KR101308354B1

KR101308354B1 - 카로테노이드의 분리법

Info

Publication number: KR101308354B1
Application number: KR1020117020087A
Authority: KR
Inventors: 가즈아키 히라사와; 아키라 츠보쿠라
Original assignee: 제이엑스 닛코닛세키에너지주식회사
Priority date: 2009-01-30
Filing date: 2010-01-28
Publication date: 2013-09-17
Also published as: AU2010208932B2; US8853460B2; CA2751036C; CN102300998B; NO2392666T3; NZ594438A; EP2392666A4; JP5155898B2; EP2392666B1; CN102300998A; WO2010087400A1; AU2010208932A1; CL2011001798A1; JP2010172293A; KR20110111511A; CA2751036A1; US20120059192A1; EP2392666A1

Abstract

본 발명은 카로테노이드 산생 세균의 배양물로부터 카로테노이드를 고수율로 회수하는 방법을 제공한다. 상세하게는, 본 발명은 카로테노이드를 생산하는 세균의 배양물로부터, 산성 조건하에서 카로테노이드를 함유하는 농축물을 침전시키는 공정을 포함하는 카로테노이드의 분리 방법, 그리고 카로테노이드를 생산하는 세균의 배양물로부터, 산성 조건하에서 카로테노이드를 함유하는 농축물을 침전시키고, 얻어지는 침전물로부터 카로테노이드를 회수하는 공정을 포함하는 카로테노이드의 제조 방법을 제공한다.

Description

카로테노이드의 분리법{METHOD FOR SEPARATING CAROTENOID}

본 발명은 카로테노이드의 미생물학적 제조 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 사료 첨가물, 식품 첨가물, 화장품 소재, 의약품 원료 등으로서 유용한 아스타크산틴, 칸타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 리코펜, β-카로틴, 페니코크산틴, 아도니크산틴, 에키네논, 아스테로이데논 및 3-하이드록시에키네논 등의 카로테노이드를 카로테노이드 생산 세균의 배양물로부터 분리하는 방법에 관한 것이다.

카로테노이드는 사료 첨가물, 식품 첨가물, 화장품 소재, 의약품 등으로서 유용한 천연 색소이다. 카로테노이드에는, 아스타크산틴, 칸타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 리코펜, β-카로틴, 페니코크산틴, 아도니크산틴, 에키네논, 아스테로이데논 및 3-하이드록시에키네논 등이 포함된다. 그 중에서도, 아스타크산틴은 양식어인 연어, 송어, 참돔 등의 체색 개선제나, 가금류의 난황색 개선제와 같은 사료 첨가물로서 유용하다. 또, 아스타크산틴은 안전한 천연의 식품 첨가물이나 건강 식품 소재, 화장품 소재로서 산업상 가치가 높다. 아도니크산틴 및 페니코크산틴은, 공업적 제조법이 확립됨으로써, 아스타크산틴과 동일하게 사료 첨가물, 식품 첨가물, 화장품 소재, 의약품 등으로서의 용도가 기대되고 있다. 또한, β-카로틴은 사료 첨가물, 식품 첨가물, 화장품 소재, 의약품 등으로서 사용되고, 칸타크산틴은 사료 첨가물, 식품 첨가물, 화장품 등으로서 사용되며, 제아크산틴은 식품 첨가물, 사료 첨가물, 화장품 소재 등으로서 사용되고 있다. 또한 리코펜, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-하이드록시에키네논, 아스테로이데논 등도 사료 첨가물, 식품 소재, 화장품 소재 등으로서의 사용이 기대된다. 이들 카로테노이드의 제조 방법으로는, 화학 합성법, 천연물로부터의 추출법, 미생물에 의한 산생 방법 등이 알려져 있다.

아스타크산틴의 화학 합성법으로는 β-카로틴의 변환에 의한 방법 (비특허문헌 1 : Pure Appl. Chem., 57, 741, 1985) 및 C15 포스포늄염으로부터 합성하는 방법 (비특허문헌 2 : Helv. Chim. Acta, 64, 2436, 1981) 이 알려져 있다. 또, 아스타크산틴은 참돔, 연어 등의 어류 및 새우, 게, 크릴 새우 등의 갑각류에 존재하기 때문에, 이들로부터 추출할 수도 있다. 화학 합성법으로 제조된 아스타크산틴은 사료 첨가물로서 판매되고 있다.

미생물에 의한 아스타크산틴의 생산 방법으로는, 녹조류 Haematococcus pluvialis 에 의한 배양법 (특허문헌 1 : 일본 공개특허공보 2007-97584호), 적색 효모 Phaffia rhodozyma 에 의한 발효법 (특허문헌 2 : 일본 공개특허공보 평11-69969호), Sphingomonas 속에 속하는 세균에 의한 발효법 (특허문헌 3 : 일본 공개특허공보 2006-191919호), Brevundimonas 속에 속하는 세균에 의한 발효법 (특허문헌 4 : 일본 공개특허공보 2006-340676호), Erythrobacter 속에 속하는 세균에 의한 발효법 (특허문헌 5 : 일본 공개특허공보 2008-259452호), Paracoccus 속에 속하는 세균 (이하, 「Paracoccus 속 세균」이라고도 한다) 에 의한 발효법이 보고되어 있다. 아스타크산틴을 생산하는 Paracoccus 속에 속하는 세균의 예로는, E-396 주 및 A-581-1 주를 들 수 있다 (특허문헌 6 : 일본 공개특허공보 평7-79796호 및 비특허문헌 3 : International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 277-282). 다른 아스타크산틴 생산성의 Paracoccus 속에 속하는 세균으로는, Paracoccus marcusii MH1 주 (특허문헌 7 : 일본 공표특허공보 2001-512030호), Paracoccus haeundaensis BC74171 주 (비특허문헌 4 : International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1699-1702), Paracoccus 속 세균 N-81106 주 (특허문헌 8 : 일본 공개특허공보 2007-244205호), Paracoccus zeaxanthinifaciens (비특허문헌 5 : International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238) 및 Paracoccus sp. PC-1 주 (특허문헌 9 : WO2005/118812호) 등을 들 수 있다.

그러나, 전술한 카로테노이드의 제조 방법은 몇 가지의 과제가 있었다. 예를 들어, 화학 합성법은 안전성의 관점에서 소비자에게 바람직하지 않은 인상을 주는 것이다. 또, 천연물로부터의 추출은 제조 비용이 비싸다. 또한, 녹조류나 효모에 의한 산생에서는 생산성이 낮은 데다가 강고한 세포벽을 갖기 때문에 카로테노이드의 추출이 곤란하다.

한편, Paracoccus 속에 속하는 세균은 증식 속도가 빠르고, 카로테노이드의 생산성이 높으며, 당해 세균으로부터의 카로테노이드의 추출이 용이하다는 등의 이점을 갖는다. 그런데, Paracoccus 속 세균은 카로테노이드를 일부 세포 밖으로 소포 (小胞) 로서 분비하여, 많은 카로테노이드가 극소 미립자로서 액 중에 분산되어 있으므로, 배양물로부터 상청을 제거하여 카로테노이드를 고수율로 회수하기 곤란했다. Paracoccus 속 세균 이외의 카로테노이드 생산 미생물로서 종래부터 잘 알려진 녹조류 Haematococcus pluvialis 나 적색 효모 Phaffia rhodozyma 에 있어서는, 카로테노이드가 전부 세포 내에 축적되므로, 이와 같은 문제는 일어나지 않았다. 카로테노이드 산생 Paracoccus 속 세균에 의한 배양에서는, 세포 밖의 카로테노이드는 많을 때에는 세포 내를 포함한 카로테노이드 전체의 80 ％ 에나 달한다. Paracoccus 속 세균의 배양물로부터 카로테노이드를 분리하는 방법으로서, 세포를 펠릿화하기에 충분한 제 1 속도로 배양물을 원심 분리하여, 카로테노이드를 포함하는 상청을 회수하고, 그 카로테노이드 소포를 펠릿화하기에 충분한 제 2 속도로 그 상청을 원심 분리하는 방법이 제안되어 있다 (특허문헌 4 : 일본 공표특허공보 2001-512030호). 그러나, 카로테노이드는 배양 상청 중에서 매우 미소한 입자로서 존재하므로, 펠릿화하기 위해서는 100,000 × g 레벨의 초고속 원심 분리를 실시할 필요가 있어, 설비비 및 동력비를 고려하면 실용적이지 않았다.

일본 공개특허공보 2007-97584호 일본 공개특허공보 평11-69969호 일본 공개특허공보 2006-191919호 일본 공개특허공보 2006-340676호 일본 공개특허공보 2008-259452호 일본 공개특허공보 평7-79796호 일본 공표특허공보 2001-512030호 일본 공개특허공보 2007-244205호 국제공개 제2005/118812호 팜플렛

Pure Appl. Chem., 57, 741, 1985 Helv. Chim. Acta, 64, 2436, 1981 International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 277-282 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1699-1702 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238

본 발명은 이와 같은 실상을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 카로테노이드 산생 세균의 배양물로부터 상청을 제거하여, 카로테노이드를 고수율로 회수하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 다양하게 검토한 결과, 카로테노이드 산생 세균의 배양물의 pH 를 산성측으로 조정한 후, 원심 분리, 여과 분리 또는 데캔테이션을 실시함으로써 고수율로 카로테노이드를 분리할 수 있음을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다 :

(1) 카로테노이드를 생산하는 세균의 배양물로부터, 산성 조건하에서 카로테노이드 및 균체를 함유하는 농축물을 침전시키는 공정을 포함하는 카로테노이드의 분리 방법.

(2) 카로테노이드를 생산하는 세균의 배양물로부터, 산성 조건하에서 카로테노이드 및 균체를 함유하는 농축물을 침전시키고, 얻어지는 침전물로부터 카로테노이드를 회수하는 공정을 포함하는 카로테노이드의 제조 방법.

(3) 산성 조건이 pH 5.5 이하의 조건인 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.

(4) 산성 조건은 배양물에 산을 첨가함으로써 조정되는 것인 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.

(5) 산이 황산, 염산, 질산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 인산, 말산, 부티르산, 프로피온산, 옥살산, 글루콘산, 타르타르산, 프탈산, 탄산 및 아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 (4) 에 기재된 방법.

(6) 카로테노이드가 아스타크산틴, 칸타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 리코펜, β-카로틴, 페니코크산틴, 아도니크산틴, 에키네논, 아스테로이데논 및 3-하이드록시에키네논으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.

(7) 세균이 Paracoccus 속에 속하는 세균인 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.

(8) 세균의 16S 리보솜 RNA 에 대응하는 DNA 의 염기 배열이 배열 번호 1 에 기재된 염기 배열과 95 ％ 이상 상동인 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.

(9) 세균이 E-396 주 (FERM BP-4283) 혹은 A-581-1 주 (FERM BP-4671) 또는 그들의 변이주인 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.

(10) 농축물을 침전시키는 공정이 원심 분리, 여과 분리 및 데캔테이션으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종에 의해 실시되는 (1) 에 기재된 방법.

(11) (1) ∼ (10) 중 어느 1 항에 기재된 방법으로 얻어지는 카로테노이드 함유 조성물.

본 발명에 의해, 배양물로부터 상청을 제거하여, 카로테노이드를 고수율로 회수할 수 있게 되었다.

도 1 은 원심 분리에 의해 분리된 각 pH 에 있어서의 카로테노이드의 회수율을 나타내는 도면이다.
도 2 는 원심 분리에 의해 분리되고, 그 후 가열 처리에 제공된 각 pH 에 있어서의 카로테노이드의 회수율을 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 이들 설명에 한정되지 않고, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 저해하지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용한 모든 간행물, 예를 들어, 선행 기술 문헌, 공개 공보, 특허 공보 및 그 밖의 특허문헌은 그 전체가 본 명세서에 있어서 참고로서 도입된다. 본 명세서는 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허출원 2009-019935호 명세서 (출원일 : 2009년 1월 30일) 의 내용을 포함한다.

본 발명은 카로테노이드 산생 세균을 배양하고, 그 배양물로부터 카로테노이드를 제조하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 배양물로부터 원심 분리, 여과 분리 또는 데캔테이션에 의해 카로테노이드를 함유하는 농축물을 침전시키는 공정을 산성 조건하에서 실시하는 공정을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해, 카로테노이드를 저비용으로 제조할 수 있게 된다.

본 발명에 사용하는 세균으로는, 카로테노이드를 산생하는 세균이면 전혀 한정되지 않지만, 바람직하게는 Paracoccus 속, Sphingomonas 속, Brevundimonas 속 또는 Erythrobacter 속에 속하는 세균이 사용되며, 그 중에서도 Paracoccus 속에 속하는 세균이 바람직하다. Paracoccus 속에 속하는 세균 중에서는, Paracoccus carotinifaciens, Paracoccus marcusii, Paracoccus haeundaensis 및 Paracoccus zeaxanthinifaciens 가 바람직하게 사용되고, 특히 Paracoccus carotinifaciens 가 바람직하게 사용된다. Paracoccus 속에 속하는 세균의 구체적인 균주의 예로서, Paracoccus carotinifaciens E-396 주 (FERM BP-4283) 및 Paracoccus 속 세균 A-581-1 주 (FERM BP-4671) 를 들 수 있으며, 이들의 변이주도 본 발명에 바람직하게 사용된다.

또, 카로테노이드 산생 세균으로서, 바람직하게는 16S 리보솜 RNA 에 대응하는 DNA 의 염기 배열이 배열 번호 1 에 기재되는 E-396 주의 염기 배열과 높은 상동성을 갖는 세균이 사용된다. 여기서 말하는 「높은 상동성을 갖는다」란, 배열 번호 1 에 기재되는 염기 배열과 목적으로 하는 세균의 대응하는 염기 배열이 바람직하게는 95 ％ 이상, 보다 바람직하게는 96 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 97 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상 상동인 것을 의미한다.

16S 리보솜 RNA 에 대응하는 DNA 의 염기 배열이란, 16S 리보솜 RNA 의 염기 배열 중의 U (우라실) 를 T (티민) 로 치환한 염기 배열을 의미한다.

이 16S 리보솜 RNA 의 염기 배열의 상동성에 기초한 미생물 분류법은 최근 주류가 되었다. 종래의 미생물 분류법은 당해 미생물의 운동성, 영양 요구성, 당의 자화성 등 균학적 성질에 기초하였기 때문에, 자연 돌연변이에 의한 형질의 변화 등이 발생한 경우, 미생물을 잘못 분류하는 경우가 있었다. 이에 대하여, 16S 리보솜 RNA 의 염기 배열은 매우 유전적으로 안정적이므로, 그 상동성에 기초한 분류법은 종래의 분류법에 비해 분류의 신뢰도가 현격히 향상된다.

Paracoccus carotinifaciens E-396 주의 16S 리보솜 RNA 의 염기 배열과, 다른 카로테노이드 산생 세균 Paracoccus marcusii DSM 11574 주, Paracoccus 속 세균 N-81106 주, Paracoccus haeundaensis BC 74171 주, Paracoccus 속 세균 A-581-1 주, Paracoccus zeaxanthinifaciens ATCC 21588 주, 및 Paracoccus sp. PC-1 주의 16S 리보솜 RNA 의 염기 배열과의 상동성은, 각각 99.7 ％, 99.7 ％, 99.6 ％, 99.4 ％, 95.7 ％ 및 95.4 ％ 여서, 이들은 분류학상 매우 근연한 균주임을 알 수 있다. 따라서, 이들 균주는 카로테노이드를 산생하는 세균으로서 하나의 그룹을 형성하고 있다고 할 수 있다. 이 때문에, 이들 균주는 본 발명에 바람직하게 사용되고, 카로테노이드를 효율적으로 산생할 수 있다.

본 발명에 있어서, 카로테노이드의 생산성이 개량된 변이주도 사용할 수 있다. 개량된 변이주의 예로는, 아스타크산틴 생산능이 높은 균주 (일본 공개특허공보 2001-95500호), 칸타크산틴을 선택적으로 많이 산생하는 균주 (일본 공개특허공보 2003-304875호), 제아크산틴과 β-크립토크산틴을 선택적으로 많이 산생하는 균주 (일본 공개특허공보 2005-87097호), 리코펜을 선택적으로 산생하는 균주 (일본 공개특허공보 2005-87100호), 침강성이 향상된 균주 등을 들 수 있다.

카로테노이드의 생산성이 개량된 변이주는 변이 처리와 스크리닝에 의해 취득할 수 있다. 변이 처리하는 방법은 변이를 유발하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 및 에틸메탄술포네이트 (EMS) 등의 변이제에 의한 화학적 방법, 자외선 조사 및 X 선 조사 등의 물리적 방법, 유전자 재조합 및 트랜스포존 등에 의한 생물학적 방법 등을 사용할 수 있다. 변이 처리되는 미생물은 특별히 한정되지 않지만, 카로테노이드 산생 세균인 것이 바람직하다. 또, 변이주는 자연적으로 일어나는 돌연변이에 의해 생성된 것이어도 된다.

변이주의 스크리닝 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 한천 배지 상의 콜로니의 색조로 목적으로 하는 변이주를 선택하는 방법 외에, 시험관, 플라스크, 발효조 등에서 변이주를 배양하고, 흡광도, 고속 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 등을 이용한 카로테노이드 색소 분석에 의해 목적으로 하는 변이주를 선택하는 방법 등이 예시된다.

변이 및 스크리닝의 공정은 1 회이어도 되고, 또, 예를 들어 돌연변이 처리와 스크리닝에 의해 변이주를 얻고, 이것을 다시 변이 처리와 스크리닝에 의해 생산성이 개량된 변이주를 취득하도록, 변이 및 스크리닝 공정을 2 회 이상 반복해도 된다.

본 발명에서 생산되는 카로테노이드는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 아스타크산틴, 칸타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 리코펜, β-카로틴, 페니코크산틴, 아도니크산틴, 에키네논, 아스테로이데논 또는 3-하이드록시에키네논이고, 바람직하게는 크산토필 (즉 함산소 카로테노이드) 인 아스타크산틴, 칸타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 페니코크산틴, 아도니크산틴, 에키네논, 아스테로이데논 또는 3-하이드록시에키네논이다. 보다 바람직하게는, 아스타크산틴, 칸타크산틴, 페니코크산틴, 아도니크산틴, 제아크산틴 또는 β-크립토크산틴이고, 더욱 바람직하게는 아스타크산틴이다. 본 발명에 의해 제조되는 카로테노이드는 1 종이어도 되고, 복수 종이 조합되어 있어도 된다. 또, 아스타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 페니코크산틴, 아도니크산틴 등, 수산기를 갖는 카로테노이드에 있어서는, 지방산과의 에스테르체, 또는 당과 결합된 글루코시드체, 화합물과 결합되어 있지 않은 프리체 등의 존재 형태가 있을 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 카로테노이드는 어느 존재 형태이어도 되지만 프리체인 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 있어서 상기 세균을 배양하는 방법을 이하에 설명한다.

본 발명의 배양에 사용하는 카로테노이드 생산용 배지는 카로테노이드 산생 세균이 생육되고, 카로테노이드를 생산하는 것이라면 어느 것이어도 되는데, 탄소원, 질소원, 무기 염류 및 필요에 따라 비타민류 등을 함유하는 배지가 바람직하게 사용된다.

탄소원으로는, 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 프룩토오스, 트레할로오스, 만노오스, 만니톨 및 말토오스 등의 당류, 아세트산, 푸마르산, 시트르산, 프로피온산, 말산, 말론산 및 피루브산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥사놀, 이소부탄올 및 글리세놀 등의 알코올류, 대두유, 미강유, 올리브유, 옥수수유, 참기름 및 아마인유 등의 유지류 등을 들 수 있고, 그 중에서도 바람직하게는 글루코오스 또는 수크로오스가 사용된다. 이들 탄소원 중, 1 종 또는 2 종 이상을 사용할 수 있다. 배양 전의 배지 (시발 (始發) 배지) 에 첨가하는 양은 탄소원의 종류에 따라 상이하며 적절히 조정하면 되는데, 통상적으로 배지 1 ℓ 당 1 ∼ 100 g, 바람직하게는 2 ∼ 50 g 이다. 또, 탄소원은 시발 배지에 첨가할 뿐만 아니라, 배양 도중에 축차적 또는 연속적으로 추가 공급하는 것도 바람직하게 실시된다.

무기 질소원으로는, 질산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염류, 질산칼륨 등의 질산염류, 암모니아 및 우레아 등 중, 1 종 또는 2 종 이상이 사용된다. 첨가량은 질소원의 종류에 따라 상이하며 적절히 조정하면 되는데, 통상적으로는 배지 1 ℓ 에 대하여 0.1 g ∼ 20 g, 바람직하게는 0.2 ∼ 10 g 이다.

유기 질소원으로는, 예를 들어, 콘 스팁 리커 (여과 처리물을 포함한다), 파마 미디어, 콩깻묵, 대두 분말, 피넛 밀, 디스틸러즈 솔러블, 건조 효모, 글루탐산 소다 등 중, 1 종 또는 2 종 이상이 사용된다. 첨가 농도는 질소원의 종류에 따라 상이하며 적절히 조정하면 되는데, 통상적으로 0 ∼ 80 g/ℓ, 바람직하게는 0 ∼ 30 g/ℓ 다.

무기 질소원 및 유기 질소원은 통상적으로 시발 배지에 첨가하는데, 축차적 또는 연속적으로 추가 공급하는 것도 바람직하게 실시된다.

무기 염류로는, 예를 들어, 인산 2 수소칼륨, 인산수소 2 칼륨, 인산수소 2 나트륨 등의 인산염류, 황산마그네슘, 염화마그네슘 등의 마그네슘염류, 황산철, 염화철 등의 철염류, 염화칼슘, 탄산칼슘 등의 칼슘염류, 탄산나트륨, 염화나트륨 등의 나트륨염류, 황산망간 등의 망간염류, 염화코발트 등의 코발트염류, 황산구리 등의 구리염류, 황산아연 등의 아연염류, 몰리브덴산나트륨 등의 몰리브덴염류, 황산니켈 등의 니켈염류, 셀렌산나트륨 등의 셀렌염류, 붕산 및 요오드화칼륨 등 중, 1 종 또는 2 종 이상이 사용된다. 첨가량은 무기염의 종류에 따라 상이하며 적절히 조정하면 되는데, 통상적으로 배지 1 ℓ 에 대하여 0.0001 ∼ 15 g 이다. 무기 염류는 통상적으로 시발 배지에 첨가하는데, 축차적 또는 연속적으로 추가 공급해도 된다.

비타민류로는, 예를 들어, 시아노코발라민, 리보플라빈, 판토텐산, 피리독신, 티아민, 아스코르브산, 엽산, 니아신, p-아미노벤조산, 비오틴, 이노시톨, 콜린 등을 사용할 수 있다. 첨가 비율은 비타민류의 종류에 따라 상이하며 적절히 조정하면 되는데, 통상적으로 배지 1 ℓ 에 대하여 0.001 ∼ 1000 ㎎ 이고, 바람직하게는 0.01 ∼ 100 ㎎ 이다. 비타민류는 통상적으로 시발 배지에 첨가하는데, 축차적 또는 연속적으로 추가 공급해도 된다.

본 발명에 있어서, 배양물의 발포를 억제하기 위해 소포제가 바람직하게 사용된다. 소포제의 종류는 기포의 발생을 억제하고 또는 발생한 기포를 없애는 작용이 있으며, 또한 생산균에 대한 저해 작용이 적은 것이면 어느 것이어도 된다. 예를 들어, 알코올계 소포제, 폴리에테르계 소포제, 에스테르계 소포제, 지방산계 소포제, 실리콘계 소포제, 술폰산계 소포제 등을 예시할 수 있다. 첨가량은 소포제의 종류에 따라 상이하며 적절히 조정하면 되는데, 통상적으로 배지 1 ℓ 에 대하여 0.01 g ∼ 10 g 이다.

소포제는 통상적으로 살균 전의 시발 배지에 첨가한다. 또한, 배양 도중에 연속적 또는 간헐적으로 추가 첨가해도 된다.

본 발명에 있어서 사용하는 카로테노이드 생산용 배지는 살균 처리한 후, 세균의 배양에 사용된다. 살균 처리는 당업자라면 적절히 실시할 수 있다. 예를 들어, 적절한 용기 중의 배지를 오토클레이브로 가열 멸균시키면 된다. 혹은, 멸균 필터에 의해 여과 멸균시키면 된다.

본 발명에 있어서 사용하는 카로테노이드 생산용 배지의 초기 pH 는 2 ∼ 12, 바람직하게는 6 ∼ 9, 보다 바람직하게는 6.5 ∼ 8.0 으로 조정한다. 배양 중에도 상기 범위의 pH 를 유지하는 것이 바람직하다. pH 조정제로는, 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 탄산나트륨 수용액, 암모니아수, 암모니아 가스, 황산 수용액 또는 이들의 혼합물이 예시된다.

본 발명에 있어서, 카로테노이드 생산 세균은 상기와 같이 조제된 카로테노이드 생산용 배지에 식균되어, 소정의 조건으로 배양된다. 식균은 시험관, 플라스크 혹은 발효조 등을 사용한 시드 배양에 의해 균주를 적절히 증가시키고, 얻어진 배양물을 카로테노이드 생산용 배지에 첨가함으로써 실시한다. 시드 배양에 사용하는 배지는 카로테노이드 생산균이 양호하게 증식되는 배지이면 특별히 한정되지 않는다.

배양은 적절한 배양 용기에서 실시된다. 배양 용기는 배양 용량에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들어, 시험관, 플라스크, 발효조 등을 들 수 있다.

배양 온도는 15 ∼ 80 ℃, 바람직하게는 20 ∼ 35 ℃, 보다 바람직하게는 25 ℃ ∼ 32 ℃ 이며, 통상적으로 1 일 ∼ 20 일간, 바람직하게는 2 ∼ 12 일간, 보다 바람직하게는 3 ∼ 9 일간, 호기 조건으로 배양을 실시한다. 호기 조건으로는, 예를 들어, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등을 들 수 있으며, 용존 산소 농도를 일정한 범위로 제어하는 것이 바람직하다. 용존 산소 농도의 제어는, 예를 들어, 교반 회전수, 통기량, 내압 등을 변화시킴으로써 실시할 수 있다. 용존 산소 농도는 바람직하게는 0.3 ∼ 10 ppm, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 7 ppm, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 ppm 으로 제어한다.

본 발명에서는, 상기와 같이 카로테노이드 산생 세균을 배양하여 얻어지는 배양물로부터 원심 분리, 여과 분리 또는 데캔테이션에 의해 카로테노이드 및 균체를 함유하는 농축물을 침전시키는 공정 (즉, 카로테노이드의 분리) 을 산성 조건하에서 실시하는 것을 특징으로 한다. 산성 조건으로 함으로써 배양 상청 중에 분산되어 있는 카로테노이드가 응집되어, 카로테노이드의 입자 직경이 커짐과 함께 침강성이 향상되므로, 분리 공정에 있어서 배양물을 상청과 카로테노이드 및 균체를 함유하는 농축물로 분리하는 것이 매우 용이해진다. 여기서, 본 명세서에 있어서, 「배양물」이란, 배양 상청, 배양 균체, 또는 균체의 파쇄물 모두를 의미하는 것이다.

배양물을 산성 조건으로 조정하는 방법은 통상적으로 배양물에 산을 첨가함으로써 실시한다. 또, 다른 방법으로는, 본 발명의 배양에 있어서는 탄소원을 소비하면서 pH 는 저하되어 가므로, 배양 후기에 알칼리에 의한 pH 제어를 정지시켜, 분리에 적합한 산성 pH 에 도달한 시점에서 배양을 종료하는 방법도 있다.

배양물을 산성 조건으로 하는 경우에 사용하는 산은 산이면 어느 것이어도 되는데, 예를 들어, 황산, 염산, 질산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 인산, 말산, 부티르산, 프로피온산, 옥살산, 글루콘산, 타르타르산, 프탈산, 탄산, 아스코르브산 등을 예시할 수 있다. 이들 산은 최대 농후액이어도 되지만, 물 등으로 희석된 산을 사용해도 된다.

산성 조건은 산성역이면 어느 pH 이어도 되는데, 상한은 바람직하게는 pH 5.5 이하, 보다 바람직하게는 pH 5.2 이하, 더욱 바람직하게는 pH 4.9 이하이다. 하한에 제한은 없지만, 바람직하게는 pH 0.5 이상, 보다 바람직하게는 pH 1.5 이상이다. pH 조정은 통상적으로 pH 전극으로 배양물의 pH 를 모니터하면서 산을 첨가함으로써 실시한다.

배양물은 산성역으로 pH 조정한 후 그대로 분리 조작을 실시할 수도 있지만, 불필요한 성분의 제거 효과를 높이기 위해 물로 배양물을 희석시키고 나서 분리하는 것도 바람직하게 실시된다. 그 때의 배양물의 pH 조정은 물을 첨가하기 전이어도 되고, 물을 첨가한 후이어도 된다. 또, 원심 분리, 여과 분리, 데캔테이션 등의 조작의 도중에 물을 첨가할 수도 있다. 희석을 위해 첨가하는 물의 양에 제한은 없지만, 바람직하게는 배양물 용적의 0 ∼ 10 배, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 3.0 배이다. 또, 배양 종료 후, 분리할 때까지의 동안에 배양 미생물을 사멸시키기 위해 가열 살균을 실시할 수도 있다. 이 경우의 pH 조정은 가열 살균 전이어도 되고 이후이어도 된다.

본 발명에 있어서의 카로테노이드의 분리 방법은 침강성에 기초하여 분리하는 방법 혹은 입자의 크기에 기초하여 분리하는 방법이라면 어느 방법이어도 되는데, 바람직하게는 원심 분리, 여과 분리 또는 데캔테이션이 사용된다. 이들은 단독이어도 되지만, 2 종 이상을 조합해도 된다. 또, 1 회 원심 분리를 실시하고, 상청액에 남은 카로테노이드를 추가로 회수하기 위해 한번 더 상청액만을 원심 분리에 제공하도록 동종의 분리를 2 회 이상 반복해도 된다.

원심 분리에 사용하는 원심 분리기는 연속식이어도 되고 배치식이어도 되는데, 바람직하게는 연속식이 사용된다. 타입은 어느 타입이어도 되는데, 예를 들어, 바구니형, 다실형, 디캔터형, 디스크형 (노즐형, 디슬러지형), 튜블러형, 로터형의 원심 분리기를 들 수 있다. 원심 가속도는 일반적인 세균의 균체 분리에 사용되는 레벨이라면 어느 레벨이어도 되는데, 바람직하게는 500 ∼ 100,000 × g, 보다 바람직하게는 1,000 ∼ 50,000 × g 이다.

여과 분리에 사용하는 막 여과 장치는 스태틱형이어도 되고 크로스 플로우형이어도 되는데, 막힘을 방지하기 쉬운 크로스 플로우형이 바람직하다. 사용되는 막의 재질은, 예를 들어, 여과지, 여과천, 화학 섬유, 세라믹 등을 예시할 수 있다. 또, 규조토 등을 여과 보조제로서 사용해도 된다. 여과를 촉진시키는 힘의 방식으로는 가압형, 감압형, 원심 여과형, 필터 프레스형 등, 막의 형상으로는, 평막, 중공사막, 통형막 등이 예시된다. 막의 구멍 직경은 통상적으로 세균을 분리하기에 적합한 것이라면 어느 것이어도 되는데, 바람직하게는 0.001 ㎛ ∼ 100 ㎛, 보다 바람직하게는 0.01 ∼ 10 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 1 ㎛ 다. 정밀 여과막, 한외 여과막이 바람직하고, 정밀 여과막이 특히 바람직하게 사용된다.

데캔테이션에 사용하는 용기는 어느 용기이어도 되는데, 예를 들어, 통상적인 원통형 탱크가 사용된다. 데캔테이션으로 배양물을 가만히 정지시키는 시간에 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 0.5 h ∼ 48 h, 보다 바람직하게는 1 h ∼ 24 h 이다.

분리에 제공하는 배양물의 온도는 통상적인 온도이면 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 0 ℃ ∼ 90 ℃, 보다 바람직하게는 2 ℃ ∼ 75 ℃, 더욱 바람직하게는 4 ℃ ∼ 60 ℃ 이다.

상기 분리 공정, 즉 원심 분리, 여과 분리 또는 데캔테이션, 또는 이들의 조합에 의해 배양물로부터 얻어진 침전 농축물에는, 카로테노이드와 균체가 농축된다. 침전 농축물이 다음 공정에 적합한 점도, 수분 함량이 되도록 분리 속도, 분리 강도 등을 적절히 조정하는 것도 바람직하게 실시할 수 있다. 분리 공정 후의 카로테노이드의 농축물 중으로의 회수율은 카로테노이드의 분해·열화, 장치 내면 등에 대한 부착, 상청액으로의 누설 등의 영향에 의해 변화될 수 있는데, 바람직하게는 70 ∼ 100 ％, 보다 바람직하게는 80 ∼ 100 ％, 더욱 바람직하게는 90 ∼ 100 ％ 이다.

얻어진 침전 농축물을 건조시킴으로써, 카로테노이드를 함유하는 건조 균체를 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 건조 균체는 그대로 사료 첨가물로서 사용할 수 있다. 또, 건조 균체로부터 카로테노이드를 추출하고, 필요에 따라 정제하여, 식품용, 화장품용, 사료용으로서 사용할 수 있다. 침전 농축물을 건조시키지 않고 카로테노이드를 추출 회수함으로써, 카로테노이드를 제조할 수 있다. 건조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 분무 건조, 유동 건조, 분무 조립 (造粒) 건조, 분무 조립 유동 건조, 회전식 드럼 건조, 동결 건조 등을 들 수 있다. 또, 배양물, 침전 농축물, 혹은 건조 균체의 단계에 있어서, 알칼리 시약 혹은 계면 활성제 등을 사용한 화학적 처리, 용균 효소, 지질 분해 효소 혹은 단백질 분해 효소 등을 사용한 생화학적 처리, 또는 초음파, 분쇄, 가열 등의 물리적 처리 중 1 개 혹은 2 개 이상의 처리를 실시해도 된다.

카로테노이드를 배양물로부터 추출하는 경우, 추출 및 세정에 사용하는 용매는 특별히 한정되지 않지만, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 저급 알코올류, 아세톤, 테트라하이드로푸란, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭사이드, 헥산 등을 들 수 있다.

이와 같이 얻어진 추출물을 카로테노이드로서 그대로 사용할 수 있으며, 추가로 정제하여 사용할 수도 있다. 추출 조작 후의 추출물로부터 균체 등을 분리하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 여과, 원심 분리, 데캔테이션 등이 사용된다. 추출액으로부터 카로테노이드 침전물을 얻는 방법으로는, 예를 들어, 냉각, 가열, 감압 농축, 빈(貧)용매 첨가, 산·알칼리 약제 등 각종 염류의 첨가 및 이들의 조합에 의해 침전시키는 방법을 들 수 있다. 얻어진 카로테노이드 침전물은 세정을 위해 필요에 따라 소량의 저급 알코올류 등의 용매를 사용하여 현탁 교반시켜도 된다. 세정의 수법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 현탁 교반 후에 여과 채취하는 방법 또는 침전물 상으로부터 통액시키는 방법 등을 실용적으로 바람직한 방법으로서 들 수 있다.

배양물, 침전 농축물, 건조 균체, 추출액, 정제물 및 각 공정 조작에 있어서의 카로테노이드의 산화 분해를 최대한 방지하고자 하는 경우에는, 질소 가스 등의 불활성 가스 분위기에서 실시할 수 있다. 또, 의약품이나 식품에서 사용되고 있는 산화 방지제를 선택하여 첨가해도 된다. 혹은, 이들 처리를 조합해도 된다. 또, 광에 의한 카로테노이드의 분해를 최대한 방지하기 위해, 광을 조사하지 않는 조건하에서 실시해도 된다.

상기와 같이 얻어지는 침전 농축물, 건조 균체, 추출물 또는 정제물은 카로테노이드로서 각각 단독으로 사용할 수도 있으며, 이들을 임의의 비율로 혼합하여 사용할 수도 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명의 범위는 이하의 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 실시예에 있어서의 카로테노이드류의 정량은 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 를 사용하여 이하와 같이 실시하였다.

칼럼은 Wakosil-II 5 SIL-100 (φ4.6 × 250 ㎜) (와코 준야쿠 제조) 을 2 개 연결시켜 사용하였다. 용출은 이동상인 n-헥산-테트라하이드로푸란-메탄올 혼합액 (40 : 20 : 1) 을 실온 부근 일정한 온도에서 매분 1.0 ㎖ 흐르게 함으로써 실시하였다. 측정에 있어서는, 샘플을 테트라하이드로푸란으로 용해시킨 것을 이동상으로 100 배 희석시킨 액 20 ㎕ 를 주입량으로 하고, 칼럼 용리액의 검출은 파장 470 ㎚ 에서 실시하였다. 또, 정량을 위한 표준품으로는, 시그마사 제조의 아스타크산틴 (Cat. No.A9335) 을 사용하였다. 표준액의 아스타크산틴 농도의 설정은 표준액의 477 ㎚ 의 흡광도 (A) 및 상기 조건으로 HPLC 분석을 실시하였을 때의 아스타크산틴 피크의 면적 백분율 ％ (B) 를 측정한 후, 이하의 식을 사용하여 실시하였다.

아스타크산틴의 농도 (㎎ /ℓ) ＝ A ÷ 2150 × B × 100

실시예 1

이하 조성의 배지 (수크로오스 30 g/ℓ, 콘 스팁 리커 30 g/ℓ, 인산 2 수소칼륨 0.54 g/ℓ, 인산수소 2 칼륨 2.78 g/ℓ, 염화칼슘 2 수화물 0.1 g/ℓ, 황산마그네슘 7 수화물 12 g/ℓ, 황산철 7 수화물 0.3 g/ℓ, pH 7.2) 100 ㎖ 를 500 ㎖ 용량의 삼각 플라스크에 넣고 121 ℃ 에서 15 분간 오토클레이브 살균하여, 시드용 플라스크 배지를 조제하였다.

다음으로 이하 조성의 배지 (수크로오스 20 g/ℓ, 콘 스팁 리커 30 g/ℓ, 인산 2 수소칼륨 1.5 g/ℓ, 인산수소 2 나트륨 12 수화물 3.8 g/ℓ, 염화칼슘 2 수화물 0.2 g/ℓ, 황산마그네슘 7 수화물 3.0 g/ℓ, 황산철 7 수화물 1.0 g/ℓ, 알코올계 소포제 0.5 g/ℓ) 2.0 ℓ 를 5 ℓ 용량의 발효조에 넣고 121 ℃ 에서 30 분간 오토클레이브 살균하였다.

Paracoccus carotinifaciens E-396 주 (FERM BP-4283) 를 시드용 플라스크 배지에 일 백금이 식균하고, 28 ℃ 에서 2 일간, 150 rpm 으로 회전 진탕 배양을 실시하였다. 다음으로, 그 배양물 80 ㎖ 를 발효조에 식균하고, 28 ℃, 통기량 1 vvm 의 호기 배양을 100 시간 실시하였다. 배양 중의 pH 가 7.2 를 유지하도록 20 ％ NaOH 로 연속적으로 제어하였다. 탄소원이 고갈되지 않도록 배양 1 일째 및 2 일째에 각각 30 g 씩 글루코오스를 첨가하였다. 또, 최저 교반 회전수를 200 rpm 으로 하고 배양물 중의 용존 산소 농도가 2 ∼ 4 ppm 을 유지하도록 교반 회전수를 변화시켰다. 기포 센서로 발포를 감지함으로써 알코올계 소포제를 자동 첨가하며 발포를 억제하였다. 배양 종료시의 배양물 중의 카로테노이드 농도를 측정한 결과, 결과는 표 1 에 나타내는 바와 같았다. 또 배양물의 pH 를 측정한 결과 pH 6.7 이었다.

	카로테노이드 농도 ㎎/ℓ
β-카로틴	3.95
에키네논	1.62
3-하이드록시에키네논	0.33
칸타크산틴 페니코크산틴	1.90 4.95
β-크립토크산틴	0.04
아스타크산틴	19.86
아스테로이데논	0.40
아도니크산틴	6.05
제아크산틴	0.21
총 카로테노이드	39.31

얻어진 배양물을 혼합하면서 30 ㎖ 씩 8 개의 비커에 채취하여, 하나는 pH 6.7 인 채로 하고, 나머지 7 개는 25 ％ 황산 수용액으로 각각 pH 5.5, pH 5.2, pH 4.9, pH 4.1, pH 3.0, pH 1.5 및 pH 0.5 로 조정하였다. 이것을 50 ㎖ 용량의 원침관 (遠沈管) 으로 옮겨, 원심 가속도 3,000 × g, 50 ℃, 10 분간의 앵글 로터에 의한 원심 분리를 실시하였다. 원심 분리 후, 신속하게 원침관을 별도의 용기 위에서 기울여 거꾸로 함으로써 상청액을 옮기고, 원침관의 바닥에 펠릿으로서 부착된 침전 농축물과 분리하였다. 또한 정제하지 않고 침전 농축물 중의 카로테노이드를 분석하고, 이하의 식에 의해 각 카로테노이드 성분에 대한 분리 회수율을 산출하였다.

회수율 ％＝ 침전 농축물 중의 각 카로테노이드 성분의 중량 (㎎) ÷ 분리 전의 배양물 중의 각 카로테노이드 성분의 중량 (㎎) × 100

배양물 각 pH 에 있어서의 카로테노이드의 분리 회수율을 표 2 및 도 1 에 나타냈다. 아스타크산틴 및 총 카로테노이드의 회수율은 pH 6.7 에서는 50 ％ 이하였지만, pH 5.5 이하에서는 90 ％ 이상을 나타냈다.

다음으로, 분리 공정 후의 가열 살균 공정, 건조 공정 혹은 보존 공정 등에 있어서의 침전 농축물 중의 카로테노이드의 안정성을 검토하기 위해, 얻어진 침전 농축물에 대해 121 ℃, 1 시간의 오토클레이브 가열 처리를 실시하였다. 가열 처리 후의 침전 농축물의 카로테노이드 농도를 분석하고, 원심 분리 전의 배양물에 대한 회수율을 구하여 표 3 및 도 2 에 나타냈다. 분리 공정 후, 가열 처리를 실시한 침전 농축물에 함유되는 총 카로테노이드의 회수율은 pH 0.5 ∼ 5.5 에 있어서 80 ％ 이상을 나타냈다.

실시예 2

Paracoccus carotinifaciens E-396 주를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 변이 처리하고, 적색의 색조가 진한 콜로니를 선택하였다. 선택된 주의 배양물 중의 카로테노이드를 분석하여, 아스타크산틴 생산성이 향상된 변이주 Y-1071 주를 선택하였다.

이하 조성의 배지 (수크로오스 30 g/ℓ, 콘 스팁 리커 30 g/ℓ, 인산 2 수소칼륨 0.54 g/ℓ, 인산수소 2 칼륨 2.78 g/ℓ, 염화칼슘 2 수화물 0.1 g/ℓ, 황산마그네슘 7 수화물 12 g/ℓ, 황산철 7 수화물 0.3 g/ℓ, pH 7.2) 6 ㎖ 를 직경 18 ㎜ 의 시험관에 넣고 121 ℃ 에서 15 분간 오토클레이브 살균하여, 시드용 시험관 배지를 조제하였다.

다음으로 이하 조성의 배지 (글루코오스 40 g/ℓ, 콘 스팁 리커 30 g/ℓ, 인산 2 수소칼륨 1.5 g/ℓ, 인산수소 2 나트륨 12 수화물 3.8 g/ℓ, 염화칼슘 2 수화물 0.2 g/ℓ, 황산마그네슘 7 수화물 3.0 g/ℓ, 황산철 7 수화물 1.0 g/ℓ, pH 7.2) 100 ㎖ 를 500 ㎖ 용량의 사카구치 플라스크에 넣고, 121 ℃ 에서 15 분간 오토클레이브 살균하였다.

Paracoccus 속 세균 Y-1071 주를 시드용 시험관 배지에 일 백금이 식균하고, 28 ℃ 에서 2 일간, 300 spm 으로 왕복 진탕 배양을 실시하였다. 다음으로, 그 배양물 2 ㎖ 를 플라스크 배지에 식균하고, 28 ℃, 3 일간, 120 spm 의 왕복 진탕 배양을 실시하였다. 배양 종료 후의 배양물 중의 카로테노이드 농도를 측정한 결과, 결과는 표 4 에 나타내는 바와 같았다. 또 배양물의 pH 를 측정한 결과 pH 6.7 이었다.

	카로테노이드 농도 ㎎/ℓ
β-카로틴	6.8
에키네논	3.7
3-하이드록시에키네논	0.5
칸타크산틴	5.7
페니코크산틴	13.9
β-크립토크산틴 아스타크산틴	0.1 48.4
아스테로이데논	0.9
아도니크산틴	11.6
제아크산틴	0.3
총 카로테노이드	91.9

얻어진 배양물을 혼합하면서 30 ㎖ 씩 2 개의 비커에 채취하여, 하나는 pH 6.7 인 채로 하고, 나머지 1 개는 25 ％ 황산 수용액으로 pH 5.2 로 조정하였다. 이것을 50 ㎖ 용량의 원침관으로 옮기고, 원심 가속도 3,000 × g, 50 ℃, 10 분간의 앵글 로터에 의한 원심 분리를 실시하였다. 원심 분리 후, 신속하게 원침관을 별도의 용기 위에서 기울여 거꾸로 함으로써 상청액을 옮기고, 원침관의 바닥에 펠릿으로서 부착된 침전 농축물과 분리하였다. 침전 농축물 중의 카로테노이드를 분석하고, 실시예 1 에 기재된 식에 의해 분리 회수율을 산출하였다. 배양물 각 pH 에 있어서의 카로테노이드의 분리 회수율을 표 5 에 나타냈다. pH 5.2 에 있어서의 아스타크산틴 및 총 카로테노이드의 회수율은 100 ％ 를 나타냈고, 변이주 Y-1071 에 있어서도 pH 를 낮게 함으로써 분리성이 현저하게 향상됨을 알 수 있었다.

얻어진 배양물 30 ㎖ 를 20 ％ 아세트산 수용액에 의해 pH 4.8 로 맞췄다. 직경 60 ㎜ 의 No.5C 여과지를 사용하여 키리야마 깔때기로 10 분간 흡인 여과하여, 침전 농축물과 여과액으로 분리하였다. 얻어진 농축 침전물에 대해 카로테노이드를 측정하고, 실시예 1 에 기재된 식에 의해 여과 회수율을 구하였다. pH 6.7 의 배양물 30 ㎖ 에 대해서도 동일하게 여과 분리를 실시하여, 양 결과를 표 6 에 나타냈다. 여과 분리에 있어서도 pH 를 낮게 함으로써 수율이 향상됨을 알 수 있었다.

실시예 3

Paracoccus 속 세균 A-581-1 주 (FERM BP-4671) 를 시드용 시험관 배지에 일 백금이 식균하고, 28 ℃ 에서 2 일간, 300 spm 으로 왕복 진탕 배양을 실시하였다. 다음으로, 그 배양물 2 ㎖ 를 플라스크 배지에 식균하고, 28 ℃, 3 일간, 120 spm 의 왕복 진탕 배양을 실시하였다. 배양 종료 후의 배양물 중의 카로테노이드 농도를 측정한 결과 표 7 에 나타내는 바와 같았다. 또 배양물의 pH 는 6.6 이었다.

	카로테노이드 농도 ㎎/ℓ
β-카로틴	0.71
에키네논	0.22
3-하이드록시에키네논	0.03
칸타크산틴	0.30
페니코크산틴	0.74
아스타크산틴	2.72
아스테로이데논	0.03
아도니크산틴	1.36
제아크산틴	0.02
총 카로테노이드	6.13

얻어진 배양물 30 ㎖ 를 20 ％ 염산 수용액에 의해 pH 4.9 로 조정하였다. 이것과 원래의 pH 6.6 의 배양물 30 ㎖ 를 각각 50 ㎖ 용량의 원침관으로 옮기고, 원심 가속도 2,000 × g, 10 분간의 스윙 로터에 의한 원심 분리를 실시하였다. 원심 분리 후, 신속하게 원침관을 별도의 용기 위에 기울여 거꾸로 함으로써 상청액을 옮기고, 원침관의 바닥에 펠릿으로서 부착된 침전 농축물과 분리하였다. 침전 농축물 중의 카로테노이드를 분석하고, 실시예 1 에 기재된 식에 의해 분리 회수율을 산출하였다. 카로테노이드의 분리 회수율을 표 8 에 나타냈다. pH 4.9 에서는 회수율 100 ％ 였다.

산업상 이용가능성

이상 서술한 바와 같이, 본 발명에 의해, 카로테노이드의 미생물학적인 제조 방법에 있어서, 카로테노이드를 고수율로 회수할 수 있게 되었다.

수탁번호

본 발명에 사용하는 카로테노이드 산생 세균의 예로서 예시되는 E-396 주는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 이하와 같이 국제 기탁되어 있다.

국제 기탁 당국 : 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터

(구 명칭 : 통상 산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소)

(우) 305-8566

이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반치 1 츄오우 다이 6

식별을 위한 표시 : E-396

수탁 번호 : FERM BP-4283

원기탁일 : 평성 5년 (1993년) 4월 27일

또, 본 발명에 사용하는 카로테노이드 산생 세균의 다른 예로서 예시되는 A-581-1 주는 상기 기관에 이하와 같이 국제 기탁되어 있다.

식별을 위한 표시 : A-581-1

수탁 번호 : FERM BP-4671

원기탁일 : 평성 6년 (1994년) 5월 20일

독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터

FERMBP-4283

19930427

독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터

FERMBP-4671

19940520

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Claims

파라코커스 (Paracoccus) 속에 속하는 세균의 배양물로부터, 산성 조건하에서 카로테노이드 및 균체를 함유하는 농축물을 침전시키는 공정을 포함하는 카로테노이드의 분리 방법.
파라코커스 (Paracoccus) 속에 속하는 세균의 배양물로부터, 산성 조건하에서 카로테노이드 및 균체를 함유하는 농축물을 침전시키고, 얻어지는 침전물로부터 카로테노이드를 회수하는 공정을 포함하는 카로테노이드의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
산성 조건이 pH 5.5 이하의 조건인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
산성 조건은 배양물에 산을 첨가함으로써 조정되는 것인 방법.
제 4 항에 있어서,
산이 황산, 염산, 질산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 인산, 말산, 부티르산, 프로피온산, 옥살산, 글루콘산, 타르타르산, 프탈산, 탄산 및 아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
카로테노이드가 아스타크산틴, 칸타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 리코펜, β-카로틴, 페니코크산틴, 아도니크산틴, 에키네논, 아스테로이데논 및 3-하이드록시에키네논으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 방법.
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제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
세균의 16S 리보솜 RNA 에 대응하는 DNA 의 염기 배열이 배열 번호 1 에 기재된 염기 배열과 95 ％ 이상 상동인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
세균이 E-396 주 (FERM BP-4283) 혹은 A-581-1 주 (FERM BP-4671) 인 방법.
제 1 항에 있어서,
농축물을 침전시키는 공정이 원심 분리, 여과 분리 및 데캔테이션으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종에 의해 실시되는 방법.
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