JP2012509300A - 色素コンジュゲートイメージング剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、インビボ光学イメージングに適したイメージング剤であって、ジヒドロカルバゾリウム色素とペプチドのような生物学的ターゲティング部分とのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤に関する。また、医薬組成物及びキット並びにインビボイメージング方法も開示される。ジヒドロカルバゾリウム色素は水溶化基で官能化されていると共に、生物学的ターゲティング部分へのコンジュゲーションを容易にする官能基を有している。
【選択図】なし

Description

本発明は、インビボ光学イメージングに適したイメージング剤であって、ジヒドロカルバゾリウム色素とペプチドのような生物学的ターゲティング部分とのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤に関する。また、医薬組成物及びキット並びにインビボイメージング方法も開示される。
多くの光学イメージング剤では、近赤外（ＮＩＲ）吸収シアニン色素がその蛍光性光学レポーターとして使用されている。光学シグナルの感度を最大にするため、色素の最適光物理的性質は、その大部分で組織が透明である電磁スペクトル部分（７００〜８５０ｎｍ）において励起及び発光を可能にすべきである。この要件を満たすシアニン色素は、ヘプタメチンシアニン色素（次の式Ａ）である。
ポリメチン鎖の長さのため、ヘプタメチンシアニン色素は短波長吸収性のペンタ及びトリメチンシアニンに比べて化学安定性及び光安定性の低下を示す。インビボ用途のためには、メチン鎖の中央に環を形成することでヘプタメチンシアニン色素の安定性を高めることが試みられた。
米国特許第６０８３４８５号及びその対応特許には、２．０以下のオクタノール−水分配係数を有するシアニン色素を用いるインビボ近赤外（ＮＩＲ）光学イメージング方法が開示されている。また、前記色素と、特定の細胞集団に結合し、或いはレセプターと選択的に結合し、或いは組織又は腫瘍中に集積する３０ｋＤａまでの分子量の「生物学的検出単位」とのコンジュゲートも開示されている。米国特許第６０８３４８５号の色素は、ポリリシン、デキストラン又はポリエチレングリコールのような巨大分子にコンジュゲートすることもできる。特定の色素コンジュゲートは開示されていない。
米国特許第５８９２０５６号には、次の式Ｂの色素が開示されている。
式中、
Ｒ1はＣ1-18アルキル、アリール、スルホアルキル、カルボキシアルキル、スルファトアルキル、アシルオキシアルキル、ジアルキルアミノアルキレン、シクロアミノアルキレン、アシル又はアルケニルであり、
Ｒ2はＣ1-18アルキルであり、
Ｒ3及びＲ4はＨ又はＣ1-18アルキルであり、
Ｒ5はＨ、ＮＯ2、カルボキシル、スルホ、ＯＨ、Ｈａｌ、Ｃ1-18アルコキシ、チオアルコキシ、オキシアルキル、アシル、アルキル、アリール又はアミノ基であり、
いずれか２つのＲ5基、又はＲ4及びＲ5、又はＲ1及びＲ4は、一緒になって置換又は非置換のアリール環、ヘテロアリール環、脂肪族環又は複素環を形成することができ、
Ｚは、カルボシアニン色素、アザカルボシアニン色素、ヘミシアニン色素、スチリル色素、ジアザカルボシアニン色素、トリアザカルボシアニン色素、ジアザヘミシアニン色素、ポリメチンシアニン色素、アザポリメチンシアニン色素、ホロポーラー色素、インドシアニン色素、メロシアニン色素、スクアリリウム色素及びジアザヘミシアニン色素からなる群から選択される色素を完成するために必要な原子を表す。
米国特許第５８９２０５６号には、色素と生物学的ターゲティング部分とのコンジュゲートについても、かかるコンジュゲートの製造に適した色素の官能化形態についても開示されていない。また、米国特許第５８９２０５６号には、インビボ光学イメージング用途についても開示されていない。
特開２００５−２２００４５号（コニカミノルタエムジー株式会社）には、特に癌のインビボ光学イメージングのための、マイクロキャリヤー（特にリポソーム）に内包された色素が開示されている。記載されている色素は、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）及び米国特許第５８９２０５６号に開示された色素（４以上のスルホン酸置換基を有するものを含む）を含むシアニン色素である。特開２００５−２２００４５号には、記載された色素のいずれかと生物学的ターゲティング分子とのコンジュゲートは開示されていない。
米国特許出願公開第２００５／０１３６００７号には、次の式Ｃのシアニン化合物を含む近赤外蛍光造影剤が開示されている。
式中、
ＲはＨ、低級アルキル基又は芳香族基であり、
Ｒ1及びＲ2は各々が水溶化基を含む脂肪族基であり、
Ｒ3及びＲ4は各々が低級アルキル基または芳香族基であるが、Ｒ3及びＲ4が互いに結合して炭素環を形成してもよく、
Ｌ1〜Ｌ6は各々がメチン基であるが、ｎが１又は２である場合にはＬ6がＲ3又はＲ4と結合して炭素環を形成してもよく、ｎが０である場合にはＬ4がＲ3又はＲ4と結合して炭素環を形成してもよく、
Ｚ1及びＺ2は各々が五員環又は六員環を形成するのに必要な非金属原子群であり、
Ｘは分子の電荷を中和するのに必要な対イオンであり、
ｐは分子の電荷を中和するのに必要なＸの数であり、
ｍは２〜４の整数であり、
ｎは０〜２の整数である。
米国特許出願公開第２００５／０１３６００７号には、色素と生物学的ターゲティング部分とのコンジュゲートについても、かかるコンジュゲートの製造に適した色素の官能化形態についても開示されていない。
特開２００５−２２００４５号公報
本発明は、インビボでの光学イメージングに適した光物理的性質を有するジヒドロカルバゾリウム色素を提供する。本発明の色素は、蛍光性であると共に、シアニン色素Ｃｙ７に匹敵する性質を有することが判明した。このような蛍光性は、先行技術におけるジヒドロカルバゾリウム色素に関しては報告されていない。
本発明のジヒドロカルバゾリウム色素では、複素環を結合するメチン鎖の２つの炭素原子が六員環の一部をなしている。米国特許出願公開第２００５／０１３６００７号の色素では、メチン鎖の１つの炭素原子のみが縮合環の一部をなしている。本発明の色素は、水溶化基及び生物学的ターゲティング部分へのコンジュゲーションを容易にする基で官能化されている。それにより、本発明の色素は各種の生物学的ターゲティング分子とのコンジュゲートとしてインビボでの光学イメージングのために有用である。本発明の色素はまた、対応するヘプタメチンシアニン色素より高い量子収量を有している。
図１は、色素Ａの吸光度スペクトルを示す。 図２は、７４６ｎｍでの励起及び分光光度計キュベット内で２５０ｎＭの濃度を用いた色素Ａの蛍光発光スペクトルを示す。 図３は、Ｃｙ７の吸光度スペクトルを示す。 図４は、７４８ｎｍでの励起及び分光光度計キュベット内で２５０ｎＭの濃度を用いたＣｙ７の蛍光発光スペクトルを示す。 図５は、色素Ａの光退色を示す。 図６は、Ｃｙ７の光退色を示す。
第１の態様では、本発明は、哺乳類の身体のインビボ光学イメージングに適したイメージング剤であって、次の式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤を提供する。
［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−ＣｚD
（Ｉ）
式中、
ＢＴＭは生物学的ターゲティング部分であり、
ＣｚDは次の式ＩＩのジヒドロカルバゾリウム色素であり、
（式中、
Ｒ1、Ｒ2及びＲ11〜Ｒ16は各々独立にＲa基であり、
Ｒ3〜Ｒ10は各々独立にＨ、−ＳＯ3Ｍ1、−ＣＯ2Ｍ1、Ｃ2-7カルボキシアルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又は１〜３のヒドロキシ基で任意に置換されたＣ2-7カルボキサミドアルキルであり、式中のＭ1は独立にＨ又はＢcであり、Ｂcは生体適合性陽イオンであり、
Ｒ17〜Ｒ20は各々独立にＨ又はＲa基であり、
ＲaはＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル、Ｃ2-7カルボキシアルキル又はＣ1-4ヒドロキシアルキルである。）
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数であり、
ジヒドロカルバゾリウム色素は２以上のスルホン酸置換基を含むことを条件とする。
「イメージング剤」という用語は、完全な（即ち、無傷の）哺乳類の身体の関心領域のインビボでの光学イメージングを行うために適した化合物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒト被験体である。イメージングは侵襲的（例えば、手術中検査又は内視鏡検査）であってもよいし、或いは非侵襲的であってもよい。イメージングは、任意には（例えば、内視鏡器具の生検チャネルを通しての）生検又は（例えば、腫瘍縁の同定による手術処置中の）腫瘍切除を容易にするために使用できる。
式Ｉのコンジュゲートはインビボイメージングのために適するが、それはインビトロ用途（例えば、生物学的試料中のＢＴＭを定量するアッセイ又は組織試料中のＢＴＭの可視化）も有し得る。好ましくは、イメージング剤はインビボイメージングのために使用される。
「生物学的ターゲティング部分」（ＢＴＭ）という用語は、投与後、哺乳類の身体の特定部位に選択的に取り込まれるか又は特定部位に局在する化合物を意味する。かかる部位は、例えば、特定の疾患状態に関係するものであるか、或いは器官又は代謝過程がいかに機能しているかを表すものであり得る。生物学的ターゲティング部分は、好ましくは、線状ペプチド、環状ペプチド又はこれらの組合せであり得る３〜１００量体ペプチド、ペプチド類似体、ペプトイド又はペプチド模倣体、単一のアミノ酸、酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト（部分アゴニストを含む）又は酵素阻害剤、レセプター結合化合物（レセプター基質、アンタゴニスト、アゴニスト又は基質を含む）、オリゴヌクレオチド、或いはオリゴＤＮＡフラグメント又はオリゴＲＮＡフラグメントからなる。
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合）によって連結された（下記に定義するような）２以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質がペプチド的でない（即ち、いかなるペプチド結合（つまり、アミノ酸間のアミド結合）も含まない）生物学的活性化合物をいう。ここでは、ペプチド模倣体という用語は広い意味で使用され、性質が完全にはペプチド的でない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。「ペプチド類似体」という用語は、下記に記載するような１種以上のアミノ酸類似体を含むペプチドをいう。“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ”，Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ Ｅ２２ｃ，Ｔｈｉｅｍｅも参照されたい。
「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体）、したがってキラルなものであるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸に関する通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（即ち、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターは当業者にとって公知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールを包含する［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）を参照されたい］。
ＢＴＭが酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト、酵素阻害剤又はレセプター結合化合物である場合、それは好ましくは非ペプチドであり、さらに好ましくは合成品である。「非ペプチド」という用語は、いかなるペプチド結合（即ち、２つのアミノ酸残基間のアミド結合）も含まない化合物を意味する。好適な酵素の基質、アンタゴニスト、アゴニスト又は阻害剤には、グルコース及びグルコース類似体（例えば、フルオロデオキシグルコース）、脂肪酸、或いはエラスターゼ、アンギオテンシンＩＩ又はメタロプロテイナーゼ阻害剤がある。好ましい非ペプチドのアンギオテンシンＩＩアンタゴニストはロサルタンである。好適な合成レセプター結合化合物には、エストラジオール、エストロゲン、プロゲスチン、プロゲステロン及び他のステロイドホルモン、ドーパミンＤ−１又はＤ−２レセプター用リガンド及びトロパンのようなドーパミン輸送体用リガンド、並びにセロトニンレセプター用リガンドがある。
「スルホン酸置換基」という用語は、式−ＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）の置換基を意味する。−ＳＯ3Ｍ1置換基は炭素原子に共有結合され、炭素原子はアリール（例えば、Ｒ3〜Ｒ10基）又はアルキル（即ち、スルホアルキル基）であり得る。「生体適合性陽イオン」（Ｂc）という用語は、イオン化して負に帯電した基（この場合にはスルホネート基）と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳類の身体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
式ＩＩのジヒドロカルバゾリウム色素（ＣｚD）は、緑色ないし近赤外波長（５００〜１２００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍ）の光を用いる光学イメージング方法で直接又は間接に検出できる蛍光色素又は発色団である。好ましくは、ＣｚDは蛍光性を有する。
式Ｉのリンカー基−（Ａ）m−の役割の１つは、ＣｚDをＢＴＭの活性部位から遠ざけることにあると想定されている。これが特に重要であるのは、ＣｚDが比較的バルキーであり、したがって不都合な立体相互作用が起こり得るからである。これは、ＣｚDが活性部位から離れて位置する自由を与えるたわみ性（例えば、単純アルキル鎖）及び／又はＣｚDを活性部位から離すように定位させる剛性（例えば、シクロアルキル又はアリールスペーサー）を組み合わせることで達成できる。リンカー基の性質はまた、イメージング剤の生体分布を調整するためにも使用できる。即ち、例えばリンカー中にエーテル基を導入することは、血漿タンパク質結合を最小限に抑えるために役立つ。−（Ａ）m−がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位又は１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、リンカー基はインビボでイメージング剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整するために機能し得る。かかる「バイオモディファイアー」リンカー基は、バックグラウンド組織（例えば、筋肉又は肝臓）及び／又は血液からのイメージング剤のクリアランスを促進することで、バックグラウンド妨害を少なくして一層良好な診断画像を与えることができる。バイオモディファイアーリンカー基はまた、特定の排泄経路（例えば、肝臓経由ではなく腎臓経由の排泄）を有利にするためにも使用できる。
「糖」という用語は、単糖、二糖又は三糖を意味する。好適な糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース及びラクトースがある。任意には、アミノ酸への容易なカップリングを可能にするように糖を官能化することができる。即ち、例えばアミノ酸のグルコサミン誘導体は、ペプチド結合を介して他のアミノ酸にコンジュゲートすることができる。（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社から商業的に入手できる）アスパラギンのグルコサミン誘導体はこれの一例である。
式Ｉは、−（Ｌ）n［ＣｚD］部分がＢＴＭの任意適宜の位置に結合し得ることを示す。−（Ｌ）n［ＣｚD］部分に対して好適なかかる位置は、インビボで活性部位への結合に係わるＢＴＭ部分から離れた位置にあるように選択される。式Ｉの［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−部分は、式ＩＩのＣｚDの任意適宜の位置に結合し得る。［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−部分は、既存の置換基に取って代わるか、或いはＣｚDの既存の置換基に共有結合する。［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−部分は、好ましくは、第５の態様（下記）で説明されるようにＣｚDのカルボキシアルキル置換基を介して結合する。
好ましい特徴
イメージング剤の分子量は、好適には３００００ダルトン以下である。好ましくは、分子量は１０００〜２００００ダルトンの範囲内にあり、最も好ましくは２０００〜１８０００ダルトンの範囲内にあり、２５００〜１６０００ダルトンが特に好ましい。
ＢＴＭは合成品又は天然品であり得るが、好ましくは合成品である。「合成品」という用語はそれの通常の意味を有し、即ち、天然の供給源（例えば、哺乳類の身体）から単離されるものではなく人造のものを意味する。かかる化合物は、それの製造及び不純物プロファイルを完全に制御できるという利点を有している。したがって、天然由来のモノクローナル抗体及びそのフラグメントは、本明細書中で使用する「合成品」という用語の範囲外にある。ＢＴＭは、好ましくは３〜１００量体ペプチド、酵素基質、酵素アンタゴニスト及び酵素阻害剤から選択される。ＢＴＭは、最も好ましくは３〜１００量体ペプチド又はペプチド類似体である。ＢＴＭがペプチドである場合、それは好ましくは４〜３０量体ペプチドであり、最も好ましくは５〜２８量体ペプチドである。
式ＩＩ中、好ましくはＲ19及びＲ20の少なくとも一方がＨであり、最も好ましくは両方がＨである。
Ｒ3〜Ｒ10のカルボキサミドアルキル置換基は、好ましくは次の式を有する。
−（ＣＨＲ'）xＣＯＮＲ'2
式中、ｘは１〜６の値を有する整数であり、各Ｒ'は独立にＨ、Ｃ1-3アルキル又はＣ1-3ヒドロキシアルキルである。好ましいかかる置換基は−（ＣＨ2）xＣＯＮＲ'2（式中、ｘ及びＲ'は上記に定義した通りである。）である。
ジヒドロカルバゾリウム色素（ＣｚD）は、好ましくは、（Ｒ3〜Ｒ10の）−ＳＯ3Ｍ1基及び（ＲaがＣ1-4スルホアルキルであるように選択された場合には）スルホアルキル基から選択される全部で３又は４のスルホン酸置換基を有する。好ましくは、ＣｚDは１〜３のスルホアルキル置換基を含み、最も好ましくは、ＣｚDのスルホン酸置換基の少なくとも２つはスルホアルキル基であるように選択される。スルホアルキル基は、好ましくはＲ1、Ｒ2、Ｒ15又はＲ18の位置にある。式ＩＩ中、スルホアルキル基は好ましくは式−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、ｋは１〜４の値を有する整数であり、Ｂcは（上記に定義したような）生体適合性陽イオンである。）を有する。ｋは好ましくは３又は４である。
式ＩＩ中のＲ11及びＲ12は、好ましくは、一方がＲb基（式中、ＲbはＣ1-4スルホアルキル又はＣ2-7カルボキシアルキルである。）であり、他方がＣＨ3であるように選択される。
式Ｉの［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−部分は、好ましくは式ＩＩのＣｚDのＲ1、Ｒ2、Ｒ11又はＲ17の位置、さらに好ましくはＲ1、Ｒ11又はＲ17の位置、最も好ましくはＲ1又はＲ11の位置に結合している。
特に好ましいＣｚD色素は次の式ＩＩａを有する。
式中、
Ｒ1a及びＲ2aは各々独立にＲb基であり、
Ｒ11a及びＲ12aは各々独立にＣＨ3又はＲb基であり、
Ｒ13a〜Ｒ15aは各々独立にＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ又はＣ2-5カルボキシアルキルであり、
Ｒ17a及びＲ18aは各々独立にＨ又はＲb基であり、
Ｒ21及びＲ22は各々独立に−ＳＯ3Ｍ1又は−ＣＯ2Ｍ1であり、
Ｒb及びＭ1は上記に定義した通りであり、
各ｎは独立に０、１又は２である。
式ＩＩａ中、好ましくはＲ17a及びＲ18aの少なくとも一方がＨである。最も好ましくは、Ｒ17a＝Ｒ18a＝Ｈである。式ＩＩａ中、好ましくはＲ1a及びＲ2aの少なくとも一方がＣ1-4スルホアルキルであり、最も好ましくは両方がＣ1-4スルホアルキルである。式ＩＩａ中、好ましくはＲ11a及びＲ12aの一方がＲb基（式中、Ｒbは上記に定義した通りである。）であり、他方がＣＨ3である。
ＢＴＭがペプチドである場合、好ましいかかるペプチドには以下のものがある。
−ソマトスタチン、オクトレオチド及び類似体。
−ＳＴレセプターに結合するペプチド（ここで、ＳＴとは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の微生物によって産生される耐熱性毒素をいう。）。
−ラミニンフラグメント、例えば、ＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＩＫＶＡＶ、ＬＲＥ及びＫＣＱＡＧＴＦＡＬＲＧＤＰＱＧ。
−白血球集積部位をターゲティングするためのＮ−ホルミルペプチド。
−血小板第４因子（ＰＦ４）及びそれのフラグメント。
−例えば血管形成をターゲティングし得るＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）含有ペプチド［Ｒ．Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７ Ｊｕｎ；１５（６）：５４２−６］、［Ｅ．Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．１９９７ Ｍａｙ；５１（５）：１４１３−７］。
−α2−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン又はトロンボスポンジンのペプチドフラグメント。α2−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン及びトロンボスポンジンのアミノ酸配列は、以下の参考文献中に見出すことができる。α2−抗プラスミン前駆体［Ｍ．Ｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０２，１０３３（１９８７）］、β−カゼイン［Ｌ．Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１３９，１９３（１９９４）］、フィブロネクチン［Ａ．Ｇｕｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０７，１４５（１９９６）］、トロンボスポンジン１前駆体［Ｖ．Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８３，５４４９（１９８６）］、Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，１９５（１９８４）。
−アンギオテンシンＩＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（Ｅ．Ｃ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９７９，Ｖｏｌ ２２，９，１０３８−１０４４）及び［Ｓａｒ，Ｉｌｅ］アンギオテンシンＩＩ：Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（Ｒ．Ｋ．Ｔｕｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７２，１７７，１２０３）のようなアンギオテンシンの基質又は阻害剤であるペプチド。
−アンギオテンシンＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ。
ＢＴＭがペプチドである場合、ペプチドの一方又は両方の末端（好ましくは両方の末端）に代謝抑制基（ＭIG）がコンジュゲートされる。このようにして両方のペプチド末端を保護することは、インビボイメージング用途のために重要である。さもないと、急速な代謝の結果としてＢＴＭペプチドに対する選択的結合親和性が失われると予想されるからである。「代謝抑制基」（ＭIG）という用語は、アミノ末端又はカルボキシ末端におけるＢＴＭペプチドの酵素（特にカルボキシペプチダーゼのようなペプチダーゼ）代謝を阻止又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基はインビボ用途のために特に重要であって、これらは当業者にとって公知であり、好適にはペプチドアミン末端に関してはＮ−アシル化基−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＲG（式中、アシル基−（Ｃ＝Ｏ）ＲGはＣ1-6アルキル基及びＣ3-10アリール基から選択されるＲGを有するか、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位を含む。）から選択される。好適なＰＥＧ基は、リンカー基（Ｌ）に関して下記に記載される。好ましいかかるＰＥＧ基は、式Ｂｉｏ１又はＢｉｏ２（下記）のバイオモディファイアーである。好ましいかかるアミノ末端ＭIG基はアセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。
ペプチドカルボキシル末端に関して好適な代謝抑制基には、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位がある。ＢＴＭペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基にとって好適なＭIG基は、アミノ酸残基の末端アミンをＣ1-4アルキル基（好ましくはメチル基）でＮ−アルキル化したものである。好ましいかかるＭIG基はカルボキサミド又はＰＥＧであり、最も好ましいかかる基はカルボキサミドである。
いずれか一方又は両方のペプチド末端がＭIG基で保護された場合、−（Ｌ）n［ＣｚD］部分はＭIG基に任意に結合できる。好ましくは、少なくとも一方のペプチド末端はＭIG基を有しておらず、その位置に−（Ｌ）n［ＣｚD］部分が結合することでそれぞれ次の式ＩＶａ又はＩＶｂの化合物が得られる。
［ＣｚD］−（Ｌ）n−［ＢＴＭ］−Ｚ2 （ＩＶａ）
Ｚ1−［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−［ＣｚD］ （ＩＶｂ）
式中、
Ｚ1はＢＴＭペプチドのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
Ｚ2はＢＴＭペプチドのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは（上記に定義したような）生体適合性陽イオンである。）又はＭIGである。
式ＩＶａ及びＩＶｂ中、Ｚ1及びＺ2は好ましくは共に独立にＭIGである。Ｚ1及びＺ2にとって好ましいかかるＭIG基は、ペプチド末端に関して上記に記載した通りである。いずれかのペプチド末端におけるＢＴＭペプチドの代謝抑制はこのように−（Ｌ）n［ＣｚD］部分を結合することによっても達成できるが、−（Ｌ）n［ＣｚD］自体は本発明のＭIGの定義範囲外にある。
ＢＴＭペプチドは、任意には、ＣｚDの容易なコンジュゲーションに適した側鎖を有しかつリンカー基（Ｌ）のＡ残基の一部をなす１以上の追加アミノ酸残基を含み得る。好適なかかるアミノ酸残基には、アミン官能化ＣｚD色素とのコンジュゲーションのためのＡｓｐ又はＧｌｕ残基、或いはカルボキシ官能化又は活性エステル官能化ＣｚD色素とのコンジュゲーションのためのＬｙｓ残基がある。ＣｚDのコンジュゲーションのための追加アミノ酸残基は、好適にはＢＴＭペプチドの結合領域から離れて位置しており、好ましくはＣ末端又はＮ末端に位置している。好ましくは、コンジュゲーションのためのアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。
合成リンカー基（Ｌ）が存在する場合、それは好ましくは［ＢＴＭ］及びＣｚDへのコンジュゲーションを容易にする末端官能基を含む。好適なかかる基（Ｑa）は第５の態様（下記）で記載する。Ｌが１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、アミノ酸残基は好ましくはグリシン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びセリンから選択される。ＬがＰＥＧ部分からなる場合、それは好ましくは次の式Ｂｉｏ１又はＢｉｏ２の単分散ＰＥＧ様構造のオリゴマー化で導かれる単位からなる。
かかるＰＥＧ様構造は、式Ｂｉｏ１（式中、ｐは１〜１０の整数である。）の１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸であり得る。別法として、式Ｂｉｏ２のプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造も使用できる。
式中、ｐは式Ｂｉｏ１に関して定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数である。式Ｂｉｏ２中、ｐは好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。
リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖からなっていない場合、好ましいＬ基は、２〜１０の原子、最も好ましくは２〜５の原子、特に好ましくは２又は３の原子を含む−（Ａ）m−部分を構成する結合原子の主鎖を有している。２つの原子を含む最小リンカー基主鎖は、いかなる望ましくない相互作用も最小限に抑えられるようにＣｚDを十分に引き離すという利点を与える。
商業的に入手できないＢＴＭペプチドは、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ａｎｄ Ｅ．Ｇｉｒａｌｄ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されているような固相ペプチド合成法によって合成できる。
イメージング剤は以下のようにして製造できる。
ＢＴＭに対するＣｚDのコンジュゲーションを容易にするため、ＣｚDには好適には反応性官能基（Ｑa）が結合されている。Ｑa基は、ＢＴＭの相補的な官能基と反応することでＣｚDとＢＴＭとの間に共有結合を形成するように設計されている。ＢＴＭの相補的な官能基は、ＢＴＭの固有部分であってもよいし、或いは当技術分野で公知のように二官能性基での誘導体化の使用によって導入してもよい。表１は、反応基及びその相補的な対応基の例を示す。
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語は、良好な脱離基であり、したがってアミンのような求核性化合物との一層容易な反応を可能にするように設計されたカルボン酸のエステル誘導体を意味する。好適な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、ｐ−ニトロフェノール及びヒドロキシベンゾトリアゾールである。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールエステルである。
Ｑａがアジド又はアルキンである場合、コンジュゲーション反応はトリアゾール環を形成する「クリック化学」を含んでいる。コンジュゲート形成で使用されるクリック化学の詳細は、“ＣｌｉｃｋＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ”［Ｊ．Ｌａｈａｎｎ（Ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ（２００９）］中の“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｖｉａ Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｃ．Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｐａｇｅｓ ３５５−３７８に記載されている。アルキン基又はアジド基による生物学的ターゲティング分子の官能化のためのさらなるアプローチは、Ｎｗｅ ｅｔ ａｌ［Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，２４（３），２８９−３０２（２００９）］によって記載されている。Ｌｉ ｅｔ ａｌは、Ｎ3−Ｌ1−ＣＯ2Ｈ型（式中、Ｌ1は−（ＣＨ2）4−である。）の化合物の合成法及びアミン含有ＢＴＭへのコンジュゲートのためのそれの使用を記載している［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１８（６），１９８７−１９９４（２００７）］。Ｈａｕｓｎｅｒ ｅｔ ａｌは、Ｎ3−Ｌ1−ＣＯ2Ｈ（式中、Ｌ1は−（ＣＨ2）4−である。）についての関連方法論を記載している［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５１（１９），５９０１−５９０４（２００８）］。Ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，２０（７），１２８１−１２９５（２００９）］は、アジド側鎖を有する非天然アミノ酸及び続くクリックコンジュゲーションのためのペプチド又はタンパク質中への部位特異的組込みを記載している。
タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などのＢＴＭ中に存在する官能基の例には、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル（アルデヒド及びケトンを含む）並びにチオホスフェートがある。好適なＱa基は、カルボキシル、活性化エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホラミダイトから選択できる。好ましくは、Ｑaはカルボン酸の活性化エステル、イソチオシアネート、マレイミド又はハロアセトアミドである。
相補基がアミン又はヒドロキシルである場合、Ｑaは好ましくは活性化エステルであり、好ましいかかるエステルは上記に記載した通りである。ＣｚD上の好ましいかかる置換基は、５−カルボキシペンチル基の活性化エステルである。相補基がチオールである場合、Ｑaは好ましくはマレイミド基又はヨードアセトアミド基である。
光学色素を生物学的分子にコンジュゲートするための一般的方法は、Ｌｉｃｈａ ｅｔ ａｌ［Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］によって記載されている。本発明で使用するためのペプチド、タンパク質及びオリゴヌクレオチド基質は、末端位置で標識することができ、或いは別法として１以上の内部位置で標識することができる。蛍光色素標識試薬を用いるタンパク質標識の総説及び例に関しては、“Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７、及び“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ − Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ａｓｌａｍ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｎｔ，Ａ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌｔｄ．（１９９８）を参照されたい。合成ペプチドにおいて部位特異的標識を達成するためのプロトコルが利用できる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。
好ましくは、イメージング剤の製造方法は、
（ｉ）ＢＴＭのアミン官能基を式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＣｚD］の化合物と反応させるか、
（ｉｉ）ＢＴＭのカルボン酸又は活性化エステル官能基を式Ｙ2−（Ｌ）n−［ＣｚD］の化合物と反応させるか、或いは
（ｉｉｉ）ＢＴＭのチオール基を式Ｙ3−（Ｌ）n−［ＣｚD］の化合物と反応させる
ことを含んでいる。式中、
ＢＴＭ、ＭIG、Ｌ、ｎ及びＣｚDは上記に定義した通りであり、
Ｙ1はカルボン酸基、活性化エステル基、イソチオシアネート基又はチオシアネート基であり、
Ｙ2はアミン基であり、
Ｙ3はマレイミド基である。
Ｙ2は、好ましくは第一又は第二アミン基であり、最も好ましくは第一アミン基である。段階（ｉｉｉ）では、ＢＴＭのチオール基は好ましくはシステイン残基に由来する。
段階（ｉ）〜（ｉｉｉ）では、ＢＴＭはＣｚD誘導体と反応する可能性がある他の官能基を任意に有し得るが、これらは所望の部位のみで化学反応が選択的に起こるように適当な保護基で保護される。「保護基」という用語は、望ましくない化学反応を阻止又は抑制するが、分子の残部を変質させない程度に温和な条件下で問題の官能基から脱離させ得るのに十分な反応性を有するように設計された基を意味する。脱保護後には所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者にとって公知であり、好適にはＢｏｃ（ここでＢｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｆｍｏｃ（ここでＦｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである。）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］及びＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から適宜に選択される。好適なチオール保護基は、Ｔｒｔ（トリチル）、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、メトキシベンジル、メチルベンジル及びＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）である。さらに他の保護基の使用は、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載されている。好ましいアミン保護基はＢｏｃ及びＦｍｏｃであり、最も好ましくはＢｏｃである。好ましいアミン保護基はＴｒｔ及びＡｃｍである。
本発明のＣｚD色素は、実施例に記載されるようにして製造できる。
光学レポーター色素をアミノ酸及びペプチドにコンジュゲートする方法は、Ｌｉｃｈａ（上記参照）並びにＦｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８，７５１−７５６（１９９７）］、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ［ｉｂｉｄ，１３，６０５−６１０（２００２）］及びＺａｈｅｅｒ［Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，１（４），３５４−３６４（２００２）］によって記載されている。リンカー基（Ｌ）をＢＴＭにコンジュゲートする方法は、色素のみをコンジュゲートする方法（上記参照）と類似の化学作用を使用し、当技術分野で公知である。
第２の態様では、本発明は、哺乳動物への投与に適した形態で第１の態様のイメージング剤を生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬組成物を提供する。
「生体適合性キャリヤー」は、組成物が生理学的に認容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳類の身体に投与できるようにして）イメージング剤を懸濁又は溶解できる流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水又は等張食塩水である。
イメージング剤及び生体適合性キャリヤーはそれぞれ、注射器又はカニューレによる溶液の追加及び抜取りを許しながら、無菌保全性及び／又は放射能安全性の維持、さらに任意には不活性ヘッドスペースガス（例えば、窒素又はアルゴン）の維持を可能にする密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。好ましいかかる容器は、気密クロージャーを（通例はアルミニウムからなる）オーバーシールと共にクリンプ加工した隔壁密封バイアルである。クロージャーは、無菌保全性を維持しながら皮下注射針による１回又は数回の穿刺に適したもの（例えば、クリンプ加工した隔壁シールクロージャー）である。かかる容器は、（例えば、ヘッドスペースガスの変更又は溶液のガス抜きのために）所望される場合にはクロージャーが真空に耐え得ると共に、酸素又は水蒸気のような外部大気ガスの侵入を許すことなしに減圧のような圧力変化にも耐え得るという追加の利点を有している。
好ましい複数用量容器は、複数の患者用量を含む（例えば、容積１０〜３０ｃｍ3の）単一のバルクバイアルからなり、したがって臨床的状況に合わせて製剤の実用寿命中に様々な時間間隔で１回分の患者用量を臨床グレードの注射器中に抜き取ることができる。予備充填注射器は１回分のヒト用量又は「単位用量」を含むように設計され、したがって好ましくは臨床用に適した使い捨て注射器又は他の注射器である。本発明の医薬組成物は、好ましくは１人の患者用に適した用量を有し、上述したような適当な注射器又は容器に入れて供給される。
かかる医薬組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、安定剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加賦形剤を任意に含むことができる。「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、任意には投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳動物への投与のために許容し得る範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容し得る緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容し得る塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容し得る増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
第２の態様の医薬組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。第２の態様の医薬組成物は、好ましくは第３の態様に関して下記に記載するようなキットから製造される。
第３の態様では、本発明は、第２の態様の医薬組成物を製造するためのキットであって、当該キットは第１の態様のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬組成物を与えるキットを提供する。
その場合、イメージング剤及び上述したような他の任意賦形剤は、凍結乾燥粉末として適当なバイアル又は容器に入れて供給できる。かかる薬剤は、次いで所望の生体適合性キャリヤーを用いて再構成することで、哺乳動物への投与が可能な無菌で非発熱性の形態の医薬組成物を与えるように設計される。
イメージング剤の好ましい無菌固体形態は凍結乾燥固体である。無菌固体形態は、好ましくは医薬組成物に関して（上記に）記載したような医薬品用容器に入れて供給される。キットを凍結乾燥する場合、配合物は糖類（好ましくはマンニトール、マルトース及びトリシン）から選択される凍結保護剤を任意に含むことができる。
第４の態様では、本発明は次の式Ｉのコンジュゲートを提供する。
［ＢＴＭ’］−（Ｌ）n−ＣｚD
（Ｉ）
式中、Ｌ、ｎ、ＢＴＭ及びＣｚD並びにこれらの好ましい態様は第１の態様で定義した通りである。
第４の態様のコンジュゲートは、式ＩＩ及び式ＩＩａのＣｚD色素を含む本発明のイメージング剤及び医薬組成物の製造に際して有用である。ＢＴＭ、Ｌ、ｎ並びに式ＩＩ及び式ＩＩａのＣｚD色素の好ましい態様は上述した通りである。かかるコンジュゲートは本発明の第１及び第５の態様に記載したようにして製造できる。
第５の態様では、本発明は、第４の態様のコンジュゲートの製造において有用な官能化ジヒドロカルバゾリウム色素（ＣｚD）であって、ＣｚDは第１の態様で定義された式ＩＩ又は式ＩＩａを有すると共に、前記ＣｚDはさらにＱa基（式中、ＱaはＢＴＭへのコンジュゲーションに適した反応性官能基である。）を含む官能化色素を提供する。
「反応性官能基」（Ｑa）及びその好ましい実施形態は、第１の態様（上記）に記載した通りである。
第６の態様では、本発明は、哺乳類の身体のインビボ光学イメージング方法であって、第１の態様のイメージング剤又は第２の態様の医薬組成物を用いてインビボでＢＴＭの局在部位の画像を得る段階を含んでなる方法を提供する。
「光学イメージング」という用語は、緑色ないし近赤外領域（波長５００〜１２００ｎｍ）の光との相互作用に基づいて、疾患の検出、ステージング又は診断、疾患進展の追跡或いは疾患治療の追跡のための画像を形成する任意の方法を意味する。光学イメージングはさらに、いかなる装置も使用しない直接可視化並びに各種スコープ、カテーテル及び光学イメージング装置（例えば、断層撮影表示用のコンピューター支援ハードウェア）のような装置の使用を伴う直接可視化のためのあらゆる方法を包含する。かかるモダリティ及び測定技法には、特に限定されないが、ルミネセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡検査、光音響イメージング、音響光学イメージング、スペクトル分析、反射スペクトル分析、干渉分析、コヒーレンス干渉分析、拡散光学断層撮影及び蛍光媒介拡散光学断層撮影（連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、並びに光の散乱、吸光、偏光、ルミネセンス、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定がある。これらの技法のさらなる詳細は、Ｔｕａｎ Ｖｏ−Ｄｉｎｈ（ｅｄｉｔｏｒ）：“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（２００３），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣ、Ｍｙｃｅｋ ＆ Ｐｏｇｕｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）：“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”（２００３），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、及びＳｐｌｉｎｔｅｒ ＆ Ｈｏｐｐｅｒ：“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ”（２００７），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣに示されている。
緑色ないし近赤外領域の光は、好適には５００〜１２００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍの波長を有する。光学イメージング方法は、好ましくは蛍光内視鏡検査である。第６の態様の哺乳類の身体は、好ましくは人体である。イメージング剤の好ましい実施形態は、第１の態様に関して（上記に）記載した通りである。特に、使用するＣｚD色素は蛍光性であることが好ましい。
第６の態様の方法では、イメージング剤又は医薬組成物は好ましくは前記哺乳類の身体に予め投与されている。「予め投与されている」とは、臨床医の関与の下でイメージング剤を例えば静脈内注射によって患者に投与する段階がイメージングに先立って既に実施されていることを意味する。この実施形態は、ＢＴＭが関係している哺乳類の身体の疾患状態のインビボ診断イメージング用の診断剤を製造するために、第１の実施形態のイメージング剤を使用することを含んでいる。
第６の態様の好ましい光学イメージング方法は、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）である。ＦＲＩでは、本発明のイメージング剤を診断すべき被験体に投与し、次いで被験体の組織表面を励起光（通常は連続波（ＣＷ）励起）で照明する。光はイメージング剤のＣｚD色素を励起する。励起光によって生じるイメージング剤からの蛍光を、蛍光検出器を用いて検出する。好ましくは、戻る光を濾光することで蛍光成分を（単独に又は部分的に）分離する。蛍光から画像を形成する。通常、最小限の処理が実施され（寿命、量子収量などの光学パラメーターを計算するためのプロセッサーは使用されない）、画像は蛍光強度をマップする。イメージング剤は、疾患領域に集中して高い蛍光強度を生み出すように設計されている。したがって、疾患領域は蛍光強度画像中に正のコントラストを生み出す。画像は好ましくはＣＣＤカメラ又はチップを用いて取得される結果、リアルタイムイメージングが可能である。
励起用の波長は使用する特定のＣｚD色素に応じて変化するが、本発明の色素に関しては通例５００〜１２００ｎｍの範囲内にある。励起光を発生するための装置は、レーザー（例えば、イオンレーザー、色素レーザー又は半導体レーザー）、ハロゲン光源或いはキセノン光源のような通常の励起光源であり得る。任意には、各種の光学フィルターを用いて最適の励起波長を得ることができる。
好ましいＦＲＩ方法は下記の段階を含んでいる。即ち、
（ｉ）哺乳類の身体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ｉｉ）ＣｚDの励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでいる。段階（ｉ）では、励起光は好ましくは連続波（ＣＷ）の性質を有する。段階（ｉｉｉ）では、検出された光は好ましくは濾光される。特に好ましいＦＲＩ方法は蛍光内視鏡検査である。
第６の態様の別のイメージング方法は、ＦＤＰＭ（周波数ドメイン光子移動）を使用する。これは、組織内における色素の検出深度が大きいことが重要である場合、連続波（ＣＷ）方法に比べて利点を有する［Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］。かかる周波数／時間ドメインイメージングのためには、ＣｚDが、画像化すべき病変の組織深度及び使用する計装のタイプに応じて変調できる蛍光特性を有するならば有利である。
ＦＤＰＭ方法は下記のようなものである。即ち、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳類の身体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織は励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルは組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでいる。
段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくはイメージング剤の取込みに対応し、好ましくはさらにイメージング剤の投与前における組織の吸着係数及び散乱係数に対応する複数の量のマッピングを含んでいる。段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくは蛍光寿命、蛍光量子効率、蛍光収量及びイメージング剤取込みの１以上に対応する。蛍光特性は、好ましくは発光強度に無関係であり、またイメージング剤濃度に無関係である。
段階（ｃ）の定量化は、好ましくは、（ｉ）値の推定値を設定し、（ｉｉ）推定値の関数として計算発光を求め、（ｉｉｉ）計算発光を前記検出段階の発光と比較して誤差を求め、（ｉｖ）誤差の関数として蛍光特性の修正推定値を得ることを含んでいる。定量化は、好ましくは、組織の多重光散乱挙動をモデル化する数学的関係から値を求めることを含んでいる。第１のオプションの方法は、好ましくはさらに、前記蛍光特性の変動を検出することでインビボでの組織の代謝特性をモニターすることを含んでいる。
第６の態様の光学イメージングは、好ましくは哺乳類の身体の疾患状態の管理を支援するために使用される。「管理」という用語は、検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングでの使用を意味する。疾患状態は、好適にはイメージング剤のＢＴＭが関係するものである。イメージング用途には、好ましくは、カメラに基づく表面イメージング、内視鏡検査及び外科的誘導がある。好適な光学イメージング方法のさらなる詳細は、Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］によって総説されている。
第７の態様では、本発明は、哺乳類の身体の疾患状態の検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングを行う方法であって、第６の態様のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法を提供する。
以下に詳述する非限定的な実施例によって本発明を例証する。実施例１は、カルバゾリウム色素前駆体の合成法を示す。実施例２は、（水溶性を向上させるために）Ｎ−スルホアルキル基を有するカルバゾリウム色素前駆体の合成法を示す。実施例３は、（生物学的ターゲティング部分に対する色素のコンジュゲーションを容易にするために）カルボキシアルキル置換基を有するカルバゾリウム色素前駆体の合成法を示す。実施例４は、スルホアルキル置換基及びカルボキシアルキル置換基の両方を有するカルバゾリウム色素前駆体の合成法を示す。実施例５は、改良されたカルバゾリウム色素合成法に基づく予測例として本発明の３種の色素（色素１、色素２及び色素３）の合成法を示す。実施例６は、本発明のジヒドロカルバゾリウム色素がインビボ光学イメージングに適した光物理的性質を有するという証拠を示す。
略語
ＢＰ： 沸点
ＣＶ： カラム容積
ＤＣＭ： ジクロロメタン
ＤＭＦ： Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
ＨＰＬＣ： 高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ−ＭＳ： 液体クロマトグラフィー質量分析法
ＰＢＳ： リン酸塩緩衝食塩水
ＲＴ： 室温
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ： テトラヒドロフラン
ＴＬＣ： 薄層クロマトグラフィー
実施例１：カルバゾリウム前駆体（化合物１ｄ）の合成
（ｉ）１，３−ジメチルインドール（化合物１ａ）
１−メチル−１−フェニルヒドラジン（６ｇ、４９．２ｍｍｏｌ）を酢酸（１２ｍｌ）中のプロピオンアルデヒド（３．２ｇ、９ｍｍｏｌ）にゆっくりと添加した。添加中に熱が発生した。溶液をＣＥＭマイクロ波反応器（２００℃、３００Ｗ、保持時間１分）内で加熱した。高真空回転蒸発器で酢酸を除去し、得られた黒色のガム質をＤＣＭ（２０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル（５０ｇ）を添加し、試料を濃縮乾固した。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ペトロール４０〜６０，Ｂ＝ＤＣＭ，１〜４ＣＶ １０％Ｂ，１３ＣＶ ８０％Ｂ，４０ｇカラム）を行った。速く流出する大きいピークを集め、濃縮することで不純な黄色油状物を得た。生成物を高沸点画分から分離するように注意しながら、不純物質を分別蒸留（１００Ｐａ（１ｍＢａｒ）でＢＰ＝１９０℃）により精製することで、所望の物質（３．７ｇ、４４％）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）２．３３（３Ｈ，ｓ，メチル）、３．７３（３Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、６．８２（１Ｈ，ｓ，２−ＣＨ）、７．１（１Ｈ，ｄｄ，インドール）、７．２１（１Ｈ，ｄｄ，インドール）、７．２８（１Ｈ，ｄ，インドール）、７．５７（１Ｈ，ｄ，インドール）。
（ｉｉ）４，４，４ａ，９−テトラメチル−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロカルバゾール−２−オン（化合物１ｂ）
１，３−ジメチルインドール（化合物１ａ、２００ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍｌ）に溶解し、氷水浴上で冷却した。硫酸（９７％、０．２ｍｌ）を添加し、１分後にメシチルオキシド（４０５ｍｇ、４．１４ｍｍｏｌ）を添加した。熱が発生し、撹拌を１／２時間続けた後、１時間かけて温度をＲＴまで上昇させた。反応物を冷却及び撹拌しながら、水（１０ｍｌ）中のＮａＨＣＯ3（１．２６７ｇ）懸濁液にゆっくりと添加し、ジエチルエーテル（３×２０ｍｌ）で抽出し、ＭｇＳＯ4上で乾燥した。蒸発によって得られた淡黄色の油状物をジエチルエーテル（２０ｍｌ）に溶解し、溶液をシリカゲル（約５ｇ）上で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ペトロール４０〜６０，Ｂ＝ＤＣＭ，１〜４ＣＶ ５％Ｂ乃至１０％Ｂ，１０ＣＶ １００％Ｂ，１３ＣＶ １００％Ｂ，１２０ｇカラム）によって１つの主要化学種を得たが、これを静置して結晶化することで所望の物質（３０２ｍｇ、９０％）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）０．８１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ 3）、１．０６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ 3）、１．４６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ 3 )、２．２０（１Ｈ，ｄ，３−ＣＨ）、２．３２（１Ｈ，ｄ，３−ＣＨ）、２．６２（３Ｈ，ｓ，Ｎ−ＣＨ 3）、２．７２（２Ｈ，ｍ，１−ＣＨ 2）、３．５５（１Ｈ，ｄｄ，９ａ−ＣＨ）、６．５４（１Ｈ，ｄ，８−ＣＨ）、６．７６（１Ｈ，ｄｄ，６−ＣＨ）、７．０６（１Ｈ，ｄ，５−ＣＨ）、７．１４（１Ｈ，ｄｄ，７−ＣＨ）。
（ｉｉｉ）２−メチレン−４，４，４ａ，９−テトラメチル−１，２，３，４，５，６−テトラヒドロカルバゾール（化合物１ｃ）
化合物１ｂ（８７０ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（２ｍｌ）に溶解し、−４０℃に冷却した。ピリジン（１０μｌ）を添加し、次いでテッベ（Ｔｅｂｂｅ）試薬の溶液（０．５Ｍトルエン溶液、２ｅｑ．、８．０８ｍｍｏｌ、１６．１６ｍｌ）を窒素下で約１分かけて添加した。混合物を−４０℃で１／２時間撹拌し、２時間かけてＲＴに昇温させた。冷却した反応混合物に水酸化ナトリウム溶液（０．４５ｍｌの１５％水溶液）を添加する（熱及びガスが発生した）ことで反応物を奪活した。暗緑色の混合物をジエチルエーテル（６０ｍｌ）で希釈し、セライトパッドで濾過した。シリカゲル（約２０ｇ）を添加し、溶媒を蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ペトロール４０〜６０，Ｂ＝ＤＣＭ，１〜３ＣＶ ０〜５％Ｂ，３〜７ＣＶ ５％Ｂ乃至４０％Ｂ，７〜９ＣＶ ４０％Ｂ乃至１００％Ｂ，１２０ｇカラム）により、所望の生成物を主要化学種（０．３８ｇ、３９％）として得た。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）０．５７（３Ｈ，ｓ，メチル）、０．９６（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．４１（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．８４（１Ｈ，ｄ，ＣＨ ３）、２．２８（１Ｈ，ｄ，ＣＨ ３）、２．４３（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ １）、２．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ １）、２．６４（３Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、２．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ９ａ）、４．６８（１Ｈ，ｄ，エキソ−ＣＨ2）、４．８１（１Ｈ，ｄ，エキソ−ＣＨ2）、６．５５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ８）、６．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ６）、７．０５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ５）、７．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ７）。
（ｉｖ）２，４，４，４ａ，９−ペンタメチル−４，４ａ−ジヒドロ−３−Ｈ−カルバゾリウムヨージド（化合物１ｄ）
無水メタノール中の化合物１ｃ（３００ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）、ヨウ素（２ｅｑ．、６３１ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）及びヨウ化ナトリウム（６１５ｍｇ、４．１ｍｍｏｌ）を窒素下で２時間加熱還流した。冷却後、生じた沈殿を濾過によって集め、氷冷水で洗浄し、高真空下で乾燥して所望の生成物（１１０ｍｇ、２３％）を得た。濾液をチオ硫酸ナトリウム溶液（０．２ｍｌ飽和溶液）で処理し、生成物を半分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）１５０ｘ２１．２ｍｍ，Ａ＝水，Ｂ＝ＭｅＣＮ，１５ｍｌ／分，λ＝３３０ｎｍ，０〜５分 ５％Ｂ，１２分 ７０％Ｂ，１２〜１４分 ９５％Ｂ，１４〜１８分 ５％Ｂ，ｔr＝１１分）によって精製した。凍結乾燥によってオフホワイトの固体（１２２ｍｇ、２７％）を得た。総収率５０％。
1Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ3）：δ（ｐｐｍ）０．５９（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．５０（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．５４（３Ｈ，ｓ，メチル）、２．３１（３Ｈ，ｓ，メチル）、２．４５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ３）、３．０３（１Ｈ，ｄ，Ｈ ３）、３．９９（３Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、７．０３（１Ｈ，ｓ，Ｈ １）、７．６１（１Ｈ，ｄｄ）、７．６５（１Ｈ，ｄｄ）、７．７５（２Ｈ，ｍ）。
実施例２：Ｎ−スルホアルキルカルバゾリウム前駆体（化合物２ｅ）の合成
（ｉ）３−メチル−１−（４−スルホブチル）インドール（化合物２ｂ）
３−メチルインドール（化合物２ａ、３１１ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、（乾燥ジエチルエーテルで洗浄した）水素化ナトリウム（９７ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ、１．７ｅｑ．）をＤＭＦ（乾燥、２ｍｌ）中の懸濁液として一度に添加した。微細懸濁液をＲＴで３０分間撹拌し、１，４−ブタンスルトン（３２４ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１時間撹拌した。次いで、反応物をジエチルエーテル（１００ｍｌ）に添加し、懸濁液を４℃で１６時間貯蔵した。上澄み液をデカントによって除去し、固体をジエチルエーテルでトリチュレートした。オフホワイトの固体を高真空下で乾燥した（４１０ｍｇ、６１％）。プロトンＮＭＲは約１７モル％のＤＭＦの存在を示した。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ（ｐｐｍ）１．５４（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、１．７４（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、２．２４（３Ｈ，ｓ，メチル）、２．４０（２Ｈ，ｔ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2−ＳＯ3 -）、４．１０（２Ｈ，ｔ，Ｎ−ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、６．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ）、７．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ）、７．１２（１Ｈ，ｓ，２−Ｈ）、７．３９（１Ｈ，ｄ，ＡｒＨ）、７．４１（１Ｈ，ｄ，ＡｒＨ）。
（ｉｉ）９−（４−スルホブチル）−４，４，４ａ−トリメチル−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロカルバゾール−２−オンテトラブチルアンモニウム塩（化合物２ｃ）
化合物２ｂ（２．０ｇ、６．９２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１５０ｍｌ）中に懸濁し、７０℃に加温してから超音波処理し、次いで大部分の原料が溶解するまでさらに加温した。メシチルオキシド（２ｅｑ．，１．３６ｇ、１３．８４ｍｍｏｌ）を添加し、次いで硫酸（９７％、１ｍｌ）をゆっくりと添加した。反応物を窒素下においてＲＴで１６時間撹拌した。メシチルオキシド（１ｍｌ）、次いで硫酸（９７％、０．５ｍｌ）を添加し、撹拌を２４時間続けた。
反応溶液を真空下で濃縮して油状物を得、次いで水（８０ｍｌ）を添加した。水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（固体）を、ｐＨが約７になるまで少量ずつ添加し、溶液を酢酸エチル（４×５０ｍｌ）で抽出した。洗液を乾燥せずに濃縮して黄色の油状物（３．５ｇ）を得、これを高真空下で１６時間乾燥した。油状物をＤＣＭ（８０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル（約５０ｇ）上で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ＤＣＭ，Ｂ＝１０％メタノール／ＤＣＭ，Ｃ＝メタノール，０〜２ＣＶ １００％Ａ，２〜１０ＣＶ ０〜１００％Ｂ，１０〜１２ＣＶ １００％Ｂ，１２〜１７ＣＶ ０〜２０％Ｃ，１７〜２０ＣＶ ２０％Ｃ，３３０ｇカラム）によって一連の画分を得た。１２ＣＶ後に溶出する３つの主要画分は、所望の生成物及び若干の出発原料を様々な塩として含むことが示された。最も遅く流出する画分は、プロトンＮＭＲにより、テトラブチルアンモニウム塩としての所望生成物を清浄な物質（０．８７ｇ、２１％）として含むことが示された。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）０．８０（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．００（１２Ｈ，ｔ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 3）、１．０６（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．４５（８Ｈ，ｔｔ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ3）、１．４６（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．５５（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、１．６（８Ｈ，ｍ，ＮＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ3）、１．８２（２Ｈ，ｔｔ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、２．２０（２Ｈ，２ｘｄ オーバーラッピング，Ｈ ３ ａ／ｂ系）、２．６７（２Ｈ，ｍ，Ｈ １ ａ／ｂ系）、２．８０（２Ｈ，２ｘｄ，Ｎ−ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、３．０（２Ｈ，ｍ，，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、３．３２（８Ｈ，ｔ，ＮＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）、３．６１（１Ｈ，ｄｄ，９ａ−Ｈ）、６．４４（１Ｈ，ｄ，８−Ｈ）、６．６５（１Ｈ，ｄｄ，６−Ｈ）、７．００（１Ｈ，ｄ，５−Ｈ）、７．０６（１Ｈ，ｄｄ，７−Ｈ）。
（ｉｉｉ）２−メチレン−９−（４−スルホブチル）−４，４，４ａ−トリメチル−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロカルバゾールテトラブチルアンモニウム塩（化合物２ｄ）
トルエン共沸蒸発（乾燥トルエン、３×２０ｍｌ）を用いて化合物２ｃ（２００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を乾燥し、ＴＨＦ（乾燥、２０ｍｌ）に溶解した。カードアイス／アセトン浴を用いて溶液を−４０℃に冷却した。テッベ試薬（トルエン中０．５Ｍ、１ｍｍｏｌ、２ｍｌ、３ｅｑ．）を約２分かけてゆっくりと添加した。反応物を窒素下において−４０℃で３０分間撹拌し、さらに３０分間撹拌しながらＲＴに昇温させた（全反応時間１．５時間）。水酸化テトラブチルアンモニウム（３ｅｑ．、１ｍｍｏｌ）の水（３ｍｌ）溶液を冷却しながらゆっくりと添加し（激しい反応）、混合物を−１５℃で一晩貯蔵した。ＲＴの混合物にＤＣＭ（５０ｍｌ）を添加し、混合物をガラスフリットで濾過した。相分離器カートリッジを用いて濾液から水を除去し、ＤＣＭ溶液を濃縮乾固してオレンジ色の油状物を得た。粗生成物をＤＣＭ（１５ｍｌ）に溶解し、水酸化テトラブチルアンモニウム溶液（１ｍｌの１Ｍメタノール溶液）を添加した。溶液をシリカゲル（約５ｇ）上で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ＤＣＭ，Ｂ＝１０％メタノール／ＤＣＭ，Ｃ＝メタノール，０〜１ＣＶ １００％Ａ，１〜８ＣＶ ０〜１００％Ｂ，８〜１０ＣＶ １００％Ｂ，１０〜１７ＣＶ １００％Ｂ乃至２０％Ｃ，１６〜１７％Ｃ，２０％Ｃ，４０ｇカラム）によって様々なピークを得た。最も遅く流出するものが所望の生成物（１４０ｍｇ、７０％）であることがわかったが、これは不純物として２０〜３０％のケトン出発原料も含んでいた。不純な物質を次の段階で使用した。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）０．５５（３Ｈ，ｓ，メチル）、０．９０（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．００（１２Ｈ，ｔ，，ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 3）、１．３４（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．４５（８Ｈ，ｔｔ，ＮＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ3）、１．５５（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、１．６（８Ｈ，ｍ，ＮＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ3）、１．９０（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、２．２０（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、２．３５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ３）、２．５５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ３）、２．８０（３Ｈ，ｍ，Ｈ １及びＨ ９ａ）、３．０（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、３．３２（８Ｈ，ｔ，ＮＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）、４．６３（１Ｈ，ｓ，エキソ−メチレン）、４．７６（１Ｈ，ｓ，エキソ−メチレン）、６．４２（１Ｈ，ｄ）、６．６２（１Ｈ，ｄｄ）、７．００（１Ｈ，ｄ）、７．０５（１Ｈ，ｄｄ）。
（ｉｖ）９−スルホブチル−２，４，４，４ａ−テトラメチル−４，４ａ−ジヒドロ−３−Ｈ−カルバゾリウムテトラブチルアンモニウム塩（化合物２ｅ）
化合物２ｄ（１００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）をメタノール（乾燥、１０ｍｌ）に溶解し、ヨウ素（１ｅｑ．、４１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を３５分間加熱還流した。反応溶液を約１／２の体積に濃縮し、水をゆっくりと添加して全体積を約１０ｍｌにした。半分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）１５０ｘ２１．２ｍｍ，Ａ＝水，Ｂ＝ＭｅＣＮ，１５ｍｌ／分，λ＝３３０ｎｍ，０〜２分 ５％Ｂ，１２分 ７０％Ｂ，１２〜１４分 ９５％Ｂ，１４〜１８分 ５％Ｂ，ｔr＝２０．９分）によって精製を行った。集めた画分を濃縮し、次いで凍結乾燥した。質量収量＝１９ｍｇ。
1Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ4）：δ（ｐｐｍ）０．５９（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．０２（３Ｈ，ｔ，メチル）、１．４（ｑ）、１．５（ｍ）、１．６５（２Ｈ，ｍ）、１．９（２Ｈ，ｍ）、２．０５（２Ｈ，ｍ）、２．３０（２Ｈ，ｍ）、２．４５（２Ｈ，２ｘｄ）、２．９（ｍ）、３．０５（２Ｈ，２ｘｄ）、３．２５（２Ｈ，ｍ）、４．４５（ｍ）、７．１２（１Ｈ，ｓ）、７．６４−７．８（４Ｈ，ｍ）。
実施例３：カルボキシプロピル官能化カルバゾリウム前駆体（化合物３ｅ及び３ｆ）の合成
（ｉ）３−（３−メトキシカルボニルプロプ−１−イル）−１−メチルインドール（化合物３ｃ）
１−メチル−１−フェニルヒドラジン（３ａ、８４５ｇ、６．９３ｍｍｏｌ）を酢酸（１０ｍｌ）に溶解し、アジピン酸セミアルデヒドメチルエステル（３ｂ、９９７ｍｇ、６．９３ｍｍｏｌ）を滴下した（熱が発生した）。溶液を窒素下で３時間加熱還流した。高真空回転蒸発器で酢酸を除去し、得られた濃厚油状物をＤＣＭ（２０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル（約１０ｇ）を添加し、試料を濃縮乾固した。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ペトロール４０〜６０，Ｂ＝ＤＣＭ，１〜５ＣＶ １０％乃至３０％Ｂ，５〜１０ＣＶ ３０％乃至１００％Ｂ，１０〜１４ＣＶ １００％Ｂ，１２０ｇカラム）を行った。単一の大きいピークを集め、濃縮して油状物（１．１ｇ、６９％）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）２．０６（２Ｈ，ｔｔ，ＣＯＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2）、２．３９（２Ｈ，ｔ，ＣＯＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2）、２．７９（２Ｈ，ｔ，ＣＯＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2）、３．６６（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ）、３．７４（３Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、６．８４（１Ｈ，ｓ，Ｈ ２）、７．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ）、７．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ）、７．２７（１Ｈ，ｄ，Ａｒ）、７．６０（１Ｈ，ｄ，Ａｒ）。
（ｉｉ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−４，４，９−トリメチル−１，２，３，４，５，６−テトラヒドロカルバゾール−２−オン（化合物３ｄ）
化合物３ｃ（２５０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）及びメシチルオキシド（１０６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。溶液を脱気し（真空／窒素ガスサイクル×３）、窒素下に置いた。硫酸（９７％、０．５ｍｌ）を滴下し、反応物を０℃で撹拌した。反応物をＲＴに昇温させ、４８時間撹拌した。１０％Ｋ2ＣＯ3水溶液を用いて反応物のｐＨを約５に調整し、溶液をジエチルエーテル（３×２０ｍｌ）で抽出し、抽出液をＭｇＳＯ4上で乾燥し、濃縮してピンク色の油状物を得た。生成物をカラムクロマトグラフィー（Ａ＝ＤＣＭ，Ｂ＝１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ，１〜８ＣＶ ０％乃至５０％Ｂ，８〜１２ＣＶ ５０％乃至１００％Ｂ，１２〜１８ＣＶ １００％Ｂ，４０ｇカラム）によって精製した。所望の生成物と対応するカルボン酸との混合物であることを示す１つの画分が溶出された。カラムクロマトグラフィー操作を繰り返すことでこの混合物を分離した。２つの画分が得られた。速く流出する化学種は所望の生成物（０．２５ｇ、７０％）であり、遅く流出する化学種は対応する遊離酸（０．１ｇ、２９％）であった。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）０．８７（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．０６（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．３０（１Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2）、１．４６（１Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2）、１．６６（１Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2）、２．０（１Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2）、２．２０（２Ｈ，２ｘｄｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ，Ｈ３）、２．３３（２Ｈ，ｔ，ＣＯＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2）、２．６２（３Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、２．７１（２Ｈ，２ｘｄ，Ｈ １）、３．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ９ａ）、３．６４（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ）、６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｈ ８）、６．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ６）、６．９５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ５）、７．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ７）。
（ｉｉｉ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−２−メチリデン−４，４，９−トリメチル−１，２，３，４，５，６−テトラヒドロカルバゾール（化合物３ｅ）
化合物２ｄに関するものと同じ手順により、化合物３ｄを用いてこの化合物を製造する。
（ｉｖ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−２−メチリデン−２，４，４，９−テトラメチル−４，４ａ−ジヒドロ−３Ｈ−カルバゾリウムヨージド（化合物３ｆ）
化合物２ｅに関するものと同じ手順により、化合物３ｅを用いてこの化合物を製造する。
実施例４：カルボキシアルキル官能化及びスルホアルキル官能化カルバゾリウム前駆体（化合物４ｆ及び４ｇ）の合成
（ｉ）３−（３−メトキシカルボニルプロプ−１−イル）インドール（化合物４ｃ）
フェニルヒドラジン（４ａ、４．０４ｇ、３７．４ｍｍｏｌ）の酢酸溶液にアジピン酸セミアルデヒドメチルエステル（４ｂ、５．９２ｇ、４１．１ｍｍｏｌ）を滴下し、１時間加熱還流した。混合物を放冷し、次いで真空中で溶媒を除去して暗オレンジ色の固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（１００％ＤＣＭ溶離剤→５％ＭｅＯＨ）を用いて、この物質を精製した。粗化合物を注射液としてカラム上に装填した。物質は２つの画分
Ｆ３〜２０（1Ｈ ＮＭＲによれば純粋）１．４８ｇ及びＦ２１〜３１（1Ｈ ＮＭＲによれば約９５％で僅かに不純）０．９７８ｇとして得られた。化合物４ｃは３１％の収率で得られた。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）δ２．００（２Ｈ，五重線，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2）、２．３５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ2）、２．７５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０２Ｈｚ，ＣＨ 2ＣＯ2Ｍｅ）、３．６１（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ）、６．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，ＮＨＣＨ）、７．０７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，７．３Ｈｚ及び１．５Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．１４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，７．０５Ｈｚ及び１．２Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、１０．７７（１Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ）。
（ｉｉ）３−（３−メトキシカルボニルプロプ−１−イル）−１−（４−スルホブチル）インドール（化合物４ｄ）
化合物４ｃ（４．０ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、水素化ナトリウム（０．８１ｇ、２０．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）中の懸濁液として一度に添加した。暗紫色の懸濁液をＲＴで６時間撹拌した。０．５モル当量のＮａＨ及びスルトンを添加し、反応物を室温でさらに６時間撹拌し続けた。反応混合物をジエチルエーテルに添加し、得られた懸濁液を室温で一晩撹拌した。混合物を濾過し、集めた固体は急速にガム質に変わった。ガム質をメタノールで洗浄／溶解し、蒸発乾固して脆いオレンジ色の泡状物（３．８８ｇ、５６％）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；３００ＭＨｚ）、１．４９−１．６１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2）、１．７３−１．９１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2）、２．３２（２Ｈ，ｔ，ＪHH ７Ｈｚ，ＣＨ2）、２．４３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＣＨ2）、２．６８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＣＨ2）、４．０９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＣＨ2）、６．９８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，Ｊ＝０．６Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．１０（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７及び０．６Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．１３（１Ｈ，ｓ，ＡｒＣＨ）、７．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＡｒＣＨ）。
（ｉｉｉ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−４，４−ジメチル−９−（４−スルホブチル）−１，２，３，４，５，６−テトラヒドロカルバゾール−２−オン（化合物４ｅ）
化合物２ｃと同様にして、化合物４ｄ及びメシチルオキシドを用いてこの化合物を製造する。
（ｉｖ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−４，４−ジメチル−２−メチリデン−９−（４−スルホブチル）−１，２，３，４，５，６−テトラヒドロカルバゾール（化合物４ｆ）
化合物２ｄと同様にして、化合物４ｅを用いてこの化合物を製造する。
（ｖ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−２，４，４−トリメチル−９−（４−スルホブチル）−４，４ａ−ジヒドロ−３Ｈ−カルバゾリウムヨージド（化合物４ｇ）
化合物２ｅと同様にして、化合物４ｆを用いてこの化合物を製造する。
実施例５：カルバゾリウム色素（色素Ａ及び色素１〜３）の合成
（ｉ）４，４，４ａ，９−テトラメチル−２−（３−（１Ｅ−４，４，４ａ，９−テトラメチル−４，４ａ−ジヒドロ−３Ｈ−カルバゾール−２−イリデン）プロプ−１−エニル）−４，４ａ−ジヒドロ−３Ｈ−カルバゾリウムヨージド（色素Ａ、先行技術）
これは、米国特許第５８９２０５６号の合成法に対する改良法である。
実施例１からの化合物１（１１０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）及びオルトギ酸トリエチル（３ｅｑ．、１３３ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を暗所で窒素下においてピリジン中で４時間加熱還流した。ピリジンを真空下で除去し、光への暴露を最小限に抑えながら粗生成物をメタノール（３ｍｌ）に溶解した。半分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）１５０ｘ２１．２ｍｍ，Ａ＝０．５％ＴＦＡ／水，Ｂ＝０．５％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ，１５ｍｌ／分，λ＝７００ｎｍ，０〜１分 １０％Ｂ，１３分 ９５％Ｂ，１３〜１７分 ９５％Ｂ，１７〜２０分 １０％Ｂ，ｔr＝１３．７分）を行った。複数回の実施にわたる生成物ピークを手作業でシンチレーションバイアル中に集め、これらを直ちに（やはり暗所で）フリーザーに入れた。画分を合わせ、溶媒を除去して濃青色／金色のフィルムを得た。生成物をトルエン（１０ｍｌ）に溶解し、溶媒を真空下で除去した。最後に、生成物を高真空下で２４時間乾燥した。プロトンＮＭＲ及びＬＣＭＳは、生成物が不純であることを示した。精製段階を上述したようにして２回繰り返した（３ｍｇ、２％）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ（ｐｐｍ）０．６７（６Ｈ，ｓ，メチル）、１．４０（６Ｈ，ｓ，メチル）、１．５６（６Ｈ，ｓ，メチル）、２．８０（２Ｈ，ｄｄ，Ｈ ３）、３．０（２Ｈ，ｄｄ，Ｈ ３）、３．５２（６Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、６．２９（２Ｈ，ｓ，Ｈ １）、６．４０（２Ｈ，ｄ，メチン）、７．２３（２Ｈ，ｄｄ）、７．２６（２Ｈ，ｄ）、７．４０（２Ｈ，ｄｄ）、７．５５（２Ｈ，ｄ，Ｈ ８）、７．８８（１Ｈ，ｔ，中央メチンＨ）。
ＬＣＭＳ：Ｃ35Ｈ41Ｎ2に関するｍ／ｚ計算値４８９．３、実測値４８９[Ｍ]+。
色素Ａと同様にして、各１モル当量の化合物１ｄ及び化合物３ｆを用いて色素１を製造する。
色素Ａと同様にして、各１モル当量の化合物２ｅ及び化合物３ｆを用いて色素２を製造する。
色素Ａと同様にして、各１モル当量の化合物２ｅ及び化合物４ｇを用いて色素３を製造する。
実施例６：カルバゾリウム色素の光物理的性質
（ａ）シアニン色素Ｃｙ７と比較した色素Ａの吸光度及び蛍光
０．１〜０．２ｍｇバイアルの色素をまず１００μｌのＤＭＳＯに溶解し、次いでＰＢＳで規定濃度に希釈する。ＨＰ ８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計により、２．５μＭ溶液に関して吸光度測定を実施した。また、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計を標準化計器設定値（６００Ｖ ＰＭＴ設定値）で使用することにより、２．５μＭ溶液に関して蛍光測定を実施した。
（７４６ｎｍでの）測定吸光度は２６００００／Ｍ／ｃｍに等しい。
（７４８ｎｍでの）測定吸光度は２５００００／Ｍ／ｃｍに等しい。
【書類名】 明細書
【発明の名称】 色素コンジュゲートイメージング剤
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボ光学イメージングに適したイメージング剤であって、ジヒドロカルバゾリウム色素とペプチドのような生物学的ターゲティング部分とのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤に関する。また、医薬組成物及びキット並びにインビボイメージング方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
多くの光学イメージング剤では、近赤外（ＮＩＲ）吸収シアニン色素がその蛍光性光学レポーターとして使用されている。光学シグナルの感度を最大にするため、色素の最適光物理的性質は、その大部分で組織が透明である電磁スペクトル部分（７００〜８５０ｎｍ）において励起及び発光を可能にすべきである。この要件を満たすシアニン色素は、ヘプタメチンシアニン色素（次の式Ａ）である。
【０００３】
【化１】
【０００４】
ポリメチン鎖の長さのため、ヘプタメチンシアニン色素は短波長吸収性のペンタ及びトリメチンシアニンに比べて化学安定性及び光安定性の低下を示す。インビボ用途のためには、メチン鎖の中央に環を形成することでヘプタメチンシアニン色素の安定性を高めることが試みられた。
【０００５】
米国特許第６０８３４８５号及びその対応特許には、２．０以下のオクタノール−水分配係数を有するシアニン色素を用いるインビボ近赤外（ＮＩＲ）光学イメージング方法が開示されている。また、前記色素と、特定の細胞集団に結合し、或いはレセプターと選択的に結合し、或いは組織又は腫瘍中に集積する３０ｋＤａまでの分子量の「生物学的検出単位」とのコンジュゲートも開示されている。米国特許第６０８３４８５号の色素は、ポリリシン、デキストラン又はポリエチレングリコールのような巨大分子にコンジュゲートすることもできる。特定の色素コンジュゲートは開示されていない。
【０００６】
米国特許第５８９２０５６号には、次の式Ｂの色素が開示されている。
【０００７】
【化２】
【０００８】
式中、
Ｒ1はＣ1-18アルキル、アリール、スルホアルキル、カルボキシアルキル、スルファトアルキル、アシルオキシアルキル、ジアルキルアミノアルキレン、シクロアミノアルキレン、アシル又はアルケニルであり、
Ｒ2はＣ1-18アルキルであり、
Ｒ3及びＲ4はＨ又はＣ1-18アルキルであり、
Ｒ5はＨ、ＮＯ2、カルボキシル、スルホ、ＯＨ、Ｈａｌ、Ｃ1-18アルコキシ、チオアルコキシ、オキシアルキル、アシル、アルキル、アリール又はアミノ基であり、
いずれか２つのＲ5基、又はＲ4及びＲ5、又はＲ1及びＲ4は、一緒になって置換又は非置換のアリール環、ヘテロアリール環、脂肪族環又は複素環を形成することができ、
Ｚは、カルボシアニン色素、アザカルボシアニン色素、ヘミシアニン色素、スチリル色素、ジアザカルボシアニン色素、トリアザカルボシアニン色素、ジアザヘミシアニン色素、ポリメチンシアニン色素、アザポリメチンシアニン色素、ホロポーラー色素、インドシアニン色素、メロシアニン色素、スクアリリウム色素及びジアザヘミシアニン色素からなる群から選択される色素を完成するために必要な原子を表す。
【０００９】
米国特許第５８９２０５６号には、色素と生物学的ターゲティング部分とのコンジュゲートについても、かかるコンジュゲートの製造に適した色素の官能化形態についても開示されていない。また、米国特許第５８９２０５６号には、インビボ光学イメージング用途についても開示されていない。
【００１０】
特開２００５−２２００４５号（コニカミノルタエムジー株式会社）には、特に癌のインビボ光学イメージングのための、マイクロキャリヤー（特にリポソーム）に内包された色素が開示されている。記載されている色素は、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）及び米国特許第５８９２０５６号に開示された色素（４以上のスルホン酸置換基を有するものを含む）を含むシアニン色素である。特開２００５−２２００４５号には、記載された色素のいずれかと生物学的ターゲティング分子とのコンジュゲートは開示されていない。
【００１１】
米国特許出願公開第２００５／０１３６００７号には、次の式Ｃのシアニン化合物を含む近赤外蛍光造影剤が開示されている。
【００１２】
【化３】
【００１３】
式中、
ＲはＨ、低級アルキル基又は芳香族基であり、
Ｒ1及びＲ2は各々が水溶化基を含む脂肪族基であり、
Ｒ3及びＲ4は各々が低級アルキル基または芳香族基であるが、Ｒ3及びＲ4が互いに結合して炭素環を形成してもよく、
Ｌ1〜Ｌ6は各々がメチン基であるが、ｎが１又は２である場合にはＬ6がＲ3又はＲ4と結合して炭素環を形成してもよく、ｎが０である場合にはＬ4がＲ3又はＲ4と結合して炭素環を形成してもよく、
Ｚ1及びＺ2は各々が五員環又は六員環を形成するのに必要な非金属原子群であり、
Ｘは分子の電荷を中和するのに必要な対イオンであり、
ｐは分子の電荷を中和するのに必要なＸの数であり、
ｍは２〜４の整数であり、
ｎは０〜２の整数である。
【００１４】
米国特許出願公開第２００５／０１３６００７号には、色素と生物学的ターゲティング部分とのコンジュゲートについても、かかるコンジュゲートの製造に適した色素の官能化形態についても開示されていない。
【先行技術文献】
【００１５】
【特許文献】特開２００５−２２００４５号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、インビボでの光学イメージングに適した光物理的性質を有するジヒドロカルバゾリウム色素を提供する。本発明の色素は、蛍光性であると共に、シアニン色素Ｃｙ７に匹敵する性質を有することが判明した。このような蛍光性は、先行技術におけるジヒドロカルバゾリウム色素に関しては報告されていない。
【００１７】
本発明のジヒドロカルバゾリウム色素では、複素環を結合するメチン鎖の２つの炭素原子が六員環の一部をなしている。米国特許出願公開第２００５／０１３６００７号の色素では、メチン鎖の１つの炭素原子のみが縮合環の一部をなしている。本発明の色素は、水溶化基及び生物学的ターゲティング部分へのコンジュゲーションを容易にする基で官能化されている。それにより、本発明の色素は各種の生物学的ターゲティング分子とのコンジュゲートとしてインビボでの光学イメージングのために有用である。本発明の色素はまた、対応するヘプタメチンシアニン色素より高い量子収量を有している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
第１の態様では、本発明は、哺乳類の身体のインビボ光学イメージングに適したイメージング剤であって、次の式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤を提供する。
［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−ＣｚD
（Ｉ）
式中、
ＢＴＭは生物学的ターゲティング部分であり、
ＣｚDは次の式ＩＩのジヒドロカルバゾリウム色素であり、
【００１９】
【化４】
【００２０】
（式中、
Ｒ1、Ｒ2及びＲ11〜Ｒ16は各々独立にＲa基であり、
Ｒ3〜Ｒ10は各々独立にＨ、−ＳＯ3Ｍ1、−ＣＯ2Ｍ1、Ｃ2-7カルボキシアルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又は１〜３のヒドロキシ基で任意に置換されたＣ2-7カルボキサミドアルキルであり、式中のＭ1は独立にＨ又はＢcであり、Ｂcは生体適合性陽イオンであり、
Ｒ17〜Ｒ20は各々独立にＨ又はＲa基であり、
ＲaはＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル、Ｃ2-7カルボキシアルキル又はＣ1-4ヒドロキシアルキルである。）
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数であり、
ジヒドロカルバゾリウム色素は２以上のスルホン酸置換基を含むことを条件とする。
【００２１】
「イメージング剤」という用語は、完全な（即ち、無傷の）哺乳類の身体の関心領域のインビボでの光学イメージングを行うために適した化合物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒト被験体である。イメージングは侵襲的（例えば、手術中検査又は内視鏡検査）であってもよいし、或いは非侵襲的であってもよい。イメージングは、任意には（例えば、内視鏡器具の生検チャネルを通しての）生検又は（例えば、腫瘍縁の同定による手術処置中の）腫瘍切除を容易にするために使用できる。
【００２２】
式Ｉのコンジュゲートはインビボイメージングのために適するが、それはインビトロ用途（例えば、生物学的試料中のＢＴＭを定量するアッセイ又は組織試料中のＢＴＭの可視化）も有し得る。好ましくは、イメージング剤はインビボイメージングのために使用される。
【００２３】
「生物学的ターゲティング部分」（ＢＴＭ）という用語は、投与後、哺乳類の身体の特定部位に選択的に取り込まれるか又は特定部位に局在する化合物を意味する。かかる部位は、例えば、特定の疾患状態に関係するものであるか、或いは器官又は代謝過程がいかに機能しているかを表すものであり得る。生物学的ターゲティング部分は、好ましくは、線状ペプチド、環状ペプチド又はこれらの組合せであり得る３〜１００量体ペプチド、ペプチド類似体、ペプトイド又はペプチド模倣体、単一のアミノ酸、酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト（部分アゴニストを含む）又は酵素阻害剤、レセプター結合化合物（レセプター基質、アンタゴニスト、アゴニスト又は基質を含む）、オリゴヌクレオチド、或いはオリゴＤＮＡフラグメント又はオリゴＲＮＡフラグメントからなる。
【００２４】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合）によって連結された（下記に定義するような）２以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質がペプチド的でない（即ち、いかなるペプチド結合（つまり、アミノ酸間のアミド結合）も含まない）生物学的活性化合物をいう。ここでは、ペプチド模倣体という用語は広い意味で使用され、性質が完全にはペプチド的でない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。「ペプチド類似体」という用語は、下記に記載するような１種以上のアミノ酸類似体を含むペプチドをいう。“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ”，Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ Ｅ２２ｃ，Ｔｈｉｅｍｅも参照されたい。
【００２５】
「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体）、したがってキラルなものであるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸に関する通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（即ち、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターは当業者にとって公知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールを包含する［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）を参照されたい］。
【００２６】
ＢＴＭが酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト、酵素阻害剤又はレセプター結合化合物である場合、それは好ましくは非ペプチドであり、さらに好ましくは合成品である。「非ペプチド」という用語は、いかなるペプチド結合（即ち、２つのアミノ酸残基間のアミド結合）も含まない化合物を意味する。好適な酵素の基質、アンタゴニスト、アゴニスト又は阻害剤には、グルコース及びグルコース類似体（例えば、フルオロデオキシグルコース）、脂肪酸、或いはエラスターゼ、アンギオテンシンＩＩ又はメタロプロテイナーゼ阻害剤がある。好ましい非ペプチドのアンギオテンシンＩＩアンタゴニストはロサルタンである。好適な合成レセプター結合化合物には、エストラジオール、エストロゲン、プロゲスチン、プロゲステロン及び他のステロイドホルモン、ドーパミンＤ−１又はＤ−２レセプター用リガンド及びトロパンのようなドーパミン輸送体用リガンド、並びにセロトニンレセプター用リガンドがある。
【００２７】
「スルホン酸置換基」という用語は、式−ＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）の置換基を意味する。−ＳＯ3Ｍ1置換基は炭素原子に共有結合され、炭素原子はアリール（例えば、Ｒ3〜Ｒ10基）又はアルキル（即ち、スルホアルキル基）であり得る。「生体適合性陽イオン」（Ｂc）という用語は、イオン化して負に帯電した基（この場合にはスルホネート基）と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳類の身体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
【００２８】
式ＩＩのジヒドロカルバゾリウム色素（ＣｚD）は、緑色ないし近赤外波長（５００〜１２００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍ）の光を用いる光学イメージング方法で直接又は間接に検出できる蛍光色素又は発色団である。好ましくは、ＣｚDは蛍光性を有する。
【００２９】
式Ｉのリンカー基−（Ａ）m−の役割の１つは、ＣｚDをＢＴＭの活性部位から遠ざけることにあると想定されている。これが特に重要であるのは、ＣｚDが比較的バルキーであり、したがって不都合な立体相互作用が起こり得るからである。これは、ＣｚDが活性部位から離れて位置する自由を与えるたわみ性（例えば、単純アルキル鎖）及び／又はＣｚDを活性部位から離すように定位させる剛性（例えば、シクロアルキル又はアリールスペーサー）を組み合わせることで達成できる。リンカー基の性質はまた、イメージング剤の生体分布を調整するためにも使用できる。即ち、例えばリンカー中にエーテル基を導入することは、血漿タンパク質結合を最小限に抑えるために役立つ。−（Ａ）m−がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位又は１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、リンカー基はインビボでイメージング剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整するために機能し得る。かかる「バイオモディファイアー」リンカー基は、バックグラウンド組織（例えば、筋肉又は肝臓）及び／又は血液からのイメージング剤のクリアランスを促進することで、バックグラウンド妨害を少なくして一層良好な診断画像を与えることができる。バイオモディファイアーリンカー基はまた、特定の排泄経路（例えば、肝臓経由ではなく腎臓経由の排泄）を有利にするためにも使用できる。
【００３０】
「糖」という用語は、単糖、二糖又は三糖を意味する。好適な糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース及びラクトースがある。任意には、アミノ酸への容易なカップリングを可能にするように糖を官能化することができる。即ち、例えばアミノ酸のグルコサミン誘導体は、ペプチド結合を介して他のアミノ酸にコンジュゲートすることができる。（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社から商業的に入手できる）アスパラギンのグルコサミン誘導体はこれの一例である。
【００３１】
【化５】
【００３２】
式Ｉは、−（Ｌ）n［ＣｚD］部分がＢＴＭの任意適宜の位置に結合し得ることを示す。−（Ｌ）n［ＣｚD］部分に対して好適なかかる位置は、インビボで活性部位への結合に係わるＢＴＭ部分から離れた位置にあるように選択される。式Ｉの［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−部分は、式ＩＩのＣｚDの任意適宜の位置に結合し得る。［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−部分は、既存の置換基に取って代わるか、或いはＣｚDの既存の置換基に共有結合する。［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−部分は、好ましくは、第５の態様（下記）で説明されるようにＣｚDのカルボキシアルキル置換基を介して結合する。
【００３３】
好ましい特徴
イメージング剤の分子量は、好適には３００００ダルトン以下である。好ましくは、分子量は１０００〜２００００ダルトンの範囲内にあり、最も好ましくは２０００〜１８０００ダルトンの範囲内にあり、２５００〜１６０００ダルトンが特に好ましい。
【００３４】
ＢＴＭは合成品又は天然品であり得るが、好ましくは合成品である。「合成品」という用語はそれの通常の意味を有し、即ち、天然の供給源（例えば、哺乳類の身体）から単離されるものではなく人造のものを意味する。かかる化合物は、それの製造及び不純物プロファイルを完全に制御できるという利点を有している。したがって、天然由来のモノクローナル抗体及びそのフラグメントは、本明細書中で使用する「合成品」という用語の範囲外にある。ＢＴＭは、好ましくは３〜１００量体ペプチド、酵素基質、酵素アンタゴニスト及び酵素阻害剤から選択される。ＢＴＭは、最も好ましくは３〜１００量体ペプチド又はペプチド類似体である。ＢＴＭがペプチドである場合、それは好ましくは４〜３０量体ペプチドであり、最も好ましくは５〜２８量体ペプチドである。
【００３５】
式ＩＩ中、好ましくはＲ19及びＲ20の少なくとも一方がＨであり、最も好ましくは両方がＨである。
【００３６】
Ｒ3〜Ｒ10のカルボキサミドアルキル置換基は、好ましくは次の式を有する。
−（ＣＨＲ'）xＣＯＮＲ'2
式中、ｘは１〜６の値を有する整数であり、各Ｒ'は独立にＨ、Ｃ1-3アルキル又はＣ1-3ヒドロキシアルキルである。好ましいかかる置換基は−（ＣＨ2）xＣＯＮＲ'2（式中、ｘ及びＲ'は上記に定義した通りである。）である。
【００３７】
ジヒドロカルバゾリウム色素（ＣｚD）は、好ましくは、（Ｒ3〜Ｒ10の）−ＳＯ3Ｍ1基及び（ＲaがＣ1-4スルホアルキルであるように選択された場合には）スルホアルキル基から選択される全部で３又は４のスルホン酸置換基を有する。好ましくは、ＣｚDは１〜３のスルホアルキル置換基を含み、最も好ましくは、ＣｚDのスルホン酸置換基の少なくとも２つはスルホアルキル基であるように選択される。スルホアルキル基は、好ましくはＲ1、Ｒ2、Ｒ15又はＲ18の位置にある。式ＩＩ中、スルホアルキル基は好ましくは式−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、ｋは１〜４の値を有する整数であり、Ｂcは（上記に定義したような）生体適合性陽イオンである。）を有する。ｋは好ましくは３又は４である。
【００３８】
式ＩＩ中のＲ11及びＲ12は、好ましくは、一方がＲb基（式中、ＲbはＣ1-4スルホアルキル又はＣ2-7カルボキシアルキルである。）であり、他方がＣＨ3であるように選択される。
【００３９】
式Ｉの［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−部分は、好ましくは式ＩＩのＣｚDのＲ1、Ｒ2、Ｒ11又はＲ17の位置、さらに好ましくはＲ1、Ｒ11又はＲ17の位置、最も好ましくはＲ1又はＲ11の位置に結合している。
【００４０】
特に好ましいＣｚD色素は次の式ＩＩａを有する。
【００４１】
【化６】
【００４２】
式中、
Ｒ1a及びＲ2aは各々独立にＲb基であり、
Ｒ11a及びＲ12aは各々独立にＣＨ3又はＲb基であり、
Ｒ13a〜Ｒ15aは各々独立にＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ又はＣ2-5カルボキシアルキルであり、
Ｒ17a及びＲ18aは各々独立にＨ又はＲb基であり、
Ｒ21及びＲ22は各々独立に−ＳＯ3Ｍ1又は−ＣＯ2Ｍ1であり、
Ｒb及びＭ1は上記に定義した通りであり、
各ｎは独立に０、１又は２である。
【００４３】
式ＩＩａ中、好ましくはＲ17a及びＲ18aの少なくとも一方がＨである。最も好ましくは、Ｒ17a＝Ｒ18a＝Ｈである。式ＩＩａ中、好ましくはＲ1a及びＲ2aの少なくとも一方がＣ1-4スルホアルキルであり、最も好ましくは両方がＣ1-4スルホアルキルである。式ＩＩａ中、好ましくはＲ11a及びＲ12aの一方がＲb基（式中、Ｒbは上記に定義した通りである。）であり、他方がＣＨ3である。
【００４４】
ＢＴＭがペプチドである場合、好ましいかかるペプチドには以下のものがある。
−ソマトスタチン、オクトレオチド及び類似体。
−ＳＴレセプターに結合するペプチド（ここで、ＳＴとは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の微生物によって産生される耐熱性毒素をいう。）。
−ラミニンフラグメント、例えば、ＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＩＫＶＡＶ、ＬＲＥ及びＫＣＱＡＧＴＦＡＬＲＧＤＰＱＧ。
−白血球集積部位をターゲティングするためのＮ−ホルミルペプチド。
−血小板第４因子（ＰＦ４）及びそれのフラグメント。
−例えば血管形成をターゲティングし得るＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）含有ペプチド［Ｒ．Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７ Ｊｕｎ；１５（６）：５４２−６］、［Ｅ．Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．１９９７ Ｍａｙ；５１（５）：１４１３−７］。
−α2−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン又はトロンボスポンジンのペプチドフラグメント。α2−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン及びトロンボスポンジンのアミノ酸配列は、以下の参考文献中に見出すことができる。α2−抗プラスミン前駆体［Ｍ．Ｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０２，１０３３（１９８７）］、β−カゼイン［Ｌ．Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１３９，１９３（１９９４）］、フィブロネクチン［Ａ．Ｇｕｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０７，１４５（１９９６）］、トロンボスポンジン１前駆体［Ｖ．Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８３，５４４９（１９８６）］、Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，１９５（１９８４）。
−アンギオテンシンＩＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（Ｅ．Ｃ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９７９，Ｖｏｌ ２２，９，１０３８−１０４４）及び［Ｓａｒ，Ｉｌｅ］アンギオテンシンＩＩ：Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（Ｒ．Ｋ．Ｔｕｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７２，１７７，１２０３）のようなアンギオテンシンの基質又は阻害剤であるペプチド。
−アンギオテンシンＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ。
【００４５】
ＢＴＭがペプチドである場合、ペプチドの一方又は両方の末端（好ましくは両方の末端）に代謝抑制基（ＭIG）がコンジュゲートされる。このようにして両方のペプチド末端を保護することは、インビボイメージング用途のために重要である。さもないと、急速な代謝の結果としてＢＴＭペプチドに対する選択的結合親和性が失われると予想されるからである。「代謝抑制基」（ＭIG）という用語は、アミノ末端又はカルボキシ末端におけるＢＴＭペプチドの酵素（特にカルボキシペプチダーゼのようなペプチダーゼ）代謝を阻止又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基はインビボ用途のために特に重要であって、これらは当業者にとって公知であり、好適にはペプチドアミン末端に関してはＮ−アシル化基−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＲG（式中、アシル基−（Ｃ＝Ｏ）ＲGはＣ1-6アルキル基及びＣ3-10アリール基から選択されるＲGを有するか、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位を含む。）から選択される。好適なＰＥＧ基は、リンカー基（Ｌ）に関して下記に記載される。好ましいかかるＰＥＧ基は、式Ｂｉｏ１又はＢｉｏ２（下記）のバイオモディファイアーである。好ましいかかるアミノ末端ＭIG基はアセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。
【００４６】
ペプチドカルボキシル末端に関して好適な代謝抑制基には、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位がある。ＢＴＭペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基にとって好適なＭIG基は、アミノ酸残基の末端アミンをＣ1-4アルキル基（好ましくはメチル基）でＮ−アルキル化したものである。好ましいかかるＭIG基はカルボキサミド又はＰＥＧであり、最も好ましいかかる基はカルボキサミドである。
【００４７】
いずれか一方又は両方のペプチド末端がＭIG基で保護された場合、−（Ｌ）n［ＣｚD］部分はＭIG基に任意に結合できる。好ましくは、少なくとも一方のペプチド末端はＭIG基を有しておらず、その位置に−（Ｌ）n［ＣｚD］部分が結合することでそれぞれ次の式ＩＶａ又はＩＶｂの化合物が得られる。
［ＣｚD］−（Ｌ）n−［ＢＴＭ］−Ｚ2 （ＩＶａ）
Ｚ1−［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−［ＣｚD］ （ＩＶｂ）
式中、
Ｚ1はＢＴＭペプチドのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
Ｚ2はＢＴＭペプチドのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは（上記に定義したような）生体適合性陽イオンである。）又はＭIGである。
【００４８】
式ＩＶａ及びＩＶｂ中、Ｚ1及びＺ2は好ましくは共に独立にＭIGである。Ｚ1及びＺ2にとって好ましいかかるＭIG基は、ペプチド末端に関して上記に記載した通りである。いずれかのペプチド末端におけるＢＴＭペプチドの代謝抑制はこのように−（Ｌ）n［ＣｚD］部分を結合することによっても達成できるが、−（Ｌ）n［ＣｚD］自体は本発明のＭIGの定義範囲外にある。
【００４９】
ＢＴＭペプチドは、任意には、ＣｚDの容易なコンジュゲーションに適した側鎖を有しかつリンカー基（Ｌ）のＡ残基の一部をなす１以上の追加アミノ酸残基を含み得る。好適なかかるアミノ酸残基には、アミン官能化ＣｚD色素とのコンジュゲーションのためのＡｓｐ又はＧｌｕ残基、或いはカルボキシ官能化又は活性エステル官能化ＣｚD色素とのコンジュゲーションのためのＬｙｓ残基がある。ＣｚDのコンジュゲーションのための追加アミノ酸残基は、好適にはＢＴＭペプチドの結合領域から離れて位置しており、好ましくはＣ末端又はＮ末端に位置している。好ましくは、コンジュゲーションのためのアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。
【００５０】
合成リンカー基（Ｌ）が存在する場合、それは好ましくは［ＢＴＭ］及びＣｚDへのコンジュゲーションを容易にする末端官能基を含む。好適なかかる基（Ｑa）は第５の態様（下記）で記載する。Ｌが１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、アミノ酸残基は好ましくはグリシン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びセリンから選択される。ＬがＰＥＧ部分からなる場合、それは好ましくは次の式Ｂｉｏ１又はＢｉｏ２の単分散ＰＥＧ様構造のオリゴマー化で導かれる単位からなる。
【００５１】
【化７】
【００５２】
かかるＰＥＧ様構造は、式Ｂｉｏ１（式中、ｐは１〜１０の整数である。）の１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸であり得る。別法として、式Ｂｉｏ２のプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造も使用できる。
【００５３】
【化８】
【００５４】
式中、ｐは式Ｂｉｏ１に関して定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数である。式Ｂｉｏ２中、ｐは好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。
【００５５】
リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖からなっていない場合、好ましいＬ基は、２〜１０の原子、最も好ましくは２〜５の原子、特に好ましくは２又は３の原子を含む−（Ａ）m−部分を構成する結合原子の主鎖を有している。２つの原子を含む最小リンカー基主鎖は、いかなる望ましくない相互作用も最小限に抑えられるようにＣｚDを十分に引き離すという利点を与える。
【００５６】
商業的に入手できないＢＴＭペプチドは、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ａｎｄ Ｅ．Ｇｉｒａｌｄ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されているような固相ペプチド合成法によって合成できる。
【００５７】
イメージング剤は以下のようにして製造できる。
【００５８】
ＢＴＭに対するＣｚDのコンジュゲーションを容易にするため、ＣｚDには好適には反応性官能基（Ｑa）が結合されている。Ｑa基は、ＢＴＭの相補的な官能基と反応することでＣｚDとＢＴＭとの間に共有結合を形成するように設計されている。ＢＴＭの相補的な官能基は、ＢＴＭの固有部分であってもよいし、或いは当技術分野で公知のように二官能性基での誘導体化の使用によって導入してもよい。表１は、反応基及びその相補的な対応基の例を示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語は、良好な脱離基であり、したがってアミンのような求核性化合物との一層容易な反応を可能にするように設計されたカルボン酸のエステル誘導体を意味する。好適な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、ｐ−ニトロフェノール及びヒドロキシベンゾトリアゾールである。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールエステルである。
【００６１】
Ｑａがアジド又はアルキンである場合、コンジュゲーション反応はトリアゾール環を形成する「クリック化学」を含んでいる。コンジュゲート形成で使用されるクリック化学の詳細は、“ＣｌｉｃｋＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ”［Ｊ．Ｌａｈａｎｎ（Ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ（２００９）］中の“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｖｉａ Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｃ．Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｐａｇｅｓ ３５５−３７８に記載されている。アルキン基又はアジド基による生物学的ターゲティング分子の官能化のためのさらなるアプローチは、Ｎｗｅ ｅｔ ａｌ［Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，２４（３），２８９−３０２（２００９）］によって記載されている。Ｌｉ ｅｔ ａｌは、Ｎ3−Ｌ1−ＣＯ2Ｈ型（式中、Ｌ1は−（ＣＨ2）4−である。）の化合物の合成法及びアミン含有ＢＴＭへのコンジュゲートのためのそれの使用を記載している［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１８（６），１９８７−１９９４（２００７）］。Ｈａｕｓｎｅｒ ｅｔ ａｌは、Ｎ3−Ｌ1−ＣＯ2Ｈ（式中、Ｌ1は−（ＣＨ2）4−である。）についての関連方法論を記載している［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５１（１９），５９０１−５９０４（２００８）］。Ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，２０（７），１２８１−１２９５（２００９）］は、アジド側鎖を有する非天然アミノ酸及び続くクリックコンジュゲーションのためのペプチド又はタンパク質中への部位特異的組込みを記載している。
【００６２】
タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などのＢＴＭ中に存在する官能基の例には、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル（アルデヒド及びケトンを含む）並びにチオホスフェートがある。好適なＱa基は、カルボキシル、活性化エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホラミダイトから選択できる。好ましくは、Ｑaはカルボン酸の活性化エステル、イソチオシアネート、マレイミド又はハロアセトアミドである。
【００６３】
相補基がアミン又はヒドロキシルである場合、Ｑaは好ましくは活性化エステルであり、好ましいかかるエステルは上記に記載した通りである。ＣｚD上の好ましいかかる置換基は、５−カルボキシペンチル基の活性化エステルである。相補基がチオールである場合、Ｑaは好ましくはマレイミド基又はヨードアセトアミド基である。
【００６４】
光学色素を生物学的分子にコンジュゲートするための一般的方法は、Ｌｉｃｈａ ｅｔ ａｌ［Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］によって記載されている。本発明で使用するためのペプチド、タンパク質及びオリゴヌクレオチド基質は、末端位置で標識することができ、或いは別法として１以上の内部位置で標識することができる。蛍光色素標識試薬を用いるタンパク質標識の総説及び例に関しては、“Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７、及び“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ − Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ａｓｌａｍ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｎｔ，Ａ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌｔｄ．（１９９８）を参照されたい。合成ペプチドにおいて部位特異的標識を達成するためのプロトコルが利用できる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。
【００６５】
好ましくは、イメージング剤の製造方法は、
（ｉ）ＢＴＭのアミン官能基を式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＣｚD］の化合物と反応させるか、
（ｉｉ）ＢＴＭのカルボン酸又は活性化エステル官能基を式Ｙ2−（Ｌ）n−［ＣｚD］の化合物と反応させるか、或いは
（ｉｉｉ）ＢＴＭのチオール基を式Ｙ3−（Ｌ）n−［ＣｚD］の化合物と反応させる
ことを含んでいる。式中、
ＢＴＭ、ＭIG、Ｌ、ｎ及びＣｚDは上記に定義した通りであり、
Ｙ1はカルボン酸基、活性化エステル基、イソチオシアネート基又はチオシアネート基であり、
Ｙ2はアミン基であり、
Ｙ3はマレイミド基である。
【００６６】
Ｙ2は、好ましくは第一又は第二アミン基であり、最も好ましくは第一アミン基である。段階（ｉｉｉ）では、ＢＴＭのチオール基は好ましくはシステイン残基に由来する。
【００６７】
段階（ｉ）〜（ｉｉｉ）では、ＢＴＭはＣｚD誘導体と反応する可能性がある他の官能基を任意に有し得るが、これらは所望の部位のみで化学反応が選択的に起こるように適当な保護基で保護される。「保護基」という用語は、望ましくない化学反応を阻止又は抑制するが、分子の残部を変質させない程度に温和な条件下で問題の官能基から脱離させ得るのに十分な反応性を有するように設計された基を意味する。脱保護後には所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者にとって公知であり、好適にはＢｏｃ（ここでＢｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｆｍｏｃ（ここでＦｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである。）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］及びＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から適宜に選択される。好適なチオール保護基は、Ｔｒｔ（トリチル）、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、メトキシベンジル、メチルベンジル及びＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）である。さらに他の保護基の使用は、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載されている。好ましいアミン保護基はＢｏｃ及びＦｍｏｃであり、最も好ましくはＢｏｃである。好ましいアミン保護基はＴｒｔ及びＡｃｍである。
【００６８】
本発明のＣｚD色素は、実施例に記載されるようにして製造できる。
【００６９】
光学レポーター色素をアミノ酸及びペプチドにコンジュゲートする方法は、Ｌｉｃｈａ（上記参照）並びにＦｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８，７５１−７５６（１９９７）］、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ［ｉｂｉｄ，１３，６０５−６１０（２００２）］及びＺａｈｅｅｒ［Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，１（４），３５４−３６４（２００２）］によって記載されている。リンカー基（Ｌ）をＢＴＭにコンジュゲートする方法は、色素のみをコンジュゲートする方法（上記参照）と類似の化学作用を使用し、当技術分野で公知である。
【００７０】
第２の態様では、本発明は、哺乳動物への投与に適した形態で第１の態様のイメージング剤を生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬組成物を提供する。
【００７１】
「生体適合性キャリヤー」は、組成物が生理学的に認容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳類の身体に投与できるようにして）イメージング剤を懸濁又は溶解できる流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水又は等張食塩水である。
【００７２】
イメージング剤及び生体適合性キャリヤーはそれぞれ、注射器又はカニューレによる溶液の追加及び抜取りを許しながら、無菌保全性及び／又は放射能安全性の維持、さらに任意には不活性ヘッドスペースガス（例えば、窒素又はアルゴン）の維持を可能にする密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。好ましいかかる容器は、気密クロージャーを（通例はアルミニウムからなる）オーバーシールと共にクリンプ加工した隔壁密封バイアルである。クロージャーは、無菌保全性を維持しながら皮下注射針による１回又は数回の穿刺に適したもの（例えば、クリンプ加工した隔壁シールクロージャー）である。かかる容器は、（例えば、ヘッドスペースガスの変更又は溶液のガス抜きのために）所望される場合にはクロージャーが真空に耐え得ると共に、酸素又は水蒸気のような外部大気ガスの侵入を許すことなしに減圧のような圧力変化にも耐え得るという追加の利点を有している。
【００７３】
好ましい複数用量容器は、複数の患者用量を含む（例えば、容積１０〜３０ｃｍ3の）単一のバルクバイアルからなり、したがって臨床的状況に合わせて製剤の実用寿命中に様々な時間間隔で１回分の患者用量を臨床グレードの注射器中に抜き取ることができる。予備充填注射器は１回分のヒト用量又は「単位用量」を含むように設計され、したがって好ましくは臨床用に適した使い捨て注射器又は他の注射器である。本発明の医薬組成物は、好ましくは１人の患者用に適した用量を有し、上述したような適当な注射器又は容器に入れて供給される。
【００７４】
かかる医薬組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、安定剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加賦形剤を任意に含むことができる。「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、任意には投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
【００７５】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳動物への投与のために許容し得る範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容し得る緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容し得る塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
【００７６】
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容し得る増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
【００７７】
第２の態様の医薬組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。第２の態様の医薬組成物は、好ましくは第３の態様に関して下記に記載するようなキットから製造される。
【００７８】
第３の態様では、本発明は、第２の態様の医薬組成物を製造するためのキットであって、当該キットは第１の態様のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬組成物を与えるキットを提供する。
【００７９】
その場合、イメージング剤及び上述したような他の任意賦形剤は、凍結乾燥粉末として適当なバイアル又は容器に入れて供給できる。かかる薬剤は、次いで所望の生体適合性キャリヤーを用いて再構成することで、哺乳動物への投与が可能な無菌で非発熱性の形態の医薬組成物を与えるように設計される。
【００８０】
イメージング剤の好ましい無菌固体形態は凍結乾燥固体である。無菌固体形態は、好ましくは医薬組成物に関して（上記に）記載したような医薬品用容器に入れて供給される。キットを凍結乾燥する場合、配合物は糖類（好ましくはマンニトール、マルトース及びトリシン）から選択される凍結保護剤を任意に含むことができる。
【００８１】
第４の態様では、本発明は次の式Ｉのコンジュゲートを提供する。
［ＢＴＭ’］−（Ｌ）n−ＣｚD
（Ｉ）
式中、Ｌ、ｎ、ＢＴＭ及びＣｚD並びにこれらの好ましい態様は第１の態様で定義した通りである。
【００８２】
第４の態様のコンジュゲートは、式ＩＩ及び式ＩＩａのＣｚD色素を含む本発明のイメージング剤及び医薬組成物の製造に際して有用である。ＢＴＭ、Ｌ、ｎ並びに式ＩＩ及び式ＩＩａのＣｚD色素の好ましい態様は上述した通りである。かかるコンジュゲートは本発明の第１及び第５の態様に記載したようにして製造できる。
【００８３】
第５の態様では、本発明は、第４の態様のコンジュゲートの製造において有用な官能化ジヒドロカルバゾリウム色素（ＣｚD）であって、ＣｚDは第１の態様で定義された式ＩＩ又は式ＩＩａを有すると共に、前記ＣｚDはさらにＱa基（式中、ＱaはＢＴＭへのコンジュゲーションに適した反応性官能基である。）を含む官能化色素を提供する。
【００８４】
「反応性官能基」（Ｑa）及びその好ましい実施形態は、第１の態様（上記）に記載した通りである。
【００８５】
第６の態様では、本発明は、哺乳類の身体のインビボ光学イメージング方法であって、第１の態様のイメージング剤又は第２の態様の医薬組成物を用いてインビボでＢＴＭの局在部位の画像を得る段階を含んでなる方法を提供する。
【００８６】
「光学イメージング」という用語は、緑色ないし近赤外領域（波長５００〜１２００ｎｍ）の光との相互作用に基づいて、疾患の検出、ステージング又は診断、疾患進展の追跡或いは疾患治療の追跡のための画像を形成する任意の方法を意味する。光学イメージングはさらに、いかなる装置も使用しない直接可視化並びに各種スコープ、カテーテル及び光学イメージング装置（例えば、断層撮影表示用のコンピューター支援ハードウェア）のような装置の使用を伴う直接可視化のためのあらゆる方法を包含する。かかるモダリティ及び測定技法には、特に限定されないが、ルミネセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡検査、光音響イメージング、音響光学イメージング、スペクトル分析、反射スペクトル分析、干渉分析、コヒーレンス干渉分析、拡散光学断層撮影及び蛍光媒介拡散光学断層撮影（連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、並びに光の散乱、吸光、偏光、ルミネセンス、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定がある。これらの技法のさらなる詳細は、Ｔｕａｎ Ｖｏ−Ｄｉｎｈ（ｅｄｉｔｏｒ）：“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（２００３），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣ、Ｍｙｃｅｋ ＆ Ｐｏｇｕｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）：“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”（２００３），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、及びＳｐｌｉｎｔｅｒ ＆ Ｈｏｐｐｅｒ：“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ”（２００７），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣに示されている。
【００８７】
緑色ないし近赤外領域の光は、好適には５００〜１２００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍの波長を有する。光学イメージング方法は、好ましくは蛍光内視鏡検査である。第６の態様の哺乳類の身体は、好ましくは人体である。イメージング剤の好ましい実施形態は、第１の態様に関して（上記に）記載した通りである。特に、使用するＣｚD色素は蛍光性であることが好ましい。
【００８８】
第６の態様の方法では、イメージング剤又は医薬組成物は好ましくは前記哺乳類の身体に予め投与されている。「予め投与されている」とは、臨床医の関与の下でイメージング剤を例えば静脈内注射によって患者に投与する段階がイメージングに先立って既に実施されていることを意味する。この実施形態は、ＢＴＭが関係している哺乳類の身体の疾患状態のインビボ診断イメージング用の診断剤を製造するために、第１の実施形態のイメージング剤を使用することを含んでいる。
【００８９】
第６の態様の好ましい光学イメージング方法は、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）である。ＦＲＩでは、本発明のイメージング剤を診断すべき被験体に投与し、次いで被験体の組織表面を励起光（通常は連続波（ＣＷ）励起）で照明する。光はイメージング剤のＣｚD色素を励起する。励起光によって生じるイメージング剤からの蛍光を、蛍光検出器を用いて検出する。好ましくは、戻る光を濾光することで蛍光成分を（単独に又は部分的に）分離する。蛍光から画像を形成する。通常、最小限の処理が実施され（寿命、量子収量などの光学パラメーターを計算するためのプロセッサーは使用されない）、画像は蛍光強度をマップする。イメージング剤は、疾患領域に集中して高い蛍光強度を生み出すように設計されている。したがって、疾患領域は蛍光強度画像中に正のコントラストを生み出す。画像は好ましくはＣＣＤカメラ又はチップを用いて取得される結果、リアルタイムイメージングが可能である。
【００９０】
励起用の波長は使用する特定のＣｚD色素に応じて変化するが、本発明の色素に関しては通例５００〜１２００ｎｍの範囲内にある。励起光を発生するための装置は、レーザー（例えば、イオンレーザー、色素レーザー又は半導体レーザー）、ハロゲン光源或いはキセノン光源のような通常の励起光源であり得る。任意には、各種の光学フィルターを用いて最適の励起波長を得ることができる。
【００９１】
好ましいＦＲＩ方法は下記の段階を含んでいる。即ち、
（ｉ）哺乳類の身体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ｉｉ）ＣｚDの励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでいる。段階（ｉ）では、励起光は好ましくは連続波（ＣＷ）の性質を有する。段階（ｉｉｉ）では、検出された光は好ましくは濾光される。特に好ましいＦＲＩ方法は蛍光内視鏡検査である。
【００９２】
第６の態様の別のイメージング方法は、ＦＤＰＭ（周波数ドメイン光子移動）を使用する。これは、組織内における色素の検出深度が大きいことが重要である場合、連続波（ＣＷ）方法に比べて利点を有する［Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］。かかる周波数／時間ドメインイメージングのためには、ＣｚDが、画像化すべき病変の組織深度及び使用する計装のタイプに応じて変調できる蛍光特性を有するならば有利である。
【００９３】
ＦＤＰＭ方法は下記のようなものである。即ち、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳類の身体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織は励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルは組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでいる。
【００９４】
段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくはイメージング剤の取込みに対応し、好ましくはさらにイメージング剤の投与前における組織の吸着係数及び散乱係数に対応する複数の量のマッピングを含んでいる。段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくは蛍光寿命、蛍光量子効率、蛍光収量及びイメージング剤取込みの１以上に対応する。蛍光特性は、好ましくは発光強度に無関係であり、またイメージング剤濃度に無関係である。
【００９５】
段階（ｃ）の定量化は、好ましくは、（ｉ）値の推定値を設定し、（ｉｉ）推定値の関数として計算発光を求め、（ｉｉｉ）計算発光を前記検出段階の発光と比較して誤差を求め、（ｉｖ）誤差の関数として蛍光特性の修正推定値を得ることを含んでいる。定量化は、好ましくは、組織の多重光散乱挙動をモデル化する数学的関係から値を求めることを含んでいる。第１のオプションの方法は、好ましくはさらに、前記蛍光特性の変動を検出することでインビボでの組織の代謝特性をモニターすることを含んでいる。
【００９６】
第６の態様の光学イメージングは、好ましくは哺乳類の身体の疾患状態の管理を支援するために使用される。「管理」という用語は、検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングでの使用を意味する。疾患状態は、好適にはイメージング剤のＢＴＭが関係するものである。イメージング用途には、好ましくは、カメラに基づく表面イメージング、内視鏡検査及び外科的誘導がある。好適な光学イメージング方法のさらなる詳細は、Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］によって総説されている。
【００９７】
第７の態様では、本発明は、哺乳類の身体の疾患状態の検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングを行う方法であって、第６の態様のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法を提供する。
【実施例】
【００９８】
以下に詳述する非限定的な実施例によって本発明を例証する。実施例１は、カルバゾリウム色素前駆体の合成法を示す。実施例２は、（水溶性を向上させるために）Ｎ−スルホアルキル基を有するカルバゾリウム色素前駆体の合成法を示す。実施例３は、（生物学的ターゲティング部分に対する色素のコンジュゲーションを容易にするために）カルボキシアルキル置換基を有するカルバゾリウム色素前駆体の合成法を示す。実施例４は、スルホアルキル置換基及びカルボキシアルキル置換基の両方を有するカルバゾリウム色素前駆体の合成法を示す。実施例５は、改良されたカルバゾリウム色素合成法に基づく予測例として本発明の３種の色素（色素１、色素２及び色素３）の合成法を示す。実施例６は、本発明のジヒドロカルバゾリウム色素がインビボ光学イメージングに適した光物理的性質を有するという証拠を示す。
【００９９】
略語
ＢＰ： 沸点
ＣＶ： カラム容積
ＤＣＭ： ジクロロメタン
ＤＭＦ： Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
ＨＰＬＣ： 高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ−ＭＳ： 液体クロマトグラフィー質量分析法
ＰＢＳ： リン酸塩緩衝食塩水
ＲＴ： 室温
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ： テトラヒドロフラン
ＴＬＣ： 薄層クロマトグラフィー
実施例１：カルバゾリウム前駆体（化合物１ｄ）の合成
【０１００】
【化９】
【０１０１】
（ｉ）１，３−ジメチルインドール（化合物１ａ）
１−メチル−１−フェニルヒドラジン（６ｇ、４９．２ｍｍｏｌ）を酢酸（１２ｍｌ）中のプロピオンアルデヒド（３．２ｇ、９ｍｍｏｌ）にゆっくりと添加した。添加中に熱が発生した。溶液をＣＥＭマイクロ波反応器（２００℃、３００Ｗ、保持時間１分）内で加熱した。高真空回転蒸発器で酢酸を除去し、得られた黒色のガム質をＤＣＭ（２０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル（５０ｇ）を添加し、試料を濃縮乾固した。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ペトロール４０〜６０，Ｂ＝ＤＣＭ，１〜４ＣＶ １０％Ｂ，１３ＣＶ ８０％Ｂ，４０ｇカラム）を行った。速く流出する大きいピークを集め、濃縮することで不純な黄色油状物を得た。生成物を高沸点画分から分離するように注意しながら、不純物質を分別蒸留（１００Ｐａ（１ｍＢａｒ）でＢＰ＝１９０℃）により精製することで、所望の物質（３．７ｇ、４４％）を得た。
【０１０２】
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）２．３３（３Ｈ，ｓ，メチル）、３．７３（３Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、６．８２（１Ｈ，ｓ，２−ＣＨ）、７．１（１Ｈ，ｄｄ，インドール）、７．２１（１Ｈ，ｄｄ，インドール）、７．２８（１Ｈ，ｄ，インドール）、７．５７（１Ｈ，ｄ，インドール）。
【０１０３】
（ｉｉ）４，４，４ａ，９−テトラメチル−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロカルバゾール−２−オン（化合物１ｂ）
１，３−ジメチルインドール（化合物１ａ、２００ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍｌ）に溶解し、氷水浴上で冷却した。硫酸（９７％、０．２ｍｌ）を添加し、１分後にメシチルオキシド（４０５ｍｇ、４．１４ｍｍｏｌ）を添加した。熱が発生し、撹拌を１／２時間続けた後、１時間かけて温度をＲＴまで上昇させた。反応物を冷却及び撹拌しながら、水（１０ｍｌ）中のＮａＨＣＯ3（１．２６７ｇ）懸濁液にゆっくりと添加し、ジエチルエーテル（３×２０ｍｌ）で抽出し、ＭｇＳＯ4上で乾燥した。蒸発によって得られた淡黄色の油状物をジエチルエーテル（２０ｍｌ）に溶解し、溶液をシリカゲル（約５ｇ）上で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ペトロール４０〜６０，Ｂ＝ＤＣＭ，１〜４ＣＶ ５％Ｂ乃至１０％Ｂ，１０ＣＶ １００％Ｂ，１３ＣＶ １００％Ｂ，１２０ｇカラム）によって１つの主要化学種を得たが、これを静置して結晶化することで所望の物質（３０２ｍｇ、９０％）を得た。
【０１０４】
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）０．８１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ 3）、１．０６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ 3）、１．４６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ 3 )、２．２０（１Ｈ，ｄ，３−ＣＨ）、２．３２（１Ｈ，ｄ，３−ＣＨ）、２．６２（３Ｈ，ｓ，Ｎ−ＣＨ 3）、２．７２（２Ｈ，ｍ，１−ＣＨ 2）、３．５５（１Ｈ，ｄｄ，９ａ−ＣＨ）、６．５４（１Ｈ，ｄ，８−ＣＨ）、６．７６（１Ｈ，ｄｄ，６−ＣＨ）、７．０６（１Ｈ，ｄ，５−ＣＨ）、７．１４（１Ｈ，ｄｄ，７−ＣＨ）。
【０１０５】
（ｉｉｉ）２−メチレン−４，４，４ａ，９−テトラメチル−１，２，３，４，５，６−テトラヒドロカルバゾール（化合物１ｃ）
化合物１ｂ（８７０ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（２ｍｌ）に溶解し、−４０℃に冷却した。ピリジン（１０μｌ）を添加し、次いでテッベ（Ｔｅｂｂｅ）試薬の溶液（０．５Ｍトルエン溶液、２ｅｑ．、８．０８ｍｍｏｌ、１６．１６ｍｌ）を窒素下で約１分かけて添加した。混合物を−４０℃で１／２時間撹拌し、２時間かけてＲＴに昇温させた。冷却した反応混合物に水酸化ナトリウム溶液（０．４５ｍｌの１５％水溶液）を添加する（熱及びガスが発生した）ことで反応物を奪活した。暗緑色の混合物をジエチルエーテル（６０ｍｌ）で希釈し、セライトパッドで濾過した。シリカゲル（約２０ｇ）を添加し、溶媒を蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ペトロール４０〜６０，Ｂ＝ＤＣＭ，１〜３ＣＶ ０〜５％Ｂ，３〜７ＣＶ ５％Ｂ乃至４０％Ｂ，７〜９ＣＶ ４０％Ｂ乃至１００％Ｂ，１２０ｇカラム）により、所望の生成物を主要化学種（０．３８ｇ、３９％）として得た。
【０１０６】
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）０．５７（３Ｈ，ｓ，メチル）、０．９６（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．４１（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．８４（１Ｈ，ｄ，ＣＨ ３）、２．２８（１Ｈ，ｄ，ＣＨ ３）、２．４３（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ １）、２．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ １）、２．６４（３Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、２．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ９ａ）、４．６８（１Ｈ，ｄ，エキソ−ＣＨ2）、４．８１（１Ｈ，ｄ，エキソ−ＣＨ2）、６．５５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ８）、６．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ６）、７．０５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ５）、７．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ７）。
【０１０７】
（ｉｖ）２，４，４，４ａ，９−ペンタメチル−４，４ａ−ジヒドロ−３−Ｈ−カルバゾリウムヨージド（化合物１ｄ）
無水メタノール中の化合物１ｃ（３００ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）、ヨウ素（２ｅｑ．、６３１ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）及びヨウ化ナトリウム（６１５ｍｇ、４．１ｍｍｏｌ）を窒素下で２時間加熱還流した。冷却後、生じた沈殿を濾過によって集め、氷冷水で洗浄し、高真空下で乾燥して所望の生成物（１１０ｍｇ、２３％）を得た。濾液をチオ硫酸ナトリウム溶液（０．２ｍｌ飽和溶液）で処理し、生成物を半分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）１５０ｘ２１．２ｍｍ，Ａ＝水，Ｂ＝ＭｅＣＮ，１５ｍｌ／分，λ＝３３０ｎｍ，０〜５分 ５％Ｂ，１２分 ７０％Ｂ，１２〜１４分 ９５％Ｂ，１４〜１８分 ５％Ｂ，ｔr＝１１分）によって精製した。凍結乾燥によってオフホワイトの固体（１２２ｍｇ、２７％）を得た。総収率５０％。
【０１０８】
1Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ3）：δ（ｐｐｍ）０．５９（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．５０（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．５４（３Ｈ，ｓ，メチル）、２．３１（３Ｈ，ｓ，メチル）、２．４５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ３）、３．０３（１Ｈ，ｄ，Ｈ ３）、３．９９（３Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、７．０３（１Ｈ，ｓ，Ｈ １）、７．６１（１Ｈ，ｄｄ）、７．６５（１Ｈ，ｄｄ）、７．７５（２Ｈ，ｍ）。
【０１０９】
実施例２：Ｎ−スルホアルキルカルバゾリウム前駆体（化合物２ｅ）の合成
【０１１０】
【化１０】
【０１１１】
（ｉ）３−メチル−１−（４−スルホブチル）インドール（化合物２ｂ）
３−メチルインドール（化合物２ａ、３１１ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、（乾燥ジエチルエーテルで洗浄した）水素化ナトリウム（９７ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ、１．７ｅｑ．）をＤＭＦ（乾燥、２ｍｌ）中の懸濁液として一度に添加した。微細懸濁液をＲＴで３０分間撹拌し、１，４−ブタンスルトン（３２４ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１時間撹拌した。次いで、反応物をジエチルエーテル（１００ｍｌ）に添加し、懸濁液を４℃で１６時間貯蔵した。上澄み液をデカントによって除去し、固体をジエチルエーテルでトリチュレートした。オフホワイトの固体を高真空下で乾燥した（４１０ｍｇ、６１％）。プロトンＮＭＲは約１７モル％のＤＭＦの存在を示した。
【０１１２】
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ（ｐｐｍ）１．５４（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、１．７４（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、２．２４（３Ｈ，ｓ，メチル）、２．４０（２Ｈ，ｔ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2−ＳＯ3 -）、４．１０（２Ｈ，ｔ，Ｎ−ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、６．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ）、７．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ）、７．１２（１Ｈ，ｓ，２−Ｈ）、７．３９（１Ｈ，ｄ，ＡｒＨ）、７．４１（１Ｈ，ｄ，ＡｒＨ）。
【０１１３】
（ｉｉ）９−（４−スルホブチル）−４，４，４ａ−トリメチル−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロカルバゾール−２−オンテトラブチルアンモニウム塩（化合物２ｃ）
化合物２ｂ（２．０ｇ、６．９２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１５０ｍｌ）中に懸濁し、７０℃に加温してから超音波処理し、次いで大部分の原料が溶解するまでさらに加温した。メシチルオキシド（２ｅｑ．，１．３６ｇ、１３．８４ｍｍｏｌ）を添加し、次いで硫酸（９７％、１ｍｌ）をゆっくりと添加した。反応物を窒素下においてＲＴで１６時間撹拌した。メシチルオキシド（１ｍｌ）、次いで硫酸（９７％、０．５ｍｌ）を添加し、撹拌を２４時間続けた。
【０１１４】
反応溶液を真空下で濃縮して油状物を得、次いで水（８０ｍｌ）を添加した。水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（固体）を、ｐＨが約７になるまで少量ずつ添加し、溶液を酢酸エチル（４×５０ｍｌ）で抽出した。洗液を乾燥せずに濃縮して黄色の油状物（３．５ｇ）を得、これを高真空下で１６時間乾燥した。油状物をＤＣＭ（８０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル（約５０ｇ）上で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ＤＣＭ，Ｂ＝１０％メタノール／ＤＣＭ，Ｃ＝メタノール，０〜２ＣＶ １００％Ａ，２〜１０ＣＶ ０〜１００％Ｂ，１０〜１２ＣＶ １００％Ｂ，１２〜１７ＣＶ ０〜２０％Ｃ，１７〜２０ＣＶ ２０％Ｃ，３３０ｇカラム）によって一連の画分を得た。１２ＣＶ後に溶出する３つの主要画分は、所望の生成物及び若干の出発原料を様々な塩として含むことが示された。最も遅く流出する画分は、プロトンＮＭＲにより、テトラブチルアンモニウム塩としての所望生成物を清浄な物質（０．８７ｇ、２１％）として含むことが示された。
【０１１５】
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）０．８０（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．００（１２Ｈ，ｔ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 3）、１．０６（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．４５（８Ｈ，ｔｔ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ3）、１．４６（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．５５（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、１．６（８Ｈ，ｍ，ＮＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ3）、１．８２（２Ｈ，ｔｔ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、２．２０（２Ｈ，２ｘｄ オーバーラッピング，Ｈ ３ ａ／ｂ系）、２．６７（２Ｈ，ｍ，Ｈ １ ａ／ｂ系）、２．８０（２Ｈ，２ｘｄ，Ｎ−ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、３．０（２Ｈ，ｍ，，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、３．３２（８Ｈ，ｔ，ＮＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）、３．６１（１Ｈ，ｄｄ，９ａ−Ｈ）、６．４４（１Ｈ，ｄ，８−Ｈ）、６．６５（１Ｈ，ｄｄ，６−Ｈ）、７．００（１Ｈ，ｄ，５−Ｈ）、７．０６（１Ｈ，ｄｄ，７−Ｈ）。
【０１１６】
（ｉｉｉ）２−メチレン−９−（４−スルホブチル）−４，４，４ａ−トリメチル−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロカルバゾールテトラブチルアンモニウム塩（化合物２ｄ）
トルエン共沸蒸発（乾燥トルエン、３×２０ｍｌ）を用いて化合物２ｃ（２００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を乾燥し、ＴＨＦ（乾燥、２０ｍｌ）に溶解した。カードアイス／アセトン浴を用いて溶液を−４０℃に冷却した。テッベ試薬（トルエン中０．５Ｍ、１ｍｍｏｌ、２ｍｌ、３ｅｑ．）を約２分かけてゆっくりと添加した。反応物を窒素下において−４０℃で３０分間撹拌し、さらに３０分間撹拌しながらＲＴに昇温させた（全反応時間１．５時間）。水酸化テトラブチルアンモニウム（３ｅｑ．、１ｍｍｏｌ）の水（３ｍｌ）溶液を冷却しながらゆっくりと添加し（激しい反応）、混合物を−１５℃で一晩貯蔵した。ＲＴの混合物にＤＣＭ（５０ｍｌ）を添加し、混合物をガラスフリットで濾過した。相分離器カートリッジを用いて濾液から水を除去し、ＤＣＭ溶液を濃縮乾固してオレンジ色の油状物を得た。粗生成物をＤＣＭ（１５ｍｌ）に溶解し、水酸化テトラブチルアンモニウム溶液（１ｍｌの１Ｍメタノール溶液）を添加した。溶液をシリカゲル（約５ｇ）上で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ＤＣＭ，Ｂ＝１０％メタノール／ＤＣＭ，Ｃ＝メタノール，０〜１ＣＶ １００％Ａ，１〜８ＣＶ ０〜１００％Ｂ，８〜１０ＣＶ １００％Ｂ，１０〜１７ＣＶ １００％Ｂ乃至２０％Ｃ，１６〜１７％Ｃ，２０％Ｃ，４０ｇカラム）によって様々なピークを得た。最も遅く流出するものが所望の生成物（１４０ｍｇ、７０％）であることがわかったが、これは不純物として２０〜３０％のケトン出発原料も含んでいた。不純な物質を次の段階で使用した。
【０１１７】
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）０．５５（３Ｈ，ｓ，メチル）、０．９０（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．００（１２Ｈ，ｔ，，ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 3）、１．３４（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．４５（８Ｈ，ｔｔ，ＮＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ3）、１．５５（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、１．６（８Ｈ，ｍ，ＮＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ3）、１．９０（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、２．２０（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、２．３５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ３）、２．５５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ３）、２．８０（３Ｈ，ｍ，Ｈ １及びＨ ９ａ）、３．０（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3 -）、３．３２（８Ｈ，ｔ，ＮＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）、４．６３（１Ｈ，ｓ，エキソ−メチレン）、４．７６（１Ｈ，ｓ，エキソ−メチレン）、６．４２（１Ｈ，ｄ）、６．６２（１Ｈ，ｄｄ）、７．００（１Ｈ，ｄ）、７．０５（１Ｈ，ｄｄ）。
【０１１８】
（ｉｖ）９−スルホブチル−２，４，４，４ａ−テトラメチル−４，４ａ−ジヒドロ−３−Ｈ−カルバゾリウムテトラブチルアンモニウム塩（化合物２ｅ）
化合物２ｄ（１００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）をメタノール（乾燥、１０ｍｌ）に溶解し、ヨウ素（１ｅｑ．、４１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を３５分間加熱還流した。反応溶液を約１／２の体積に濃縮し、水をゆっくりと添加して全体積を約１０ｍｌにした。半分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）１５０ｘ２１．２ｍｍ，Ａ＝水，Ｂ＝ＭｅＣＮ，１５ｍｌ／分，λ＝３３０ｎｍ，０〜２分 ５％Ｂ，１２分 ７０％Ｂ，１２〜１４分 ９５％Ｂ，１４〜１８分 ５％Ｂ，ｔr＝２０．９分）によって精製を行った。集めた画分を濃縮し、次いで凍結乾燥した。質量収量＝１９ｍｇ。
【０１１９】
1Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ4）：δ（ｐｐｍ）０．５９（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．０２（３Ｈ，ｔ，メチル）、１．４（ｑ）、１．５（ｍ）、１．６５（２Ｈ，ｍ）、１．９（２Ｈ，ｍ）、２．０５（２Ｈ，ｍ）、２．３０（２Ｈ，ｍ）、２．４５（２Ｈ，２ｘｄ）、２．９（ｍ）、３．０５（２Ｈ，２ｘｄ）、３．２５（２Ｈ，ｍ）、４．４５（ｍ）、７．１２（１Ｈ，ｓ）、７．６４−７．８（４Ｈ，ｍ）。
【０１２０】
実施例３：カルボキシプロピル官能化カルバゾリウム前駆体（化合物３ｅ及び３ｆ）の合成
【０１２１】
【化１１】
【０１２２】
（ｉ）３−（３−メトキシカルボニルプロプ−１−イル）−１−メチルインドール（化合物３ｃ）
１−メチル−１−フェニルヒドラジン（３ａ、８４５ｇ、６．９３ｍｍｏｌ）を酢酸（１０ｍｌ）に溶解し、アジピン酸セミアルデヒドメチルエステル（３ｂ、９９７ｍｇ、６．９３ｍｍｏｌ）を滴下した（熱が発生した）。溶液を窒素下で３時間加熱還流した。高真空回転蒸発器で酢酸を除去し、得られた濃厚油状物をＤＣＭ（２０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル（約１０ｇ）を添加し、試料を濃縮乾固した。カラムクロマトグラフィー（Ａ＝ペトロール４０〜６０，Ｂ＝ＤＣＭ，１〜５ＣＶ １０％乃至３０％Ｂ，５〜１０ＣＶ ３０％乃至１００％Ｂ，１０〜１４ＣＶ １００％Ｂ，１２０ｇカラム）を行った。単一の大きいピークを集め、濃縮して油状物（１．１ｇ、６９％）を得た。
【０１２３】
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）２．０６（２Ｈ，ｔｔ，ＣＯＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2）、２．３９（２Ｈ，ｔ，ＣＯＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2）、２．７９（２Ｈ，ｔ，ＣＯＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2）、３．６６（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ）、３．７４（３Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、６．８４（１Ｈ，ｓ，Ｈ ２）、７．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ）、７．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ）、７．２７（１Ｈ，ｄ，Ａｒ）、７．６０（１Ｈ，ｄ，Ａｒ）。
【０１２４】
（ｉｉ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−４，４，９−トリメチル−１，２，３，４，５，６−テトラヒドロカルバゾール−２−オン（化合物３ｄ）
化合物３ｃ（２５０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）及びメシチルオキシド（１０６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。溶液を脱気し（真空／窒素ガスサイクル×３）、窒素下に置いた。硫酸（９７％、０．５ｍｌ）を滴下し、反応物を０℃で撹拌した。反応物をＲＴに昇温させ、４８時間撹拌した。１０％Ｋ2ＣＯ3水溶液を用いて反応物のｐＨを約５に調整し、溶液をジエチルエーテル（３×２０ｍｌ）で抽出し、抽出液をＭｇＳＯ4上で乾燥し、濃縮してピンク色の油状物を得た。生成物をカラムクロマトグラフィー（Ａ＝ＤＣＭ，Ｂ＝１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ，１〜８ＣＶ ０％乃至５０％Ｂ，８〜１２ＣＶ ５０％乃至１００％Ｂ，１２〜１８ＣＶ １００％Ｂ，４０ｇカラム）によって精製した。所望の生成物と対応するカルボン酸との混合物であることを示す１つの画分が溶出された。カラムクロマトグラフィー操作を繰り返すことでこの混合物を分離した。２つの画分が得られた。速く流出する化学種は所望の生成物（０．２５ｇ、７０％）であり、遅く流出する化学種は対応する遊離酸（０．１ｇ、２９％）であった。
【０１２５】
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ（ｐｐｍ）０．８７（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．０６（３Ｈ，ｓ，メチル）、１．３０（１Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2）、１．４６（１Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ2 ＣＨ 2ＣＨ2）、１．６６（１Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2）、２．０（１Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ 2）、２．２０（２Ｈ，２ｘｄｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ，Ｈ３）、２．３３（２Ｈ，ｔ，ＣＯＣＨ 2ＣＨ2ＣＨ2）、２．６２（３Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、２．７１（２Ｈ，２ｘｄ，Ｈ １）、３．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ９ａ）、３．６４（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ）、６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｈ ８）、６．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ６）、６．９５（１Ｈ，ｄ，Ｈ ５）、７．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ ７）。
【０１２６】
（ｉｉｉ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−２−メチリデン−４，４，９−トリメチル−１，２，３，４，５，６−テトラヒドロカルバゾール（化合物３ｅ）
化合物２ｄに関するものと同じ手順により、化合物３ｄを用いてこの化合物を製造する。
【０１２７】
（ｉｖ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−２−メチリデン−２，４，４，９−テトラメチル−４，４ａ−ジヒドロ−３Ｈ−カルバゾリウムヨージド（化合物３ｆ）
化合物２ｅに関するものと同じ手順により、化合物３ｅを用いてこの化合物を製造する。
【０１２８】
実施例４：カルボキシアルキル官能化及びスルホアルキル官能化カルバゾリウム前駆体（化合物４ｆ及び４ｇ）の合成
【０１２９】
【化１２】
【０１３０】
（ｉ）３−（３−メトキシカルボニルプロプ−１−イル）インドール（化合物４ｃ）
フェニルヒドラジン（４ａ、４．０４ｇ、３７．４ｍｍｏｌ）の酢酸溶液にアジピン酸セミアルデヒドメチルエステル（４ｂ、５．９２ｇ、４１．１ｍｍｏｌ）を滴下し、１時間加熱還流した。混合物を放冷し、次いで真空中で溶媒を除去して暗オレンジ色の固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（１００％ＤＣＭ溶離剤→５％ＭｅＯＨ）を用いて、この物質を精製した。粗化合物を注射液としてカラム上に装填した。物質は２つの画分Ｆ３〜２０（1Ｈ ＮＭＲによれば純粋）１．４８ｇ及びＦ２１〜３１（1Ｈ ＮＭＲによれば約９５％で僅かに不純）０．９７８ｇとして得られた。化合物４ｃは３１％の収率で得られた。
【０１３１】
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）δ２．００（２Ｈ，五重線，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2）、２．３５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ2）、２．７５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０２Ｈｚ，ＣＨ 2ＣＯ2Ｍｅ）、３．６１（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ）、６．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，ＮＨＣＨ）、７．０７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，７．３Ｈｚ及び１．５Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．１４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，７．０５Ｈｚ及び１．２Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、１０．７７（１Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ）。
【０１３２】
（ｉｉ）３−（３−メトキシカルボニルプロプ−１−イル）−１−（４−スルホブチル）インドール（化合物４ｄ）
化合物４ｃ（４．０ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、水素化ナトリウム（０．８１ｇ、２０．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）中の懸濁液として一度に添加した。暗紫色の懸濁液をＲＴで６時間撹拌した。０．５モル当量のＮａＨ及びスルトンを添加し、反応物を室温でさらに６時間撹拌し続けた。反応混合物をジエチルエーテルに添加し、得られた懸濁液を室温で一晩撹拌した。混合物を濾過し、集めた固体は急速にガム質に変わった。ガム質をメタノールで洗浄／溶解し、蒸発乾固して脆いオレンジ色の泡状物（３．８８ｇ、５６％）を得た。
【０１３３】
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ；３００ＭＨｚ）、１．４９−１．６１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2）、１．７３−１．９１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2）、２．３２（２Ｈ，ｔ，ＪHH ７Ｈｚ，ＣＨ2）、２．４３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＣＨ2）、２．６８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＣＨ2）、４．０９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＣＨ2）、６．９８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，Ｊ＝０．６Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．１０（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７及び０．６Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．１３（１Ｈ，ｓ，ＡｒＣＨ）、７．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＡｒＣＨ）、７．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＡｒＣＨ）。
【０１３４】
（ｉｉｉ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−４，４−ジメチル−９−（４−スルホブチル）−１，２，３，４，５，６−テトラヒドロカルバゾール−２−オン（化合物４ｅ）
化合物２ｃと同様にして、化合物４ｄ及びメシチルオキシドを用いてこの化合物を製造する。
【０１３５】
（ｉｖ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−４，４−ジメチル−２−メチリデン−９−（４−スルホブチル）−１，２，３，４，５，６−テトラヒドロカルバゾール（化合物４ｆ）
化合物２ｄと同様にして、化合物４ｅを用いてこの化合物を製造する。
【０１３６】
（ｖ）４ａ−（３−カルボキシプロプ−１−イル）−２，４，４−トリメチル−９−（４−スルホブチル）−４，４ａ−ジヒドロ−３Ｈ−カルバゾリウムヨージド（化合物４ｇ）
化合物２ｅと同様にして、化合物４ｆを用いてこの化合物を製造する。
【０１３７】
実施例５：カルバゾリウム色素（色素Ａ及び色素１〜３）の合成
【０１３８】
【化１３】
【０１３９】
（ｉ）４，４，４ａ，９−テトラメチル−２−（３−（１Ｅ−４，４，４ａ，９−テトラメチル−４，４ａ−ジヒドロ−３Ｈ−カルバゾール−２−イリデン）プロプ−１−エニル）−４，４ａ−ジヒドロ−３Ｈ−カルバゾリウムヨージド（色素Ａ、先行技術）
これは、米国特許第５８９２０５６号の合成法に対する改良法である。
【０１４０】
実施例１からの化合物１（１１０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）及びオルトギ酸トリエチル（３ｅｑ．、１３３ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を暗所で窒素下においてピリジン中で４時間加熱還流した。ピリジンを真空下で除去し、光への暴露を最小限に抑えながら粗生成物をメタノール（３ｍｌ）に溶解した。半分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）１５０ｘ２１．２ｍｍ，Ａ＝０．５％ＴＦＡ／水，Ｂ＝０．５％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ，１５ｍｌ／分，λ＝７００ｎｍ，０〜１分 １０％Ｂ，１３分 ９５％Ｂ，１３〜１７分 ９５％Ｂ，１７〜２０分 １０％Ｂ，ｔr＝１３．７分）を行った。複数回の実施にわたる生成物ピークを手作業でシンチレーションバイアル中に集め、これらを直ちに（やはり暗所で）フリーザーに入れた。画分を合わせ、溶媒を除去して濃青色／金色のフィルムを得た。生成物をトルエン（１０ｍｌ）に溶解し、溶媒を真空下で除去した。最後に、生成物を高真空下で２４時間乾燥した。プロトンＮＭＲ及びＬＣＭＳは、生成物が不純であることを示した。精製段階を上述したようにして２回繰り返した（３ｍｇ、２％）。
【０１４１】
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ（ｐｐｍ）０．６７（６Ｈ，ｓ，メチル）、１．４０（６Ｈ，ｓ，メチル）、１．５６（６Ｈ，ｓ，メチル）、２．８０（２Ｈ，ｄｄ，Ｈ ３）、３．０（２Ｈ，ｄｄ，Ｈ ３）、３．５２（６Ｈ，ｓ，Ｎ−メチル）、６．２９（２Ｈ，ｓ，Ｈ １）、６．４０（２Ｈ，ｄ，メチン）、７．２３（２Ｈ，ｄｄ）、７．２６（２Ｈ，ｄ）、７．４０（２Ｈ，ｄｄ）、７．５５（２Ｈ，ｄ，Ｈ ８）、７．８８（１Ｈ，ｔ，中央メチンＨ）。
【０１４２】
ＬＣＭＳ：Ｃ35Ｈ41Ｎ2に関するｍ／ｚ計算値４８９．３、実測値４８９[Ｍ]+。
【０１４３】
色素Ａと同様にして、各１モル当量の化合物１ｄ及び化合物３ｆを用いて色素１を製造する。
【０１４４】
色素Ａと同様にして、各１モル当量の化合物２ｅ及び化合物３ｆを用いて色素２を製造する。
【０１４５】
色素Ａと同様にして、各１モル当量の化合物２ｅ及び化合物４ｇを用いて色素３を製造する。
【０１４６】
実施例６：カルバゾリウム色素の光物理的性質
（ａ）シアニン色素Ｃｙ７と比較した色素Ａの吸光度及び蛍光
０．１〜０．２ｍｇバイアルの色素をまず１００μｌのＤＭＳＯに溶解し、次いでＰＢＳで規定濃度に希釈する。ＨＰ ８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計により、２．５μＭ溶液に関して吸光度測定を実施した。また、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計を標準化計器設定値（６００Ｖ ＰＭＴ設定値）で使用することにより、２．５μＭ溶液に関して蛍光測定を実施した。
【０１４７】
【図１】
（７４６ｎｍでの）測定吸光度は２６００００／Ｍ／ｃｍに等しい。
【０１４８】
【図２】
【０１４９】
【図３】
（７４８ｎｍでの）測定吸光度は２５００００／Ｍ／ｃｍに等しい。
【０１５０】
【図４】
【０１５１】
図２及び図４の蛍光スペクトルは、両試料が同じバイアル濃度、希釈媒質（ＰＢＳ）及び計器設定値を用いて得られたので、直接に比較可能である。
【０１５２】
（ｂ）光退色
２ｍｌの希釈溶液を同一の照明条件下でキセノン光源（Ｋａｒｌ Ｓｔｏｒｔｚ Ｘｅｎｏｎ １７５ Ｍｏｄｅｌ ２０ １３２１ ２０）に露光した。露光中、試料の加熱を回避するため、試料キュベットを室温の水浴中に保った。０分、１分、２分、３分、５分及び１０分の露光時に試料からの蛍光スペクトルを記録した。スペクトルを図５及び図６に示す。
【０１５３】
【図５】
【０１５４】
【図６】

Claims (29)

  1. 哺乳類の身体のインビボ光学イメージングに適したイメージング剤であって、次の式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤。
    ［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−ＣｚD
    （Ｉ）
    式中、
    ＢＴＭは生物学的ターゲティング部分であり、
    ＣｚDは次の式ＩＩのジヒドロカルバゾリウム色素であり、
    （式中、
    Ｒ1、Ｒ2及びＲ11〜Ｒ16は各々独立にＲa基であり、
    Ｒ3〜Ｒ10は各々独立にＨ、−ＳＯ3Ｍ1、−ＣＯ2Ｍ1、Ｃ2-7カルボキシアルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又は１〜３のヒドロキシ基で任意に置換されたＣ2-7カルボキサミドアルキルであり、式中のＭ1は独立にＨ又はＢcであり、Ｂcは生体適合性陽イオンであり、
    Ｒ17〜Ｒ20は各々独立にＨ又はＲa基であり、
    ＲaはＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル、Ｃ2-7カルボキシアルキル又はＣ1-4ヒドロキシアルキルである。）
    Ｌは式−（Ａ）m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
    ｎは０又は１の値を有する整数であり、
    ジヒドロカルバゾリウム色素は２以上のスルホン酸置換基を含むことを条件とする。）
  2. Ｒ19＝Ｒ20＝Ｈである、請求項１記載のイメージング剤。
  3. ＣｚDが全部で３又は４のスルホン酸置換基を有する、請求項１又は請求項２記載のイメージング剤。
  4. スルホン酸置換基が１〜３のスルホアルキル基からなる、請求項３記載のイメージング剤。
  5. スルホアルキル基が独立に式−（ＣＨ2）k−ＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1は請求項１に定義した通りであり、ｋは１〜４の値を有する整数である。）を有する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のイメージング剤。
  6. Ｒ11及びＲ12の一方がＲb基（式中、ＲbはＣ1-4スルホアルキル又はＣ2-7カルボキシアルキルである。）であり、他方がＣＨ3である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のイメージング剤。
  7. ＣｚDが次の式ＩＩａを有する、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のイメージング剤。
    （式中、
    Ｒ1a及びＲ2aは各々独立にＲb基であり、
    Ｒ11a及びＲ12aは各々独立にＣＨ3又はＲb基であり、
    Ｒ13a〜Ｒ15aは各々独立にＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ又はＣ2-5カルボキシアルキルであり、
    Ｒ17a及びＲ18aは各々独立にＨ又はＲb基であり、
    Ｒ21及びＲ22は各々独立に−ＳＯ3Ｍ1又は−ＣＯ2Ｍ1であり、
    Ｒbは請求項６に定義した通りであり、
    各ｎは独立に０、１又は２である。）
  8. Ｒ17a及びＲ18aの少なくとも一方がＨである、請求項６記載のイメージング剤。
  9. Ｒ1a＝Ｒ2a＝Ｃ1-4スルホアルキルである、請求項７又は請求項８記載のイメージング剤。
  10. Ｒ11a及びＲ12aの一方がＲb基（式中、ＲbはＣ1-4スルホアルキル又はＣ2-7カルボキシアルキルである。）であり、他方がＣＨ3である、請求項７乃至請求項９のいずれか１項記載のイメージング剤。
  11. ＢＴＭが
    （ｉ）単一のアミノ酸、
    （ｉｉ）３〜１００量体ペプチド、
    （ｉｉｉ）酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト又は酵素阻害剤、
    （ｉｖ）レセプター結合化合物、
    （ｖ）オリゴヌクレオチド、及び
    （ｖｉ）オリゴＤＮＡフラグメント又はオリゴＲＮＡフラグメント
    から選択される、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載のイメージング剤。
  12. ＢＴＭが３〜１００量体ペプチドである、請求項１１記載のイメージング剤。
  13. 次の式ＩＶａ又はＩＶｂを有する、請求項１２記載のイメージング剤。
    ［ＣｚD］−（Ｌ）n−［ＢＴＭ］−Ｚ2 （ＩＶａ）
    Ｚ1−［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−［ＣｚD］ （ＩＶｂ）
    （式中、
    Ｚ1はＢＴＭペプチドのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
    Ｚ2はＢＴＭペプチドのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは請求項１に定義した通りである。）又はＭIGであり、
    ＭIGは、生体適合性基である代謝抑制基であって、ＢＴＭペプチドの酵素代謝を阻止又は抑制する基である。）
  14. Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGである、請求項１３記載のイメージング剤。
  15. 哺乳動物への投与に適した形態で、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載のイメージング剤を生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬組成物。
  16. １人の患者用に適した用量を有し、適当な注射器又は容器に入れて供給される、請求項１５記載の医薬組成物。
  17. 請求項１５又は請求項１６記載の医薬組成物を製造するためのキットであって、当該キットは請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬組成物を与える、キット。
  18. 無菌固体形態が凍結乾燥固体である、請求項１７記載のキット。
  19. 次の式Ｉのコンジュゲート。
    ［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−ＣｚD
    （Ｉ）
    （式中、Ｌ及びｎは請求項１に定義した通りであり、ＢＴＭは請求項１、請求項１１及び請求項１２のいずれか１項に定義した通りであり、ＣｚDは請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に定義した通りである。）
  20. 請求項１９記載のコンジュゲートの製造において有用な官能化ジヒドロカルバゾリウム色素（ＣｚD）であって、ＣｚDは請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に定義された式ＩＩ又は式ＩＩａを有すると共に、前記ＣｚDはさらにＱa基（式中、ＱaはＢＴＭへのコンジュゲーションに適した反応性官能基である。）を含む、官能化色素。
  21. ＱaがＣ2-7カルボキシアルキル又は活性化エステル基からなる、請求項２０記載の官能化色素。
  22. 哺乳類の身体のインビボ光学イメージング方法であって、請求項１乃至請求項１４記載のイメージング剤或いは請求項１５又は請求項１６記載の医薬組成物を用いてインビボでＢＴＭの局在部位の画像を得る段階を含んでなる方法。
  23. 請求項１乃至請求項１４記載のイメージング剤或いは請求項１５又は請求項１６記載の医薬組成物が前記哺乳類の身体に予め投与されている、請求項２２記載の方法。
  24. 請求項２３記載の方法であって、
    （ｉ）哺乳類の身体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
    （ｉｉ）ＣｚDの励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
    （ｉｉｉ）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
    （ｉｖ）段階（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
    を含んでなる方法。
  25. 段階（ｉ）の励起光が連続波（ＣＷ）の性質を有する、請求項２４記載の方法。
  26. 請求項２３記載の方法であって、
    （ａ）不均質組成を有する前記哺乳類の身体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織が励起光を多重散乱させる段階、
    （ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
    （ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルが組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
    （ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
    を含んでなる方法。
  27. 光学イメージング方法が蛍光内視鏡検査からなる、請求項２２乃至請求項２６のいずれか１項記載の方法。
  28. インビボ光学イメージングが、哺乳類の身体の疾患状態の検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングを支援するために使用される、請求項２２乃至請求項２７のいずれか１項記載の方法。
  29. 哺乳類の身体の疾患状態の検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングを行う方法であって、請求項２２乃至請求項２８のいずれか１項記載のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法。
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