JPH01180834A - 血栓溶解剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は納豆菌の生産する線溶酵素ナラトラキナーゼ（
以下ＮＫと略称することもある）を有効成分とする経口
用血栓溶解剤に関する。

（従来の技術） 血栓は末梢動静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞症、冠動
脈閉塞症、脳血管閉塞症、網膜動静脈血栓症をはじめ種
々の疾患に関連し病原因子として大きな問題となってい
る。

現在血栓症の治療は主に欧米ではストレプトキナーゼ（
以下ＳＫと略称する）が、そして本邦ではウロキナーゼ
（以下（ＪＫと略称する）を用いる線溶療法が用いられ
ている。また、最近ヒトの亜性腫瘍の一つであるメラノ
ーマ細胞から得られるプラスミノーゲンアクチベーター
がヒトの血管内皮細胞から血中に産生されるテイシュプ
ラスミノーゲンアクチベータ−（以下ＴＰＡと略称）と
称矛る酵素と同一アミノ酸配列を持つこと、そしてその
ＴＰＡはＵＫよりも血栓の構成４分であるフィブリンへ
の親和性が強く、よく効くと考えられることがら／ラノ
ーマ細胞のみならず遺伝子組換で微生物に造らせたＴＰ
Ａを臨床応用しようという計画も進められている。

また、納豆、納豆菌およびその培養物から線溶酵素（Ｎ
Ｋ）が分離され、静注あるいは経口投与により血栓症な
どの治療、予防薬としての応用が期待されている〔特開
昭６１−１６２１８４号公報；　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉ
ａ　　４３．　１１１０〜１１１１（１９８７）、：ｌ
。

（発明が解決しようとする問題点） しかしＳ　’にはヒト生体にとっては異物であるため反
復して静注投与すると種々のアレルギー反応、ショック
などを起す危険性がある。またＵＫ。

ＴＰＡも静注すると生体内での半減期は３０分以内と極
めて短かく、また血中の種々のインヒビターによって阻
害され活性を失うため大量を持続点滴することが必要で
あった。そしてこれら薬剤を大量投与すると今度は出血
傾向を招く危険性がある。さらに最近のアメリカ合衆国
ＦＤＡの報告（Ｕ、　Ｓ、　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕ
ｇ　Ａｄｍｉｎｓｔｒａｔｉｏｎ、Ｔａ１ｋ　Ｐａｐｅ
ｒ：５ｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ　ｒｅｃｏｍｍｅｎｄ
ｅｄｆｏｒ　１Ｖｕｓｅ、　ＴＰＡ　ｄｅｌａｙｅｄ　
Ｔ８７−２５　　Ｊｕｎｅ４、　１９８７）　　ではＳ
Ｋに比較してＴＰＡの薬効そのものが未だ断定できる段
階ではなく、医薬品として許可するには早すぎるという
結論も出されている。

また静注した場合、大量のヒト尿あるいは培養細胞から
ウィルス、発熱物質などを含まない目的物を取り出すこ
とが必要であるから原料の制約もあり価格が高くなると
いう問題がある。またメラノーマ由来のＴＰＡの場合は
歴史も浅く生体に対する安全性も保障されていない。

また、ＮＫについては血栓症などへの応用が期待されて
いるだけで、実際上の薬効、有効量、適当な投与方法、
副作用の有無などは全く開示されていないから医薬とし
て使用できるかどうか不明である。

（問題点を解決するための手段） ８に、ＵＫおよびＴＰＡは上記のような種々の問題点を
有するためそれらにかわる新規な血栓溶解剤の開発が熱
望されていた。

そこで本発明者らは先ず何よりも人体に無害で、しかも
血栓溶解効果の高い酵素剤の検索に鋭意努力を尽して来
た。その結果式が国で１０００年以上日常摂取されてき
た食品であり、安全性に問題がなく、また原料直でも制
約のない納豆あるいは納豆菌の培養液から得られるナラ
トラキナーゼ（ＮＫ）を経口投与することでその酵素が
生体にもともと備わっているＴＰＡの産生を高め血中の
線溶活性を亢進する効果のあることを初めて確認し、さ
らに研究を重ねて本発明を確立するに至った。

本発明は、納豆菌の生産する線溶酵素を含有してなる経
口用血栓溶解剤である。

納豆菌の生産する線溶酵素はナラトラキナーゼと呼ばれ
、その製法や理化学的性状は本発明者らにより特開昭６
１−１６２１８４号公報およびＩ；ｘｐｅｒｉｅｎｔｉ
ａ　４３．１１１０〜１１１１（１９８７）に発表され
ている。

線溶酵素は納豆、納豆菌またはその培養物中に含まれる
。これらはそのま＼用いてもよいが、線溶活性を一定し
、投与を容易にするため、納豆や納豆菌は水もしくは塩
類水溶液のような水性溶液で抽出する。抽出はＩ））Ｉ
　６ないし１１で、６０’Ｃ以下で行うのがよい。

また納豆菌の培養物が液体培養物である場合は濾過して
上溝をとる。これらの抽出液や上溝はそのま＼用いても
よいが、アセトンやエタノールを加えて析出するたん白
を除去したり、あるいはゲル濾過して精製すると七がで
きる。ゲル濾過には、たとえば、セファデックスＧ−１
００、同１５０を用いることもできる。

また、的記の抽出液や上溝は水や緩衝液を用いて透析し
、酵素を含む透析内液を得ることもできる。

これらの精製法は単独もしくは組合せて行うことができ
る。

上記のようにして得られる粗製もしくは精製酵素はその
ま＼または減圧乾燥、凍結乾燥などにより乾燥または濃
縮物として供用することができる。

本発明の血栓溶解剤は経口的に投与して、毒性を示さず
、有効である。

投与量は線溶酵素の精製の程度にもよるが、たとえば、
納豆を生理食塩水で抽出し、抽出液をゲル濾過して分子
量約２０，０００　　の両分として得たものについては
、一般に０．１ないし１０ｇ、好ましくは０２ないし５
ｙを１日１ないし３回程度投与するのがよく、この用量
単位に製剤を分割調製する。

６一 酵素が吸収される曲に分解するのをなるべく防ぐため、
腸溶製剤の形で投与するのが望ましい。

腸溶製剤は既知の方法により、たとえば酵素含有粉末な
いし顆粒をエンテリツクコーティングし、あるいは腸溶
カプセルに充填することにより行いうる。

実施例１ 特開昭６１−１６２１８４号実施例１　（Ｈ，Ｓｕｍｉ
ｅｔ　ａｌ：Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　４３．　１１１
０〜１１１１゜１９８７参照）により市販納豆から生理
食塩水で抽出し、ゲル濾過した後凍結乾燥して調製した
ナラトラキナーゼ（以下ＮＫと略称する）を３人の健康
成人（男３８才、図１−〇−１−１男子３−〇−１−１
男子５−ロー）にそれぞれ腸溶カプセル剤の形で経口投
与（５，Ｉ　ＴＶｌｋＱ　）　ｂ経時的に末梢血液を採
取し、ニーグロブリン溶解時間（ｅｕｇｌｏｂｕｌｉ、
ｎ　１ｙｓｉｓ　　ｔｉｍｅ　（ＲＭｉｌｓｔｏｎｅ：
Ｊ、　Ｉ皿ｕｎｏ１．阻１０９〜１１６，１９４１）以
下ＥＬＴと略称する。〕をＵＳＥ−５Ｅｕｇｌｏｂｕｌ
ｉｎ　Ｃ１ｏｔ　Ｌｙｓｉｓ　’ｐｉｍｅｒ（利康商事
製）を使用して測定し、さらにニーグロブリン分画のフ
ィブリン平板（■６Ｍ、Ｎｉ　１ｓｓｏｎ、　Ｆ。

Ｍａｒｋｕａｒｄｔ　（ｅｄ　）“Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙ
ｔｉｃｓ　ａｎｄａｎｔｉ−ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｌｉｃ
ｓ、”Ｐ　Ｐ　１１２−１１５゜Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ
ｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７８　）に対
する溶解能（ｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｆｉｂｒｉｎｏｌ
ｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｇ、以下ＥＦＡと略称する）の
それぞれ、を測定した。なおその除用いたフィブリン平
板調製に当ってはヒトフィブリノーゲン（持田製薬製、
東京）を用いそれに５３μｆ／ｍｌ　　のヒ）　Ｑｌｕ
−プラスミノーゲンを添加した。図１はその結果である
が、ＮＫの経口投与後２時間後にはＥＬＴが短縮しはじ
め（３）、またＥＦＡを高める効果が認められ（Ｂ）、
且つそれらの効果が長時間持続することがわかった。

実施例２ ７人の健康成人（男６名、女１名）に５　ｋｇの市販納
豆から４１の蒸留水を使って抽出し、ガーゼ濾過して調
製したＮＫの凍結乾燥品を１日３回、１．３ｇずつ経口
投与し続けた場合の経口的な血中の線溶活性の変化を調
べた。全血溶解時（ｗｈｏｌｅ。

ｂｌｏｏｄ　ｃｌｏｔ　１ｙｓｉｓ　ｔｉｍｅ　以下Ｗ
ＢＣＬＴと略称する。）はＣｈｏｈａｎらの方法（１，
Ｓ、　Ｃｈｏｈａｎｅｔ　ａｌ　４”ｈｒｏｍｂｏｓ、
　］）ｉａｔｈｅｓ、　Ｈａｅｍｏｒｒｈ。

（Ｓｔｕｔｔｇ）３３，２２６−２２９．１９７５〕で
測定した。即ち０．２　ｍｌの血液に１．７　ｍｌの０
．１２　Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，４）　　および０
．１　ｍｌのトロンビン溶液（５０単位　時間／　ｍｌ
　トロンビンは持田製薬社製、東京）を加え、３７°Ｃ
で形成されたフィブリン塊の溶けるまでの時間を測定し
た。ニーグロブリン分画のフィブリン溶解能（Ｅ　Ｆ　
Ａ　）　ＬｉＫｌｕｆｔらの方法（Ｃ，ｋｌｕｆｔ　　
ｅｔ　ａｌ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｕ　Ｑｈｅｍｉｃａｌ
　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｌ
ｙｓｉｓ、　２　：　５７−６５．Ｊ、Ｆ、　Ｄａｂｉ
ｄｓｏｎｅｔ　ａｌ（ｅｄ）、　Ｒｅｖｅｎ　ｐｒｅｓ
ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７６、）１を用いた。蒸
留水で１０倍に希釈した血漿をｐＨ５９に合わせ生じる
沈澱（ニーグロブリン分画）をＥＤＴＡ緩衝液に溶解し
たもの０．０３　ｍｌを標準フィブリン平板（Ｔ、　Ａ
ｓｔｒｕｐ　ａｎｄ　ｓ、　Ｍｕ’１ｌｅｒｔｚ。

Ａｒｃｈｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　
４０．３４６−３５１゜１９５２）にのせ３７°Ｃ１１
８時間保温後のフィブリン膜の溶解面積（ｍｍ”）で測
定した。なお標準フィブリン平板作製に用いたフィブリ
ノーゲンはマイルズ社製（米国）のウシ由来のもの、ま
たトロンビンは持田製薬社製（東京）のウシ由来のもの
である。血中のフィブリンあるいはフィブリノーゲンノ
分解産物（ｆｉｂｒｉｎ　ａｎｄ　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅ
ｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ以下ＦＤ
Ｐと略称する）は帝国臓器社製（東京）のＦＤＰＬテス
トによるラテックス凝集法を用いて測定した。即ち添付
説明書に定められた検体希釈用液で被検血清を希釈（１
−８２倍）したもの０．０７　ｍｌにラテックス試薬０
．０４　ｙｎｌを加えスライド板上で撹拌し２分後の凝
集の有無でみた。（例えば血清の２倍希釈液で凝集が起
った場合はＦＤＰ濃度は１μｆ　／　ｙｎｌ、４倍希釈
液で凝集が起ると２μ９７ｍ１である。）血漿中のＴＰ
ＡはＢｌｏｐｏｏ１社（米国）のＥＬＩＳＡキットを用
いてＢｅｒｇｓｄｏｒｆ　ＯＤ方法（Ｈ，Ｂｅｒｇｓｄ
ｏｒｆ　　ｅｔ　　ａｌＴｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ
ａｓ５０．７４０−７４４．１９８３）に従って、その
抗原量を精製されたヒトメラノーマＴＰＡを標準として
表示（μｇ／耐）した。

表１がこれらの測定結果であるがＮＫ投与によるＷ　Ｂ
　ＣＬ　Ｔ　（Ａ）の大きな変化はみられなかったが、
Ｅ　Ｆ　Ａ　（Ｂ）は投与１−８日にわたって次第に高
まること、そしてまた特に血中のＦＤＰ量（０）はＮＫ
投投与１目目ら投与前に比らべて有意に（Ｐ＜０．００
１）高まっていることがわかった。

また今日血中の線溶活性を説明する際に最もよく確かめ
られている血管内皮細胞由来とされる線溶因子ＴＰＡ（
口の血中抗原量もＮＫ投投与法次第高まること（投与４
日〜８日には投与前に比らべてＰ＜０．０５）がわかっ
た。図２，３および４は各々ＥＰＡ、ＦＤＰおよびＴＰ
Ａを測定したこれまでの成績の平均上標準偏差値をまと
めたものである。なおこのような血中線溶活性およびＴ
ＰＡ抗原量の変化は同じ人にＮＫを全く含まないカプセ
ル（プラセボ）を投与した場合は起らないことを確認し
た。

−へ０ハハハヘハ　■ に）　　　ｏ−Ｏトド−寸 寸　　■〕　　■　　（）　　Ｎ　　ｏフ　　ＯつＱ　
　　　０　ｘ　０　Ｓ　Ｅ−一寸 四　　　寸Ｃの■へω曽 Ｈ寸　Ｃω　Ｑ　Ｎ　■　■ ト ミ　ミ　薫　云　ミ　云　−］１ ρ　　　　　　　　リ　Ｑ　Ｖ−７ソ　ｖ　０　ワ　　
　ｋ実施例３ 外側伏在静脈に佐々木らの方法（Ｋ、　５ａｓａｋｉｅ
ｔ　ａｌ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　２７．１６５９
−１６６５゜１９８０）で０．４　ｍｌの５％ウシ−フ
ィブリノーゲンと０．２　ｍｌの５０単位／　ｙｔｔｌ
のウシ−トロンビンを用いて人工血栓を作製した雑種成
犬（１０〜１６に９、雄）に実施例２と同じ方法で調製
したＮＫの腸溶カプセル剤（２５０”Ｐ／カプセル）を
−度に４個経口投与し、それが−二脂腸移行した後経時
的に採血し、前述佐々木らの方法に従ってニーグロブリ
ン溶解時間（ＥＬＴ）を測定すると共に鼠経部の大動脈
よりＡｎｇｉｏｇｒａｆｉｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社西独
）を４　ｖｔｌ　７２秒で注入し、Ｘ線による血管造影
を行った。その結果ＮＫを含まないカプセルを投与した
対照群（Ｎ＝６　）のＥＬＴが３０分〜１２時間に亘っ
て６０±１０分と変化なく、また人工血栓の溶解も血栓
形成後いずれも１８時間以上に認められなかったのに対
してＮＫ投与群（Ｎ２２）ではＥＬＴは３０分後に３０
±８分（ｐく０．００５）１時間目には４１±１３分（
ｐ＜０．５＞、３時間目には５４±１１分（１）＜０．
５）、そして６時間でも５５±９分（１）＜０．５）と
ＮＫ投与後に短縮（即ち線溶亢進）が認められた。また
人工血栓もＮＫ投与群では５時間以内に完全溶解するこ
とが確認され、経口ＮＫに血栓溶解効果のあることがわ
かった。

（発明の効果） 本発明によれば、入手容易で安全な血栓症治療剤が提供
される。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の実験結果、第２，３および４図は実
施例２の実験結果を示す。 図面中、ＮＫは本発明の線溶酵素、ＥＬＴはニーグロブ
リン溶解時間、ＥＦＡはニーグロブリン分画のフィブリ
ン平板に対する溶解能、ＦＤＰは血中のフィブリンまた
はフィブリノーゲンの分解産物を示す。 （乙ｔ、ｕｕｕ）ｙ４ヨ　　　　　　　　　　　　　　
撮Ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　区（Ｑ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ぐ
濠　　　　　　　　　　　　　　　　　象（ＩＬＩＩ１
５ＬＪ）　Ｖｄｉ ○　　ｏｏ　　　♀　　　○ ５ｓＣｆ＞へ （」しＤ上］ヨ ｏ　　　ｏ　　　９　　０　　　＝

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　納豆菌の生産する線溶酵素を含有してなる経口用血
   栓溶解剤。 ２　０．１ないし１０ｇ、好ましくは０．２ないし５ｇ
   の用量単位に分割された請求項１記載の血栓溶解剤。 ３　腸溶剤の形態である請求項１記載の血栓溶解剤。