JP2010116413A - 近赤外線を用いた診断法および治療のための酸不安定性で酵素的に分割可能な染料構造体 - Google Patents

Abstract

【課題】公知技術水準の欠点を克服している新規の化合物を提供する。
【解決手段】本発明は、近赤外線（ＮＩＲ線）を用いた生体内診断法および生体外診断法のための、酸不安定性で酵素的に分割可能な化合物、これらの化合物の視覚的診断薬および治療薬としての使用、およびこれらの化合物を含有する診断用薬に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、近赤外線照射（ＮＩＲ線）を用いた生体内診断法および試験管内診断法のための、酸不安定性で酵素的に分割可能な化合物、視覚的診断薬および治療薬としてのこれらの化合物の使用、およびこれらの化合物を含有する診断用薬に関する。

近赤外画像形成は、生体組織の高い透過性が波長６５０〜１０００ｎｍの光に対して利用される、非観血的診断方法である。組織の最上ミリメーターにだけ入り込める紫外線、および可視のスペクトル領域と異なって、近赤外線を使用する場合、数センチメートルにいたるまでの組織内への侵入深度が達成される。原理的に小さい光侵入深度の原因は、しかし、６５０〜１０００ｎｍの近赤外線のスペクトル範囲内で最小値である、生体に特有の色素、主にヘモグロビンおよび水の吸収である。したがって、この最大の視覚的組織透明度のスペクトル領域は、診断窓／治療窓とも呼ばれる(Boulnois, J., Lasers Med Sci 1986, 1:47〜66)。

これによって、診断医には現代の画像形成法、例えばレントゲン、磁気断層撮影法または超音波診断法とともに、画像的組織表示のためのもう１つの方法が提供されている(Haller, E.B., Time-resolved transillumuination and optical tomography. J Biomed Optics 1996, 1:7〜17)。

ヘモグロビン／デオキシヘモグロビンの吸収を検知することによって、乳児の脳内の出血および酸素化度を局所により表示するため、ＮＩＲ線を使用することは、数年来の公知かつ使用されてきた方法である(Jobsis, F.F., Science 1977, 198:1264〜1267; Chance, B., Leigh, J.S., Miyake, H.他、Proc Natl Acad Sci USA 1988, 85:4971〜75; Benaron D.A.他、Science 1933, 33:369A.)。

近赤外線使用の場合の本質的な問題は、著しい光線の散乱であり、その結果、はっきりと境界をつけられた対象とその周辺との異なった光物理学的性質の場合でさえ、この対象は不鮮明に浮き出るだけである。表面からの対象の距離が拡大するにつれ、この問題は大きくなり、かつ主な制限的な構成要素として、徹照法の場合、ならびに蛍光線の検出の場合にも観察されうる。したがって、染料は、組織の光学的性質を明らかにし、かつ検出すべき組織の吸収および蛍光の増強をもたらす造影剤として、また局所性溶解の少ない場合も、明白な検出を実現できる。この場合、このような染料化合物の吸収挙動は、画像形成情報として使用されることができる。その上染料が、吸収されたエネルギーを蛍光線として放出する性質を有する場合には、蛍光線も同様に画像形成情報として使用されてよい。この場合、励起照射に対して、特に赤色部へ向かって遷移した蛍光線が検出される。利点は特に、組織自体がＮＩＲ領域内で極端に少ない固有蛍光を有し、従って下染めは最小であることである。(Ｓ．フォリ(S.Folli) 他、Cancer Research 54, 2643〜9(1994); Ｂ．バロウ(B.Ballou)他、Cancer Immunol. Immunother. 41, 257〜63 (1995); Ｘ．リー(X.Li)他、SPIE Vol. 2389, 789〜98(1995))。

蛍光診断法では、検出すべき組織と周辺の組織との間で、蛍光放出の場合に、蛍光診断のために十分な、できるだけ高い差異が前提条件である。この条件は原理的に、蛍光染料の濃度における差異によって、物質の使用に応じた所定の時点までに達成されることができる。殊に組織深層内での診断法に関しては、この差異は非特異性豊富化挙動を有する物質を使用する場合、しばしば不十分である。

Boulnois, J., Lasers Med Sci 1986, 1:47〜66 Haller, E.B., Time-resolved transillumuination and optical tomography. J Biomed Optics 1996, 1:7〜17 Jobsis, F.F., Science 1977, 198:1264〜1267 Chance, B., Leigh, J.S., Miyake, H.他、Proc Natl Acad Sci USA 1988, 85:4971〜75 Benaron D.A.他、Science 1933, 33:369A Ｓ．フォリ(S.Folli) 他、Cancer Research 54, 2643〜9(1994) Ｂ．バロウ(B.Ballou)他、Cancer Immunol. Immunother. 41, 257〜63 (1995) Ｘ．リー(X.Li)他、SPIE Vol. 2389, 789〜98(1995)

したがって本発明には、公知技術水準の欠点を克服している新規の化合物を提供するという課題が基礎として課される。

この課題は、本発明により一般式（Ｉ）：
（Ｆ−Ｌ）_ｍ−Ａ （Ｉ）
［式中、
Ｆは少なくとも１個の６００〜１２００ｎｍの吸収最大値を有する染料分子を表わし、
Ｌは酸不安定性および／または酵素的に分割可能な結合を含有するリンカー構造体を表わし、
ｍは１〜８０の数値であり、
（ここで、ｍが１〜３の数値である場合には、
Ａは少なくとも１個の６００〜１２００ｎｍの吸収最大値を有する染料分子、抗生作用分子または抗細胞増殖抑制効果分子、生体分子、非生物巨大分子、または化合物：Ｂ−（Ｌ−Ｗ）_ｏまたはＤ−（Ｌ−Ｗ）_ｏを表わし、この場合、
Ｄは非生物巨大分子を表わし、
Ｂは生体分子を表わし、
Ｌは前記の意味を表わし、
Ｗは抗生作用分子または抗細胞増殖抑制効果分子を表わし、
ｏは１〜２０の数値である、
および、ｍが４〜８０の数値である場合には、
Ａは生体分子、非生物巨大分子、または化合物：Ｂ−（Ｌ−Ｗ）_ｏまたはＤ−（Ｌ−Ｗ）_ｏを表わし、この場合、
Ｄ、Ｂ、Ｌ、Ｗおよびｏは、前記の意味を表わす］で示される化合物によって解決される。

本発明による化合物の近赤外蛍光放出生体内検出に関する特別な性質は、この化合物が蛍光放出をわずかに有するか、ないしは全く有しないこと、およびこの構造体の分割後もしくは構造体から染料を分離後に初めて、照準部位（例えば腫瘍、炎症）で蛍光信号の上昇が発生することである。したがって、検出すべき組織と周辺組織との蛍光信号の効果的な差異は、
ａ）薬物動態機序に基づく濃度差および
ｂ）診断の時点までの蛍光量子収率における差異、
によって明白にされる。

染料分子が、本発明による化合物を取得しながら、もう１つの分子（二量体）に結合されている場合、染料の蛍光はクエンチされる、すなわち、結合されていない状態にある相応する染料分子と比較して、極めて少ない蛍光放出が発生することが見出された。さらに、染料ならびに作用物質（例えば細胞増殖抑制剤または抗生剤）であってよいような、芳香族構造体を有する他の分子が、蛍光染料と結合している場合には、比較可能なクエンチングが発生することが見出された。驚くべきことに同様に、抗体、抗体断片およびタンパク質に染料を結合する際にもクエンチングが発生する。

本質的に、本発明による化合物の構造成分である染料は、モノマーの非共役形で、高モルの吸収係数および高い蛍光量子収率を示すはずである。

好ましい一般式Ｉの本発明による化合物は、Ｆおよび／またはＡが次のものを表わすことを示す：
ポリメチン染料、テトラピロール染料、テトラアザピロール染料、キサンチン染料、フェノキサジン染料またはフェノチアジン染料。

特に好ましくは、ポリメチン染料の群からの構造体である。それというのも、これらの構造体の、極めて高いモル吸収係数を有する吸収最大値が、７００〜１０００ｎｍの近赤外スペクトル領域内にある（εは３０００００ ｌ モル^−１ｃｍ^−１まで）からであり、例えば、シアニン染料、スクアリリウム染料およびクロコニウム染料、ならびにメロシアニン染料およびオキソノール染料である。

さらに、一般式（Ｉ）の式中のＦおよび／またはＡが、一般式ＩＩ：

［式中、
Ｒ^１〜Ｒ^４およびＲ^７〜Ｒ^１０は互いに無関係にフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子またはニトロ基を表わすか、または基：−ＣＯＯＥ^１、−ＣＯＮＥ^１Ｅ^２、−ＮＨＣＯＥ^１、−ＮＨＣＯＮＨＥ^１、−ＮＥ^１Ｅ^２、−ＯＥ^１、−ＯＳＯ_３Ｅ^１、−ＳＯ_３Ｅ^１、−ＳＯ_２ＮＨＥ^１、−Ｅ^１を表わし、
（ここで、Ｅ^１およびＥ^２は互いに無関係に水素原子、飽和または不飽和の、分枝鎖状または直鎖状Ｃ_１〜Ｃ_５０−アルキル鎖を表わし、この場合、鎖またはこれらの鎖の一部は、場合によっては１つまたは複数の芳香族または飽和環状Ｃ_５〜Ｃ_６単位または二環状のＣ_１０単位を形成してよく、かつこの場合、Ｃ_１〜Ｃ_５０−アルキル鎖は酸素原子０〜１５個および／またはカルボニル基０〜３個によって中断されており、および／またはヒドロキシ基０〜５個、エステル基０〜５個、炭素基０〜３個、アミノ基０〜３個で置換されている）、
およびここで、それぞれ隣接した基Ｒ^１〜Ｒ^４および／またはＲ^７〜Ｒ^１０は６員の芳香族炭素環の形成下に互いに結合していてよく、
Ｒ^５およびＲ^６は互いに無関係に、前記の意味を有する基：−Ｅ^１、またはＣ^１〜Ｃ^４−スルホアルキル鎖を表わし、
および／またはＲ^１〜Ｒ^１０はＬとの結合を表わし、
Ｑは断片：

（ここで、
Ｒ^１１は水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子またはニトロ基を表わすか、またはＥ^１およびＥ^２が前記の意味を表わす場合に、基：−ＮＥ^１Ｅ^２、−ＯＥ^１または−Ｅ^１を表わすか、またはＬとの結合を表わし、
Ｒ^１２は水素原子、または前記の意味を表わす基：Ｅ^１を表わし、
ｂは数値０、２または３である）を表わし、
ＸおよびＹは互いに無関係にＯ、Ｓ、−ＣＨ＝ＣＨ−または断片：

（ここで、Ｒ^１３およびＲ^１４は互いに無関係に水素を表わすか、または飽和または不飽和の、分枝鎖状または直鎖状で、５個までの酸素原子によって中断されていてよいか、および／または５個までのヒドロキシ基で置換されていてよいＣ_１〜Ｃ_１０−アルキル鎖を表わし、かつここで、Ｒ^１３およびＲ^１４は５員環または６員環の形成下に互いに結合していてよい）を表わす］で示されるシアニン染料を表わすような、一般式（Ｉ）の本発明による化合物は好ましい。

さらに本発明の対象は、式中、生理的に分割可能な結合を介して、染料が治療効果のある分子と結合しているか、または染料と作用物質が生理学的に分割可能な結合を介して生体分子、または非生物担体分子に結合している、一般式（Ｉ）の化合物である。

特に好ましくは、結合した状態にある染料の蛍光がクエンチされており、かつ作用分子の治療活性が、染料もしくは担体分子への結合によって隠蔽されている（プロドラッグ作用(Pro-Drug-Effekt)）構造体である。結合の分割は、蛍光放出の増大をもたらすと同時に、作用物質の活性の遊離をもたらす。

本発明による一般式（Ｉ）中の作用物質Ｗおよび／またはＡは、例えば次に記載される化合物である：
抗生物質：アクラシノマイシン(Aclacinomycin)、アクチノマイシン(Actinomycin)Ｆ^１、アントラマイシン(Anthramycin)、アザセリン(Azaserin)、ブレオマイシン(Bleomycine)、カクチノマイシン(Cactinomycin)、カルビシン（Carubicin)、カルジノフィリン(Carzinophilin)、クロモマイシン(Chromomycine)、ダクチノマイシン(Dactinomycin)、ダウノルビシン(Daunorubicin)、ドキソルビシン(Doxorubicin)、エピルビシン(Epirubicin)、ムチオマイシン(Mtiomycine)、マイコフェノール酸(Mycophenolsaure)、ノガラマイシン(Nogalamycin)、オリーボマイシン(Olivomycine)、ペプロマイシン(Peplomycin)、プリカマイシン(Plicamycin)、ポルフィロマイシン(Porfiromycin)、ピューロマイシン(Puromycin)、ストレプトニグリン(Streptonigrin)、ツベルシジン(Tubercidin)、ゾルビシン(Zorubicin)、
葉酸−類似体：デノプテリン(Denopterin)、メトスレキサート(Metothrexat)、プテロプテリン(Pteropterin)、トリメトレキサート(Trimetrexat)、
ピリミジン−類似体：アンシタビン(Ancitabin)、アザシチジン(Azacitidin)、６−アザウリジン(Azauridin)、カーモファー(Carmofur)、シタラビン(Cytarabin)、ドキシフルリジン(Doxifluridin)、エノシタビン(Enocitabin)、フロックスリジン(Floxuridin)、５−フルオル(Fluor)−ウラシル(Uracil)、
プリン−類似体：フルダラビン(Fludarabin)、６−メルカプトプリン(Mercaptopurin)、チアミプリン(Thiamiprin)、チオグアニン(Thioguanin)および前記化合物の誘導体、
アルキル化物質：スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ニトロ尿素、ナイトロフジェンマスタード化合物、
ホルモン作用物質例えばアンドロゲン、抗副腎(Antiadrenale)、抗アンドロゲン物質、抗エストロゲン、エストロゲン、
ＬＨ−ＲＨ−類似体および黄体ホルモン物質、
ならびに他の細胞増殖抑制効果物質、例えばタクソール(Taxol)およびタクソール(Taxol)誘導体。

他の作用物質は、励起後に細胞毒の単線酸素形成およびラジカル形成によって、光線増感作用を展開できることを示す、光感作物質である。そのような化合物は、まず第一にテトラピロールもしくはテトラアザピロール、例えばポルフィリン、ベンゾポルフィリン、クロリン、プルプリン、フタロシアニン、ナフタロシアニンおよび前記化合物の誘導体である。他の化合物は、発砲ポルフィリン、ポルフィセンおよびオキサジン染料もしくはフェノキサジン染料である。

一般式（Ｉ）によりリンカー構造体Ｌ中に含有されている化学結合は、構造的には次のようである、すなわち、発病している組織（腫瘍）が、パラメーターによって特生を示されており、かつ通常の組織の領域とは異なる所定の生理的パラメーターの場合に、リンカー構造体が分割される。

文献中には、腫瘍が通常組織と比較して少ないｐＨ値によって特性を示していることが記載されている。細胞間ｐＨ値は十分に一致している（約ｐＨ７.４）が、腫瘍中の細胞外ｐＨ値は、０.５ｐＨ単位に至るまでが減少している。また炎症、殊に細菌性の種類は、減少したｐＨ値によって特性を示されている。ｐＨ値を測定するための方法は、特に微小電極を用いた測定、ｐＨ感作性蛍光試験体を用いた蛍光測定、およびＭＲ−ゾンデを用いた測定である(R.J.ジリーズ(Gillies)他、Am.J.Physiol. 267,pC 195〜203(1994)、
G.R.マルチン(Martin)およびR.K.ジェイン(Jain)、Microvascular Research 46, 216〜230 (1993)、
L.E.ゲルベック(Gerweck)およびK.シータラマン(Seetharaman)、Cancer Research 56、1194〜1198(1996)、
K.エンジン(Engin)他、Int. J. Hyperthermia 11(1995)211〜216、
K.エンジン(Engin)他、Int. J.Radiation Oncology Biol. Phys. 29(1994)125〜132、
G.ヘルムリンガー(Helmlinger)他、Nature Medicine 3 (1997) 177〜182。

したがって、さらに本発明の対象は、生理的ｐＨ値の低下によって分割されるリンカー構造体Ｌを有する化合物である。このような構造体は、例えばアルキルヒドラゾン、アシルヒドラゾン、アリールヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、イミン、オキシム、アセタール、ケタール、次の断片に相応するオルトエステル：

［式中、ｐは２〜４の数値である］。

本発明による化合物の分割は、ｐＨ値の低下に基づく分割とともに、検出すべき組織（例えば腫瘍、細菌性の炎症）内に高められた濃度で存在する酵素によっても行われてもよい。

したがって、さらに本発明の対象は、酵素的に分割されるリンカー構造体Ｌを有する化合物である。酵素的に分割可能なリンカー構造体は、例えばカテプシン、ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、α−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼ、脂肪分解酵素、オキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、蛋白質分解酵素、エラスターゼ、スルファターゼ、還元酵素、転移酵素および細菌性酵素、例えばペニシリン−アミダーゼ、ならびにβ−ラクタマーゼによって分割されるようなものである(P.D.センター(Senter)他、Bioconjugate Chem.6 (1995), 389〜94)。

好ましい酵素的に分割可能な構造体は、短鎖ペプチド配列、例えばアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓを含有する配列である。

使用後の所定の時点までに、検出すべき組織内で豊富化をもたらすか、もしくは相応する濃度勾配をもたらす速度論は、本発明による化合物の分割の速度論、ならびに遊離した染料分子の運び出しの速度論と相関関係にあるべきであり、かつ相乗効果をもたらすべきである。

さらに一般式（Ｉ）の好ましい本発明による化合物は、Ａおよび／またはＢが抗体、抗体の接合体および断片、特異ペプチドおよびタンパク質、受容体、酵素、基質基、ヌクレオチド、天然または合成のリボ核酸またはデオキシリボ核酸、またはこれらの化学変性物、例えばアプタマー(Aptamer)またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リポタンパク質、レクチン、炭水化物、単糖類、二糖類または三糖類、線状または分枝鎖状オリゴ糖または多糖またはオリゴ糖誘導体または多糖誘導体、またはデキストランを表わすことを示す。

さらに、Ｄがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリリシンまたはポリリシン−デンドリマー(Dendrimer)またはこれらの誘導体を表わす、一般式（Ｉ）の本発明による化合物は好ましい。

組織構成要素Ａ、Ｄ、Ｂ、ＬおよびＷの結合は、直接または常用の官能基を介して行われる。このような基は、例えばエステル、エーテル、第二アミンおよび第三アミン、アミド、チオ尿素基、尿素基、カルバミン酸塩基またはマレイミド構造体である。

本発明のもう１つの対象は、ＮＩＲ線を用いた、発病した組織範囲の生体内診断法のため、ならびに発病した組織範囲の治療のための、一般式Ｉの本発明による化合物の使用である。

さらに本発明の対象は、少なくとも１つの一般式（Ｉ）の本発明による化合物を含有するＮＩＲ線を用いた、発病した組織範囲の生体内診断法のための視覚による診断薬である。

この薬剤は、当業者に公知の方法により、場合によっては常用の助剤および／または担体物質ならびに希釈剤等の使用下に製造される。これには、生理学的に相容性の電解質、緩衝剤、清浄剤およびモル浸透圧濃度に適応するための物質ならびに安定性および可溶性を改善するための物質が該当する。調剤学で常用の方法によって、製造の際および殊に使用の前に調剤の無菌性が配慮される。

染料ＦおよびＡの合成は、文献に公知の方法により行われる。例えば次の文献である：
F.M. Hamer in The Cyanine Dyes and Related Compounds, John Wiley and Sons, New York, 1964;
J.Fabian et al.,Chem.Rev.92 (1992) 1197;
L.A.Ernst et al., Cytometrie 10 (1989) 3〜10;
P.L.Southwick et al., Cytometrie 11 (1990) 418〜430;
R.B.Mujumdar et al., Bioconjugate Chem. 4 (1993)105〜11;
E.Terpetschnig et al., Anal. Biochem. 217 (1994)197〜204;
J.S.Lindsey et al., Tetrahedron 45 (1989) 4845〜66, 欧州特許出願公開第0591820号明細書；
L.Strekowski et al., J. Heterocycl. Chem. 33 (1996) 1685〜1688；
S.R.Mujumdar et al., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 356〜362；
M.Lipowska et al., Synth. Commun. 23 (1993) 3087〜94;
E.Terpetschnig et al., Anal. Chim. Acta 282 (1993) 633〜641;
M. MatsuokaおよびT.Kitao, Dyes Pigm. 10 (1988) 13〜22;
N. NarayananおよびG. Patronay, I. Org. Chem. 60 (1995) 2361〜95。

染料は、文献に公知の方法にならって、酸不安定性結合または酵素的に分割可能な結合を含有するか、またはこれらからカップリングによりこのような結合が生じる置換基を用いて合成される；例えば次の文献による：
B.M. Mueller et al., Bioconjugate Chem. 1 (1990) 325〜330;
K. Srinivasachar およびD.M. Neville, Biochemistry 28 (1989) 2501〜09;
D.M. Neville et al., J.Biol. Chem. 264 (1989) 14653〜61;
T. Kaneko et al., Bioconjugate Chem. 2 (1991), 133〜41;
B.A. Froesch et al., Cancer Immunol. Immunother. 42 (1996), 55〜63；
J.V.Crivello et al., J.Polymer Sci: Part A: Polymer Chem. 34 (1996) 3091〜3102。

次の例につき本発明を詳説する：

１．５−（１−オキソエチル）−１，１’−（４−スルホブチル）−インドトリカルボシアニン−ナトリウム塩 １ の合成を示す図。 酸不安定性リンカーを用いた変性を示す図。 対称スピロダイマー１０の製造を示す図。 ６からなる酸不安定性ヒドラゾンリンカー構造を有する染料二量体（１１）の製造を示す図。 ｍＡＫ９．２．２７／４−接合体（リン酸塩緩衝剤ｐＨ７.８）からのＶＩＳ／ＮＩＲ−吸収スペクトルを示す図。 １０（リン酸塩緩衝剤ｐＨ８中５μモル／ｌ）からのＶＩＳ／ＮＩＲ−吸収スペクトルを示す図。 リン酸塩緩衝剤ｐＨ８.０中およびリン酸塩緩衝剤ｐＨ６.０中１１（４μモル／ｌ）からの、３７℃で２４時間後のＶＩＳ／ＮＩＲ−吸収スペクトルを示す図。 酸不安定性二量体１１の分割の、時間に応じた異なったｐＨ値での蛍光量子収率上昇に基づく観察を示す図。

例：
１．５−（１−オキソエチル）−１，１’−（４−スルホブチル）−インドトリカルボシアニン−ナトリウム塩 １ の合成（図１）
４−ヒドラジノフェニルメチルケトンを、４−アミノフェニルメチルケトンから、ジアゾ化し、かつＳｎＣｌ_２ を用いて還元することによって合成する（T.Gorecki et al., J. Heterocyclic Chem. 33 (1996) 1871〜76による)。

４−ヒドラジノフェニルメチルケトン４.８ｇ（３２ミリモル）、酢酸ナトリウム５.４ｇおよび３−メチル−２−ブタノン３.９ｇ（４５ミリモル）を、酢酸４０ｍｌ中に室温で１時間攪拌し、および１２０℃で４時間攪拌する。反応混合物を真空中で蒸発濃縮し、ジクロルメタン３００ｍｌ中に取り、かつ有機相を塩添加ＮａＣｌ溶液を用いて洗浄する。ＭｇＳＯ_４上で乾燥後、茶色の油７.５ｇが得られる。得られた油を１，４−ブタンスルトン６.５ｇ（４８ミリモル）を用いて、１４０℃に５時間で加熱し、アセトンを用いて冷却後攪拌し、かつ沈殿した染料をクロマトグラフィー法（ＲＰ Ｃ−１８、流展剤 メタノール／水により清浄化する。収量：５−（１−オキソエチル）−１−（４−スルホブチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドレニン ２ ２.５ｇ（２３％）。

染料１を製造するため、１−（４−スルホブチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドレニン ３ ０.５ｇ（１.７ミリモル）とグルタコンアルデヒドジアニルヒドロクロリド０.４７ｇ（１.６ミリモル）とを無水酢酸１０ｍｌ中で、１２０℃で３０分攪拌する。冷却後、２ ０.６ｇ（１.８ミリモル）、無水酢酸１０ｍｌ、酢酸４ｍｌおよび酢酸ナトリウム０.５ｇを添加し、かつ１２０℃で３０分加熱する。深青色の溶液を冷却し、エーテル２００ｍｌと一緒に攪拌し、かつ沈殿した染料を濾別する。クロマトグラフィー法による清浄化（ＲＰ Ｃ−１８、流展剤 メタノール／水）および凍結乾燥後、生成物１ ０.３ｇ（２６％）が得られる。
元素分析：
計算値：C 61.99 H 6.33 N 3.91 S 8.95
測定値：C 61.73 H 6.49 N 3.80 S 8.78
吸収：λ_ｍａｘ（Ｈ_２Ｏ）＝７４８ｎｍ（ε＝１４８０００ ｌモル^−１ｃｍ^−１）

２．酸不安定性リンカーを用いた変性（図２）
２．１． １と４−カルボキシフェニルスルホニルヒドラジンとの反応
１ ０.２ｇ（０.２８ミリモル）および４−カルボキシフェニルスルホニルヒドラジン７４ｍｇ（０.３４ミリモル）をメタノール２０ｍｌ中に溶解し、トリフルオル酢酸５μｌを添加し、および室温で１８時間攪拌する。溶剤を真空中で蒸発し、残滓を数回ジクロルメタンを用いて洗浄し、かつ生成物を乾燥させる。収量：４ ０.２１ｇ
２．２． １と４−アミノ安息香酸ヒドラジドとの反応
１ ０.２ｇ（０.２８ミリモル）と４−アミノ安息香酸ヒドラジド５１ｍｇ（０.３４ミリモル）とを２．１と同様に反応させる。収量：５ ０.２０ｇ
２．３． １と４−（アミノメチル）安息香酸ヒドラジドとの反応
１ ０.２ｇ（０.２８ミリモル）と４−アミノメチル安息香酸ヒドラジド５６ｍｇ（０.３４ミリモル）とを２．１と同様に反応させる。収量：６ ０.２２ｇ

３．反応性官能基の製造
（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびイソチオシアネート）（図２）
相応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物７を製造するため、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１２ｍｌ中に４ ０.１ｇ（０.１ミリモル）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１４ｍｇ（０.１２ミリモル）とを装入し、室温でＤＭＦ１ｍｌ中にジシクロヘキシルカルボジイミド２３ｍｇ（０.１１ミリモル）の溶液を添加する。７２時間の攪拌後、ジエチルエーテルを用いて生成物を沈殿し、濾別し、かつ新たにＤＭＦ／ジエチルエーテルから再沈殿させる。真空乾燥後、得られた生成物（１２ｍｇ）を後浄化なしで使用する。

酸不安定性イソチオシアネート化合物８を製造するため、クロロホルム１５ｍｌ中で、５ ０.１ｇ（０.１１ミリモル）、Ｎ，Ｎ’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン３３ｍｇ（０.１４ミリモル）およびトリエチルアミン１５ｍｇ（０.１５ミリモル）を室温で６０分間攪拌する。ジエチルエーテルを用いて、生成物を沈殿し、濾別し、かつＨＰＬＣを用いて浄化させる（RP Select B,メルック(Merck)、流展剤 １０ｍＭリン酸塩緩衝剤ｐＨ８／メタノール）。凍結乾燥、ジクロルメタン／メタノールを有する塩の分離および真空中乾燥後、８ ４０ｍｇ（４０％）が得られる。

４．ｍＡＫ９．２．２７の標識化（抗メラノーム抗体）
４．１．酸不安定性ＮＨＳ−エステル７を用いた標識化
ホウ酸塩緩衝剤（ｐＨ９.２）０.５ｍｌ ５０ｍＭ中抗体１ｍｇに、７（ＤＭＦ中原液５ミリモル／ｌ）３３μｌを添加し、室温で１時間攪拌する。非結合染料をＮＡＰ−５−カラム上に分離させる（リン酸塩緩衝剤ｐＨ７.８、＋０.０１％ ＮａＮ_３ ２５ｍＭを用いた溶出）。生成物ｍＡＫ９．２．２７／４−接合体を溶液中４℃で貯蔵する。

ｍＡＫ９．２．２７／４−接合体（リン酸塩緩衝剤ｐＨ７.８）からのＶＩＳ／ＮＩＲ−吸収スペクトルは、図５参照。
蛍光量子収率Ｑ＝０.１％（リン酸塩緩衝剤ｐＨ７.８中５μモル／ｌ；R.C.ベンソン(Benson)およびH.A.キューズ(Kues)、J. of Chemical and Engineerign Data 22 (1977) 379による、ＤＭＳＯ中Ｑ＝１３％を有する標準としてのインドシアニングリーンに関する)。
４．２．酸不安定性イソチオシアネート８を用いた標識化
ホウ酸塩緩衝剤（ｐＨ９.２）０.５ｍｌ ５０ｍＭ中抗体１ｍｇに、８（ＤＭＦ中原液５ミリモル／ｌ）６μｌを添加し、室温で１５分間攪拌する。非結合染料をＮＡＰ−５−カラム上に分離させる（リン酸塩緩衝剤ｐＨ７.４、＋０.０１％ ＮａＮ_３ ２５ｍＭを用いた溶出）。生成物ｍＡＫ９．２．２７／５−接合体を溶液中４℃で貯蔵する。

５．二量体インドトリカルボシアニン染料の合成
５．１．対称スピロダイマー１０の製造（図３）
３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ−［５．５］ウンデカン（M.クリベロ(Crivello)他、J.Polymer Sci.:A部：Polymer Chem. 34 (1996) 3091〜3102 により合成）０.１ｇ（０.４７ミリモル）および６−アミノ−１−ヘキサノール０.１１ｇ（０.９４ミリモル）を、ジエチルエーテル１５ｍｌ中で室温で２４時間攪拌し、溶剤を真空中で蒸発する。残滓を油ポンプで乾燥させ、後浄化なしで反応させる。

５−カルボキシ−ビス−１，１’−（４−スルホブチル）−インドトリカルボシアニン−ナトリウム塩９ ０.２ｇ（０.２８ミリモル）を、ジクロルメタン１５ｍｌ中でＴＢＴＵ ０.０９ｇ（０.２８ミリモル）およびトリエチルアミン３０ｍｇと一緒に３０分攪拌し、かつジクロルメタン２ｍｌ中前記スピロ化合物０.０６ｇ（０.１４ミリモル）を添加する。室温で１８時間の攪拌後、ジエチルエーテルを用いて生成物を沈殿し、クロマトグラフィー法により浄化する（ＲＰ Ｃ−１８、流展剤 メタノール／リン酸塩緩衝剤ｐＨ８ １０ｍＭ）。凍結乾燥後、メタノール／ジクロルメタンを有する塩を沈殿させる。生成物１０ ６８ｍｇ（２６％）が得られる。

１０（リン酸塩緩衝剤ｐＨ８中５μモル／ｌ）からのＶＩＳ／ＮＩＲ−吸収スペクトルは、図６参照。

蛍光量子収率Ｑ＝０.２％（リン酸塩緩衝剤ｐＨ８中５μモル／ｌ；標準としてのインドシアニングリーンに関する、例４．１．参照）。
５．２． ６からなる酸不安定性ヒドラゾンリンカー構造を有する染料二量体（１１）の製造（図４）
５−カルボキシ−ビス−１，１’−（４−スルホブチル）−インドトリカルボシアニン−ナトリウム塩９ ０.１ｇ（０.１４ミリモル）を、ＤＭＦ１０ｍｌ中でＴＢＴＵ４５ｍｇ（０.１４ミリモル）およびトリエチルアミン１５ｍｇと一緒に３０分攪拌し、かつＤＭＦ２ｍｌ中６ ０.１４ｇ（０.１６ミリモル）を添加する。室温で５時間の攪拌後、ジエチルエーテルを添加することによって生成物を結晶析出させ、濾別し、かつクロマトグラフィー法により浄化する（ＲＰ Ｃ−１８、流展剤 メタノール／リン酸塩緩衝剤ｐＨ８ １０ｍＭ）。凍結乾燥後、メタノール／ジクロルメタンを有する塩を沈殿させる。１１ ０.１３ｇ（５９％）が得られる。

リン酸塩緩衝剤ｐＨ８.０中およびリン酸塩緩衝剤ｐＨ６.０中１１（４μモル／ｌ）からの、３７℃で２４時間後のＶＩＳ／ＮＩＲ−吸収スペクトル：図７参照。

６．時間に依存した、異なったｐＨ値での１１の蛍光量子収率測定
ｐＨ値７.４；７.０；６.６；６.０および５.０のリン酸塩緩衝剤５０ｍＭ中４μモル／ｌ濃度の溶液を３７℃で保温する。種々の時点で一定部分を取り出し、蛍光量子収率を測定する（ＳＰＥＸ フルオロログ(Fluorolog)スペクトル蛍光計、４００ワットＸｅ−ランプ、ＰＭ９５８−検出器、検出器の波長による感度、インドシアニングリーンに関する数値を検量、例４．１．参照）。

酸不安定性二量体１１の分割の、時間に応じた異なったｐＨ値での蛍光量子収率上昇に基づく観察は、図８に示される。

７．ドキソルビシン−インドトリカルボシアニン−接合体（１３）と酸不安定性ヒドラゾンリンカーとの合成（図４）
ドキソルビシン−ヒドロクロリド２０ｍｇ（３４μモル）および４−（アミノメチル）安息香酸ヒドラジド１１ｍｇ（６８μモル）を、無水メタノール３ｍｌ中でトリフルオル酢酸２μｌの添加後室温で２４時間攪拌する。生成物１２を、アセトニトリルを用いて結晶析出させ、遠心分離させ、アセトニトリルを用いて洗浄し、かつ乾燥させる。収量は粗製生成物１８ｍｇ（２４μモル）。

５−カルボキシ−ビス−１，１’−（４−スルホブチル）−インドトリカルボシアニン−ナトリウム塩９ １４ｍｇ（２０μモル）を、ＤＭＦ０.５ｍｌ中でＴＢＴＵ ７ｍｇ（２２μモル）およびトリエチルアミン２０μｌと一緒に３０分攪拌する。この反応混合物を、０℃で少しずつ、前記１２（ＤＭＦ ０.２ｍｌ中に１８ｍｇ）の溶液に滴加し、０℃で３時間攪拌する。ジエチルエーテルを添加することによって生成物を沈殿させ、かつ例５と同様にクロマトグラフィー法により浄化する。１３ １２ｍｇ（４７％）が得られる。

Claims (12)

1. 一般式（Ｉ）：
   （Ｆ−Ｌ）_ｍ−Ａ （Ｉ）
   ［式中、
   Ｆは少なくとも１個の６００〜１２００ｎｍの吸収最大値を有する染料分子を表わし、
   Ｌは酸不安定性および／または酵素的に分割可能な結合を含有するリンカー構造体を表わし、
   ｍは１〜８０の数値であり、
   （ここで、ｍが１〜３の数値である場合には、
   Ａは少なくとも１個の６００〜１２００ｎｍの吸収最大値を有する染料分子、抗生作用分子または抗細胞増殖抑制効果分子、生体分子、非生物巨大分子、または化合物：Ｂ−（Ｌ−Ｗ）_ｏまたはＤ−（Ｌ−Ｗ）_ｏを表わし、この場合、
   Ｄは非生物巨大分子を表わし、
   Ｂは生体分子を表わし、
   Ｌは前記の意味を表わし、
   Ｗは抗生作用分子または抗細胞増殖抑制効果分子を表わし、
   ｏは１〜２０の数値である、
   および、ｍが４〜８０の数値である場合には、
   Ａは生体分子、非生物巨大分子、または化合物：Ｂ−（Ｌ−Ｗ）_ｏまたはＤ−（Ｌ−Ｗ）_ｏを表わし、この場合、
   Ｄ、Ｂ、Ｌ、Ｗおよびｏは、前記の意味を表わす］で示される化合物。
2. 一般式（Ｉ）中、Ｆおよび／またはＡが、ポリメチン染料、テトラピロール染料、テトラアザピロール染料、キサンチン染料、フェノキサジン染料またはフェノチアジン染料を表わす、請求項１記載の化合物。
3. 一般式（Ｉ）中、Ｆおよび／またはＡが、シアニン染料、スクアリリウム染料、クロコニウム染料、メロシアニン染料またはオキソノール染料を表わす、請求項１または２記載の化合物。
4. 一般式（Ｉ）中、Ｆおよび／またはＡが一般式（ＩＩ）：
   

   

   ［式中、
   Ｒ^１〜Ｒ^４およびＲ^７〜Ｒ^１０は互いに無関係にフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子またはニトロ基を表わすか、または基：−ＣＯＯＥ^１、−ＣＯＮＥ^１Ｅ^２、−ＮＨＣＯＥ^１、−ＮＨＣＯＮＨＥ^１、−ＮＥ^１Ｅ^２、−ＯＥ^１、−ＯＳＯ_３Ｅ^１、−ＳＯ_３Ｅ^１、−ＳＯ_２ＮＨＥ^１、−Ｅ^１を表わし、
   （ここで、Ｅ^１およびＥ^２は互いに無関係に水素原子、飽和または不飽和の、分枝鎖状または直鎖状Ｃ_１〜Ｃ_５０−アルキル鎖を表わし、この場合、鎖またはこれらの鎖の一部は、場合によっては１つまたは複数の芳香族または飽和環状Ｃ_５〜Ｃ_６単位または二環状のＣ_１０単位を形成してよく、かつこの場合、Ｃ_１〜Ｃ_５０−アルキル鎖は酸素原子０〜１５個および／またはカルボニル基０〜３個によって中断されており、および／またはヒドロキシ基０〜５個、エステル基０〜５個、カルボキシ基０〜３個、もしくはアミノ基０〜３個で置換されている）、
   およびここで、それぞれ隣接した基Ｒ^１〜Ｒ^４および／またはＲ^７〜Ｒ^１０は６員の芳香族炭素環の形成下に互いに結合していてよく、
   Ｒ^５およびＲ^６は互いに無関係に、前記の意味を有する基：−Ｅ^１、またはＣ^１〜Ｃ^４−スルホアルキル鎖を表わし、
   および／またはＲ^１〜Ｒ^１０はＬとの結合を表わし、
   Ｑは断片：
   

   

   （ここで、
   Ｒ^１１は水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子またはニトロ基を表わすか、またはＥ^１およびＥ^２が前記の意味を表わす場合に、基：−ＮＥ^１Ｅ^２、−ＯＥ^１または−Ｅ^１を表わすか、またはＬとの結合を表わし、
   Ｒ^１２は水素原子、または前記の意味を表わす基：Ｅ^１を表わし、
   ｂは数値０、２または３である）を表わし、
   ＸおよびＹは互いに無関係に基：Ｏ、Ｓ、−ＣＨ＝ＣＨ−または断片：
   

   

   （ここで、Ｒ^１３およびＲ^１４は互いに無関係に水素を表わすか、または飽和または不飽和の、分枝鎖状または直鎖状で、５個までの酸素原子によって中断されていてよいか、および／または５個までのヒドロキシ基で置換されていてよいＣ_１〜Ｃ_１０−アルキル鎖を表わし、かつここで、基Ｒ^１３およびＲ^１４は５員環または６員環の形成下に互いに結合していてよい）を表わす］で示されるシアニン染料を表わす、請求項１から３までのいずれか１項記載の化合物。
5. 一般式（Ｉ）中で、ＷまたはＡが抗生物質、葉酸−類似体、ピリミジン−類似体、プリン−類似体、ホルモン作用物質ならびに他の細胞増殖抑制効果物質を表わす、請求項１から４までのいずれか１項記載の化合物。
6. 一般式（Ｉ）中、Ｌが式：
   

   

   ［式中、ｐは２〜４の数値である］で示される酸不安定断片を含有する構造体を表わす、請求項１から５までのいずれか１項記載の化合物。
7. 一般式（Ｉ）中、Ｌが酵素的に分割可能な化学結合を含有する構造体を表わす、請求項１から６までのいずれか１項記載の化合物。
8. 一般式（Ｉ）中、Ｌが、カテプシン、ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、α−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼ、脂肪分解酵素、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、蛋白質分解酵素、エラスターゼ、スルファターゼ、還元酵素および細菌性酵素によって分割される構造体を表わす、請求項１から７までのいずれか１項記載の化合物。
9. 一般式（Ｉ）中、Ａおよび／またはＢが抗体、抗体の接合体および断片、特異ペプチドおよびタンパク質、受容体、酵素、酵素基質基、ヌクレオチド、天然または合成のリボ核酸またはデオキシリボ核酸、またはこれらの化学変性物、例えばアプタマー(Aptamer)またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リポタンパク質、レクチン、炭水化物、単糖類、二糖類または三糖類、線状または分枝鎖状オリゴ糖または多糖またはオリゴ糖誘導体または多糖誘導体、またはデキストランを表わす、請求項１から８までのいずれか１項記載の化合物。
10. 一般式（Ｉ）中、Ｄがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリリシンまたはポリリシン−デンドリマー(Dendrimer)またはこれらの誘導体を表わす、請求項１から９までのいずれか１項記載の化合物。
11. ＮＩＲ線を用いた、発病した組織範囲の生体内診断法のため、ならびに発病した組織範囲の治療のための、請求項１による化合物の使用。
12. 少なくとも１つの請求項１による化合物と一緒に常用の助剤および／または担体物質ならびに希釈剤を含有する、ＮＩＲ線を用いた、発病した組織範囲の生体内診断法のための視覚による診断薬。

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