KR102089411B1 - 미코나졸을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents
미코나졸을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 화학식 1로 표시되는 미코나졸(Miconazole)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.
[화학식 1]
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 건강기능식품은 염증유발인자를 억제하고, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 베타-세크리테이즈 1(beta-secretase 1; BACE 1) 및 C99의 생성을 저해하여 아밀로이드-β의 축적을 억제함으로써 기억력을 향상시킨다.
따라서, 본 발명의 미코나졸(miconazole)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품은 퇴행성 중추신경계 질환, 특히 알츠하이머를 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다.
[화학식 1]
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 건강기능식품은 염증유발인자를 억제하고, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 베타-세크리테이즈 1(beta-secretase 1; BACE 1) 및 C99의 생성을 저해하여 아밀로이드-β의 축적을 억제함으로써 기억력을 향상시킨다.
따라서, 본 발명의 미코나졸(miconazole)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품은 퇴행성 중추신경계 질환, 특히 알츠하이머를 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 퇴행성 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 건강기능식품에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 미코나졸(Miconazole)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 건강기능식품에 관한 것이다.
알츠하이머 질환(Alzheimer's Disease)은 기억력, 사고력 및 행동상의 문제를 야기하는 퇴행성 중추신경계 질환 중 하나로, 치매 사례의 60-80%를 차지하는 것으로 추정되고 있다(Blennow et al., 2006, Lancet 368:387). 알츠하이머 질환은 조직병리학적으로는 뇌의 전반적인 위축, 뇌실의 확장, 신경섬유의 다발성 병터(신경섬유뒤틀림) 및 노인반(neuritic plaque)을 유발한다. 알츠하이머 질환의 발병 원인으로는 여러 가지가 보고되고 있으나, 아밀로이드-β 단백질의 축적에 의한 발명이 가장 유력한 원인으로 보고되어 있다.
아밀로이드-β 단백질의 축적은 신경 세포에 손상을 야기하며, GSK3β 효소를 활성화 시켜 기억 형성에 필요한 장기강화(Long Term Potentiation; LTP)를 방해하는 것으로 알려져 있다. 또한, 아밀로이드-β는 염증 및 세포사멸을 활성화 시켜 뉴런 항상성을 붕괴함으로써 기억을 손상시킨다.
아밀로이드-β는 아밀로이드 전구체 단백질 (amyloid precursor protein; APP)로부터 생성된다. 그 생성 기전은 APP 특이 절단효소인 베타 세크레타아제 (beta-secretase) 및 감마 세크레타아제 (gamma-secretase) 의 활성화에 의해 APP가 아밀로이드-β 로 생성되는 것이다.
반면, 알파 세크레타아제 (alpha-secretase) 가 활성화되는 경우는 아밀로이드-β 의 중간을 자르기 때문에 베타 아밀로이드의 생성이 억제된다. 이런 기전에 기초하여 알파 세크레타아제의 활성제나 베타 및 감마 세크레타아제의 억제제들이 개발되어왔으나, 여러 부작용 등으로 정식 승인된 약물은 없는 것이 현실이다.
현재 알츠하이머병의 치료는 콜린에스테르 가수분해효소(cholinesterase) 저해제나 글루타메이트(glutamate) 억제제들이 임상에서 사용되고 있으나, 증상만 치료될 뿐 근본적인 치료는 되지 않는 것으로 판단되고 있다.
미코나졸(Miconazole)은 백색결정 분말의 이미다졸유도체로서, 화학명은 1-[2,4-dichloro-β-(2,4-dichlo-robenzyloxy)-phenethyl]imidazole nitrate이며, 화학식은 C18H14Cl4N2O 이다. 현재, 통상 1% 크림제가 백선과 기타 피부진균증의 국소치료제로 사용된다. 또한 이 제품의 유리염기는 독성이 낮고 점적(點適)정맥내 투여(한 번에 200~600mg, 8시간 주기)로 여러 가지 심재성 진균증의 치료에 유효하다고 알려져 있다.
미코나졸(Miconazole)을 항진균제로서 이용하는 특허가 존재한다. 구체적으로, 한국 등록특허 제10-1045867호는 미코나졸(Miconazole) 또는 그의 염을 항진균제 및 항세균제로서 포함하는 조성물에 대하여 개시되어 있다. 그러나, 상기 미코나졸의 퇴행성 중추신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 용도에 대해서는 개시된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 미코나졸(Miconazole)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 경우, 염증유발인자를 억제하고, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 베타-세크리테이즈 1(beta-secretase 1; BACE 1) 및 C99의 생성을 저해하여 아밀로이드-β의 축적을 억제함으로써 기억력을 향상시키므로, 퇴행성 중추신경계 질환, 특히 알츠하이머를 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 염증유발인자를 억제하고, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 베타-세크리테이즈 1(beta-secretase 1; BACE 1) 및 C99의 생성을 저해하여 아밀로이드-β의 축적을 억제함으로써 기억력을 향상시켜, 퇴행성 중추신경계 질환, 특히 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 미코나졸(miconazole)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 중추신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 미코나졸(Miconazole)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 약학적 조성물은 미코나졸(Miconazole)을 0.1 ~ 600mg/Kg 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 미코나졸(Miconazole)은 염증유발인자인 NO, iNOS 및 COX-2를 억제하는 것을 특징으로 한다.
*본 발명의 일 실험예에 따르면, 미코나졸(Miconazole)을 처리한 군에서 NO, iNOS, COX-2, IL-1β 및 IL-6의 발현 레벨이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 미코나졸(Miconazole)이 아밀로이드-β에 의한 염증 생성을 억제하여 뉴런 항상성을 유지시킴으로써, 신경 세포의 손상을 막아 결론적으로는 퇴행성 중추신경계 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 시사한다(도 6 내지 9, 도 11 내지 13 참조).
*본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 미코나졸(Miconazole)은 아밀로이드-β의 축적을 억제하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 아밀로이드-β의 축적은 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 베타-세크리테이즈 1(beta-secretase 1; BACE 1) 및 C99의 생성을 저해함으로써 억제되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 미코나졸(Miconazole)을 처리한 군에서 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 베타-세크리테이즈 1(beta-secretase 1; BACE 1) 및 C99의 생성이 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 아밀로이드-β 및 β-secretase 레벨을 조직학적으로 분석한 결과, 미코나졸(Miconazole)을 처리한 군에서 Aβ 및 β-secretase의 축적이 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 미코나졸(Miconazole)이 아밀로이드-β의 축적을 억제함으로써 신경 세포에 손상 및 기억 형성에 필요한 장기강화(Long Term Potentiation; LTP) 억제를 막을 수 있으며, 결론적으로는 퇴행성 중추신경계 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 시사한다(도 8 및 도 9, 도 14 및 15, 도 18 및 19 참조)
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 퇴행성 중추신경계 질환은 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease) 및 허혈성 뇌질환(Ischemia)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 알츠하이머인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여, 비강 투여 등으로 투여할 수 있다. 가장 바람직하게는 비강 투여(nasal administration)로 투여 된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 미코나졸(Miconazole)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 중추신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품에 있어서, 미코나졸(Miconazole)을 0.1~ 600mg/Kg 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 건강기능식품은 이는 캡슐, 정제, 분말, 액상 현탁액, 환제 및 과립제 등으로 제형화하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 미코나졸(Miconazole)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품은 염증유발인자를 억제하고, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 베타-세크리테이즈 1(beta-secretase 1; BACE 1) 및 C99의 생성을 저해하여 아밀로이드-β의 축적을 억제함으로써 기억력을 향상시키며, 이에 따라 본 발명의 미코나졸(Miconazole)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품은 퇴행성 중추신경계 질환, 특히 알츠하이머를 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다.
도 1은 실험예 1 및 2의 테스트 단계를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실험예 1에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실험예 2에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실험예 3에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실험예 4에 따른 세포독성 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실험예 4에 따른 H2O2의 측정 결과를 나타내는 도면이다 (성상세포(astrocyte)).
도 7은 본 발명의 실험예 4에 따른 NO 및 H2O2의 측정 결과를 나타내는 도면이다(BV-2 미세아교세포(microglial)).
도 8을 본 발명의 실험예 5에 따른 결과를 나타내는 도면이다(성상세포(astrocyte)).
도 9는 본 발명의 실험예 5에 따른 결과를 나타내는 도면이다(BV-2 미세아교세포(microglial)).
도 10은 본 발명의 실험예 5에 따른 결과를 나타내는 도면이다(in vivo).
도 11 내지 13은 본 발명의 실험예 6에 따른 결과를 나타내는 도면이다(도 10: 미세아교세포(microglial), 도 11: 성상세포(astrocyte), 도 12: in vivo).
도 14는 본원발명 실험예 7에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 본원발명 실험예 8에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 16 및 도 17은 실험예 9에 따른 결과를 나타내는 도면이다(도 16: Aβ, 도 17: β-secretase).
도 2는 본 발명의 실험예 1에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실험예 2에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실험예 3에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실험예 4에 따른 세포독성 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실험예 4에 따른 H2O2의 측정 결과를 나타내는 도면이다 (성상세포(astrocyte)).
도 7은 본 발명의 실험예 4에 따른 NO 및 H2O2의 측정 결과를 나타내는 도면이다(BV-2 미세아교세포(microglial)).
도 8을 본 발명의 실험예 5에 따른 결과를 나타내는 도면이다(성상세포(astrocyte)).
도 9는 본 발명의 실험예 5에 따른 결과를 나타내는 도면이다(BV-2 미세아교세포(microglial)).
도 10은 본 발명의 실험예 5에 따른 결과를 나타내는 도면이다(in vivo).
도 11 내지 13은 본 발명의 실험예 6에 따른 결과를 나타내는 도면이다(도 10: 미세아교세포(microglial), 도 11: 성상세포(astrocyte), 도 12: in vivo).
도 14는 본원발명 실험예 7에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 본원발명 실험예 8에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 16 및 도 17은 실험예 9에 따른 결과를 나타내는 도면이다(도 16: Aβ, 도 17: β-secretase).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
<실험동물>
DBL (Daejeon, South Korea)로부터 구매한 8주된 C57BL6/N 마우스를 사용하였다. 모든 실험 절차는 충북 대학교의 실험동물 운영위원회(IACUC)의 승인 하에 실시되었다(approval number:CBNUA-144-1001-01). 마우스들은 케이지 당 3 마리를 보관하고, 물과 음식을 자유롭게 섭취 할 수 있도록 허용하였으며, 23 ° C의 실내 온도에서 12 시간의 명암 사이클을 유지하였다. 실험은 개별 케이지에 보관 후, 최소 1 주일 후에 수행하였다.
미코나졸(miconazole) 은 Sigma사에서 구입하여 실험에 사용하였다.
<Astrocytes 및 microglial
microglial
세포의 배양>
1차 성상세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglial) 배양은 다음과 같은 방법으로 준비된다.
구체적으로, 하루 지난 마우스는 ice-anaesthetized 및 decapitated 하여 준비하였다. 그 다음 뇌를 분리한 후 PBS로 세척하고, 대뇌겉질(cerebral cortex) 은 기계적 소화에 의해 해리되었다(using the cell strainer (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)).
해리된 세포를 1500 rpm, 5 min 조건으로 원심분리 하였으며, serum-supplemented 배양액(DMEM supplementedwith F12, FBS (5%), Antibiotic-Antimycotic (Gibco, Rockville, MD 100 μg/ml))에서 재부유(resuspend) 시킨다. 그 다음, T75flask에서 배양하였다.
상기 플라스크에 배양된 세포는 배양액에서 37 °C 및 5% CO2의 조건에서 9일동안 정치(incubate) 시켰다.
정치 시킨 지 9일째에 플라스크를 37 ℃에서 16 시간 동안 진탕 시켰다. 그 다음, 배양물에 48시간 동안 시토신아라비노시드(cytosine arabinoside)를 처리한 다음, 배양액을 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12HAM로 교체하였다.
배양된 세포는 LPS (1 μg/ml) 및 DMSO에 농도 별로 용해된 Miconazole (1.25 2.5 5 10 μM)를 동시에 처리하였다. 세포는 상기 처리 24시간 후에 수득하였다.
수득한 세포는 웨스턴 블럿팅, Nitric oxide 및 Cell viability를 확인하는데 이용하였다.
<실험예> 행동기능검사(Behavioral test)
실험예 1: 수중 미로 테스트
LPS에 의한 기억 손상 모델에서 미코나졸(miconazole)에 의한 기억력 향상 효과를 조사하기 위해, 마우스에 0.25 mg/kg/일 용량의 LPS를 먼저 복강투여하고 두시간 뒤에 40mg/kg/일 용량의 미코나졸(miconazole)을 7일간 매일 복강으로 투여하였다.
기억력 증진 효과를 보기 위해 모리스 수중 미로 (Morris water maze) 시험을 통해 탈출 지연 시간과 거리 측정을 실시하였다. 모든 마우스들은 7일 동안 하루에 세 번씩 시험을 받았다.
모리스(Morris) 수중미로실험은 인지 기능을 시험하기 위해 종래에 널리 사용되어온 방법이다. 구체적으로, 원형 플라스틱 풀 (높이 35cm, 직경 100cm)에 22-25 ℃로 유지된 물 (백색 염료)을 채운다. 탈출 플랫폼(높이 14.5cm, 직경 4.5cm)은 물 표면 아래 1 내지 1.5cm에 잠겨 있다. 이 검사는 5일 동안 하루에 3회 실시하였다.
획득 단계 (1 내지 5 일) 동안 무작위로 3개의 출발 지점을 이용하였으며, 탈출 플랫폼의 위치는 일정하게 유지시킨다. 각 실험은 60초 동안 지속되거나 생쥐가 잠수 플랫폼에 도달하자 마자 종료시켰다.
각 마우스의 수영 패턴을 모니터하고 수영장 중심 위에 설치된 카메라로 기록하고 탈출 대기 시간, 탈출 거리 및 수영 속도를 SMART-LD 프로그램 (Panlab, Spain)으로 평가하였다. 실험 기간 동안 조용한 환경, 일정한 수온을 유지하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 대조군 마우스(control)는 시험이 진행될수록 훈련되어 짧은 이동 거리와 시간을 나타낸다. LPS가 처리 된 마우스군(LPS+saline)은 시간이 지날수록 탈출하는데 걸리는 시간 및 거리가 대조군에 비해 더디게 줄어들었으며, 이는 대조군에 비해 메모리 손상을 입었음을 보여준다.
이에 반해, 본 발명의 실시예에 의하여 미코나졸(Miconazole)이 처리된 마우스군(LPS+miconazole)은 탈출하기까지 걸린 시간과 거리가 LPS군에 비해 개선된 효과를 나타내었다.
실험예 2: 탐침 테스트
본 발명의 실시예에 의한 미코나졸을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물에 의한 기억 강화를 평가하기 위하여, 수중미로테스트(즉, 7일) 후에 48시간 동안 탐침 테스트(프로브 테스트)를 수행하였다.
탐침 테스트를 위해 플랫폼을 풀에서 제거하고 마우스가 자유롭게 수영할 수 있도록 하였다. 각 마우스의 수영 패턴을 모니터링하고 SMART-LD 프로그램 (Panlab)을 사용하여 60 초 동안 기록 하였다. 강화된 공간 기억은 타겟으로 하는 사분면 영역에서 소요된 시간에 의해 추정하였다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이, 타겟 사분면에 소요되는 평균 시간이 대조군 마우스(control)에 비해 LPS 주입 마우스는 감소되었고(LPS+saline), 미코나졸(miconazole)을 투여하고 LPS를 투여한 군(LPS+miconazole) LPS 투여군과 유의적인 차이를 보였다
실험예 3: 수동적 회피 반응 테스트
수동 회피 반응은 "step-through" 기구 (Med Associates, USA)를 사용하여 확인하였다. 프로브 테스트 (즉, 9 일) 후 48 시간 후에, 트레이닝 시험을 수행하였다.
이를 위해, 각각의 마우스는 어두운 구획으로부터 멀리 떨어져 있는 조명이 있는 구역 내에 둔다. 그 다음, 마우스가 어두운 구획으로 완전히 이동하면 전기 충격 (0.4 mA, 3 초 지속)을 받도록 한다.
트레이닝 시험 (즉, 10 일째) 24 시간 후, 각 마우스를 조명이 있는 구획에 두고 어두운 구획에 들어갈 때까지의 잠복기를 결정하여 스텝 스루 대기 시간으로 정의 하였다. 검사를 위한 차단 시간은 180초 이다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 대조군(control)에 비해 LPS 투여군(LPS+saline)에서 회피에 대한 기억력이 감소되었고, 미코나졸(miconazole)과 LPS를 투여한 군(LPS+miconazole)에서는 대조군 수준으로 회복 되었다.
실험예 4: 세포독성 및 Nitric oxide 확인
배양된 성상세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglial)는 24-well 플라스크에서 미코나졸(miconazole) 의 다양한 농도로 처리한 또는 처리하지 않은 상태에서 LPS(1 μg/ml)를 처리 또는 처리하지 않고 정치(incubation)시켜 세포를 성장시켰다.
구체적으로, 성상세포(astrocyte)에 여러 농도 (1.25, 2.5, 5, 10 μM)의 미코나졸(miconazole)을 처리 후, 1 시간 뒤에 1 μg/ml LPS를 처리하였다. 그 다음, 24시간 뒤에 Miconazole의 독성 농도 확인하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이, 20 μM에서 독성을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 다른 농도 (1.25, 2.5, 5, 10 μM)의 미코나졸(miconazole)을 처리 후, 1 시간 뒤에 1 μg/ml LPS를 처리하였다. 그 다음, 24시간 뒤에 상층액을 이용해서 NO 및 H2O2의 level을 측정하였다.
상청액의 아질산성 질소축적은 NO 검출 키트(iNtRON, Kyungki-do, Korea)를 이용하여 측정하였다. 540nm에서 흡광도는 microplate absorbance reader를 이용하여 측정하였으며, 알려진 아질산 나트륨의 농도를 표준으로 하여 비교 측정하였다.
그 결과, 도 6에서 확인할 수 있듯이, H2O2의 경우에는 차이가 없었으며, NO의 경우에는, 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다.
미세아교세포의 Nitric oxide도 측정하였다.
구체적으로, BV-2 미세아교세포에 여러 농도 (1.25, 2.5, 5, 10 μM)의 미코나졸(miconazole)을 처리 후, 1 시간 뒤에 1 μg/ml LPS를 처리한 다음 24시간 뒤에 상층액을 이용해서 NO와 H2O2의 level을 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 도 7에서 확인할 수 있듯이 NO의 경우 농도 의존적으로 감소하는 경향이 보였지만 H2O2의 경우는 차이가 없는 것을 확인하였다.
실험예 5: 웨스턴 블럿팅
뇌 조직에서 분리된 동량의 총 단백질(40mg)을 8 % 또는 10 % 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔에서 분리 한 다음, 니트로 셀룰로스 멤브레인 (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech, USA)으로 옮겼다.
막은 anti-COX-2, anti-iba-1, anti-iNOS, anti-APP, anti-BACE1, anti-GFAP, anti-APP-C99, anti-calpain1 및 anti-β-actin (1:1000; Santa Cruz Biotechnologies Inc., CA, USA)의 특이적 항체를 처리하여 실온에서 incubation 하였다.
이어서 블롯을 peroxidase-conjugated anti-mouse, anti-rabbit antibodies 또는 anti-goat 항체(1 : 5000; Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA)를 처리하여 실온에서 2 시간 동안 항온 배양 하였다.
면역 단백질은 ECL Western blotting 검출 시스템을 이용하여 검출하였다.
그 결과, 도 8 에서 확인할 수 있듯이, 성상세포(astrocyte) 에서는 iNOS, COX-2, BACE1, APP-C99, calpain1이 농도에 따라 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 도 9의 BV-2 미세아교세포에서는 iNOS, COX-2, BACE1, APP-C99, Iba-1이 농도에 따라 감소되는 것을 확인하였다.
또한, 도 10의 in vivo에서는 LPS에 의해 증가된 iNOS, COX-2가 원래의 수준으로 감소 및 회복하는 것을 확인하였다.
실험예 6: Real-time PCR 분석
미코나졸(miconazole)의 염증 억제효과를 확인하기 위하여, 성상세포(astrocyte), 미세아교세포(microglial) 및 뇌 조직에서 iNOS, IL-1β, IL-6 및 TNF-α 발현을 Real-time PCR을 통해 확인 하였다.
구체적으로, Total RNA는 RNeasy Mini kit (Quiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 성상세포(astrocyte), 미세아교세포(microglial) 및 뇌 조직으로부터 분리하였고, first strand cDNA는 QuantTect Reverse Transcription kit (Quiagen, Germany)를 이용하여 합성하였다. Real-time PCR은 KAPA SYBR fast qPCR kit (KAPA BIosystems, Woburn, MA, USA)를 사용하였으며, 95℃에서 10분, 95℃에서 20초간 50번 반복, 55℃에서 30초, 72℃에서 20초 순서의 조건으로 수행하였다. 유전자 발현 수준은 GAPDH, β-actin 발현 수준을 표준으로 하였다. 상기 qPCR의 결과를 도 11 내지 13에 나타내었다.
도 11 내지 도 12에서 확인할 수 있듯이, 성상세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglial)에서 미코나졸(miconazole)의 농도가 증가함에 따라 iNOS 및 IL-1β의 발현이 감소하였다.
또한, 도 13에서 확인할 수 있듯이, in vivo에서는 LPS에 의해 증가한 iNOS, IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 미코나졸(miconazole)이 다시 원래의 수준으로 감소시켰다.
실험예 7: cresyl violet counter staining
3% 우혈청 알부민이 함유된 PBS로 실온에서 30분간 조직 절편을 처리하여 블로킹시키고 살아있는 세포들을 검출하기 위해, 니슬 소체 (Nissl bodies)를 염색하는 크레실 바이올렛 역염색 (cresyl violet counter staining)을 수행하였다. 절편은 DAB (3,3'-diaminobenzidine) 함유0.1 M 트리스 완충액으로 시각화하여 젤라틴 코팅된 슬라이드에 올려놓았다. 영상은 올림푸스 DP72 디지탈 카메라 및 DP2-BSW 현미경 디지탈 카메라 소프트웨어로 촬영 및 분석하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
그 결과, 도 14에서 확인할 수 있듯이, LPS에 의해 뇌 퇴행이 유도된 쥐의 해마(CA1, CA3, DG)에서 DNA 분절이 미코나졸(miconazole)을 처리함에 따라 증가함을 신경세포에서 확인 할 수 있다.
실험예 8: thioflavine S staining
아밀로이드 베타 신경반에 대한 면역형광 분석 및 아밀로이드 베타를 특이적으로 염색하는 것으로 알려진 티오플라빈 S 염색(thioflavin S staining)을 수행하였다.
티오플라빈 S 염색(thioflavine S staining)은 동결절편(cryoscetion)을 수분 동안 미지근한 흐르는 수돗물에서 세척한 후 수행하였다. 상기 세척된 절편을 5분 동안 0.25% 과망간산 칼륨(potassium permanganate)에 담가 둔 후, 1% K2S2O5 및 1% 옥살산에 5분 동안 담가 둔 후 8분 동안 0.02% thioflavine-S 용액에 담가 두었다. 그런 다음 뇌조직 절편을 1분 동안 2회 80% 에탄올에 헹구고, 천천히 흐르는 수돗물로 4-5분 동안 세척하였다. 그리고 나서 70, 80, 95% 알코올을 연속적으로 담가서 탈수하였고 자일렌에 담구었다. 커버슬립으로 봉입한 후 조직 절편을 공초점 레이저현미경(Flouview FV 1000)으로 조사하였다. 모든 형광 신호는 Image J Software(National Institutes of Health, USA)를 사용하여 정량하였고, 적분 광밀도(integral optical density, IOD)로 나타내었다(도 15).
그 결과 도 15에서 확인할 수 있듯이, LPS에 의해 뇌 퇴행이 유도된 쥐의 해마(CA1, CA3, DG)에서 Aβ가 미코나졸(miconazole)을 처리함에 따라 감소함을 신경세포에서 확인 할 수 있다.
실험예 9: Aβ 및 β-secretase 억제 활성 확인
뇌 조직에서 Aβ 레벨을 ELISA를 통해 확인하였다.
구체적으로, 각 뇌의 균질액에 대하여 종래의 방법에 따라 처리하여 웨스턴 블롯팅을 실시할 수 있도록 하였으며(Lee et al., 2009), 이 경우 Aβ, saline 및 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체를 이용하였다. 인핸스드 화학발광 시약(Pierce, Rockford, IL, USA)으로 develop하고, 디지털적으로 스캐닝 하였다(GS-700; Bio-Rad, Hercules, CA, 미국). 각각의 밴드의 β-액틴에 대한 상대적 광학 밀도를 Molecular AnalystTM 소프트웨어(Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다. 뇌 균질액에서 Aβ의 레벨은 Aβ Ultrasensitive ELISA 키트(Invitrogen)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
그 결과, 도 16에서 확인할 수 있듯이, LPS에 의해 증가된 Aβ가 미코나졸(miconazole)을 처리함에 따라 감소되는 것을 확인할 수 있다.
또한, 알츠하이머 질병 진행의 주요 기작에 관여하는 베타-세크레타아제의 억제 활성 정도를 β-secretase inhibitory activity assay를 통하여 분석하였다.
구체적으로, 베타-세크레타제 assay kit에서 제시한 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 70 ㎕ buffer(50 mM sodium acetate, pH 4.5), 10 ㎕ β-secretase (1.0 Unit/㎖), 10 ㎕ substrate를 10㎕의 시료액과 혼합 후 25℃에서 20분간 암조건에서 반응시켰다. 형광 reader(Bio-Rad)는 excitation 360㎚로 하고, emission 405 ㎚로 하여 측정하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
그 결과, 도 17에서 확인할 수 있듯이, LPS에 의해 증가된 β-secretase 활성이 미코나졸(miconazole)을 처리함에 따라 감소되는 것을 확인할 수 있다.
실험예 10: 면역조직화학적(Immunohistochemistry) 분석
Aβ 항체, GFAP 항체 및 Iba-1 항체를 이용한 면역조직화학적 분석에 의하여 LPS를 처리한 마우스 뇌의 해마의 DG, CA1 및 CA3에서 Aβ, GFAP 및 Iba-1 의 존재 정도를 확인하였다.
구체적으로, 뇌조직을 채취하여 4% 포름알데히드(neutral bufferedparaformaldehyde)에 48시간 내지 72 시간 고정하였다. 고정된 조직을 세척하여 고정액을 제거한 후 70% 에탄올에서 1시간 반응, 80% 에탄올에서 1시간, 90% 에탄올에서 1시간, 95% 에탄올에서 1시간, 100% 에탄올에서 2시간 및 자일렌(xylene)에서 2시간 반응시키는 탈수와 투명화 과정을 거치고, 파라핀 임베딩 장치(paraffin embedding center, Leica, Wetzlar, Germany)에서 포맷하였다. 파라핀 블록은 10 ㎛로 박절하여, 박절된 조직은 자일렌, 100%, 95%, 90%, 80% 및 70% 에탄올의 단계로 탈파라핀과 함수과정을 거친 후 조직절편은 0.1M 인산 나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer,0.1M PB)에 5분간 3회 세척하고 1차 항체, 6E10(Covance)로 1:50으로 희석하여 실온에서 2 시간 동안 처리한 후, 2차 항체는 1:100 ~ 1:200으로 희석한 FITC 컨쥬게이트 항체(conjugated antibody, Sigma)를 2시간 반응시켰다.
각 항체의 희석은 0.1M PB에 1% 노멀 고트 세럼(normal goat serum, sigma) 및 0.3% 트립톤(Triton) X-100(Sigma)를 혼합하여 사용하였다. 항체 처리시 각 단계의 세척는 PBS로 5분간 3회 실시하였다. 형광으로 발색되는 세포를 양성세포로 하여 이들 세포들의 분포 조사하였다.
그 결과, 도 19 및 도 20에서 확인할 수 있듯이, LPS에 의해 증가된 Aβ, GFAP 및 Iba-1가 미코나졸(miconazole)를 처리함에 따라 감소되는 것을 확인할 수 있다.
실험예 11: 통계분석
모든 통계 분석은 GraphPad Prism 5 소프트웨어(버전 5.03, GraphPad 소프트웨어, Inc., San Diego, CA)를 이용하여 수행 하였다. 그룹 차이는 Dunnette's post hoc test에 이어 two-way ANOVA에 따라 분석하였다. 모든 값은 평균 ± S.D로 나타내었다. 유의성은 모든 검사에서 p <0.05로 설정되었다.
Claims (3)
- 하기 화학식 1로 표시되는 미코나졸(Miconazole)을 포함하는 시험관 내에서(in vitro) 아밀로이드-β 축적 및 베타-세크리테이즈 1 활성화 억제용 조성물로서,
상기 아밀로이드-β의 축적은 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 베타-세크리테이즈 1(beta-secretase 1; BACE 1) 또는 C99의 생성을 저해함으로써 억제되는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
[화학식 1]
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 미코나졸(Miconazole)을 0.1~ 600mg/Kg 포함하는 것인, 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 염증유발인자인 NO, iNOS, COX-2, IL-1β 및 IL-6를 억제하는 것인, 조성물.
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-
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