JPWO2006025276A1 - ナットウキナーゼを含む眼科疾患の治療・予防剤 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、抽出や精製が容易な物質を用いた、眼科疾患(特に網膜・硝子体疾患)の新規な治療・予防剤を提供することである。本発明によれば、ナットウキナーゼを含む、眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤が提供される。
Description
本発明は、ナットウキナーゼ(subtilisin NAT)を含む、眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤に関する。より詳細には、本発明は、硝子体の液化、増殖膜の脆弱化ならびに後部硝子体剥離等を誘導するナットウキナーゼを含む、眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤に関する。
発明の背景、眼の解剖
硝子体は水晶体の後面から網膜の表面までを満たす透明なゲル状の構造物であり、二大構成要素であるコラーゲンとヒアルロン酸のネットワーク構造の中に、多量の水と僅かな低分子物質などが存在し成り立っている。一方、網膜は硝子体の後方に接し眼球内壁を覆う膜状の神経組織である。この網膜と硝子体の界面には、様々な原因によって増殖膜が発生し、網膜剥離や硝子体出血を惹起して、失明の原因となっている。現在ではその治療法として硝子体手術が導入され、外科的にその増殖膜の切除ならびにその足場となる硝子体を網膜表面から剥がすこと(「後部硝子体剥離」)が行われているが、そのような機械的切除術では、術中に元来脆弱である正常な網膜組織を牽引し損傷する危険を常に伴っている。そこで、酵素を用いて後部硝子体剥離を誘導し、あるいは病的な増殖膜等の組織を酵素によって化学的に処理し、術中合併症を低下せしめること、さらには酵素の投与のみで外科手術を行うことなく治療することが切望されていた。
硝子体は水晶体の後面から網膜の表面までを満たす透明なゲル状の構造物であり、二大構成要素であるコラーゲンとヒアルロン酸のネットワーク構造の中に、多量の水と僅かな低分子物質などが存在し成り立っている。一方、網膜は硝子体の後方に接し眼球内壁を覆う膜状の神経組織である。この網膜と硝子体の界面には、様々な原因によって増殖膜が発生し、網膜剥離や硝子体出血を惹起して、失明の原因となっている。現在ではその治療法として硝子体手術が導入され、外科的にその増殖膜の切除ならびにその足場となる硝子体を網膜表面から剥がすこと(「後部硝子体剥離」)が行われているが、そのような機械的切除術では、術中に元来脆弱である正常な網膜組織を牽引し損傷する危険を常に伴っている。そこで、酵素を用いて後部硝子体剥離を誘導し、あるいは病的な増殖膜等の組織を酵素によって化学的に処理し、術中合併症を低下せしめること、さらには酵素の投与のみで外科手術を行うことなく治療することが切望されていた。
他の酵素の従来の眼科での使用
硝子体の固形成分には、コラーゲンとヒアルロン酸の2種があり、コラーゲン線維の中にコイル状のヒアルロン酸分子が存在している。ヒアルロニダーゼ(Vitrase登録商標、イスタファーマスーティカルズインコーポレイテッド)は、ヒアルロン酸を分解することによって硝子体の液化を促し、硝子体出血の吸収を促進するとして、硝子体腔内注入が提案されている。しかしながら、ヒアルロニダーゼは硝子体の骨格成分であるコラーゲン繊維は分解せず、治療上重要である後部硝子体剥離は誘導しないと考えられる。一方、プラスミンは、硝子体の骨格成分といえるコラーゲン線維を分解し、硝子体の液化のみならず後部硝子体剥離をも誘導すると考えられ、一部の眼科施設で臨床使用されている。
硝子体の固形成分には、コラーゲンとヒアルロン酸の2種があり、コラーゲン線維の中にコイル状のヒアルロン酸分子が存在している。ヒアルロニダーゼ(Vitrase登録商標、イスタファーマスーティカルズインコーポレイテッド)は、ヒアルロン酸を分解することによって硝子体の液化を促し、硝子体出血の吸収を促進するとして、硝子体腔内注入が提案されている。しかしながら、ヒアルロニダーゼは硝子体の骨格成分であるコラーゲン繊維は分解せず、治療上重要である後部硝子体剥離は誘導しないと考えられる。一方、プラスミンは、硝子体の骨格成分といえるコラーゲン線維を分解し、硝子体の液化のみならず後部硝子体剥離をも誘導すると考えられ、一部の眼科施設で臨床使用されている。
現在まで網膜硝子体疾患に対する硝子体手術の際に、機械的牽引による硝子体剥離が行われてきた。しかしながら、一定の頻度で網膜裂孔などの術中合併症が見られるのも事実である。近年、術中合併症の発生率を軽減させ、また後部硝子体剥離を簡便におこさせることを目的として、自己血清から精製したプラスミンを使用することが米国の一部の施設から報告され、熊本大学医学部附属病院眼科においても、倫理委員会の承認のもと、適応疾患でありかつ本人の同意が得られた症例に対し手術補助剤として使用している。その結果、硝子体の液化ならびに後部硝子体剥離の誘導を認め、また病的組織である網膜硝子体界面の増殖膜剥離を容易にする等、網膜硝子体疾患の治療に有用であることが確認された。しかしながら、プラスミンは自家血から抽出、精製する必要があり、そのための特殊な設備ならびに技術・技術者を必要とすることにより広く多施設で臨床応用されることが困難であること、プラスミンの精製に数日間にわたる時間を要するため、即日に手術を要する症例には応用できないこと、さらには抽出、精製したプラスミンの活性量に個人差が生じうることなどが挙げられ、一般的な治療法となるのは困難である。
即ち、本発明は、抽出や精製が容易な物質を用いた、眼科疾患(特に網膜・硝子体疾患)の新規な治療・予防剤を提供することを解決すべき課題とした。さらに詳細には、本発明は、硝子体の液化及び後部硝子体剥離を誘導できる物質であって、かつ抽出や精製が容易な物質を用いた、眼科疾患(特に網膜・硝子体疾患)の新規な治療・予防剤を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、硝子体腔内にナットウキナーゼを投与することによって、硝子体の液化、及び後部硝子体剥離を誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、ナットウキナーゼを含む、眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤が提供される。
好ましくは、ナットウキナーゼは、納豆菌培養エキス由来のものである。
好ましくは、眼科疾患は網膜・硝子体疾患である。
好ましくは、本発明の薬剤は、硝子体の液化及び/又は後部硝子体剥離の誘導作用を有する。
好ましくは、本発明の薬剤は、硝子体腔内に投与される。
好ましくは、眼科疾患は網膜・硝子体疾患である。
好ましくは、本発明の薬剤は、硝子体の液化及び/又は後部硝子体剥離の誘導作用を有する。
好ましくは、本発明の薬剤は、硝子体腔内に投与される。
本発明の別の側面によれば、ナットウキナーゼをヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、眼科疾患を治療又は予防する方法又は眼科疾患の手術を補助する方法が提供される。
本発明の別の側面によれば、眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤の製造ためのナットウキナーゼの使用が提供される。
本発明の別の側面によれば、眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤の製造ためのナットウキナーゼの使用が提供される。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤(本書中、本発明の薬剤とも言う)においては、ナットウキナーゼを有効成分として用いる。ナットウキナーゼ(subtilisin NAT)は、275個のアミノ酸からなる一本鎖構造の蛋白であり、これまで強力な血栓溶解作用[Sumi et al. Experientia, 1987]、プラスミノーゲン活性化因子の効果増強 [Sumi et al.Hematologica, 1990]、ならびにプラスノーゲン活性化因子阻害因子の抑制作用[Urano et al. J Biol Chem, 2001]を有することが報告されている。
本発明による眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤(本書中、本発明の薬剤とも言う)においては、ナットウキナーゼを有効成分として用いる。ナットウキナーゼ(subtilisin NAT)は、275個のアミノ酸からなる一本鎖構造の蛋白であり、これまで強力な血栓溶解作用[Sumi et al. Experientia, 1987]、プラスミノーゲン活性化因子の効果増強 [Sumi et al.Hematologica, 1990]、ならびにプラスノーゲン活性化因子阻害因子の抑制作用[Urano et al. J Biol Chem, 2001]を有することが報告されている。
また、ナットウキナーゼは経口投与で血栓溶解作用を有することも報告され[Sumi et al. Hematologica, 1990]、ナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキス等を利用した加工食品が、近年健康食品として広く普及している。
本発明では、従来使用されてきたプラスミンの代替薬として、このナットウキナーゼを使用するものである。これまでプラスミンで行ってきた手術法と同様、硝子体腔内にナットウキナーゼを投与し、一定時間の後、硝子体切除を開始することにより、硝子体手術における機械的吸引、切除による合併症を軽減させることができる。
本明細書中の実施例に示す通り、家兎眼を用いた実験結果では、硝子体の液化、後部硝子体剥離の誘導が確認され、プラスミンと同等以上の効果が期待できる結果が得られている。ナットウキナーゼを網膜・硝子体疾患等の眼科疾患の治療・予防薬ならびに手術補助薬として提供することにより、プラスミンを用いた場合の欠点を克服することができる。
本発明で用いるナットウキナーゼは、例えば、納豆菌培養エキス由来のものでもよいし、ナットウキナーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターを宿主に形質転換し、当該遺伝子を発現させることにより得られる組み換え体のナットウキナーゼでもよいし、あるいはペプチド合成機で化学合成したタンパク質の何れでもよい。
納豆菌培養エキス由来のものを使用する場合は、例えば、大豆を主原料とした液体培地に納豆菌を摂取し培養することで、ナットウキナーゼを高含有する培養液を製造することができる。納豆菌培養エキスの製造方法については、特開2001−299277号公報に記載されており、本発明においても特開2001−299277号公報に記載の方法で作製した納豆菌培養エキスを用いることができる。
例えば、納豆菌培養エキスの製造に用いられる微生物は、納豆菌に分類され、ナットウキナーゼを生産できる微生物であれば、いずれの微生物も使用できる。市販の納豆から分離した納豆菌を用いてもよい。また、納豆菌の培養に用いる培地の種類は特に限定されず、澱粉(例えば、コーンスターチ)、グルコース、ショ糖などの炭素源、脱脂大豆、肉エキスなどの窒素源、炭酸カルシウム、塩化マグネシウムなどの無機塩などを培地成分として用いて、納豆菌を培養することができる。納豆菌の培養方法も特に限定されず、例えば、通気攪拌培養で培養することができる。培養温度も特に限定されないが、通常は30〜45℃程度であり、32〜42℃が特に好ましい。培養期間も特に限定されず、例えば、3〜4日間程度培養することができる。
また、培養終了後の培養物上清中には、ナットウキナーゼのほかにビタミンK2が含まれているので、この培養物をキトサンと接触させて、ビタミンK2をキトサンに吸着させて除去することができる。得られた濾液を濃縮機等で処理することにより納豆菌培養液の濃縮液が得られる。
本発明に使用されるナットウキナーゼは、納豆、納豆菌の液体又は固体培養物並びにこれら加工品を出発原料として、一般の酵素蛋白質の分離・精製に使用されている方法、即ち、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等により得る事が出来る。分離・精製法に付いては、須見らの方法(特開昭61−162184号公報、Experientia,43,1110 (1987))、Ichishimaらの方法(Biochimica et Biophysica Acta,869,178-184 (1986))、中西らの方法(特開平3−168082号公報)、三沢らの方法(特開平6−153977号公報)、Uranoらの方法(J. Biol. Chem.,276,24690-24696 (2001)) を始めとして多数の学術文献・総説等に収載されている。これら各々の方法若しくはこれらを組合わせた方法により精製品を得る事が出来る。
納豆からの精製例を参考例として以下に示す。
市販納豆500 gに2倍量の水を加え暫く撹拌させた後、ガーゼでろ過した。ろ液の半分量のエタノールを加え緩やかに撹拌させた後ガーゼでろ過した。このろ液に硫酸アンモニウムを80%飽和量加え溶解し、一晩放置後遠心分離により沈殿物を回収した。得られた沈殿物を100 mmol/Lリン酸緩衝液 (pH 7.0) に再溶解した後、2 mmol/Lリン酸緩衝液中 (pH 7.0) で一晩透析した。この透析液を、予め10 mmol/Lリン酸緩衝液(pH 7.0) で平衡化しておいたDEAE-Sephadex A-50 (Amersham Biosciences) に通し、非吸着画分を回収した。10 mmol/L酢酸緩衝液 (pH 6.0) で一晩透析し、同緩衝液で予め平衡化しておいたCM-Sephadex (Amersham Biosciences) に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、1 mol/L塩化ナトリウムを含む10 mmol/L酢酸緩衝液 (pH 6.0) のリニアグラジエントにより溶出させた。最後に100 mmol/L塩化ナトリウムを含む10 mmol/Lリン酸緩衝液 (pH 7.5) で平衡化させたSephacryl S-200 HR (Amersham Biosciences) でゲルろ過を行い、活性画分を得た。活性画分はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動上で単一バンドである事を確認した。本工程の活性収率は約30%であった。
市販納豆500 gに2倍量の水を加え暫く撹拌させた後、ガーゼでろ過した。ろ液の半分量のエタノールを加え緩やかに撹拌させた後ガーゼでろ過した。このろ液に硫酸アンモニウムを80%飽和量加え溶解し、一晩放置後遠心分離により沈殿物を回収した。得られた沈殿物を100 mmol/Lリン酸緩衝液 (pH 7.0) に再溶解した後、2 mmol/Lリン酸緩衝液中 (pH 7.0) で一晩透析した。この透析液を、予め10 mmol/Lリン酸緩衝液(pH 7.0) で平衡化しておいたDEAE-Sephadex A-50 (Amersham Biosciences) に通し、非吸着画分を回収した。10 mmol/L酢酸緩衝液 (pH 6.0) で一晩透析し、同緩衝液で予め平衡化しておいたCM-Sephadex (Amersham Biosciences) に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、1 mol/L塩化ナトリウムを含む10 mmol/L酢酸緩衝液 (pH 6.0) のリニアグラジエントにより溶出させた。最後に100 mmol/L塩化ナトリウムを含む10 mmol/Lリン酸緩衝液 (pH 7.5) で平衡化させたSephacryl S-200 HR (Amersham Biosciences) でゲルろ過を行い、活性画分を得た。活性画分はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動上で単一バンドである事を確認した。本工程の活性収率は約30%であった。
また、上記の通り、ナットウキナーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターを宿主に形質転換し、当該遺伝子を発現させることにより得られる組み換え体のナットウキナーゼを用いることもできる。ナットウキナーゼは275個のアミノ酸からなる一本鎖構造の蛋白であり、そのアミノ酸配列及び塩基配列は公知である[Nakamura et al. Biosci.Biotech.Biochem., 56(11), 1869-1871, 1992]。上記したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて、当業者であれば、ナットウキナーゼをコードする遺伝子を入手し、それを含む発現ベクターを構築し、その発現ベクターを宿主に形質転換し、得られた形質転換体を培養して当該遺伝子を発現させることにより組み換え体のナットウキナーゼを製造することができる。
本発明の薬剤は、以下の実施例で示す通り、注入後早期より後部硝子体剥離を示す所見が認められ、また網膜表面の硝子体線維は薬剤濃度に依存的に消失した。即ち、本発明の薬剤は、硝子体の液化及び/又は後部硝子体剥離の誘導作用を有し、これにより、眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤として使用されるものである。眼科疾患の種類は特に限定されるものではないが、好ましくは網膜・硝子体疾患である。眼科疾患の具体例としては、網膜剥離、硝子体出血、 HYPERLINK "http://www.matsuda-eye-clinic.com/gantei1-2.htm" 網膜静脈閉塞症、 HYPERLINK "http://www.matsuda-eye-clinic.com/gantei1-4.htm" 加齢黄斑変性、 HYPERLINK "http://www.matsuda-eye-clinic.com/gantei1-5.htm" 黄斑円孔、黄斑下血腫、増殖性硝子体網膜症、網膜出血、網膜血管異常、高血圧または腎疾患による網膜症、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、および光凝固による眼球後眼部合併症(例えば、黄斑部浮腫、網膜剥離等)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本化合物の投与は経口、非経口のどちらでもよいが、非経口が好ましく、眼局所投与が特に好ましい。眼局所用剤としては、例えば硝子体内投与剤、眼内灌流液、点眼剤、眼軟膏、眼内インプラント等が挙げられ、上記の中でも硝子体内投与剤が特に好ましい。
硝子体内投与剤、眼内還流液又は点眼剤として製剤化する場合、緩衝剤(例えばホウ酸、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤等)、等張化剤(例えばグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ソルビトール、マンニトールなど)、pH調整剤(例えば塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど)、安定化剤(例えばエデト酸ナトリウムなど)、無痛化剤(例えば、ベンジルアルコールなど)、又は保存剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウム、クロロブタノールなど)などを適宜選択して製剤化できる。その他の投与剤型についても汎用の技術を用いて製剤化することができる。
本発明においては、ナットウキナーゼを含む眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤を温血動物(好ましくは哺乳動物であり、特に好ましくはヒト)に投与することにより、眼科疾患を治療することができ、また眼科疾患の手術補助のために投与することができる。
本発明の薬剤の投与量は、投与対象となる疾患、症状やその他の条件、又は投与方法などに応じて適宜選択することができる。ナットウキナーゼを成人患者に投与する場合、一回あたりの投与量は、眼への局所投与の場合、通常1回当たり、0. 001FU〜100FU程度の量で投与することができる。
なお、ナットウキナーゼ活性については、日本生物科学研究所で開発された、再現性があり且つ正確に数値化できるナットウキナーゼ測定方法を用いて測定することができる。具体的には以下のとおりである。
ナットウキナーゼはBacillus属の産生するアルカリセリンプロテアーゼの一種類であり、蛋白質及び/又はペプチドを基質とした活性測定法で評価できる。一般的には、乳性カゼイン分解法、合成ペプチド分解法、フィブリン平板溶解法、フィブリンゲル分解法等により測定されている。本発明者らは、株式会社日本生物.科学研究所が開発したフィブリン分解法によりナットウキナーゼの活性を測定した。該法は、社団法人日本健康・栄養食品協会が定める所の、納豆菌培養エキス食品中のナットウキナーゼ活性測定法としても採用されており、その再現性と的確性が立証されている。該法は、フィブリンにナットウキナーゼが作用する時、ペプチド結合の分解に伴って増加する酸可溶性低分子分解産物量を紫外部 (275 nm) における吸光度を測定して定量化する方法である。活性度の定義は、該法に従って試験するとき、酸不溶性物質を除いた反応液の275 nmにおける吸光度を1分間に0.01増加させる酵素量を1単位 (FU) とする。該反応は以下の如くである。フィブリノーゲン (SIGMA社製 フィブリノーゲン フラクションI Type I-S 、PRODUCT NUMBER F8630) 96 mgを0.9 % 塩化ナトリウムを含む50 mmol/Lホウ砂緩衝液 (pH 8.5) 10 mLに溶解させた。溶けきらない物をガラス棒で磨り潰し完全に溶解させた後、ろ紙 (ADVANTEC, No. 6) でろ過した。本溶液0.4 mLと0.9 % 塩化ナトリウムを含む50 mmol/Lホウ砂緩衝液 (pH 8.5) 1.4 mLを試験管 (15 mm ID × 150 mm L) に量り取り、37±0.3 ℃の恒温水槽中で5分間加温後、0.9 % 塩化ナトリウムを含む50 mmol/Lホウ砂緩衝液 (pH 8.5) で20 U/mLに調製したトロンビン (SIGMA社製、PRODUCT NUMBER T6634) 溶液0.1 mLを加え撹拌した。この液を37±0.3 ℃で正確に10分間放置した後、試料溶液0.1 mLを加え、5秒間撹拌し、37±0.3 ℃で放置した。試料溶液を添加してから20分後及び40分後に各5秒間撹拌し、正確に60分後、200 mmol/Lトリクロロ酢酸溶液2 mLを加えて撹拌し、更に37±0.3 ℃で20分間放置した。この液をマイクロテストチューブに入れ15,000×gで5分間遠心分離した。上清1 mLを回収し、275 nmにおける吸光度(AT)を測定した。別に、試験管に0.9 % 塩化ナトリウムを含む50 mmol/Lホウ砂緩衝液 (pH 8.5) 1.4 mL及びフィブリノーゲン溶液0.4 mLを量り取り、37±0.3 ℃の恒温水槽で5分間加温した後、トロンビン溶液0.1 mLを加え撹拌した。この液を37±0.3 ℃で正確に10分間放置した後、200 mmol/Lトリクロロ酢酸溶液2 mLを加え撹拌し、更に試料溶液0.1 mLを加え撹拌した。この液を37±0.3 ℃で20分間放置し、以下同様に操作して吸光度 (AB) を測定した。ナットウキナーゼ活性度は次式により求めた。
ナットウキナーゼ活性度 (FU/g) = (AT−AB)/0.01 × 1/60 × 1/0.1 × D
D : 試料の希釈倍数
D : 試料の希釈倍数
尚、試料溶液の調製には、2 mmol/L硫酸カルシウム、10 mmol/L塩化ナトリウム、0.005 % トリトン X-100を含む2 mmol/L酢酸緩衝液 (pH 6.0) を使用した。
又、該法で使用する基質 (フィブリノーゲン) は天然物由来であり、製造ロット毎の品質の差が激しく、酵素活性の絶対値を定めることが困難である。それ故、該法による測定時には、株式会社日本生物.科学研究所が供給する標準酵素を必ず測定し、その測定値を標準酵素表記力価で除した値を補正係数とした。全ての測定値に補正係数を乗じて測定値とした。
この方法ではその単位を「FU(フィブリン分解ユニット)」としている(厚生労働省の外郭団体、財団法人日本健康・栄養食品協会は2003年1月15日にナットウ菌培養エキス食品の規格基準を公示し、「FU」をナットウキナーゼ活性測定の単位として認定している)。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
(1)実験の材料・方法
動物: 12週齢の体重2.0kgの日本白色家兎[九動株式会社]を使用した。ウサギ飼育用のケージに個々に収容し、自由に利用可能な十分量の水と飼料を与えた。
動物: 12週齢の体重2.0kgの日本白色家兎[九動株式会社]を使用した。ウサギ飼育用のケージに個々に収容し、自由に利用可能な十分量の水と飼料を与えた。
ナットウキナーゼ(subtilisin NAT): ナットウキナーゼは、日本生物.科学研究所においてナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキス[NSK-SD登録商標、日本生物.科学研究所]を用いて下記の通り精製、下記の方法によってその活性を測定したものを使用した。
精製: 食品及び健康食品原料として市販されている、納豆菌培養エキス NSK-SD(株式会社日本生物.科学研究所)1 gを 10 mLの2 mmol/L酢酸カルシウム溶液に溶解した。10 mmol/L酢酸緩衝液 (pH 6.0) で一晩透析し、同緩衝液で予め平衡化しておいたCM-Sephadex (Amersham Biosciences) に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、0.5 mol/L塩化ナトリウムを含む10 mmol/L酢酸緩衝液 (pH 6.0) のリニアグラジエントにより溶出させた。最後に150 mmol/L塩化ナトリウムを含む10 mmol/Lリン酸緩衝液 (pH 7.5) で平衡化させたSephacryl S-100 HR (Amersham Biosciences) でゲルろ過を行い、活性画分を得た。活性画分はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動上で単一バンドである事を確認した。本工程の活性収率は約60%であった。
ナットウキナーゼ活性: 日本生物科学研究所で開発された、再現性があり且つ正確に数値化できるナットウキナーゼ測定方法(詳細は本明細書中上記の通り)を用いた。この方法ではその単位を「FU(フィブリン分解ユニット)」としている。(厚生労働省の外郭団体、財団法人日本健康・栄養食品協会は2003年1月15日にナットウ菌培養エキス食品の規格基準を公示し、「FU」をナットウキナーゼ活性測定の単位として認定している。)
麻酔: 各処置施行の際、白色家兎はペントバルビタール(20mg/kg静注)と塩酸ケタミン(20mg/kg筋注)にて麻酔した。
ナットウキナーゼの投与: 白色家兎の処置眼に0.5%トロピカミドと0.5%塩酸フェニレフリン混合液を点眼し散瞳した。眼科手術用眼内潅流液[BSSplus登録商標、アルコン]にて溶解し活性を調整したナットウキナーゼ溶液(3FU/0.1ml、1FU/0.1ml、0.1FU/0.1ml、0.01FU/0.1ml)を1mlシリンジに準備し、硝子体手術用コンタクトレンズを角膜上に設置後、眼科手術用顕微鏡下に角膜輪部から2mm離れた場所よりシリンジに接続した30ゲージ針を刺入して、注意深く0.1mlを硝子体腔内中央へゆっくりと注入した。また対照眼には、眼科手術用眼内潅流液0.1mlを同様に注入した。注入直後は眼圧の上昇が生じたため、20ゲージの眼科用ナイフにて前房穿刺を施行し、眼圧を正常化した。なお、硝子体腔内に注入する溶液はすべて0.22μmのフィルターにて濾過滅菌した。
超音波画像診断検査: ナットウキナーゼ溶液3 FU/0.1mlならびに眼科手術用眼内潅流液0.1mlを、それぞれ上記の方法により硝子体腔内に注入し、30分後にBモード超音波画像診断装置[UD-1000、TOMEY]にて観察した。
走査電子顕微鏡検査: 眼科手術用眼内潅流液0.1mlおよびナットウキナーゼ溶液(0.01FU/0.1ml、0.1FU/0.1ml、1FU/0.1ml)をそれぞれ上記の方法により硝子体腔内に注入し、30分後に眼球を摘出。4℃の固定液(2%パラホルム、2.5%グルタール)中に入れ、その1時間後に毛様体扁平部に半周切開を加えた後、再び同固定液中で一晩静置。その後、スプリング剪刀にて毛様体扁平部を全周切開しアイカップを作製。アイカップを剃刀で髄翼と垂直方向に半割し、走査電子顕微鏡検査用の試料とした。同試料を4℃の2%タンニン酸[Wako]中で一晩静置した後、PBSにて20分間毎に6回洗浄、その後2%オスミウム中に氷上で70分静置。2%オスミウムを回収した後、蒸留水にて水洗3回。エタノール50%15分、70%15分、90%15分、95%15分、99.5%30分2回にて脱水した後、tブチルアルコールに浸漬(20分3回)。凍結の後、試料を凍結乾燥器にて凍結乾燥し、アルミニウムの載物台にカーボン両面テープにて接着、金蒸着装置[JFC-1200、JEOL]にて金属コーティングした試料を、走査電子顕微鏡[JSM-5800LV、JEOL]にて観察した。
網膜電図検査: 正常未処置の白色家兎眼を散瞳し、30分間暗順応の後、網膜電図を記録した[LE-2000、TOMEY]。次に同一の白色家兎眼硝子体腔内に1 FU/0.1mlのナットウキナーゼ溶液を注入、30分間暗順応の後、溶液注入1時間後に網膜電図を記録した(n=4)。
(2)実験の結果
超音波画像診断検査: 対照眼(眼科手術用眼内潅流液注入眼)では、注入後も特記すべき変化が認められなかったのに対し、ナットウキナーゼ注入眼では、注入後早期より後部硝子体剥離を示す所見が認められた(図1〜図3)。
走査電子顕微鏡検査: ナットウキナーゼ注入眼では、網膜表面の硝子体線維は濃度依存的にほぼ消失した。なお、網膜表面の損傷は認められなかった(図4〜図7)。
網膜電図検査: ナットウキナーゼ注入前のa波振幅の平均は104. 8μV、ナットウキナーゼ注入前のb波振幅の平均は190. 4μV。 ナットウキナーゼ注入後のa波振幅の平均は98. 4μV、 ナットウキナーゼ注入後のb波振幅の平均は163. 4μVであり、a波b波ともに振幅の有意な低下は認められなかった(各々p = 0. 35、 0. 48)。
超音波画像診断検査: 対照眼(眼科手術用眼内潅流液注入眼)では、注入後も特記すべき変化が認められなかったのに対し、ナットウキナーゼ注入眼では、注入後早期より後部硝子体剥離を示す所見が認められた(図1〜図3)。
走査電子顕微鏡検査: ナットウキナーゼ注入眼では、網膜表面の硝子体線維は濃度依存的にほぼ消失した。なお、網膜表面の損傷は認められなかった(図4〜図7)。
網膜電図検査: ナットウキナーゼ注入前のa波振幅の平均は104. 8μV、ナットウキナーゼ注入前のb波振幅の平均は190. 4μV。 ナットウキナーゼ注入後のa波振幅の平均は98. 4μV、 ナットウキナーゼ注入後のb波振幅の平均は163. 4μVであり、a波b波ともに振幅の有意な低下は認められなかった(各々p = 0. 35、 0. 48)。
参考例:
ナットウキナーゼの他に手術補助薬としてプラスミンの利用が考えられる。以下にプラスミンを用いての実験結果を参考例として示す。
プラスミンの投与: 白色家兎の処置眼に0.5%トロピカミドと0.5%塩酸フェニレフリン混合液を点眼し散瞳した。過去の報告(Margherio AR, Margherio RR, Hartzer M, Trese MT, Williams GA, Ferrone PJ. Plasmin enzyme-assisted vitrectomy in traumatic pediatric macular holes. Ophthalmology 1998;105:1617-1620.、Trese MT. Enzymatic vitreous surgery. Semin Ophthalmol 2000;15:116-121.)に従って健常人より精製し活性化したプラスミン(0. 05単位、0. 25単位、0. 5単位)と、対照として眼科手術用眼内潅流液[BSSplus登録商標、アルコン]を、硝子体手術用コンタクトレンズを角膜上に設置後、眼科手術用顕微鏡下に角膜輪部から2mm離れた場所よりシリンジに接続した30ゲージ針を刺入して、注意深く0.05mlを硝子体腔内中央へゆっくりと注入した。また対照眼には、眼科手術用眼内潅流液0.05mlを同様に注入した。なお、硝子体腔内に注入する溶液はすべて0.22μmのフィルターにて濾過滅菌した。
ナットウキナーゼの他に手術補助薬としてプラスミンの利用が考えられる。以下にプラスミンを用いての実験結果を参考例として示す。
プラスミンの投与: 白色家兎の処置眼に0.5%トロピカミドと0.5%塩酸フェニレフリン混合液を点眼し散瞳した。過去の報告(Margherio AR, Margherio RR, Hartzer M, Trese MT, Williams GA, Ferrone PJ. Plasmin enzyme-assisted vitrectomy in traumatic pediatric macular holes. Ophthalmology 1998;105:1617-1620.、Trese MT. Enzymatic vitreous surgery. Semin Ophthalmol 2000;15:116-121.)に従って健常人より精製し活性化したプラスミン(0. 05単位、0. 25単位、0. 5単位)と、対照として眼科手術用眼内潅流液[BSSplus登録商標、アルコン]を、硝子体手術用コンタクトレンズを角膜上に設置後、眼科手術用顕微鏡下に角膜輪部から2mm離れた場所よりシリンジに接続した30ゲージ針を刺入して、注意深く0.05mlを硝子体腔内中央へゆっくりと注入した。また対照眼には、眼科手術用眼内潅流液0.05mlを同様に注入した。なお、硝子体腔内に注入する溶液はすべて0.22μmのフィルターにて濾過滅菌した。
走査電子顕微鏡検査:各濃度のプラスミン注入30分後に眼球を摘出し、4℃の固定液(2%パラホルム、2.5%グルタール)中に入れ、その1時間後に毛様体扁平部に半周切開を加えた後、再び同固定液中で一晩静置。その後、スプリング剪刀にて毛様体扁平部を全周切開しアイカップを作製。アイカップを剃刀で髄翼と垂直方向に半割し、走査電子顕微鏡検査用の試料とした。同試料を4℃の2%タンニン酸[Wako]中で一晩静置した後、PBSにて20分間毎に6回洗浄、その後2%オスミウム中に氷上で70分静置。2%オスミウムを回収した後、蒸留水にて水洗3回。エタノール50%15分、70%15分、90%15分、95%15分、99.5%30分2回にて脱水した後、tブチルアルコールに浸漬(20分3回)。凍結の後、試料を凍結乾燥器にて凍結乾燥し、アルミニウムの載物台にカーボン両面テープにて接着、金蒸着装置[JFC-1200、JEOL]にて金属コーティングした試料を、走査電子顕微鏡[JSM-5800LV、JEOL]にて観察した。
結果:プラスミン投与により、網膜表面の硝子体線維は濃度依存的にほぼ消失した(図8〜11)。
本発明の薬剤は、眼科疾患、特に網膜・硝子体疾患の治療・予防剤又は手術補助剤として有用である。眼科疾患(網膜・硝子体疾患など)の治療・予防薬又は手術補助薬としてナットウキナーゼ(subtilisin NAT)を使用することによって、プラスミン精製のための技術や施設を有しない施設においても、その代替薬として利用可能となる。本発明で使用するナットウキナーゼは、各個人の血清から精製する必要がなく、緊急手術の際も利用可能である。また、本発明によれば、個人間のばらつきがなくなり正常組織に傷害を与えることのないより安全かつ低侵襲な治療手段を提供することができる。また、本発明で使用するナットウキナーゼの生産コストは安価である。
Claims (5)
- ナットウキナーゼを含む、眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤。
- ナットウキナーゼが、納豆菌培養エキス由来のものである、請求項1に記載の眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤。
- 眼科疾患が網膜・硝子体疾患である、請求項1又は2に記載の眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤。
- 硝子体の液化及び/又は後部硝子体剥離の誘導作用を有する、請求項1から3の何れかに記載の眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤。
- 硝子体腔内に投与される、請求項1から4の何れかに記載の眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤。
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