KR100613306B1

KR100613306B1 - 근적외선에 의한 진단 및 치료를 위한 산 불안정성 및 효소 분해성 염료 화합물

Info

Publication number: KR100613306B1
Application number: KR1019997009757A
Authority: KR
Inventors: 카이 리카; 브예른 리프케; 볼프하르트 세믈러; 볼프강 브라지들로
Original assignee: 인스티튜트 피르 디아그노스티크포르슝 게엠베하 안 데르 프라이엔 유니버시태트 베를린
Priority date: 1997-04-23
Filing date: 1998-04-02
Publication date: 2006-08-17
Also published as: DE19717904A1; US6534041B1; DE59814030D1; CY1106860T1; JP5118790B2; KR20010020183A; ES2289786T3; JP2010116413A; WO1998047538A2; PT988060E; NO995181L; HU226812B1; DK0988060T3; NO995181D0; HUP0003132A2; EP0988060A2; HUP0003132A3; WO1998047538A3; AU733757B2; NO327495B1

Abstract

본 발명은 근적외선 방사선 (NIR 방사선)에 의한 생체내 및 생체외 진단용 산 불안정성 및 효소 분해성 화합물, 상기 화합물의 광학 진단제 및 치료제로서의 용도 및 상기 화합물을 함유하는 진단제에 관한 것이다.

근적외선, 효소, 진단제, 치료제, 화합물.

Description

근적외선에 의한 진단 및 치료를 위한 산 불안정성 및 효소 분해성 염료 화합물 {Acid-Labile and Enzymatically Divisible Dye Compounds for Diagnosis with Near Infrared Light and for Therapy}

본 발명은 근적외선 (NIR 방사선)에 의한 생체내 및 생체외 진단용 산 불안정성 및 효소 분해성 화합물, 상기 화합물의 광학 진단제 및 치료제로서의 용도, 및 상기 화합물을 함유하는 진단제에 관한 것이다.

근적외선 화상법은 비침입성 진단 방법이며, 파장 650 내지 1000 nm에서의 광에 대한 생물학적 조직의 높은 투과율을 이용한다. 조직의 최상부 밀리미터에만 투과할 수 있는 자외선 및 가시광선 영역의 광과는 대조적으로 근적외선의 사용에 의해 수 센티미터 이하 조직으로의 투과 깊이가 달성된다. 광의 투과 깊이가 기본적으로 작은 이유는 내인성 염료, 주로 헤모글로빈 및 물의 흡광도가 근적외선의 범위에 있으나 650 내지 1000 nm의 최소값을 갖기 때문이다. 따라서, 최대 광학적 조직 투명도의 스펙트럼 범위는 또한 진단/치료 창이라 부른다 (Boulnois, J., Lasers Med Sci 1986, 1:47-66).

따라서, 진단 방사선의학, 자기 공명 단층촬영법 또는 초음파 진단과 같은 현대 화상법 뿐만 아니라 조직을 그래프적으로 가시화하기 위한 또다른 방법이 진단의에게 이용되고 있다 (Haller, E. B., Time-Resolved Transillumination and Optical Tomography. J. Biomed Optics 1996, 1:7-17).

헤모글로빈/데옥시헤모글로빈의 흡광도의 검출에 의한 신생아의 뇌에서의 혈류 및 산소포화도의 부위 의존적 기록을 위해 NIR 방사선을 사용하는 것은 수년 동안 공지되고 사용된 방법이다 (Joebsis, F. F., Science 1977, 198: 1264-67; Chance, B.; Leigh, J. S.; Miyake, H. 등, Proc Natl Acad Sci USA 1988, 85: 4971-75; Benaron, D. A. 등, Science 1993, 33: 369 A).

근적외선 방사선이 사용되는 경우 기본 문제점은 광이 강하게 산란하며, 상이한 광물리학적 특성의 경우에서도 대상물이 뚜렷한 경계가 있는 대상물 및 주변 영역으로부터 가까스로 구별되는 것이다. 표면으로부터 대상물의 제거가 증가함에 따라 상기 문제점이 증가하고 투시법의 경우 및 형광 방사선의 검출에서는 주요 제한 인자로서 여겨질 수 있다. 조영제로서 조직의 광학적 특성을 표시하고 검출하고자 하는 조직의 증가된 흡광도 및 형광을 유발시키는 염료는 따라서 불량한 부위 분해능으로도 명백한 검출을 가능하게 할 수 있다. 상기 경우에는 이러한 염료 화합물의 흡광 거동을 화상 정보로서 사용할 수 있다. 또한 염료가 형광 방사선으로서 흡수된 에너지를 방출하는 특성을 갖는 경우 이러한 특성도 화상 정보로서 사용될 수 있다. 상기 경우에는 여기 방사선에 대한 적색 이동된 형광 방사선이 개별적으로 검출된다. 조직 자체는 NIR 범위에서 극도로 낮은 고유 형광을 가지므로 배경이 최소인 것이 잇점이다 [S. Folli 등, Cancer Research 54, 2643-9 (1994); B. Ballou 등, Cancer Immunol. Immunother. 41, 257-63 (1995); X. Li 등, SPIE Vol. 2389, 789-98 (1995)].

형광 진단학에서 상기 관점에서의 예비 조건은 검출하고자 하는 조직과 주변 조직 사이의 형광 방출에 가능한 한 큰 적절한 차이를 검출하는 것이다. 이는 주로 물질 투여가 달성된 후 특정 시간에서 형광 염료의 농도 차이에 의해 달성될 수 있다. 특히 보다 두꺼운 조직층에서의 진단을 위해 특이하지 않은 농도 거동을 갖는 물질을 사용할 경우 상기 차이는 종종 부적절하다.

본 발명의 목적은 종래 기술의 단점을 극복하는 신규 화합물을 유용하게 하는 것이다.

상기 목적은 본 발명에 따라 하기 화학식 (I)의 화합물에 의해 달성된다.

(F-L)_m-A

상기 식 중, F는 하나 이상의 최대 흡광도 600 내지 1200 nm를 갖는 염료 분자를 나타내고,

L은 산 불안정성 및(또는) 효소 분해성 결합을 함유하는 링커 구조물을 나타내고,

m은 1 내지 80이며,

m이 1 내지 3인 경우,

A는 하나 이상의 흡광도 최대값 600 내지 1200 nm를 갖는 염료 분자, 항생 활성 또는 세포증식 억제 활성 분자, 생체분자, 비생물학적 거대분자 또는 화합물 B-(L-W)₀ 또는 D-(L-W)_o를 나타내며, 여기서

D는 비생물학적 거대분자이고,

B는 생체분자이고,

L은 상기 기재된 의미를 갖고,

W는 항생 활성 또는 세포증식 억제 활성 분자를 나타내고,

o는 1 내지 20이고,

m이 4 내지 80인 경우,

A는 생체분자, 비생물학적 거대분자 또는 화합물 B-(L-W)₀ 또는 D-(L-W)₀를 나타내며, 여기서 D, B, L, W 및 o는 상기 기재된 의미를 갖는다.

본 발명에 따른 화합물의 근적외선 형광 방출의 생체내 검출에 대한 특이성은 화합물이 형광 방출을 거의 갖지 않거나 또는 전혀 갖지 않고, 형광 신호의 증가는 상기 구조물이 분해되거나 또는 염료가 표적 부위 (예, 종양, 염증) 상의 구조물로부터 분해된 후에만 발생하는 사실에 있다. 따라서 검출하고자 하는 조직 및 주변 조직 사이의 형광 신호의 유효 차이는

a) 약물동력학적 메카니즘을 기준으로 하는 농도 차이 및

b) 진단 시점에서 형광 양자 수율의 차이에 의해 표시된다.

본 발명자들은 염료 분자를 또다른 분자와 커플링 (이량체)할 경우 염료의 형광이 켄칭되는 한편 본 발명에 따른 화합물이 얻어지며, 즉 비결합 상태의 상응하는 염료 분자에 비해 극소량의 형광 방출이 발생하는 것을 알게 되었다. 또한 본 발명자들은 염료이거나 활성 성분 (예, 세포증식 억제제 또는 항생제)일 수 있 는 방향족 구조물을 갖는 다른 분자를 형광 염료와 커플링할 경우 비교할 만한 켄칭이 발생함을 알게 되었다. 놀랍게도, 켄칭은 또한 염료가 항체, 항체 단편 및 단백질과 커플링할 경우에도 발생한다.

주로, 본 발명에 따른 화합물의 구조 성분인 염료는 높은 몰 흡광 계수 및 높은 형광 양자 수율에 의해 콘쥬게이션되지 않은 단량체 형태로 구별되어야 한다.

본 발명에 따른 화학식 (I)의 바람직한 화합물은 F 및(또는) A가 폴리메틴 염료, 테트라피롤 염료, 테트라아자피롤 염료, 크산틴 염료, 페녹사진 염료 또는 페노티아진 염료를 나타내는 것으로 구별된다.

폴리메틴 염료류로부터의 구조물이 특히 바람직한데, 그 이유는 예를 들면 시아닌 염료, 스퀄리움 염료 및 크로코늄 염료, 뿐만 아니라, 메로시아닌 및 옥손올 염료와 같이 700 내지 1000 nm의 근적외 스펙트럼 범위에서 내우 높은 몰 흡광 계수 (ξ 300,000 lmol^-1cm^-1 이하)를 갖는 최대 흡광도를 갖기 때문이다.

본 발명에 따른 화학식 (I)의 화합물은 또한 F 및(또는) A가 하기 화학식 (II)의 시아닌 염료를 나타내는 것이 바람직하다.

상기 식 중, R¹ 내지 R⁴ 및 R⁷ 내지 R¹⁰은 서로 독립적으로 불소, 염소, 브롬, 요오드 원자 또는 니트로기, 또는 라디칼 -COOE¹, -CONE¹E², -NHCOE¹, -NHCONHE¹, -NE¹E², -OE¹, -OSO₃E¹, -SO₃E¹, -SO₂NHE¹, -E¹을 나타내며, 여기서 E¹ 및 E²는 서로 독립적으로 수소 원자, 포화 또는 불포화, 분지쇄 또는 직쇄 C₁-C₅₀알킬쇄를 나타내며, 여기서 상기 쇄 또는 쇄의 일부는 임의로 하나 이상의 방향족 또는 포화 C₅-C₆ 고리 또는 C₁₀ 이고리를 형성할 수 있고, C₁-C₅₀ 알킬쇄는 0 내지 15개의 산소 원자 및(또는) 0 내지 3개의 카르보닐기가 개재되고(되거나) 0 내지 5개의 히드록시기, 0 내지 5개의 에스테르기, 0 내지 3개의 탄소기, 0 내지 3개의 아미노기에 의해 치환되고,

각 경우에 인접 라디칼 R₁-R₄ 및(또는) R₇-R₁₀은 서로 결합되어 6원 방향족 탄소 고리를 형성할 수 있고,

R⁵ 및 R⁶은 서로 독립적으로 상기 기재된 의미를 갖는 라디칼 -E¹ 또는 C₁-C₄ 술포알킬쇄를 나타내고(내거나),

R¹ 내지 R¹⁰은 L과의 결합을 나타내고,

Q는 단편

을 나타내며,

여기서, R¹¹은 수소, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자 또는 니트로기 또는 라디칼 -NE¹E², -OE¹ 또는 -E¹을 나타내며, 여기서 E¹ 및 E²는 상기 기재된 의미를 갖거나, 또는 R¹¹은 L과의 결합을 나타내고,

R¹²는 수소 원자 또는 상기 기재된 의미를 갖는 라디칼 E¹을 나타내고,

b는 0, 2 또는 3을 나타내고,

X 및 Y는 서로 독립적으로 O, S, -CH=CH- 또는 단편

을 나타내며, 여기서

R¹³ 및 R¹⁴는 서로 독립적으로 수소, 포화 또는 불포화, 분지쇄 또는 직쇄 C₁-C₁₀ 알킬쇄 [5개 이하의 산소 원자가 개재되고(되거나) 5개 이하의 히드록시기에 의해 치환될 수 있음]를 나타내고, 라디칼 R¹³ 및 R¹⁴는 서로 결합하여 5 또는 6원 고 리를 형성할 수 있다.

본 발명의 또다른 주제는 화학식 (I)의 화합물이며, 치료 활성 분자와 염료는 생리학적으로 분해 가능한 결합을 통해 연결되거나, 또는 염료 및 활성 성분은 생체분자 또는 비생물학적 담체 분자에 생리학적으로 분해 가능한 결합을 통해 커플링된다.

커플링된 상태에서 염료의 형광이 켄칭을 일으키고 활성 분자의 치료 활성이 염료 또는 담체 분자로의 커플링에 의해 마스킹 (프로드러그 효과)되는 구조물이 특히 바람직하다. 결합의 분해에 의해 형광 방출과 함께 동시에 활성 성분의 활성의 방출이 증가된다.

본 발명에 따른 화학식 (I)의 활성 성분 W 및(또는) A는 예를 들면 다음의 화합물이다.

항생제: 아클락시노마이신, 악티노마이신 F₁, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카루비신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩플로마이신, 플리카마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 스트렙토니그린, 투베르시딘, 조루비신;

폴산 유사체: 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트;

피리디미딘 유사체: 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-플루오로우라실;

푸린 유사체: 풀루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌 및 상기 기재된 화합물의 유도체;

알킬화 물질: 알킬술포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민, 메틸멜라민, 니트로우레아, 질소 머스타드 화합물;

호르몬 활성 물질: 안드로겐, 안티아드레날, 안티안드로겐, 안티에스트로겐, 에스트로겐, LH-RH 유사체 및 프로게스토겐,

및 기타 세포증식 억제 활성 물질: 탁솔 및 탁솔 유도체.

기타 활성 성분은 여기 후에 세포독성 단일상태 산소 및 라디칼을 형성함으로써 감광 작용을 나타내는 성능에 의해 구별되는 광역학적 활성 물질이다. 이러한 화합물로는 주로 테트라피롤 또는 테트라아자피롤, 예를 들면 포르피린, 벤조포르피린, 클로린, 푸르푸린, 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌 및 상기 기재된 화합물의 유도체가 있다. 기타 화합물은 포르피린, 포르피센 및 옥사진 또는 페녹사진 염료로 확장된다.

화학식 (I)에 따라 링커 구조물 L에 함유되는 화학 결합은 환부 조직 (종양)을 특징으로 하고 정상 조직 영역과 구별되는 특정 생리학적 인자의 경우 화합물이 분해되는 방식으로 구조적으로 이루어진다.

문헌에는 종양이 정상 조직에 비하여 낮은 pH를 특징으로 한다고 기재되어 있다. 세포내 pH가 대개 동일한 경우 (약 pH 7.4) 종양내의 세포외 pH는 0.5 pH 단위 이하로 감소된다. 또한, 특히 박테리아 유형의 염증은 감소된 pH를 특징으로 한다. pH 측정 방법은 마이크로 전극에 의한 측정, 감-pH성 형광 시료에 의한 형광 측정 및 MR 프로브에 의한 측정이 있다 [R. J. Gillies 등, Am. J. Physiol. 267 pc 195-203 (1994)],

[G. R. Martin 및 R. K. Jain, Microvascular Research 46, 216-230 (1993)],

[L. E. Gerweck 및 K. Seetharaman, Cancer Research 56, 1194-1198 (1996)],

[K. Engin 등, Int. J. Hyperthermia 11 (1995) 211-216],

[K. Engin 등, Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 29 (1994) 125-132],

[G. Helmlinger 등, Nature Medicine 3 (1997) 177-182].

따라서 본 발명의 또다른 주제는 감소된 생리학적 pH 값에 의해 분해되는, 링커 구조물 L을 갖는 화합물이다. 이러한 구조물의 예로는 하기 단편 (여기서, p는 2 내지 4를 나타냄)에 상응하는 알킬히드라존, 아실히드라존, 아릴히드라존, 술포닐시드라존, 이민, 옥심, 아세탈, 케탈, 오르토에스테르가 있다.

감소된 pH를 기준으로 하는 분해 뿐만 아니라 본 발명에 따른 화합물의 분해는 또한 검출하고자 하는 조직 (예, 종양, 박테리아성 염증)내에 증가된 농도로 존재하는 효소에 의해 수행될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또다른 주제는 효소 분해성 링커 구조물 L을 갖는 화합물이다. 효소 분해성 링커 구조물의 예로는 카텝신, 펩티다제, 카르복시펩티다제, α 및 β-글루코시다제, 리파제, 옥시다제, 포스포리파제, 포스파타제, 포스포디에스테라제, 프로테아제, 엘라스타제, 술파타제, 리덕타제, 전이효소 및 박테리아성 효소, 예를 들면 페니실린-아미다제 및 β-락타마제가 있다 [P. D. Senter 등, Bioconjugates Chem. 6 (1995), 389-94].

바람직한 효소 분해성 구조물은 단쇄 펩티드 서열, 예를 들면 아미노산 서열 Val-Leu-Lys를 함유하는 서열이다.

검출하고자 하는 조직내에서의 농도 또는 투여 후에 특정 시간에서 상응하는 농도 구배를 유발하는 동력학은 본 발명에 따른 화합물의 분해 동력학과 방출된 염 료 분자의 제거 동력학을 서로 관련시켜 상승 효과를 유발하여야 한다.

본 발명에 따른 화학식 (I)의 다른 바람직한 화합물은 A 및(또는) B가 항체, 이의 콘쥬게이트 및 단편, 특정 펩티드 및 단백질, 수용체, 효소, 효소 기질, 뉴클레오티드, 천연 또는 합성 리보핵산 또는 데옥시리보핵산 또는 이의 화학 개질물, 예를 들면 압타머 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 지방단백질, 렉틴, 탄수화물, 모노, 디 또는 트리사카리드, 직쇄 또는 분지쇄 올리고사카리드 또는 폴리사카리드 또는 사카리드 유도체 또는 덱스트란을 나타내는 것으로 구별된다.

또한, 본 발명에 따른 화학식 (I)의 화합물은 D가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리리신 또는 폴리리신 덴드리머 또는 이의 유도체를 나타내는 것이 바람직하다.

구조 요소 A, D, B, L 및 W의 결합은 직접적이거나 통상 사용된 관능기를 통해 수행된다. 이러한 기의 예로는 에스테르, 에테르, 2급 및 3급 아민, 아미드, 티오우레아, 우레아, 카르바메이트기 또는 말레이미도 구조가 있다.

본 발명의 또다른 주제는 NIR 방사선 사용에 의한 환부 조직 영역의 생체내 진단 및 환부 조직 영역의 치료를 위한 본 발명에 따른 화학식 (I)의 화합물의 용도이다.

또한 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 하나 이상의 화학식 (I)의 화합물을 함유하는, NIR 방사선 사용에 의한 환부 조직 영역의 생체내 진단용 광학 진단제이다.

상기 진단제는 당업자에게 공지된 방법에 따라 임의로는 통상적으로 사용되는 보조제 및(또는) 비히클 뿐만 아니라 희석제 등의 사용에 의해 제조된다. 이는 생리학적 상용성 전해질, 완충액, 세정제 및 안정성 및 용해도 개선용 뿐만 아니라 삼투 몰농도 조화용 물질을 포함한다. 제약학에서 통상적으로 사용되는 측정법은 제조하는 동안 및 특히 투여하기 전에 제제의 멸균을 확실히 한다.

염료 F 및 A의 합성은 하기 문헌에 공지된 방법에 따라 수행한다.

[F. M. Hamer, The Cyanine Dyes and Related Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1964],

[J. Fabian 등, Chem. Rev. 92 (1992) 1197],

[L. A. Ernst 등, Cytometrie (Cytometry) 10 (1989) 3-10],

[P. L. Southwick 등, Cytometrie 11 (1990) 418-430],

[R. B. Mujumdar 등, Bioconjugate Chem. 4 (1993) 105-11],

[E. Terpetschnig 등, Anal. Biochem. 217 (1994) 197-204],

[J. S. Lindsey 등, Tetrahedron 45 (1989) 4845-66, EP0591820 A1],

[L. Strekowski 등, Heterocycl. Chem. 33 (1996) 1685-1688],

[S. R. Mujumdar 등, Bioconjugate Chem. 7 (1996) 356-362],

[M. Lipowska 등, Synth. Commun. 23 (1993) 3087-94],

[E. Terpetschnig 등, Anal. Chim. Acta 282 (1993) 633-641],

[M. Matsuoka 및 T. Kitao, Dyes Pigm. 10 (1988) 13-22] 및

[N. Narayanan 및 G. Patronay, I. Org. Chem. 60 (1995) 2361-95].

염료는 예를 들면 하기 문헌에 따라 산 불안정성 또는 효소 분해성 결합을 함유하는 물질 또는 커플링 후에 이러한 결합이 제조되는 물질로부터 하기 문헌에 공지된 방법과 유사하게 합성한다.

[B. M. Mueller 등, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 325-330],

[K. Srinivasachar 및 D. M. Neville, Biochemistry 28 (1989) 2501-09],

[D. M. Neville 등, J. Biol. Chem. 264 (1989) 14653-61],

[T. Kaneko 등, Bioconjugate Chem. 2 (1991), 133-41],

[B. A. Froesch 등, Cancer Immunol. Immunother. 42 (1996), 55-63], 및

[J. V. Crivello 등, J. Polymer Sci: Part A: Polymer Chem. 34 (1996) 3091-3102].

하기 실시예는 본 발명을 설명한다.

1. 5-(1-옥소에틸)-1,1'-(4-술포부틸)-인도트리카르보시아닌-나트륨염 1의 합성 (도 1)

4-히드라지노페닐메틸케톤을 디아조화 및 SnCl₂에 의한 환원에 의해 4-아미노페닐메틸케톤으로부터 합성하였다 [T. Gorecki 등, J. Heterocyclic Chem. 33 (1996) 1871-76과 유사한 방법].

4-히드라지노페닐메틸케톤 4.8 g (32 밀리몰), 아세트산나트륨 5.4 g 및 3-메틸-2-부타논 3.9 g (45 밀리몰)을 1시간 동안 실온 및 4시간 동안 120 ℃에서 에틸 아세테이트 40 ㎖ 중에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 진공하에 증발에 의해 농 축하고 디클로메탄 300 ㎖ 중에 용해시키고 유기상을 포화 NaCl 용액으로 세척하였다. MgSO₄ 상에서 건조한 후 갈색 오일 7.5 g을 얻었다. 이를 5시간 동안 1,4-부탄술폰 6.5 g (48 밀리몰)과 함께 140 ℃로 가열하고 냉각시킨 후 아세톤으로 교반시키고 침전된 고상물을 크로마토그래피로 정제하였다 (RP C-18, 이동 용매 메탄올/물). 5-(1-옥소에틸)-1-(4-술포부틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌 2의 수득량: 2.5 g (23 %).

염료 1을 제조하기 위하여 1-(4-술포부틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌 (3) 0.5 g (1.7 밀리몰)을 아세트산 무수물 10 ㎖ 중 글루타콘산 알데히드 디아닐 히드로클로라이드 0.47 g (1.6 밀리몰)으로 120 ℃에서 30분 동안 교반시켰다. 냉각시킨 후 화합물 (2) 0.6 g (1.8 밀리몰), 아세트산 무수물 10 ㎖, 아세트산 4 ㎖ 및 아세트산나트륨 0.5 g과 혼합하고 120 ℃로 30분 동안 가열하였다. 암청색 용액을 냉각하고 에테르 200 ㎖로 교반시키고 침전된 고상물을 여과하였다. 크로마토그래피 정제 (RP C-18, 이동 용매 메탄올/물) 및 동결 건조후에 생성물 (1) 0.3 g (26 %)을 얻었다.

원소 분석:

계산치: C 61.99 H 6.33 N 3.91 S 8.95

실측치: C 61.73 H 6.49 N 3.80 S 8.78

흡광도: λ_max (H₂O) = 748 nm (ξ = 14,800 ℓmol^-1cm^-1).

2. 산 불안정성 링커에 의한 개질 (도 2)

2.1 화합물 (1)과 4-카르복시페닐술포닐히드라진의 반응

화합물 (1) 0.2 g (0.28 밀리몰) 및 4-카르복시페닐술포닐히드라진 74 ㎎ (0.34 밀리몰)을 메탄올 20 ㎖ 중에 용해시키고 트리플루오로아세트산 5 ㎕와 혼합하고 18시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 진공하에 증발시키고 잔류물을 디클로로메탄으로 수회 세척하고 생성물을 건조하였다. 수득량: 화합물 (4) 0.21 g

2.2 화합물 (1)과 4-아미노벤조산 히드라지드의 반응

화합물 (1) 0.2 g (0.28 밀리몰) 및 4-아미노벤조산 히드라지드 51 ㎎ (0.34 밀리몰)을 2.1과 유사하게 반응시켰다. 수득량: 화합물 (5) 0.20 g.

2.3 화합물 (1)과 4-(아미노메틸)벤조산-히드라지드의 반응

화합물 (1) 0.2 g (0.28 밀리몰) 및 4-아미노메틸벤조산 히드라지드 56 ㎎ (0.34 밀리몰)을 2.1과 유사하게 반응시켰다. 수득량: 화합물 (6) 0.22 g.

3. 반응성 관능기 (N-히드록시숙신이미드 에스테르 및 이소티오시아네이트)의 제조 (도 2)

상응하는 N-히드록시숙신이미디일에스테르 화합물 (7)을 제조하기 위하여 디메틸포름아미드 (DMF) 12 ㎖ 중 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 14 ㎎ (0.12 밀리몰)과 함께 화합물 (4) 0.1 g (0.1 밀리몰)을 도입하고 실온에서 DMF 1 ㎖ 중 디시클로헥실카르보디이미드 23 ㎎ (0.11 밀리몰)의 용액과 혼합하였다. 72시간 동안 교반한 후 생성물을 디에틸 에테르로 침전시키고 여과하고 DMF/디에틸 에테르로부터 재침전시켰다. 진공 건조 후에 얻은 생성물 12 ㎎을 추가로 정제하지 않고 사용하였다.

산 불안정성 이소티오시아네이트 화합물 (8)을 제조하기 위하여 화합물 (5) 0.1 g (0.11 밀리몰), N,N'-티오카르보닐디-2(1H)-피리돈 33 ㎎ (0.14 밀리몰) 및 트리에틸아민 15 ㎎ (0.15 밀리몰)을 클로로포름 15 ㎖ 중 실온에서 60분 동안 교반하였다. 생성물을 디에틸 에테르로 침전시키고 여과하고 HPLC의 사용에 의해 정제하였다 (RP Select B, Merck, 이동 용매 pH 8의 포스페이트 완충액 10 밀리몰/메탄올). 화합물 (8) 40 ㎎ (40 %)을 동결 건조, 디클로로메탄/메탄올에 의한 염의 분리 및 진공에서의 건조후에 얻었다.

4. mAK 9.2.27 (항멜라노마 항체)의 표지화

4.1 산 불안정성 NHS-에스테르 7의 표지화

보레이트 완충액 (pH 9.2) 50 밀리몰의 0.5 ㎖ 중 항체 1 ㎎을 화합물 (7) (DMF 중 초기 용액 5 밀리몰/ℓ) 33 ㎕와 혼합하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 비결합 염료를 NAP-5 칼럼을 통해 분리하였다 (pH 7.8의 포스페이트 완충액 25 밀리몰로 용출함, +0.01 % NaN₃). 생성물 mAK9.2.27/화합물 (4)-콘쥬게이트를 용액 중 4 ℃에서 저장하였다.

mAK9.2.27/화합물 (4)-콘쥬게이트 (pH 7.8의 포스페이트 완충액 중)의 VIS-NIR 흡광도 스펙트럼은 도 5를 참고한다.

형광 양자 수율 Q = 0.1 % [pH 7.8의 포스페이트 완충액 중 5 μmol/ℓ; R. C. Benson 및 H. A. Kues, J. of Chemical and Engineering Data 22 (1977) 379에 따라 DMSO 중 Q = 13 %인 표준물로서 인도시아닌 그린을 기준으로 함).

4.2 산 불안정성 이소티오시아네이트 8의 표지화

보레이트 완충액 (pH 9.2) 50 밀리몰의 0.5 ㎖ 중 항체 1 ㎎을 화합물 (8) (DMF 중 초기 용액 5 밀리몰/ℓ) 6 ㎕와 혼합하고 실온에서 15분 동안 교반하였다. 비결합 염료를 NAP-5 칼럼을 통해 분리시켰다 (pH 7.4의 포스페이트 완충액 25 밀리몰로 용출, +0.01 % NaN₃). 생성물 mAK9.2.27/화합물 (5)-콘쥬게이트를 용액 중 4 ℃에서 저장하였다.

5. 이량체 인도트리카르보시아닌 염료의 합성

5.1 대칭형 스피로 이량체 10의 제조 (도 3)

3,9-디에틸리덴-2,4,8,10-테트라옥사스피로-[5.5]운데칸 0.1 g (0.47 밀리몰) (M. Crivello 등, J. Polymer Sci.: Part A: Polymer Chem. 34 (1996) 3091-3102에 따라 합성함) 및 6-아미노-1-헥산올 0.11 g (0.94 밀리몰)을 디에틸 에테르 15 ㎖ 중 실온에서 24시간 동안 교반시키고 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 오일 펌프 상에서 건조시키고 추가로 정제하지 않고 반응시켰다.

5-카르복시-비스-1,1'-(4-술포부틸)-인도트리카르보시아닌-나트륨염 (9) 0.2 g (0.28 밀리몰)을 TBTU 0.09 g (0.28 밀리몰) 및 트리에틸아민 30 ㎎과 함께 디클로로메탄 15 ㎖ 중에서 30분 동안 교반시키고, 디클로로메탄 2 ㎖ 중 상기 기재한 스피로 화합물 0.06 g (0.14 밀리몰)과 혼합하였다. 실온에서 18시간 동안 교반한 후 생성물을 디에틸 에테르로 침전시키고 크로마토그래피로 정제하였다 (RP C-18, 이동 용매 메탄올/pH 8의 포스페이트 완충액 10 밀리몰). 동결 건조후에 염을 메 탄올/디클로로메탄으로 침전시켰다. 생성물 (10) 68 ㎎ (26 %)을 얻었다.

생성물 (10) (pH 8의 포스페이트 완충액 중 5 μmol/ℓ)의 VIS/NIR 흡광 스펙트럼은 도 6을 참고한다.

형광 양자 수율 Q = 0.2 % (pH 8의 포스페이트 완충액 중 5 μmol/ℓ; 표준물로서 인도시아닌 그린을 기준으로 함, 실시예 4.1 참고).

5.2 화합물 (6)의 산 불안정성 히드라존 링커에 의한 염료 이량체 (11)의 제조 (도 4)

5-카르복시-비스-1,1'-(4-술포부틸)-인도트리카르보시아닌-나트륨염 (9) 0.1 g (0.14 밀리몰)을 TBTU 45 ㎎ (0.14 밀리몰) 및 트리에틸아민 15 ㎎과 함께 DMF 10 ㎖ 중에서 30분 동안 교반시키고, DMF 2 ㎖ 중 화합물 (6) 0.14 g (0.16 밀리몰)과 혼합하였다. 실온에서 5시간 동안 교반시킨 후 생성물을 디에틸 에테르를 첨가하여 결정화하고 여과하고 크로마토그래피 정제하였다 (RP C-18, 이동 용매 메탄올/pH 8의 포스페이트 완충액 10 밀리몰). 동결 건조후에 염을 메탄올/디클로로메탄으로 침전시켰다. 화합물 (11) 0.13 g (59 %)을 얻었다.

pH 8.0의 포스페이트 완충액 중 화합물 (11) (4 μmol/ℓ)의 VIS/NIR 흡광 스펙트럼 및 24시간 후 37 ℃에서 pH 6.0의 포스페이트 완충액 중 VIS/NIR 흡광 스펙트럼; 도 7 참고.

6. 시간의 함수로서 다양한 pH 값에서 화합물 (11)의 형광 양자 수율 측정

pH값 7.4, 7.0, 6.6, 6.0 및 5.0에서의 포스페이트 완충액 50 밀리몰 중 농도 4 μmol/ℓ 용액을 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 다양한 시간에서 분취량을 꺼 내고 형광 양자 수율을 측정하였다 (SPEX Fluorolog Spectral fluorometer, 400 W Xe 램프, PM958 검출기, 상기 검출기의 파장 의존 감작성으로 캘리브레이션함, 인도시아닌 그린에 대한 값, 실시예 4.1. 참고).

시간의 함수로서 다양한 pH 값에서 형광 양자 수율의 증가를 기준으로 하여 산 불안정성 이량체 11의 분해를 관찰하여 도 8에 나타내었다.

7. 산 불안정성 히드라존 링커에 의한 독소루비신-인도트리카르보시아닌 콘쥬게이트(13)의 합성 (도 4)

독소루비신-히드로클로라이드 20 ㎎ (34 마이크로몰) 및 4-(아미노메틸)-벤조산 히드라진 11 ㎎ (68 마이크로몰)을 무수 메탄올 3 ㎖ 중에서 교반시킨 후 트리플루오로아세트산 2 ㎕를 실온에서 24시간 동안 첨가하였다. 생성물 12를 아세토니트릴로 결정화하고 원심분리하고 아세토니트릴로 세척하고 건조하여 조 생성물 18 ㎎ (24 마이크로몰)을 얻었다. 5-카르복시-비스-1,1'-(4-술포부틸)-인도트리카르보시아닌-나트륨염 (9) 14 ㎎ (20 마이크로몰)을 TBTU 7 ㎎ (22 마이크로몰) 및 트리에틸아민 20 ㎕와 함께 DMF 0.5 ㎖ 중에서 30분 동안 교반시켰다. 상기 반응 혼합물을 0 ℃에서 상기 기재한 화합물 (12)의 용액 (DMF 0.2 ㎖ 중 18 ㎎)에 적가하고 0 ℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 생성물을 디에틸 에테르를 첨가함으로써 침전시키고 실시예 5와 유사하게 크로마토그래피 정제하였다. 화합물 (13) 12 ㎎ (47 %)을 얻었다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물.

<화학식 I>

(F-L)_m-A

상기 식 중,

L은 카텝신, 펩티다제, 카르복시펩티다제, α 및 β-글리코시다제, 리파제, 포스포리파제, 포스파타제, 포스포디에스테라제, 프로테아제, 엘라스타제, 술파타제, 리덕타제 및 박테리아성 효소에 의해 분해되는 효소 분해성 결합을 함유하는 링커 구조물을 나타내고,

m은 1 내지 80이며,

F 및 A는 하기 화학식 (II)의 시아닌 염료를 나타낸다.

<화학식 II>

상기 식 중, R¹ 내지 R⁴ 및 R⁷ 내지 R¹⁰은 서로 독립적으로 불소, 염소, 브롬, 요오드 원자 또는 니트로기, 또는 라디칼 -COOE¹, -CONE¹E², -NHCOE¹, -NHCONHE¹, -NE¹E², -OE¹, -OSO₃E¹, -SO₃E¹, -SO₂NHE¹, -E¹을 나타내며, 여기서 E¹ 및 E²는 서로 독립적으로 수소 원자, 포화 또는 불포화, 분지쇄 또는 직쇄 C₁-C₅₀알킬쇄를 나타내며, 여기서 상기 쇄 또는 쇄의 일부는 임의로 하나 이상의 방향족 또는 포화 C₅-C₆ 고리 또는 C₁₀ 이고리를 형성할 수 있고, C₁-C₅₀ 알킬쇄는 0 내지 15개의 산소 원자 및(또는) 0 내지 3개의 카르보닐기가 개재되고(되거나) 0 내지 5개의 히드록시기, 0 내지 5개의 에스테르기, 0 내지 3개의 카르복시기, 0 내지 3개의 아미노기에 의해 치환되고,

각 경우에 인접 라디칼 R¹-R⁴ 및(또는) R⁷-R¹⁰은 서로 결합되어 6원 방향족 탄소 고리를 형성할 수 있고,

R⁵ 및 R⁶은 서로 독립적으로 상기 기재된 의미를 갖는 라디칼 -E¹ 또는 C₁-C₄ 술포알킬쇄를 나타내고(내거나),

R¹ 내지 R¹⁰은 L과의 결합을 나타내고,

Q는 단편
을 나타내며,

여기서, R¹¹은 수소, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자 또는 니트로기 또는 라디칼 -NE¹E², -OE¹ 또는 -E¹을 나타내며, 여기서 E¹ 및 E²는 상기 기재된 의미를 갖거나, 또는 R¹¹은 L과의 결합을 나타내고,

R¹²는 수소 원자 또는 상기 기재된 의미를 갖는 라디칼 E¹을 나타내고,

b는 0, 2 또는 3을 나타내고,

X 및 Y는 서로 독립적으로 라디칼 O, S, -CH=CH- 또는 단편
을 나타내며, 여기서

R¹³ 및 R¹⁴는 서로 독립적으로 수소, 포화 또는 불포화, 분지쇄 또는 직쇄 C₁-C₁₀ 알킬쇄 [5개 이하의 산소 원자가 개재되고(되거나) 5개 이하의 히드록시기에 의해 치환될 수 있음]를 나타내고, 라디칼 R¹³ 및 R¹⁴는 서로 결합하여 5 또는 6원 고리를 형성할 수 있다.
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하기 화학식 I의 화합물.

<화학식 I>

(F-L)_m-A

상기 식 중,

L은 단쇄 펩티드 서열로 이루어진 효소 분해성 결합을 함유하는 링커 구조물을 나타내고,

m은 1 내지 80이며,

F 및 A는 하기 화학식 (II)의 시아닌 염료를 나타낸다.

<화학식 II>

상기 식 중, R¹ 내지 R⁴ 및 R⁷ 내지 R¹⁰은 서로 독립적으로 불소, 염소, 브롬, 요오드 원자 또는 니트로기, 또는 라디칼 -COOE¹, -CONE¹E², -NHCOE¹, -NHCONHE¹, -NE¹E², -OE¹, -OSO₃E¹, -SO₃E¹, -SO₂NHE¹, -E¹을 나타내며, 여기서 E¹ 및 E²는 서로 독립적으로 수소 원자, 포화 또는 불포화, 분지쇄 또는 직쇄 C₁-C₅₀알킬쇄를 나타내며, 여기서 상기 쇄 또는 쇄의 일부는 임의로 하나 이상의 방향족 또는 포화 C₅-C₆ 고리 또는 C₁₀ 이고리를 형성할 수 있고, C₁-C₅₀ 알킬쇄는 0 내지 15개의 산소 원자 및(또는) 0 내지 3개의 카르보닐기가 개재되고(되거나) 0 내지 5개의 히드록시기, 0 내지 5개의 에스테르기, 0 내지 3개의 카르복시기, 0 내지 3개의 아미노기에 의해 치환되고,

각 경우에 인접 라디칼 R¹-R⁴ 및(또는) R⁷-R¹⁰은 서로 결합되어 6원 방향족 탄소 고리를 형성할 수 있고,

R⁵ 및 R⁶은 서로 독립적으로 상기 기재된 의미를 갖는 라디칼 -E¹ 또는 C₁-C₄ 술포알킬쇄를 나타내고(내거나),

R¹ 내지 R¹⁰은 L과의 결합을 나타내고,

Q는 단편
을 나타내며,

여기서, R¹¹은 수소, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자 또는 니트로기 또는 라디칼 -NE¹E², -OE¹ 또는 -E¹을 나타내며, 여기서 E¹ 및 E²는 상기 기재된 의미를 갖거나, 또는 R¹¹은 L과의 결합을 나타내고,

R¹²는 수소 원자 또는 상기 기재된 의미를 갖는 라디칼 E¹을 나타내고,

b는 0, 2 또는 3을 나타내고,

X 및 Y는 서로 독립적으로 라디칼 O, S, -CH=CH- 또는 단편
을 나타내며, 여기서

R¹³ 및 R¹⁴는 서로 독립적으로 수소, 포화 또는 불포화, 분지쇄 또는 직쇄 C₁-C₁₀ 알킬쇄 [5개 이하의 산소 원자가 개재되고(되거나) 5개 이하의 히드록시기에 의해 치환될 수 있음]를 나타내고, 라디칼 R¹³ 및 R¹⁴는 서로 결합하여 5 또는 6원 고리를 형성할 수 있다.
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제12항에 있어서, 화학식 (I)에서 L이 카텝신, 펩티다제, 카르복시펩티다제, α 및 β-글리코시다제, 리파제, 포스포리파제, 포스파타제, 포스포디에스테라제, 프로테아제, 엘라스타제, 술파타제, 리덕타제 및 박테리아성 효소에 의해 분해되며, 단쇄 펩티드 서열로 이루어진 효소 분해성 결합을 함유하는 링커 구조물을 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
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제1항 기재의 하나 이상의 화합물과 함께 통상적으로 사용되는 보조제 및(또는) 비히클 및 희석제를 함유하는, NIR 방사선 사용에 의한 환부 조직 영역의 생체내 진단용 광학 진단제.