠하이머 동물모델인 Psen2 N141I KI/+ 마우스(KI/+)에서 유래된 미세아교세포의 저하된 아밀로이드 베타 분해능력을, 디다노신이 회복시키는 것을 확인한 도면이다.
도 8은 야생형(WT) 및 알츠하이머 동물모델인 Psen2 N141I KI/+ 마우스(KI/+) 에서 신경염증에 의해 과분비된 IL-6 양을 현저히 감소하는 것을 확인한 도면이다.
도 9a는 디다노신 투여가 운동성에 영향을 주지 않음을 확인한 도면이다.
도 9b는 디다노신이 기억 능력 저하를 회복하는 효과를 가지는 것을 확인한 도면이다.
도 10은 디다노신이 LPS에 의해 신경염증이 유발된 Psen2 N141I KI/+ 마우스 유래 미세아교세포의 증가된 IL-6 분비량을 감소하는 효과를 가지는 것을 확인한 도면이다.
도 11a는 디다노신 투여가 야생형 마우스 및 5XFAD 질환 동물모델에서 운동성에 영향을 주지 않음을 확인한 도면이다.
도 11b는 디다노신이 5XFAD 질환 동물모델에서 기억 능력 저하를 회복하는 효과를 가지는 것을 확인한 도면이다.
도 12는 디다노신이 5XFAD 질환 동물모델에서 뇌의 염증을 회복하는 효과를 가지는 것을 확인한 도면이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 질환 동물모델의 제조
동물의 관리 및 사용에 대한 모든 절차는 동물관리기관(Institutional Animal care) 및 DGIST 사용위원회(Use Committee of DGIST)의 승인을 받아 진행하였다. 동물은 DGIST 동물시설(DGIST animal facility)에서 12시간의 명주기, 12시간의 암주기 하에 무균환경에서 유지되었다.
인간 신경 염증성 질환, 예를 들면 알츠하이머 질환을 보다 정확하게 재현하고, 내인성 발현 수준을 유지하기 위해 이형접합 Psen2 N141I/+ (KI/+) 마우스를 사용하였다. Psen2 N141I/+ 마우스는 상동재조합을 사용하여 생성되었다.
구체적으로, 가족성 알츠하이머 돌연변이 중 하나로서 presenilin 2 유전자의 141번 아미노산 N(아르기닌)이 I(아이소류신)으로 치환된 Psen2 N141I knock-in (KI) 동물모델을 제작하였다. 표적화 벡터는 엑손 4 부위의 I141 돌연변이 및 Neo r -loxp 서열을 포함한다. 표적화 벡터의 상동성 부위는 야생형(WT) 대립유전자의 Psen2에 삽입되었다. Psen2 N141I/N141I ;loxp-Neo r -loxp 마우스는 Psen2 N141I 돌연변이 knock-in 마우스 모델을 생성하기 위해 Cre-loxp 시스템을 사용하여 Cre 마우스와 교배되었다.
본 실시예에서 “Psen2 N141I”이란 동물모델의 정상 Psen2 유전자를 인간에서 보고된 치매 돌연변이와 동일한 변이를 발현하도록 치환한 것을 의미하며, 보다 구체적으로는 마우스 Presenilin 2 유전자의 141번 아미노산이 N에서 I로 치환된 것을 의미한다. 본 발명에서 Psen2 N141I 유전자로서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 사용하며, 야생형 Psen2 유전자는 서열번호 2에 나타낸다.
도 1a와 같이 Psen2 N141I 대립유전자 (Psen2 N141I/+ and Psen2 N141I/N141I)를 보유한 KI 마우스를 생성하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, AAC 서열로 이루어지는 Asparagine (N)에서 AAC과 ATC로의 치환은 Asparagine (N)과 Isoleucine (I)를 모두 가지는 KI/+ 모델, 모두 ATC로 치환된 I141을 가지는 KI/KI 모델을 마우스의 꼬리에서 추출한 DNA의 게놈 서열분석을 통해 확인하였다.
실시예 2. LPS에 의한 질환 동물모델의 염증유발
본 실시예는 Psen2 N141I 변이 알츠하이머 질병 마우스 모델이 정상(야생형) 마우스에 비해 과도하게 염증반응을 일으킨다는 것을 확인하기 위해 수행하였다.
2-1. 염증유발 LPS 농도 분석
Psen2 N141I/+ 마우스에서 파생된 미세아교세포의 면역 반응이 악화됨에 따라 동물이 염증 및 인지 기능저하를 나타내는 경향이 있음을 확인하기 위하여, 다양한 LPS 농도로 야생형 및 Psen2 N141I/+ 마우스 간의 면역 반응을 비교하였다.
마우스의 면역반응은 활동이 시작될 무렵부터 몇 시간 내에 최고조에 달하는 경향을 나타내는 바, 8주령의 야생형 및 Psen2 N141I/+ 마우스에 18:00시 기준으로 LPS를 복강 내(i.p.) 주입하고(Zeitgeber 시간 11:00, 07:00에 점등, 19:00에 소등) 20시간 후 다음날 14:00시에 염증반응을 모니터링하였다. LPS는 Escherichia coli 0111:B4 strain에서 얻은 것으로, 톨 유사 수용체 4의 리간드로 작용하여 세포의 면역반응을 유도한다. Phosphate-buffered saline (PBS)에 농도에 맞춰 희석한 LPS를 100 ㎕씩 마우스 복강 내에 주입했다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 얻은 Psen2 N141I 변이 알츠하이머 질병 마우스 모델에 1.4, 3.6, 4.0, 25, 및 5,000 ㎍/kg 농도의 LPS 복강 주사에 의하여 신경염증을 유도하였다.
대조 실험으로서, 상기 알츠하이머 질병 마우스 모델을 대신하여, 야생형 마우스 모델을 사용하여 동일하게 LPS를 주입하여 신경 염증 유발 시험을 수행하였다. 또한, 대조 실험으로서 LPS를 주입하지 않는 야생형 마우스와 Psen2 N141I 변이 알츠하이머 질병 마우스 모델을 준비하였다. 따라서, 그룹 1은 LPS를 주입하지 않는 야생형 마우스(WT(LPS(-))), 그룹 2는 다양한 LPS를 투입한 야생형 마우스(WT(LPS(+))), 그룹 3은 LPS를 주입하지 않는 알츠하이머 질병 마우스 모델(KI/+(LPS(-))), 그룹 4는 다양한 LPS를 투입한 알츠하이머 질병 마우스 모델(KI/+(LPS(+)))을 준비하였다. 1개 그룹 당 마우스는 각각 5~8 마리를 사용하였다.
다양한 농도의 LPS 주입에 따른 신경염증을 조사하고자, 상기 LPS를 주입하고 약 20시간이 경과한 후에, 그룹 2의 야생형 마우스 및 그룹 4의 알츠하이머 질병 마우스 모델의 볼 정맥에서 혈액을 추출하고, 원심 분리를 통해 얻은 혈청에서 각각 IL-6, TNFα, CCL2, CXCL1, CCL5용 ELISA 키트 (R&D Systems)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 각 단백질량을 ELISA 방법으로 측정하였다. 또한, 그룹 1의 LPS를 주입하지 않는 야생형 마우스와 그룹 3의 Psen2 N141I 변이 알츠하이머 질병 마우스 모델에서 동일하게 혈청을 추출하고 키트 제조사의 지침에 따라 각 단백질량을 ELISA 방법으로 측정하였다.
상기 그룹 1 내지 그룹 4의 마우스의 혈청에서 분석한 IL-6과 TNF-α농도를 하기 표 1에 나타낸다.
LPS 처리용량(㎍/kg) 1.4 3.6 4.0 25 5000
그룹1- WT(LPS(-)) IL-6 (pg/mL) 55.983±5.891 6.167±2.833 26.815±6.121 152.718
±7.843		 47.066±4.710
TNF-α (pg/mL) 57.129±15.581 51.606±16.486 13.801±6.203 7.112±2.436 59.262±18.848
그룹2- WT(LPS(+)) IL-6 (pg/mL) 135.414±12.377 435.609±58.851 589.102±31.891 2186.084
±152.786		 3362.240±261.326
TNF-α (pg/mL) 95.940±15.385 212.951±57.449 127.232±32.518 844.100±52.867 1549.235±124.825
그룹3- KI/+(LPS(-)) IL-6 (pg/mL) 65.998±13.677 6.167± 2.833 14.302±5.915 180.661±7.031 54.023
±6.36
TNF-α (pg/mL) 35.391±13.406 21.775±9.850 19.633±6.349 9.389±2.097 88.176±18.527
그룹4- KI/+(LPS(+)) IL-6 (pg/mL) 260.651±28.433 858.809±45.574 884.273±27.475 3180.879
±95.747		 4596.187
±136.528
TNF-α (pg/mL) 93.490±24.912 218.504±666.226 157.121±13.298 874.443±65.026 1736.561±19.360
표 1은 각 그룹에서 L-6과 TNF-α의 혈중 농도의 평균값 (mean ± SEM)을 나타낸다. LPS 주입한 그룹 2의 야생형 마우스 및 그룹 4의 알츠하이머 질병 마우스 모델에서 다양한 농도의 LPS 복강 주사에 의해서 IL-6는 모두 과발현 되며, 야생형 마우스와 알츠하이머 질병 마우스 모델의 발현 차이는 낮은 농도에서 점점 벌어진다. LPS에 의해 TNF-α는 야생형 마우스와 알츠하이머 질병 마우스 모델 간에 동일한 혈중 농도를 나타낸다. 그룹 1의 LPS를 주입하지 않는 야생형 마우스와 그룹 3의 Psen2 N141I 변이 알츠하이머 질병 마우스 모델에서는 IL-6와 TNF-a 모두 분비량이 매우 적으며 동일하다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 야생형 마우스와 비교하여 KI/+ 알츠하이머 질병 마우스는 테스트된 모든 LPS 용량에서 IL-6의 순환 수준이 높았으며 유전자형 간의 차이는 낮은 용량에서 더 두드러지게 나타나는 것을 확인하였으며, 도 2b에 나타난 바와 같이, TNF-α의 혈중 농도는 모든 용량에서 유전자형 간에 동일하게 나타나는 것을 확인하였다.
2-2. 낮은 농도의 LPS 처리에 의한 질병동물의 염증유발
상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 그룹 1 내지 그룹 4의 동물을 준비하였으며, 다만 그룹 2 및 그룹 4에서는 다양한 농도의 LPS 처리를 대신하여, 야생형 마우스에서는 염증반응을 일으키지 않는 낮은 농도의 LPS(0.35 μg/kg)를 사용하였다.
마우스 모델에서 동일하게 혈청을 추출하고 키트 제조사의 지침에 따라 각 단백질량을 ELISA 방법으로 측정하였다. 상기 그룹 1 내지 그룹 4의 마우스의 혈청에서 분석한 염증성 사이토카인들인 IL-6, CXCL1, CCL2, CCL5의 혈중농도를 하기 표 2에 나타낸다.
염증성 사이토카인 분비 IL-6
(pg/mL)		 CXCL1
(pg/mL)		 CCL2
(pg/mL)		 CCL5
(pg/mL)		 TNF-α
(pg/mL)
그룹1- WT(LPS(-)) 59.231±11.121 290.073±47.194 49.908±14.051 81.978±13.271 65.792±9.335
그룹2- WT(LPS(+)) 60.385±8.520 298.861±27.363 63.494±17.542 108.104±24.672 58.332±7.341
그룹3- KI/+(LPS(-)) 47.048±11.825 252.408±38.448 66.926±24.473 99.095±28.489 64.929±3.615
그룹4- KI/+(LPS(+)) 190.945±28.265 447.010±13.464 263.378±15.024 244.741±36.921 69.896±7.249
상기 표 2에 염증성 사이토카인들인 IL-6, CXCL1, CCL2, CCL5의 혈중농도의 변화 (mean ± SEM)를 나타낸다. 그룹 2에서 야생형 마우스에서는 염증반응을 일으키지 않는 낮은 농도의 LPS(0.35 μg/kg)를 주사했을 때 그룹 4의 Psen2 알츠하이머 질병 마우스에서만 TNF-α와 달리 염증성 사이토카인들이 현저하게 증가함을 확인하였다.
도 2c에 나타낸 바와 같이, 가장 낮은 LPS용량　(0.35 μg/체중 kg)은 야생형 마우스에서 염증을 일으키지 않았지만 Psen2 알츠하이머 질병 마우스에서 염증성 사이토카인들의 (IL-6, CXCL1, CCL2 그리고 CCL5) 혈중 농도가 현저하게 증가함을 보여준다.
실시예 3: 미세아교세포 형태 분석을 이용한 신경 염증 동물모델의 염증 악화 확인
미세아교세포의 형태는 그 기능과 밀접한 관련이 있으며, 미세아교세포의 활성화는 모양 변화와 연관되는 것을 특징으로 하며, 염증성 사이토카인의 증가된 생산이 미세아교세포의 형태에 반영되는지 여부를 확인하기 위해, 면역 조직화학분석을 통해, 미세아교세포 특이적 마커인 Iba-1에 대항되는 항체를 사용하여 야생형 및 Psen2 변이 알츠하이머 질병 마우스의 해마에서 미세아교세포의 모양을 조사하였다.
상기 실시예 2-2에서 준비된 그룹 1 내지 그룹 4의 마우스에 대해 면역 조직화학분석 및 공초점 분석을 수행하였다. 상기 그룹 2 및 그룹 4에 주입된 LPS 농도는 야생형 마우스에서 염증반응을 일으키지 않는 낮은 농도의 LPS(0.35 μg/kg)를 사용한 것이다.
면역 조직화학분석은 구체적으로, 마우스는 졸레틸(Virbac, 50mg/kg)과 럼푼(Bayer, 10mg/kg) 혼합물을 주입하여 마취하였다. 이후 마우스에게 PBS를 관류하고, 4%의 paraformaldehyde (PFA)를 관류하여 고정하였다. 뇌를 채취해 4% PFA로 16시간 동안 고정시킨 후 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 30%의 수크로스로 옮긴 후 frozen 용액을 이용해 보관하였다. Coronal 방향으로 50 μm 두께로 슬라이스 한 뇌 시료를 95℃에서 항원 복구 (antigen retrieval) 과정을 거친 후 4℃에서 24시간 동안 3% 소 혈청 알부민이 함유된 PBS에서 IBA-1 항체 (1:250)를 처리 후 상온에서 2시간 동안 2차 항체를 처리하였다. 이미지는 LSM 7 및 LSM 700 공초점 레이저 스캔 현미경을 이용하였다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 그룹 1의 야생형 마우스의 해마에 있는 미세아교세포는 고도로 분파된 과정을 가진 작은 세포체를 가지고 있으며, 사이토카인 방출 유도가 없는 것과 일치하여 저용량의 LPS는 그룹 2의 야생형 마우스 해마의 미세아교세포의 형태를 변경하지 않은 반면, LPS 주입이 없는 경우에도 그룹 3의 Psen2 변이 알츠하이머 질병 마우스의 해마 미세아교세포는 더 짧은 둥근 모양의 확대된 체세포를 보였으며, 이러한 형태학적 특징은 그룹 4에서 LPS 주입에 의해 더욱 증가되는 것을 확인하였다.
도 3b에 나타낸 바와 같이 그룹 1 내지 그룹 4의 마우스 해마의 미세아교세포의 조직학적 공초점 이미지를 3D 형태로 재구성하고 IMARIS 소프트웨어를 사용하여 다양한 형태학적 매개변수를 측정하였다. 구체적으로, 공초점 현미경으로 무작위로 선택된 필드의 전체 Z축을 합쳐 이미지를 얻은 후 IMARIS 소프트웨어(v9.2.1, bitplane AG)를 사용하여 3D 이미징화하였다.
IMARIS 분석 Dendrite 길이 (㎛) Dendrite 가지 수
그룹1- WT(LPS(-)) 679.113±38.931 88.226±16.285
그룹2- WT(LPS(+)) 774.000±38.151 81.161±13.253
그룹3- KI/+(LPS(-)) 531.981±31.526 44.645±3.416
그룹4- KI/+(LPS(+)) 420.806±21.694 35.871±2.186
상기 표 3에 dendrite 길이, dendrite 가지 수의 정량값 (mean ± SEM)을 정리하였다.
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 각 미세아교세포의 총 수상 돌기 길이와 수상 돌기 말단 지점은 그룹 1과 2의 야생형 마우스에 비하여 그룹 3과 4의 알츠하이머 질병 마우스 및 LPS 주입에 의해 훨씬 더 감소되는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 형태학에 기초하였을 때 미세아교세포 활성화는 Psen2 변이 알츠하이머 질병 마우스에서 분명하게 나타나고 가벼운 LPS 주입에 의해 추가로 유도됨을 확인하였다.
실시예 4. 신경 염증 동물모델의 기억력 감퇴 확인
4-1. Y-maze 분석
상기 실시예 2-2에서 준비된 그룹 1 내지 그룹 4의 마우스의 공간 학습능력 및 기억 능력을 검사하기 위해 LPS 주입 20시간 후 Y-maze 테스트를 수행하였다. 상기 그룹 2 및 그룹 4에 주입된 LPS 농도는 야생형 마우스에서 염증반응을 일으키지 않는 낮은 농도의 LPS(0.35 μg/kg)를 사용한 것이다.
구체적으로, Y-maze는 공간 작업 기억능력를 평가하는 데 사용된다. Y자 모양의 미로의 흰색 플라스틱 팔에서 수행하며, 쥐를 팔(arm)에 넣고 5분 동안 자유롭게 팔을 탐색할 수 있게 했다. 실험은 EthoVision 소프트웨어(Noldus)로 기록되었다. 엔트리의 수와 트라이어드 수를 분석하여 3개의 연속 엔트리의 수를 가능한 트라이어드 수 × 100(총 암 엔트리 - 2)로 나누어 교대 비율 (alternation)을 계산하였다.
Y-maze 교대 비율 (Alternation) 팔 엔트리 수
그룹1- WT(LPS(-)) 65.120±4.161 16.769±1.574
그룹2- WT(LPS(+)) 66.124±4.441 14.923±1.129
그룹3- KI/+(LPS(-)) 61.475±4.855 15.417±1.209
그룹4- KI/+(LPS(+)) 42.353±4.137 14.200±0.818
상기 표 4는 각 그룹의 Y-maze의 교대 비율과 팔 엔트리 수의 평균값 (mean ± SEM)을 나타낸 것이다. 그 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, Y-maze에서 팔 교대는 그룹 1의 야생형 마우스 (13마리)와 LPS를 주입한 야생형 마우스 그룹 2 (13마리) 에서는 염증성 사이토카인 분비와 비례하여 기억능력의 차이는 없다. LPS 주입 없는 그룹 1의 야생형 마우스와 그룹 3의 Psen2 변이 알츠하이머 질병 마우스 (12마리)에서도 기억 능력의 차이를 보이지 않으나, LPS를 주입한 그룹 4의 Psen2 변이 알츠하이머 질병 마우스 그룹 (15마리)에서는 유의미하게 감소하였다. 팔 엔트리 총 수는 모든 그룹에서 동일하므로 정상적인 운동 기능을 나타내는 것을 확인했다.
4-2. T-maze 분석
상기 실시예 2-2에서 준비된 그룹 1 내지 그룹 4의 마우스의 학습 기억력을 추가적으로 분석하기 위해서 LPS 주입 20시간 후 음식 보상을 통한 T-maze 테스트를 수행하였다. 상기 그룹 2 및 그룹 4에 주입된 LPS 농도는 야생형 마우스에서 염증반응을 일으키지 않는 낮은 농도의 LPS(0.35 μg/kg)를 사용한 것이다.
구체적으로, T-maze는 보상에 대한 공간 학습과 기억을 평가하는 데 사용되었다. 도 4c에서 나타낸 바와 같이, T자 모양의 미로의 흰색 플라스틱 팔에서 수행되며, 실험 전 5분 동안 마우스를 미로와 먹이 보상에 적응시키고 이어진 시행에서는 양팔에 한쪽 팔을 막고 한쪽에 보상을 주었다. 마우스는 열린 팔에 도착하여 보상을 확인하고 다음 시행에서는 이전에 닫았던 팔을 열어, 마우스를 다시 출발시켜, 새로 열린 팔을 선택한다면 보상을 확인할 수 있도록 한다. 만약 마우스가 이전에 방문한 팔을 잘못 선택했다면, 보상을 받을 수 없다. 여러 시행을 통해 올바른 팔을 방문한 시행 횟수는 전체 시행의 백분율로 계산한다.
T-maze 성공률 (%)
그룹1- WT(LPS(-)) 68.831±5.030
그룹2- WT(LPS(+)) 63.636±3.907
그룹3- KI/+(LPS(-)) 64.113±7.608
그룹4- KI/+(LPS(+)) 25.000±3.761
상기 표 5는 각 그룹의 T-maze 수행 결과 성공률의 평균값 (mean ± SEM)을 보여준다. 그 결과, 도 4d에 나타낸 바와 같이 그룹 1의 야생형 마우스 (11마리)와 LPS를 주입한 그룹 2 (11마리) 에서는 염증성 사이토카인 분비와 비례하여 학습 및 기억 능력의 차이는 없었다. LPS 주입 없는 그룹 1의 야생형 마우스와 그룹 3의 알츠하이머 질병 마우스 (10마리)에서도 학습 및 기억 능력의 차이를 보이지 않았으나, LPS를 주입한 그룹 4의 알츠하이머 질병 마우스 그룹 (10마리)에서는 유의미하게 감소하였다.
상기 결과로부터, 낮은 용량의 LPS는 면역반응의 과활성을 유도하고 Psen2 N141I KI/+ 알츠하이머 질병 마우스에서 IL-6을 포함하는 염증성 사이토카인의 과잉 생산을 통해 기억력 결핍을 유발하는 반면 동일한 용량의 LPS는 야생형 마우스에게는 무해하다는 것을 확인하였다.
실시예 5. 디다노신 처리에 따른 세포 독성 확인
5-1. 야생형 마우스 유래 미세아교세포 준비
야생형 마우스 유래 일차 배양한 미세아교세포를 얻기 위해, 1 내지 3일령의 신생 야생형 마우스로부터 뇌를 추출한 후 세포를 분리하고, 10% 열-불활성화시킨 소 태아 혈청(HI-FBS, Hyclone) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Hyclone)이 보충된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Corning)으로 배양하였다. 1차 미세아교세포는 시험관 내에서 탭핑(tapping)하여 12일에 분리되었다. 1차 미세아교세포의 순도는 미세아교세포 마커인 항-Iba-1 항체로 면역 염색하여 추정하였다.
5-2. 세포독성 확인
디다노신의 세포독성 (cytotoxicity)을 확인하기 위해 야생형(WT) 마우스의 미세아교세포에 디다노신을 1, 5, 또는 10uM 농도로 처리하여 세포 사멸율을 측정하였다. 디다노신(CCL-D1-000017-G06)은 한국 화합물 은행(Korea Chemical Bank)에서 제공받아 실험에 사용하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5-1에서 준비한 미세아교세포를 5 x 104의 밀도로 96-well plate에 시딩(seeding)하였다. 다음날 시딩한 세포에 디다노신을 0, 1, 5 또는 10 μM 농도로 12 시간 동안 처리한 후 Hoechst 33342 (Invitrogen, H3570) 및 propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich, P4170)를 공동 염색시켜 세포 사멸을 측정하였다. 염색된 세포의 이미지는 형광 현미경(Axiovert 40 CFL; Carl Zeiss)을 사용하여 캡쳐하였고 Hoechst 양성 및 PI 양성 세포는 NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계수되었다. 세포 사멸율(%)은 (PI-양성 [죽은] 세포 수 / Hoechst-양성 [총] 세포 수) × 100으로 계산하였다.
도 5 및 표 6에 나타난 바와 같이, 디다노신은 세포에 대한 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
디다노신 농도 (uM) 세포 사멸율 (%)
0 5.784 ± 0.985
1 2.026 ± 0.769
5 5.567 ± 1.694
10 5.847 ± 1.059
실시예 6. 질환 동물의 미세아교세포를 이용한 약물의 신경 염증 억제 효능
실시예 1에서 제조한 Psen2 N141I KI/+ 마우스와 야생형 마우스를 출생 후 1일 내지 3일째 되는 때에 뇌를 분리하였다. 야생형과 Psen2 N141I KI/+ 마우스 유래 1차 미세아교세포는 상기 실시예 5-1에 따라 배양하였다.
상기 준비한 미세아교세포에 디다노신을 0, 5 또는 10 μM 농도로 30분 전처리하고, Escherichia coli 0111:B4(L4391) 유래 LPS를 1 μg/mL의 농도로 추가 처리하여, 12 시간 후 배양액에 분비된 사이토카인 IL-6양을 ELISA를 통해 측정하였다. 마우스의 IL-6에 대한 ELISA 키트는 R&D system에서 구입하였으며 제조업체의 지침에 따라 배양 배지에서 사이토카인을 측정하는 데 사용하였다.
구체적으로, 일차배양한 미세아교세포에 디다노신을 처리한 그룹을 각각 하기와 같이 구분하였다.
실험군 IL-6 (pg/mL)
그룹5- WT (LPS(디다노신 0 uM)) 3424.373 ± 86.045
그룹6- WT (LPS(디다노신 5 uM)) 3099.967 ± 67.852
그룹7- WT (LPS(디다노신 10 uM)) 3009.218 ± 196.428
그룹8- KI/+ (LPS(디다노신 0 uM)) 4730.879 ± 231.776
그룹9- KI/+ (LPS(디다노신 5 uM)) 3749.965 ± 35.714
그룹10- KI/+ (LPS(디다노신 10 uM)) 3261.407 ± 156.334
표 7 및 도 6에 나타난 바와 같이, 디다노신에 의해 LPS를 처리한 Psen2 N141I KI/+ 마우스 유래 미세아교세포에서 증가되어 있는 IL-6의 분비량이 유의적으로 감소하였다.
실시예 7. 디다노신 처리에 따른, 미세아교세포에서 Psen2 N141I 변이에 의해 저하된 아밀로이드 베타 분해능 회복 효과 확인
실시예 1에서 제조한 Psen2 N141I KI/+ 마우스와 야생형 마우스를 출생 후 1일 내지 3일째 되는 때에 뇌를 분리하였다. 야생형과 Psen2 N141I KI/+ 마우스 유래 1차 미세아교세포는 상기 실시예 5-1에 따라 배양하였다. 상기 준비된 미세아교세포를 분리 및 배양하여 24-well plate에 cover glass와 함께 시딩하였다.
구체적으로, FITC 신호가 결합된 아밀로이드 베타 1-42는 하기 참조에 따라 제조하였다 (Cho, M.-H. et al. “Autophagy in microglia degrades extracellular β-amyloid fibrils and regulates the NLRP3 inflammasome.” Autophagy 10, 1761-1775 (2014)).
FITC가 접합된 아밀로이드 베타 올리고머 (oligomer)를 24 시간 동안 미디어에서 응집화 (fibrillize) 시켰다.
상기 미세아교세포에 디다노신을 10 μM 농도로 30분 전처리 후, 상기 제조된 응집된 (fibrilized) 아밀로이드 베타 1-42 (fAβ42)를 4 μM 농도로 미세아교세포의 배양액에 직접 처리하였다. 그런 후에, 응집된 아밀로이드 베타를 처리하고 2 시간 뒤 washing 과정을 거쳐 섭식되지 않고 미디어에 남아 있던 아밀로이드 베타를 제거하였다.
이후 디다노신의 지속적 처리와 함께 24 시간 후 세포 고정화를 거쳐 slide glass에 올린 다음 세포 내에 남아 있는 응집된 아밀로이드 베타양을 측정하여 분해된 정도를 비교하였다. 아밀로이드 베타의 양은 공초점 레이저 주사 현미경(LSM700)을 통해 무작위로 선택된 필드의 세포의 전체 z 축을 2 μm 간격으로 촬영하여, 세포 내 존재하는 FITC 레이블된 아밀로이드 베타 시그널의 픽셀 (pixel) 수를 ZEN (black edition; Carl Zeiss) 소프트웨어를 통해 계산하여 상대적 형광세기를 측정함으로서 정량하였다.
도 7 및 표 8에 나타난 바와 같이, 디다노신은 Psen2 N141I KI 미세아교세포에서 저하된 아밀로이드 베타 분해능력을 회복시켜 신경염증성 질환, 예를 들어 알츠하이머 병을 치료하는 효과를 나타냈다.
실험군 아밀로이드 베타 잔량 상대값
그룹11- WT (디다노신 0 uM)) 1.000 ± 0.075
그룹12- WT (디다노신 10 uM)) 0.973 ± 0.100
그룹13- KI/+ (디다노신 0 uM) 1.964 ± 0.169
그룹14- KI/+ (디다노신 10 uM) 1.353 ± 0.115
실시예 8. Psen2 N141I KI 모델 마우스 (KI/+)를 이용한 사이토카인 발현 분석
야생형 마우스(WT)와 실시예 1에서 제조한 알츠하이머 유발 Psen2 N141I KI 모델 마우스 (KI/+)에 디다노신을 5 mg/kg 농도로 복강으로 주사하고, 4시간 뒤에 LPS를 0.35 μg/kg 농도로 복강 주사하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 0.35 μg/kg 농도의 LPS는 야생형 마우스에서는 염증반응을 유도하지 않아 IL-6 사이토카인 혈중 농도를 올리지 않는, 매우 낮은 농도에 해당하였다. 반면에, Psen2 N141I KI/+ 마우스에서는 신경염증을 유도하여 IL-6의 과생성을 일으켰다. 또한, 5 mg/kg 농도의 디다노신은 사람에게는 0.4 mg/kg (24 mg/60 kg) 농도에 해당하며, HIV 치료제로 처방되는 하루 250 mg 용량에 비해 약 0.1배 이하의 낮은 농도이다.
디다노신 투여 24 시간 후 마우스의 혈액을 채취하여 혈청을 분리하고 분비된 사이토카인 IL-6양을 ELISA를 통해 분석하였다. 도 8 및 표 9에 나타난 바와 같이, 디다노신은 신경염증에 의해 과분비되었던 IL-6 양을 현저하게 감소시켰다.
실험군 IL-6 (pg/mL)
그룹15- WT (LPS(디다노신 0 mg/kg)) 339.507 ± 24.022
그룹16- WT (LPS(디다노신 5 mg/kg)) 312.679 ± 68.423
그룹17- KI/+ (LPS(디다노신 0 mg/kg)) 675.229 ± 105.941
그룹18- KI/+ (LPS(디다노신 5 mg/kg)) 297.484 ± 25.155
실시예 9. Psen2 N141I KI 모델 마우스 (KI/+)를 이용한 운동성 및 기억력 평가 실험
Psen2 N141I KI/+ 질환 동물모델을 이용한 동물 실험을 수행하였다. 상기 실시예 5와 동일한 방법으로, 실시예 1에서 얻은 Psen2 N141I KI 모델 마우스 (KI/+)와 야생형 마우스에 디다노신을 투여하고, 4시간 뒤에 LPS를 0.35 μg/kg 농도로 복강 주사하였다. 도 9b 및 표 11에 나타난 바와 같이, 0.35 μg/kg 농도의 LPS는 야생형 마우스에서는 기억력 감퇴를 유도하지 않는, 매우 낮은 농도에 해당한다. 반면에, Psen2 N141I KI/+ 마우스에서는 신경염증을 유도하여 기억력 감소를 일으켰다.
운동성 평가를 위해, 디다노신 투여 24 시간 후 Open field test를 이용하여 이동 속도와 총 거리를 분석하였다. 도 9a 및 표 10에 나타난 바와 같이, 디다노신 복강 주사는 운동성에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
Open field test 이동 속도 (cm/s) 전체 이동 거리 (cm)
그룹19- WT (LPS(디다노신 0 mg/kg)) 3.09 ± 0.136 2983.939 ± 172.749
그룹20- WT (LPS(디다노신 5 mg/kg)) 3.155 ± 0.138 3354.104 ± 240.995
그룹21- KI/+ (LPS(디다노신 0 mg/kg)) 3.019 ± 0.178 3050.195 ± 213.565
그룹22- KI/+ (LPS(디다노신 5 mg/kg)) 3.410 ± 0.138 3549.364 ± 215.031
기억력 회복 평가를 위해, 디다노신 투여 24 시간 후 Y-maze 분석을 통해 공간 기억 능력을 평가하였다. 구체적으로, Y-모양 미로를 이용하여 마우스를 가까운 팔 (maze arm)에 넣고 5 분 동안 자유롭게 돌아다니도록 했다. Y-모양의 각 팔을 A, B, 그리고 C로 명명하고, 마우스가 들어가는 팔의 이름을 기재하였다. 기록하는 동안 마우스가 가지 않았던 새로운 팔에 들어가는 횟수를 다음과 같이 계산하여 분석했다. Alternation (%) = (세번의 연속된 다른 시도 (arm) / (총 시도 (entry) 수-2)) X 100 으로 계산하였다. 팔에 들어가는 총 시도수 (Number of enters)는 동일하다는 것을 통해 운동성은 각 그룹마다 동일하다는 것을 확인하였다.
도 9b 및 표 11에 나타난 바와 같이, 디다노신은 알츠하이머 유발 Psen2 N141I KI 모델 마우스의 기억능력 저하를 야생형 마우스의 기억력 수준으로 회복시켰다. 구체적으로, 실시예 4-1에서 확인한 바와 같이, 낮은 농도의 LPS는 정상군에서는 기억력 감소를 유발하지 않고, 운동성에도 영향을 주지 않아서, LPS를 투여한 정상군은 LPS를 투여하지 않은 정상군과 기억력과 운동성에 차이를 보이지 않았다. 낮은 농도의 LPS는 오직 알츠하이머 유발군에서만 기억력 감소를 유발하였다. 즉, 디다노신은 LSP를 주입한 알츠하이머 유발 Psen2 N141I KI 마우스의 감소된 기억력을, LPS를 주입하지 않은 야생형 마우스 수준으로 회복하는 효과를 나타내었다.
Y- maze 교대 비율 (Alternation) 팔 엔트리 수
그룹19- WT (LPS(디다노신 0 mg/kg)) 76.261 ± 2.810 30.239 ± 4.694
그룹20- WT (LPS(디다노신 5 mg/kg)) 75.512 ± 5.919 34.707 ± 8.543
그룹21- KI/+ (LPS(디다노신 0 mg/kg)) 55.485 ± 2.942 27.000 ± 4.481
그룹22- KI/+ (LPS(디다노신 5 mg/kg)) 75.977 ± 5.160 30.545 ± 7.187
실시예 10. 질환 동물의 미세아교세포를 이용한 약물의 신경 염증 치료 효능
실시예 1에서 제조한 Psen2 N141I KI/+ 마우스와 야생형 마우스를 출생 후 1일 내지 3일째 되는 때에 뇌를 분리하였다. 야생형과 Psen2 N141I KI/+ 마우스 유래 1차 미세아교세포는 상기 실시예 5-1에 따라 배양하였다.
디다노신의 치료 효과를 관찰하기 위해, 상기 준비한 미세아교세포에 LPS를 1 μg/mL의 농도로 먼저 처리한 후 1 시간 뒤에 디다노신을 10 μM 농도로 처리하고, 11 시간 후 배양액에 분비된 사이토카인 IL-6양을 ELISA를 통해 측정하였다. 마우스의 IL-6에 대한 ELISA 키트는 R&D system에서 구입하였으며 제조업체의 지침에 따라 배양 배지에서 사이토카인을 측정하는 데 사용하였다.
일차배양한 미세아교세포에 디다노신을 처리한 그룹을 각각 하기와 같이 구분하였다. 도 10 및 표 12에 나타낸 바와 같이, LPS에 의해 신경염증이 유발된 Psen2 N141I KI/+ 마우스 유래 미세아교세포에 디다노신을 처리한 결과, 증가되어 있는 IL-6의 분비량이 유의적으로 감소하였다. 따라서, 디다노신의 신경염증 치료 효과를 확인하였다.
실험군 IL-6 (pg/mL)
그룹23- WT (LPS(디다노신 0 uM)) 2160 ± 176.635
그룹24- WT (LPS(디다노신 10 uM)) 2040 ± 164.317
그룹25- KI/+ (LPS(디다노신 0 uM)) 3607.5 ± 128.087
그룹26- KI/+ (LPS(디다노신 10 uM)) 2115 ± 151.959
실시예 11. 5xFAD 마우스 모델을 이용한 운동성 및 기억력 평가실험
알츠하이머병 연구에 이용되는 동물 모델　중 하나로서 총 5 개의 AD 관련 돌연변이가 있는 APP 및 PSEN1 유전자 (APP; Swedish (K670N/M671L), Florida (I716V), and London (V717I) mutations and PSEN1; M146L and L286V mutations)를 발현하는 5XFAD 마우스 모델을 이용하였다. Thy1 (mature 뉴런 특이적 표지) 프로모터에 의해 APP 및 PSEN1 돌연변이 유전자가 발현되며, 반접합 마우스에서도 심각한 아밀로이드 병리와 행동 결핍을 보인다. (Jawhar S. et al. “Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Aβ aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease.”　Neurobiology of Aging 196. e29-40 (2012))
노화된 6개월 5xFAD 마우스 및 야생형 마우스에 디다노신을 0.5mg/kg/day 농도로 복강으로 1주일에 5일 연속으로 총 4주 주사하였다. 0.5 mg/kg 농도의 디다노신은 사람에게는 0.04 mg/kg (2.4 mg/60 kg) 농도에 해당하며, HIV 치료제로 처방되는 하루 250 mg 용량에 비해 약 0.01배 이하의 낮은 농도이다.
운동성 평가를 위해, 실시에 9와 동일한 방법으로 디다노신 투여 후 Open field test를 이용하여 이동 속도와 총 거리를 분석하였다. 도 11a 및 표 13에 나타난 바와 같이, 디다노신 복강 주사는 운동성에 영향을 주지 않았다.
Open field test 이동 속도 (cm/s) 전체 이동 거리 (cm)
그룹27- WT (디다노신 0 mg/kg/day) 3.118 ± 0.197 2841.843 ± 445.852
그룹28- WT (디다노신 0.5 mg/kg/day) 3.616 ± 0.154 3253.840 ± 138.739
그룹29- 5 x FAD (디다노신 0 mg/kg/day) 3.464 ± 0.335 3855.947 ± 187.071
그룹30- 5 x FAD(디다노신 0.5 mg/kg/day) 3.607 ± 0.525 3212.850 ± 438.732
기억력 회복 평가를 위해, 디다노신 투여 후 실시예 9와 동일한 방법으로 기억력 회복 효과를 평가하였다. 도 11b 및 표 14에 나타난 바와 같이, 5XFAD (6개월) 알츠하이머 모델 마우스에서 유도된 기억능력 저하가 디다노신에 의해 회복된 것을 확인하였다.
Y- maze 교대 비율 (Alternation) 팔 엔트리 수
그룹27- WT (디다노신 0 mg/kg/day) 72.333 ± 3.180 15.667 ± 1.667
그룹28- WT (디다노신 0.5 mg/kg/day) 76.667 ± 6.489 20.333 ± 0.333
그룹29- 5xFAD (디다노신 0 mg/kg/day) 40.667 ± 7.881 16.333 ± 2.333
그룹30- 5xFAD(디다노신 0.5 mg/kg/day) 68.667 ± 4.096 21.000 ± 4.359
실시예 12. 5xFAD 마우스 모델을 이용한 신경염증회복 평가
실시예 11 실험 종료 후 5xFAD 마우스의 해마 조직을 분리하여 IL-6 (Il-6)의 유전자 발현을 조사하였다. 구체적으로, Il-6 mRNA 발현수준을 qRT-PCR (Quantitative RT-PCR) 방법으로 측정하였으며, 분리한 해마 조직에서 RNA를 분리하고 ImProm-II Reverse Transcriptase kit (Promega)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 프라이머는 상업적으로 합성하였다(Cosmo Genetech). qRT-PCR은 마우스 cDNA에 특이적인 Taq Polymerase (Invitrogen) 및 하기 표 15에 개시된 프라이머를 사용하여 실시하였다. 또한, TOPrealTM qPCR 2 × PreMIX (SYBR Green with low ROX) (Enzynomics)를 사용하였고, CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)을 사용하여 모든 프라이머에 대해 50-cycle amplification을 적용하였다. Actb는 정규화를 위한 참조 유전자로 사용되었다.
Gene Gene reference number 5’- primer sequence -3’
IL-6 NM_031168.2 F CTGGATATAATCAGGAAATTTGC (서열번호 3)
R AAATCTTTTACCTCTTGGTTGA (서열번호 4)
도 12 및 표 16에 나타난 바와 같이, 5XFAD 마우스 뇌조직에서 증가되어 있는 IL-6 발현이 디다노신에 의해 감소되었으며, 디다노신이 뇌의 염증, 구체적으로 해마 조직의 염증을 회복하는 효과를 가지며, 이에 신경염증성 질환을 치료하는 효과를 확인하였다.
실험군 Il-6 mRNA 발현량 (fold)
그룹27- WT (디다노신 0 mg/kg/day) 1.000 ± 0.141
그룹28- WT (디다노신 0.5 mg/kg/day) 1.033 ± 0.124
그룹29- 5xFAD (디다노신 0 mg/kg/day) 2.104 ± 0.169
그룹30- 5xFAD (디다노신 0.5 mg/kg/day) 1.348 ± 0.255
실시예 13. 통계 분석
본원 실시예에서 데이터는 최소 3 개의 독립적인 실험을 평균 ± 평균(SEM) 값의 표준 오차로 표시하였다. 통계 분석은 unpaired student t 테스트, 일원 분산 분석(ANOVA) 또는 양방향 ANOVA에 의해 결정하였고, GraphPad Prism을 사용하여 통계적 유의성을 분석하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> OATC Inc Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology <120> Composition for preventing or treating of neuroinflammatory disease comprising didanosine <130> DPP20214936KR <150> KR 10-2020-0156060 <151> 2020-11-19 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Psen2 N141I <400> 1 atgctcgcat tcatggcctc tgacagcgag gaagaggtgt gtgatgagcg gacgtccttg 60 atgtcagccg agagccccac atctcgctcc tgccaggaag gcaggccagg cccggaggat 120 ggagagagca ctgcccagtg gaggactcag gagagcgaag aagactgtga agaggacccg 180 gaccgctacg catgcagtgg ggctcctggg cgaccgtcgg gcctggagga agagctgacc 240 ctcaagtatg gggcgaagca tgtgatcatg ctattcgtgc ctgtcacgct gtgtatgatc 300 gtggtggtgg ccactatcaa gtctgtgcgt ttctacactg agaagaacgg gcagctcatc 360 tacacgccct tcacggagga cacgccctcg gtgggccagc ggctcctcaa ctccgtgctt 420 atcaccctca tcatgatcag cgtcatcgta gtcatgacca tcttcctcgt ggtactctac 480 aagtatcgat gctacaagtt catccatggc tggctgatca tgtcctccct gatgctcctc 540 ttcttgttca cctacatcta cctcggggaa gtgctcaaga cctacaatgt ggccatggac 600 tatcccacac tcttcctggc tgtctggaac ttcggggcag tgggcatggt gtgcatccac 660 tggaaggggc ctctggtgct gcagcaggct taccttattg tgatcagcgc actcatggcc 720 ctggtgttca tcaagtacct gccggagtgg tctgcctggg tcatcttggg tgccatctct 780 gtgtacgatc tcgtggccgt gctgtgcccc aaagggccac tgaggatgct ggtggaaact 840 gcccaggaga gaaatgagcc catatttcct gccctgatat actcatctgc catggtgtgg 900 acggtgggca tggcaaagct ggacccctcc tctcaaggag cgctgcagct cccctatgac 960 ccagagatgg aagaagactc ctacgacagt tttggagaac cctcataccc tgaagccttc 1020 gaagcccccc tgcctggcta cccaggggag gagctggagg aggaggagga aaggggcgtg 1080 aagctcggcc tgggagactt catcttctac agcgtcctgg tgggcaaggc tgcagccact 1140 ggcaacggag actggaacac tacgctggcc tgttttatcg ccatcctcat tggcttgtgt 1200 ctcaccctcc tgctgcttgc tgtgttcaag aaggctctgc ccgccctccc catctccatc 1260 acctttggac tcatcttcta cttctccaca gacaacctgg tgcgcccttt catggacact 1320 ctggcctccc accagctcta catctga 1347 <210> 2 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Psen2 wild type <400> 2 atgctcgcat tcatggcctc tgacagcgag gaagaggtgt gtgatgagcg gacgtccttg 60 atgtcagccg agagccccac atctcgctcc tgccaggaag gcaggccagg cccggaggat 120 ggagagagca ctgcccagtg gaggactcag gagagcgaag aagactgtga agaggacccg 180 gaccgctacg catgcagtgg ggctcctggg cgaccgtcgg gcctggagga agagctgacc 240 ctcaagtatg gggcgaagca tgtgatcatg ctattcgtgc ctgtcacgct gtgtatgatc 300 gtggtggtgg ccactatcaa gtctgtgcgt ttctacactg agaagaacgg gcagctcatc 360 tacacgccct tcacggagga cacgccctcg gtgggccagc ggctcctcaa ctccgtgctt 420 atcaccctca tcatgatcag cgtcatcgta gtcatgacca tcttcctcgt ggtactctac 480 aagtatcgat gctacaagtt catccatggc tggctgatca tgtcctccct gatgctcctc 540 ttcttgttca cctacatcta cctcggggaa gtgctcaaga cctacaatgt ggccatggac 600 tatcccacac tcttcctggc tgtctggaac ttcggggcag tgggcatggt gtgcatccac 660 tggaaggggc ctctggtgct gcagcaggct taccttattg tgatcagcgc actcatggcc 720 ctggtgttca tcaagtacct gccggagtgg tctgcctggg tcatcttggg tgccatctct 780 gtgtacgatc tcgtggccgt gctgtgcccc aaagggccac tgaggatgct ggtggaaact 840 gcccaggaga gaaatgagcc catatttcct gccctgatat actcatctgc catggtgtgg 900 acggtgggca tggcaaagct ggacccctcc tctcaaggag cgctgcagct cccctatgac 960 ccagagatgg aagaagactc ctacgacagt tttggagaac cctcataccc tgaagccttc 1020 gaagcccccc tgcctggcta cccaggggag gagctggagg aggaggagga aaggggcgtg 1080 aagctcggcc tgggagactt catcttctac agcgtcctgg tgggcaaggc tgcagccact 1140 ggcaacggag actggaacac tacgctggcc tgttttatcg ccatcctcat tggcttgtgt 1200 ctcaccctcc tgctgcttgc tgtgttcaag aaggctctgc ccgccctccc catctccatc 1260 acctttggac tcatcttcta cttctccaca gacaacctgg tgcgcccttt catggacact 1320 ctggcctccc accagctcta catctga 1347 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(F) for IL-6 <400> 3 ctggatataa tcaggaaatt tgc 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(R) for IL-6 <400> 4 aaatctttta cctcttggtt ga 22

Claims (17)

  1. 디다노신(didanosine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 대상의 알츠하이머 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 중추신경계에서 신경염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 미세아교세포의 신경염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 미세아교세포의 아밀로이드 베타 분해 능력을 회복시키는 것인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 0.001 내지 4 mg/kg 농도의 일일 투여량으로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 0.001 내지 2.5 mg/kg 농도의 일일 투여량으로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머 병은 가족성 알츠하이머 병 (Familial Alzheimer’s Disease)인, 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머 병은 Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin 1 (PSEN1), 및 Presenilin 2 (PSEN2) 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 변이를 가지는 알츠하이머 병인, 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 Presenilin 2 유전자 변이는 PSEN2 N141I 외 A85V, N141Y, M174I, G212V, A237V, M239I 및 M239V로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머 병은 아밀로이드 베타에 의해 발생한 알츠하이머 병인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머 병은 미세아교세포의 아밀로이드 베타 분해능 저하에 의해 발생한 알츠하이머 병인, 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
KR1020210160155A 2020-11-19 2021-11-19 디다노신을 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 KR102456699B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220132676A KR20220145310A (ko) 2020-11-19 2022-10-14 디다노신을 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200156060 2020-11-19
KR20200156060 2020-11-19

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220132676A Division KR20220145310A (ko) 2020-11-19 2022-10-14 디다노신을 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220068945A KR20220068945A (ko) 2022-05-26
KR102456699B1 true KR102456699B1 (ko) 2022-10-19

Family

ID=81709504

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210160155A KR102456699B1 (ko) 2020-11-19 2021-11-19 디다노신을 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물
KR1020220132676A KR20220145310A (ko) 2020-11-19 2022-10-14 디다노신을 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220132676A KR20220145310A (ko) 2020-11-19 2022-10-14 디다노신을 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11918599B2 (ko)
EP (1) EP4289431A1 (ko)
JP (1) JP2023550749A (ko)
KR (2) KR102456699B1 (ko)
WO (1) WO2022108381A1 (ko)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1763351B9 (en) * 2004-06-28 2017-05-31 Incyte Holdings Corporation 3-aminocyclopentanecarboxamides as modulators of chemokine receptors
JP2008518935A (ja) 2004-11-01 2008-06-05 セオ ホン ユー 筋萎縮性側索硬化症の神経退行を減少させるための方法及び組成物
EP2504030A4 (en) 2009-11-24 2013-06-26 Alderbio Holdings Llc IL-6 ANTAGONISTS FOR INCREASING ALBUMIN AND / OR REDUCING CRP
CN105101963A (zh) 2013-02-12 2015-11-25 艾库里斯有限及两合公司 用于阿兹海默氏病治疗方法中的解旋酶-引发酶抑制剂
KR101478304B1 (ko) * 2013-05-13 2014-12-31 이화여자대학교 산학협력단 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
TW201815766A (zh) * 2016-09-22 2018-05-01 美商普雷辛肯公司 用於ｉｄｏ及ｔｄｏ調節之化合物及方法以及其適應症
US20210267995A1 (en) * 2018-06-20 2021-09-02 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute Anti-retroviral therapies and reverse transcriptase inhibitors for treatment of alzheimer's disease

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Zhu et al., "CXCR3 activation by lentivirus infection suppresses neuronal autophagy : neuroprotective effects of antiretroviral therapy", The FASEB Journal, Vol. 23 September 2009

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220068945A (ko) 2022-05-26
US11918599B2 (en) 2024-03-05
WO2022108381A1 (ko) 2022-05-27
US20230147946A1 (en) 2023-05-11
JP2023550749A (ja) 2023-12-05
EP4289431A1 (en) 2023-12-13
KR20220145310A (ko) 2022-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Arendash et al. Caffeine and coffee as therapeutics against Alzheimer's disease
US10966962B2 (en) Method for treating neurodegenerative diseases
Imbimbo et al. Are NSAIDs useful to treat Alzheimer's disease or mild cognitive impairment?
JP2021525284A (ja) ２，３，５−置換されたチオフェン化合物の乳癌の予防、改善または治療用途
KR102456699B1 (ko) 디다노신을 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물
JP2021105061A (ja) アミロイド線維形成の抑制又は阻害剤
JP4880477B2 (ja) 胃粘膜疾患の治療のための医薬組成物
US10034848B2 (en) Increase of protein synthesis ameliorates synaptopathy-related neurological disorders
KR102400112B1 (ko) 클로르프로마진을 포함하는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN112569217B (zh) 戊酸衍生物在治疗遗传性小脑共济失调中的应用
CN113827585B (zh) 艾地苯在治疗肢带型肌营养不良2g型中的应用
Yan et al. Deoxyschizandrin attenuates Aβ1–42-induced cognitive impairments through up-regulation of AMPA receptors in mice
KR102588274B1 (ko) D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
US20230149419A1 (en) Composition for preventing or treating neuroinflammatory diseases, comprising chlorpromazine
KR102527378B1 (ko) 2&#39;-fl을 함유하는 도파민 감소로 말미암아 발생하는 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
DE3240650A1 (de) Pharmazeutische zusammensetzung zur therapie infektionsbedingter nierensteinbildung
CN118121593A (zh) 一种用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物组合物及其用途
JP6607599B2 (ja) 筋萎縮性側索硬化症治療剤
Harland Neuronal Mitofusin 2 Modulates Neuroinflammation in Acute Systemic Inflammation and Alleviates Pathologies in a Mouse Model for Neurodegenerative Diseases
EP2044944A1 (en) Nootropic medicinal agent
JP2021158953A (ja) 神経細胞の軸索の伸展剤
Goetzl An emerging spectrum of therapeutic targets for Alzheimer's disease
KR20220083571A (ko) 알란토락톤 또는 이의 유도체를 포함하는 만성신장질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20220082750A (ko) 16-하이드록시헥사데카노익산을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 치료용 약학적 조성물
Putten The influence of low dystrophin levels on disease pathology in mouse models for Duchenne Muscular Dystrophy

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right