KR101333654B1

KR101333654B1 - 인간 ＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ 혈액형을 신속하게 결정하는 방법 및 그 테스트 키트

Info

Publication number: KR101333654B1
Application number: KR1020107028483A
Authority: KR
Inventors: 다밍 왕; 왠 양; 지앙쿤 시아오; 바오단 왕
Original assignee: 인텍 프로덕츠 인코포레이티드 (시아멘)
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2009-03-26
Publication date: 2013-11-27
Also published as: EP2315024A1; CN101603967B; JP2011522228A; WO2009149615A1; MX2010013460A; ES2444430T3; WO2009149615A8; CN101603967A; KR20110017387A; US20110076698A1; BRPI0914801A2; RU2475758C2; RU2010150683A; EP2315024A4; JP5181058B2; EP2315024B1

Abstract

인간 ABO/Rh/MN 혈액형을 신속하게 결정하는 방법 및 그 테스트 키트. 검출되어야 하는 혈액 샘플은 항-A, 또는 항-B, 또는 항-M, 또는 항-N 항체로 미리 코팅된 테스트 스트립 상에 적용되고, 린스 용액은 테스트 스트립의 한쪽 말단 상에 적하된 후, 혈액 샘플의 혈액형은 반응 사이트에 잔류된 응집된 적혈구의 존재에 의하여 결정된다.

Description

인간 ＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ 혈액형을 신속하게 결정하는 방법 및 그 테스트 키트{A METHOD OF QUICKLY DETERMINING HUMAN ABO/Rh/MN BLOOD TYPE AND A TEST KIT THEREOF}

본 발명은 인간 ABO/Rh/MN 혈액형을 신속하게 검출하는 방법 및 그 키트에 관한 것이다.

혈액형 결정(Blood typing)은 ABO 시스템에 따라 A, B, AB 및 O의 4개 상이한 그룹으로, 각각 Rh 시스템 및 MN 혈액형 시스템에 따라, 인간 적혈구를 그룹화하는 전통적인 기술이다. 혈액형을 확인하는 일반적인 과정은 검출되어야 하는 적혈구를 혈액형 항체(blood group antibody) 함유 시약과 혼합하고, 반응 후에, 적혈구 응집(agglutination) 발생을 관찰함으로써 검출된 적혈구의 혈액형을 결정하는 것이다. 그러한 과정은 먼저 환자의 혈청으로부터 적혈구를 분리하는 것, 이후 적당량의 적혈구를 테스트 튜브 또는 슬라이드에 도입된 각각의 테스트 용액(각각, 항-A 혈청, 항-B 혈청, 항-D 혈청, 항-M 혈청 또는 항-N 혈청을 함유)과 혼합하는 것, 및 선택적으로, 면역 반응을 촉진하는 추가적인 시약을 첨가하고, 반응시킨 후, 반응 혼합물을 원심분리 및 교반하고, 이후 적혈구 응집의 발생을 관찰하는 것을 포함한다.

샘플에 있어서, 항-A 시약 존재하에 응집이 발생한 반면, 항-B 시약 존재하에서는 응집이 일어나지 않은 경우, 혈액 샘플은 A 혈액형으로 확인된다. 항-B 시약 존재하에 적혈구 응집이 발생한 반면, 항-A 시약 존재하에 응집이 일어나지 않는 경우, 샘플은 B 혈액형으로 확인된다. 항-A 시약의 존재하에, 및 항-B 시약의 존재하에 모두 적혈구 응집이 일어나는 경우, 샘플은 AB 혈액형으로 확인된다. 항-A 시약 존재하에서, 또는 항-B 시약 존재하에서 모두 응집 반응이 일어나지 않는 경우, 샘플은 O 혈액형으로 확인된다. 항-D 시약 존재하에 응집이 일어나는 경우, 샘플은 Rh-양성 혈액형으로 확인되며, 그렇지 않은 경우에는 Rh-음성 혈액형으로 확인된다. MN 혈액형 시스템에 있어서, 샘플은 적혈구 응집의 발생에 따라서 M, N 또는 MN 혈액형으로 지정된다.

현재 인간 ABO/Rh/MN 혈액형을 결정하는데 이용되는 기술은 2가지 형태로 분류될 수 있다. 첫번째 형태는 세포막과 관련된 혈액형 항원의 검출에 기초하며, 적혈구 식염수 응집 분석(red cell saline assay), 중화 분석(neutralization assay), 흡수 분석(absorption assay), 해리 분석(dissociation assay) 및 혼합 응집 반응(mixed agglutination reaction)을 포함한다. 두번째 형태는 유리 혈액형 항원(free blood group antigen)의 직접 검출에 기초하며, 공동응집 반응(coagglutination reaction) 및 방사면역측정(radioimmunoassay)을 포함한다.

최근 일반적으로 이용되는 적혈구 식염수 응집 분석에서, 테스트 혈액은 신선한 적혈구 표면에서 혈액형 항원에 대한 공지된 IgM 또는 IgG 항체의 결합에 의하여 유도된 적혈구 응집에 의하여 그 혈액형이 결정된다. 이 과정은 임상적 수혈에 있어서 혈액형 판단(혈액형 결정)에 광범위하게 이용된다. 그러나, 이 과정은 저온에서 보존되어야 하는 상응하는 시약을 필요로 하고, 나아가 그 결과를 확인하는 것이 어렵다.

혈액형을 결정하는 다른 과정은 여러 가지 결점을 갖고 있다. 예를 들어, 중화 분석은 장시간에 걸쳐 수행되고, 민감도(sensitivity)가 낮다. 해리 테스트 및 혼합 응집 반응은 각각의 수행시에 최적화가 복잡한 고도의 숙련된 수행을 필요로 하고, 민감도가 낮다. 공동응집 반응은 테스트된 샘플의 혈액형을 결정하기 위하여, IgG 항체에 의하여 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphyloccocus aureus (SPA))로부터 단백질 A를 민감하게 만든 후, 스타필로코쿠스 아우레우스의 응집을 관찰하는 것을 포함하는데, 이 과정은 시약의 복잡한 저장을 필요로 한다. 방사면역측정 및 ELISA는 민감도가 높지만, 수행에 시간이 오래 걸리고, 따라서 단일 샘플 또는 현장 검출(on-site detection)에 적합하지 않다.

요약하면, 임상적인 혈액형 결정에 일반적으로 이용되는 방법은 긴 수행 시간, 노동 집약적 작업, 변화가 큰 주관적인 결과, 및 잠재적인 오염과 같은 다양한 문제를 갖고 있다. 따라서, 혈액형 결정을 위한 종래 방법의 실질적 향상이 요구된다.

본 발명의 목적의 하나는 테스트되어야 하는 혈액 샘플을 항-A, 항-B, 항-D, 항-M 또는 항-N 혈액형 항체로 미리 코팅된 테스트 스트립(test strip) 상에 적하하는 단계, 린스 용액(rinse solution)을 상기 스트립의 한쪽 말단 상에 적하하여, 상기 린스 용액과 함께 응집되지 않은 적혈구를 로딩 사이트(loading site)로부터 떨어지도록 이동시키고, 항체와 응집된 적혈구는 로딩 사이트에 남기는 단계, 이후 로딩 사이트에서 응집된 적혈구의 존재에 따라 테스트 샘플의 혈액형을 결정하는 단계를 포함하는, 인간 ABO/Rh/MN 혈액형의 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 테스트 스트립 상에 적하된 혈액 샘플은 1~10 ㎕ 만큼 작은 부피를 가질 수 있다. 상기 린스 용액은 10 mM 인산염 완충 식염수(phosphate buffer saline; PBS), 생리 식염수(physiological saline) 또는 다른 등장성 용액(isotonic solution)이다. 상기 테스트되어야 하는 혈액 샘플은 테스트 스트립의 로딩 패드(loading pad) 상에 적하된다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 혈액형 항체를 부동화(immobilizing)시키는 방법은 예를 들어, 물리적 흡착 또는 화학적 가교결합에 기초할 수 있다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 상기 테스트되어야 하는 혈액 샘플은 적혈구 또는 전혈(whole blood), 또는 생리 식염수 또는 인산염 완충 식염수와 같은 등장성 용액으로 희석된 적혈구 또는 전혈의 현탁액일 수 있다. 또한, 상기 혈액 샘플은 부분적으로 용혈된(hemolyzed) 혈액 샘플 및 지질이 풍부한 혈액 샘플을 포함한다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 테스트 결과는 육안으로, 또는 광 신호 또는 전기 신호를 수집하는 장치에 의하여 결정될 수 있다.

간단하게, 혈액 샘플은 상응하는 혈액형 항체가 고정된 로딩 패드에 접촉하고, 로딩 패드와 반응한다, 즉 혈액 샘플은 로딩 패드 상에서 상응하는 항체와 면역 결합 반응(immunological binding reaction)을 겪는다. 린스 용액으로 헹군 후에, 면역 결합 반응을 겪은 혈액 샘플은 패드 상에 잔류하고, 매우 붉은 색을 갖는 반면, 면역 결합 반응을 겪지 않은 혈액 샘플은 린스 용액에 의하여 로딩 패드로부터 떨어지도록 헹궈지고, 이에 의하여 로딩 사이트에서 붉은 색이 나타나지 않는다. 따라서, 혈액 샘플의 ABO/Rh/MN 혈액형은 샘플 내의 적혈구와 혈액형 항체 사이의 면역 반응(immunological reaction)의 발생에 의하여 결정될 수 있으며, 이는 적혈구와 혈액형 항체 사이의 면역 반응 후에 로딩 패드 상에서 붉은 색 물질의 발생에 의하여 결정된다.

본 발명의 다른 목적은 테스트 스트립, 린스 용액 및 혈액 수집 수단(blood-collecting means)으로 이루어진, 상기 검출 방법을 수행하는데 이용되는 키트를 제공하는 것이며, 여기에서 테스트 스트립은 린스 패드(rinse pad), 로딩 패드, 쿠션 패드(cushion pad), 흡수 패드, 방수 점착 테이프(water-proof adhesive tape) 및 배킹(backing)으로서 폴리에스테르 시트(polyester sheet)로 이루어진다.

도 1은 본 발명의 혈액형 검출 키트의 ABO 혈액형용 신속 검출 스트립(fast detection strip)의 예시를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 혈액형 검출 키트의 ABO 혈액형용 신속 검출 스트립의 다른 예시의 분해도를 나타내며, 이는 린스 패드(1), 방수 점착 테이프(2), 혈액형 항체가 고정된 로딩 패드(3), 쿠션 패드(4), 흡수 패드(5), 및 폴리에스테르 배킹 시트(polyester backing sheet)(6)를 포함한다.
도 3은 본 발명의 키트의 Rh 혈액형용 신속 검출 스트립의 예시를 나타내며, 이는 린스 패드(1), 방수 점착 테이프(2), 항-D 항체가 고정된 로딩 패드(3), 쿠션 패드(4), 및 흡수 패드(5)를 포함한다.
도 4는 본 발명의 혈액형 검출 키트의 MN 혈액형용 신속 검출 스트립의 예시를 나타낸다.
도 5는 혈액형 항체가 고정된 섬유 유리 패드 상에 양성 혈액 샘플을 적하한 후의 개략적 반응을 나타낸다.

본 발명은 테스트되어야 하는 인간 혈액 샘플의 ABO/Rh/MN 혈액형을 신속하게 검출하는 방법 및 그 키트에 있다.

첫 번째 측면에서, 본 발명은 테스트되어야 하는 혈액 샘플을 항-A, 항-B, 항-D, 항-M 또는 항-N 혈액형 항체가 미리 고정된 테스트 스트립(test strip) 상에 적하하는 단계, 린스 용액(rinse solution)을 상기 스트립의 한쪽 말단 상에 적하하여, 상기 린스 용액과 함께 응집되지 않은 적혈구를 로딩 사이트(loading site)로부터 떨어지도록 이동시키고, 항체와 응집된 적혈구는 로딩 사이트에 남기는 단계, 이후 반응 사이트(reaction site)에서 응집된 적혈구의 존재에 따라 테스트 샘플의 혈액형을 결정하는 단계를 포함하는, 인간 ABO/Rh/MN 혈액형의 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 상기 테스트되어야 하는 혈액 샘플은 적혈구 또는 전혈, 또는 생리 식염수 또는 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 등장성 용액으로 희석된 적혈구 또는 전혈의 현탁액일 수 있다. 또한, 상기 혈액 샘플은 부분적으로 용혈된 혈액 샘플 및 지질이 풍부한 혈액 샘플을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 테스트 스트립 상에 적하된 혈액 샘플의 부피는 10 ㎕ 이하이다. 상기 린스 용액은 10 mM 인산염 완충 식염수, 생리 식염수 또는 이외의 것이다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 혈액형 항체를 고정하는 방법은 예를 들어, 물리적 흡착 또는 화학적 가교결합에 기초할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 테스트 스트립, 린스 용액 및 혈액 수집 수단으로 이루어지는, 상기 검출방법에 이용되는 키트를 제공하며, 여기에서, 테스트 스트립은 린스 패드, 로딩 패드, 쿠션 패드, 흡수 패드, 방수 점착 테이프 및 배킹으로서 폴리에스테르 시트로 이루어진다(도 1 참조).

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 상기 린스 패드, 로딩 패드, 쿠션 패드 및 흡수 패드는 섬유 유리(fibre glass)와 같은, 기공 크기를 갖는 다공성 폴리머 물질(porous polymeric materials)로 만들어지며, 여기에서 기공 크기에 의하여 적어도 단일의 적혈구가 통과할 수 있게 된다. 선택된 물질의 관점에서, 린스 패드, 로딩 패드 및 쿠션 패드는 때때로 섬유 유리 패드(fibre glass pad)로 일반적으로 나타내어진다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 테스트되어야 하는 혈액 샘플은 로딩 패드 상에 적하되고, 상기 린스 용액은 린스 패드 상에 적하된다. 로딩 패드는 혈액형 항체가 고정된 다공성 지지체(porous support)이다. 또한, 혈액형 항체를 고정하는 방법은 물리적 흡착 또는 화학적 가교결합에 기초할 수 있다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 상기 혈액 샘플은 부분적으로 용혈된 혈액 샘플 또는 혈액 지질이 풍부한 혈액 샘플일 수 있다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 테스트 결과는 육안으로, 또는 광 신호 또는 전기 신호를 수집하고 판독하는 장치에 의하여 결정될 수 있다. 특히, 본 발명의 키트를 이용하여, 인간 ABO/Rh/MN 혈액형을 검출하는 과정은 하기를 포함한다:

1) 로딩 패드(3) 상에 인간 ABO/Rh/MN 혈액형 항체를 직접적으로 또는 간접적으로 고정함(도 2): 물리적 흡착 또는 화학적 가교결합을 이용하여 기공 크기를 갖는 섬유 유리 패드 상에 혈액형 항체를 고정함. 선택된 물리적 또는 화학적 고정 방법은 항체의 생물학적 활성에 거의 영향을 미치지 않는다. 또한, 고정된 항체는 소 혈청 알부민, 송아지 혈청, 펩톤(peptone), 수크로오스(sucrose), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 단백질 보호제(protein protective agent)가 보충될 수 있다.

고 적정농도(titer)의 인간 ABO/Rh/MN 혈액형 모노클로날(monoclonal) 항체를 5 mM 인산염 완충 식염수로 적당한 적정농도로 희석하고, 섬유 유리 패드 상에 항체의 고정 및 보존을 용이하게 하기 위하여 항체 보호제를 첨가함. 후속 면역 반응을 촉진하기 위하여 반응 증강제(reaction enhancer)가 희석된 항체에 첨가될 수 있다. 5 ㎝ × 5 ㎝ 섬유 패드 당 1.5 ㎖ 항체의 비율로 미리 활성화된(pre-activated) 섬유 유리 상에 희석된 항체를 가한 후, 37℃에서 건조한 후 밀봉하여 보존함.

2) 테스트 샘플을 로딩 패드(3) 상에 적하한 후, 린스 용액을 린스 패드(2) 상에 적하함(도 3 참조). 샘플을 로딩하고, 린스 용액을 적하한 후, 면역 결합 반응이 일어나고, 결과가 제시됨.

3) 반응 종결 및 추가적인 헹굼 후에, 로딩 패드 상에서 붉은 색 잔류물의 존재에 따라 테스트 샘플의 혈액형을 결정함.

ABO 혈액형 테스트 스트립에 있어서, 반응물을 헹군 후에, 실질적인 양(substantial amount)의 붉은 색 물질이 항-A 항체를 함유하는 로딩 패드 상에 잔류하는 경우, 이는 혈액 샘플이 항-A 항체에 의하여 포획됨으로써 그들 사이에 응집 반응이 일어난 것(즉, 양성 반응)을 나타내며; 실질적인 양의 붉은 색 물질이 항-A 항체를 함유하는 로딩 패드 상에 잔류하지 않는 경우, 이는 혈액 샘플과 항-A 항체 사이에 응집 반응이 일어나지 않은 것(즉, 음성 반응)을 나타내며; 완결된 반응물을 헹굴 때 항-B 항체를 함유하는 로딩 패드 상에 실질적인 양의 붉은 색 물질이 잔류하는 경우, 이는 혈액 샘플과 항-B 항체 사이에 응집 반응이 일어난 것을 나타내며; 완결된 반응물을 헹굴 때 항-B 항체를 함유하는 로딩 패드 상에 실질적인 양의 붉은 색 물질이 잔류하지 않는 경우, 이는 혈액 샘플과 항-B 항체 사이에 응집 반응이 일어나지 않은 것을 나타낸다. 따라서, 테스트 결과에 따라, 항-A 및 항-B 항체 양쪽과 응집 반응을 나타내는 혈액 샘플은 AB 혈액형으로; 항-A 항체와만 응집 반응을 나타내는 혈액 샘플은 A 혈액형으로; 항-B 항체와만 응집 반응을 나타내는 혈액 샘플은 B 혈액형으로; 및 항-A 또는 항-B 항체와 응집 반응을 나타내지 않는 혈액 샘플은 O 혈액형으로 결정될 수 있다.

Rh 혈액형 테스트 스트립에 있어서, 반응물이 헹궈진 후, 실질적인 양의 붉은 색 물질이 항-D 항체를 함유하는 로딩 패드 상에 잔류하는 경우, 이는 혈액 샘플과 항-D 항체 사이에 응집 반응이 일어난 것을 나타내며; 반면에 실질적인 양의 붉은 색 물질이 항-D 항체를 함유하는 로딩 패드 상에 잔류하지 않는 경우, 이는 혈액 샘플과 항-D 항체 사이에 응집 반응이 일어나지 않은 것을 나타낸다. 따라서, 테스트 결과에 따라, 항-D 항체와 응집 반응을 나타내는 혈액 샘플은 Rh-양성 혈액형으로, 반면에 항-D 항체와 응집 반응을 나타내지 않는 혈액 샘플은 Rh-음성 혈액형으로 결정될 수 있다.

MN 혈액형 테스트 스트립에 있어서, 반응물이 헹궈진 후, 실질적인 양의 붉은 색 물질이 항-M 항체를 함유하는 로딩 패드 상에 잔류하는 경우, 이는 혈액 샘플이 항-M 항체에 의하여 포획됨으로써 그들 사이에 응집 반응이 일어난 것을 나타내며; 실질적인 양의 붉은 색 물질이 항-M 항체를 함유하는 로딩 패드 상에 잔류하지 않는 경우, 이는 혈액 샘플과 항-M 항체 사이에 응집 반응이 일어나지 않은 것을 나타내며; 실질적인 양의 붉은 색 물질이 항-N 항체를 함유하는 로딩 패드 상에 잔류하는 경우, 이는 혈액 샘플과 항-N 항체 사이에 응집 반응이 일어난 것을 나타낸다. 따라서, 테스트 결과에 따라, 항-M 및 항-N 항체 양쪽과 응집 반응을 나타내는 혈액 샘플은 MN 혈액형으로; 항-M 항체와만 응집 반응을 나타내는 혈액 샘플은 M 혈액형으로; 및 항-N 항체와만 응집 반응을 나타내는 혈액 샘플은 N 혈액형으로 결정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 상기 신속 테스트 스트립은 배킹, 린스 패드, 로딩 패드, 쿠션 패드, 흡수 패드 및 방수 점착 테이프로 이루어진다. 린스 패드, 로딩 패드, 쿠션 패드, 흡수 패드 및 방수 점착 테이프는 배킹에 순서대로 부착된다. 로딩 패드의 모서리(edge)는 린스 패드의 모서리와 중첩되고(overlaps), 쿠션 패드의 모서리는 로딩 패드의 모서리와 중첩되며, 흡수 패드의 모서리는 쿠션 패드의 모서리와 중첩되고, 방수 점착 테이프는 린스 용액이 로딩 패드로부터 넘쳐 흐르는 것을 방지하기 위하여 린스 패드 및 로딩 패드의 중첩된 모서리에 적용된다. 배킹은 폴리에스테르 물질로 만들어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 용어 "항체를 고정하는 것(fixing an antibody)"는 "항체를 부동화하는 것(immbilizing an antibody)"과 동등하며, 예를 들어 물리적 또는 화학적 가교결합에 의하여, 기공 크기를 갖는 섬유 유리 패드, 또는 유사한 기공 크기를 갖는 다른 지지체 상에 항-A, 항-B, 항-D, 항-M 또는 항-N 항체를 고정(부동화)시키는 것을 의미한다. 고정하기 전에, 항체는 이용될 수 있는 적당한 농도를 얻기 위하여, 항체 적정농도을 고려한 비율로 희석될 수 있다. 항체는 예를 들어, 담그거나(soaking), 또는 균일하게 적용하거나, 또는 분사한 후, 동결 건조하거나 다르게 건조함으로써 섬유 유리 패드(로딩 패드) 상에 고정될 수 있다. 상기 항체는 가교결합제로서 글루타르알데하이드로 선처리될 수 있다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 상기 테스트되어야 하는 혈액 샘플은 적혈구 또는 전혈, 또는 10 mM 인산염 완충 식염수(PBS) 및 생리 식염수와 같은 등장성 용액으로 희석된 적혈구의 현탁액(일반적으로 2~50%로 희석됨)일 수 있다. 부분적으로 용혈되거나, 또는 혈액 지질이 풍부한 혈액 샘플도 본 발명의 키트에 대하여 적용될 수 있다.

희석되거나 또는 희석되지 않은 전혈 또는 혈액 세포의 테스트 샘플은 혈액형 항체가 고정된 로딩 패드에 첨가될 수 있으며, 면역 결합 반응을 시킨 후에, 로딩 패드는 린스 용액으로 헹궈진다. 상기 린스 용액은 10 mM 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 이외의 것일 수 있다. 면역 반응을 시킨 후에, 응집된 적혈구의 존재는 육안으로 쉽게 관찰될 수 있으며, 또는 배치(batch)에서 샘플의 테스트 결과는 광학 신호 또는 전기 신호를 수집 및 판독하는 장치에 의하여 판독될 수 있다.

ABO 혈액형의 검출에 있어서, 본 방법의 수행은 동일한 폴리에스테르 배킹 상에 개별적으로 평행하게 형성되고, 항-A 또는 항-B 혈액형 항체가 각각 로딩 패드 상에 고정된 2개의 테스트 스트립 상에서 이루어질 수 있다.

MN 혈액형 검출에 있어서, 본 방법의 수행은 동일한 폴리에스테르 배킹 상에 개별적으로 평행하게 형성되고, 항-M 또는 항-N 혈액형 항체가 각각 로딩 패드 상에 고정된 2개의 테스트 스트립 상에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 ABO/Rh/MN 혈액형용 신속 검출 키트는 ABO/Rh/MN 혈액형에 대한 혈액 은행에서의 혈액형 스크리닝(screening), 현장 혈액 수집(field blood collection) 및 가정내 자가-테스트(household self-test)에 적합하다. 신속한 면역 반응 및 간단한 결과 판독을 이용함으로써 신속하고 신뢰성 있는 혈액형 확인이 이루어질 수 있다. 본 방법은 쉽게 수행되고, 항-인간 글로불린 시약(anti-human globulin reagent)와 같은 추가적인 시약이 필요하지 않다. 본 방법에서, 혈액 샘플의 로딩 부피는 10 ㎕ 이하이고, 전체 지속 시간은 2분 이하이다.

본 발명의 인간 ABO/Rh/MN 혈액형을 신속하게 검출하는 방법 및 그 키트는 면역크로마토그래피(immunochromatography) 원칙에 기초하고 있으며, 혈액형 결정은 혈액형 물질(blood group substance) 항원-항체 반응시에 적혈구 응집에 기인하는 붉은 색 물질의 존재에 의하여 이루어진다. 본 방법은 수행이 쉽고, 당업계에 존재하는 일반적인 혈액형 검출 방법의 많은 결점을 방지한다. 본 방법은 특히 혈액 수집 자리에서 ABO/Rh/MN 혈액형 검출 및 혈액형의 가정내 자가-검출을 위하여, 단일 샘플 검출, 또는 다중 샘플 검출에 적합하다. 관련 장치와 결합되어, 본 방법은 혈액 은행의 배치에서 ABO/Rh/MN 혈액형의 신속한 집단 스크리닝(population screening)에 이용될 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 더 설명하기 위한 것이며, 이러한 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않을 것이다. 당업자에 의한 본 발명의 어떠한 변화 및 변형도 본 발명의 정신으로부터 벗어나지 않고 첨부된 청구항에 포함된 범위 내에 속할 것이다.

실시예 1: 인간 ABO 혈액형 검출을 위한 키트의 테스트 스트립 제조 및 그 검출 단계

(1) 로딩 패드 상에 혈액형 항체(항-A, 항-B 항체)의 고정:

고 적정농도의 모노클로날 항-A 및 항-B 항체(Changchun Brother Biotech Co., Ltd에 의하여 공급됨)를 각각 5mM 인산염 완충 식염수로 최종 적정농도가 64인 1 ㎖로 희석하였다. 섬유 유리 패드 상에서의 항체의 고정화 및 보존을 촉진하기 위하여, PBS 중의 5% 소 혈청 알부민, 5% 수크로오스, 5% PVP 및 5% 송아지 혈청으로 이루어진 항체 고정화 보호제(antibody fixation protective agent)를 희석된 항체 용액에 첨가하였다. 희석된 항체를 섬유 유리 패드 5 ㎝ × 5 ㎝ 당 희석된 항체 1.5 ㎖의 비율로 미리 활성화된 섬유 유리 패드에 퍼뜨리고, 이후 항체를 37℃에서 건조하고, 밀봉하여 보존하였다.

(2) 신속 테스트 스트립의 어셈블링(assembling):

폭이 20 ㎜인 린스 섬유 유리 패드(rinse fibre glass pad)를 폭이 약 5~10 ㎝인 폴리에스테르 배킹의 중심에 부착한 후, 폭이 10 ㎜인 로딩 패드, 쿠션 패드 및 폭이 30 ㎜인 흡수 패드를 양면에 순서대로 부착하고, 부착된 패드들이 벗겨지는 것을 방지하고, 린스 용액이 퍼지는 것을 방지하기 위하여, 마지막으로 린스 패드와 로딩 패드의 중첩된 부분을 방수 점착 테이프로 점착 고정하였다. 다음으로, 상기 패드와 부착된 폴리에스테르 시트를 5 ㎜ 폭의 스트립으로 절단함으로써 길이가 약 5~10 ㎝이고, 폭이 약 5 ㎜인 테스트 스트립을 얻었다(도 1 및 2 참조).

(3) 샘플의 검출:

전혈 샘플 5 ㎕를 테스트 스트립의 로딩 패드 상에 적하하였다. 테스트 샘플의 적하 후에, 린스 용액 5 방울을 천천히 균일한 속도로 린스 패드(2) 상에 적하하였다. 린스 용액의 크로마토그래피 후에 로딩 패드의 색을 관찰하였다. 실질적인 양의 붉은 색 물질이 로딩 패드(3) 상에 잔류하는 것은 양성 반응을 나타내고; 반면에 실질적인 양의 붉은 색 물질이 로딩 패드(3) 상에 잔류하지 않는 것은 음성 반응을 나타내는 것이다. ABO 혈액형 항체와 적혈구 반응의 관계에 대한 지식과 결합하여, 테스트 샘플의 혈액형을 결정하는 것은 쉽다. 대안으로, 배치에서 혈액 샘플의 ABO 혈액형을 신속하게 스크리닝하기 위하여, 로딩 패드 상의 붉은 색 잔류물은 광 신호 또는 전기 신호 수집 시스템에 의하여 판독될 수 있고, 결과는 자동적으로 결정될 수 있다.

실시예 2: 인간 Rh 혈액형 검출용 테스트 스트립의 제조 및 그 검출 단계

(1) 로딩 패드 상에 혈액형 항체(항-D 항체)의 고정:

고 적정농도의 모노클로날 항-D 항체(MILLIPORE Corp.로부터 공급됨)를 5mM 인산염 완충 식염수로 최종 적정농도가 32인 1 ㎖로 희석하였다. 섬유 유리 패드 상에서 항체의 고정화 및 보존을 촉진하기 위하여, PBS 중의 5% 알부민, 5% 수크로오스, 5% PVP 및 5% 송아지 혈청으로 이루어진 항체 고정화 보호제를 희석된 항체 용액에 첨가하였다. 후속 면역 반응을 촉진시키기 위하여, 반응 증강제(PBS 중의 2% Tween 20 및 2% Triton)을 더 첨가하였다. 희석된 항체를 섬유 유리 패드 5 ㎝ × 5 ㎝ 당 희석된 항체 1.5 ㎖의 비율로 미리 활성화된 섬유 유리 패드에 퍼뜨리고, 이후 항체를 37℃에서 건조하고, 밀봉하여 보존하였다(도 3 참조).

다른 단계는 인간 ABO 혈액형 검출을 위한 키트의 테스트 스트립 제조 및 그 검출 단계와 유사하다.

실시예 3: 인간 MN 혈액형 검출용 키트의 테스트 스트립의 제조 및 그 검출 방법

인간 MN 혈액형용 검출 키트의 테스트 스트립의 제조 및 그 검출 단계는 테스트 스트립 상에 고정된 항체가 항-M 및 항-N 항체로 대체된 점을 제외하고는 인간 Rh 혈액형용 검출 키트의 테스트 스트립 제조 및 그 검출 단계와 동일하다.

실시예 4: 기존의 통상적인 방법과 본 혈액형 검출 방법의 비교

우리는 통상적인 혈액형 검출 방법과 본 방법 및 그 키트를 동시에 함께 이용하여, 일반 집단으로부터 1500명의 개인들(혈액 제공자)에 대하여 혈액형을 이중 맹검으로 검출하였다. 결과는 본 방법의 검출 결과가 현탁 응집에서의 적혈구(red cell in-suspension agglutination)에 기초하는 공지된 방법의 결과와 100% 일치하는 것을 나타내었다. 또한, 본 방법은 부분적으로 용혈된 혈액 샘플 및 지질이 풍부한 혈액 샘플과 같이 광범위한 샘플에 대하여 적용될 수 있다. 나아가, 본 방법은 긴 수행 시간, 노동 집약적 작업, 수행자에 기인하여 변화가 큰 주관적인 결과 및 잠재적인 오염과 같은 임상적 혈액형 확인에 있어서 기존의 통상적인 방법에서의 문제점을 방지한다.

Claims

테스트 스트립, 린스 용액 및 혈액 수집 수단으로 이루어지며,
상기 테스트 스트립은 린스 패드, 로딩 패드, 쿠션 패드, 흡수 패드, 방수 점착 테이프, 및 배킹(backing)으로서 폴리에스테르 시트로 이루어지고,
상기 테스트 스트립을 형성하는 상기 린스 패드, 상기 로딩 패드, 상기 쿠션 패드 및 상기 흡수 패드는 적어도 하나의 적혈구 통과에 적합한 기공 크기를 갖는 섬유 유리(fibre glass) 물질로 만들어지며,
상기 린스 패드, 상기 로딩 패드, 상기 쿠션 패드, 상기 흡수 패드 및 상기 방수 점착 테이프는 상기 배킹에 순서대로 부착되며, 상기 로딩 패드의 모서리(edge)는 상기 린스 패드의 모서리와 중첩되고(overlaps), 상기 쿠션 패드의 모서리는 상기 로딩 패드의 모서리와 중첩되고, 상기 흡수 패드의 모서리는 상기 쿠션 패드의 모서리와 중첩되고, 상기 방수 점착 테이프는 상기 린스 용액이 상기 로딩 패드로부터 넘쳐 흐르는 것을 방지하기 위하여 상기 린스 패드 및 상기 로딩 패드의 중첩된 모서리에 적용되는
인간 ABO/Rh/MN 혈액형의 검출방법을 수행하기 위한 키트.
제1항에 있어서,
혈액형 항체가 고정된 상기 로딩 패드 상에 혈액 샘플이 적하되고, 상기 린스 패드 상에 등장성 린스 용액이 적하되며, 이어서 상기 혈액 샘플의 혈액형을 결정하기 위하여, 상기 로딩 패드에서 응집된 적혈구의 존재가 관찰되는
인간 ABO/Rh/MN 혈액형의 검출방법을 수행하기 위한 키트.
혈액 샘플을 항-A, 항-B, 항-D, 항-M, 또는 항-N 혈액형 항체로 미리 코팅된 테스트 스트립(test strip) 상에 적하하는 단계;
린스 용액(rinse solution)을 상기 스트립의 한쪽 말단 상에 적하하여, 상기 린스 용액과 함께 응집되지 않은 적혈구를 로딩 사이트(loading site)로부터 떨어지도록 이동시키고, 상기 항체와 응집된 적혈구는 로딩 사이트에 남기는 단계; 및
이후 반응 사이트(reaction site)에서 응집된 적혈구의 존재에 따라 테스트 샘플의 혈액형을 결정하는 단계를 포함하며,
제1항 또는 제2항에 따른 키트를 이용하는,
인간 ABO/Rh/MN 혈액형의 검출방법.
제3항에 있어서,
상기 혈액 샘플은 적혈구 또는 전혈, 또는 생리 식염수 또는 등장성 인산염 완충 식염수로 희석된 적혈구 또는 전혈일 수 있는
인간 ABO/Rh/MN 혈액형의 검출방법.
제3항에 있어서,
상기 혈액 샘플은 부분적으로 용혈되거나, 또는 지질이 풍부한 혈액 샘플을 포함하는
인간 ABO/Rh/MN 혈액형의 검출방법.
제3항에 있어서,
상기 항체는 물리적 흡착 또는 화학적 가교결합에 의하여 테스트 스트립 상에 고정되는
인간 ABO/Rh/MN 혈액형의 검출방법.
제3항에 있어서,
상기 반응 사이트에서 응집의 존재는 육안으로, 또는 광학 신호 또는 전기 신호를 수집하는 장치를 이용함으로서 결정될 수 있는
인간 ABO/Rh/MN 혈액형의 검출방법.
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