KR100790771B1 - 비타민 ｋ2의 회수 방법 - Google Patents

비타민 ｋ2의 회수 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 비타민 K2를 함유하는 시료를 키토산으로 처리하고, 당해 키토산에 흡착된 비타민 K2를 유기용매로 추출하여, 비타민 K2를 회수하는 방법에 관한 것이다.
바실루스 낫토, 키토산, 비타민 K2

Description

비타민 Ｋ2의 회수 방법{A method for collecting vitamin K2}
본 발명은 혈전 용해효소인 낫토키나제를 함유하지만 혈액 응고인자인 비타민 K2를 거의 또는 전혀 함유하지 않는 식품에 관한 것이다.
바실루스 낫토(Bacillus natto)가 혈전 용해효소인 낫토키나제를 생산하는 것은 스미(Sumi) 등에 의해 발견되었으며[참조: Experientia 제43권, 제1110면(1987)], 낫토의 영양가는 물론, 건강 식품으로서의 가치가 다시 평가되고 있다. 낫토키나제는 그 자신이 선용(線溶) 효소로서 작용하는 것이 공지되어 있으며 식품으로서 섭취되면 혈전을 용해시킨다. 이러한 낫토키나제는 반감기가 길며 장시간 효과가 지속된다는 매우 우수한 특징을 갖고 있다. 또한, 동일한 혈전 용해작용을 갖는 우로키나제에서는 명확하지 않은 절박(切迫)기 망막 중심 정맥 폐색증의 치료효과가 낫토키나제에서 명확하게 나타나는 것으로 보고되어 있다[참조: 니시무라 등, 안과 임상의보 제88권, 제9호 제53면 내지 제57면(1994년)].
따라서, 낫토키나제를 다량으로 함유하는 식품, 예를 들면, 바실루스 낫토 배양 추출물을 분말 또는 캡슐화시킨 상품이 건강식품으로서 판매되고 있다.
한편, 바실루스 낫토는 배양에 의해 비타민 K2를 다량으로 생산하는 것이 공지되어 있다. 이러한 비타민 K2는 혈액 응고계의 필수성분으로 공지되어 있다. 또한, 비타민 K2는 별도의 생리작용을 갖고 있으며, 이의 결핍증으로서는 신생아의 흡수장애 및 노인성 골다공증을 일으키며 과잉증으로서는 용혈성 빈혈, 비종(脾腫) 및 신장·간 등의 장애를 야기한다고 되어 있다. 이와 같이 바실루스 낫토 배양 추출물에는 낫토키나제라는 혈전 용해계 작용인자와 비타민 K2라는 혈액 응고계 작용인자가 동시에 함유되어 있다.
일반적으로, 비타민 K2의 1일 필요 섭취량은 성인이 55 내지 65㎍이다. 비타민 K류는 해조, 브로콜리(broccoli) 등의 음식물에 많이 함유되어 있으며, 또한 장내 세균에 의해 생산되거나 낫토를 섭취할 때에 바실루스 낫토가 장내에서 생육하며 비타민 K2를 생산할 가능성이 있으므로 비타민 K2의 필요 섭취량은 통상적인 식사에 의해 충족되고 있다. 이와 같이 비타민 K2는 일반적으로는 별도 섭취할 필요가 없을 정도이다.
한편, 혈전 예방을 위해 비타민 K 의존성 응고인자(예: 프로트롬빈 VII, IX, X 등)의 합성 억제제를 복용하고 있는 환자가 혈전 예방 등을 목적으로 하여 혈전 용해효소인 낫토키나제를 함유하는 낫토 또는 바실루스 낫토 배양 추출물을 섭취하면 비타민 K2도 동시에 섭취하게 되어 당해 비타민 K 의존성 응고인자 합성 억제제의 효과가 상쇄된다는 문제가 생긴다.
따라서, 혈전 형성 예방을 위해 비타민 K2 함량이 감소된 바실루스 낫토 배양 추출물 식품이 요망되고 있으며 비타민 K2를 감소시키는 방법이 시도되고 있다. 비타민 K2를 감소시키는 방법으로서는 헥산 등의 유기 용매를 사용하여 지용성 비타민 K2를 추출하는 방법이 있다.
그러나, 본 방법에서는 비타민 K2 이외의 지용성 영양분도 추출되어 제거된다는 영양학상의 문제, 헥산 등의 유기 용매의 제거가 필요해지므로 제조원가 상승 등의 제조 기술면에서의 문제, 또한 식품에 유기 용매가 잔류할 가능성, 유기 용매의 사용에 대한 소비자의 거부감 등의 문제가 있다.
따라서, 유기 용매 등을 사용하지 않고 간편하게 비타민 K2를 제거할 수 있는 방법 및 당해 방법으로 생산되는, 비타민 K2 함량이 감소된 바실루스 낫토 배양 추출물이 요구되고 있다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하는 것을 목적으로 하여 실시된 것이며, 낫토키나제와 특정량 이하의 비타민 K2를 함유하는 바실루스 낫토 배양 추출물 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따라 종래의 낫토키나제를 함유하는 식품이 갖고 있는 문제점이 해결되어 영양분에서 우수하며, 혈액 응고인자인 비타민 K2가 거의 또는 전혀 함유되지 않으므로 비타민 K2의 과잉 섭취를 걱정할 일이 없고, 낫토키나제 활성이 강화되며, 또한 혈액 응고계의 질환을 갖는 환자에게 최적인 식품이 제공된다.
본 발명은 낫토키나제와 건조 중량 1g당 1㎍ 이하의 비타민 K2를 함유하는 바실루스 낫토 배양 추출물(이하, 본 발명의 바실루스 낫토 배양 추출물이라고 한다)에 관한 것이다.
바람직한 실시 양태에서는 바실루스 낫토를 액체 배양하는 공정과 수득한 배양액을 키토산 처리하는 공정을 포함하는 방법으로 수득된다.
바람직한 실시 양태에서는 상기 바실루스 낫토 배양 추출물이 농축 추출물, 페이스트, 분말, 과립, 캡슐, 드링크 또는 정제의 형태이다.
또한, 본 발명은 바실루스 낫토를 액체 배양하여 배양액을 수득하는 공정과 수득한 배양액을 키토산 처리하는 공정을 포함하는, 낫토키나제와 건조 중량 1g당 1㎍ 이하의 비타민 K2를 함유하는 바실루스 낫토 배양 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 비타민 K2를 함유하는 시료를 키토산 처리하는 공정과 당해 키토산에 흡착된 비타민 K2를 유기 용매로 추출하는 공정을 포함하는 비타민 K2의 회수방법에 관한 것이다.
본 발명에서 바실루스 낫토 배양 추출물에는 낫토키나제와 건조 중량 1g당 1㎍ 이하의 비타민 K2가 함유되어 있다. 바람직하게는 비타민 K2는 건조 중량 1g당 0.5㎍ 이하, 보다 바람직하게는 건조 중량 1g당 0.1㎍ 이하로 함유된다.
바실루스 낫토 배양 추출물의 형태에는 바실루스 낫토를 배양하여 배양액으로부터 균체가 전부 제거되고, 또한 비타민 K2의 대부분 또는 전부가 제거된 배양액 자체를 포함한다. 바실루스 낫토 배양 추출물의 형태는 액체, 분말 또는 고형 일 수 있다. 액체로서는 배양액의 농축액 또는 페이스트일 수 있다. 분말로서는 농축액 또는 페이스트를 다시 건조한 분말 또는 과립일 수 있다. 고체로서는 타정(打錠) 등에 의해 수득되는 정제일 수 있다. 정제는 당의정 등의 각종 용도에 따라 표면이 코팅된 정제일 수 있다. 또는, 이들의 농축액, 페이스트, 분말 및 과립을 함유하는 캡슐일 수 있다. 또한, 드링크 상태일 수 있다.
본 발명의 바실루스 낫토 배양 추출물에는 낫토키나제가 함유된다. 낫토키나제의 함유량은 특별히 제한되지 않지만, 1g당 20FU 이상이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1000FU 이상, 보다 더 바람직하게는 2500FU 이상이다. 이들은 농도에 따라 변동된다. 건조 분말의 경우에는 상기 농도에 추가하여 5000FU 이상일 수 있으며 1000OFU 이상일 수 있다. 낫토키나제 활성의 유무는, 예를 들면, 스미 등의 문헌[참조: Experientia 제43권, 제1110면(1987)]에 기재된 방법 등에 따라 피브린 플레이트 위에 용해 얼룩을 형성하는지의 여부로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에서 낫토키나제는 바실루스 낫토에 의해 생산되어 피브린 플레이트 위에서 투명한 플라크를 형성하는 능력이 있는 효소를 의미한다.
본 발명의 낫토 배양 추출물에 함유되는 비타민 K2는 건조 중량 1g당 1㎍ 이하이며, 검출 한계(건조 중량 1g당 0.001㎍) 이하의 함량일 수 있다. 비타민 K2의 제거는 키토산을 사용하여 실시한다. 제거 방법은 후술한다. 이러한 키토산 처리에 의해 비타민 K2는 배양액으로부터 99% 이상 제거된다.
하기에 본 발명의 바실루스 낫토 배양 추출물의 제조방법에 관해, 소위 바실루스 낫토[바실루스 서브틸리스 낫토(Bacillus subtilis natto)가 이의 대표이다] 를 예로 들어 설명한다. 또한, 이러한 설명에서 비타민 K2 등의 수치는 사용하는 바실루스 낫토의 종류, 배양조건 등으로 변화하는 것이며 본 발명을 한정하는 것이 아니다.
바실루스 낫토 배양 추출물의 제조에 사용되는 미생물은 바실루스 낫토로 분류되며 낫토키나제를 생산할 수 있는 미생물이면 어떤 미생물도 사용할 수 있다. 시판되는 낫토로부터 분리한 바실루스 낫토를 사용할 수 있다.
바실루스 낫토의 배양에 사용되는 배지는 특별히 제한되지 않지만, 농축액 자체가 식품으로 되는 것을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 전분(예: 옥수수 전분), 글루코스, 자당 등의 탄소원, 탈지 대두, 고기 추출물 등의 질소원, 탄산칼슘, 염화마그네슘 등의 무기염, 필요에 따라, 지방산 등을 배지 성분으로서 사용하여 바실루스 낫토를 배양한다. 이들 배지에 사용되는 성분은 식품 첨가물 등급인 것이 바람직하다.
바실루스 낫토의 배양방법에는 특별히 제한되지 않지만, 대량으로 배양하기 위해서는 통기(通氣) 교반 배양이 바람직하다. 배양 온도는 바실루스 낫토가 생육할 수 있는 온도이면 특별한 제한은 없지만, 30 내지 45℃가 바람직하며, 32 내지 42℃가 보다 바람직하며, 37℃ 전후가 가장 바람직하다. 배양은 3 내지 4일이 바람직하다.
배양 종료 후의 배양물 상등액 중에는 일반적으로는 낫토키나제 활성이 약 300 내지 600FU/ml이고 비타민 K2가 건조 중량 1g당 약 10 내지 100㎍ 함유되어 있다. 이러한 배양물을 키토산과 접촉시켜 비타민 K2를 키토산에 흡착시킨다. 키토 산은 용액일 수 있으며, 고체라도 양호하지만 용액상으로 가하는 것이 바람직하다.
키토산 처리로서, 키토산 단독으로 배양액을 처리하는 경우, 0.1 내지 1중량%의 키토산을 함유하는 키토산 수용액을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 키토산 농도는 0.2 내지 O.8중량%이며, 보다 바람직하게는 O.3 내지 0.6중량%이다. 키토산 단독으로는 용해되지 않는 경우, 수용액의 pH를 산성화 함으로써 용해시킬 수 있다. 식품 용도로 하는 것을 고려하면, 아세트산을 0.05 내지 1중량%, 바람직하게는 O.1 내지 0.3중량% 첨가한 키토산 수용액(키토산-아세트산 혼합 용액)을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
배양액에 대하여 상기한 키토산 수용액 또는 키토산-아세트산 혼합 용액을 1 내지 10중량%, 바람직하게는 5 내지 10중량%, 보다 바람직하게는 6 내지 8중량% 첨가하고, 교반하여 충분하게 반응시킨다. 다음에, 예를 들면, 펄라이트, 규조토 등의 여과 보조제를 사용하여 가압형 여과기로 여과하여 청등한 여액을 수득한다. 또한, 키토산 용액 또는 키토산-아세트산 수용액을 배양액에 첨가한 다음, 펄라이트, 규조토 등의 여과 보조제를 첨가하여 적절한 시간 동안 교반하여 가압형 여과기로 여과하고 여액을 수득할 수 있다. 본 명세서에서 키토산 처리란 상기한 몇가지 방법으로 한정되지 않으며, 키토산과 배양액을 접촉시키는 것을 말한다.
또한, 키토산은 수용액 중에 용해되어 있지만 배양액 중의 균체 등을 흡착하고 여과 보조제로 제거하여 여액 중에는 거의 함유되지 않는다. 상기한 키토산 처리에 의해 여액 중의 비타민 K2는 99% 이상, 경우에 따라서는 99.9% 이상 제거된 다.
수득된 여액은 그대로 또는 다시 여과 보조제 등을 사용하여 정밀 여과한 다음, 농축기, 예를 들면, 역삼투압 농축기를 사용하여 농축한다. 이러한 역삼투압 농축기를 사용함으로써 분자량 100 이하의 물질은 대부분이 제거된다. 또한, 필요에 따라, 막 필터, 예를 들면, 0.5μm 및/또는 0.2μm의 막 필터를 사용하여 농축액을 무균 여과함으로써 바실루스 낫토 배양액의 농축액이 수득된다. 이때에 농축액 중의 비타민 K2의 농도는 건조 중량 1g당 1㎍ 이하로 된다.
수득된 농축액은 다시 농축되어 페이스트상으로 된다. 또한, 수득된 농축액에 대하여 적절한 양의 식품 첨가물, 예를 들면, 수용성 음식물 섬유, 유당, 셀룰로스 등을 가하고, 동결건조시켜 분말상 또는 과립상의 바실루스 낫토 배양 추출물을 제조한다. 또한, 상기에서 수득된 농축액, 페이스트상, 분말상 및 과립상의 추출물을 캡슐에 밀봉시켜 바실루스 낫토 배양 추출물을 함유하는 캡슐이 제조된다. 또한, 정제도 제조된다. 정제는 당의정 등의 각종 용도에 따라 표면이 코팅된 정제일 수 있다.
한편, 키토산 처리한 여과 잔사를 유기 용매, 예를 들면, 저급 알콜류, 헥산, 에틸에테르, 아세톤, 에틸 아세테이트 또는 이들의 혼합 용매 등으로 추출하여 농축함으로써 비타민 K2를 함유하는 조생성물을 수득한다. 바람직한 혼합 용매는 헥산-이소프로필 알콜(3:2 중량비)이다. 이러한 조생성물로부터 비타민 K2를 회수하는 데는 분자 증류, 수증기 증류 등의 당업자가 통상적으로 사용하는 방법이 적용된다. 이와 같이 하여 회수된 비타민 K2는 골다공증 등의 예방 및 치료에 이용 된다.
또한, 낫토키나제의 활성과 비타민 K2의 정량은 하기의 방법에 따랐다.
A: 낫토키나제의 활성측정
낫토키나제를 피브린에 작용시키고 피브린의 분해에 따라 증가하는 산 가용성 저분자 분해산물의 양을, 자외선(275nm) 흡광도를 측정하여 구하는 방법으로 측정하였다.
a-1: 피브리노겐 수용액의 조제
50mM 붕사 완충액(pH 8.5, 150mM NaCl을 함유한다) 10ml에 피브리노겐(시그마 코포레이션(Sigma Corp.)제, 소 혈장 유래 피브리노겐 분획 I, TYPE I-S) 72mg 상당분을 용해시켜 0.72% 피브리노겐 수용액을 조제하였다.
a­2: 트롬빈 용액의 조제
트롬빈(시그마 코포레이션제, 소 혈장 유래)을 50mM 붕사 완충액에 용해시켜 1000U/ml의 농도로 조제하고, 사용할 때에 동일한 붕사 완충액을 사용하여 50배로 희석(즉, 20U/ml)한다.
a­3: 활성 측정
시험관에 50mM 붕사 완충액 1.4ml 및 피브리노겐 수용액 0.4ml를 취하고, 37℃±O.3℃의 항온 수조에서 5분 동안 가온한 다음, 트롬빈 용액 0.1ml를 가하여 교반한다. 혼합액을 10분 동안 이러한 항온 수조에 방치한 다음, 시료 용액 O.1ml를 혼합액에 가하고 5초 동안 교반하여 항온 수조에서 방치한다. 시료 용액을 첨가하 고 나서 20분 후 및 40분 후에 각각 5초 동안 교반하며, 60분 후에 O.2M 트리클로로아세테이트 용액 2ml를 가하여 교반한 다음, 추가로 20분 동안 방치한다. 이러한 반응액을 15,000×g에서 5분 동안 원심분리하여 상등액의 275nm에서의 흡광도(Ar)를 측정한다.
한편, 50mM 붕사 완충액 1.4ml 및 피브리노겐 수용액 0.4ml를 취하고, 37℃±0.3℃의 항온 수조에서 5분 동안 가온한 다음, 트롬빈 용액 0.1ml를 가하여 교반한다. 혼합액을 10분 동안 이러한 항온 수조에 방치한 다음, O.2M 트리클로로아세테이트 용액 2ml를 혼합액에 가하여 교반한다. 다음에, 시료 용액을 0.1ml 가하여 교반하고 20분 동안 방치한다. 이러한 반응액을 15,000×g에서 5분 동안 원심분리하여 상등액의 275nm에서의 흡광도(Ac)를 측정하고 대조군으로 한다.
낫토키나제의 활성(A)은 하기 식으로 구한다.
A(FU/ml)= [(Ar-Ac)/(0.01×60×O.l)]×D
상기식에서,
D는 희석 배율이다.
B: 비타민 K2의 정량
또한, 비타민 K2는 하기의 방법으로 HPLC용 샘플을 조제하여 HPLC로 측정하였다.
b­1: HPLC용 시료의 조제
측정 시료 O.5ml, 물 O.5ml 및 이소프로판올 1.5ml를 혼합한 다음, 헥산 5ml 를 가하여 교반한다. 원심분리(1700×g, 10분, 20℃)를 실시하고, 상등액(유기층) 4ml를 농축 건조시키고, 100μl의 에탄올에 용해시켜 샘플 용액으로 한다.
b-2: HPLC의 조건
HPLC의 조건은 하기와 같다.
칼럼: 시마즈(Simazu) STR ODS-2 4.6×250mm
용출액: 97% 에탄올
유속: O.7ml/분
검출: UV 254nm
이러한 조건에서 비타민 K2의 체류 시간은 16분의 후반이다.
실시예
하기에 실시예를 들어 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예로 한정되는 것이 아니다.
실시예 1 및 2, 및 비교예 1 및 2
폴리펩톤 1중량%, 글루코스 1중량%, 고기 추출물 O.5중량% 및 NaCl O.2중량%를 함유하는 pH 7.O의 배지를 환저 플라스크에 넣고 바실루스 낫토를 접종한 다음, 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 수득한 배양액을 동일한 조성의 배지를 함유하는 씨드(seed) 배양조에 접종하고, 22시간 동안 배양하여 씨드 배양액을 수득하였다.
한편, 옥수수 전분 6.25중량%, 탈지 대두 3.O9중량%, 식품첨가물 등급의 탄 산칼슘 0.15중량%, 대두유 1.5중량% 및 실리콘 0.008중량%을 함유하는 pH 7.3의 본 배양 배지를 준비하고, 여기에 상기한 씨드 배양액을 첨가하여 통기량 O.5VVM 및 온도 37℃에서 69시간 동안 배양하였다. 수득된 배양액 중에는 470FU/ml의 낫토키나제와 배양액 1g당 55㎍의 비타민 K2가 함유되어 있었다.
수득된 배양액의 일부를 취하고, 배양액 200L에 대해 키토산[가부시키가이샤 교와테크노스제(Kyowa Technos)] O.4중량% 및 아세트산 0.18중량%를 함유하는 키토산 수용액을 15kg 가한 다음, 펄라이트를 5kg 첨가하여 교반하였다(실시예 1). 별도의 배양액 200L에는 이러한 키토산 수용액 15kg만을 첨가하여 교반하였다(실시예 2). 또한, 별도의 배양액 200L에는 펄라이트[상품명: 토프코 펄라이트(Topco perlite); 니혼고켄가부시키가이샤제(Nihon Kouken Corp.)] 5kg만을 첨가하거나(비교예 1), 규조토[상품명: 셀라이트 #505, 셀라이트 코포레이션(Celite Corporation)제: 미국 캘리포니아주 93438-0519 롬폭] 5kg만을 첨가하였다(비교예 2). 각각의 배양액을 1시간 동안 교반한 다음, 가압형 여과기로 여과하여 여액을 수득하였다. 또한, 실시예 2에서는 규조토를 여과 보조제로 사용하여 여과하였다. 각각의 여액에 관해서 비타민 K2의 양을 측정한 결과를 표 1에 기재하였다.
여과 보조제 비타민 K2(배양액 1g당 ㎍) 여과율 (%)
여과 전 여과 후
실시예 1 키토산-펄라이트 55 0.002 99.99
실시예 2 키토산 용액 55 0.15 99.72
비교예 1 펄라이트 55 54 1.8
비교예 2 규조토 55 55 0
표 1로부터 명백한 바와 같이, 키토산 용액을 사용하여 처리한 실시예 1 및 2에서는 비타민 K2가 거의 제거되어 있었다. 즉, 키토산과 펄라이트를 조합하는 경우, 비타민 K2가 99.99% 제거되었다. 키토산만으로도 비타민 K2가 99.72% 제거되었다. 이에 대하여, 펄라이트만을 사용하는 경우(비교예 1) 및 규조토만을 사용하는 경우(비교예 2), 비타민 K2는 거의 제거되지 않았다.
실시예 3
실시예 1에서 수득한 여액(키토산-펄라이트 처리) 180L에 다시 규조토를 5kg 가하여 가압형 여과기를 사용하여 정밀 여과하고, 역삼투막을 사용하여 35L까지 농축하였다. 이러한 농축액을 O.2μm의 막 필터를 통과시켜 바실루스 낫토 배양 추출물을 수득하였다. 이러한 바실루스 낫토 배양 추출물 5L에 대하여 O.2kg의 수용성 음식물 섬유를 가하고 동결건조시킨 후에 분쇄하여 바실루스 낫토 배양 추출물 분말 약 800g을 수득하였다. 수득한 바실루스 낫토 배양 추출물 및 이의 분말 중의 낫토키나제 및 비타민 K2의 함량을 표 2에 기재하였다. 또한, 시판되는 22종류의 낫토를 대조군으로서 사용하고, 이들의 약 50g 중의 낫토키나제 및 비타민 K2의 함량을 아울러 표 2에 기재하였다.
제품 낫토키나제 활성(FU/g) 비타민 K2(건조 중량 1g당 ㎍)
바실루스 낫토 배양 추출물 2500 0.01
바실루스 낫토 배양 추출물 분말 13000 0.05
시판 낫토 20-40 6-12
표 2의 결과에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따라 높은 낫토키나제 활성과 건조 중량 1g당 O.1㎍ 이하의 농도의 비타민 K2를 함유하는 바실루스 낫토 배양 추출물 및 바실루스 낫토 배양 추출물 분말이 수득되었다. 특히, 시판되는 낫토와의 비교에 따라 본 발명의 유용성이 명백해진다. 시판되는 낫토 1팩(pack)(약 50g)에는 1000 내지 2000FU의 낫토키나제 및 300 내지 600㎍의 비타민 K2가 함유되어 있다. 즉, 시판되는 낫토에는 1g당 20 내지 40FU의 낫토키나제가 함유되어 있지만, 본 발명의 바실루스 낫토 배양 추출물 및 이의 분말에는 1g당 각각 2500FU 및 13,000FU가 함유되어 있다. 본 발명의 바실루스 낫토 배양 추출물 및 이의 분말에는 각각 시판되는 낫토의 약 60 내지 120배 및 약 300 내지 600배의 낫토키나제가 함유되어 있는 것을 알 수 있다.
또한, 시판되는 낫토가 1g당 6 내지 12㎍의 비타민 K2를 함유하는 데 대하여 본 발명의 바실루스 낫토 배양 추출물 및 이의 분말에는 각각 0.01㎍ 및 O.05㎍의 비타민 K2가 함유되는 것에 불과하다. 즉, 본 발명의 바실루스 낫토 배양 추출물 및 이의 분말에는 각각 시판되는 낫토의 약 1/500 내지 1/100O의 비타민 K2가 함유되어 있는데 불과한 것을 알 수 있다.
또한, 필요에 따라, 수득된 바실루스 낫토 배양 추출물(농축액, 페이스트상, 분말상 및 과립상)에 비타민 K2를 첨가하고 비타민 K2가 풍부한 바실루스 낫토 배양 추출물로 할 수 있다. 예를 들면, 수득된 바실루스 낫토 배양 추출물과 비타민 K2를 적절한 비율로, 예를 들면, 시판되는 낫토 1팩분(약 50g)의 낫토키나제 활성치 1000 내지 2000FU를 함유하며, 또한 성인의 1일 필요 섭취량인 55 내지 65㎍의 비타민 K2를 함유하도록 혼합하여 함유하는 캡슐, 정제, 드링크 등으로 할 수 있다. 비타민 K2는 하기의 실시예 4에서도 수득할 수 있다.
실시예 4
실시예 1의 제조공정(키토산-펄라이트 처리)에서 생성된 잔사를 회수하였다. 회수된 잔사 500g에 헥산 750g과 이소프로필 알콜 500g를 가하여 잘 교반하고, 유기층을 경사분리하여 수집하였다. 유기층에는 1g당 120㎍의 비타민 K2가 함유되어 있다. 이러한 유기층을 농축, 증발, 건조(60℃) 및 고화시켜 정제된 비타민 K2를 150mg 회수하였다.
본 발명에 따라, 키토산을 사용하여 간편한 방법으로 비타민 K2를 회수할 수 있다.

Claims (1)

  1. 비타민 K2를 함유하는 시료를 키토산 처리하는 공정과 당해 키토산에 흡착된 비타민 K2를 유기 용매로 추출하는 공정을 포함하는 비타민 K2의 회수방법.
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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3881494B2 (ja) 2000-04-21 2007-02-14 株式会社日本生物科学研究所 納豆菌培養エキス
WO2002076240A1 (fr) * 2001-03-22 2002-10-03 Nihon Kefir Co., Ltd. Aliments dietetiques contenant de la kinase de natto et produits laitiers fermentes
US7435565B2 (en) * 2001-04-11 2008-10-14 Japan Bio Science Laboratories, Inc. Bacillus natto culture extract
WO2003013565A1 (fr) * 2001-08-08 2003-02-20 Toyo Hakko Co., Ltd. Materiaux fonctionnels, agonistes sod, hypotensifs et thrombolytiques, leur procede de production et souches microbiennes a utiliser
US20040043014A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-04 Hiroyoshi Moriyama Platelet aggregation inhibitor and supplement food effective for inhibiting platelet aggregation
US7041286B2 (en) * 2003-07-23 2006-05-09 Nerenberg Arnold P Composition for mitigating a pernicious thrombotic event
JP2006143601A (ja) * 2004-11-16 2006-06-08 Yamato Yakuhin Kk 血液粘度低下剤
JP3834048B2 (ja) * 2004-12-28 2006-10-18 株式会社日本生物科学研究所 納豆菌培養液に由来する食品の製造方法
CN1857722A (zh) * 2005-04-30 2006-11-08 成都地奥九泓制药厂 蜡样芽孢杆菌在制备治疗血栓疾病药物中的用途
JP2006325538A (ja) * 2005-05-30 2006-12-07 Asahimatsu Shokuhin Kk ナットウキナーゼ製造方法とその方法で製造されたナットウキナーゼ
TW200712492A (en) * 2005-09-23 2007-04-01 Zen U Biotechnology Co Ltd The method of determining the standard activity value of Nattokinase
TW200722524A (en) * 2005-12-13 2007-06-16 Zen U Biotechnology Co Ltd The device of determining the activity value of nattokinase
US20080044398A1 (en) * 2006-07-13 2008-02-21 Vesta Ingredients, Inc. Soluble composition having enzymatic activity and improved stability
US20080220094A1 (en) * 2006-11-01 2008-09-11 Wyeth Compositions and methods for the treatment and/or prevention of osteoporosis
KR100887385B1 (ko) * 2007-04-26 2009-03-05 김재현 혈액순환장애 개선용 건강보조식품
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
WO2010033878A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 David Brown Solute concentration measurement device and related methods
WO2011014704A2 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
JP5722052B2 (ja) * 2011-01-12 2015-05-20 理 松尾 血栓性疾患予防食品
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
CN104738623A (zh) * 2015-03-17 2015-07-01 徐州医学院 一种富含维生素k2和钙剂的香菇粉胶囊及其制备方法
JP2017119683A (ja) * 2015-12-24 2017-07-06 株式会社日本生物科学研究所 血液凝固阻害剤
NZ748875A (en) 2016-05-27 2022-07-01 Nattocat Llc Compositions and methods for thromboembolism dissolution
KR101990144B1 (ko) 2017-06-23 2019-06-18 김철우 콩을 발효시켜 만든 낫토 및 그 제조방법
CN107099487B (zh) * 2017-06-27 2020-07-24 南京工业大学 一种高分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用
KR102425417B1 (ko) * 2018-02-26 2022-07-25 주식회사 엘지화학 조효소 회수 방법
KR102141341B1 (ko) 2018-08-10 2020-08-05 농업회사법인 두승식품주식회사 혈행개선 증진용 혈전용해효소 및 그 제조방법
CN109259229A (zh) * 2018-12-04 2019-01-25 乐陵市信诺医疗器械有限公司 罗汉果片及其制备工艺
CN109706193A (zh) * 2019-03-12 2019-05-03 中国科学院合肥物质科学研究院 一种富集纳豆芽孢杆菌发酵液中维生素k2的方法
CN112753973A (zh) * 2019-11-01 2021-05-07 洛阳华清天木生物科技有限公司 一种纳豆芽孢杆菌果蔬发酵粉及其制备方法
WO2021260057A2 (en) * 2020-06-23 2021-12-30 Dsm Ip Assets B.V. Fermentation process
CN113403348B (zh) * 2021-06-18 2022-03-22 山东润德生物科技有限公司 一种维生素k2的制备方法
KR102523928B1 (ko) * 2021-09-17 2023-04-21 주식회사 지에프퍼멘텍 바실러스 서브틸리스 낫또 배양균체 추출물을 포함하는 기억력 개선용 조성물
CN115777877B (zh) * 2023-01-30 2023-05-05 北京一品堂医药科技有限公司 一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61162184A (ja) * 1985-01-10 1986-07-22 Noriyoshi Morimoto 新規な線溶酵素およびその取得法
JPH01180834A (ja) * 1988-01-13 1989-07-18 Nippon Chem Res Kk 血栓溶解剤
JPH0853364A (ja) * 1994-08-10 1996-02-27 Nippon Chem Res Kk 注射用血栓溶解剤
JPH08208512A (ja) * 1995-02-03 1996-08-13 Nippon Chem Res Kk 血栓形成阻害剤
JPH11346714A (ja) * 1998-06-03 1999-12-21 Nissei Kosan Kk 特異選択的脂質吸着組成物
US6420145B1 (en) 1999-11-16 2002-07-16 Honda Trading Corporation Yunnan SL-001 strain
US6537543B1 (en) 2000-09-14 2003-03-25 Unicafe Inc. Intestinal activation food using natto powder
US6669971B1 (en) 1999-10-28 2003-12-30 Ooyama Tofu Co., Ltd Barley and yam Natto
US6730504B2 (en) 2000-04-21 2004-05-04 Japan Bio Science Laboratory Co., Ltd. Bacillus natto culture extract

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61162184A (ja) * 1985-01-10 1986-07-22 Noriyoshi Morimoto 新規な線溶酵素およびその取得法
JPH01180834A (ja) * 1988-01-13 1989-07-18 Nippon Chem Res Kk 血栓溶解剤
JPH0853364A (ja) * 1994-08-10 1996-02-27 Nippon Chem Res Kk 注射用血栓溶解剤
JPH08208512A (ja) * 1995-02-03 1996-08-13 Nippon Chem Res Kk 血栓形成阻害剤
JPH11346714A (ja) * 1998-06-03 1999-12-21 Nissei Kosan Kk 特異選択的脂質吸着組成物
US6669971B1 (en) 1999-10-28 2003-12-30 Ooyama Tofu Co., Ltd Barley and yam Natto
US6420145B1 (en) 1999-11-16 2002-07-16 Honda Trading Corporation Yunnan SL-001 strain
US6730504B2 (en) 2000-04-21 2004-05-04 Japan Bio Science Laboratory Co., Ltd. Bacillus natto culture extract
US6537543B1 (en) 2000-09-14 2003-03-25 Unicafe Inc. Intestinal activation food using natto powder

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