WO2014119544A1 - イムノクロマト法で血漿タンパクを測定する方法 - Google Patents

イムノクロマト法で血漿タンパクを測定する方法 Download PDF

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心平 佐藤
良治 木下
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring plasma protein by immunochromatography.
  • Immunochromatography is used for rapid examination of influenza and pregnancy in the medical field.
  • the immunochromatography method is not suitably used for measuring plasma proteins in whole blood. This is because red blood cells of red blood cells make it difficult to discern color development due to the accumulation of labeled antibodies because the plasma protein concentration in whole blood is high.
  • Patent Documents 1 and 2 As a method for measuring plasma protein in whole blood, a method of previously centrifuging whole blood or a method using an immunochromatographic strip provided with a plasma / serum separation pad is known (see Patent Documents 1 and 2).
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring plasma proteins in whole blood using an immunochromatographic test strip at low cost and in a simple manner.
  • plasma protein can also be measured by immunochromatography by diluting whole blood and using a specific development membrane, and completed the present invention.
  • the present invention is a method for measuring plasma protein by immunochromatography, Diluting blood collected from humans 100 to 10,000 times; Developing the diluted blood on an immunochromatographic test strip; Analyzing the color development of the immunochromatographic test strip on which the diluted blood is developed, and does not separate whole blood into plasma or serum and blood cell components.
  • the immunochromatographic test strip includes a development membrane in which red blood cells can move by capillary action, a sample pad, and a conjugate pad having a labeled antibody that can bind to plasma proteins.
  • a test line formed of a capture antibody capable of binding to the plasma protein bound to the labeled antibody and a control line formed of a substance capable of binding to the labeled antibody not bound to the plasma protein are provided on the development membrane. Yes.
  • the plasma protein preferably contains at least one of albumin, prealbumin, globulin, fibrinogen, antithrombin, transferrin, ceruloplasmin, or C-reactive protein (CRP), and most preferably the plasma
  • the protein is prealbumin.
  • the spread membrane may be a spread membrane having a pore diameter of 5 to 100 ⁇ m.
  • the labeled antibody is preferably a metal colloid-modified antibody, and particularly preferably a gold colloid-modified antibody.
  • an immunochromatographic reader is used in the step of analyzing the color development of the immunochromatographic test strip in which the diluted blood is developed.
  • plasma protein in whole blood can be measured easily and inexpensively using an immunochromatographic test strip.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view showing a cross section parallel to the longitudinal direction of an immunochromatographic test strip 10 according to the embodiment.
  • FIG. 2 is a graph showing the correlation between the result of the measurement method in Example 1 and the result of measurement by the immunoturbidimetric method for the same sample.
  • This embodiment is a method for measuring plasma proteins by immunochromatography.
  • the immunochromatography method is one of immunoassay methods.
  • the principle is that the test substance develops color by capturing the target substance in the specimen flowing in the development membrane by capillary action with the capture antibody fixed to the test line in the development membrane. By measuring the color development of the test line qualitatively, preferably quantitatively, the target substance in the sample is measured.
  • an immunochromatographic test strip 10 As shown in FIG. 1, an immunochromatographic test strip 10 includes a developing membrane 11, a sample pad 12, and a conjugate pad 13 provided with a labeled antibody that can bind to a target substance (in this embodiment, plasma protein). Have. Further, the immunochromatographic test strip 10 includes an absorption pad 16 that absorbs excess liquid and a base material 17 that prevents the skin from directly touching the developing film 11. The absorbent pad 16 and the base material 17 are members that are appropriately provided as necessary, and are not necessarily provided on the immunochromatographic test strip 10. The immunochromatographic test strip 10 is not provided with a plasma / serum separation pad.
  • the developing film 11 is a strip-shaped film that is elongated in the left-right direction in FIG. 1, and the sample pad 12 and the conjugate pad 13 are arranged at one end (left side in FIG. 11 are sequentially stacked.
  • An absorption pad 16 is stacked on the other end (the right side in FIG. 1) of the development film 11.
  • the deployment membrane 11 is a membrane in which red blood cells can move by capillary action.
  • the spread membrane 11 in which red blood cells can move by capillary action generally corresponds to the spread membrane 11 having a pore diameter of 5 to 100 ⁇ m. In other words, the deployment membrane 11 is not clogged with red blood cells.
  • the material of the spread film 11 include cotton, hemp, silk, cellulose, rock wool, animal hair, nitrocellulose, cellulose acetate, glass fiber, carbon fiber, boron fiber, polyamide, aramid, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, Examples include rayon, polyester, polyacrylic acid, polyacrylic acid ester, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, and polyvinylidene chloride.
  • Such a deployment membrane 11 is sold by Merck Co., Ltd., Nippon Pole Co., Ltd., and the like. Although there are some commercially available development membranes 11 whose pore diameters are not disclosed, whether or not red blood cells can move by capillary action is determined when blood is actually developed on the development membrane 11. It can be easily discriminated by observing the penetration of red color of red blood cells.
  • a test line 14 and a control line 15 are provided on the side of the absorbent pad 16 from the center in the longitudinal direction (left and right direction in FIG. 1) of the spreading film 11 so as to be separated in the longitudinal direction.
  • the control line 15 is disposed closer to the absorption pad 16 than the test line 14.
  • the test line 14 is formed by fixing a capture antibody capable of binding to a target substance across the width direction of the developing film 11 (direction perpendicular to the paper surface in FIG. 1).
  • the control line 15 is formed by fixing a substance capable of binding to the labeled antibody to which the target substance is not bound, across the width direction of the spreading film 11 (direction perpendicular to the paper surface in FIG. 1). .
  • the test line 14 and the control line 15 are not colored and difficult to see in a state where the labeled antibody provided on the conjugate pad 13 is not bound.
  • the labeled antibody provided on the conjugate pad 13 is a combination of an antibody and a label.
  • the antibody in the labeled antibody is not particularly limited as long as it can bind to plasma protein.
  • examples include goat-derived anti-prealbumin antibody and rabbit-derived anti-prealbumin antibody.
  • the labeling substance in the labeled antibody is not limited to those generally used for immunochromatography.
  • examples of the label include metal colloids such as gold colloid, platinum colloid and palladium colloid, and gold colloid is preferably used from the viewpoint of high measurement sensitivity.
  • Examples of the substance that can be bound to the labeled antibody that is not bound to the plasma protein and fixed as the control line 15 include an antigen or a secondary antibody different from the plasma protein that can bind to the antibody in the labeled antibody.
  • an antigen or a secondary antibody different from the plasma protein that can bind to the antibody in the labeled antibody For example, when prealbumin is used as the plasma protein and gold colloid-labeled goat-derived anti-prealbumin antibody is used as the labeled antibody, the rabbit-derived anti-goat IgG antibody can be used as a substance that can bind to the labeled antibody that is not bound to plasma protein. It can be used suitably.
  • the method of measuring a target substance with the immunochromatographic test strip 10 is roughly divided into the following steps. (1) A step of diluting blood collected from humans 100 to 10,000 times. (2) A step of developing the diluted blood on the immunochromatographic test strip 10. (3) A step of analyzing the color development of the immunochromatographic test strip 10 in which the diluted blood is developed.
  • Plasma protein refers to a protein that accounts for about 7% of plasma, and examples include albumin, prealbumin, globulin, fibrinogen, antithrombin, transferrin, ceruloplasmin, and C-reactive protein (CRP).
  • prealbumin which is attracting attention as an indicator of human nutritional status, is preferably selected, but the present invention is not limited to the method for measuring prealbumin.
  • Specimen is blood collected from a human.
  • the collected blood is diluted 100 to 10,000 times with a diluent before being dropped onto the sample pad 12 of the immunochromatographic test strip 10.
  • the method for collecting blood from a human is not particularly limited, and may be either blood collection by a doctor or nurse or blood collection by oneself.
  • Blood collection by a doctor or nurse includes blood collection using a blood collection tube or syringe
  • blood collection by oneself includes, for example, blood collection using a puncture device used in the field of self blood glucose measurement (SMBG). .
  • SMBG self blood glucose measurement
  • the method of diluting the collected blood 100 to 10,000 times is also not particularly limited, but generally, physiological saline, phosphate buffered saline (PBS) and tris buffered saline (TBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • TBS tris buffered saline
  • a liquid usually developed on an immunochromatographic test strip such as) is used as a diluent. If the dilution factor is lower than 100, it will be difficult to discriminate the color development described later based on the color of red blood cells, and if it is higher than 10,000, the color development described later will be difficult to discriminate.
  • the diluted blood is dropped on the sample pad 12 of the immunochromatographic test strip 10 to be developed on the developing film 11.
  • diluted blood on the immunochromatographic test strip 10 is performed by applying or dropping diluted blood (hereinafter also abbreviated as “diluted blood”) to the sample pad 12 of the immunochromatographic test strip 10.
  • diluted blood diluted blood
  • the diluted blood applied or dripped onto the sample pad 12 passes through the conjugate pad 13 and is developed in the longitudinal direction (left and right direction in FIG. 1) on the development film 11.
  • plasma proteins present in the diluted blood bind to the labeled antibody provided on the conjugate pad 13.
  • the diluted blood (including the labeled antibody bound to the plasma protein) developed on the deployment membrane 11 moves through the deployment membrane 11 by capillary action.
  • red blood cells can move by capillary action.
  • the diluted blood can reach the test line 14 in the developing membrane 11, and the labeled antibody bound to the plasma protein present in the diluted blood is captured in the test line 14. It can bind to an antibody. As a result, the test line 14 is colored.
  • the labeled antibody that is not bound to the plasma protein present in the diluted blood becomes a substance that can bind to the labeled antibody that is not bound to the plasma protein in the control line 15. Can be combined. As a result, the control line 15 develops color.
  • the labeled antibody is a polyclonal antibody or a multivalent antigen having a plurality of plasma protein epitopes
  • the labeled antibody binds to most of the plasma protein epitopes, so that the capture antibody in the test line 14 Can be difficult to capture plasma proteins.
  • a method of directly applying or dropping diluted blood to a position between the conjugate pad 13 and the test line 14 in the development film of the immunochromatographic test strip 10 instead of the sample pad is employed.
  • the diluted blood applied or dropped directly on the development film 11 is developed in the longitudinal direction (left and right direction in FIG. 1) in the development film 11.
  • the diluted blood developed on the deployment membrane 11 moves through the deployment membrane 11 by capillary action. Plasma proteins present in the diluted blood bind to the capture antibody at the test line 14.
  • the developing solution is not particularly limited, and a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, or a Tris buffer solution is used.
  • the developing solution dropped on the sample pad 12 passes through the conjugate pad 13 and is developed in the longitudinal direction (left and right direction in FIG. 1) in the developing film 11.
  • the labeled antibody provided on the conjugate pad 13 is eluted in the developing solution and is developed in the longitudinal direction (left and right direction in FIG. 1) in the developing film 11.
  • the developing solution containing the labeled antibody is developed on the developing membrane 11, and then moves in the developing membrane 11 while being mixed with the diluted blood by capillary action.
  • the labeled antibody binds to the plasma protein bound to the capture antibody. As a result, the test line 14 is colored.
  • the labeled antibody that is not bound to the plasma protein in the additive solution mixed with the diluted blood is bound to the plasma protein in the control 15. Binds to a substance capable of binding with no labeled antibody. As a result, the control line 15 is colored.
  • the color of the control line 15 of the immunochromatographic test strip 10 on which the diluted blood has been developed is analyzed visually or by an immunochromatographic reader.
  • an immunochromatographic reader it is also possible to quantitatively analyze based on the color intensity of the color of the immunochromatographic test strip 10.
  • the immunochromatographic reader a commercially available one can be used. For example, Hamamatsu Photonics Co., Ltd., Otsuka Electronics Co., Ltd., Oriental Instruments Co., Ltd., and Nippin Engineering Co., Ltd. sell it.
  • whole blood is not separated into plasma or serum and blood cell components, that is, the centrifugation operation is not performed, and the immunochromatographic test strip 10 is not provided with a plasma / serum separation pad. It is a feature. Thereby, an inexpensive method for plasma protein can be provided.
  • Serum for quality control was diluted with physiological saline to prepare solutions with prealbumin concentrations of 0, 10.1, 15.6, 20.0 and 31.4 mg / dL. Pricing was performed by immunoturbidimetry.
  • Immunochromatographic test strip 10 An immunochromatographic test strip 10 shown in FIG. 1 was produced. Specifically, the development membrane 11 was made of Merck High Flow HF90, the sample pad 12 was made of Merck CFSP173000, and the conjugate pad 13 was made of Merck GFCP103000. It was confirmed in advance that the developing membrane 11, the sample pad 12, and the conjugate pad 13 uniformly permeate red blood. The conjugate pad 13 was impregnated with goat-derived anti-prealbumin polyclonal antibody (labeled antibody) labeled with colloidal gold.
  • goat-derived anti-prealbumin polyclonal antibody labeled with colloidal gold.
  • the test line 14 was formed by applying a phosphate buffer solution (1.0 mg / mL) of a goat-derived anti-prealbumin polyclonal antibody (capture antibody) and air drying.
  • the control line 15 was applied with a phosphate buffer solution (0.2 mg / mL) of a rabbit-derived anti-goat IgG antibody (a substance capable of binding to a labeled antibody not bound to plasma protein, manufactured by Rockland Immunochemicals) Formed by drying.
  • Example 1 A solution was prepared by diluting 25 samples of blood samples 800 times with physiological saline. Next, 10 ⁇ L was directly developed at a position between the conjugate pad 13 and the test line 14 in the development membrane 11 of the immunochromatographic test strip 10, and then 1 mL of Tris buffer solution as a developing solution was developed on the sample pad 12. The color intensity of the obtained test line 14 was measured with a test strip reader. The concentration of each blood sample was determined by comparing the obtained color intensity and the calibration curve.
  • FIG. 2 shows the result of evaluating the correlation between the obtained concentration and the concentration of the blood sample measured by immunoturbidimetry. As a result, the value of R 2 (correlation coefficient) was 0.96, and it was revealed that the prealbumin concentration can be quantitatively measured by the method of the present invention.
  • Example 1 The test was performed in the same manner as in Example 1 except that the dilution rate of the blood sample with physiological saline was 80 times. However, the color of the test line 14 was difficult to see due to the red color of the blood, and it was difficult to determine qualitatively. there were.
  • the present invention can provide an inexpensive and simple method for measuring plasma protein in whole blood using an immunochromatographic test strip.
  • prealbumin is selected as the plasma protein, human nutritional status can be quickly diagnosed. Will be able to.

Abstract

【課題】　安価かつ簡易的にイムノクロマトテストストリップを用いて全血中の血漿タンパクを測定する方法を提供すること 【解決手段】本測定方法は、ヒトから採取された血液を１００～１００００倍に希釈する工程；該希釈した血液をイムノクロマトテストストリップ１０に展開する工程；該希釈した血液が展開されたイムノクロマトテストストリップ１０の発色を分析する工程；を含み、全血を血漿または血清と血球成分に分離しないものである。イムノクロマトテストストリップ１０は、赤血球が毛細管現象により移動可能な展開膜１１と、サンプルパッド１２と、血漿タンパクと結合可能な標識抗体を具備するコンジュゲートパッド１３と、該標識抗体と結合した血漿タンパクと結合可能なキャプチャー抗体で形成したテストライン１４と、および該血漿タンパクが結合していない標識抗体と結合可能な物質で形成したコントロールライン１５と、を備える。

Description

イムノクロマト法で血漿タンパクを測定する方法
　本発明は、イムノクロマト法で血漿タンパクを測定する方法に関する。
　イムノクロマト法は、医療現場においては、インフルエンザや妊娠の迅速検査に用いられている。
　しかし、イムノクロマト法は全血中の血漿タンパクの測定には好適には用いられていない。これは全血に含まれる血漿タンパク濃度が高いため、赤血球の赤色が標識抗体の集積による発色を判別しにくくするためである。
　全血中の血漿タンパクを測定する方法として、予め全血を遠心分離する方法や、血漿／血清分離パッドが設けられたイムノクロマトストリップを用いる方法が公知である（特許文献１，２参照）。
特開２００２－２１４２３６号公報 特開２００２－３５０４２８号公報
　しかしながら、前述された従来の方法は、遠心分離機が必要であったり、血漿／血清分離パッドを設ける必要があったりするため、より安価かつ簡易に全血中の血漿蛋白を測定する方法が望まれる。
　本発明は、安価かつ簡易的にイムノクロマトテストストリップを用いて全血中の血漿タンパクを測定する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、全血を希釈することと、特定の展開膜を用いることで、イムノクロマト法で血漿タンパクも測定できることを見いだし、本発明を完成させた。
　本発明は、イムノクロマト法で血漿タンパクを測定する方法であって、
　ヒトから採取された血液を１００～１００００倍に希釈する工程；
　該希釈した血液をイムノクロマトテストストリップに展開する工程；
　該希釈した血液が展開されたイムノクロマトテストストリップの発色を分析する工程；を含み、全血を血漿または血清と血球成分に分離しないものである。
　上記イムノクロマトテストストリップは、赤血球が毛細管現象により移動可能な展開膜と、サンプルパッドと、血漿タンパクと結合可能な標識抗体を有するコンジュゲートパッドと、を具備する。上記展開膜に、上記標識抗体と結合した血漿タンパクと結合可能なキャプチャー抗体で形成したテストラインと、血漿タンパクが結合していない上記標識抗体と結合可能な物質で形成したコントロールラインが設けられている。
　上記血漿タンパクは、アルブミン、プレアルブミン、グロブリン、フィブリノーゲン、アンチトロンビン、トランスフェリン、セルロプラスミンまたはＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）のうち、少なくともいずれか１つを含むことが好適であり、最も好適な上記血漿タンパクは、プレアルブミンである。
　上記展開膜は、孔径５～１００μｍを有する展開膜であってもよい。
　上記標識抗体は、金属コロイド修飾抗体が好適であり、特に金コロイド修飾抗体が好適である。
　前記希釈した血液が展開されたイムノクロマトテストストリップの発色を分析する工程において、イムノクロマトリーダーが用いられることが好適である。
　本発明によれば、安価かつ簡易的にイムノクロマトテストストリップを用いて全血中の血漿タンパクを測定することができる。
図１は、実施形態に係るイムノクロマトテストストリップ１０の長手方向に対して平行な断面を示す断面図である。 図２は、同一サンプルにて実施例１における測定方法の結果と免疫比濁法により測定した結果との相関を示すグラフである。
　以下、図面が参照されつつ本発明の実施形態が説明される。なお、本実施形態は、本発明の一例にすぎず、本発明の要旨が変更されない範囲において、本実施形態が適宜変更されてもよいことは言うまでもない。
　本実施形態は、イムノクロマト法により血漿タンパクを測定する方法である。イムノクロマト法とは、免疫測定法の１つである。その原理は、毛細管現象によって展開膜中を流れる検体中の目的物質が、展開膜におけるテストラインに固定されたキャプチャー抗体によって捕捉されることによってテストラインが発色するものである。テストラインの発色が、定性的、好適には定量的に測定されることにより、検体中の目的物質の測定が行われる。
［イムノクロマトテストストリップ１０］
　図１に示されるように、イムノクロマトテストストリップ１０は、展開膜１１と、サンプルパッド１２と、目的物質（本実施形態では、血漿タンパク）と結合可能な標識抗体が設けられたコンジュゲートパッド１３と、を有する。また、イムノクロマトテストストリップ１０は、余剰の液体を吸収する吸収パッド１６と、展開膜１１に直接皮膚が触れることを防止するベース素材１７と、を有する。なお、吸収パッド１６やベース素材１７は、必要に応じて適宜設けられる部材であり、必ずしもイムノクロマトテストストリップ１０に設けられていなくてもよい。また、イムノクロマトテストストリップ１０には、血漿／血清分離パッドは設けられていない。
　展開膜１１は、図１における左右方向に細長な短冊形状の膜であり、その一方端（図１における左側）に、サンプルパッド１２及びコンジュゲートパッド１３が、サンプルパッド１２を上側として、展開膜１１に順次積層されている。展開膜１１の他方端（図１における右側）には、吸収パッド１６が積層されている。
　展開膜１１は、赤血球が毛細管現象で移動可能なものである。赤血球が毛細管現象で移動可能な展開膜１１とは、一般的には孔径５～１００μｍを有する展開膜１１が該当する。換言すれば、展開膜１１は、赤血球により目詰まりしないものである。このような展開膜１１の材料としては、綿、麻、絹、セルロース、ロックウール、獣毛、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ガラス繊維、カーボン繊維、ボロン繊維、ポリアミド、アラミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、レーヨン、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニルおよびポリ塩化ビニリデンなどが挙げられる。このような展開膜１１は、メルク株式会社および日本ポール株式会社などが販売している。なお、市販されている展開膜１１の中には孔径が公表されていないものもあるが、赤血球が毛細管現象で移動可能か否かの判別は、実際に血液を展開膜１１に展開した場合に、赤血球の赤色の色の浸透具合を観察することにより容易に判別することができる。
　展開膜１１における長手方向（図１における左右方向）の中央より吸収パッド１６側には、テストライン１４及びコントロールライン１５が長手方向に隔てられて設けられている。コントロールライン１５は、テストライン１４より吸収パッド１６側に配置されている。テストライン１４は、目的物質と結合可能なキャプチャー抗体が展開膜１１の幅方向（図１における紙面と垂直な方向）に渡って固定されることにより形成されたものである。コントロールライン１５は、目的物質が結合していない標識抗体と結合可能な物質が展開膜１１の幅方向（図１における紙面と垂直な方向）に渡って固定されることにより形成されたものである。テストライン１４及びコントロールライン１５は、コンジュゲートパッド１３に設けられた標識抗体が結合していない状態においては、着色が無く目視は困難である。
　コンジュゲートパッド１３に設けられた標識抗体は、抗体と標識物が結合されたものである。標識抗体における抗体は、血漿タンパクと結合可能なものであれば特に限定されるものではない。例えば、血漿タンパクがプレアルブミンである場合は、ヤギ由来抗プレアルブミン抗体およびウサギ由来抗プレアルブミン抗体などが挙げられる。
　標識抗体における標識物も、一般的にイムノクロマトに用いられるものが選択され、限定されるものではない。例えば、標識物としては、金コロイド、白金コロイドおよびパラジウムコロイドなどの金属コロイドが挙げられ、測定感度が高い観点から金コロイドが好適に用いられる。
　コントロールライン１５として固定される、血漿タンパクと結合していない標識抗体と結合可能な物質としては、標識抗体における抗体と結合可能な血漿タンパクとは別の抗原または二次抗体が挙げられる。例えば、血漿タンパクとしてプレアルブミンを、標識抗体として金コロイド標識ヤギ由来抗プレアルブミン抗体を用いた場合、血漿タンパクと結合していない標識抗体と結合可能な物質としては、ウサギ由来抗ヤギＩｇＧ抗体を好適に用いることができる。
［測定方法］
　イムノクロマトテストストリップ１０により目的物質を測定する方法は、次の工程に大別される。
（１）ヒトから採取された血液を１００～１００００倍に希釈する工程。
（２）希釈された血液をイムノクロマトテストストリップ１０に展開する工程。
（３）希釈された血液が展開されたイムノクロマトテストストリップ１０の発色を分析する工程。
　イムノクロマトテストストリップ１０により測定される目的物質は、血漿蛋白である。血漿タンパクとは、血漿の約７％を占めるタンパクをいい、例えば、アルブミン、プレアルブミン、グロブリン、フィブリノーゲン、アンチトロンビン、トランスフェリン、セルロプラスミンおよびＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）などが挙げられる。なお、本発明においては、血漿タンパクの中でも、ヒトの栄養状態の指標として注目されているプレアルブミンが好適に選択されるが、本発明はプレアルブミンを測定する方法に限定されるものではない。
　検体は、ヒトから採取された血液である。採取された血液は、イムノクロマトテストストリップ１０のサンプルパッド１２に滴下される前に、希釈液にて１００～１００００倍に希釈される。
　血液をヒトから採取する方法は特に限定されるものではなく、医師または看護師による採血、自己による採血のいずれであってもよい。医師または看護師による採血は、採血管またはシリンジを用いた採血などが挙げられ、自己による採血は、例えば、自己血糖測定（ＳＭＢＧ）分野で用いられている穿刺器具を用いた採血などが挙げられる。
　採取された血液を１００～１００００倍に希釈する方法もまた特に限定されるものではないが、一般的には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などの、通常イムノクロマトテストストリップに展開される液体が希釈液として用いられる。希釈倍率が１００より低いと、赤血球の色により後述する発色を判別することが困難になり、１００００より高いと、今度は後述する発色自体が判別しにくくなる。
　希釈された血液は、イムノクロマトテストストリップ１０のサンプルパッド１２に滴下されることによって、展開膜１１に展開される。
　希釈した血液のイムノクロマトテストストリップ１０への展開は、イムノクロマトテストストリップ１０のサンプルパッド１２に希釈した血液（以下、「希釈血液」と略すこともある）を塗布または滴下することにより実施される。サンプルパッド１２に塗布または滴下した希釈血液は、コンジュゲートパッド１３を通過して、展開膜１１において長手方向（図１における左右方向）へ展開される。希釈した血液がコンジュゲートパッド１３を通過する際、希釈血液中に存在する血漿タンパクは、コンジュゲートパッド１３に設けられた標識抗体と結合する。
　展開膜１１に展開された希釈血液（血漿タンパクと結合した標識抗体を含む）は、毛細管現象により展開膜１１中を移動する。展開膜１１においては、赤血球が毛細管現象で移動可能である。このような展開膜１１が用いられることにより、希釈血液は、展開膜１１におけるテストライン１４に到達することができ、希釈血液中に存在する血漿タンパクと結合した標識抗体は、テストライン１４におけるキャプチャー抗体と結合することができる。これによりテストライン１４が発色する。
　希釈血液が展開膜１１におけるコントロールライン１５に到達すると、希釈血液中に存在する血漿タンパクと結合していない標識抗体は、コントロールライン１５における血漿タンパクと結合していない標識抗体と結合可能な物質と結合することができる。これによりコントロールライン１５が発色する。
　なお、標識抗体がポリクローナル抗体である場合、または血漿タンパクのエピトープが複数ある多価抗原である場合には、血漿タンパクのエピトープの大半に標識抗体が結合することによって、テストライン１４において、キャプチャー抗体が血漿タンパクを捕捉し難くなることがあり得る。この場合、希釈血液は、サンプルパッドではなく、イムノクロマトテストストリップ１０の展開膜における、コンジュゲートパッド１３とテストライン１４との間の位置へ直接塗布または滴下する方法が採用される。展開膜１１に直接塗布または滴下された希釈血液は、展開膜１１において長手方向（図１における左右方向）へ展開される。
　展開膜１１に展開された希釈血液は、毛細管現象によって展開膜１１を移動する。希釈血液中に存在する血漿タンパクは、テストライン１４においてキャプチャー抗体と結合する。
　血漿タンパクがキャプチャー抗体と結合するのみでは、テストライン１４は発色しないので、コンジュゲートパッド１３に含まれる標識抗体がテストライン１４及びコントロールライン１５へ到達させる操作が必要となる。このため、希釈血液が展開膜１１に展開された後、サンプルパッド１２に展開液が滴下される。展開液は特に限定されるものではなく、リン酸緩衝液やホウ酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝液が用いられる。サンプルパッド１２に滴下された展開液は、コンジュゲートパッド１３を通過して、展開膜１１において長手方向（図１における左右方向）へ展開される。展開液がコンジュゲートパッド１３を通過する際、コンジュゲートパッド１３に設けられた標識抗体が展開液中に溶出して、展開膜１１において長手方向（図１における左右方向）へ展開される。
　標識抗体を含む展開液は、展開膜１１に展開された後、毛細管現象により展開膜１１中を希釈血液と混ざりつつ移動する。そして、テストライン１４へ到達すると、標識抗体は、キャプチャー抗体と結合した血漿タンパクと結合する。これにより、テストライン１４が発色する。
　希釈血液と混ざった展開液が更に展開膜１１におけるコントロールライン１５へ到達すると、希釈血液と混ざった添加液中における血漿タンパクと結合していない標識抗体が、コントロール１５における、血漿タンパクと結合していない標識抗体と結合可能な物質と結合する。これにより、コントロールライン１５が発色する。
　希釈した血液が展開されたイムノクロマトテストストリップ１０のコントロールライン１５の発色は、目視またはイムノクロマトリーダーにより分析される。イムノクロマトリーダーにより分析する場合は、イムノクロマトテストストリップ１０の発色の発色強度により、定量的に分析することもできる。イムノクロマトリーダーは、市販されているものを用いることができ、例えば、浜松ホトニクス株式会社、大塚電子株式会社、オリエンタルインスツルメンツ株式会社およびニップンエンジニアリング株式会社などが販売している。
　前述された測定方法について補足すると、全血を血漿または血清と血球成分に分離しないこと、つまり、遠心分離操作を実施するものではなく、イムノクロマトテストストリップ１０に血漿／血清分離パッドを設けないことも特徴である。これにより安価な血漿蛋白の方法を提供することができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
（標準物質）
　精度管理用血清を生理食塩水で希釈し、プレアルブミン濃度０、１０．１、１５．６、２０．０および３１．４ｍｇ／ｄＬの溶液を調製した。値付けは免疫比濁法で行った。
（イムノクロマトテストストリップ１０）
　図１に示すイムノクロマトテストストリップ１０を製造した。具体的に、展開膜１１は、メルク社製のハイフローＨＦ９０を、サンプルパッド１２はメルク社製のＣＦＳＰ１７３０００を、コンジュゲートパッド１３はメルク社製のＧＦＣＰ１０３０００をそれぞれ用いた。展開膜１１、サンプルパッド１２およびコンジュゲートパッド１３は、血液の赤色が満遍なく浸透することを予め確認した。コンジュゲートパッド１３には、金コロイドで標識したヤギ由来抗プレアルブミンポリクローナル抗体（標識抗体）を含浸した。テストライン１４は、ヤギ由来抗プレアルブミンポリクローナル抗体（キャプチャー抗体）のリン酸緩衝液（１．０ ｍｇ／ｍＬ）を塗布し、自然乾燥することにより形成した。コントロールライン１５は、ウサギ由来抗ヤギＩｇＧ抗体（血漿タンパクが結合していない標識抗体と結合可能な物質、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）のリン酸緩衝液（０．２ ｍｇ／ｍＬ）を塗布し、自然乾燥することにより形成した。
（検量線）
　標準物質を、生理食塩水により１，２００倍に希釈し、イムノクロマトテストストリップ１０の展開膜１１におけるコンジュゲートパッド１３とテストライン１４との間の位置に１０μＬを直接展開し、次いで、サンプルパット１２に展開液としてのトリス緩衝液１ｍＬを展開した。得られたテストライン１４の発色強度をテストストリップリーダーで測定することにより、検量線を作成した。
（血液サンプル）
　免疫比濁法により、プレアルブミンの濃度が予め判明している血液サンプルを２５検体準備した。
（実施例１）
　血液サンプル２５検体を、それぞれ生理食塩水により８００倍に希釈した液を調製した。次いで、イムノクロマトテストストリップ１０の展開膜１１におけるコンジュゲートパッド１３とテストライン１４との間の位置に１０μＬを直接展開し、次いで、サンプルパット１２に展開液としてのトリス緩衝液１ｍＬを展開した。得られたテストライン１４の発色強度をテストストリップリーダーで測定した。得られた発色強度と検量線とを比較することにより、それぞれの血液サンプルの濃度を求めた。求められた濃度と、免疫比濁法により測定された血液サンプルの濃度との相関性を評価した結果を図２に示す。その結果、Ｒ２の値（相関係数）は０．９６であり、本発明の方法により定量的にプレアルブミンの濃度が測定できることが明らかとなった。
（比較例１）
　生理食塩水による血液サンプルの希釈倍率が８０倍であること以外は、実施例１と同様に実施したが、テストライン１４の発色が血液の赤色により見えにくく、定性的に判定することは困難であった。
　本発明は、安価かつ簡易的にイムノクロマトテストストリップを用いて全血中の血漿タンパクを測定する方法を提供することができ、血漿タンパクとしてプレアルブミンを選択した場合、ヒトの栄養状態を迅速に診断することができるようになる。
１０・・・イムノクロマトテストストリップ
１１・・・展開膜
１２・・・サンプルパッド
１３・・・コンジュゲートパッド
１４・・・テストライン
１５・・・コントロールライン
１６・・・吸収パッド
１７・・・ベース素材

Claims (7)

  1. 　イムノクロマト法で血漿タンパクを測定する方法であって、
    　ヒトから採取された血液を１００～１００００倍に希釈する工程；
    　希釈した血液をイムノクロマトテストストリップに展開する工程；
    　希釈した血液が展開されたイムノクロマトテストストリップの発色を分析する工程；
    を含み、
    　全血を血漿または血清と血球成分に分離せず、
    　上記イムノクロマトテストストリップが、赤血球が毛細管現象により移動可能な展開膜と、サンプルパッドと、血漿タンパクと結合可能な標識抗体を有するコンジュゲートパッドと、を具備しており、
    　上記展開膜に、上記標識抗体と結合した血漿タンパクと結合可能なキャプチャー抗体で形成されたテストラインと、血漿タンパクが結合していない上記標識抗体と結合可能な物質で形成されたコントロールラインと、が設けられている血漿タンパクの測定方法。
  2. 　上記血漿タンパクが、アルブミン、プレアルブミン、グロブリン、フィブリノーゲン、アンチトロンビン、トランスフェリン、セルロプラスミンまたはＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）のうちの少なくともいずれか１つを含むものである請求項１に記載の血漿タンパクの測定方法。
  3. 　上記血漿タンパクが、プレアルブミンである請求項２に記載の血漿タンパクの測定方法。
  4. 　上記展開膜が、孔径５～１００μｍを有するものである請求項１から３のいずれかに記載の血漿タンパクの測定方法。
  5. 　上記標識抗体が、金属コロイド修飾抗体である請求項１から４のいずれかに記載の血漿タンパクの測定方法。
  6. 　上記金属コロイド修飾抗体が、金コロイド修飾抗体である請求項５に記載の血漿タンパクの測定方法。
  7. 　イムノクロマトリーダを用いて上記イムノクロマトテストストリップの発色を分析する請求項１から６のいずれかに記載の血漿タンパクの測定方法。
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